DE69717092T2

DE69717092T2 - Gebrauch einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend ein appetitzügelndes Peptid

Info

Publication number: DE69717092T2
Application number: DE69717092T
Authority: DE
Inventors: Juul Holst; Edward Judge; Dragsbak Madsen; Lars Thim; Schjellerup Wulff
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: KR19990087439A; DE69738695D1; IL125805A0; CN1112367C; NO2013006I2; AU1871597A; EP1231218B1; DK0891378T3; BR9707807A; FR13C0009I1; WO1997031943A1; NO2013006I1; DE69740176D1; CN1215405A; JP4064460B2; UA70283C2; CA2246733A1; CZ297338B6; ES2306685T3; RU2197261C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend ein appetitzügelndes Peptid oder eine ein appetitzügelndes Peptid enthaltende Fraktion, wie auch ein Verfahren zum Erhalten einer Appetitregulation mittels dieses Peptids.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Glucagon wird von pankreatischen A-Zellen produziert und als Antwort auf niedrige Blutglukosespiegel freigesetzt. Sein Hauptwirkungsort ist die Leber, wo es die Glukoseproduktion stimuliert. Es ist daher das Haupthormon, das dem Insulin bei der Blutzuckerhomöostase entgegenwirkt (Unger, R. H. und L. Orci (1990). Glucagon, in: Diabetes mellitus, 4. Aufl. New York, Elsevier. SS. 104-120).
Glucagon wird aus einem größeren Vorläufer durch limitierte Proteolyse aufbereitet. Molekulares Klonieren des Glucagongens ergab, dass der Proglucagonvorläufer nicht nur Glucagon, sondern auch zwei zusätzliche Glucagon-ähnliche Peptide, genannt GLP-1 und GLP-2, enthielt. GLP-1 und GLP-2 sind auf getrennten Exons kodiert, was verschiedene biologische Aktivitäten nahe legt. Später wurde gezeigt, dass der Proglucagonvorläufer einem differenziellen Prozessieren in drei verschiedenen Geweben unterzogen wurde, von denen bekannt ist, dass sie Proglucagon produzieren: der pankreatischen A-Zelle, der intestinalen L-Zelle und im zentralen Nervensystem (ZNS). Glucagon wird so selektiv in der Insel-A- Zelle aus dem Vorläufer ausgeschnitten, wogegen GLP-1 und GLP-2 selektiv in der intestinalen L-Zelle und dem ZNS freigesetzt werden. [Übersicht in (Unger, R. H. und L. Orci (1990). Glucagon, in: Diabetes Mellitus, 4. Aufl. New York, Elsevier, SS. 104-120)].
Spezifische GLP-1-Rezeptoren wurden identifiziert (Thorens, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641-8645), die klar von dem Glucagonrezeptor verschieden sind (L. J. Jelinek, et al. (1993) Science 259: 1614-1616), und sie haben unterschiedliche Gewebeverteilungen (R. V. Campos, et al. (1994) Endocrinology 134: 2156-2164). GLP-1 wird aus L-Zellen nach einer Mahlzeit freigesetzt und wirkt als ein Secretinhormon (d. h. es potenziert die glucoseinduzierte Insulinfreisetzung aus den pankreatischen B-Zellen). Der GLP-1-Rezeptor ist daher auf der Oberfläche von Insel-B-Zellen in hohen Niveaus exprimiert (K. Moens, et al. (1996) Diabetes 45: 257-261).
Die Induktion intestinaler epithelialer Proliferation durch GLP-2 wurde gezeigt (Drucker, D. J. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7911-7916) und die Behandlung von gastrointestinalen Erkrankungen mit Zellen, die in GLP-2- Medium gezüchtet waren, wurde offenbart (Drucker, D. J. und Keneford, J. R., WO 96/32414). Es wurde bisher über keinen GLP-2-Rezeptor berichtet.

Progluca~onabgeleitete Peptide und Ernährungsverhalten

Wir haben kürzlich vom Erhalten und der Etablierung transplantierbarer anorektischer Glucagonome (O. D. Madsen, et al. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030) wie auch von hypoglykämischen Insulinomen in der Ratte (O. D. Madsen, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6652-6656) berichtet. Solche Tumore können von gemeinsamem klonalem Ursprung pluripotenter MSL-Zellen abgeleitet werden (O. D. Madsen, et al. (1986) J. Cell Biol. 103: 2025-2034) und reflektieren einen Reifungsprozess in Richtung auf Insel-A-Zellen bzw. B-Zellen (O. D. Madsen et al. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030).
Die Glucagonom-assoziierte Anorexie ist sehr schwerwiegend: Sie hat eine akute Anfangsphase und führt nach wenigen Tagen zu einem kompletten Stopp der Nahrungsaufnahme. Diese Schwere der Anorexie wird kaum durch andere experimentelle Tumore in Nagern erreicht und legt die Vermutung der Produktion eines sehr starken Sättigungsfaktors durch das Glucagonom nahe, der durch einen peripheren Weg der Verabreichung wirkt. Es wurde zuvor gezeigt, dass die anorektischen Glucagonome ein unphysiologisches Prozessieren zeigen, was in der Bildung von sowohl Glucagon als auch GLP-1 resultiert (O. D. Madsen et al. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030). Darüber hinaus war eine nicht- anorektische Glucagonomvariante nicht in der Lage, den Vorläufer zu prozessieren (O. D. Madsen, et al. (1995) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55, suppl. 220: 27- 36). Ein Gewichtsverlust wird als eine Komponente auch des Glucagonom- Syndroms im Menschen (J. J. Holst (1985) Glucagon-producing tumors, in: Hormone-producing tumors of the gastrointestinal tract. New York, Churchill Livingstone. SS. 57-84), wenn auch mit einem hohen Grad an Variabilität bei verschiedenen Patienten (S. J. Bhathena, et al. (1981) Glucagonoma and glucagonoma syndrome, in: Glucagon. Physiology, pathophysiology and morphology of the pancreatic A-cells. New York, Elsevier. 413-438), erwähnt.

Glucagon

Von Glucagon wurde gezeigt, dass es an der Regulation der spontanen Mahlzeitgröße bei Ratten beteiligt ist, aber die Gesamtwirkung ist minimal und wird auf die Leber über Vagus-Verbindungen ausgeübt (N. Geary et al. (1993) Am. J. Physiol. 264: R116-R122). Dieser Effekt wird nur bei hepatischer Pfortaderinfusion von Glucagon beobachtet, wogegen intraperitoneale Verabreichung von pharmakologischen Dosen keine Wirkung auf die Nahrungsaufnahme fastender Ratten zeigt (O. D. Madsen et al. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030).

