DE69637332T2

DE69637332T2 - Kombinierung von PDGF, KGF, IGF und IGFBP für Wundheilung

Info

Publication number: DE69637332T2
Application number: DE69637332T
Authority: DE
Inventors: Lewis T. Emeryville Williams
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1995-10-11
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2016-09-28
Also published as: EP0871730B1; DE69633194T2; EP1486565A1; JP2007182461A; EP1486565B1; AU7248896A; PT871730E; ATE274056T1; US6903078B1; EP0871730A1; WO1997013857A1; DE69633194D1; ES2293137T3; DE69637332D1; HK1067382A1; PT1486565E; DK1486565T3; ES2224178T3; JPH11513405A; US20050250695A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines Thrombozyten-Wachstumsfaktors (PDGF) und eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) und eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (IGF-1 oder IGF-2) bei der Herstellung eines Medikaments. Die Kombination ist verwendbar zur Behandlung oder Verhinderung von Epithelzellschädigung, wobei sie eine Verbesserung gegenüber früheren Verfahren zur Behandlung von Epithelzellschädigung darstellt. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsproteins (IGFBP) in Kombination mit der PDGF/KGF/IGF-Kombination der Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Die Patentanmeldung EP 0 619 370 offenbart die Verwendung von KGF zum Zwecke der Wundheilung. Außerdem kann PDGF, wie in US-Patent Nr. 5 187 263 offenbart, zum Zwecke der Wundheilung verwendet werden, wie durch seine Fähigkeit zur Stimulierung von Zellen, die aus dem Mesenchym stammen, gezeigt.
Insulin-ähnliche bzw. insulinartige Wachstumsfaktoren, IGF und IGF-2, sind im Stand der Technik beschrieben und untersucht worden. IGF ist in Rinderknecht, J. Biol. Chem. 253: 2769 (1978) beschrieben und man hat gefunden, dass es als Mitogen auf eine Anzahl verschiedener Zelltypen wirkt, wie in EP 0 128 733 beschrieben. Wie Insulin stimulieren die IGFs die Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste innerhalb der cytoplasmatischen Domäne der Rezeptoren, an die der IGF bindet, wie in WO 93/98826 beschrieben. IGF-2 ist in Rinderknecht, FEBS Letters (1978) 89: 283 beschrieben.
Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren sind auch unter dem Klassennamen Somatomedine bekannt und sind in verschiedenen Tierarten als Polypeptide, die wirken, um das Wachstum von Zellen in einer Vielfalt von Geweben und Zelltypen, insbesondere während der Entwicklung, zu stimulieren, identifiziert worden. Wachstumsfördernde Effekte von Somatomedinen schließen Steigerung der Zellvermehrung und Stimulation der Knorpelproliferation, Stimulation des Transports von Aminosäuren, Stimulation der RNA-, DNA- und Proteinsynthese und Stimulation des Einbaus von Sulfat in Proteoglycan und von Prolin in Kollagen ein. Ein Großteil des postnatalen Wachstums bei Säugern beruht auf der Stimulation von Knorpelwachstum durch Somatomedine und In-Utero-Wachstum kann auch Somatomedin-abhängig sein.
Verwendungen von IGF als ein bekanntes stimulatorisches und wachstumsförderndes Mittel schließen die Verwendung zur Knochenreparatur und Ersatztherapie wie in EP 303 855 beschrieben; als ein Mittel, um gewissen nachteiligen Nebenwirkungen von karzinostatischen Arzneimitteln entgegenzuwirken, wie in JP 63-196524 beschrieben; und als einen Weg, um die Laktation und Fleischproduktion bei Vieh bzw. Rindern und anderen Nutztieren zu vergrößern, wie im US-Patent Nr. 4 783 524 beschrieben, ein.
Es ist außerdem gefunden worden, dass IGF-1 bei der Behandlung von Osteoporose in Säugern, die eine verringerte Mineraliendichte der Korticalis aufweisen, und solchen, die Arzneimitteln oder Umweltbedingungen, die in einer Verringerung der Knochendichte resultieren, und möglicherweise einer Osteoporosebedingung ausgesetzt sind, verwendbar ist, wie in EP 560 723 und EP 436 469 beschrieben.
IGF-1 ist mit Natriumpentosanpolysulfat (PPS) Hunden mit schwerer Osteoarthrose mit dem Effekt der Verminderung der Schwere der Krankheit durch das Herabsetzen des Levels von aktiver neutraler Metalloproteinase im Knorpel verabreicht worden. Im Hundemodell von milder Osteoarthritis schien eine therapeutische Intervention mit IGF-1 und PPS zusammen erfolgreich die Knorpelstruktur und -biochemie zu erhalten, während IGF allein ineffektiv war, wie in Rogachefsky, Osteoarthritis und Cartilage (1993) 1: 105–114, beschrieben.
Bindungsproteine für IGF sind ausführlich untersucht worden, und derzeit sind sechs IGFBPs bekannt (IGFBP1–6). IGFBPs bilden im Plasma mit IGF-1 und IGF-2 Komplexe und man glaubt, dass sie üblicherweise als Bindungsproteine für Proteinhormone wirken, d. h., dass sie die Verfügbarkeit und Aktivität des Proteinhormonliganden, den sie transportieren, regulieren und dessen Halbwertszeit verlängern. Während IGFBP-3, ein 150 kDa-Komplex, das am meisten abundante IGFPB im Plasma ist und man glaubt, dass es als Träger bzw. Transporter und Reservoir von IGF-1 im Plasma wirkt, ist IGFBP-1 ein kleines 25 kDa-Bindungsprotein, das hauptsächlich in der Leber und in Fibroblasten produziert wird und sich zwischen dem Blutkreislauf und den Geweben verteilen kann und deshalb möglicherweise die biologische Verfügbarkeit von IGF in beiden Kompartimenten, wie in Tsuboi et al., J. of Inv. Derm. 104: 199–203 (1995) beschrieben, reguliert. IGF ist als in Kombination mit IGFBP für die Wundheilung verwendbar beschrieben worden, wie in Tsuboi et al., J. of Inv. Derm. 104: 199–203 (1995), Kratz et al, Scand J. Plast Reconstr. Hand Surg. 28: 107–112 (1994) und Jyung et al, Surgery 115: 233–239 (1994) beschrieben.
IGF-Expression ist mit Wundheilung, wie in Gartner et al, J. Surg. Res. 52: 389–394 (1992) und Steenfos und Jansson, Eur. J. Surg. 158: 327–331 (1992) beschrieben, assoziiert worden. Zusätzlich ist IGF als nützlich beschrieben worden, wenn es in Kombination mit PDGF zur Wundheilung verabreicht wird, wie in US-Patent Nr. 4 861 757 beschrieben.
Deshalb wäre es vorteilhaft, wenn eine verbesserte Zusammensetzung, die verbesserte Eigenschaften gegenüber der Verabreichung von PDGF allein, gegenüber der Verabreichung von KGF allein, gegenüber PDGF mit IGF, und gegenüber IGF allein und gegenüber IGF mit IGFBP hätte, gefunden werden kann.
Weiterhin stellt die EP 0 568 334 A1 kollagenhaltige Schwämme, umfassend einen absorbierbaren Gelatineschwamm, Kollagen und einen aktiven Inhaltsstoff, sowie Verfahren zur Steigerung der Wundheilung von äußerlichen und inneren Wunden, wobei derartige Schwämme verwendet werden, bereit. Der bevorzugte aktive Inhaltsstoff ist PDGF.
Zudem beschreibt die WO 92/14480 ein Verfahren, verwendend GM-CSF und G-CSF, zur Förderung einer beschleunigten Wundheilung bei Säugern. Dieses Verfahren umfasst das topische Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einem dieser zwei Polypeptide oder eines Gemisches von einem dieser zwei Polypeptide und wenigstens einem weiteren Protein an den Säuger.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung einer Epithelzellschädigung bereitzustellen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines ersten Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines Thrombozyten-Wachstumsfaktors (PDGF) und eines zweiten Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Kertinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) und eines dritten Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Reparieren oder Verhindern von Epithelzellschädigung bereitgestellt.
Die Verwendung kann ferner ein viertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität von Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsprotein (IGFBP) umfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines ersten DNA-Moleküls, eines zweiten DNA-Moleküls und eines dritten DNA-Moleküls, wobei das erste DNA-Molekül eine erste Nukleotidsequenz, die für PDGF codiert, umfasst, das zweite DNA-Molekül eine zweite Nukleotidsequenz, die für KGF codiert, umfasst und das dritte DNA-Molekül eine dritte Nukleotidsequenz, die für IGF codiert, umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Reparieren oder Verhindern von Epithelzellschädigung bereitgestellt.
Die Verwendung kann ferner ein viertes DNA-Molekül, das eine vierte Nukleotidsequenz, die für IGFBP codiert, umfasst, umfassen.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die hierin gegebene Offenbarung stützt sich auf früher veröffentlichte Arbeiten, wie wissenschaftliche Artikel, veröffentlichte Patente oder veröffentlichte Patentanmeldungen.
Die vorliegende Erfindung kann angesichts der folgenden Definitionen besser verstanden werden.
Definitionen
Soweit hierin nicht ausdrücklich etwas anderes bestimmt ist, schließt der Ausdruck „Thrombozyten-Wachstumsfaktor" bzw. „Platelet-derived growth factor" oder „PDGF" das PDGF-A-Kette-Polypeptid und das PDGF-B-Kette-Polypeptid und die AA-, BB- und AB-Dimere und biologisch aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon, wie im US-Patent Nr. 5 187 263 ; Waterfield et al., Nature 304: 35–39 (1983); Wang et al., J. Biol. Chem. 259: 10645–48 (1984), Antoniades et al., Biochem. Pharm. 33: 2833–38 (1984); und Westermark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7197–7200 (1986); US-Patent Nr. 5 219 759 beschrieben, ein.
