CZ284251B6 - Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce - Google Patents

Abstract

Konstrukce DNA zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BAR1, obsahujícího sekvenci kodující signální peptid, alespoň jeden strukturní gen cizí pro vybraného hostitele a promotor, který kontroluje expresi v buňkách hostitele transformovaného touto konstrukcí, při čemž napojení polypeptidu nebo proteinu pochází z části genu BAR1 a strukturního genu. Transformovaná buňka obsahuje kteroukoliv shora uvedenou konstrukci. Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce se provádí transformací hostitelské buňky konstrukcí DNA kodující uvedený heterologní protein a selektovatelný marker a pak kultivací transformované buňky za kultivačních podmínek vhodných pro výrobu heterologního proteinu. Podstata tohoto způsobu je v tom, že se hostitelská buňka představovaná buňkou houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BAR1 obsahujícího alespoň sekvenci kodující signální peptid, strukturní gen kodující uvedený heterologní protein a promotor, kterŕ

Description

(57) Anotace:

Konstrukce DNA zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BARI, obsahujícího sekvenci kódující signální peptid, alespoň Jeden strukturní gen cizí pro vybraného hostitele a promotor, který kontroluje expresi v buňkách hostitele transformovaného touto konstrukcí, přičemž napojení polypeptidu nebo proteinu pochází z části genu BARI a strukturního genu. Transformovaná buňka obsahuje kteroukoliv shora uvedenou konstrukci. Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce se provádí transformací hostitelské buňky konstrukcí DNA kódující uvedený heterologní protein a selektovatelný markér a pak kultivací transformované buňky za kultivačních podmínek vhodných pro výrobu heterologního proteinu. Podstata tohoto způsobu je v tom, že se hostitelská buňka představovaná buňkou houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BARI obsahujícího alespoň sekvenci kódující signální peptid, strukturní gen kódující uvedený heterologní protein a promotor, který v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího signální peptid a heterologní protein, přičemž napojený protein se vyrábí v transformované buňce a Je směrován do sekreční cesty buňky. Protein vyráběný způsobem podle vynálezu zahrnuje s výhodou sekvenci aminokyselin lidského proinzulinu nebo inzulínu.

Konstrukce DNA zahrnující část Saccharomyces cerevisiae genu BARI, transformovaná buňka obsahující tuto konstrukci, způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce

Oblast techniky

Vynález se tyká konstrukce DNA zahrnující část Saccharomyces cerevisiae genu BARI, transformované buňky obsahující tuto konstrukci, způsobu výroby heterologního proteinu v transformované buňce a proteinu vyrobeného uvedeným způsobem.

Jedná se o konstrukce nových DNA, které obsahují alespoň translatovanou signální peptidovou část genu BARI ze Saccharomyces cerevisiae a alespoň jeden strukturní gen, který je cizí pro hostitelskou buňku transformovanou uvedenou konstrukcí. Transformace hostitelských organismů takovými konstrukcemi vede k expresi primárního translačního produktu, který obsahuje strukturní protein kódovaný cizím genem napojeným na signální peptid BARI, takže protein je opracováván v sekreční cestě hostitelské buňky a může být z hostitelské buňky sekretován do kultivačního prostředí nebo do periplazmového prostoru.

Dosavadní stav techniky

Jako hostitelé pro produkci heterologních polypeptidů, tj. polypeptidů. které nejsou přirozeně produkovány hostitelem, cestou rekombinantní DNA, se používají různé prokaiyotické a eukaryotické mikroorganismy. Zvláště zajímavé jsou různé druhy eukaryotických hub. včetně Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus a Neurospora. Zvláště mnoho práce bylo uděláno na kvasinkách S. cerevisiae. Kvasinkové buňky po transformaci vhodnou DNA konstrukcí, jako je například plazmid, provádějí expresi heterologních genů obsažených v plazmidu. Hlavním omezením této technologie je však to, že v mnoha případech nejsou proteinové produkty vylučovány hostitelskými buňkami do prostředí. Je tedy nutné buňky rozbít a žádaný protein vyčistit od různých znečišťujících buněčných složek, aniž by při tom došlo k její denaturaci nebo desaktivaci. Je tedy žádoucí, aby bylo možné směrovat transformované buňky k sekreci takového heterologního produktu, což by zjednodušilo čištění tohoto produktu. Dále může být žádoucí, aby některé proteiny vstupovaly do sekreční cesty hostitelské buňky, čímž by se usnadnilo příslušné opracovávání, tj. tvorba disulfidové vazby.

Je známo, že S. cerevisiae vylučují některé ze svých přirozeně produkovaných proteinů, i když znalosti tohoto procesu jsou dost omezené ve srovnání s tím, co je známo o sekreci proteinů z bakterií a z buněk savců. Zdá se, že většina ze sekretovaných kvasinkových proteinů jsou enzymy, které zůstávají v periplazmovém prostoru, i když enzymy invertáza a fosfatáza mohou být zahrnuty také do buněčné stěny. Mezi proteiny, o kterých je známo, že jsou kvasinkami S. cerevisiae vylučovány do kultivačního prostředí, patří pohlavní feromony (sexuální atraktanty) (alfafaktor a a-faktor), zabíjecí toxin a proteiny ovlivňující Barrierovu aktivitu (dále zde budou tyto proteiny označovány jako Barrier). Vylučování buněčnou stěnou do prostředí je označováno také jako export. Buňky S. cerevisiae pohlavního typu alfa produkují alfa-faktor, který je vylučován do kultivačního prostředí, zatímco buňky produkují dva sekretované polypeptidy, a-faktor a Barrier. Gen pro alfa-faktor byl klonován, sekvenován a analyzován (viz: Kurjan a Herskowitz: Cell 30, 933 (1982). Signální peptid (krátká peptidová sekvence, o níž se předpokládá, že vede buňky k sekreci napojeného proteinu), leader sekvence (obsahující prekurzorový polvpeptid, který je štěpen od maturovaného alfa-faktoru) a netranslované genové sekvence (včetně promotorových a regulačních oblastí) z genu alfa-faktoru se mohou použít k řízení sekrece cizích proteinů produkovaných kvasinkou (Brake a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81. 4642 (1984).). Zdá se, že opracování alfa-faktorového prekurzoru na maturovanou

- 1 CZ 284251 B6 bílkovinu vyžaduje alespoň dva stupně, o kteiých se předpokládá, že jsou pod kontrolou genů STE-13 a K.EX2.

Na rozdíl od alfa-faktoru se zdá, že Barrier je glykosylován, vzhledem kjeho schopnosti vázat konkavalin A. Barrier je produkován buňkami. Zdá se, že exprese je pod kontrolou genu MATa2. S výjimkou možného odštěpení signálního peptidu nebylo až dosud demonstrováno žádné opracování prekurzoru Barriera a nepředpokládá se. že by geny STE13 a K.EX2 hrály roli při expresi Barriera.

Díky shora uvedeným rozdílům mezi kontrolou exprese a opracováním α-faktoru a Barriera, nelze předem říci, který' z těchto kvasinkových genů je vhodnější pro řízení sekrece dotyčného cizího proteinu. Jelikož se zdá, že oba proteiny jsou opracovávány v různých sekrečních cestách, bylo by žádoucí využít vlastností Barrierova sekrečního systému.

Uvedené nedostatky jsou z převážné části odstraněny v postupu podle tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je konstrukce DNA zahrnující část Saccharomyces cerevisiae genu BARI obsahujícího sekvenci kódující signální peptid, alespoň jeden strukturní gen cizí pro vybraného hostitele a promotor, který' kontroluje expresi v buňkách hostitele transformovaného touto konstrukcí, při čemž napojení polypeptidu nebo proteinu pochází z části genu BARI a strukturního genu.

Jedno provedení konstrukce DNA je takové, že v ní napojený polypeptid nebo protein obsahuje místo KEX2 pro opracování.

Druhé provedení konstrukce DNA je takové, že v ní napojená sekvence genu BARI kódující signální peptid je změněna tak, že snižuje účinnost štěpení napojeného polypeptidu nebo proteinu signální peptidázou.

Třetí provedení konstrukce DNA podle vynálezu je typické tím, že v ní obsažený promotor znamená promotor genu kvasinkové glykolytické cesty.

Čtvrté provedení konstrukce DNA je takové, že v ní obsažený promotor je vybrán ze skupiny zahrnující S. cerevisae promotoru BARI, S. cerevisiae promotoru alkoholdehvdrogenázy I a Schizosaccharomyces pombe promotoru alkoholdehydrogenázy.

Páté provedení konstrukce DNA podle vynálezu je charakteristické tím, že konstrukce je vybrána ze skupiny zahrnující pXV30, pZV31, pZV49 a pZV50.

Šesté provedení konstrukce DNA je dáno tím, že konstrukce dále obsahuje oblast terminace transkripce Saccharomyces cerevisae genu triosofosfátizomerázy.

Sedmé provedení konstrukce DNA podle vynálezu je typické tím, že část genu BARI dále obsahuje sekvenci 5' nepřeložené oblasti o 680 párech nukleotidů přilehlou k místě iniciace translace.

Jiným předmětem vynálezu je transformovaná buňka, která obsahuje kteroukoliv shora uvedenou konstrukci podle vynálezu.

-2 CZ 284251 B6

Transformovanou buňkou může být buňka houby, s výhodou Saccharomyces cerevisae. Schizosaccharomyces pombe a Aspergillus nebo Neurospora.

Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce transformací hostitelské buňky konstrukcí DNA kódující uvedený heterologní protein a selektovatelný markér a pak kultivací transformované buňky za kultivačních podmínek vhodných pro výrobu heterologního proteinu. Podstata tohoto způsobu je v tom, že se hostitelská buňka představovaná buňkou houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BARI obsahujícího alespoň sekvenci kódující signální peptid, strukturní gen kódující uvedený heterologní protein a promotor, který v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího signální peptid a heterologní protein, při čemž napojený protein se vyrábí v transformované buňce a je směrován do sekreční cesty buňky.

Při postupu se jako houba používá s výhodou Saccharomyces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nebo Neurospora.