GLP-1

Eine zentrale Rolle für GLP-1 in der Regulation der Ernährung wurde kürzlich berichtet (M. D. Turton, et al. (1996) Nature 379: 69-72). Intracerebroventrikuläre (ICV) Verabreichung von GLP-1 inhibierte die Ernährung der Ratten, die gefastet hatten. Wiederum zeigte die periphere Verabreichung von GLP-1 keine Wirkung auf das Ernährungsverhalten (M. D. Turton, et al. (1996) Nature 379: 69-72; O. D. Madsen et al. (1993) Endocrinology 133: 2022-2030), was die Vermutung nahe legt, dass das von Tumoren produzierte GLP-1 nicht signifikant zu der beobachteten Anorexie beiträgt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde gefunden, dass GLP-2 eine starke Wirkung auf die Inhibition der Nahrungsaufnahme hat, wenn es peripher verabreicht wird.
Es wurde vorgeschlagen, dass GLP-2, das normalerweise zusammen mit GLP-1 aus der intestinalen L-Zelle freigesetzt wird, seine eigene spezielle Rolle als ein peripherer Sättigungsfaktor spielt.
Das Ziel der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger oder Vehikel, eine HPLC-Fraktion eines Glucagonomtumorextraktes, hergestellt durch saure Ethanolextraktion, Gelfiltration und präparative HPLC, wobei die Fraktion als Fraktion G4H9 in Fig. 2 gezeigt ist und Glucagon-ähnliches Peptid 2 (GLP-2) als eine Hauptkomponente (d. h. mehr als 40%) enthält oder umfassend eine beliebige Einzelkomponente dieser Fraktion oder eine Kombination von 2 oder mehr Komponenten dieser Fraktion.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend Glucagon-ähnliches Peptid-2 (GLP-2) oder eine Variante oder ein Homolog hiervon für die Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit gestörter Appetitregulation assoziiert sind.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz
X¹HX²DGSFSDEMNTX³LDX&sup4;LAX&sup5;X&sup6;DFIfNWLX&sup7;X&sup8;TKIT DX&sup9;
wobei X¹ NH&sub2;, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRR oder ein Fragment hiervon ist,
X² Gly ist,
X³ Ile oder Val ist,
X&sup4; Asn, Ser oder His ist,
X&sup5; Ala oder Thr ist,
X&sup6; Arg oder Lys ist,
X&sup7; Ile oder Leu ist,
X&sup8; Gln oder His ist, oder
X&sup9; OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg oder Lys-Lys ist
zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit einer gestörten Appetitregulation assoziiert sind.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines wie hierin spezifizierten Peptids zur Zubereitung eines Arzneimittels für ein Verfahren zum Behandeln von Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit einer gestörten Appetitregulation assoziiert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen an ein Individuum umfasst, das eine solche Behandlung benötigt, in einer Menge eines wie hierin spezifizierten Peptids, die ausreicht, Appetit zu zügeln oder eine Sattheit in dem Individuum zu induzieren.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines wie hierin spezifizierten Peptids zur Zubereitung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit gestörter Appetitregulation assoziiert sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Beschreibung ist unter dem Ausdruck "Peptid" zu verstehen, dass er sowohl das reife GLP-2 Peptid oder eine Vorläuferform hiervon wie auch ein funktionales Fragment hiervon, das im Wesentlichen die Aktivität des Peptids voller Länge besitzt, einschließt. Darüber hinaus ist von dem Ausdruck "Peptid" beabsichtigt, dass Homologe dieses Peptids eingeschlossen sind. Diese Homologe umfassen eine Aminosäuresequenz, die ein Ausmaß der Identität von mindestens 50%, wie z. B. mindestens 75% und weiter bevorzugt von mindestens 90% Identität mit der Aminosäuresequenz des humanen GLP-2 aufweist. Das Ausmaß der Identität kann durch herkömmliche Verfahren, siehe z. B. Altshul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992, bestimmt werden.
Homologe des vorliegenden Peptids können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen können von geringerer Natur sein, das heißt konservative Aminosäure substitutionen, die keinen signifikanten Effekt auf die Faltung oder Aktivität des Peptids haben, kleine Deletionen, typischerweise von 1-5 Aminosäuren, kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie z. B. ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu ca. 15 Resten oder eine kleine Verlängerung, die die Aufreinigung vereinfacht, wie z. B. ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Beispiele von konservativen Substitutionen sind die innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z. B. Arginin, Lysin, Histidin), der sauren Aminosäuren (wie z. B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), der polaren Aminosäuren (wie z. B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie z. B. Leucin, Isoleucin, Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie z. B. Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie z. B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
Das Homolog kann eine allelische Variante sein, d. h. eine alternative Form eines Gens, die einer Mutation entstammt, oder ein verändertes Peptid, das von einem mutierten Gen kodiert wird, aber im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das native GLP-2-Peptid aufweist. Daher können Mutationen still sein (keine Veränderung in dem kodierten Peptid) oder sie können Peptide mit einer veränderten Aminosäuresequenz kodieren.
Das Homolog des vorliegenden Peptids kann auch ein Spezieshomolog sein, d. h. ein Peptid mit einer ähnlichen Aktivität, das aus einer anderen Spezies stammt. Beispiele von Spezieshomologen des GLP-2-Peptids sind humanes, bovines, Ratten-, Hamster-, Meerschweinchen- und Schweine-GLP-2.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das GLP-2- Peptid ein solches, in welchem X¹ NH&sub2; ist, X² Ala ist, X³ Ile ist, X&sup4; Asn ist, X&sup5; Ala ist, X&sup6; Arg ist, X&sup7; Ile ist, X&sup8; Gln ist oder X&sup9; OH ist. Insbesondere hat das Peptid die folgende Aminosäuresequenz:
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(humanes GLP-2) oder
HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD(Ratten- GLP-2) oder
HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD (Schweine-GLP-2).
Ein Homolog des Peptids kann durch Herstellen einer genomischen oder cDNA- Bibliothek einer Zelle der fraglichen Spezies und Screenen nach DNA-Sequenzen, die das gesamte oder Teile des Homologs kodieren, unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken, z. B. wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 beschrieben, oder mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer, wie von Sambrook et al., supra beschrieben, isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammenseazung umfassend eine Variante des GLP-2-Peptids. Die Variante ist eine solche, in der eine oder mehrere Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste substituiert wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wurde an Position 2 des reifen Peptids Ala durch Gly ersetzt. Es wird erwartet, dass diese Variante eine längere Plasmahalbwertszeit als das native Peptid zeigt, was ein Vorteil ist, da die benötigte Dosis, um eine adäquate appetitzügelnde oder ein Sattheit induzierende Wirkung zu erhalten, im Allgemeinen niedriger sein wird.
Das GLP-2-Peptid oder Homolog oder die wie oben definierte Variante hiervon kann durch rekombinante DNA-Techniken nach den im Stand der Technik gut bekannten Arbeitsverfahren hergestellt werden.