Außerdem bezieht sich der Ausdruck „Keratinozytenwachstumsfaktor" oder „KGF", soweit hierin nicht ausdrücklich etwas anderes bestimmt ist, auf ein beliebiges aus einem reifen Polypeptid und biologisch aktiven Fragmenten, Analoga und Derivaten davon, wie in WO 90/08771 und WO 95/01434 beschrieben.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck „Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor" IGF-1 und IGF-2 in ihren im Wesentlichen gereinigten, nativen, rekombinant produzierten oder chemisch synthetisierten Formen und schließt biologisch aktive Fragmente, Analoga, Muteine, einschließlich C-terminaler Deletionsmuteine, und Derivate davon, die IGF-Aktivität und/oder die Fähigkeit, die IGF-Rezeptoren zu binden, beibehalten, ein, wie z. B. in EP 135 094 , WO 85/00831 , US-Patent Nr. 4 738 921 , WO 92/04363 , US-Patent Nr. 5 158 875 , EP 123 228 und EP 128 733 beschrieben. Ein Analogon von IGF oder ein Analogon des Fragments schließt nativen IGF, der durch eine oder mehrere Aminosäureinsertion(en), -deletion(en) oder -substitution(en), die seine Eigenschaften nicht wesentlich beeinträchtigt (beeinträchtigen), modifiziert worden ist, ein. Vorzugsweise hat das Analogon erhöhte Aktivität, verglichen mit nativem IGF. Bevorzugter wenigstens 2-fachen Anstieg, am bevorzugtesten wenigstens 7- bis 10-fachen Anstieg. Das Analogon kann beispielsweise konservative Aminosäuresubstitutionen einschließen. Ein IGF-Analogon schließt außerdem Peptide, die eine oder mehrere Peptidnachahmungen bzw. „peptide mimics" („Peptoide") haben, wie solche beschrieben in WO 91/04282 , ein. Ein IGF-Mutein ist eine Polypeptidvariante, bei der eine oder mehrere Aminosäuren abgeändert sind, um ein gewünschtes Charakteristikum zu erzeugen, wie z. B. einen Cysteinrest mit einer Aminosäure, die keine Disulfidbrücken ausbildet, zu ersetzen. Muteine, Analoga und Derivate können unter Verwendung von konventionellen Techniken erzeugt werden. Beispielsweise kann PCR-Mutagenese verwendet werden. Während sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, ist selbstverständlich, dass die Technik auch auf RNA Anwendung findet. Ein Beispiel einer PCR-Technik ist in WO 92/22653 beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Analoga, Muteinen und Derivaten ist Kassetten-Mutagenese, basierend auf der Technik beschrieben von Wells, Gene (1985) 34: 315.
Der Ausdruck „Bindungsprotein für insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGFBP)" bzw. „insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsprotein” bezieht sich auf ein Bindungsprotein, das identifiziert wurde, ein Bindungsprotein für IGF zu binden, wie beschrieben und identifiziert in Keifer et al., J. Biol. Chem. 266: 9043–9 (1991), Camacho-Hubner et al., J. Biol. Chem. 267: 11949–56 (1992), McCusker und Clemens, THE INSULIN LIKE GROWTH FACTORS: STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS, Oxford Univ. Press, N.Y., S. 110–150 (1992).
Ein Polypeptid „mit der biologischen Aktivität von PDGF" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der gleichen oder erhöhter Fähigkeit, vorzugsweise das Wachstum von Zellen der Dermisschicht der Haut zu stimulieren. So ein Polypeptid kann ein Volllängen-PDGF, ein Fragment von PDGF, ein Analogon von PDGF, das Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition aufweist, oder ein Derivat von PDGF, wie das beschrieben in US-Patent Nr. 5 149 792 und EP 458 959 B1 ; und US-Patent Nrn. 4 769 328 , 4 801 542 , 4 766 073 , 4 849 407 , 4 845 075 , 4 889 919 , 5 045 633 und 5 128 321 , sein.
Ein Polypeptid „mit der biologischen Aktivität von KGF" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der gleichen oder erhöhter Fähigkeit, vorzugsweise das Wachstum von Zellen der Epidermisschicht der Haut zu stimulieren. So ein Polypeptid kann ein Volllängen-KGF, ein Fragment von KGF, ein Analogon von KGF, das eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition aufweist; oder ein Derivat von KGF, wie in WO 90/08771 und WO 95/01434 beschrieben, sein.
Ein Polypeptid „mit der biologischen Aktivität von IGF" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der gleichen oder erhöhter Fähigkeit als Wachstumsfaktor, fähig zu Insulin-ähnlichen Effekten, wie zum Beispiel Stimulation der Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste innerhalb der cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors, an welchen es bindet, wie in WO 93/98826 beschrieben, oder in manchen Fällen z. B. mitogenen Effekten auf bestimmte Zellen, wie in EP 0 128 733 beschrieben, zu fungieren. So ein Polypeptid kann ein Volllängen-IGF, ein Fragment von IGF, ein Analogon von IGF, das eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition aufweist, oder ein beliebiges Derivat von IGF sein.
Ein Polypeptid „mit der biologischen Aktivität von IGFBP" bezieht sich auf ein Polypeptid mit ungefähr der gleichen oder erhöhter Fähigkeit als ein Bindungsprotein für IGF durch das Binden und Transportieren von IGF zu Gewebe und Zellen, wo IGF einen biologischen Effekt haben kann, zu fungieren. Da derzeit wenigstens sechs IGFBPs bekannt sind, von denen viele signifikant verschieden von den anderen IGFBPs sind, schließen spezifische Eigenschaften hinsichtlich der biologischen Aktivität eines gegebenen IGFBP nicht notwendigerweise die gesamte Gruppe der Bindungsproteine für IGF ein. Folglich kann die biologische Aktivität eines IGFBP manche Ähnlichkeiten zu anderen IGFBPs haben, kann aber auch Unterschiede haben, die es als ein einzigartiges IGFBP identifizieren.
„Volllängen-PDGF" oder „reifes PDGF" und „Volllängen-KGF" oder „reifes KGF" und „Volllängen-IGF" oder „reifes IGF" und „Volllängen-IGFBP" und „reifes IGFBP" bezieht sich auf das jeweilige native Polypeptid, wie in menschlichen oder anderen Säugetiergeweben gefunden.
Der Ausdruck „Analogon", hierin in Bezug auf PDGF-, KGF-, IGF- und IGFBP-Protein, bezieht sich auf Verkürzungen bzw. Trunkierungen, Varianten, Allele und Derivate davon. Sofern nicht ausdrücklich anderweitig vermerkt, umfassen diese Ausdrücke die Bioaktivitäten von „reifem" KGF oder „reifem" PDGF, „reifem" IGF oder „reifem" IGFBP. Folglich sind Polypeptide, die identisch mit dem reifen Protein sind oder wenigstens 60%, bevorzugt 70%, bevorzugter 80% und am meisten bevorzugt 90% Sequenzidentität zu dem reifen Protein enthalten, von wo auch immer abgeleitet, von menschlichen oder nicht-menschlichen Quellen, innerhalb dieser Definition eingeschlossen. Die Analoga hierin schließen ferner Peptide mit einer oder mehreren Peptidnachahmungen oder „peptide mimics", auch bekannt als Peptoide, die die Bioaktivität des Proteins besitzen, ein. Eingeschlossen innerhalb der Definition sind außerdem Polypeptide, enthaltend eine oder mehrere analoge Aminosäuren (einschließlich beispielsweise unnatürliche Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Kopplungen sowie andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen, die sowohl natürlich als auch nicht natürlich vorkommen. Der Ausdruck Polypeptid schließt außerdem Post-Expressions-Modifikationen des Polypeptids, z. B. Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen, nicht aus.
Die „Varianten" und „Derivate" hierin enthalten Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen. Die Aminosäuresubstitutionen können konservative Aminosäuresubstitutionen oder Substitutionen, um nicht-essentielle Aminosäurereste zu eliminieren, wie z. B. um eine Glycosylierungsstelle, eine Phosphorylierungsstelle, eine Acetylierungsstelle zu verändern, oder um Fehlfaltung durch Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Cysteinresten, die nicht für die Funktion notwendig sind, zu minimieren, sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind solche, die die allgemeine Ladung, Hydrophobizität/Hydrophilie und/oder räumliche Größe der ersetzten Aminosäure bewahren, z. B. sind Substitutionen zwischen den Mitgliedern der folgenden Gruppen konservative Substitutionen: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr und Phe/Trp/Tyr.
Der Ausdruck „Polynukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, ein RNA-Molekül oder dessen komplementären Strang. Ein Polynukleotidmolekül kann einzel- oder doppelsträngig sein.
Eine „therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge einer Zusammensetzung, die zur Erreichung eines erwünschten Ergebnisses, welches im vorliegenden Fall die Reparatur von Epithelgeweben ist, wirksam ist. Diese Menge kann in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe von Dosen sein. Die genaue Menge wird von Subjekt zu Subjekt, abhängig von Alter, Größe, Gewicht und Gesundheit des Subjekts, der Natur und dem Schweregrad des zu behandelnden Zustandes variieren. Es ist nicht möglich, im Vorhinein eine genaue Menge, die therapeutisch wirksam ist, zu spezifizieren. Die für eine gegebene Situation wirksame Menge kann jedoch durch Routineexperimente oder basierend auf der Erfahrung der Person, die die Zusammensetzung verabreicht, basierend auf der hierin bereitgestellten Information, bestimmt werden. Es wird erwartet, dass die Dosis in einen relativ weiten Bereich fallen kann.
„Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger" hierin bezieht sich auf einen beliebigen Träger, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern, schädlich für das Individuum, das die Zusammensetzung erhält, induziert. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie z. B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und ein inaktives Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Eine gründliche Diskussion pharmazeutisch annehmbarer Trägersubstanzen bzw. Exzipientien kann in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Merck Pub. Co., N.J. 1991) gefunden werden. Exemplarische pharmazeutisch annehmbare Träger können Salze, z. B. Mineralsäuresalze wie z. B. Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate u. dgl.; und die Salze organischer Säuren, wie z. B. Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate u. dgl. einschließen.
Die „pharmazeutischen Zusammensetzungen" hierin können ferner eine oder mehrere Komponenten, wie z. B. Wasser, Salzlösung, Glycerin oder Ethanol, enthalten. Zusätzlich können Zusatzstoffe, wie z. B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Substanzen, Stabilisatoren, Antioxidantien u. dgl. in solchen Zusammensetzungen vorhanden sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen hierin können als eine Creme, um topisch angewendet zu werden, oder als flüssige Lösungen oder Suspensionen oder feste Formen, geeignet zur Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln zur Injektion, zubereitet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung hierin kann in liposomalem Format zubereitet werden, wie z. B. jene eingekapselt in Liposome oder DepoFoam^®, wie in US-Patent Nr. 5 442 120 , WO 95/13796 und WO 91/14445 beschrieben.
„Gleichzeitige Verabreichung" („co-administration"), wie hierin verwendet, bedeutet Verabreichung von KGF und PDGF gemäß dem Verfahren der Erfindung in Kombination miteinander, gleichzeitige Verabreichung von KGF/PDGF und einem IGF und gleichzeitige Verabreichung von KGF/PDGF/IGF/IGFBP. Gleichzeitige Verabreichung bedeutet außerdem Verabreichung einer PDGF/KGF-Kombination außerdem in Kombination mit IGF oder PDGF/KGF/IGF-Kombination außerdem in Kombination mit IGFBP. Gleichzeitige Verabreichung kann simultan sein, z. B. durch das Verabreichen einer Mischung von KGF und PDGF, oder einer Mischung von PDGF, KGF und IGF oder IGF und IGFBP, oder kann durch getrennte Verabreichung der Wirkstoffe, wie z. B. innerhalb einer kurzen Zeitspanne, erreicht werden. Gleichzeitige Verabreichung schließt außerdem sukzessive Verabreichung von KGF und PDGF oder sukzessive Verabreichung von KGF, PDGF und IGF oder sukzessive Verabreichung von KGF, PDGF und gleichzeitige Verabreichung von IGF und IGFBP ein. Außerdem kann im Fall all dieser Verabreichungen, z. B. im Fall der Verabreichung von KGF und PDGF, einer der beiden präventiv verabreicht werden, während der andere danach innerhalb einer angemessenen Zeitspanne nach der präventiven Verabreichung zur Behandlung verabreicht wird. Zum Beispiel können im Fall der Verabreichung von KGF, PDGF und IGF oder IGF und IGFBP einer oder zwei oder drei präventiv verabreicht werden und können einer oder zwei oder drei danach innerhalb einer angemessenen Zeitspanne nach der präventiven Verabreichung zur Behandlung verabreicht werden. Die Dosierungsbehandlung zur Verabreichung oder gleichzeitigen Verabreichung kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosenplan sein.