Při jednom provedení způsobu podle vynálezu se buňka houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje promotor, který v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího místo K.EX2 pro opracování.

Při druhém provedení způsobu podle vynálezu se sekvence genu BARI kódující signální peptid změní místně specifickou mutací potenciálních míst štěpení, s výhodou míst spojujících aminokyseliny 23 a 24 nebo 24 a 25.

Při třetím provedení způsobu se buňka houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje promotor vybraný ze skupiny zahrnující promotor Saccharomyces cerevisiae BARI, promotor Saccharomyces cerevisiae alkoholdehydrogenázy I a promotor Schizosaccharomyces pombe alkoholdehydrogenázy.

Při čtvrtém provedení způsobu podle vynálezu se buňka houby transformuje konstrukcí DNA, která jako promotor zahrnuje promotor genu kvasinkové glvkolvtické cesty.

Při pátém provedení způsobu se buňka houby transformuje konstrukcí DNA vybranou ze skupiny sestávající z plazmidů pZV30, pZV31, pZV49 a pZV50.

Při šestém provedení způsobuje typické, že se heterologní protein exportuje z buňky.

Při posledním provedení způsobu podle vynálezu se použije odpovídajícím způsobem výchozích látek za vzniku proteinu zahrnujícího proinzulin nebo inzulín.

Posledním předmětem vynálezu je pak protein vyrobený způsobem podle vynálezu, zejména protein s výhodou zahrnující sekvenci aminokyselin lidského proinzulinu nebo inzulínu.

Konstrukce DNA podle tohoto vynálezu obsahují alespoň signální peptid kódující sekvenci genu BARI Saccharomyces cerevisiae, alespoň jeden strukturní gen cizí pro hostitelský organismus a promotor, který v hostitelském organismu kontroluje expresi napojeného proteinu, jenž obsahuje BARI signální peptid a cizí proteiny.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje sekvenci nukleotidů genu BARI a odvozenou aminokyselinovou sekvenci primárního translačního produktu. Vazebné místo MATa2 je podtrženo. Domnělé místo štěpení

- 3 CZ 284251 B6 signálního peptidu je označeno šipkou a potenciální glykosylační místa jsou označena hvězdičkami.

Obrázek 2 je diagram plazmidu pZV9.

Obrázek 3 ilustruje konstrukci plazmidu p245.

Obrázek 4 ilustruje konstrukci plazmidů pZV30, pZV31, pZV32 a pZV33.

Obrázek 5A a 5B ilustruje konstrukci plazmidu pZV50.

Obrázek 6 ilustruje konstrukci plazmidu ml 15.

Obrázek 7 ilustruje konstrukci plazmidu pZV49.

Obrázek 8 ilustruje konstrukci plazmidu pZV134, kteiý obsahuje promotor TPI1.

Obrázek 9 ilustruje subklonování části genu MFal.

Obrázek 10 ilustruje konstrukci plazmidu pZV75.

Obrázek 11 ilustruje konstrukci plazmidů, které obsahují promotor TPI1 a napojení BARI-MFal.

Obrázek 12 ilustruje konstrukci plazmidu pSW22.

Obrázek 13 ilustruje konstrukci plazmidů, které obsahují napojení BARI-MFal.

Obrázek 14 ilustruje konstrukci plazmidu pZVlOO. Obrázek 15 ilustruje konstrukci plazmidu pZV102.

Obrázek 16 ilustruje konstrukci plazmidu pSW96. Obrázek 17 ilustruje konstrukci plazmidu pSW97.

Obrázek 18 ilustruje konstrukci plazmidů pSW98 a pSW99.

Označení Δ znamená mutaci na kodonu 25

Pojem konstrukce DNA nebo DNA konstrukce tak, jak je zde používán, znamená jakoukoliv molekulu DNA, včetně plazmidu, která je lidským zásahem modifikována tak, že sekvence nukleotidů v této molekule nejsou identické se sekvencí, která je produkována přirozeným způsobem. Pojem konstrukce DNA zahrnuje také klony DNA molekul, které jsou takto modifikovány. Pojmy expresní vektor a expresní plazmid jsou definovány jako konstrukce DNA, která obsahuje iniciační místo transkripce a alespoň jeden strukturní gen kódující bílkovinu o kterou se jedná a která má byt produkována expresí v hostitelském organismu. Expresní vektor bude obvykle také obsahovat příslušné oblasti, jako je například promotor a terminátor, které řídí expresi příslušných proteinů v hostitelském organismu, a počátek replikace. Expresní vektory podle tohoto vynálezu budou obvykle obsahovat také selektovatelný markér, jako je například gen antibiotické rezistence nebo markér nutriční.

Pojem Konstrukce DNA zahrnuje také části expresního vektoru integrovaného do hostitelského chromozomu.

Pojem Plazmid má svůj obecně přijatý význam, tj. znamená autonomně se replikující konstrukci DNA, obvykle uzavřenou smyčku.

Pojem signální peptid se týká části primárního translačního produktu, který směřuje produkt do sekreční cesty buňky, která ho produkuje. Signální peptid se během tohoto procesu obvykle odštěpí od zbytku nascentního polypeptidu signální peptidázou. Signální peptid je charakterizován přítomností jednotlivých hydrofóbních aminokyselin, vyskytuje se na aminovém konci primárního translačního produktu a obvy kle představuje do délky' asi 17 až 25 aminokyselin. Místo štěpení signální peptidázou bylo charakterizováno von Heinjem [Eur. J. Biochem. 133, 17 (1983).]. Pojem signální peptid tak, jak je zde používán, může znamenat také funkční části přirozeně se vyskytujícího signálního peptidu.

Tento vynález umožňuje způsob vedení transformovaných buněk k produkci heterolognich proteinů sekreční cestou.

-4 CZ 284251 B6

Způsob výroby heterologního proteinu v hostitelském organismu spočívá podle vynálezu v tom, že se hostitelská buňka představovaná buňkou houby transformuje konstrukcí DNA. která zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BARI obsahujícího alespoň sekvenci kódující signální peptid, strukturní gen kódující uvedený heterologní protein a promotor, který 5 v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího signální peptid a heterologní protein, přičemž napojený protein se vyrábí v transformované buňce a je směrován do sekreční cesty buňky. Takto zpracované bílkoviny se mohou sekretovat do periplazmového prostoru nebo do kultivačního média. Kvasinkový- gen BARI kóduje Barrierovu aktivitu, o které se předpokládá, že je dána glykosy lovaným proteinem sekretovaným a buňkami S. cerevisiae.

Sekretovany Barrier umožňuje, aby buňky pohlavního typu překonaly uzávěr G1 indukovaný afaktorem. Předpokládá se, že Barrier může znamenat proteázu (viz Manney: J. Bacteriol. 155, 291 (1983).). Transkripce genu BARI je stimulována α-faktorem. Barrier nebo analogická aktivita není detegována v a nebo a/a buňkách. Gen BARI není v buňkách tohoto typu transkribován.

Na obrázku 1 je uvedena sekvence 2750 párů nukleotidů obklopující gen BARI spolu s odvozenou aminokyselinovou sekvencí primárního translačního produktu. ATG translační iniciační místo BARI je v poloze 681 fragmentu o přibližně 2750 párech nukleotidů uvedeného na obrázku 1. který- byl subklonován z fragmentu získaného z kvasinkové genomové banky 20 [Nasmyth a Tatchell: Cell 19, 753 (1980).]. Otevřený čtecí fragment začíná ATG kodonem na + 1 a vede až 1761 párů nukleotidů ve směru 3'. Zdá se. že sekvence prvních 24 aminokyselin primárního translačního produktu BARI je podobná se sekvencemi známých kvasinkových a savčích signálních peptidů. Tak alanin v poloze 24 může byt použit jako místo štěpení, stejně jako v kvasinkové invertáze a kyselinové fosfatáze. Ke štěpení může docházet také za amino25 kyselinou 23. V primárním translačním produktu existuje alespoň devět potenciálních asparagin vážících glykosylačních míst, ačkoliv rozsah glykosylace maturovaného sekretovaného Barriera není ještě znám. Promotor a regulační oblasti genu BARI jsou umístěny uvnitř oblasti o přibližně 680 párech nukleotidů na 5' straně iniciačního signálu translace; úplná promotorová funkce a odpověď na stimulaci α-faktoru je lokalizována vedle ATG, přibližně 680 párů 30 nukleotidů na 5' netranslované oblasti.

Konstrukce DNA podle tohoto vy nálezu s výhodou kódují místo štěpení na spojení Barriera a cizího proteinu. Takovým výhodným místem je místo štěpení KEX2, sekvence aminokyselin, která je rozeznávána a štěpena produktem genu KEX2 z S. cerevisiae [Julius a spol.: Cell 37, 35 1 075 (1984).]. Místo KEX2 je charakterisováno párem bazických aminokyselin, jako je například lysin a arginin. Výhodnou sekvencí místa KEX2 je Lys-Arg nebo Arg-Arg. BARI primární translační produkt obsahuje dva takové páry umístěné ve strukturní oblasti. Arg-Arg v poloze 177-178 a Lys-Lys v poloze 404-405. Jak bylo shora poznamenáno, gen KEX2 není zahrnut v opracovávání Barrierovy prekurzorové bílkoviny. Z toho lze odvodit, že potenciální 40 procesní (opracovávací) místa jsou blokována konformací proteinu nebo glykosylací a dále, že

Barrier se normálně může opracovávat jinou cestou než je ta, která se využívá takovými KEX2 opracovávanými proteiny, jako je alfa-faktor. Autoři tohoto vy nálezu však zjistili, že zahrnutím KEX2 procesního místa do napojeného proteinu obsahujícího část primárního translačního produktu genu BARI, obsahujícího jeho signální peptid, spolu s příslušnou bílkovinou, se 45 napojený protein štěpí v místě KEX2, což vede k sekreci příslušného proteinu. Bylo také zjištěno, že snížení účinnosti štěpení signální peptidázou části Barriera napojeného proteinu obsahujícího místo štěpení KEX2, zvyšuje hladinu exportovaného příslušného proteinu. Místo štěpení KEX2 lze získat ze sekvence BARI, z příslušného genu nebo může být zavedeno do napojení přidáním linkeru, místně specifickou mutací atd.