Genauer kann eine DNA-Sequenz kodierend für das GLP-2-Peptid isoliert oder auf Basis der publizierten humanen Präproglucagon-DNA-Sequenz synthetisiert werden (vgl. J. W. White et al., Nucleic Acids Res. 14; 1986, SS. 4719-4730; G. I. Bell et al., Nature 304, 1983, SS. 368-371), z. B. erhalten durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek aus einem geeigneten Gewebe und Screenen nach DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder Teile des GLP-2-Peptids kodieren, durch Hybridisation unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., supra). Für den vorliegenden Zweck ist die DNA-Sequenz kodierend für das GLP-2-Peptid vorzugsweise humanen Ursprungs.
Das DNA-Konstrukt kodierend für das GLP-2-Peptid kann auch synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z. B. das Phosphoramidit-Verfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, oder das Verfahren, das von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805 beschrieben wurde, hergestellt werden. Nach dem Phosphoramidit-Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer, gereinigt, "annealed", ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Darüber hinaus kann das DNA-Konstrukt gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt nach Standardtechniken durch Ligationsfragmente synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie zweckmäßig), wobei die Fragmente mit verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts korrespondieren.
Das DNA-Konstrukt kann auch durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer, z. B. wie in US 4,683,202 oder Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491 oder Sambrook et al., supra beschrieben, hergestellt werden.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform umfasst das DNA-Konstrukt sowohl die in Fig. 3 von G. I. Bell et al., Nature 304, 1983, SS. 368-371 gezeigte DNA-Sequenz, wie auch Nukleinsäuresequenzen kodierend für humanes GLP-2, die sich aber von der in Fig. 3 gezeigten Sequenz von Bell et al., supra, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. Das DNA-Konstrukt schließt weiterhin Nukleinsäuresequenzen ein, die mit einem Nukleinsäuremolekül (entweder genomisch, synthetisch oder cDNA oder RINA) kodierend für humanes GLP-2 unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren (d. h. Voreinweichen in 5X SSC und Prähybridisieren für 1 Stunde bei ca. 40ºC in einer Lösung aus 20% Formamid; 5X Denhardts Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 ug denaturierter ultraschallbehandelter Kälberthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in der gleichen, mit 100 uM ATP ergänzten Lösung für 18 Stunden bei ca. 40ºC, gefolgt von Waschen in 0,4X SSC bei einer Temperatur von ca. 45 ºC). Dieses könnten z. B. DNA-Sequenzen kodierend für GLP-2 anderer Spezies, z. B. Ratten-, Rinder-, Hamster-, Meerschweinchen- oder Schweine-GLP-2, sein.
Um GLP-2 zu exprimieren, wird das DNA-Konstrukt, das für das GLP-2-Peptid kodiert, in einen geeigneten rekombinanten Vektor insertiert. Dies kann jeder Vektor sein, der in geeigneter Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingeführt werden soll. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welche(s) er integriert wurde, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die DNA- Sequenz, die für das GLP-2-Peptid kodiert, funktionsfähig mit zusätzlichen Abschnitten verknüpft ist, die für die Transkription der DNA benötigt werden. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von einem Plasmid oder einer viralen DNA abgeleitet oder kann Elemente aus beiden enthalten Der Ausdruck "funktionsfähig verknüpft" zeigt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie in Übereinstimmung mit den beabsichtigten Zwecken funktionieren, z. B. beginnt die Transkription in einem Promotor und setzt sich über die DNA-Sequenz, die für das Peptid kodiert, fort.
Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen, die für Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind, stammen.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der DNA, die für das GLP-2-Peptid in Säugerzellen kodiert, sind der SV40-Promotor (Subramani et aL, Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), der MT-1 (Metallothioneingen) Promotor (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) oder der Adenovirus 2 starke späte Promotor.
Ein Beispiel für einen geeigneten Promotor zur Verwendung in Insektenzellen ist der Polyhedrin-Promotor (US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), der P10-Promotor (J. M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, SS. 765-776), der Autographa californica Polyhedrose-Virus basisches Protein Promotor (EP 397 485), der Baculovirus-immediate-early-gene-1-Promotor (US 5,155,037; US 5,162,222) oder der Baculovirus-39K-delayed-early-gene- Promotor (US 5,155,037; US 5,162,222).
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in Hefewirtszellen schließen Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Cien. 1 (1982), 419-434) oder Alkoholdehydrogenasegenen (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982) oder die TPI1- (US 4,599,311) oder ADH2-4c- (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) Promotoren ein.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in flamentösen Pilzwirtszellen sind z. B. der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele von anderen verwendbaren Promotoren sind solche, die von Genen stammen, die für A. oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei Aspartic-Proteinase, A. niger neutrale α-Amylase, A. niger säurestabile α-Amylase, A. niger oder A. awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, A. oryzae basische Protease, A. oryzae Triosephosphatisomerase oder A. nidulans Acetamidase kodieren. Bevorzugt sind die TAKA- Amylase- und gluA-Promotoren.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen Promotoren des Bacillus stearothermophilus Maltogen-Amylasegens, des Bacillus licheniformis Alpha-Amylasegens, des Bacillus amyloliquefaciens BAN-Amylasegens, des Bacillus subtilis basischen Proteasegens oder des Bacillus pumilus Xylosidasegens oder durch die Phagen Lambda PR- oder PL- Promotoren oder die E. coli lac-, tri- oder tac-Promotoren ein.
Die DNA-Sequenz, die für das GLP-2-Peptid kodiert, kann auch, falls nötig, funktionsfähig mit einem geeigneten Terminator verbunden sein, wie z. B. dem humanen Wachstumshormonterminator (Palmiter et al., oben zitiert) oder (für Pilzwirte) den TPI1 (Alber und Kawasaki, oben zitiert) oder ADH3 (McKnight et al., oben zitiert) Terminatoren verknüpft sein. Der Vektor kann weiter Elemente umfassen, wie z. B. Polyadenylierungssignale (z. B. aus SV40 oder der Adenovirus 5 Elb-Region), transkriptionale Enhancer-Sequenzen (z. B. den SV40-Enhancer) und translationale Enhancer-Sequenzen (z. B. die, die Adenovirus-VA-RNAs kodieren).
Der rekombinante Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die dem Vektor erlaubt, sich in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Ein Beispiel einer solchen Sequenz (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) ist der SV40- Replikationsursprung.
Wenn die Wirtszelle eine Hefezelle ist, sind geeignete Sequenzen, die dem Vektor erlauben, sich zu replizieren, die Hefeplasmid-2u-Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung.
Der Vektor kann auch einen selektiven Marker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in einer Wirtszelle ausgleicht, wie z. B. das Gen kodierend für Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder das Schizosaccharomyces pombe TPI- Gen (von P. R. Russell, Gene 40, 1985, SS. 125-130 beschrieben) oder eines, das eine Resistenz gegen einen Wirkstoff verleiht, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin, Hygromycin oder Methotrexat. Für filamentöse Pilze schließen selektierbare Marker amdS, pyrG, argB niaD, sC ein.