Der Ausdruck „Kit" bezieht sich auf eine Packung, die das beschriebene Material enthält und gedruckte Instruktionen zur Verwendung des Materials einschließt. Zum Beispiel kann ein Kit für das Verfahren der Erfindung PDGF- und KGF-Polypeptide separat oder in Mischung oder DNA, die für PDGF und KGF codiert, separat oder in Mischung oder als eine Kombination von DNA und Polypeptiden, z. B. die DNA von PDGF und das Polypeptid von KGF, einschließen. Außerdem kann ein Kit für das Verfahren der Erfindung beispielsweise PDGF-, KGF- und IGF-Polypeptide separat oder in Mischung oder DNA, die für PDGF, KGF und IGF codiert, separat oder in Mischung oder in einer Kombination von DNA und Polypeptiden, z. B. die DNA von PDGF und KGF, aber das Polypeptid von IGF, einschließen. Außerdem kann ein Kit für das Verfahren der Erfindung beispielsweise PDGF-, KGF- und IGF- und IGFBP-Polypeptide separat oder in Mischung oder DNA, die für PDGF, KGF und IGF, IGFBP codiert, separat oder in Mischung oder in einer Kombination von DNA und Polypeptiden, z. B. die DNA von PDGF und KGF, aber das Polypeptid von IGF und das Polypeptid IGFBP, einschließen. „Gedruckte Instruktionen" können auf Papier oder andere Medien geschrieben oder gedruckt oder auf elektronischen Medien, wie z. B. Magnetband, computerlesbare Disketten oder Tonband CD-ROM u. dgl., gespeichert sein. Kits können außerdem Platten, Röhrchen, Schüsseln bzw. Schalen, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Waschflüssigkeiten oder andere konventionelle Reagenzien enthalten.
Der Erfinder hat hierin entdeckt, dass die Zugabe von IGF zu einer PDGF/KGF-Kombination die Behandlung oder Verhinderung einer Epithelzellschädigung verbessert, stark über das hinaus, was durch irgendeines der drei Medikamente allein erwartet werden könnte; und der Erfinder hat hierin zusätzlich entdeckt, dass die Zugabe von IGF und IGFBP zu einer PDGF/KGF-Kombination die Behandlung oder Verhinderung einer Epithelzellschädigung verbessert, stark über das hinaus, was durch irgendeines der vier Medikamente allein erwartet werden könnte und sogar zusätzlich zu den Verbesserungen für eine Epithelzellschädigung, erlangt durch die Verabreichung der PDGF/KGF-Kombination oder der IGF/IGFBP-Kombination.
Sowohl PDGF als auch KGF kann durch eine beliebige konventionelle Technik hergestellt werden oder kann aus seinen natürlichen Quellen gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden sowohl PDGF als auch KGF durch Expression einer Polynukleotidsequenz, die für das jeweilige Protein codiert, in separaten Wirten oder durch deren Coexpression in einem einzelnen Wirt hergestellt. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. PDGF kann beispielsweise wie in US-Patent Nr. 5 219 759 beschrieben hergestellt werden. KGF kann wie im WO 95/01434 beschrieben hergestellt werden. Andere Expressionssysteme können wie unten detaillierter beschrieben verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann eine therapeutisch wirksame Menge von PDGF, KGF und IGF enthalten. Jeder von PDGF, KGF und IGF kann durch eine beliebige konventionelle Technik hergestellt werden oder kann aus seinen natürlichen Quellen gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jeder von PDGF, KGF und IGF durch Expression einer Polynukleotidsequenz, die für das jeweilige Protein codiert, in getrennten Wirten oder durch deren Coexpression in einem einzelnen Wirt hergestellt. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. IGF kann, wie in US-Patent Nr. 4 738 921 beschrieben, hergestellt werden. IGF kann außerdem mit dem Festphasenverfahren, wie in Li, PNAS (1983), 80: 2216–2220 beschrieben, synthetisiert werden. In diesem Verfahren kann die Polypeptidsequenz für IGF-1 durch Kuppeln der Aminosäurereste zusammengesetzt werden.
Die PDGF-, KGF- und IGF-Zusammensetzungen können, sofern getrennt gehalten, getrennt oder gleichzeitig verabreicht werden. Eine direkte Abgabe der Zusammensetzungen wird im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intradermal, intraperitoneal, intraluminal, intragastral, intraintestinal, intravenös oder intramuskulär, erreicht werden. Andere Formen der Verabreichung schließen orale und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen ein. Dosierungsbehandlung kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosenplan sein.
In einer anderen Ausführungsform kann eine pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge von PDGF, KGF und IGF mit IGFBP enthalten. Jeder von PDGF, KGF und IGF und IGFBP kann durch eine beliebige konventionelle Technik hergestellt werden oder aus seinen natürlichen Quellen gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jeder von PDGF, KGF und IGF und IGFBP durch Expression einer Polynukleotidsequenz, die für das jeweilige Protein codiert, in getrennten Wirten oder durch deren Coexpression in einem einzelnen Wirt hergestellt. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Die PDGF-, KGF-, IGF- und IGFBP-Zusammensetzungen können, sofern separat gehalten, separat oder gleichzeitig verabreicht werden. Eine direkte Abgabe der Zusammensetzungen wird im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intradermal, intraperitoneal, intraluminal, intragastral, intraintestinal, intravenös oder intramuskulär, erreicht werden. Andere Arten der Verabreichung schließen orale und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen ein. Dosierungsbehandlung kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosenplan sein.
IGF kann durch konventionelle rekombinante DNA-Techniken, wie in Biochem. und Biophys. Res. Comm. (1990), 169: 832–839 (IGF II) und Cell Regulation (1990), 1: 197–213 (IGF II) und Biotechnology News (1983), 3: 1–3 (IGF-1 und 2) beschrieben, hergestellt werden. Zum Beispiel kann IGF in E. coli als ein Fusionsprotein mit dem trpE-Gen unter der Kontrolle eines modifizierten Tryptophanoperons, wie in US-Patent Nr. 4 738 921 beschrieben, hergestellt werden. Alternativ kann IGF in E. coli unter der Kontrolle der Promotor- und Protektorsequenzen des Vesicular Stomatitis Virus (VSV), wie in EP 478 333 beschrieben, synthetisiert werden. Die hierin zur Expression verwendeten E. coli-Expressionssysteme können wie im US-Patent Nr. 5 158 875 beschrieben, modifiziert werden, um eine modifizierte, positiv geladene Leadersequenz einzuschließen, um korrektes Falten des IGF-Proteins zu ermöglichen. Außerdem kann IGF in methylotrophen Hefetransformanten mit der für IGF codierenden Sequenz, verknüpft mit einer Signalsequenz, die Sekretion und proteolytische Prozessierung des Proteinprodukts regelt, hergestellt werden. Die hierin geeignete Signalsequenz schließt die S. cerevisiae-Paarungsfaktor-alpha-Präpro-Sequenz in proteasedefizienten P. pastoris-Stämmen, wie in WO 92/04363 beschrieben, ein. DNA-Konstrukte zur Herstellung von IGF-2 können wie in WO 89/03423 beschrieben hergestellt und in E. coli exprimiert werden. Eine Synthese von rekombinantem IGF-2 kann außerdem durch das Befolgen des Protokolls, beschrieben in EP 434 605 , welches sich auf die Produktion von rekombinantem IGF-2, das einen kovalent gebundenen fremden Anteil hat und dem das N-terminal-gebundene Methionin fehlt, bezieht, erreicht werden. IGF kann außerdem, wie in EP 123 228 und US-Patentanmeldung S. N. 06/922 199 beschrieben, in Hefe hergestellt werden. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von IGF unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken, das hierin geeignet ist, ist wie in Biotechnology News (1983), 10: 1–3 beschrieben. IGF-1- oder IGF-2-codierende Sequenzen können in virale oder ringförmige Plasmid-DNA-Vektoren eingesetzt werden, um Hybridvektoren zu bilden, und die resultierenden Hybridvektoren können verwendet werden, um Wirtsmikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Hefezellen, zu transformieren. Die transformierten Mikroorganismen können unter geeigneten Nährstoffbedingungen vermehrt werden, um IGF zu exprimieren, wie in EP 135 094 beschrieben. IGF kann außerdem wie in EP 434 625 beschrieben hergestellt werden.
Ein IGFBP kann jedes bekannte IGFBP, beispielsweise IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 und IGFBP-6, sein. IGFBP kann wie in Brinkman et al., EMBO J. 7: 2417–2423 (1988), Mohan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8338–42 (1989), US-Patent Nr. 5 407 913 , WO 9212243 , 92/03471 , 92/03470 , WO 92/03469 und Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 152: 1289–97 (1988) beschrieben hergestellt werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entweder eine Zusammensetzung, die PDGF allein, KGF allein, IGF allein und IGF mit IGFBP oder beliebige zwei der vier miteinander gemischt und das dritte und vierte allein, oder beliebige drei der vier miteinander gemischt und das vierte allein oder alle vier miteinander gemischt in einer einzelnen Zusammensetzung, enthält, in entweder einer Einzeldosis oder in Mehrfachdosen sein. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die pharmazeutische Zusammensetzung zum Zweck von Gentherapie eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid, das für PDGF allein codiert, enthält, eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid, das für KGF allein codiert, enthält, eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid, das für IGF allein codiert, enthält, eine Zusammensetzung, die nur IGF und IGFBP enthält, oder alle vier Polynukleotide miteinander gemischt in einer einzelnen Zusammensetzung sein.
Die PDGF-, KGF-, IGF- und IGF mit IGFBP-Zusammensetzungen können, sofern getrennt gehalten, getrennt oder gleichzeitig verabreicht werden. Zusätzlich können die Konzentrationen eines jeden je nach der Wirksamkeit des Faktors und den Bedürfnissen des Patienten verschieden sein. Eine direkte Abgabe der Zusammensetzungen wird im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intradermal, intraperitoneal, intraluminal, intragastral, intraintestinal, intravenös oder intramuskulär, erreicht werden. Andere Arten der Verabreichung schließen orale und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen ein. Dosierungsbehandlung kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosenplan sein.