Podle tohoto vynálezu může být tedy část genu BARI obsahující ATG iniciační kodon a signální peptid kódující jeho sekvenci napojena na cizí příslušný gen a takto transformována do eukaryotické hostitelské buňky. Výsledný napojený gen zahrnuje místo opracování (procese),

-5 CZ 284251 B6 s výhodou místo štěpení KEX2, na spojení BARI a cizích sekvencí. Taková konstrukce může obsahovat také regulační oblasti a promotor z 5' ne-kódující oblasti genu BARI nebo může obsahovat regulační oblasti a/nebo promotory z jiných genů. Vedle promotoru z genu BARI mohou být použity také j iné promotory, mezi něž patří promotor*' z genů alkohol-dehydrogenázy 5 1 ze S. cerevisiae nebo alkohol-dehydrogenázy II, geny glykolvtických cest ze S. cerevisiae, jako je například TPI1 promotor a odpovídající geny z jiných druhů, včetně štěpení kvasinkou Schizosaccharomyces pombe [Russell a Halí: J. Biol. Chem. 258, 143 (1983) aRussell: Nátuře 301, 167 (1983).]. Gen S. cerevisiae alkohol-dehydrogenázy I byl popsán Amererem: Methods in Enzymology 101, 192 (1983). Gen Alkohol-dehydrogenázy II byl popsán Russellem a spol.: ío J. Biol. Chem. 258, 2674 (1983). Glykolytické geny ze S. cerevisiae byly popsány Kawasakim:

Ph. D.Thesis. University of Washington, 1979 aHitzemanem a spol.: J. Biol. Chem. 225. 12073 (1980), Kawasakim a Fraenkelem: Biochem. Biophys. Res. Comm. 108. 1107 (1982) a Alberem a Kawasakim: J. Mol. Appl. Genet. L 419 (1982). Ve výhodném uspořádání je vyměněn signální peptid kódující sekvenci genu BARI. Tím se sníží účinnost štěpení signální peptidázou 15 Barrierovy části napojení proteinu obsahující místo štěpení KEX2. Toho lze dosáhnout místně specifickou mutací potenciálních míst štěpení, s výhodou míst spojující aminokyseliny 23 a 24 (proteinové sekvence Barriera) nebo spojující aminokyseliny 24 a 25.

Způsoby, které se používají pro tvorbu konstrukcí DNA podle tohoto vynálezu, zahrnují 20 konvenční techniky. Strukturní gen BARI nebo jeho část a strukturní gen, který má být expresován, bude s výhodou pod kontrolou signálního promotoru. Způsoby ligace DNA fragmentů jsou obšírně popsány ajsou ve schopnostech odborníků. DNA kódující sekvence proteinu, který má být expresován, může být v podstatě kterýmkoli*’ proteinem, zvláště může znamenat proteiny obchodně důležité, jako jsou interferony, inzulín, proinzulin. α-1-antitrypsin, 25 růstové faktor* a tkáňový’ plazminogenový aktivátor.

Po přípravě konstrukce DNA obsahující gen BARI nebo jeho část a strukturní gen, který má být expresován, se konstrukce transformuje do hostitelského organismu za transformačních podmínek. Techniky pro transformování prokaryotů aeukaryotů (včetně savčích buněk) jsou 30 známé z literatury.

Hostitelským organismem je s výhodou kmen rostoucích kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Mohou se však používat i jiné druhy hub včetně štěpících kvasinek Schizosaccharomyces pombe a vláknitých hub Aspergillus nidulans a Neurospora sp.

Následující příklady jsou míněny jako příklady a ne jako omezení rozsahu vynálezu. Pokud není jinak uvedeno, používají se standardní metody molekulární biologie. Restrikční endonukleázy byly získány od Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs a Boehringer-Mannheim Biochemicals. Restrikční endonukleázy byly používány podle návodu výrobce, obvykle se pro 40 štěpení přidávala pankreatická RNAsa (10 pg/ml). T4 DNA ligáza byla získána od Bethesda Research Laboratories nebo Boehringer-Mannheim Biochemicals a byla používána podle návodu. Hostitelské kmeny Ml3 apUC a vektory byly získány od Bethesda Chemical Laboratories. Klonování M13 bylo děláno podle způsobu, který' popisuje Messing: Methods in Enzymology 101. 20 (1983). DNA polymeráza I (Klenowxiv fragment) byl používán podle 45 Maniatise a spol.: Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Kultury E. coli byly transformovány způsobem podle Bolivara a spol.: Gene 2. 95 (1977). Kultury S. cerevisiae byly transformovány způsobem podle Beggse: Nátuře 275. 104 (1978), který modifikoval MacKay: Methods in Enzymology 101, 325 (1983). S. Pombe se transformuje podle Russella: Nátuře 301, 167 (1983). Pohlavní feromon α-faktor byl připraven způsobem 50 podle Duntze a spol.: Eur. J. Biochem. 35, 357 (1973), podle modifikace Manneye a spol.: J.

Cell Biol. 96. 1592 (1983) nebo byl získán od Sigma Chemical Co. Oligonukleotidy byly syntetizovány na syntetizátoru Applied Biosystems Model 380A DNA syntetizér a vyčištěny elektroforézou na polyakrylamidovém gelu na denaturovaných gelech.

-6CZ 284251 B6

Test aktivity Barriera

Test, který-je používán pro detekci produkce Barriera transformovanými kvasinkovými buňkami, spočívá na schopnosti Barriera změnit inhibici růstu citlivých a buněk vystavených a-faktoru. Testovaný kmen je jedním z kmenů, které jsou abnormálně citlivé na α-faktor, jako je například RC629 (MATa Bari) protože neposkytuje žádnou Barrierovu aktivitu. Tento kmen se použije k přípravě trávníku ve vrstvě měkkého agaru na agarových deskách. K této vrstvě se přidá takové množství a-faktoru (0,05 až 1 jednotka, jak bylo zjištěno Manneyem), které postačuje k inhibici růstu buněk. Transformanty, které jsou testovány na produkci Barriera, jsou pak natečkovány na trávník. Sekrece Barriera transformovanými buňkami změní α-faktorem vyvolanou inhibici růstu v bezprostředním okolí skvrny, čímž umožní, aby se citlivé buňky regenerovaly-. Tylo buňky se pozorují jako lem rostoucí kolem normálně hladkého zakončení kolonie transformovaných buněk. Přítomnost tohoto lemu indikuje, že plazmid v transformovaném kmenu řídí expresi a sekreci Barriera.

Testy- IRI a IRC

Testy IRI a IRC se provádějí pomocí komerčně dostupných sad získaných od Novo Industri, Bagsvaerd, Dánsko. Norčí protivepřový inzulín a morčí protilidské C-peptidové protilátky se dodávají v rámci sad.

Test IRI mikrolitrů vzorku vNaFAM (0.04M fosforečnanový pufr. pH 7,4. který obsahuje hovězí serumalbumin) μΐ protilátky (zásobní roztok zředěný 1:30) až 24 hodin při teplotě 4 °C μΐ ¹²⁵I-inzulinu (zředěný 1:100) hodiny při teplotě 4 °C μΐ 1% Staphylococcus aureus v NaFAM minut při teplotě 0 °C promýt dvakrát 1% roztokem BSA/TNEN* odstřeďovat a spočítat pelety

Různé stupně se mohou s výhodou provádět v mikrotitrovacích destičkách, dokud se pelety nepřenesou do scintilačních fiol.

TEST IRC mikrolitrů vzorku v NaFAM mikrolitrů protilátky (zásobní roztok zředěný 1:50) až 24 hodin při teplotě 4 °C mikrolitrů ¹²⁵I-C peptidu (zásobní roztok zředěný 1:30) až 4 hodiny při teplotě 4 °C mikrolitrů 1% S. aureus in NaFAM minut při teplotě 0 °C promýt dvakrát 1% BSA/TNEN odstřeďovat a spočítat pelety + TNEN je 20 mM Tris, pH 8,0, 100 ml NaCl, 1 mM EDTA a 0,5 % NP-40.

-7CZ 284251 B6

Test alfa-faktorové aktivity

Test používaný pro detekci exportu α-faktoru transformovanými kvasinkami využívá schopnosti α-faktoru inhibovat růst citlivých a buněk. Testovaný kmen (jako například S. cerevisiae kmen RC629 (MATa barl) obsahuje v genu BARI mutaci, která zabraňuje produkci Barrierovy aktivity a poskytuje buňky supercitlivé na α-faktor. Na vrstvě měkkého agaru na desce standardního kvasinkového selektivního syntetického média (např. média bez leucinu) se připraví trávník testovaného kmene. Transformanty, které se mají testovat na export a-faktoru, se vy sejí na trávník a inkubují při 30 °C. Sekrece α-faktoru transformanty způsobí ínhibíci růstu v trávníku bezprostředně obklopujícím kolonii. Kruh inhibice růstu v trávníku testovaných buněk znamená, že kolonie exportuje aktivní α-faktor. Srovnání velikosti kruhů umožňuje odhadnout relativní množství α-faktoru exportovaného příslušným transformantem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese proinzulinu v S. cerevisiae pomocí genu BARI

Rekombinantní plazmid obsahující úplný kvasinkový genom se zkonstruuje [Nasmyth a Tatchell: Cell 19, 753 (1980).] pomocí binárního vektoru YEpl3 [Broach aspol.: Gene 8, 121 (1979).]. Kvasinkové DNA fragmenty, produkované částečným rozštěpením působením Sau 3A, se vloží do YEpl3 rozštěpeného působením Bam HI. Plazmid se použije pro transformaci S. cerevisiae kmen XP635-10C (MATa leu 2-3 leu 2-112 bar 1-1 gal2: ATCC č. 20 679). Vyberou se transformanty na leucinovou prototrofíi a nechají se růst na koncentraci α-faktoru, která inhibuje buňky barl. Výsledné kolonie se pak testují na schopnost sekretovat Barrierovu aktivitu. Byly nalezeny dvě kolonie, které nesou jak nezávislost na leucinu, tak schopnost sekretovat Barriera. Tyto kolonie nesou plazmidy označené pBAR2 a pBAR3.