Um das GLP-2-Peptid in den sekretorischen Weg der Wirtszelle zu leiten, kann in dem rekombinanten Vektor eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz) zur Verfügung gestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz ist an die DNA-Sequenz, die für das Peptid kodiert, im richtigen Leserahmen angegliedert. Sekretorische Signalsequenzen sind im Allgemeinen 5' zu der DNA-Sequenz, die für das Peptid kodiert, positioniert. Die sekretorische Signalsequenz kann die sein, die normalerweise mit dem Peptid verbunden ist, oder kann aus einem Gen sein, das für ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Für die Sekretion aus Hefezellen kann die sekretorische Signalsequenz jedes Signalpeptid kodieren, das eine effiziente Leitung des exprimierten Peptids in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil hiervon sein oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Als geeignete Signalpeptide wurden das α-Faktor- Signalpeptid (vgl. US 4,870,008), das Signalpeptid der Mausspeichelamylase (vgl. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, SS. 643-646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid (vgl. L. A. Valis et al., Cell 48, 1987, SS. 887- 897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid (vgl. WO 87/02670) oder das Hefe-Aspartic- Protease 3 (YAP3)-Signalpeptid (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, SS. 127-137) gefunden.
Für eine effiziente Sekretion in Hefe kann eine ein Leaderpeptid kodierende Sequenz auch stromabwärts der Signalsequenz und stromaufwärts der DNA- Sequenz, die für das GLP-2-Peptid kodiert, insertiert werden. Die Funktion des Leaderpeptids ist, dem exprimierten Peptid zu erlauben, aus dem endoplasmatischen Reticulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Vesikel für die Sekretion in das Kulturmedium geleitet zu werden (d. h. Export des Peptids über die Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Hefezelle). Das Leaderpeptid kann der Hefe-α-Faktor-Leader sein (dessen Verwendung z. B. in US 4,546,082, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 und EP 163 529 beschrieben ist). Alternativ kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, das heißt ein Leaderpeptid, das nicht in der Natur vorkommt. Synthetische Leaderpeptide können zum Beispiel wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben gestaltet sein.
Zur Verwendung in filamentösen Pilzen kann das Signalpeptid in geeigneter Weise aus einem Gen kodierend eine Aspergillus sp. Amylase oder Glucoamylase, einem Gen kodierend eine Rhizomucor miehei-Lipase oder -Protease, einer Humicola lanuginosa-Lipase stammen. Das Signalpeptid stammt vorzugsweise aus einem Gen kodierend A. oryzae-TAKA-Amylase, A. niger neutrale α-Amylase, A. niger säurestabile Amylase oder A. niger-Glucoamylase.
Zur Verwendung in Insektenzellen kann das Signalpeptid in geeigneter Weise von Insektengenen (vgl. WO 90/05783), wie z. B. dem Lepidopteren Manduca sexta adipokinetischen Hormonvorläufer-Signalpeptid (vgl. US 5,023,328) stammen.
Die Arbeitsverfahren, die benutzt werden, um die DNA-Sequenzen, die für das GLP-2-Peptid kodieren, den Promotor und gegebenenfalls den Terminator und/oder die sekretorische Signalsequenz jeweils zu ligieren und in geeignete Vektoren einzuführen, die die zur Replikation notwendige Information enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., oben zitiert).
Die DNA-Sequenz, die für das GLP-2-Peptid kodiert und in die Wirtszelle eingefügt ist, ist bezüglich des fraglichen Wirts entweder homolog oder heterolog. Wenn sie gegenüber der Wirtszelle homolog ist, d. h. von der Wirtszelle natürlicherweise produziert wird, wird sie typischerweise funktionsfähig an eine andere Promotorsequenz oder, wenn sachdienlich, an eine andere sekretorische Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz als in ihrer natürlichen Umgebung verknüpft sein. Von dem Ausdruck "homolog" ist beabsichtigt, dass er eine cDNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das in dem fraglichen Wirtsorganismus natürlich vorkommt, einschließt. Von dem Ausdruck "heterolog" ist beabsichtigt, dass er eine DNA-Sequenz einschließt, die in der Natur von der Wirtszelle nicht exprimiert wird. Folglich kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus sein oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszelle, in welche das DNA-Konstukt oder der rekombinante Vektor der Erfindung eingeführt wird, kann irgendeine Zelle sein, die in der Lage ist, das vorliegende Peptid herzustellen, und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryotische Zellen ein.
Beispiele von bakteriellen Wirtszellen, die in Kultur in der Lage sind, das GLP-2- Peptid herzustellen, sind Gram-positive Bakterien, wie z. B. die Stämme von Bacillus, wie z. B. die Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis oder Stämme von Streptomyces, wie z. B. S. lividans oder S. murinus, oder Gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation oder durch Verwendung kompetenter Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden (vgl. Sambrooket al., supra).
Wenn das Peptid in Bakterien, wie z. B. E. coli exprimiert wird, kann das Peptid im Zytoplasma zurückgehalten sein, typischerweise als unlösliche Körnchen (bekannt als Einschlusskörper) oder es wird durch eine bakterielle Sekretionssequenz in den periplasmatischen Raum geleitet. Im erst genanntem Fall werden die Zellen lysiert und die Körnchen wiedergewonnen und denaturiert, wonach das Peptid durch Verdünnung der denaturierenden Agenzien wieder gefaltet wird. Im letzten Fall wird das Peptid aus dem periplasmatischen Raum durch Zerstörung der Zellen, um den Inhalt des periplasmatischen Raumes freizusetzen und das Peptid wiederzuerhalten, z. B. durch Ultraschall oder osmotischen Schock, wiedergewonnen.
Beispiele für geeignete Säugerzelllinien sind COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) oder CHO (ATCC CCL 61) Zelllinien. Verfahren zum Transfizieren von Säugerzellen und Exprimieren von DNA-Sequenzen, die in die Zellen eingeführt wurden, sind z. B. in Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham und von der Eb, Virolo 52 (1973), 456; und Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845 beschrieben.
Beispiele für geeignete Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri ein. Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit heterologer DNA und zum Herstellen von heterologen Polypeptiden hieraus sind in z. B. US 4,599,311, US 4,931,373, US 4,870 008, US 5,037,743 und US 4,845,075 beschrieben, die hiermit alle durch Bezugnahme aufgenommen werden. Transformierte Zellen werden durch ihren Phänotyp, der durch einen selektierbaren Marker bestimmt wird, für gewöhnlich Wirkstoffresistenz oder die Fähigkeit, in Abwesenheit von bestimmten Nährstoffen, z. B. Leucin, zu wachsen, ausgewählt. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der POT1-Vektor, der in US 4,931,373 offenbart ist. Die DNA-Sequenz, die für das GLP-2-Peptid kodiert, kann z. B. wie oben beschrieben durch eine Signalsequenz oder gegebenenfalls eine Leadersequenz angeführt werden. Weitere Beispiele von geeigneten Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, wie z. B. K lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha oder Pichia, z. B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, SS. 3459-3465; US 4,882,279).
Beispiele für andere Pilzzellen sind Zellen filamentöser Pilze, z. B. Aspergillus ssp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere Stämme von A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus spp. zur Expression von Proteinen ist z. B. in EP 272 277 und EP 230 023 beschrieben. Die Transformation von F. oxysporum kann zum Beispiel, wie bei Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 beschrieben, ausgeführt werden.
