ES2224178T3 - Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas. - Google Patents
Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas.Info
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Abstract
LA INVENCION DESCRIBE UNA COMPOSICION TERAPEUTICA PARA LA REPARACION DE HERIDAS EPITELIALES QUE ES UNA COMBINACION DE PDGF Y KGF. ADEMAS, LA INVENCION DESCRIBE UNA COMPOSICION PARA LA REPARACION DE HERIDAS EPITELIALES QUE ES UNA COMBINACION TERAPEUTICA DE PDGF, KGF Y IGF. ADEMAS, LA INVENCION DESCRIBE UNA COMPOSICION TERAPEUTICA DE PDGF, KGF, IGF Y IGFBP PARA LA REPARACION DE HERIDAS EPITELIALES.
Description
Combinación de PDGF, KGF, IGF e IGFBP para la
cicatrización de heridas.
Esta invención se refiere a la utilización de un
polipéptido que tiene la actividad biológica de un factor de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y de un polipéptido que
tiene la actividad biológica del factor de crecimiento de los
queratinocitos (KGF) para el tratamiento o prevención del daño en
células epiteliales. Esta invención también se refiere a la
utilización de un polipéptido que tiene la actividad biológica de un
factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-1
o IGF-2) en combinación con la combinación PDGF/KGF
de la invención; la combinación PDGF/KGF/IGF es útil para el
tratamiento o prevención del daño en células epiteliales,
constituyendo una mejora respecto a métodos previos para el
tratamiento del daño en células epiteliales. La invención se refiere
además a la utilización de un polipéptido que tiene la actividad
biológica de una proteína transportadora del factor de crecimiento
semejante a la insulina (IGFBP) en combinación con un IGF y en
combinación, además, con la combinación PDGF/KGF de la invención.
Esta invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que
incluyen la combinación PDGF/KGF, la combinación PDGF/KGF/IGF, y la
combinación PDGF/KGF/IGF/IGFBP para el tratamiento y la prevención
del daño en células epiteliales. Esta invención también se refiere a
la utilización de ADN que codifica PDGF, ADN que codifica KGF, ADN
que codifica un IGF, y ADN que codifica una IGFBP para dicho
tratamiento y prevención, como una combinación PDGF/KGF o como una
combinación PDGF/KGF/IGF, o como una combinación PDGF/KGF/IGF/IGFBP.
Más aún, la presente invención se refiere a kits que contienen PDGF
y KGF, a kits que contienen PDGF, KGF e IGF, y a kits que contienen
PDGF, KGF, IGF e IGFBP, y/o a kits que contienen ADN que codifica
las tres combinaciones mencionadas.
La solicitud de patente EP 0 619 370 describe la
utilización de KGF para la cicatrización de heridas. También puede
utilizarse PDGF para la cicatrización de heridas debido a su
capacidad de estimular células derivadas del mesénquima, como se
describe en la Patente de EEUU No. 5.187.263.
Los factores de crecimiento semejantes a la
insulina, IGF e IGF-2, han sido descritos y
estudiados en este campo. IGF está descrito en Rinderknecht, J.
Biol. Chem. 253: 2769 (1978), y se ha visto que actúa
como un mitógeno en varios tipos celulares distintos como se
describe en EP 0.128.733. De manera similar a la insulina, los IGF
estimulan la fosforilación de restos de tirosina específicos del
dominio citoplásmico de los receptores a los que se unen los IGF,
como se describe en WO 93/98826. IGF-II se describe
en Rinderknecht, FEBS Letters, (1978) 89: 283.
Los factores de crecimiento semejantes a la
insulina también se conocen como somatomedinas, y se han
identificado en varias especies de animales como polipéptidos que
actúan estimulando el crecimiento de células en diferentes tejidos y
tipos celulares, particularmente durante el desarrollo. Los efectos
de estimulación del crecimiento de las somatomedinas incluyen
incremento de la multiplicación celular y la estimulación de la
proliferación del cartílago, estimulación del transporte de
aminoácidos, estimulación de la síntesis de ARN, ADN y proteínas, y
estimulación de la incorporación de sulfato en proteoglicanos y de
prolina en colágeno. Una gran parte del crecimiento postnatal en
mamíferos se debe a la estimulación del crecimiento del cartílago
por las somatomedinas y el crecimiento en el útero también puede ser
dependiente de las somatomedinas.
Los usos de IGF como un agente conocido que
estimula y promueve el crecimiento, incluyen su utilización en la
reparación de huesos y en terapia de reemplazamiento, como se
describe en EP 303 855; como un medio para contrarrestar
determinados efectos secundarios perjudiciales de los medicamentos
carcinostáticos, como se describe en JP 63-196.524;
y como un medio para incrementar la producción de leche y de carne
del ganado vacuno y de otros animales de granja, como se describe en
la Patente de EEUU No. 4.783.524.