Wenn PDGF, KGF, IGF oder IGFBP als Polypeptide entweder zusammen in einer einzelnen Zusammensetzung oder in mehreren Zusammensetzungen verabreicht werden, können die Polypeptide durch irgendein Expressionssystem, geeignet für das Polypeptid, exprimiert werden.
Exemplarische Expressionssysteme zum Erzeugen der Polypeptide von PDGF, KGF, IGF und IGFBP oder zur Klonierung der Polynukleotide, die für dieselben codieren, zur Anwendung in einem Gentherapie-Protokoll werden nachfolgend beschrieben.
EXPRESSION IN BAKTERIENZELLEN
Bakterielle Expressionssysteme können mit den vorliegenden Konstrukten verwendet werden. Kontrollelemente zur Verwendung in Bakterien schließen Promotoren, die wahlweise Operatorsequenzen enthalten, und Ribosomenbindungsstellen ein. Verwendbare Promotoren schließen Sequenzen, abgeleitet von Zucker metabolisierenden Enzymen, wie z. B. Galactose, Lactose (lac) und Maltose, ein. Zusätzliche Beispiele schließen Promotorsequenzen, abgeleitet von biosynthetischen Enzymen, wie z. B. Tryptophan (trp), das β-Lactamase (bla)-Promotorsystem, Bakteriophage λPL und T7 ein. Zusätzlich können synthetische Promotoren, wie z. B. der tac-Promotor, verwendet werden. Die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme sind in Chang et al., Nature (1978) 275: 615 und Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544 beschrieben; das alkalische Phosphatase, Trypophan (trp)-Promotorsystem sind in Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057 und EP 36 776 beschrieben, und Hybridpromotoren, wie z. B. der tac-Promotor, sind im US-Patent Nr. 4 551 433 und deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21–25 beschrieben. Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren, die zur Expression eukaryotischer Proteine verwendbar sind, auch geeignet. Ein Fachmann wäre fähig, solche Promotoren mit den vorliegenden PDGF- und KGF-codierenden Sequenzen, z. B. wie in Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269 beschrieben, unter Verwendung von Linker oder Adaptoren, um für beliebige benötigte Restriktionsorte zu sorgen, funktionell zu verbinden. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem im Allgemeinen eine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz funktionell verknüpft mit der DNA, die für das Zielpolypeptid codiert, enthalten. Für prokaryotische Wirtszellen, die die native Zielpolypeptidsignalsequenz nicht erkennen und prozessieren, kann die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz, z. B. ausgewählt aus der Gruppe von alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern, ersetzt werden. Der Replikationsstartpunkt von dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet.
Die vorhergehenden Systeme sind mit Escherichia coli besonders kompatibel. Zahlreiche andere Systeme zur Verwendung in bakteriellen Wirten schließen jedoch Gram-negative oder Gram-positive Organismen wie z. B. Bacillus spp., Streptococcus spp., Streptomyces spp., Pseudomonas-Spezies wie z. B. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans unter anderen ein. Verfahren zum Einführen exogener DNA in diese Wirte schließen typischerweise die Verwendung von CaCl₂ oder anderen Mitteln, wie z. B. zweiwertige Kationen und DMSO, ein. DNA kann außerdem durch Elektroporation, Kerninjektion oder Protoplastenfusion, wie allgemein in Sambrook et al. (1989), oberhalb zitiert, beschrieben, in Bakteriellenzellen eingeführt werden. Diese Beispiele sind eher veranschaulichend als beschränkend. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Menge proteolytischer Enzyme sezernieren bzw. sekretieren. Alternativ sind in vitro-Verfahren des Klonierens, z. B. PCR oder andere Nukleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Außerdem zur Expression von PDGF für die Erfindung verwendbar sind Vektoren, beschrieben in EP 0 622 456-A1 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen, die DNA zur Selektion und autonomen Replikation in Bakterienzellen offenbart.
Prokaryotische Zellen, verwendet zur Produktion der Zielpolypeptide dieser Erfindung, werden in geeigneten Nährmedien, wie allgemein in Sambrook et al., oberhalb zitiert, beschrieben, kultiviert.
EXPRESSION IN HEFEZELLEN
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, sind zur Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren für u. a. die folgenden Hefen entwickelt worden: Saccharomyces cerevisiae, wie in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163 beschrieben; Candida albicans, wie in Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142 beschrieben; Candida maltosa, wie in Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141 beschrieben; Hansenula polymorpha, wie in Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459 und Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 302 beschrieben; Kluyveromyces fragilis, wie in Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165 beschrieben; Kluyveromyces lactis, wie in De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737 und Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135 beschrieben; Pichia guillerimondii, wie in Kunze et al., J. Basic Microbiol (1985) 25: 141 beschrieben; Pichia pastoris, wie in Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376 und US-Patent Nrn. 4 837 148 und 4 929 555 beschrieben; Schizosaccharomyces pombe, wie in Beach und Nurse, Nature (1981) 300: 706 beschrieben; und Yarrowia lipolytica, wie in Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380 und Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49 beschrieben, für Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans, wie in Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284–289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205–221 und Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470–1474 beschrieben, und A. niger, wie in Kelly und Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479 beschrieben; für Trichoderma reesia, wie in EP 0 244 234 beschrieben, und filamentöse Pilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, wie in WO 91/00357 beschrieben.
Kontrollsequenzen für Hefevektoren sind bekannt und schließen Promotorregionen von Genen wie z. B. Alkoholdehydrogenase (ADH), wie in EP 284 044 beschrieben, Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK), wie in EP 329 203 beschrieben, ein. Das Hefegen PHO5, das für saure Phosphatase codiert, stellt außerdem, wie in Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1983) 80: 1 beschrieben, verwendbare Promotorsequenzen bereit. Andere geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten schließen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase, wie in Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255: 2073 beschrieben, oder andere glycolytische Enzyme, wie z. B. Pyruvatdecarboxylase, Triosephosphatisomerase und Phosphoglucoseisomerase, wie in Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7: 149 und Holland et al., Biochemistry (1978) 17: 4900 beschrieben, ein. Induzierbare Hefepromotoren mit dem zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen kontrollierter Transkription schließen von der Liste oberhalb und anderen die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme assoziiert mit dem Stickstoff-Stoffwechsel, Metallothionein, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind, ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind ferner in Hitzeman, EP 073 657 , beschrieben. Außerdem werden Hefeenhancer vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet. Zusätzlich dienen synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, außerdem als Hefepromotoren. Zum Beispiel können die Transkriptionserhöhende Sequenz stromaufwärts vom Promotor („upstream activating sequences") (UAS) eines Hefepromotors mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines anderen Hefepromotors verbunden werden, wobei ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird. Beispiele solcher Hybridpromotoren schließen die regulatorische Sequenz von ADH, verknüpft mit der Transkriptionsaktivierungsregion von GAP, wie in US-Patent Nr. 4 876 197 und 4 880 734 beschrieben, ein. Andere Beispiele von Hybridpromotoren schließen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen von entweder den ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Genen, kombiniert mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines Glycolyseenzymgens, wie z. B. GAP oder PyK, bestehen, wie in EP 164 556 beschrieben, ein. Außerdem kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende Promotoren Nicht-Hefeursprungs einschließen, die das Vermögen haben, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren.
Andere Kontrollelemente, die in Hefeexpressionsvektoren eingeschlossen sein können, sind Terminatoren, z. B. von GAPDH und von dem Enolasegen, wie in Holland et al., J. Biol. Chem. (1981) 256: 1385 beschrieben, und Leadersequenzen, die für Signalsequenzen zur Sekretion codieren. DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bzw. sekretierte Hefeproteine, wie z. B. dem Hefeinvertasegen, wie in EP 012 873 und JP 62,096,086 beschrieben, und dem a-Faktor-Gen, wie in US-Patent Nrn. 4 588 684 , 4 546 083 und 4 870 008 , EP 324 274 und WO 89/02463 beschrieben, stammen. Alternativ sorgen außerdem Leader Nicht-Hefeursprungs, wie z. B. ein Interferonleader, für Sekretion in Hefe, wie in EP 060 057 beschrieben.
Verfahren zum Einführen exogener DNA in Hefewirte sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen typischerweise entweder die Transformation von Sphäroblasten oder von intakten Hefezellen, behandelt mit Alkalikationen, ein. Transformationen in Hefe können nach den in Van Solingen et al., J. Bact. (1977) 130: 946 und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3829 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Jedoch können auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie z. B. durch Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion, wie allgemein in Sambrook et al., oberhalb zitiert, beschrieben, verwendet werden.
Zur Hefesekretion kann die native Zielpolypeptidsignalsequenz durch den Hefeinvertase-, α-Faktor- oder saure Phosphatase-Leader ersetzt werden. Der Replikationsstartpunkt des 2μ-Plasmidstartpunkts ist für Hefe geeignet. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, vorhanden in dem in Kingsman et al., Gene (1979) 7: 141 oder Tschemper et al., Gene (1980) 10: 157 beschriebenen Hefeplasmid. Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, zur Verfügung. Ähnlich werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20622 oder 38626) mit bekannten Plasmiden, die das Leu2-Gen tragen, komplementiert.
Zur intrazellulären Produktion der vorliegenden Polypeptide in Hefe kann eine Sequenz, die für ein Hefeprotein codiert, mit einer codierenden Sequenz des PDGF- oder des KGF- Polypeptids verbunden werden, um ein Fusionsprotein herzustellen, das bei Expression intrazellulär durch die Hefezellen gespalten werden kann. Ein Beispiel solch einer Hefeleadersequenz ist das Hefe-Ubiquitingen.
EXPRESSION IN INSEKTENZELLEN
Baculovirus-Expressionsvektoren (BEVs) sind rekombinante Insektenviren, bei denen die codierende Sequenz für ein zu exprimierendes Fremdgen hinter einem Baculovirus-Promotor anstelle eines viralen Gens, z. B. Polyhedrin, eingefügt ist, wie in Smith und Summers, US-Patent Nr. 4 745 051 beschrieben.
Ein Expressionskonstrukt schließt hierin einen DNA-Vektor, verwendbar als ein Intermediat für die Infektion oder Transformation eines Insektenzellsystems, ein, wobei der Vektor im Allgemeinen DNA enthält, die für einen Baculovirus-Transkriptionspromotor codiert, wahlweise, aber vorzugsweise, stromabwärts gefolgt von einer Insekten-Signal-DNA-Sequenz, die zum Steuern der Sekretion eines gewünschten Proteins fähig ist, und einer Stelle zur Insertion des Fremdgens, das für das Fremdprotein codiert, wobei die Signal-DNA-Sequenz und das Fremdgen unter die transkriptionale Kontrolle eines Baculovirus-Promotors gesetzt werden, wobei das Fremdgen hierin die codierende Sequenz für das PDGF- oder das KGF-Polypeptid ist.