Plazmidová DNA, která se izoluje z těchto dvou transformantů, se použije pro transformaci E.coli kmene RRI (ATCC č. 31343). Vyberou se transformanty na ampicilinovou rezistenci. Plazmidy pBAR2 a pBAR3 se vyčistí od E.coli transformantů. Charakterisují se štěpením restrikční endonukleázou a elektroforézou na agarosových nebo akrylamidových gelech. Plazmid pBAR2 obsahuje inzert o přibližně 9200 párech nukleotidů. E.coli RRI transformovaná plazmidem pBAR2 byla uložena v ATCC pod číslem 39 410.

Subklonování ukázalo, že pBAR3 plazmidový inzert obsahuje část inzertu pBAR2, ale je ve vektoru orientován opačným směrem. Další subklonování atestování na Barrierovu sekreci lokalizovalo funkční BARI genovou sekvenci v oblasti o přibližně 2750 párech nukleotidů. Tento fragment obsahuje kódující sekvenci, netranslované transkribované sekvence, promotor, regulační oblasti, transkripční terminátor a obklopující chromozomální sekvence.

Plazmid pBAR2 se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz Hind III a Xho I. Elektroforézou na agarosovém gelu se vyčistí fragment o velikosti přibližně 3000 párů nukleotidů. Tento fragment se vloží do plazmidu pUC13, který’ byl rozštěpen působením Hind ΙΠ a Sal I. Výsledný rekombinantní plazmid, který je označen pZV9 (obr. 2), se může použít pro transformaci E.coli, ale nemá nutný počátek replikace a selektovatelný markér pro kvasinkový vektor. Plazmid pZV9 v transformovaném kmenu E.coli RRI byl uložen v ATCC pod číslem 53 283.

-8CZ 284251 B6

Pro gen BARI, který se použije pro řízení sekrece proinzulinu, se používají fragmenty genu BARI obsahující 5' regulační oblast a část kódující oblasti. Napojení BARI a fragmentů proinzulinového genu se provede v příslušné čtecí oblasti a v tom bodě sekvence BARI, v němž může být výsledné napojení polypeptidu rozštěpeno, s výhodou in vivo. V genu BARI existuje 5 několik potenciálních míst štěpení. Jako testovací místo napojení s proinzulinem bylo vybráno místo Arg-Arg v poloze 177-178. 5'-Regulační sekvence a kódující sekvence o přibližně 800 párech nukleotidů z BARI se vyčistí z plazmidu pZV9 jako Hind 111-Sal I fragment o 1900 párech nukleotidů.

Na obrázku 3 je ukázán způsob subklonování lidské proinzulinové DNA. Lidská preproinzulinová cDNA (pře BCA klon), p27, se produkuje G-končícím Pst I rozštěpeným pBR327 a vložením C-končící DNA, připravené opačnou transkripcí celkové RNA z lidské slinivky břišní. Plazmid pBR327 je popsán Soberonem a spol.: Gene 9, 287 (1980). Sekvence lidského preproinzulinu je popsána Bellem a spol.: Nátuře 232, 525 (1979); úplná translatovaná sekvence byla odštěpena i? jako Nco I - Hga I fragment. Přečnívající konce se doplní DNA-polymerázou 1 (Klenowův fragment), současně se připojí syntetické Eco R1 linkery (GGAATTCC) a Xba 1 linkery (CTCTAGAG). Fragment se subklonuje do pUC13 [Vieira a Messing: Gene 19. 259 (1982) a Messing: Methods In Enzymology 101. 20 (1983).], který byl rozštěpen působením EcoRI aXbal. Jelikož přidání EcoRI linkeru na konci 5' restauruje místo Ncol (CCATGG) na iniciačním kodonu, plazmidv se testují na přítomnost míst EcoRI, Nco I a Xba I obklopujících inzert o 340 párech nukleotidů. Plazmid, který má tylo vlastnosti, se označí p47, jako ukazuje obrázek 3. Proinzulinový (BCA) fragment se zarovnaným 5' koncem se regeneruje opravnou syntézou primeru plazmidu p47 [Lawn a spol.: Nucl. Acids Res. 9. 6103 (1981).]. Následná štěpení působením Xba 1 poskytují fragment o 270 párech nukleotidů, který' se vloží do pUC12 [Vieira a Messing: viz výše a Messing: viz výše], Vektor se připraví štěpením působením Hind III. zarovnáním konců působením DNA polvmerázy I (Klenowův fragment), štěpením působením Xba I a vyčištěním na gelu. Výsledný vektorový fragment, obsahující zarovnaný konec a Xba I přečnívající konce, se liguje do shora uvedeného BCA fragmentu. Jelikož maturovaný BCA počíná aminokyselinou fenylalaninem (kodon TTT), ligací zarovnaných konců obou fragmentů se na spojení regeneruje místo Hind III. Plazmidy se testují nejdříve na regeneraci místa Hind III a pak sekvenováním podél spojení použitím sekvenujíciho primeru M13. Plazmid p254 má správnou sekvenci.

Na obrázku 4 je vidět, že plazmid p254 se rozštěpí působením restrikčních endonukleáz Hind III a EcoRI. Proinzulinový fragment o přibližně 270 párech nukleotidů se vyčistí na gelu. Konce fragmentu se zarovnají DNA polymerázou I (Klenowův fragment) spolu s deoxynukleotidtrifosfáty. Sal I linkerové sekvence (GGTCGACC) se zpracují působením T4 polynukleotid kinázy ay-³²P-ATP a ligují se na zarovnané konce proinzulinového fragmentu. Štěpení působením Sáli a Bam HI a následující elektroforéza na 1,5% agarosovém gelu poskytne proinzulinový fragment se Sal I a Bam HI kohezivními (lepivými) konci.

Proinzulinový fragment a fragment BARI o 1900 párech nukleotidů se spolu ligují do pUC13, který’ byl rozštěpen působením Hind III a Bam HI. Tato konstrukce se použije pro transformaci E.cóli K12 (JM83).

Transformované buňky se testují na ampicilinovou rezistenci a na produkci bílých kolonií. Další testování štěpením restrikčními endonukleázami Hind III, Bam HI a Sal I identifikuje plazmid (pZV27) obsahující Hind III - Bam HI fragment patřičné velikosti s jediným Sal I místem.

Aby se první aminoky selina proinzulinu napojila na Arg-Arg potenciální opracovávací místo produktu genu BARI, vynechá se v napojení BARl-proinzulin intervenující materiál. Pro řízení odstranění těchto cizích materiálů ze smyčky' se použijí syntetické oligonukleotidy následujícím způsobem. Na obrázku 4 je ukázáno, že plazmid pZV27 se rozštěpí působením Hind III

-9CZ 284251 B6 a Bam HI. Na gelu se vyčistí fragment napojení Barl-proinzulin o přibližně 2200 párech nukleotidů. Tento fragment se pak vloží do replikativní formy fágového vektoru M13mpll [Messing: Meth. In Enzymology 101. 20 (1983).]. který' se rozštěpí působením Hind III a Bam HI. Tato rekombinantní DNA se použije pro transfekci E.coli K12 (JM103) (Messing: viz výše). Vyberou se bílé plaky. Replikativní formy rekombinantního fágu se testují na správný restrikční vzorek dvojnásobným enzymovým štěpením použitím Hind III a Sal I a Sal I spolu s Bam HI. Konstrukce, která vykazuje žádaný vzor, je známa jako mpll-ZV29. Oligonukleotidový primer (sekvence: 3' GGATCTTCTAAACACTTG 5') se označí pomocí γ-³²Ρ-ΑΤΡ a T4 polynukleotidkinázy. 7,5 Pikomolu kinázového primeru se pak spojí s 80 ng sekvenujícího primeru M13 (Bethesda Research Laboratories, Inc.). Tato směs se aneluje na 2 pg jednovláknového mpll-ZV29. Druhé vlákno se prodlouží pomocí T4 DNA ligázy a DNA polymerázy I (Klenovvův fragment), jak je popsáno pro oligonukleotidově řízenou mutaci (metoda dvou primerů) Zollerem a spol. (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983.). DNA, která se tímto způsobem připraví, se použije pro transfekci E.coli K12 (JMI03). Plaky se testují pomocí kinázového oligomeru jako sondy (Zoller a spol.: viz výše). Takto identifikované plaky se použijí pro přípravu fág replikující formy (RF) DNA (Messing: viz výše.). Štěpení RF DNA restrikčním enzymem identifikuje dva klony, které mají příslušný Xba I restrikční vzor (fragmenty o 7500. 810 a 650 párech nukleotidů), ale kterým chybí restrikční místo Sal I (které bylo přítomno v deletované oblasti napojení BAR1proinzulin).

RF DNA z těchto dvou klonů se rozštěpí působením Hind III a Bam HI. Na gelu se vyčistí fragment napojení o 1900 párech nukleotidů z každého klonu. Tyto fragmenty se lisují do vektorů pUC13 a YEpl3 [Broach a spol.: Gene 8. 121 (199).]. které byly rozštěpeny působením Hind III a Bam HI. Hybridní plazmidy pUC/BARl-proinzulin pro následné sekvenování se použijí pro transformaci E.coli K12 (JM83). Dva z těchto plazmidů se označí pZV32 a pZV33. Rekombinanty odvozené od YEpl3 se použijí pro transformaci E.coli RR1 [Nasmyth a Reed: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77. 2119 (1980).]. Dva z těchto plazmidů se označí pZV30 a pZV31 (obrázek 4).

Plazmidy pZV32 a pZV33 se sekvenují způsobem podle Maxama a Gilberta [Meth. in Enzymology 65. 57 (1980.)]. Napojení BARl-proinzulin se sekvenuje od místa Bgl II. které je umístěno přibližně 190 párů nukleotidů k 5' straně spojení a od místa Sau 961. které je umístěno přibližně 140 párů nukleotidů k 3' straně spojení (v proinzulinovém genu). Data z těchto pokusů potvrdila, že došlo ke zkonstruování žádaného napojení mezi genem BARI a genem proinzulinu.