También se ha visto que IGF-I es
útil en el tratamiento de la osteoporosis en mamíferos que presentan
una densidad disminuida de los minerales en los huesos corticales y
en aquellos expuestos a medicamentos o a condiciones
medioambientales que resultan en una reducción de la densidad ósea y
en una condición potencial de osteoporosis, como se describe en EP
560 723 y en EP 436 469.
Se ha administrado IGF-I con
polisulfato de pentosán sódico (PPS) a caninos osteoartríticos
graves con el efecto de reducir la gravedad de la enfermedad
mediante una disminución de los niveles de metaloproteinasa neutra
activa en el cartílago. En el modelo de caninos osteoartríticos
leves, la intervención terapéutica con IGF-I y PPS
juntos, parece que mantiene de manera exitosa la estructura y la
bioquímica del cartílago, mientras que IGF solo no resultó eficaz,
como se describe en Rogachefsky, Osteoarthritis and
Cartilage, (1993) 1: 105-114.
Las proteínas transportadoras de los IGF se han
estudiado de manera extensa, y actualmente se conocen seis IGFBP
(IGFBP1-6). Las IGFBP forman complejos con
IGF-I e IGF-II en el plasma y se
cree que funcionan como proteínas transportadoras de hormonas
proteicas, regulando la disponibilidad, la actividad, y alargando la
vida media de la hormona proteica que transportan. Mientras
IGFBP-3, un complejo de 150 kDa, es la IGFBP más
abundante en el plasma y se cree que funciona como un transportador
y reservorio de IGF-I en el plasma,
IGFBP-1 es una proteína de transporte pequeña de 25
kDa producida principalmente en el hígado y en los fibroblastos, y
puede distribuirse entre la circulación y los tejidos, regulando, de
esta manera, la biodisponibilidad de IGF en ambos compartimentos
como se describe en Tsuboi et al., J. of Inv. Dem.
104 :199-203 (1995). Se ha descrito que IGF
es útil para la cicatrización de heridas en combinación con IGFBP,
como se describe en Tsuboi et al., J. of Inv. Derm.
104: 199-203 (1995), Kratz et al.,
Scand J. Plast Reconstr Hand Surg. 28 :
107-112 (1994), y Jyung et al.,
Surgery 115: 233-239 (1994).
La expresión de IGF se ha asociado a la
cicatrización de heridas como se describe en Gartner et al.,
J. Surg. Res. 52: 389-394 (1992), y
Steenfos y Jansson, Eur. J. Surg. 158:
327-331 (1992). Adicionalmente, se ha descrito que
IGF es útil cuando se administra en combinación con PDGF para la
cicatrización de heridas como se describe en la Patente de EEUU No.
4.861.757.
Por lo tanto, sería ventajoso si se pudiera
encontrar una composición mejorada que tuviera propiedades mejoradas
respecto a la administración de PDGF solo, respecto a la
administración de KGF solo, respecto a PDGF con IGF, y respecto a
IGF solo, y respecto a IGF con IGFBP.
Es, por lo tanto, un objetivo de la presente
invención proporcionar una composición mejorada para el tratamiento
o prevención del daño en células epiteliales. Además es un objetivo
de la presente invención proporcionar un método mejorado para dicho
tratamiento o prevención.
De acuerdo con uno de los objetivos de la
presente invención, se proporciona en la presente memoria una
composición farmacéutica para el tratamiento o prevención del daño
en células epiteliales, que contiene un primer polipéptido que tiene
la actividad biológica de un factor de crecimiento derivado de las
plaquetas (PDGF) y un segundo polipéptido que tiene la actividad
biológica del factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF).
De acuerdo con uno de los objetivos de la
presente invención, se proporciona en la presente memoria una
composición farmacéutica para el tratamiento o prevención del daño
en células epiteliales, que contiene un primer polipéptido que tiene
la actividad biológica de un factor de crecimiento derivado de las
plaquetas (PDGF) y un segundo polipéptido que tiene la actividad
biológica del factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF) y un
tercer polipéptido que tiene la actividad biológica del factor de
crecimiento semejante a la insulina-1 (IGF1).
También de acuerdo con otro objetivo de la
invención, se proporcionan kits para el tratamiento y la prevención
del daño en células epiteliales que comprenden las composiciones
farmacéuticas de la invención como se describe en la presente
memoria.
De acuerdo con un objeto adicional de la presente
invención, se proporcionan métodos de tratamiento o prevención del
daño en células epiteliales mediante la aplicación a estas células
de las composiciones farmacéuticas descritas más arriba.