Der Promotor zur Verwendung hierin kann eine transkriptionale Baculovirus-Promotorregion sein, abstammend von irgendeinem der über 500 Baculoviren, die im Allgemein Insekten, wie z. B. die Ordnungen Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Coleoptera und Hymenoptera, infizieren, einschließlich z. B., aber nicht beschränkt auf die viralen DNAs von Autographo californica MNPV, Bombyx mori NPV, Trichoplusia ni MNPV, Rachlplusia ou MNPV oder Galleria mellonella MNPV. Daher kann der transkriptionale Baculovirus-Promotor z. B. ein unmittelbar-früher Baculovirusgen-IEI- oder -EIN-Promotor; ein unmittelbar-frühes Gen in Verbindung mit einer verzögert-frühen Baculovirus-Gen-Promotorregion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem 39K und einem HindIII-Fragment, enthaltend ein verzögert-frühes Gen; oder ein später Baculovirus-Gen-Promotor sein. Die unmittelbar-frühen oder verzögert-frühen Promotoren können mit transkriptionalen Enhancer-Elementen verstärkt werden.
Besonders zur Verwendung hierin geeignet ist der starke Polyhedrinpromotor des Baculovirus, welcher einen hohen Expressionslevel eines DNA-Inserts steuert, wie in Friesen et al. (1986) „The Regulation of Baculovirus Gene Expression" in: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (W. Doerfler, Hrsg.); EP 127 839 und EP 155 476 beschrieben; und der Promotor des Gens, das für das p10-Protein codiert, wie in Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765–776 beschrieben.
Das Plasmid zur Verwendung hierin enthält für gewöhnlich außerdem das Polyhedrinpolyadenylierungssignal, wie in Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177 beschrieben, und ein prokaryotisches Ampicillin-Resistenzgen (amp) und einen Replikationsursprung zur Selektion und Vermehrung in E. coli. DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann außerdem eingeschlossen sein und ist im Allgemeinen von Genen für sezernierte bzw. sekretierte Insekten- oder Baculovirusproteine abgeleitet, wie z. B. das Baculovirus-Polyhedringen, wie in Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409 beschrieben, sowie Säugersignalsequenzen, wie z. B. diejenigen, die von Genen, die für menschliches a-Interferon codieren, abgeleitet sind, wie in Maeda et al., Nature (1985) 315: 592–594 beschrieben; menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid, wie in Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129 beschrieben; menschliches IL-2, wie in Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404 beschrieben; Mäuse-IL-3, wie in Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273 beschrieben; und menschliche Glucocerebrosidase, wie in Martin et al., DNA (1988) 7: 99 beschrieben.
Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen sind von Wirten wie z. B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori-Wirtszellen identifiziert worden und können hierin verwendet werden. Siehe z. B. die Beschreibung in Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47–55, Miller et al., in GENETIC ENGINEERING (Setlow, J.K. et al., Hrsg.), Bd. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279 und Maeda et al., Nature (1985) 315: 592–594. Eine Vielzahl solcher viraler Stämme ist öffentlich zugänglich, z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV. Solche Viren können als das Virus zur Transfektion von Wirtszellen wie z. B. Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet werden.
Andere Baculovirus-Gene zusätzlich zu dem Polyhedrin-Promotor können vorteilhaft in einem Baculovirus-Expressionssystem verwendet werden. Diese umfassen unmittelbar-frühe (alpha), verzögert-frühe (beta), späte (gamma) oder sehr späte (delta), gemäß der Phase der viralen Infektion, während der sie exprimiert werden. Die Expression dieser Gene geschieht sequentiell, wahrscheinlich als das Ergebnis eines „Kaskade"-Mechanismus transkriptionaler Regulation. Deshalb werden die unmittelbar-frühen Gene unmittelbar nach Infektion in der Abwesenheit anderer viraler Abläufe bzw. Funktionen exprimiert und ein oder mehrere der resultierenden Genprodukte induziert/induzieren die Transkription der verzögert-frühen Gene. Manche verzögert-frühen Genprodukte induzieren wiederum Transkription der späten Gene, und schließlich werden die sehr späten Gene unter der Kontrolle zuvor exprimierter Genprodukte aus einer oder mehreren der früheren Klassen exprimiert. Eine relativ gut definierte Komponente dieser regulatorischen Kaskade ist IEI, ein bevorzugtes unmittelbar-frühes Gen von Autographo californica-Nuclear-Polyhedrosis-Virus (AcMNPV). IEI wird in der Abwesenheit anderer viraler Abläufe exprimiert und codiert für ein Produkt, das die Transkription verschiedener Gene der verzögert-frühen Klasse einschließlich des bevorzugten 39K-Gens, wie in Guarino und Summers, J. Virol. (1986) 57: 563–571 und J. Virol. (1987) 61: 2091–2099 beschrieben, sowie später Gene, wie in Guanno und Summers, Virol. (1988) 162: 444–451 beschrieben, stimuliert.
Unmittelbar-frühe Gene, wie oberhalb beschrieben, können in Kombination mit einer Baculovirus-Genpromotorregion aus der verzögert-frühen Kategorie verwendet werden. Im Gegensatz zu den unmittelbar-frühen Genen benötigen solche verzögert-frühen Gene die Anwesenheit anderer viraler Gene oder Genprodukte, wie z. B. die der unmittelbar-frühen Gene. Die Kombination von unmittelbar-frühen Genen kann mit irgendeiner von verschiedenen verzögert-frühen Genpromotorregionen, wie z. B. 39K oder einer der verzögert-frühen Genpromotoren, gefunden auf dem HindIII-Fragment des Baculovirus-Genoms, erstellt werden. Im vorliegenden Fall kann die 39K-Promotorregion mit dem zu exprimierenden Fremdgen verbunden werden, so dass die Expression durch die Anwesenheit von IEI weiter kontrolliert werden kann, wie in L.A. Guarino und Summers (1986a), oberhalb zitiert, Guarino & Summers (1986b) J. Virol. (1986) 60: 215–223 und Guarino et al. (1986c), J. Virol. (1986) 60: 224–229 beschrieben.
Zusätzlich kann, wenn eine Kombination von unmittelbar-frühen Genen mit einer verzögert-frühen Genpromotorregion verwendet wird, eine Verstärkung der Expression von heterologen Genen durch die Anwesenheit einer Enhancersequenz in direkter cis-Verknüpfung mit der verzögert-frühen Genpromotorregion realisiert werden. Solche Enhancersequenzen sind durch ihre Verstärkung verzögert-früher Genexpression in Situationen, wo das unmittelbar-frühe Gen oder dessen Produkt limitierend ist, gekennzeichnet. Zum Beispiel kann die hr5-Enhancersequenz direkt, in cis, mit der verzögert-frühen Genpromotorregion, 39K, verknüpft werden, wobei sie die Expression der klonierten heterologen DNA, wie in Guarino und Summers (1986a), (1986b) und Guarino et al. (1986) beschrieben, verstärkt.
Das Polyhedringen wird als sehr spätes Gen klassifiziert. Deshalb benötigt eine Transkription von dem Polyhedrinpromotor die vorangehende Expression einer unbekannten, aber wahrscheinlich großen Anzahl anderer viraler und zellulärer Genprodukte. Wegen dieser verzögerten Expression des Polyhedrinpromotors werden Stand-der-Technik-BEVs wie z. B. das beispielhafte BEV-System, beschrieben von Smith und Summers z. B. im US-Patent Nr. 4 745 051 , Fremdgene nur als ein Resultat der Genexpression von dem Rest des viralen Genoms exprimieren, und nur, nachdem die virale Infektion gut im Gange ist. Dies stellt eine Beschränkung der Verwendung existierender BEVs dar. Das Vermögen der Wirtszelle, neu synthetisierte Proteine zu prozessieren, nimmt mit fortschreitender Baculovirusinfektion ab. Folglich findet Genexpression von dem Polyhedrinpromotor zu einer Zeit statt, wenn das Vermögen der Wirtszelle, neu synthetisierte Proteine zu prozessieren, möglicherweise für bestimmte Proteine, wie z. B. humanen Gewebeplasminogenaktivator, verringert ist. Als eine Folge ist die Expression sekretorischer Glycoproteine in BEV-Systemen aufgrund unvollständiger Sekretion des klonierten Genprodukts, wodurch das klonierte Genprodukt innerhalb der Zelle in einer unvollständig prozessierten Form eingeschlossen wird, kompliziert.
Während es anerkannt worden ist, dass eine Insektensignalsequenz zur Expression eines Fremdproteins, das gespalten werden kann, um ein reifes Protein zu erzeugen, verwendet werden kann, wird die vorliegende Erfindung vorzugsweise mit einer Säugersignalsequenz, z. B. der PDGF- oder der KGF- oder IGF- oder IGFBP-Signalsequenz, praktiziert.
Eine beispielhafte, hierin geeignete Insekten-Signalsequenz ist die Sequenz, die für ein Lepidopteren-Adipokinetikhormon (AKH)-Peptid codiert. Die AKH-Familie besteht aus kurzen blockierten Neuropeptiden, die Energiesubstratmobilisierung und -stoffwechsel in Insekten regulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine DNA-Sequenz, die für ein Lepidopteren-Manduca-sexta-AKH-Signalpeptid codiert, verwendet werden. Andere Insekten-AKH-Signalpeptide, wie z. B. jene von dem Orthoptera-Schistocerca-gregaria-Locus, können auch vorteilhaft eingesetzt werden. Eine weitere exemplarische Insekten-Signalsequenz ist die Sequenz, die für Cuticula-Proteine von Drosophila, wie z. B. CP1, CP2, CP3 oder CP4, codiert.
Zurzeit ist der am meisten verbreitet verwendete Transfervektor, der hierin zum Einführen von Fremdgenen in AcNPV verwendet werden kann, pAc373. Viele andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, können hierin ebenso verwendet werden. Materialien und Verfahren für Baculovirus-/Insektenzellexpressionssysteme sind von Firmen wie z. B. Invitrogen (San Diego, CA) („MaxBac"-Kit) in Form eines Kits kommerziell verfügbar. Die hierin verwendeten Techniken sind im Allgemeinen dem Fachmann bekannt und sind vollständig beschrieben in Sommers und Smith, A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, Texas A&M University (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156 und Luckow und Summers (1989). Diese schließen z. B. die Verwendung von pVL985 ein, das das Polyhedrinstartkodon von ATG zu ATT verändert und das eine BamHI-Klonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts von dem ATT einführt, wie in Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31 beschrieben.
Folglich kann z. B. zur Insektenzellexpression der vorliegenden Polypeptide die gewünschte DNA-Sequenz in den Transfervektor unter Verwendung von bekannten Techniken eingefügt werden. Ein Insektenzellwirt kann mit dem Transfervektor, der die eingefügte gewünschte DNA enthält, zusammen mit der genomischen DNA von Wildtyp-Baculovirus cotransformiert werden, gewöhnlich durch Cotransfektion. Dem Vektor und viralen Genom wird ermöglicht zu rekombinieren, was in einem rekombinanten Virus resultiert, das leicht identifiziert und gereinigt werden kann. Das verpackte rekombinante Virus kann verwendet werden, um Insektenwirtszellen zu infizieren, um die PDGF- und KGF-Polypeptide zu exprimieren.