Wenn ein filamentöser Pilz als die Wirtszelle verwendet wird, kann er mit einem DNA-Konstrukt, das das GLP-2-Peptid kodiert, in geeigneter Weise durch Integrierung des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom transformiert werden, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten. Diese Integration wird im Allgemeinen als vorteilhaft betrachtet, da es wahrscheinlich ist, dass die DNA-Sequenz stabil in der Zelle bleibt. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann nach herkömmlichen Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination, durchgeführt werden.
Transformation von Insektenzellen und Produktion von heaerologen Polypeptiden hiervon kann wie in US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; US 5,162,222; EP 397,485 beschrieben durchgeführt werden, die alle hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die als Wirtszelle verwendete Insektenzelllinie kann geeigneterweise eine Lepidoptera-Zelllinie, wie z. B. Spodoptera frugiperda-Zellen oder Trichoplusia ni-Zellen (vgl. US 5,077,214), sein. Die Kulturbedingungen können geeigneterweise wie z. B. in WO 89/01029 oder WO 89/01028 oder wie in irgendeiner der oben zitierten Referenzen sein.
Die wie oben beschrieben transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des GLP-2-Peptids erlauben, wonach das resultierende GLP-2-Peptid aus der Kultur wiedergewonnen wird.
Das zur Kultivierung der Zellen verwendete Medium kann irgendein herkömmliches Medium sein, das geeignet zum Züchten von Wirtszellen ist, wie z. B. minimale oder komplexe Medien enthaltend geeignete Zusätze. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich oder können nach veröffentlichten Rezepten hergestellt werden (z. B. in Katalogen der "American Type Culture Collection"). Das von den Zellen produzierte GLP-2-Peptid kann dann aus dem Kulturmedium durch herkömmliche Arbeitsverfahren wiedergewonnen werden, einschließlich Trennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren der Proteinbestandteile aus dem Überstand oder Filtrat mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, Aufreinigung durch eine Vielfalt von chromatographischen Arbeitsverfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder Ähnlichem.
In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann das GLP-2- Peptid durch irgendeines der etablierten Verfahren zur Formulierung pharmazeutischer Zusammensetzungen, z. B. wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, formuliert sein. Die Zusammensetzung kann in einer Form sein, die für die systemische Injektion oder Infusion geeignet ist, und kann als solche mit einem geeigneten flüssigen Vehikel, wie z. B. sterilem Wasser oder einer isotonischen Salz- oder Glucoselösung, formuliert sein. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisationstechniken sterilisiert sein, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert sein, wobei die lyophilisierte Zubereirung mit einer sterilen wässrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzung kann pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen beinhalten, wie sie benötigt werden, um sich den physiologischen Bedingungen anzugleichen, wie z. B. puffernde Agenzien, Tonizität-einstellende Agenzien und Ähnliches, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid etc.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch angepasst werden für nasale, transdermale, pulmonale oder rektale Verabreichung. Der pharmazeutisch verträgliche Träger oder das Verdünnungsmittel, der/das in der Zusammensetzung eingesetzt wird, kann irgendein herkömmlicher fester Träger sein. Beispiele für feste Träger sind Laktose, Kaolin, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akazie, Magnesiumstearat und Stearinsäure. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel irgendein Material zum langwirksamen Freisetzen, das im Stand der Technik bekannt ist, enthalten, wie z. B. Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, alleine oder in Kombination mit einem Wachs.
Es kann von besonderem Vorteil sein, die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form einer Formulierung mit langwirksamen Freisetzung zu Verfügung zu stellen. Als solche kann die Formulierung als Mikrokapseln oder Mikropartikel, enthaltend das GLP-2-Peptid verkapselt durch oder dispergiert in einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen, biologisch abbaubaren Polymer wie z. B. Polymilchsäure, Polyglycolsäure oder einem Milchsäure/Glycolsäure-Kopolymer formuliert sein.
Zur nasalen Verabreichung kann die Zubereitung das GLP-2-Peptid in einem flüssigen Träger, insbesondere einem wässrigen Träger, für die Aerosolverabreichung gelöst oder suspendiert enthalten. Der Träger kann Zusatzstoffe wie z. B. solubilisierende Agenzien, z. B. Propylenglycol, Surfactants, Absorptionsverstärker, wie z. B. Lecithin (Phosphatidylcholin) oder Cyclodextrin, oder Konservierungsstoffe, wie z. B. Parabene enthalten.
Im Allgemeinen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Einheitsdosisform enthaltend 0,5-500 mg des Peptids zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger pro Einheitsdosis abgegeben.
Das GLP-2-Peptid wird als vorteilhaft zur Verwendung in der Appetitzüglung oder Induktion einer Sattheit erachtet, wie z. B. zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die mit einer gestörten Appetitregulation assoziiert sind. Beispiele von solchen Erkrankungen oder Funktionsstörungen sind Fettleibigkeit und Typ-II-Diabetes. Die GLP-2-Peptid-Dosis, die einem Patienten verabreicht wird, wird mit der Art und der Schwere des zu behandelnden Zustands variieren, aber im Allgemeinen in einem Bereich von ca. 10 ug/kg bis ca. 5 mg/kg Körpergewicht sein.
In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammenseazung kann das GLP-2- Peptid mit anderen appetitzügelnden oder Sattheit induzierenden Mittel kombiniert werden. Ein Beispiel eines solchen Mittels ist GLP-1, von dem gezeigt worden ist, dass es eine gewisse Wirkung auf die Appetitzüglung hat (vgl. M. D. Turton et al., Nature 379, 4. Januar 1996, SS. 69-72).
Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, dass das GLP-2-Peptid in einer geeigneten markierten Form, z. B. radioaktiv markiertes GLP-2, verwendet werden kann, um einen Rezeptor für GLP-2 in Bindungsstudien unter Verwendung von Gewebe(n), von dem/denen erwartet wird, dass es/sie den GLP-2-Rezeptor exprimiert/exprimieren, z. B. Hypothalamusgewebe, zu identifizieren. Nachdem der Rezeptor durch GLP-2-Bindung lokalisiert ist, kann er durch Expressions- klonieren geklont werden, d. h. durch Herstellung einer cDNA-Bank des fraglichen Gewebes, Klonieren der cDNA in geeignete Vektoren und Einführen der Vektoren in eine geeignete Zelle, um die Expression der cDNA zu bewirken, wonach ein Klon, der den Rezeptor exprimiert, durch Bindung von GLP-2 identifiziert wird. Eine den Rezeptor stabil exprimierende Zelllinie kann dann in einem Screening-Test nach GLP-2-Agonisten (d. h. Verbindungen, die an dem Rezeptor wirken, um Sattheit zu induzieren oder Appetit zu zügeln) oder GLP-2- Antagonisten (d. h. Verbindungen, die die Wirkung von GLP-2 an dem Rezeptor antagonisieren, z. B. zur Verwendung in der Behandlung von Anorexie bei Krebs oder Anorexia nervosa) verwendet werden.
Die Erfindung ist weiter in den folgenden Beispielen gezeigt, die den Schutzbereich der beanspruchten Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.