De acuerdo con otro objetivo de la presente
invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas para el
tratamiento o la prevención del daño en células epiteliales mediante
la aplicación a estas células de una composición farmacéutica que
comprende una primera molécula de ADN que incluye una primera
secuencia de nucleótidos y una segunda molécula de ADN que incluye
una segunda secuencia de nucleótidos, de manera que la primera
secuencia de nucleótidos codifica PDGF y la segunda secuencia de
nucleótidos codifica KGF.
De acuerdo con otro objetivo de la presente
invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas para el
tratamiento o la prevención del daño en células epiteliales mediante
la aplicación a estas células de una composición farmacéutica que
comprende una primera molécula de ADN que incluye una primera
secuencia de nucleótidos, una segunda molécula de ADN que incluye
una segunda secuencia de nucleótidos, y una tercera molécula de ADN
que incluye una tercera secuencia de nucleótidos, de manera que la
primera secuencia de nucleótidos codifica PDGF y la segunda
secuencia de nucleótidos codifica KGF, y la tercera secuencia de
nucleótidos codifica IGF.
La composición farmacéutica puede incluir también
un cuarto polinucleótido que tiene la actividad biológica de una
proteína transportadora de los factores de crecimiento semejantes a
la insulina (IGFBP).
Los tejidos epiteliales pueden repararse mediante
la aplicación de una composición farmacéutica que incluye KGF, PDGF,
y alternativamente IGF o IGF e IGFBP.
El daño en células epiteliales puede repararse o
prevenirse mediante la aplicación a las células que se quieren
proteger o reparar de la composición farmacéutica que incluye KGF y
PDGF y que incluye además una composición con IGF.
El daño en células epiteliales puede repararse o
prevenirse mediante la aplicación a las células que se quieren
proteger o reparar de la composición farmacéutica que incluye KGF,
PDGF e IGF, y que incluye además una composición que comprende una
IGFBP.
El daño en células epiteliales puede repararse o
prevenirse mediante la aplicación a la célula epitelial de una
composición farmacéutica que comprende una primera molécula de ADN,
una segunda molécula de ADN, y una tercera molécula de ADN donde la
primera molécula de ADN es una primera secuencia de nucleótidos que
codifica PDGF, la segunda molécula de ADN es una segunda secuencia
de nucleótidos que codifica KGF, y la tercera molécula de ADN es una
tercera secuencia de nucleótidos que codifica IGF.
El daño en células epiteliales puede repararse o
prevenirse mediante la aplicación a la célula epitelial de una
composición farmacéutica que comprende una primera molécula de ADN,
una segunda molécula de ADN, una tercera molécula de ADN, y una
cuarta molécula de ADN donde la primera molécula de ADN es una
primera secuencia de nucleótidos que codifica PDGF, la segunda
molécula de ADN es una segunda secuencia de nucleótidos que codifica
KGF, la tercera molécula de ADN es una tercera secuencia de
nucleótidos que codifica IGF, y la cuarta molécula de ADN comprende
una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una IGFBP.
Otro objetivo de la invención se consigue
mediante un kit que tiene una primera molécula de ADN, una segunda
molécula de ADN, y una tercera molécula de ADN, donde la primera
molécula de ADN es una primera secuencia de nucleótidos que codifica
PDGF, la segunda molécula de ADN es una segunda secuencia de
nucleótidos que codifica KGF, y la tercera molécula de ADN es una
tercera secuencia de nucleótidos que codifica IGF.
Un objetivo final de la invención se consigue
mediante un kit que tiene una primera molécula de ADN, una segunda
molécula de ADN, una tercera molécula de ADN, y una cuarta molécula
de ADN, donde la primera molécula de ADN es una primera secuencia de
nucleótidos que codifica PDGF, la segunda molécula de ADN es una
segunda secuencia de nucleótidos que codifica KGF, la tercera
molécula de ADN es una tercera secuencia de nucleótidos que codifica
IGF, y la cuarta molécula de ADN es una cuarta secuencia de
nucleótidos que codifica una IGFBP.
La presente invención puede entenderse mejor
gracias a las definiciones siguientes.
A no ser que se proporcione otra cosa de manera
expresa en la presente memoria, el término "factor de crecimiento
derivado de las plaquetas" o "PDGF" incluye el polipéptido
de la cadena A del PDGF y el polipéptido de la cadena B del PDGF y
los dímeros AA, BB, y AB, y los fragmentos, análogos, y derivados de
éstos activos biológicamente, como se describe en la Patente de EEUU
No. 5.187.263; Waterfield et al., Nature 304:
35-39 (1983); Wang et al., J. Biol.