Andere Verfahren, die hierin anwendbar sind, sind die Standardverfahren der Insektenzellkultur, Cotransfektion und Herstellung von Plasmiden und sind dargelegt in Summers und Smith (1987), oberhalb zitiert. Diese Referenz betrifft außerdem die Standardverfahren der Klonierung von Genen in AcMNPV-Transfervektoren, Plasmid-DNA-Isolierung, das Transferieren von Genen in das AcmMNPV-Genom, Virus-DNA-Reinigung, Radionuklidmarkierung rekombinanter Proteine und Herstellung von Insektenzellkulturmedien. Die Verfahrensweisen für die Kultivierung von Viren und Zellen sind beschrieben in Volkman und Summers, J. Virol. (1975) 19: 820–832 und Volkman et al., J. Virol. (1976) 19: 820–832.
EXPRESSION IN SÄUGERZELLEN
Typische Promotoren zur Säugerzellexpression schließen u. a. den frühen SV40-Promotor, den CMV-Promotor, den Mäuse-Mammatumorvirus-LTR-Promotor, den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad MLP) und den Herpes-simplex-Virus-Promotor ein. Andere, nicht-virale Promotoren, wie z. B. ein Promotor, abgeleitet von dem murinen Metallothioneingen, werden ebenso in Säugerkonstrukten Verwendung finden. Die Expression in Säugern kann, abhängig von dem Promotor, entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein. Typischerweise werden außerdem Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, lokalisiert 3' von dem Translationsstoppkodon, vorhanden sein. Vorzugsweise ist außerdem eine Sequenz zur Optimierung der Initiation der Translation, lokalisiert 5' von der für das PDGF- oder das KGF-Polypeptid codierenden Sequenz, vorhanden. Beispiele von Transkriptionsterminator-/Polyadenylierungssignalen schließen jene, die von SV40 abgeleitet sind, wie in Sambrook et al. (1989), vorher zitiert, beschrieben, ein. Introns, die Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen enthalten, können außerdem in die Konstrukte der vorliegenden Erfindung konstruiert werden.
Außerdem können hierin Enhancerelemente verwendet werden, um die Expressionslevel der Säugerkonstrukte zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40-frühes-Gen-Enhancer, wie in Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761 beschrieben, und den Enhancer/Promotor abgeleitet von der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous-Sarcoma-Virus, wie in Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777 beschrieben, und menschliches Cytomegalie-Virus, wie in Boshart et al., Cell (1985) 41: 521 beschrieben, ein. Außerdem kann eine Leadersequenz vorhanden sein, die eine Sequenz einschließt, die für ein Signalpeptid codiert, um für die Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen zu sorgen. Vorzugsweise sind Prozessierungsstellen zwischen dem Leaderfragment und dem Gen von Interesse codiert, so dass die Leadersequenz entweder in vivo oder in vitro abgespalten werden kann. Der aus drei Teilen bestehende Leader von Adenovirus ist ein Beispiel einer Leadersequenz, die für die Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen sorgt.
Es gibt Expressionsvektoren, die für die transiente Expression von DNA, die für das Zielpolypeptid codiert, in Säugerzellen sorgen. Im Allgemeinen beinhaltet transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der imstande ist, sich effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Level eines gewünschten Polypeptids, codiert von dem Expressionsvektor, synthetisiert. Transiente Expressionssysteme, umfassend einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle, erlauben die bequeme positive Identifikation von Polypeptiden, codiert durch klonierte DNAs, sowie das schnelle Screenen bzw. Durchmustern solcher Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Folglich sind transiente Expressionssysteme besonders nützlich zum Zwecke der Identifikation von Analoga und Varianten des Zielpolypeptids, die Zielpolypeptid-ähnliche Aktivität haben.
Der Expressionsvektor, wie in EP 0 622 456 A1 offenbart zur Expression der PDGF-B-Kette, ist außerdem für die Erfindung verwendbar zur Expression von PDGF durch einen viralen Promotor, der in Säugerzellen funktionsfähig ist.
Sobald fertig, können die Expressionsvektoren für Säuger verwendet werden, um eine beliebige von vielen Säugerzellen zu transformieren. Verfahren zum Einführen heterologer Polynukleotide in Säugerzellen sind im Stand der Technik bekannt und schließen dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatfällung, polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapseln des Polynukleotids/der Polynukleotide in Liposome und direkte Mikroinjektion der DNA in die Zellkerne ein. Allgemeine Aspekte von Säugerzellwirtsystem-Transformationen werden von Axel in US 4 399 216 beschrieben.
Säugerzelllinien, die als Wirte zur Expression verfügbar sind, sind ebenso bekannt und schließen viele immortalisierte Zelllinien, erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC), ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Eierstockzellen von chinesischen Hamstern („Chinese-Hamster-Ovary-” bzw. CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Baby-Hamster-Nieren (BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), menschliche Leberkarzinomzellen (z. B. Hep G2), menschliche Embryonal-Nierenzellen, Baby-Hamster-Nierenzellen, Maus-Sertoli-Zellen, Hundenierenzellen, Buffalo-Rattenleber-Zellen, menschliche Lungenzellen, menschliche Leberzellen, Mäuse-Mamma-Tumorzellen sowie andere.
Die zur Produktion des Zielpolypeptids dieser Erfindung verwendeten Säugerwirtszellen können in einer Vielfalt von Medien kultiviert werden. Kommerziell verfügbare Medien, wie z. B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Zusätzlich können beliebige der Medien, die in Ham und Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes und Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255, US-Patent Nrn. 4 767 704 , 4 657 866 , 4 927 762 oder 4 560 655 , WO 90/103430 , WO 87/00195 und US-RE 30 985 beschrieben sind, als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Beliebige dieser Medien können wie notwendig durch Hormone und/oder andere Wachstumsfaktoren wie z. B. Insulin, Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor, Salze (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffer (wie z. B. HEPES), Nukleoside (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. Gentamycin^TM M-Drug), Spurenelemente (definiert als anorganische Verbindungen, die gewöhnlich in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder eine äquivalente Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere notwendigen Ergänzungen oder „supplements" können außerdem in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann bekannt wären, eingeschlossen sein. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH u. dgl., sind jene, die zuvor mit der zur Expression ausgewählten Wirtszelle benutzt wurden und werden dem durchschnittlichen Fachmann offenkundig sein.
GENTHERAPEUTISCHE VERABREICHUNG VON PDGF, KGF, UND IGF ODER PDGF, KGF, IGF UND IGFBP
Zum Zwecke der Gentherapie können die Polynukleotide, die für PDGF, KGF und IGF oder PDGF, KGF, IGF und IGFBP codieren, dem Tier zur Expression verabreicht werden. Ferner können die Polynukleotide entweder als nacktes Polynukleotid verabreicht werden oder können zum Zwecke der Abgabe („delivery”) mit anderen Polynukleotiden, wie z. B. viralen Vektoren, verbunden sein. Solche Polynukleotide könne außerdem in Liposomen oder anderen Abgabemitteln eingekapselt sein, wie im Stand der Technik üblich. Beispiele für die Verwendungen von Gentherapie-Protokollen zur Verabreichung von KGF, PDGF, IGF und IGFBP sind unterhalb genau beschrieben.
Wo Gentherapie-Techniken auf die Erfindung angewendet werden, können KGF, PDGF und IGI von verschiedenen Vektoren oder von demselben Vektor exprimiert werden, auch können KGF, PDGF, IGF und IGFBP von verschieden Vektoren oder von demselben Vektor exprimiert werden. Die regulatorische Kontrolle jedes Genprodukts ist verschieden und ein Fachmann auf dem Gebiet der Gentherapie und Expression kann die geeigneten regulatorischen Sequenzen für KGF, PDGF und IGF oder, wo auch IGFBP verabreicht wird, auch für IGFBP geeignete regulatorische Sequenzen, auswählen.
Alternativ können Vektoren, umfassend Polynukleotidsequenzen, die für die KGF- und PDGF-Polypeptide codieren, und außerdem das IGF-Polypeptid, und außerdem IGFBP, wo IGFBP auch verabreicht wird, direkt zur Gentherapie verwendet werden und unter der Verwendung von Standard-Genabgabeprotokollen verabreicht werden. In diesem Zusammenhang können die Nukleotidsequenzen, die für die KGF-, PDGF- und IGF-Polypeptide und auch IGFBP, wo IGFBP außerdem verabreicht wird, codieren, stabil in das Wirtszellengenom integriert werden oder auf einem stabilen episomalen Element in den Wirtszellen aufrechterhalten werden. Verfahren zur Abgabe von Genen sind im Stand der Technik bekannt, wie in US-Patent Nr. 5 399 346 beschrieben.
Gentherapie-Strategien zur Abgabe von Konstrukten der Erfindung können Herangehensweisen mit viralen oder nicht-viralen Vektoren in in-vivo- oder ex-vivo-Modalität verwenden. Die Expression einer solchen codierten Sequenz kann unter Verwendung von endogenen Säugerpromotoren oder heterologen Promotoren induziert werden. Die Expression der codierenden Sequenz in vivo kann entweder konstitutiv oder reguliert sein.
Zur Abgabe unter der Verwendung von viralen Vektoren kann eine beliebige Zahl viraler Vektoren verwendet werden, wie in Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 51–64 (1994) beschrieben. Zum Beispiel kann die codierende Sequenz in Plasmide eingefügt werden, entworfen zur Expression in retroviralen Vektoren, wie in Kimura et al., Human Gene Therapy (1994) 5: 845–852 beschrieben, adenoviralen Vektoren, wie in Connelly et al., Human Gene Therapy (1995) 6: 185–193 beschrieben, adeno-assoziierten viralen Vektoren, wie in Kaplitt et al., Nature Genetics (1994) 6: 148–153 beschrieben, und Sindbisvektoren. Promotoren, die zur Verwendung mit diesen Vektoren geeignet sind, schließen den retroviralen Moloney-LTR, den CMV-Promotor und den Maus-Albumin-Promotor ein. Ein replikationsinkompetentes freies Virus kann hergestellt werden und direkt in das Tier oder den Menschen injiziert werden oder durch Transduktion einer autologen Zelle ex vivo, gefolgt von Injektion in vivo, wie in Zatloukal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 5148–5152 beschrieben.
Die veränderte codierende Sequenz kann außerdem zur Expression des Polypeptids in vivo oder ex vivo in Plasmid eingefügt werden. Für eine in vivo-Therapie kann die codierende Sequenz durch direkte Injektion in Gewebe oder durch intravenöse Infusion abgegeben werden. In dieser Hinsicht zur Verwendung geeignete Promotoren schließen endogene und heterologe Promotoren, wie z. B. CMV, ein. Ferner kann ein synthetischer T7T7/T7OB-Promotor gemäß Chen et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 2114–2120 konstruiert werden, wo die T7-Polymerase unter der regulatorischen Kontrolle ihres eigenen Promotors ist und die Transkription der codierenden Sequenz steuert, die außerdem unter die Kontrolle eines T7-Promotors gestellt ist. Die codierende Sequenz kann in einer Formulierung, umfassend einen Puffer, der die codierende Sequenz stabilisieren und deren Transduktion in Zellen erleichtern und/oder Targetierung bereitstellen kann, injiziert werden, wie in Zhu et al., Science (1993) 261: 209–211 beschrieben.