Beispiel 1

Saure Ethanol-Extraktion von Tumorgewebe.

Anorektische Tumore wurden in Ratten wie zuvor beschrieben hergestellt (Madsen; O. D. et al. (1993) Endocrinology 133, 2022-2030). Fünfzig anorektische 12C3AN (MSL-G-AN) Tumore (bei -80ºC) entsprechend 50,07 g Feuchtgewebe wurden bei 4ºC mit 700 ml saurem Ethanol (96% Ethanol/0,7 M HCl, 3/1, vol/vol) homogenisiert. Die Homogenisation wurde für 5 Min. in einem vorgekühlten (4ºC) 2-Liter-"Waring Commercial Blender" bei maximaler Geschwindigkeit ausgeführt. Nach der Homogenisation wurde das Gemisch bei 4ºC für 16 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde bei 9000 UpM und 4ºC für 1 Stunde zentrifugiert. Das Volumen des Überstands wurde durch Vakuumrotation auf 20 % eingeengt. Während dieses Prozesses, in welchem der Hauptteil des Ethanols entfernt wurde, bildete sich ein wenig Präzipitat. Dieses Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 4ºC für eine Stunde bei 20.000 UpM entfernt. Der Überstand, der immer noch ein wenig Lipid-ähnliches Material enthielt, wurde filtriert und auf eine LiChroprep RP-18 (Merck) Säule (2,5 · 10 cm), die mit 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 100 ml 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 400 ml 0,1% TFA enthaltend 70% (vol/vol) Acetonitril eluiert. Das Acetonitril wurde durch Vakuumrotation entfernt und das resultierende Gemisch lyophilisiert. Nach Lyophilisation wurde das Material in 50 ml Wasser gelöst und der pH mit 425 ul 1 N NaOH auf 5,3 eingestellt. Die weitere Titration des Gemisches auf pH 6,0 resultierte in der Bildung eines Präzipitats. Nach Rücktitration auf pH 5,3 löste sich dieses Präzipitat wieder. Daher wurde der pH bei 5,3 belassen und das Gemisch lyophilisiert.
Die Gesamtausbeute an lyophilisiertem Material aus 50 Tumoren war 359 mg trockenes Pulver.

Beispiel 2

Erster Reinigungsschritt: Gelfiltration über Sephadex G-75

Lyophilisiertes Material (278 mg) aus dem sauren Ethanolextrakt entsprechend 38 einzelnen Tumoren wurde in 20 ml 1 M HAc gelöst und auf eine Sephadex G75- Säule (5 · 50 cm) aufgetragen. Die Säule wurde equilibriert und mit 1 M HAc bei einer Fließgeschwindigkeit von 55 ml/h eluiert und Fraktionen entsprechend 10 ml gesammelt. Die Absorption bei 280 nm wurde für jede Fraktion aufgezeichnet. Das Gelfiltrationschromatogramm ist in Fig. 1 gezeigt. Einzelne Fraktionen wurden in die folgenden S Hauptfraktionen gepoolt: G1 (Fr. 30-39), G2 (Fr. 40-45), G3 (Fr. 46-66), G4 (Fr. 67-91) und G5 (Fr. 92-118) und nach Lyophilisation einem Biotest unterzogen.