Chem. 259: 10645-48 (1984), Antoniades
et al., Biochem. Pharm. 33:
2833-38 (1984); y Westermark et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83: 7197-7200
(1986); Patente de EEUU No. 5.219.759.
También, a no ser que se proporcione otra cosa de
manera expresa en la presente memoria, el término "factor de
crecimiento de los queratinocitos" o "KGF" se refiere a uno
cualquiera de los polipéptidos maduros y a los fragmentos, análogos
y derivados de éstos activos biológicamente, como se describe en WO
90/08771 y en WO 95/01434.
El término "factor de crecimiento semejante a
la insulina", tal y como se utiliza en la presente memoria,
incluye IGF-I e IGF-II en sus formas
purificada, nativa, producida de manera recombinante, o sintetizada
químicamente, e incluye los fragmentos, análogos, muteínas,
incluyendo las muteínas con deleción en el extremo
C-terminal, y derivados de éstos activos
biológicamente, que retienen la actividad IGF y/o la capacidad de
unirse a los receptores de IGF, como se describe, por ejemplo, en EP
135 094, WO 85/00831, Patente de EEUU No. 4.738.921, WO 92/04363,
Patente de EEUU No. 5.158.875, EP 123 228, y EP 128 733. Un análogo
de IGF o un análogo del fragmento incluye IGF nativo que ha sido
modificado por uno o más de inserción, deleción o sustitución de
aminoácidos que no afectan sustancialmente sus propiedades.
Preferiblemente, el análogo tiene una actividad incrementada
comparado con el IGF nativo. Más preferiblemente, un incremento de
al menos 2 veces, más preferiblemente un incremento de al menos
7-10 veces. Por ejemplo, el análogo puede incluir
sustituciones conservativas de aminoácidos. Un análogo de IGF
también incluye péptidos que tienen uno o más mimetizadores de
péptidos ("peptoides"), como los descritos en WO 91/04282. Una
muteína de IGF es una variante de polipéptido con uno o más
aminoácidos alterados para producir una característica deseada, como
reemplazar un resto de cisteína por un aminoácido que no forme
enlaces disulfuro. Las muteínas, los análogos y los derivados pueden
generarse utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, se puede
utilizar mutagénesis PCR. Aunque la discusión siguiente se refiere a
ADN, se entiende que la técnica también se puede aplicar a ARN. Un
ejemplo de una técnica PCR se describe en WO 92/22653. Otro método
para obtener análogos, muteínas, y derivados, es mutagénesis en
cassette basada en la técnica descrita por Wells, Gene,
(1985) 34: 315.
El término "proteína transportadora de los
factores de crecimiento semejantes a la insulina (IGFBP)" se
refiere a una proteína transportadora que se ha visto une IGF como
se describe e identifica en Keifer et al., J. Biol.
Chem. 266: 9043-9 (1991),
Camacho-Hubner et al., J. Biol. Chem.
267: 11949-56 (1992), McCusker y Clemens, THE
INSULIN LIKE GROWTH FACTORS: STRUCTURE AND BIOLOGICAL FUNCTIONS,
Oxford Univ. Press, N.Y. pág. 110-150 (1992).
Un polipéptido "que tiene la actividad
biológica de PDGF" se refiere a un polipéptido que tiene la misma
capacidad o una capacidad incrementada de estimular, de manera
preferente, el crecimiento de células de la capa de la dermis de la
piel. Este polipéptido puede ser un PDGF de longitud completa, un
fragmento de PDGF, un análogo de PDGF con sustitución, deleción o
adición de aminoácidos o un derivado de PDGF, como el descrito en la
Patente de EEUU No. 5.149.792 y EP 458 959 B1; y en las Patentes de
EEUU Nos. 4.769.328; 4.801.542; 4.766.073; 4.849.407; 4.845.075;
4.889.919; 5.045.633; y 5.128.321. EP 177 957 describe la
preparación de análogos de PDGF activos biológicamente mediante la
expresión de un gen que codifica la proteína que es incorporado en
una construcción de ADNc utilizada para transformar células
eucariotas.
Un polipéptido "que tiene la actividad
biológica de KGF" se refiere a un polipéptido que tiene la misma
capacidad o una capacidad incrementada de estimular, de manera
preferente, el crecimiento de células de la capa de la epidermis de
la piel. Este polipéptido puede ser un KGF de longitud completa, un
fragmento de KGF, un análogo de KGF con sustitución, deleción o
adición de aminoácidos; o un derivado de KGF como se describe en WO
90/08771, y WO 95/01434.