Die Expression der codierenden Sequenz in vivo nach Abgabe zum Zweck der Gentherapie durch entweder virale oder nicht-virale Vektoren kann durch die Verwendung von regulierten Genexpressionspromotoren, wie in Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89: 5547–5551 beschrieben, für maximale Wirksamkeit und Sicherheit reguliert werden. Zum Beispiel kann die codierende Sequenz durch auf Tetracyclin ansprechende Promotoren reguliert werden. Diese Promotoren können auf eine positive oder negative Weise durch Behandlung mit dem Regulatormolekül reguliert werden.
Zur nicht-viralen Abgabe der codierenden Sequenz kann die Sequenz in konventionelle Vektoren eingefügt werden, die konventionelle Kontrollsequenzen zur Expression auf einem hohen Level enthalten, und dann mit synthetischen Gentransfermolekülen, wie z. B. polymeren DNA-bindenden Kationen wie Polylysin, Protamin und Albumin inkubiert werden, die verbunden sind mit Zelltargetingliganden, wie z. B. Asialoorosomucoid, wie in Wu und Wu, J. Biol. Chem. (1987) 262: 4429–4432 beschrieben; Insulin, wie in Hucked et al., Biochem. Pharmacol. 40: 253–263 (1990) beschrieben; Galactose, wie in Plank et al., Bioconjugate Chem. 3: 533–539 (1992) beschrieben; Lactose, wie in Midoux et al., Nucleic Acids Res. 21: 871–878 (1993) beschrieben; oder Transferrin, wie in Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410–3414 (1990) beschrieben. Andere Abgabesysteme schließen die Verwendung von Liposomen zum Einkapseln von DNA, umfassend das Gen unter der Kontrolle einer Vielzahl von gewebespezifischen oder ubiquitär aktiven Promotoren, ein, wie in Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307–11311 (1993) und Philip et al., Mol. Cell Biol. 14: 2411–2418 (1994) beschrieben. Ferner schließen zur Verwendung geeignete nicht-virale Abgabe mechanische Abgabesysteme, wie z. B. die biolistische bzw. „biolistic"-Herangehensweise, wie in Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91(24): 11581–11585 beschrieben, ein. Überdies können die codierende Sequenz und das Expressionsprodukt davon durch Ablagerung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien abgegeben werden. Andere konventionelle Verfahren zum Abgeben von Genen, die zum Abgeben der codierenden Sequenz verwendet werden können, schließen z. B. die Verwendung einer handgehaltenen Gentransfer-Partikelkanone, wie in US 5 149 655 beschrieben; die Verwendung ionisierender Strahlung zur Aktivierung des transferierten Gens, wie in US 5 206 152 und PCT-Anmeldung WO 92/11033 beschrieben, ein.
Die Anwendung der Gentherapie-Technologie in Hinblick auf die in der Erfindung verwendeten Peptide und Polypeptide und deren Analoga oder Varianten kann durchgeführt werden, wo es nützlich ist, eine Wunde durch Gentherapie zu behandeln, z. B. bei chronischen Wunden, wie z. B. Geschwüren, oder bei einer beliebigen Wunde, in welcher die Zellen an der Stelle der Wunde auf ein Gentherapie-Protokoll ansprechen.
Im Allgemeinen kann Gentherapie gemäß der Erfindung in allen Situationen angewendet werden, wo es nützlich ist, eine Wunde durch Verabreichung einer ausreichenden Menge eines Peptids der Erfindung oder dessen Analoga, Varianten oder dominantes Negativum gemäß einem Gentherapie-Protokoll zu heilen, z. B. zum Modulieren der normalen Aktivität von Bindungspaarwechselwirkungen. Nachträgliche Verabreichung kann erforderlich sein, abhängig von dem Zustand der Wunde und der Umgebung, mit der sie präsentiert wird.
Vektoren, die für KGF-, PDGF-, IGF- und IGFBP-Polypeptide codieren, können außerdem vor der Abgabe an das Subjekt oder an von diesem stammende Zellen in Liposomen gepackt werden. Eine Lipideinkapselung wird im Allgemeinen unter Verwendung von Liposomen, welche dazu fähig sind, Nukleinsäure stabil zu binden oder einzufangen bzw. einzuschließen und zurückzuhalten, erreicht. Das Verhältnis kondensierter DNA zur Lipidpräparation kann variieren, wird aber im Allgemeinen etwa 1:1 (mg DNA:Mikromol Lipid) oder mehr des Lipids sein. Für einen Überblick zur Verwendung von Liposomen als Träger zur Abgabe von Nukleinsäuren siehe Hug und Sleight, Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1–17 (1991); Straubinger et al., Methods of Enzymology, 101: 512–527 (1983).
Liposomale Zubereitungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen kationische (positive geladene), anionische (negativ geladene) und neutrale Zubereitungen ein, wobei kationische Liposomen im Besonderen bevorzugt sind. Von kationischen Liposomen wurde gezeigt, dass sie eine intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413–7416); mRNA (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 6077–6081) und gereinigten Transkriptionsfaktoren (Debs et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 10189–10192) in funktioneller Form vermitteln.
Kationische Liposomen sind leicht erhältlich. Zum Beispiel sind N[1-2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)-Liposomen unter der Marke Lipofectin von GIBCO BRL, Grand Island, N.Y., erhältlich (siehe außerdem Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413–7416). Andere kommerziell erhältliche Liposome schließen „transfectace" (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer) ein. Andere kationische Liposome können aus leicht erhältlichen Materialien unter der Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken hergestellt werden. Siehe z. B. Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194–4198; PCT-Publikation Nr. WO 90/11092 für eine Beschreibung der Synthese von DOTAP (1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan)-Liposomen.
Ähnlich sind anionische und neutrale Liposome leicht erhältlich, wie z. B. von Avanti polar Lipids (Birmingham, AL) oder können leicht unter der Verwendung von leicht erhältlichen Materialien hergestellt werden. Solche Materialien schließen Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) u. a. ein. Diese Materialien können außerdem mit den Ausgangsmaterialien DOTMA und DOTAP in geeigneten Verhältnissen gemischt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung dieser Materialien sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Liposome können multilamellare Vesikel (MLVs), kleine unilamellare Vesikel (SUVs) oder große unilamellare Vesikel (LUVs) umfassen. Die verschiedenen Liposom-Nukleinsäurekomplexe werden hergestellt unter der Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Siehe z. B. Straubinger et al. in Methods of Immunology (1983), Bd. 101, S. 512–527; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194–4198; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394: 483; Wilson et al., Cell (1979) 17: 77; Deamer und Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76: 836; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3348; Enoch und Strittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76; 145; Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 145 und Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215: 166.
Liposome sind in die Definition eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers eingeschlossen. Der Ausdruck „Liposome" bezieht sich z. B. auf die Liposomzusammensetzungen beschrieben in US-Patent 5 422 120 , WO 95/13796 , WO 94/23697 , WO 91/14445 und EP 524 968 B1 . Liposome können die pharmazeutischen Träger für die Polynukleotide oder Polypeptide der Erfindung oder für die Kombination der beiden sein. Das therapeutische Mittel kann mit einem Liposom konjugiert sein oder kann mit einem Hydrogelpolymer konjugiert sein, und das Hydrogelpolymer (oder eine Komponente eines Hydrogelpolymers) mit einem Liposom konjugiert oder von einem Liposom eingekapselt sein.
Die rekombinanten Vektoren (ob eingekapselt in Liposome oder nicht) können in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie oberhalb beschrieben, verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden ausreichend genetisches Material umfassen, um eine therapeutisch wirksame Menge des Analogons oder der Analoga, wie oberhalb beschrieben, zu erzeugen. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Dosis von ungefähr 0,05 mg/kg bis ungefähr 50 mg/kg der DNA-Konstrukte in dem Individuum, welchem sie verabreicht wird, sein.
Sobald sie formuliert sind, können die Zusammensetzungen der Erfindung dem Subjekt direkt verabreicht werden oder alternativ, im Fall der oberhalb beschriebenen Vektoren, ex vivo an Zellen, die von dem Subjekt stammen, abgegeben werden. Verfahren zur Abgabe ex vivo und Reimplantation transformierter Zellen in ein Subjekt sind im Stand der Technik bekannt und z. B. in WO 93/14778 beschrieben. Im Allgemeinen werden solche Verfahren Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation, polybren-vermittelte Transfektion, Protoblastenfusion, Elektroporation, Einkapseln des Polynukleotids/der Polynukleotide in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne, die alle im Stand der Technik gut bekannt sind, sein.
Eine Verabreichung der therapeutischen Kombinationen der Erfindung kann z. B. durch topische Creme, Schaum, Injektion, Aerosolspray, in einer Gelmatrix, einem Schwamm, Tropfen und einer Waschung („wash") erreicht werden. Die Verabreichung kann z. B. durch lokale, orale, intradermale, subkutane, intraluminale, intragastrale und intraperitoneale Verabreichung sein, wobei eine geeignete Formulierung der ausgewählten Zusammensetzung aus einer für die jeweilige Behandlung geeigneten Kombination der Therapeutika zusammengestellt ist.
Die Therapeutika der Erfindung können in einer therapeutisch wirksamen Dosierung und Menge im Verlauf eines therapeutisch wirksamen Protokolls zur Behandlung des Patienten verabreicht werden. Die anfänglichen und beliebige nachfolgend verabreichte Dosen werden vom Alter, Gewicht, dem Zustand des Patienten und der Krankheit, Wunde, Störung oder dem biologischen Zustand, die/der behandelt wird, abhängen. Abhängig vom Therapeutikum wird die Dosierung und das Protokoll der Verabreichung variieren und die Dosis wird außerdem von dem ausgewählten Verfahren der Verabreichung, z. B. lokale oder systemische Verabreichung, abhängen.
Die Wunde, auf welche die therapeutischen Kombinationen angewendet werden, kann innerlich oder äußerlich sein und kann auf ein beliebiges Gewebe, das eine Wunde aufweist, z. B. Epithelgewebe, gerichtet sein. Zur topischen Verabreichung von IGF kann eine Zinkoxidformulierung angewendet werden, die die lokale Produktion von IGF induziert, wie in Tarnow et al., Scand J. Plast Reconstr. Hand Surg. 28: 255–259 (1994) beschrieben. Die Verabreichung der therapeutischen Kombinationen der Erfindung kann durch eine beliebige Kombination der Therapeutika erreicht werden, z. B. durch Verabreichung von PDGF und KGF, gefolgt von IGF mit IGFBP, oder durch Verabreichung von PDGF, KGF, IGF und IGFBP zur selben Zeit oder in enger zeitlicher Nähe. Die Dosierungen jedes Therapeutikums für eine gegebene Wunde und einen bestimmten Patienten werden konzipiert, um eine maximal wirksame Dosis für das Therapeutikum zu erreichen. Die für eine gegebene Behandlung geeigneten Dosierungen können von der bestimmten, für die Behandlung ausgewählten Kombination von Therapeutika abhängen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass IGF allein weniger wirksam ist als IGF, verabreicht in Verbindung mit IGFBP.