S. cerevisiae kmen XP635-10C se transformuje plazmidy pZV30 apZV31. Jeden litr kultury se nechá růst ve standardním syntetickém médiu bez leucinu. Po 34 hodinách se k 10 ml podílům každé kultury přidá α-faktor. Po dalších 11 hodinách se kultury odstřeďují. Buněčné pelety a supematanty se testují na přítomnost inzulínu nebo inzulínu podobného materiálu. Výsledky dvou takových testů supematantu kultury' transformované plazmidem pZV31 ukázaly 3 pmoly materiálu IRI na ml kultivačního média a 5,8 pmolů materiálu IRC na ml kultivačního média. IRI je správně orientovaný inzulín, proinzulin nebo jejich degradační produkty. IRC je volný C-peptid. nesprávně orientovaný proinzulin nebo jeho degradační produkty.

Příklad 2

Exprese proinzulinu v S. cerevisiae použitím promotoru alkohol-dehydrogenázy I, genu BARI a terminátoru trioso-fosfátizomerázy.

Promotor alkohol-dehydrogenázy I S. cerevisiae (dále zde uváděný jako ADHI promotor známý také jako ADCI promotor) se testuje pro použití při řízení exprese cizích polypeptidů ve spojení

- 10 CZ 284251 B6 se sekvencemi BARI. Zkonstruuje se plazmid obsahující tyto sekvence. Plazmid pZV50 (obrázek 5B) obsahuje ADHI promotor S. cerevisiae, shora popsané napojení BARI-pro inzulín a gen terminátorové oblasti trioso-fosfátizomerázy S. cerevisiae (TPI1) [Alber aKawasaki: J. Molec. Appl. Genet. 1, 419 (1982).]. Plazmid se zkonstruuje následujícím způsobem. Plazmid pAH5 (Amerer: viz výše) uvedený na obrázku 5A se rozštěpí působením Hind III a Brna HI. Na gelu se vyčistí ADHI promotorový fragment o 1500 párů nukleotidů. Tento fragment spolu s Hind III - EcoRI polylinkerovým fragmentem z PUC13 se vloží do EcoRI a Bam HI rozštěpeného plazmidu pBR327 za použití T4 DNA ligázy. Výsledný plazmid označený pAM5 se rozštěpí působením Sphl a Xba I. Na 2% agarosovém gelu se vyčistí fragment promotoru ADHI, který má přibližně 400 párů nukleotidů. Plazmid pZV9 se rozštěpí působením Xba I. BARI fragment o přibližně 2000 párech nukleotidů, který' obsahuje úplnou kódovací oblast BARI, se vyčistí na gelu podobným způsobem. Tyto dva fragmenty (ADHI promotor a sekvence BARI) se ligují do plazmidu YEpl3, který’ byl rozštěpen působením restrikčních endonukleáz Xba I a Sph I. Získá se tak plazmid pZV24. Rozštěpením plazmidu pZV24 působením sSph I aBgl II a následujícím vyčištěním na gelu se získá napojeni ADHI promotor - BAR 1 o přibližně 800 párech nukleotidů, které obsahuje ATG iniciační translační kodon, ale neobsahuje kodony pro potenciální opracovávání v místě Arg-Arg. Plazmid pZV33, který obsahuje napojení BARl-proinzulin, se rozštěpí působením Bgl II a Xba I a fragment napojení (asi 500 párů nukleotidů), který obsahuje kodony Arg-Arg, se vyčistí.

TPI1 terminátor (uvedený na obrázku 6) se získá z plazmidu pF61 (Alber a Kawasaki: viz výše). Plazmid pF61 se rozštěpí působením EcoRI. Linearizované konce plazmidu se zarovnají DNA polymerázou I (Klenowův fragment) a přidají se Bam HI linkerové sekvence (CGGATCCA). Fragment se rozštěpí působením Bam HI a opětovně se liguje za vzniku plazmidu pl36. TPI1 terminátor o 700 párech nukleotidů se vyčistí z plazmidu p!36 jako Xba Ι-Bam HI fragment. Tento fragment se vloží do plazmidu YEpl3, který byl rozštěpen působením Xba I a Bam HI, rozštěpí se působením Hind III, konce se zarovnají působením DNA polymerázy I (Klenowův fragment) a opětovnou ligací se získá plazmid p270. TPI1 terminátor se vyčistí z plazmidu p270 jako Xba Ι-Bam HI fragment a vloží se do plazmidu pUC13, který- se před tím rozštěpí působením Xba I a Bam HI. Získá se tak plazmid ml 15.

TPI1 terminátor (obr. 5B) se z plazmidu ml 15 odstraní rozštěpením působením Xba I a Sst I a následujícím vyčištěním na gelu. Do plazmidu pUC18 [Norrander a spol.: Gene 26. 101 (1983).]. který’ se rozštěpí působením Sphl a Sst I. se vloží tři fragmenty: napojení ADH1-BAR1, napojení BARl-proinzulin a TP11 terminátor. Tato DNA se použije pro transformaci E.coli K12 (JM83). Selekcí na ampicilinovou rezistenci atestováním na produkci bílých kolinií se identifikuje plazmid (pZV45), kteiý obsahuje žádané inzerty. Plazmid pZV45 se následně rozštěpí působením Sph I a Bam HI. Na gelu se vyčistí sekvence ADHI-BARl-proinzulin-TPIl terminátor. Plazmid YEpl3 se rozštěpí působením Sph I a Bam HI. Do tohoto rozštěpeného fragmentu se vloží fragment ADHI-BARl-Proinzulin-TPIl terminátor. Získá se tak S. cerevisiae expresní vektor pZV50.

S.cerevisiae kmen XP635-10C se transformuje plazmidem pZV50, kultivuje atestuje jak shora popsáno v příkladu 1. V médiu nebyl nalezen žádný materiál IRI, materiálu IRC bylo méně než 0,5 pmolů na mililitr. Buňky, které byly extrahovány 0,1% Nonidetem P-40, vykazovaly 1 pmol materiálu IRC na ml buněčného extraktu.

-11CZ 284251 B6

Příklad 3

Exprese proinzulinu v Schizosaccharomyces pombe použitím genu BARI a promotoru S. pombe alkohol-dehydrogenázy.

Tento příklad demonstruje použití částí genu BARI pro řízení sekrece cizích polypeptidů. které jsou získávány expresí v transformovaném hostiteli Schizosaccharomyces pombe. Zkonstruuje se plazmid, který kombinuje promotor genu S.pombe alkohol-dehydrogenázy (ADH) a napojení BARl-proinzulinový gen.

Promotor S. pombe ADH se získá z banky DNA fragmentů odvozených od S. pombe kmene 972h(ATCC č. 24 843), který byl klonován do plazmidu YEpl3 jak popsali Russell a Halí [J. Biol. Chem. 258, 143 (1983).]. Promotorová sekvence se vyčistí jako Sph I-EcoRI fragment o 750 párech nukleotidů. Tento fragment a Eco RI - Hind III polylinkerový fragment z plazmidu pUC12 se liguje do plazmidu YEpl3, který byl před tím rozštěpen působením Sph I a Hind III. Výsledný plazmid je známý jako plazmid pEVP-11.

Při konstrukci S. pombe expresního vektoru (obrázek 7) se ADH promotor vyčistí od pEVP-11 jako Sph 1-Xba I fragment. Plazmid pZV33 se rozštěpí působením Xba I a Bgl II. Vyčistí se fragment BARI o asi 340 párech nukleotidů, který' obsahuje ATG iniciační kodon. Plazmid pZV33 se rozštěpí působením Bgl II a Sst I a sekvence napojení BARl-proinzulin se vyčistí. Tyto tři fragmenty se spojí s plazmidem pUC18, předem rozštěpeným působením Sph I a Sst I. Získá se plazmid pZV46. Jelikož plazmid pUC18 není efektivní při transformaci S.pombe, plazmid se podrobí dvojnásobnému štěpení enzymem. Fragment napojení ADH promotor-BARl se vyčistí od Hind III a Bgl II štěpů a sekvence napojení BARl-proinzulin se vyčistí od Bgl II a Xba I štěpů. Tyto fragmenty se vloží do plazmidu YEpl3, rozštěpeného předem působením Hind III a Xba I. Získá se S. pombe expresní vektor pZV49.

Jeden litr kultury' tranformovaného S. pombe kmen 118-4h‘(ATCC č. 20680) se nechá růst 36 hodin při teplotě 30 °C ve standardním kvasinkovém sy ntetickém médiu (-leu D). které obsahuje 200 mg/1 kyseliny aspargové, 100 mg/1 histidinu, 100 mg'l adeninu a 100 mg/1 uracilu. Kultury se centrifugují a supematanty se testují testy' IRI a IRC. Dva vzorky z buněk, které byly transformovány plazmidem pZV49, obsahovaly 1,6 pikomolu rnl materiálu IRI a 0.5 pmolů/ml reaktivního materiálu IRC. Kontrolní vzorky' z kultury' transformované plazmidem YEpl3 neobsahovaly žádný detegovatelný reaktivní materiál IRC.

Příklad 4

Export alfa-faktoru za použití signálního peptidu BARI

Signální peptid BARI se testuje na schopnost řídit export alfa-faktoru z kvasinkového transformantu. Zkonstruuje se několik plazmidů obsahujících DNA fragmenty, které kódují napojení proteinů různých délek (z proteinu BARI) a 1 nebo 4 kopie maturovaného a-faktoru. Tyto plazmidy se transformují do a/α diploidního hostitelského kmene. Transformanty se testují na produkci α-faktoru kruhovým testem.