Un polipéptido "que tiene la actividad
biológica de IGF" se refiere a un polipéptido que tiene la misma
capacidad o una capacidad incrementada de actuar como un factor de
crecimiento con efectos semejantes a los de la insulina, como, por
ejemplo, estimulación de la fosforilación de restos específicos de
tirosina en el dominio citoplasmático del receptor al que se une
como se describe en WO 93/98826, o, en algunos casos, por ejemplo,
efectos mitogénicos en determinadas células como se describe en EP 0
128 733. Este polipéptido puede ser un IGF de longitud completa, un
fragmento de IGF, un análogo de IGF con sustitución, deleción, o
adición de aminoácidos, o cualquier derivado de IGF.
Un polipéptido "que tiene la actividad
biológica de IGFBP" se refiere a un polipéptido que tiene
aproximadamente la misma capacidad o una capacidad incrementada de
actuar como una proteína transportadora de IGF uniéndose y
transportando IGF a tejidos y células donde el IGF puede tener un
efecto biológico. Como actualmente se conocen al menos seis IGFBP,
muchas de las cuales son significativamente distintas de las otras
IGFBP, las cualidades específicas respecto a la actividad biológica
de una determinada IGFBP no incluyen necesariamente al grupo
completo de proteínas transportadoras de IGF. De esta manera, la
actividad biológica de una IGFBP puede tener algunas similitudes con
otras IGFBP, pero también puede tener diferencias que la
identifiquen como una IGFBP única.
"PDGF de longitud completa" o "PDGF
maduro" y "KGF de longitud completa" o "KGF maduro" e
"IGF de longitud completa" o "IGF maduro" e "IGFBP de
longitud completa" e "IGFBP madura" se refiere al
polipéptido nativo respectivo tal y como se encuentra en los tejidos
de mamíferos o de los seres humanos.
El término "análogo" en la presente memoria
en referencia a PDGF, KGF, IGF y proteína IGFBP, se refiere a
truncaciones, variantes, alelos y derivados de éstos. A no ser que
se mencione específicamente otra cosa, estos términos incluyen las
bioactividades de KGF "maduro" o PDGF "maduro", IGF
"maduro" o IGFBP "madura". Así, se incluyen en esta
definición los polipéptidos que son idénticos o contienen al menos
60%, preferiblemente 70%, más preferiblemente 80% y más
preferiblemente 90% de identidad de secuencia con la proteína madura
de la que derivan, de fuentes humanas o no humanas. Los análogos de
la presente memoria incluyen además péptidos que tienen uno o más
mimetizadores de péptidos, también conocidos como peptoides, que
poseen la bioactividad de la proteína. También están Incluidos en la
definición polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos análogos
(incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.),
polipéptidos con uniones sustituidas, así como otras modificaciones
conocidas en este campo, tanto las que ocurren naturalmente como las
que no ocurren naturalmente. El término polipéptido tampoco excluye
modificaciones del polipéptido posteriores a su expresión, por
ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y
semejantes.
Las "variantes" y "derivados" de la
presente memoria contienen sustituciones, deleciones, o inserciones
de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser
sustituciones conservativas de aminoácidos o sustituciones para
eliminar restos de aminoácidos no esenciales para alterar un sitio
de glicosilación, un sitio de fosforilación, un sitio de
acetilación, o para minimizar el plegamiento inadecuado mediante la
sustitución o deleción de uno o más restos de cisteína que no son
necesarios para esta función. Las sustituciones conservativas de
aminoácidos son aquellas que conservan la carga general, la
hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o el tamaño estérico del aminoácido
sustituido, por ejemplo, sustituciones entre miembros de los grupos
siguientes son sustituciones conservativas: Gly/Ala, Val/Ile/leu,
Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys/Thr y Phe/Trp/Tyr.
El término "polinucleótido" tal y como se
utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula de ADN a
una molécula de ARN o a la cadena complementaria de éstas. Una
molécula de polinucleótido puede ser de cadena simple o doble.
Una "cantidad eficaz desde un punto de vista
terapéutico" tal y como se utiliza en la presente memoria se
refiere a la cantidad de una composición que es eficaz para lograr
un resultado deseado que, en la presente memoria, es la reparación
de tejidos epiteliales. Esta cantidad puede ser administrada en una
dosis única o como parte de una serie de dosis. La cantidad precisa
variará de un sujeto a otro, dependiendo de la edad, tamaño, peso y
salud del sujeto, y de la naturaleza y gravedad de la condición que
se va a tratar. No es posible especificar con antelación la cantidad
exacta que es eficaz desde un punto de vista terapéutico. Sin
embargo, la cantidad eficaz para una situación determinada puede
determinarse mediante experimentación rutinaria o en base a la
experiencia de la persona que administra la composición en base a la
información proporcionada en la presente memoria. Se espera que la
dosis esté dentro de un intervalo relativamente amplio.