Beispiel 3

Zweiter Reinigungsschritt: Präparative HPLC des G4-Pools

Etwas von der appetitzügelnden Aktivität der Gelfiltrationspools zeigte sich als vorhandene Aktivität in dem G4-Pool, und dieser Pool wurde weiter durch präparative HPLC fraktioniert. Lyophilisiertes G4-Material (entsprechend 80 Tumoren) wurde in 15 ml 0,1% TFA wieder gelöst und auf eine Vydac 214TP1022 C4- Säule (2,2 · 25 cm) in 0,1% TFA equilibriert gepumpt. Die Säule wurde mit 20 ml 0,1% TFA, gefolgt von 100 ml MeCN/H&sub2;O/TFA (10,0 : 89,9 : 0,1, v/v/v), gewaschen. Das Material wurde bei 25ºC mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min mit einem linearen Gradienten gebildet aus MeCN/H&sub2;O/TFA (10 : 79,9 : 0,1, v/v/v) und MeCN/H&sub2;O/TFA (65,0 : 34,9 : 0,1, v/v/v) über 110 Min. eluiert. Die UV- Absorption wurde bei 214 nm und 280 nm überwacht. Das HPLC- Chromatogramm (überwacht bei 280 nm) ist in Fig. 2 gezeigt. Fraktionen entsprechend 10 Hauptpools wurden wie in Fig. 2 dargestellt gebildet. Das Volumen wurde auf ca. 25% durch Vakuumrotation reduziert und die Fraktionen lyophilisiert und in dem Biotest getestet.
Die appetitzügelnde Aktivität wurde in Fraktion G4H9 (Beispiel 6) gefunden und die Peptide dieser Fraktion durch Aminosäuresequenzanalyse und Massenspektrometrieanalyse (Beispiel 4) analysiert.

Beispiel 4

Chemische Charakterisierung der Peptide in Fraktion G4H9

Aminosäuresequenzanalyse wurde durch automatisierten Edman-Abbau unter Verwendung eines "Applied Biosystems Model 477" Gasphasensequenzierers im Wesentlichen wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt. Massenspektrometrieanalyse wurde unter Verwendung eines API III LC/MS/MS Systems (Sciex, Thornhill, Ont., Kanada) durchgeführt. Das Triple-Quadrupolinstrument hat einen Masse-zu-Ladung-(m/z)-Bereich von 2400 und ist mit einem pneumatisch unterstützten Elektrospray-(auch bezeichnet als Ionenspray)-Interface (Bruins, A. P., Covey, T. R., & Henion, J. D. (1987) Anal. Chem. 59, 2642-2646 und Covey, T. R., Bonner, R. F., Shushan, B. L, & Henion, J. D. (1988) Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 249-256) angepasst. Die Probeneinführung erfolgte durch eine Spritzen- Einspritzpumpe (Sage Instruments, Cambridge, MA) durch eine Schmelzkapillare /75 mm i.d.) mit einer Flüssigkeits-Fließgeschwindigkeitseinstellung bei 0,5-1 ml/min. Die Instrumenten-m/z-Skala wurde mit den einfach geladenen Ammoniumadduktionen von Poly(propylenglycolen) (PPGs) unter Einheitsauflösung kalibriert. Die Genauigkeit der Massenbestimmungen ist im Allgemeinen besser als 0,02%.

Fraktion G4H9:

Von dem in dieser Fraktion dominierenden Peptid wurde gefunden, dass es die folgend Aminosäuresequenz hat:
HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD
Das durch Massenspektrometrie gefundene Molekulargewicht war: 3796.
Dieses Peptid ist identisch mit Ratten GLP-2 (1-33). Kleinere Mengen der folgenden beiden Peptide wurden ebenfalls gefunden:
DFPEEVAIAEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLATRDF INWLIQTKITD und HDEFERHAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
Diese Peptide sind identisch mit Ratten GLP-2, das N-terminal mit Spacerpeptid 2 bzw. Ratten GLP-1 (1-36Amid) verlängert ist.

Beispiel 5

Testverfahren zur Bestimmung der Appetitzüglung in Mäusen.

Mäusen wurde zwei Tage lang ihr normales Futter entzogen und sie erhielten freien Zugang zu einer 20%-igen Saccharoselösung am ersten Tag des Futterentzugs. Nach der 2-tägigen Fufferentzugsperiode wurde den Mäusen intraperitoneal 0,5 ml einer Lösung enthaltend die Testsubstanz injiziert. Dreißig Minuten nach der Injektion wurden einzelne Mäuse in eine von acht 15 cm² Testboxen mit einem Gitterboden aus rostfreiem Stahl und einem Glastrinkrohr, das in die Box vorragte, platziert. Das Trinkrohr war mit einem Reservoir enthaltend eine 20%-ige Saccharoselösung verbunden und das Innere des Trinkrohrs enthielt eine Elektrode, die den Nachweis der Trinkkontakte mit der Lösung durch Messen des Flusses eines schwachen (unmerkbaren) elektrischen Stromes durch die Mäuse mittels eines elektronischen Apparats erlaubte, der mit der Elektrode des Trinkrohrs und dem Gitterboden aus rostfreiem Stahl verbunden war. Der Verbrauch der Saccharoselösung wurde in 10-Minuten-Intervallen durch elektronische Aufzeichnung der Gesamtmenge des Kontakts mit der Zuckerlösung während der Testsitzung gemessen. Das Ausmaß der Appetitzüglung, das durch die gegebene Testsubstanz hervorgerufen wurde, wurde durch statistischen Vergleich der Dauer des Saccharoseverbrauchs bei Kontroll-(Vehikel-behandelten)-Mäusen mit den Mäusen, die mit einer Testsubstanz behandelt wurden, bestimmt. Das Ausmaß der Appetitzüglung in einer behandelten Gruppe von Mäusen wurde ausgedrückt als Prozent der Antwort der Kontrollgruppen.

Beispiel 6

Test auf Appetitzüglung in Mäusen durch Fraktionen enthaltend GLP-2.

Mäuse wurden auf Appetitzüglung (siehe Beispiel 5) nach Behandlung mit einer Testsubstanz getestet. Die Testsubstanz bestand aus Extrakten des anorektischen Glucagonomtumors, hergestellt nach Beispiel 3 (Gelfiltrationsfraktion G4) oder nach Beispiel 4 (HPLC-Fraktion G4H9) gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung. Die Testlösung, die lyophilisiertes Material aus der Gelfiltrationsfraktion G4 entsprechend 3,3 Tumoren enthielt, unterdrückte den Saccharoseverbrauch um 72%. Von den 10 HPLC-Unterfraktionen der G4-Gelfiltrationsfraktion (siehe Beispiel 4 und Fig. 2) ergab nur die GLP-2 enthaltende Fraktion, G4H9, eine statistisch signifikante Zügelung des Appetits, wobei der Saccharoseverbrauch um 49% unterdrückt wurde, wenn lyophilisiertes Material entsprechend 5,3 Tumoren gegeben wurde.