Plazmidy pSW94, pSW95, pSW96 a pSW97 obsahují promotor S. cerevisiae trioso-fosfátizomerázy (TPI1) fragment genu BARI o 355 párech nukleotidů nebo 756 párech nukleotidů (obsahující 114 nebo 251 kodonů z 5' konce sekvence kódující BARI) a buď jeden, nebo čtyři kopie genu sekvence kódující alfa-faktor (MFal). Tyto konstrukce jsou popsány v tabulce 1.

- 12 CZ 284251 B6

Tabulka 1

plazmid	fragment BAR 1	a-faktor
pSW94	355 párů nukleotidů	4 kopie
pSW95	767 párů nukleotidů	4 kopie
pSW96	355 párů nukleotidů	1 kopie
pSW97	767 párů nukleotidů	1 kopie

Plazmid pM220 (známý také jako plazmid pM210) byl použit jako zdroj fragmentu promotoru ίο TPI1. E.coli RRJ transformovaná plazmidem pM220 je uložena v ATCC pod číslem 39853.

Plazmid pM220 se rozštěpí působením EcoRl. Elektroforézou na agarosovém gelu se izoluje fragment o 900 párech nukleotidů, který' obsahuje TPI1 promotor. Konce se zarovnají DNA polymerázou I (Klenowův fragment). K fragmentu se přidají kinázované Xba I linkery. Tento fragment se pak rozštěpí působením Bgl II a Xba I. Tento modifikovaný TPI1 promotorový 15 fragment se liguje do Bgl II - Xba I vektorového fragmentu (o 3400 párech nukleotidů) z plazmidu pDR1107. Získá se plazmid pZV118. Plazmid pDR1107 se zkonstruuje subklonováním Bgl II-EcoRI TPI1 promotorového fragmentu (o 900 párech nukleotidů) zplazmidu pM220 do plazmidu pIC7 [Marsh, Erfle a Wykes: Gene 32. 481 (1984).]. čímž se generuje plazmid pDRllOl. Plazmid pDRHOl se štěpí působením Hind 111 a Sph 1. Izoluje se částečný fragment 20 promotoru TPI1 o 700 párech nukleotidů. Plazmid pDRllOO. obsahující Xba 1-Bam HI TP11 terminátoro\ý fragment o 800 párech nukleotidů z plazmidu pM220 subklonovaného do plazmidu pUC18, se rozštěpí působením Hind III a Sph I. Částečný promotor TPI1 o 700 párech nukleotidů se liguje do linearizovaného plazmidu pDRl 100, přičemž se získá plazmid pDRl 107. Potom se zničí místo EcoRl na 3' konci promotoru TPI1 v plazmidu pZVl 18. Plazmid se rozštěpí 25 působením Hind III a EcoRl. Izoluje se fragment o 900 párech nukleotidů a ten se liguje do syntetického linkeru zkonstruovaného anelováním oligonukleotidů ZC708 (5'AATTGCTCGAGT 3') aZC709 (3'CGAGCTCAGTC 5'). Adice linkeru eliminuje místo EcoRl na 3' konci TPI1 promotorového fragmentu a přidává místa Xho I a Xba 1. Tento fragment se pak spojí s plazmidem pUC13. který se před tím rozštěpí působením restrikčních endonukleáz 30 Hind III a Xba I.

Výsledný plazmid se označí pZV134 (obrázek 8).

Klonování genu kvasinkového pohlavního feromonu α-faktoru (MFal) bylo popsáno Kurjanem 35 a Herskovvitzem (viz výše). Gen byl v této laboratoři a podobným způsobem izolován z kvasinkové genomové banky částečných Sau 3A fragmentů klonovaných do místa Bam HI plazmidu YEpl3 [Nasmyth a Tatchell Cell 19. 753 (1980).]. Z této banky se izoluje plazmid, který- expresí dává α-faktor v diploidním kmenu kvasinek homozygotních pro mutaci mata2-34 [Manney a spol.: J. Cell. Biol. 96, 1592 (1983).]. Klon obsahoval inzert překrývající se s genem MFal, 40 který charakterisovali Kurjan a Herskowitz. Tento plazmid, známý jako pZA2, se rozštěpí působením EcoRl. Izoluje se fragment o 1700 párech nukleotidů, který se liguje do plazmidu pUC13 rozštěpeného působením EcoRl. Výsledný plazmid, označený pl92, se rozštěpí působením EcoRl. Izoluje se výsledný fragment MFal o 1700 párech nukleotidů a tento fragment se rozštěpí působením restrikční endonukleázy Mbo II. Mbo II-EcoRI fragment 45 o 550 párech nukleotidů se izoluje a liguje do kinázovaného Sal I linkeru. Navázaný fragment se rozštěpí působením Sal 1. Výsledný Sal I fragment o 300 párech nukleotidů se liguje do plazmidu pUC4 rozštěpeného působením Sal I [Vieira aMessing: Gene 19, 259 (1982).]. Získá se plazmid. který je označen p489 (na obrázku 9).

Zkonstruuje se napojení genu obsahujícího části BARI (114 kodonů) a kódující sekvenci MFal. Plazmid pZV24 (příklad 2) se rozštěpí působením Sph I a Bgl II. Izoluje se fragment ADHI promotor-Barl fragment o 800 párech nukleotidů. Plazmid p489 se rozštěpí působením Bam HI. Izoluje se fragment MFal o 300 párech nukleotidů. Tylo dva fragmenty se spojí do tří-čátečkové

- 13 CZ 284251 B6 ligaci do plazmidu YEpl3 rozštěpeného působením Sph I a Bam HI. Výsledný plazmid se označí pZV69 (obrázek 11).

Zkonstruuje se druhé napojení genu kódující 251 aminokyselinu Barriera napojených na část prekurzoru α-faktoru. Plazmid pZV16, který obsahuje Xba I-Sal I BARI fragment o 767 párech nukleotidů z plazmidu pZV9 (příklad 1) ligovaný do plazmidu pUC13, který· se předem rozštěpí působením Xba I a Sal I, se linearizuje rozštěpením působením Sal I. Tento fragment o 400 párech nukleotidů se spojí se Sal I fragmentem o 300 párech nukleotidů z plazmidu p489 kódujícím čtyři kopie alfa-faktoru. Plazmid, který' má napojení BARl-MFal ve správné orientaci, se označí pZV71. Napojení BARl-MFal z plazmidu pZV71 se pak napojí na promotor ADH1. Plazmid pZV71 se rozštěpí působením Xba I a Pst I a izoluje se fragment o 1070 párech nukleotidů. Promotor ADHI se izoluje jako Sph 1-Xba I fragment (o 420 párech nukleotidů) z plazmidu pZV24. Tyto dva fragmenty se spojí v třídílné ligaci s plazmidem pUC18, který’ se před tím rozštěpí působením Sph I a Pst 1. Výsledný plazmid pZV73 se rozštěpí působením Sph 1 a Bam HI. Izoluje se fragment o 1500 párech nukleotidů obsahující expresní jednotku. Tento fragment se liguje do plazmidu YEpl3, který- se rozštěpí působením Sph I a Bam HI. Vznikne plazmid pZV75 (obrázek 10).

Pro snadnou manipulaci se jednotky napojení BARl-MFal z plazmidu pZV69 a pZV75 subklonují s promotorem TPI1 do plazmidu pUC18 (Obrázek 11). Plazmid pZV69 se rozštěpí působením EcoRJ a Bam HI. Izoluje se fragment o 550 párech nukleotidů, který- obsahuje napojení. Fragment promotoru TPI1 o 900 párech nukleotidů se izoluje z plazmidu pZV118 rozštěpením působením Hind III a EcoRI. Třídílná ligace se provede použitím fragmentu BARl-MFal o 550 párech nukleotidů fragmentu promotoru TPI1 o 900 párech nukleotidů a plazmidu pUC19, který je rozštěpen působením Hind III a Bam HI. Výsledný plazmid se označí pSW59. Plazmid pZV75 se rozštěpí působením EcoRI a Bam Hl. Izoluje se fragment napojení BARl-MFal o 954 párech nukleotidů. Tento BARl-MFal fragment se liguje v třídílné ligaci s Hind III - EcoRI TPI1 promotorovým fragmentem o 900 párech nukleotidů a s plazmidem pUC18 rozštěpeným působením Hind III a Bam HI. Generuje se plazmid pSW60.

Při konstrukci expresních plazmidů se jako zdroj 5'sekvence kódující BARI o 116 párech nukleotidů použije plazmid pSW22, který se zkonstruuje následujícím způsobem (obrázek 12). Oblast kódující BARI nalezený v plazmidu pSW22 pochází od pZV9. Plazmid pZV9 (příklad 1) se rozštěpí působením Sal I a Bam HI. Izoluje se fragment BARI o 1300 párech nukleotidů. Tento fragment se subklonuje do plazmidu pUC13, který'je rozštěpen působením Sal I a Bam HI. Získá se tak plazmid, který je označen pZV17. Plazmid pZV17 se rozštěpí působením EcoRI, aby se odstranila 3' největší oblast kódující BARI o 500 párech nukleotidů. Vektorový fragment BARI se opětovně liguje. Vytvoří se plazmid označený pJH66. Plazmid pJH66 se linearizuje působením EcoRI. Konce se zarovnají Klenowovým fragmentem. Přidají se linearizované Bam HI linkery (5’ CCGGATCCGG 3’). Nadbytek linkerů se odstraní rozštěpením působením Bam HI před opětovnou ligaci. Výsledný plazmid pSW8 se pak rozštěpí působením Sal I a Bam HI. Izoluje se fragment o 824 párech nukleotidů kódující aminokyseliny 252 až 525 BARI. Tento fragment BARI se napojí na fragment kódující C-terminální část látky P [Munro a Pelham: EMBO J. 3, 3087 (1984).]. Plazmid pPM2 obsahující syntetickou oligonukleotidovou sekvenci kódující dimerovou formu látky P v M13mp8, byl získán od Munroa a Pellhama. Plazmid pPM2 se linearizuje rozštěpením působením Bam HI a Sal I a liguje se s fragmentem BARI o 824 párech nukleotidů. Výsledný plazmid pSW14 se rozštěpí působením Sal I a Sma I. Izoluje se fragment BARI látky P o 871 párech nukleotidů. Plazmid pZV16 (obrázek 10) se rozštěpí působením Xba 1 a Sal I. Izoluje se 5' kódující sekvence BARI o 767 párech nukleotidů. Tento fragment se liguje s fragmentem BARI látky P o 871 párech nukleotidů v třídílné ligaci s plazmidem pUC18 rozštěpeným působením Xba I a Sma I. Výsledný plazmid se označí pSW15. Plazmid pSW15 se rozštěpí působením Xba I a Sma I. Izoluje se fragment BARI látky P o 1640 párech nukleotidů. Promotor ADHI se získá z plazmidu pRL029, který obsahuje Sph

- 14 CZ 284251 B6

I-EcoRI fragment o 540 párech nukleotidů obsahující promotor ADH1 a 5' kódující oblast BARI o 116 párech nukleotidů zplazmidu pZV24 vpIJC18. Plazmid pRL029 se rozštěpí působením Sph I aXba 1. Izoluje se fragment promotoru ADH1 o 420 párech nukleotidů. Terminátor TPI1 [Alber aKavvasaki: J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 (1982).] se získá jako Xba I-EcoRI fragment 5 v pUC18 o 700 párech nukleotidů. Linearizovaný fragment obsahující terminátor TPI1 a pUC18 s Klenowem doplněným Xba I koncem a Sph 1 koncem se liguje s fragmentem promotoru ADH1 o 420 párech nukleotidů a s fragmentem BARI látky P o 1640 párech nukleotidů v třídílné ligaci. Poskytuje tak plazmid pSW22.