"Un vehículo aceptable desde un punto de vista
farmacéutico" se refiere en la presente memoria a cualquier
vehículo que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos
perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Vehículos
aceptables son típicamente macromoléculas grandes, que se
metabolizan lentamente como proteínas, polisacáridos, ácidos
polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos,
copolímeros de aminoácidos y una partícula vírica inactiva. Estos
vehículos son conocidos para aquellos especializados en el tema. Una
discusión en profundidad de excipientes aceptables desde un punto de
vista farmacéutico puede encontrarse en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL
SCIENCES (Merck Pub. Co., N.J. 1991). Vehículos ejemplares
aceptables desde un punto de vista farmacéutico pueden incluir
sales, por ejemplo, sales de ácidos minerales como hidrocloruros,
hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y semejantes; y las sales de
ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y
semejantes.
Las "composiciones farmacéuticas" de la
presente memoria pueden contener además uno o más componentes como
agua, disolución salina, glicerol, o etanol. Adicionalmente, pueden
estar presentes en estas composiciones sustancias auxiliares, como
agentes humidificadores o emulsionates, sustancias tamponadoras del
pH, estabilizantes, antioxidantes y semejantes. Las composiciones
farmacéuticas de la presente memoria pueden prepararse como una
crema para aplicarse por vía tópica, o como disoluciones o
suspensiones líquidas, o como formas sólidas adecuadas para
disolución o suspensión en vehículos líquidos para inyección. La
composición farmacéutica de la presente memoria puede prepararse en
formato liposomal como las encapsuladas en liposomas o en DepoFoam®;
como se describe en la Patente de EEUU No. 5.442.120; WO 95/13796; y
WO 91/14445.
"Co-administración" tal y
como se utiliza en la presente memoria significa administración de
KGF y de PDGF de acuerdo con el método de la invención en
combinación el uno con el otro, co-administración de
KGF/PDGF y un IGF, y co-administración de
KGF/PDGF/IGF/IGFBP. Co-administración también
significa administración de una combinación PDGF/KGF también en
combinación con IGF o de una combinación PDGF/KGF/IGF también en
combinación con IGFBP. La co-administración puede
ser simultánea, por ejemplo, por administración de una mezcla de KGF
y de PDGF, o una mezcla de PDGF, KGF, e IGF, o IGF e IGFBP, o puede
lograrse por la administración de los agentes por separado, como
dentro de un periodo de tiempo corto. La
co-administración también incluye la administración
sucesiva de KGF y de PDGF, o la administración sucesiva de KGF,
PDGF, e IGF, o la administración sucesiva de KGF, PDGF, y la
co-administración de IGF y de IGFBP. También, en el
caso de todas estas administraciones, por ejemplo en el caso de la
administración de KGF y de PDGF, uno de los dos puede administrarse
de manera preventiva mientras que el otro se administra
posteriormente para el tratamiento, dentro de un periodo de tiempo
razonable después de la administración preventiva. Por ejemplo, en
el caso de la administración de KGF, PDGF, e IGF, o de IGF e IGFBP
uno o dos o tres pueden administrarse de manera preventiva, mientras
que uno o dos o tres pueden administrarse posteriormente para el
tratamiento, dentro de un periodo de tiempo razonable después de la
administración preventiva. La dosificación para el tratamiento para
la administración o co-administración puede ser un
programa de dosis única o un programa de múltiples dosis.
El término "kit" se refiere a un paquete que
contiene el material especificado y que incluye instrucciones
impresas para la utilización del material. Por ejemplo, un kit para
el método de la invención puede incluir polipéptidos PDGF y KGF por
separado o en mezcla o ADN que codifica PDGF y KGF por separado o en
mezcla, o como una combinación de ADN y polipéptidos, por ejemplo,
el ADN de PDGF y el polipéptido KGF. También, por ejemplo, un kit
para el método de la invención puede incluir polipéptidos PDGF, KGF,
e IGF por separado o en mezcla o ADN que codifica PDGF, KGF e IGF
por separado o en mezcla, o en una combinación de ADN y
polipéptidos, por ejemplo, el ADN de PDGF y de KGF, con el
polipéptido IGF. También, por ejemplo, un kit para el método de la
invención puede incluir polipéptidos PDGF, KGF, e IGF e IGFBP por
separado o en mezcla o ADN que codifica PDGF, KGF e IGF IGFBP por
separado o en mezcla, o en una combinación de ADN y polipéptidos,
por ejemplo, el ADN de PDGF y de KGF, con el polipéptido IGF y el
polipéptido IGFBP. Las "instrucciones impresas" pueden estar
escritas o impresas en papel u otro medio, o en medio electrónico
como cinta magnética, discos de ordenador, CD-ROM, y
semejantes. Los kits también pueden incluir placas, tubos,
diluyentes, disolventes, líquidos de lavado u otros reactivos
convencionales.