Die Dosen für eine bestimmte Wunde werden auf einer Patient-zu-Patient-Basis bestimmt werden und von der Größe der Wunde, der Art der Verletzung und der Zusammensetzung, die angewendet wird, abhängen. Dosen für die individuellen Therapeutika sind innerhalb von Bereichen bestimmt worden. Zum Beispiel ist eine wirksame Dosis von PDGF zu 5 ng/mm² oder höher, wenn topisch angewendet, wie in US-Patent Nr. 4 861 757 beschrieben, und wenigstens ein 1 ng/ml lokaler Konzentration einer Isoform von PDGF (z. B. PDGF-AA, PDGF-BB oder PDGF-AB), bis zu ungefähr 30 ng/ml lokaler Konzentration angewendet auf eine Population von Fibroblasten, wie in Lepisto et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 393–399 (1995) beschrieben, bestimmt worden. PDGF kann in einer Carboxymethylcellulose-Gelformulierung in Konzentrationen von ungefähr 10 μg/g bis ungefähr 500 μg/g Gel, ungefähr 20 μg/g bis ungefähr 200 μg/g und ungefähr 30 μg/g bis ungefähr 100 μg/g Gel, optimalerweise ungefähr 100 μg/g Gel, verabreicht werden. Wirksamkeit von PDGF ist innerhalb eines Bereichs von ungefähr 3 μg/ml verabreichte Lösung bis ungefähr 300 μg/ml verabreichte Lösung erreicht worden.
Ungefähr 50 μl KGF einer Konzentration von ungefähr 5 μg/ml sind wirksam zur Wundheilung bei topischer Anwendung auf Epithelgewebe, wie in Sotozono et al., Invest. Ophthal. Vis. Science 36: 1524–29 (1995) beschrieben. Wie in US-Patent Nr. 4 861 757 beschrieben, bewegt sich eine wirksame Menge von IGF, wenn gleichzeitig mit PDGF verabreicht, in dem Bereich von wenigstens 2,5 ng/mm² bis ungefähr 5 ng/mm², mit einem Gewichtsverhältnis von PDGF zu IGF in dem Bereich von ungefähr 1:10 bis ungefähr 25:1, wobei die wirksamsten Gewichtsverhältnisse PDGF zu IGF von ungefähr 1:1 bis ungefähr 2:1 sind. Es wurde gezeigt, dass eine verabreichte Kombination von IGF mit IGFBP die Wundheilung bei Dosisleveln von ungefähr 5 μg IGF mit ungefähr 1,5 μg phosphoryliertem IGFBP in einem molaren Verhältnis von ungefähr 11:1 IGF:IGFBP verbessert, wie in Jyung et al., Surgery 115: 233–239 (1994) beschrieben.
Zur Verabreichung von Polypeptidtherapeutika, z. B. PDGF-, KGF-, IGF- und IGFBP-Polypeptide, kann sich die Dosierung in dem Bereich von ungefähr 5 μg bis ungefähr 50 μg/kg Gewebe, auf das die Anwendung gerichtet ist, außerdem ungefähr 50 μg bis zu ungefähr 5 mg/kg, außerdem ungefähr 100 μg bis ungefähr 500 μg/kg Gewebe und ungefähr 200 bis ungefähr 250 μg/kg bewegen. Für Polynukleotidtherapeutika, z. B. in einem Gentherapie-Verabreichungsprotokoll, können Vektoren, die exprimierbare Konstrukte einschließlich PDGF, KGF, IGF und IGFBP codierender Sequenzen enthalten, abhängig von der Expressionsstärke des Polynukleotids im Patienten zur auf Gewebe gerichteten bzw. targetierten Verabreichung in einem Bereich von ungefähr 100 ng bis ungefähr 200 mg DNA für lokale Verabreichung in einem Gentherapie-Protokoll, außerdem ungefähr 500 ng bis etwa 50 mg, außerdem ungefähr 1 μg bis ungefähr 2 mg DNA, ungefähr 5 μg DNA bis ungefähr 500 μg DNA und ungefähr 20 μg bis ungefähr 100 μg während einer lokalen Verabreichung in einem Gentherapie-Protokoll und ungefähr 250 μg pro Injektion oder Verabreichung verabreicht werden. Faktoren wie z. B. Wirkungsweise und Wirksamkeit von Transformation und Expression sind deshalb Überlegungen, die die für äußerste Wirksamkeit benötigte Dosierung für die Verabreichung von DNA-Therapeutika beeinflussen werden. Wo eine größere Expression auf einer größeren Fläche von Gewebe gewünscht ist, können größere Mengen von DNA oder die gleichen Mengen, erneut verabreicht in einem sukzessiven Protokoll von Verabreichungen, oder mehrfache Verabreichungen auf verschiedene angrenzende oder nahe Gewebeteile von z. B. einer Wundstelle, erforderlich sein, um ein positives therapeutisches Ergebnis herbeizuführen. In allen Fällen werden Routineexperimente in klinischen Versuchen spezifische Bereiche für optimalen therapeutischen Effekt, für jedes Therapeutikum, jedes Verabreichungsprotokoll bestimmen und wird die Verabreichung an spezifische Patienten außerdem an wirksame und sichere Bereiche, abhängig vom Zustand und der Ansprechempfindlichkeit auf initiale Verabreichungen des Patienten, angepasst werden.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die detaillierte Beschreibung deutlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die detaillierte Beschreibung, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigt, nur als Veranschaulichung gegeben wird, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Rahmens der Erfindung dem Fachmann durch diese detaillierte Beschreibung offenkundig werden werden. Die folgenden Beispiele sind nur beispielhaft und sollen die Erfindung nicht einschränken.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, welche besonders vorteilhafte Ausführungsformen darlegen. Jedoch sollte angemerkt werden, dass diese Ausführungsformen veranschaulichend sind und nicht ausgelegt werden sollen, die Erfindung in irgendeiner Art und Weise einzuschränken.
BEISPIEL 1
Verbrennungen zweiten Grades werden mit einer Sprayformulierung, enthaltend 10 μg/ml KGF, 30 ng/ml einer PDGF-Isoform, 10 ng/ml IGF-1 und 30 ng/ml IGFBP-1, behandelt. Eine Lufttrocknung des Sprays wird zugelassen. Erneute Anwendung wird alle paar Stunden vorgeschlagen.
BEISPIEL 2
Eine Nahtwunde wird verschlossen und eine lokale Salbe, hergestellt aus 10% KGF und 5% PDGF, wird vor dem Verbinden auf der Naht angewendet. Erneute Anwendung der Salbe wird dreimal täglich angewiesen.
BEISPIEL 3
Eine 20% Zinkoxidformulierung, die außerdem 5% KGF, 2,5% PDGF und 10% IGFBP enthält, wird auf geringe Abschürfungen, Sonnenbrände und wundgeriebene Stellen zur schnelleren Heilung dieser Wunden angewendet.
BEISPIEL 4
Eine liposomale Formulierung wird verwendet, um KGF-, PDGF-, IGF- und IGFBP-DNA jeweils in einem Vektor zur Expression einzukapseln. Das Verhältnis von DNA, bezogen auf das Gewicht, ist 10:5:2,5:7,5. Die liposomale Zusammensetzung wird in einer Gelkapsel oral zur Behandlung gastrointestinaler Geschwüre mit täglicher Wiederverabreichung für einen Zeitraum von ungefähr einem Monat oder bis eine signifikante Verbesserung eine verringerte Verabreichungsfrequenz verlangt, verabreicht.

Claims

Verwendung eines ersten Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines Thrombozyten-Wachstumsfaktors (PDGF) und eines zweiten Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) und eines dritten Polypeptids mit der biologischen Aktivität von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Reparieren oder Verhindern von Epithelzellschädigung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das erste Polypeptid ein Volllängen-PDGF-Polypeptid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das erste Polypeptid ein biologisch aktives Fragment eines Volllängen-PDGF-Polypeptids umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das erste Polypeptid eine PDGF-A-Kette oder PDGF-B-Kette umfasst.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das erste Polypeptid durch Expression eines DNA-Moleküls, das für PDGF codiert, in einer Wirtszelle produziert ist, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das zweite Polypeptid einen Volllängen-KGF umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das zweite Polypeptid ein biologisch aktives Fragment eines Volllängen-KGF-Polypeptids umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das zweite Polypeptid durch Expression eines DNA-Moleküls, das für KGF codiert, in einer Wirtszelle produziert ist, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das dritte Polypeptid einen Volllängen-IGF umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das dritte Polypeptid ein biologisch aktives Fragment von IGF umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das dritte Polypeptid IGF-1 oder IGF-2 ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das dritte Polypeptid durch Expression eines DNA-Moleküls, das für IGF codiert, in einer Wirtszelle produziert ist, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Sängerzelle oder eine Insektenzelle ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend ein viertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität von Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-Bindungsprotein (IGFBP).
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das vierte Polypeptid ein Volllängen-IGFBP umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das vierte Polypeptid ein biologisch aktives Fragment eines IGFBP umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das IGFBP IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 oder IGFBP-6 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das vierte Polypeptid durch Expression eines DNA-Moleküls, das für ein IGFBP codiert, in einer Wirtszelle produziert ist, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle ist.
Verwendung eines ersten DNA-Moleküls, eines zweiten DNA-Moleküls und eines dritten DNA-Moleküls, wobei das erste DNA-Molekül eine erste Nucleotidsequenz, die für PDGF codiert, umfasst, das zweite DNA-Molekül eine zweite Nucleotidsequenz, die für KGF codiert, umfasst und das dritte DNA-Molekül eine dritte Nucleotidsequenz, die für IGF codiert, umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zum Reparieren oder Verhindern von Epithelzellschädigung.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das erste DNA-Molekül für die PDGF-A-Kette oder die PDGF-B-Kette codiert.
Verwendung nach den Ansprüchen 18 oder 19, wobei das zweite DNA-Molekül für ein Volllängen-KGF-Polypeptid codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, ferner umfassend ein viertes DNA-Molekül, das eine vierte Nucleotidsequenz, die für IGFBP codiert, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das vierte DNA-Molekül für IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 oder IGFBP-6 codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die DNA-Moleküle auf dem gleichen oder separaten Plasmid(en) vorhanden sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei die DNA-Moleküle in Liposomen eingekapselt sind.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Epithelzellen Zellen der Haut, der Magenauskleidung („gastric lining") oder der Intestinalauskleidung („intestinal lining") sind.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Medikament in Form einer Creme, eines Schaums, einer injizierbaren Lösung, eines Sprays, einer Gelmatrix, eines Schwamms, von Tropfen oder einer Spülung ist.