ío Potom se zkonstruuje plazmid pSW94 (obrázek 13). Fragment o 2300 párech nukleotidů obsahující napojení BARl-látka P a terminátor TPI1 se izoluje zpSW22 jako Xba I-Sst fragment. Hind ΠΙ-Xba I TPI1 promotorový fragment izolovaný z plazmidu pZV134 se napojí na fragment BARl-látka P-TPI1 promotorový fragment v třídílné ligaci s plazmidem pUC18, který se předem rozštěpí působením Hind III a Sst I. Výsledný plazmid pSW8I se rozštěpí působením 15 Hind III a EcoRI. Izoluje se fragment o 1020 párech nukleotidů obsahující promotor TP11 o 1020 párech nukleotidů a 5' BARI o 116 párech nukleotidů. Plazmid pSW59 se rozštěpí působením EcoRI a Bam Hl. Izoluje se fragment napojení BARl-MFal o 550 párech nukleotidů. Tento fragment se pak liguje v třídílné ligaci s fragmentem TPI1 promotor-BARl zplazmidu pSW81 aYEplS linearizovaných působením Hind III aBam Hl. Výsledkem je 20 plazmid pSW94.

Konstrukce pSW95 je ilustrována na obrázku 13. Plazmid pSW60 se rozštěpí působením EcoRI a Bam Hl. Izoluje se fragment napojení BARl-MFal o 954 párech nukleotidů. Plazmid pSW61 se rozštěpí působením Hind III a EcoRI. Izoluje se TPI1 promotor-BARl o 1020 párech 25 nukleotidů, který' se spojí s fragmentem napojení BARl-MFal v třídílné ligaci s plazmidem

YEpl3, který' se před tím rozštěpí působením Hind III a Bam Hl. Výsledný plazmid se označí pSW95.

Konstrukce napojení promotor TPI1-BARl-MFal obsahující pouze jednu kopii a-faktoru 30 pochází ze spojení BARl-MFal (kódující čtyři kopie a-faktoru), které obsahují promotor TPI1 a preprosekvenci MFal (viz obrázky 14, 15 a 16). Plazmid pZV16 se rozštěpí působením EcoRI a Sal I. Izolovaný fragment BARI o 651 párech nukleotidů se liguje s kinázovaným Hind IIIEcoRI BARI specifickým adaptorem (produkovaným anelací oligonukleotidů ZC566 5AGCTTTAACAAACGATGGCACTGGTCACTTAG3' aZC567 5'AATTCTAAGTGA35 CCAGTGCCATCGTTTGTTAA3') do plazmidu pUC13, který je rozštěpen působením restrikčních endonukleáz Hind III a Sal I. Výsledný plazmid pZV96 se rozštěpí působením Hind III a Sal I. Izoluje se fragment BARI o 684 párech nukleotidů. Plazmid pM220 poskytl promotor TPI1 napojený na prepro-sekvenci MFal. Působením BglII a Hind III se rozštěpí plazmid pM220. Izoluje se promotor TPIl-MFal preprofragment o 1200 párech nukleotidů. 3' část 40 oblasti kódující BARI se získá rozštěpením pZV9 působením Sal I a Bam Hl. Izoluje se fragment BARI o 1300 párech nukleotidů. Hind ΠΙ-Sal I BARI fragment o 684 párech nukleotidů Bgl II-Hind III TPI1 promotor-MFal preprofragment o 1200 párech nukleotidů a Sal Ι-Bam Hl BARI fragment o 1300 párech nukleotidů se spojí ve čtyřdílné ligaci s plazmidem YEpl3, který' je linearizován působením Bam Hl. Konstrukce s žádanou orientací promotoru 45 as napojením MFal-BARl se označuje pZVlOO (obrázek 14).

Kvůli snadné manipulaci se fragment napojení MFal preprosekvence-BARl vyseknutý' z plazmidu pZVlOO subklonuje do plazmidu pUC13 jako Pst 1-Bam Hl fragment o 1600 párech nukleotidů. Výsledný plazmid pZVlOl se rozštěpí působením Pst I a EcoRI. Izoluje se fragment 50 MFal prepro-BARl o 270 párech nukleotidů. Plazmid pZV69 se rozštěpí působením EcoRI a Bam Hl. Izoluje se fragment napojení BARl-MFal o 550 párech nukleotidů (kódující čtyři kopie α-faktoru). Tento fragment a fragment MFal prepro-BARl o 270 párech nukleotidů se

- 15 CZ 284251 B6 liguje v třídílné ligace do plazmidu pUC13, který byl rozštěpen působením Pst I a Bam HI. Výsledný plazmid se označí pZV102 (obrázek 15).

Potom se zkonstruuje expresní jednotka, která obsahuje promotor TPI1, část BARI ajednu kopii sekvence kódující α-faktor (obrázek 16). Plazmid pZV102 se rozštěpí působením Pst I a Bam HI. Izoluje se fragment MFal prepro-BARl o 820 párech nukleotidů. Hind III-Pst I fragment o 1000 párech nukleotidů, který obsahuje promotor TP11, a pre-pro-sekvence MFal, vyseknutá z plazmidu pM220, se napojí na fragment MFal prepro-BARl o 820 párech nukleotidů izolovaný z plazmidu pZV102 v třídílné ligaci s plazmidem YEpl3 rozštěpeným působením ío Hind III a Bam HI. Výsledný plazmid se označí pZV105. Plazmid pZV105 se účinkem Hind III rozštěpí. Izoluje se fragment promotor TPIl-MFal prepro o 1200 párech nukleotidů. Plazmid pZV102 se rozštěpí působením endonukleázy Hind III. Izoluje se vektorový fragment, který obsahuje kopii koncového α-faktoru. Tento fragment vektor-MFal o 2800 párech nukleotidů se liguje s fragmentem promotor TPIl-MFal prepro o 1200 párech nukleotidů. Plazmid se i? správnou orientací a s jedinou kopií sekvence kódující MFal se označí pSW61. Plazmid pSW61 se linearizuje částečným rozštěpením působením Hind III. Působením Hind III se rozštěpí plazmid pZV102 a izoluje se fragment BARI-MFal o 300 párech nukleotidů. Tento fragment se liguje do linearizovaného plazmidu pSW61. Plazmid s inzertem se správnou orientací v místě Hind III 264 párů nukleotidů na 3' konci od iniciačního kodonu MFal se označí pSW70.

Plazmid pSW70 se rozštěpí působením EcoRI a Bam HI. Izoluje se fragment BARl-MFal o 361 párech nukleotidů. Rozštěpením plazmidu pSW81 (obrázek 13) působením Hind III a EcoRI se izoluje fragment promotor TP11-BAR1 o 1200 párech nukleotidů. Tento fragment se připojí k fragmentu BARl-MFal v třídílné ligaci s plazmidem YEpl3 linearizovaným působením Hind III a Bam HI. Výsledný plazmid pSW96 obsahuje promotor TPI1 a 5' kódující 25 sekvenci BARI o 356 párech nukleotidů napojenou na jednu kopii sekvence kódující a-faktor.

Druhá konstrukce BARl-MFal obsahující 767 párů nukleotidů BARI napojených na jednu kopii sekvence kódující MFal se připraví použitím plazmidu pZV75 jako zdroje fragmentu BARI (obrázek 17). Plazmid pZV75 se rozštěpí působením EcoRI a Bam HI a izoluje se .'0 fragment BARl-MFal o 954 párech nukleotidů. Plazmid pZVlOl. který' obsahuje sekvenci MFal prepro napojenou na Bari, se rozštěpí působením Pst I a EcoRI. Izoluje se fragment MFal prepro-BARl o 270 párech nukleotidů. Tento fragment se spojí s fragmentem BARlMFal o 954 párech nukleotidů v třídílné ligaci s plazmidem pUC13, který· se před tím rozštěpí působením Pst 1 a Bam HI. Výsledný plazmid pZV104 se rozštěpí působením Hind III. Izoluje se 35 BARl-MFal fragment o 700 párech nukleotidů. Tento fragment se liguje s plazmidem pSW61, který byl zlinearizován částečným rozštěpením působením Hind III. Plazmid, který má inzert se správnou orientací v místě Hind III 264 párů nukleotidů od 3' iniciačního kodonu MFal, se označí pSW74. Plazmid pSW74 se pak rozštěpí působením Eco RI a Bam HI. Izoluje se fragment BARl-MFal o 738 párech nukleotidů. Plazmid pSW81 se rozštěpí působením Hind III a EcoRI 40 a izoluje se fragment promotor TPI1-BAR1 o 1020 párech nukleotidů. Tento fragment se napojí na fragment BARl-MFal o 738 párech nukleotidů v třídílné ligaci s plazmidem YEpl3, který se předem rozštěpí působením Hind III a Bam HI. Výsledný plazmid pSW97 obsahuje TPI1 promotor a 767 párů nukleotidů z 5' konce BARI napojené na jednu kopii sekvence kódující afaktor.

a/a-Diploidní S. cerevisiae kmen XP733 (MATa leu2-3 leu 2-112 bar 1 -1 gal2/MATa leu 2-3 leu 2-112 barl- 1 gal2) se tranformuje plazmidy pSW73, pSW94 apSW95. Plazmid pSW73 obsahuje promotor TPI1, signální peptid MFal, prepro sekvenci MFal a kódující oblast čtyř kopií α-faktoru v plazmidu YEpl3. Transformanty se nanesou na trávník buněk S. cerevisiae 50 RC629 ve vrstvě měkkého agaru na desce selektivního média a inkubují se přes noc při teplotě

-16CZ 284251 B6 °C. Ze srovnání velikosti kruhů použitím plazmidu pSW73 a kontroly vyplývá, že pSW94 exportuje přibližně 15 % α-faktoru ve srovnání s plazmidem pSW73.