El inventor ha descubierto, como se describe en
la presente memoria, que la combinación de PDGF y de KGF o de
fragmentos, análogos o derivados de éstos activos biológicamente, es
más eficaz en el tratamiento o prevención del daño en células
epiteliales que PDGF o KGF solos. Además, el inventor ha descubierto
que la adición de IGF a la combinación PDGF/KGF mejora
adicionalmente el tratamiento o prevención del daño en células
epiteliales mucho más de lo que podría esperarse con cualquiera de
los tres medicamentos solos; y, además, el inventor de la presente
memoria ha descubierto que la adición de IGF y de IGFBP a la
combinación PDGF/KGF mejora el tratamiento o prevención del daño a
células epiteliales mucho más de los que podría esperarse con
cualquiera de los cuatro medicamentos solos, e incluso más que las
mejoras del daño a células epiteliales derivadas de la
administración de la combinación PDGF/KGF, o de la combinación
IGF/IGFBP.
En una realización de la presente invención, una
composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz desde un punto
de vista terapéutico de PDGF y KGF. Tanto PDGF como KGF pueden
obtenerse mediante cualquier técnica convencional o pueden
purificarse a partir de sus fuentes naturales. En una realización
preferida de la presente invención, tanto PDGF como KGF se obtienen
mediante la expresión de una secuencia de polinucleótidos que
codifica la proteína respectiva en anfitriones independientes o
mediante la coexpresión de ésta en un único anfitrión. La célula
anfitriona puede ser procariota o eucariota. Por ejemplo, PDGF puede
obtenerse como se describe en la Patente de EEUU No. 5.219.759. KGF
puede obtenerse como se describe en WO 95/01434. Pueden utilizarse
otros sistemas de expresión como se describe con más detalle más
abajo.
La composición farmacéutica, en una realización
preferida de la presente invención, puede ser bien una composición
que contiene PDGF solo y KGF solo, o PDGF y KGF mezclados en una
única composición, bien en una única dosis o en múltiples dosis. En
otra realización de la presente invención, para fines de terapia
génica, la composición farmacéutica puede ser una composición que
contiene un polinucleótido que codifica PDGF solo, una composición
que contiene un polinucleótido que codifica KGF solo, o ambos
polinucleótidos mezclados en una única composición.
Las composiciones de PDGF y de KGF, si se
mantienen por separado, pueden administrarse por separado o
simultáneamente. La administración directa de las composiciones se
conseguirá generalmente por inyección, bien por vía subcutánea,
intradérmica, intraperitoneal, intraluminal, intragástrica,
intraintestinal, intravenosa o intramuscular. Otros medios de
administración incluyen administración oral o pulmonar,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas. La dosificación del
tratamiento puede ser un programa de una dosis única o un programa
de múltiples dosis.
En otra realización de la presente invención, una
composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz desde un punto
de vista terapéutico de PDGF, KGF, e IGF. PDGF, KFG, e IGF pueden
obtenerse mediante cualquier técnica convencional o pueden
purificarse a partir de sus fuentes naturales. En una realización
preferida de la presente invención, PDGF, KGF e IGF se obtienen
mediante la expresión de una secuencia de polinucleótidos que
codifica la proteína respectiva en anfitriones independientes o
mediante la coexpresión de ésta en un anfitrión único. La célula
anfitriona puede ser procariota o eucariota. IGF puede obtenerse
como se describe en la Patente de EEUU No. 4.738.921. IGF también
puede sintetizarse mediante el método de fase sólida como se
describe en Li, PNAS, (1983) 80:
2216-2220. En este método, la secuencia de
polipéptido para IGF-I puede obtenerse mediante el
acoplamiento de los restos de aminoácidos.
Las composiciones de PDGF, KGF e IGF, si se
mantienen por separado, pueden administrarse por separado o
simultáneamente. La administración directa de las composiciones se
conseguirá generalmente por inyección, bien por vía subcutánea,
intradérmica, intraperitoneal, intraluminal, intragástrica,
intraintestinal, intravenosa o intramuscular. Otros medios de
administración incluyen administración oral o pulmonar,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas. La dosificación del
tratamiento puede ser un programa de una dosis única o un programa
de múltiples dosis.
En otra realización, una composición farmacéutica
contiene una cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico de
PDGF, KGF, e IGF con IGFBP. PDGF, KFG, e IGF e IGFBP pueden
obtenerse mediante cualquier técnica convencional o pueden
purificarse a partir de sus fuentes naturales. En una realización
preferida de la presente invención, PDGF, KGF e IGF e IGFBP se
obtienen mediante la expresión de una secuencia de polinucleótidos
que codifica la proteína respectiva en anfitriones independientes o
mediante la coexpresión de ésta en un anfitrión único. La célula
anfitriona puede ser procariota o eucariota.