Beispiel 7

Test auf Appetitzüglung in Mäusen durch synthetisches GLP-2.

Mäuse wurden auf ihre Appetitzüglung wie in Beispiel 5 beschrieben nach Behandlung mit einer Testsubstanz enthaltend ein synthetisches Schweine-GLP-2 gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung getestet. Schweine-GLP-2 hat die folgende Aminosäuresequenz:
HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD.
Eine intraperitoneale Injektion der Testlösung, enthaltend 50 Microgramm des synthetischen Schweine-GLP-2, unterdrückte den Saccharoseverbrauch um 38%.

Beispiel 8

Testverfahren zum Messen der Appetitzüglung in Mäusen.

Das Verfahren ist wie in Beispiel 5, aber anstelle von 20%-iger Saccharose wurde eine Lösung aus Säuglingsmilch (Complan®) verwendet. Die Testsubstanz ist in einem Vehikel enthaltend Phosphat-gepufferten Salzlösung mit 1% Albumin gelöst. Testsubstanzen gelöst in Vehikel wurden entweder intravenös (IV) in einem Volumen von 100 Mikrolitern oder intracerebroventrikulär (ICV) in einem Volumen von 10 Mikrolitern injiziert.

Beispiel 9

Test auf Appetitzüglung in Mäusen durch synthetisches GLP-2

Mäuse wurden auf Appetitzüglung wie in Beispiel 8 nach Behandlung mit einer Testsubstanz enthaltend synthetisches humanes GLP-2 getestet. Humanes GLP-2 hat die folgende Aminosäuresequenz:
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD.
Eine IV-Injektion der Testlösung enthaltend 3 Mikrogramm des synthetischen humanen GLP-2 unterdrückte den Milchverbrauch um 24%, wogegen ICV- Injektionen von 3 Mikrogramm bzw. 10 Mikrogramm von synthetischem humanem GLP-2 den Milchverbrauch um 32% bzw. 35% unterdrückten.

Claims

1. Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz.

X¹HX²DGSFSDEMNTX³LDX&sup4;LAX&sup5;X&sup6;DFINWLX&sup7;X&sup8;TKITDX&sup9;

wobei X¹ NH&sub2;, DFPEEVAIVEELGRR, DFPEEVTIVEELGRR, DFPEEVNIVEELRRR oder ein Fragment davon ist,

X² ist Gly

X³ ist Ile oder Val,

X&sup4; ist Asn, Ser oder His,

X&sup5; ist Ala oder Thr,

X&sup6; ist Arg oder Lys,

X&sup7; ist Ile oder Leu,

X&sup8; ist Gln oder His und

X&sup9; ist OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg oder Lys-Lys.

2. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X¹ NH&sub2; ist.

3. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X³ Ile ist.

4. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup4; Asn ist.

5. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup5; Ala ist.

6. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup6; Arg ist.

7. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup7; Ile ist.

8. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup8; Gln ist.

9. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei X&sup9; OH ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz

X¹HX²DGSFSDEMNTX³LDX&sup4;LAX&sup5;X&sup6;DFINWLX&sup7;X&sup8;TKITDX&sup9;

X² ist Gly

X³ ist Ile oder Val,

X&sup4; ist Asn, Ser oder His,

X&sup5; ist Ala oder Thr,

X&sup6; ist Arg oder Lys,

X&sup7; ist Ile oder Leu,

X&sup8; ist Gln oder His und

X&sup9; ist OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg oder Lys-Lys

zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger oder Vehikel.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X¹ NH&sub2; ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X³ Ile ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup4; Asn ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup5; Ala ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup6; Arg ist.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup7; Ile ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup8; Gln ist.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei X&sup9; OH ist.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein wie in einem beliebigen der Ansprüche 10-18 definiertes Peptid in Kombination mit einem anderen appetitzügelnden oder Sattheit induzierenden Mittel.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das genannte appetitzügelnde oder Sattheit induzierende Mittel Glucagon-artiges Peptid- 1 ist.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 20, wobei die Menge des Peptids in dem Bereich von etwa 10 ug/kg Körpergewicht bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht liegt.

22. Verwendung eines Peptids mit der folgenden Aminosäuresequenz

X¹HX²DGSFSDEMNTX³LDX&sup4;LAX&sup5;X&sup6;DFINWLX&sup7;X&sup8;TKITDX&sup9;

X² ist Gly

X³ ist Ile oder Val,

X&sup4; ist Asn, Ser oder His,

X&sup5; ist Ala oder Thr,

X&sup6; ist Arg oder Lys,

X&sup7; ist Ile oder Leu,

X&sup8; ist Gln oder His und

X&sup9; ist OH, Lys, Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Arg-Arg oder Lys-Lys

zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Appetitzügelung oder Sättigkeitsinduktion.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X¹ NH&sub2; ist.

24. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X³ Ile ist.

25. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup4; Asn ist;

26. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup5; Ala ist.

27. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup6; Arg ist.

28. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup7; Ile ist.

29. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup8; Gln ist.

30. Verwendung nach Anspruch 22, wobei X&sup9; OH ist.

31. Verwendung eines wie in einem beliebigen der Ansprüche 22 bis 30 definierten Peptids zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von mit gestörter Appetitregulation assoziierten Erkrankungen und Funktionsstörungen.

32. Verwendung eines wie in einem beliebigen der Ansprüche 22 bis 30 definierten Peptids zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von Fettleibigkeit oder Typ-II-Diabetes.

33. Verwendung einer HPLC-Fraktion eines Glucagonomatumor-Extrakts hergestellt mittels saurer Ethanolextraktion, Gelfiltration und präparativer HPLC, wobei die genannte Fraktion als Fraktion G4H9 in Fig. 2 gezeigt ist und GLP-2 als Hauptkomponente enthält oder eine beliebige Einzelkomponente der genannten Fraktion oder eine Kombination von zwei oder mehreren der Komponenten der genannten Fraktion für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Appetitzügelung oder Sättigkeitsinduktion umfasst.

34. Verwendung einer wie in Anspruch 33 definierten HPLC-Fraktion für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von mit gestörter Appetitregulation assoziierten Erkrankungen oder Funktionsstörungen.

35. Verwendung einer wie in Anspruch 33 definierten HPLC-Fraktion für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von Fettleibigkeit oder Typ-II-Diabetes.