Konstrukce obsahující BARI napojený na jednu kopii sekvence kódující MFal se testuje na 5 export α-faktoru stejným způsobem. Jako kontrola pro plazmidy pSW96 a pSW97 byl použit plazmid pSW67, který sestává z promotoru TPI1, signálního peptidu MFal, prepro MFal a oblasti kódující jednu kopii α-faktoru v plazmidu YEpl3. Srovnání velikosti kruhů ukazuje, že plazmid pSW96 řídí sekreci přibližně 30 až 40 % α-faktoru ve srovnání s plazmidem pSW67 a že plazmid pSW97 řídí sekreci přibližně 10 až 15% α-faktoru ve srovnání s plazmidem ío pSW67.

Příklad 5

Mutace místa štěpení signálního peptidu BARI

Jak bylo shora popsáno, bylo zjištěno, že při změně místa štěpení signálního peptidu prekurzoru Barriera lze očekávat usnadnění opracování a exportu proteinů obsahujících napojení s Barrierem prostřednictvím cesty KEX2. Potenciální místa štěpení jsou mezi aminokyselinami 20 23 a 24 a mezi aminokyselinami 24 a 25. DNA sekvence kódující primární translační produkt

BARI se tedy mutuje, takže v poloze 25 kóduje prolinový zbytek. Plazmidy pSW98 a pSW99 jsou plazmidy založené na plazmidu YEpl3 obsahující promotor S. cerevisiae TP11. fragment genu BARI o 355 párech nukleotidů a 767 párech nukleotidů, včetně mutovaného místa štěpení signálního peptidu, a jednu kopii sekvence kódující a-faktor.

Mutace signálního peptidu se zavede standardními mutačními metodami in vitro (Zoller a spol.: Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory. 1983.) pomocí templátu fágu M13 a syntetického mutagenního oligonukleotidu sekvence 5' ATTACTGCTCCTACAAACGAT 3'. Fágový templát pSW54 se zkonstruuje ligací 30 Sph 1-EcoRI fragmentu o 540 párech nukleotidů z pSW22 s M13mpl9 rozštěpeným působením

Sph I a EcoRI. Po in vitro mutaci se potenciálně mutované plaky testují hybridizací plaků '*P-značeným mutagenním oligonukleotidem. Sekvenováním se potvrdí přítomnost mutací. Replikativní forma jednoho z potvrzených mutovaných fágů mZC634-7 se rozštěpí působením Sph I a EcoRI. Izoluje se fragment o 540 párech nukleotidů, který se liguje do plazmidu pUC18 35 rozštěpeného působením Sph I a EcoRI. Výsledný plazmid pSW66 (obrázek 18) se rozštěpí působením Hind III aXba I, aby se odstranil promotor ADH1. Fragment, kteiý obsahuje sekvence vektoru BARI, se liguje sHind III-Xba I promotorem TPI1 o 900 párech nukleotidů získaným zplazmidu pZV139 působením Hind III aXba I. Tento plazmid s promotorem TPI1 a 119 páry nukleotidů z 5' konce BARI včetně mutace štěpení signálního peptidu se označí 40 pSW82.

Jak je vidět z obrázku 18, plazmid pSW82 se rozštěpí působením Hind III a EcoRI a Bgl II a EcoRI. Výsledný fragment o 1020 párech nukleotidů se izoluje. Hind ΠΙ-EcoRI fragment z plazmidu pSW82 se liguje s EcoRI-Bam H1 fragmentem plazmidu pSW74 a s plazmidem 45 YEpl3 rozštěpeným působením Hind III aBam HI za vzniku plazmidu pSW99. Bgl II-EcoRl fragment z plazmidu pSW82 se liguje s EcoRI-Bam HI fragmentem o 3000 párech nukleotidů zplazmidu pSW70 asplazmidem YEpl3 rozštěpeným působením Bam HI za vzniku plazmidu pSW98. Plazmid pSW98 zahrnuje promotor TPI1, 355 párů nukleotidů z 5' konce mutované sekvence BARI ajednu kopii sekvence kódující jednu kopii α-faktoru. Plazmid pSW99 50 obsahuje identickou expresní jednotku až na to, že mutovaná sekvence BARI má 767 párů nukleotidů.

- 17 CZ 284251 B6

Analýza kruhovým testem ukázala, že mutace místa štěpení zvýšila export α-faktoru, když se použijí plazmidy kódující jednu kopii alfa-faktoru. Transformanty obsahující plazmid pSW98 exportují asi o 50 % více α-faktoru než ty, které obsahují plazmid pSW96 (tj. při srovnání s nemutovaným typem).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (24)

1. Konstrukce DNA zahrnující část Saccharomyces cerevisiae genu BARI podle obr. 1 obsahujícího sekvenci kódující signální peptid, alespoň jeden strukturní gen cizí pro vybraného hostitele a promotor, který kontroluje expresi v buňkách hostitele transformovaného touto

15 konstrukcí, přičemž napojení polypeptidu nebo proteinu pochází zčásti genu BARI a strukturního genu.

2. Konstrukce DNA podle nároku 1, v níž napojený polypeptid nebo protein obsahuje místo KEX2 pro opracování.

3. Konstrukce DNA podle nároku 2, v níž napojená sekvence genu BARI kódující signální peptid je změněna tak, že snižuje účinnost štěpení napojeného polypeptidu nebo proteinu signální peptidázou.

25

4. Konstrukce DNA podle nároku 1, v níž promotor znamená promotor genu kvasinkové glykolytické cesty.

5. Konstrukce DNA podle nároku 1, v níž promotor je vybrán ze skupiny sestávající z S. cerevisiae promotoru BARI, S. cerevisiae promotoru alkoholdehydrogenázy I a Schizo-

30 saccharomyces pombe promotoru alkoholdehydrogenázy.

6. Konstrukce DNA podle nároku 5, přičemž tato konstrukce je vybrána ze skupiny sestávající z pXV30, pZV31, pZV49 a pZV50.

35

7. Konstrukce DNA podle nároku 1, která dále obsahuje oblast terminace transkripce

Saccharomyces cerevisiae genu triosofosfátizomerázy.

8. Konstrukce DNA podle nároku 1, přičemž část genu BARI dále obsahuje sekvenci 5' nepřeložené oblasti o 680 párech nukleotidů přilehlou k místě iniciace translace.

9. Transformovaná buňka, která obsahuje konstrukci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

10. Transformovaná buňka podle nároku 9, přičemž touto buňkou je buňka houby.

45

11. Tranformovaná buňka podle nároku 10, přičemž touto houbou je Saccharomyces cerevisiae.

12. Tranformovaná buňka podle nároku 10, přičemž touto houbou je Schizosaccharomyces pombe.

50

13. Tranformovaná buňka podle nároku 10, přičemž touto houbou je Aspergillus nebo

Neurospora.

- 18 CZ 284251 B6

14. Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce transformací hostitelské buňky konstrukcí DNA kódující uvedený heterologní protein a selektovatelný markér a pak kultivací transformované buňky za kultivačních podmínek vhodných pro výrobu heterologního proteinu, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka představovaná buňkou houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje část Saccharomyces cerevisiae genu BARI obsahujícího alespoň sekvenci kódující signální peptid, strukturní gen kódující uvedený heterologní protein a promotor, který v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího signální peptid a heterologní protein, přičemž napojený protein se vyrábí v transformované buňce a je směrován do sekreční cesty buňky.

15. Způsob podle nároku 14, Saccharomyces cerevisiae.

16. Způsob podle nároku 14, Schizosaccharomyces pombe.

17. Způsob podle nároku 14, Aspergillus nebo Neurospora.

vyznačující se tím, vyznačující se tím.

vyznačující se tím, že se jako houba použije že se jako houba použije že se jako houba použije

18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se buňka houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje promotor, který v transformované buňce kontroluje expresi napojeného proteinu obsahujícího místo KEX2 pro opracování.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se sekvence genu BARI kódující signální peptid změní místně specifickou mutací potenciálních míst štěpení, s výhodou míst spojujících aminokyseliny 23 a 24 nebo 24 a 25.

20. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se buňka houby transformuje konstrukcí DNA, která zahrnuje promotor vybraný ze skupiny sestávající z promotoru Saccharomyces cerevisiae BARI, promotoru Saccharomyces cerevisiae alkoholdehydrogenázy I a promotoru Schizosaccharomyces pombe alkoholdehydrogenázy.

21. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se buňka houby transformuje konstrukcí DNA. která jako promotor zahrnuje promotor genu kvasinkové glykolytické cesty.

22. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se buňka houby transformuje konstrukcí DNA vybranou ze skupiny sestávající z plazmidů pZV30, pZV31, pZV49 a pZV50.

23. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že heterologní protein se exportuje z buňky.

24. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se použije odpovídajícím způsobem výchozích látek za vzniku proteinu zahrnujícího proinzulin nebo inzulín.