Las composiciones de PDGF, KGF, IGF e IGFBP, si
se mantienen por separado, pueden administrarse por separado o
simultáneamente. La administración directa de las composiciones se
conseguirá generalmente por inyección, bien por vía subcutánea,
intradérmica, intraperitoneal, intraluminal, intragástrica,
intraintestinal, intravenosa o intramuscular. Otros medios de
administración incluyen administración oral o pulmonar,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas. La dosificación del
tratamiento puede ser un programa de una dosis única o un programa
de múltiples dosis.
IGF se puede obtener mediante técnicas
convencionales de ADN recombinante, como se describe en Biochem.
and Biophys. Res. Comm., (1990) 169:
832-839 (IGF-II) y Cell
Regulation, (1990) 1: 197-213,
(IGF-II), y Biotechnology News, (1983)
3: 1-3 (IGF-I y II). Por
ejemplo, IGF puede producirse en E. coli como una proteína de
fusión con el gen trpE bajo el control de un operon de
triptófano modificado, como se describe en la Patente de EEUU No.
4.738.921. De manera alternativa, IGF puede sintetizarse en
E.coli bajo el control de las secuencias del promotor y del
protector del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), como se
describe en EP 478 333. Los sistemas de expresión de E. coli
utilizados para la expresión en la presente memoria pueden
modificarse como se describe en la Patente de EEUU No. 5.158.875,
para incluir una secuencia líder modificada cargada positivamente
para permitir el plegamiento adecuado de la proteína IGF. Más aún,
IGF puede producirse en transformantes de levadura metilotróficos
con la secuencia que codifica IGF unida a una secuencia señal que
dirige la secreción y el procesamiento proteolítico de la proteína
producida. La secuencia señal adecuada en la presente memoria
incluye la secuencia pre-pro del factor de
apareamiento alfa de S. cerevisiae en cepas de P.
pastoris deficientes en proteasa, como se describe en WO
92/04363. Las construcciones de ADN para la producción de
IGF-II pueden hacerse y expresarse en E. coli
como se describe en WO 89/03423. La síntesis de
IGF-II recombinante también puede conseguirse
siguiendo el protocolo descrito en EP 434 605, que se refiere a la
producción de IGF-II recombinante con una fracción
extraña unida covalentemente y que no posee la metionina unida al
extremo N-terminal. IGF también puede obtenerse en
levaduras como se describe en EP 123 228 y en la solicitud de
patente de EEUU S.N. 06/922.199. Otro método para producir IGF
utilizando técnicas de ADN recombinante que es adecuado en la
presente memoria es el que se describe en Biotechnology News,
(1983) 10: 1-3. Las secuencias que codifican
IGF-I o IGF-II pueden insertarse en
vectores de ADN víricos o de plásmidos circulares para formar
vectores híbridos, y los vectores híbridos resultantes pueden
utilizarse para transformar microorganismos anfitriones como células
de bacteria, o de levadura. Los microorganismos transformados pueden
crecerse en las condiciones apropiadas de nutrientes para expresar
IGF, como se describe en EP 135 094. IGF también puede obtenerse
como se describe en EP 434 625.
Una IGFBP puede ser cualquier IGFBP conocida, por
ejemplo, IGFBP-1, IGFBP-2,
IGFBP-3, IGFBP-4,
IGFBP-5 e IGFBP-6. IGFBP puede
obtenerse como se describe en Brinkman et al., EMBO J.
7: 2417-2423 (1988), Mohan et al.,
Proc. Natl. Acad Sci USA 86: 8338-42
(1989), Patente de EEUU No. 5.407.913, WO 92/12243, 92/03471,
92/03470, WO 92/03469, y Brewer et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 152: 1289-97 (1988).
La composición farmacéutica, en una realización
de la presente invención, puede ser una composición que contiene
PDGF solo, KGF solo, IGF solo e IGF con IGFBP, o dos cualquiera de
los cuatro mezclados juntos, y el tercero y el cuarto solos, o tres
cualquiera de los cuatro mezclados juntos y el cuarto solo, o los
cuatro mezclados juntos en una composición única, bien en una dosis
única o en múltiples dosis. En otra realización de la presente
invención, para fines de terapia génica, la composición farmacéutica
puede ser una composición que contiene un polinucleótido que
codifica PDGF solo, una composición que contiene un polinucleótido
que codifica KGF solo, una composición que contiene un
polinucleótido que codifica IGF solo, una composición que contiene
IGF e IGFBP solo, o los cuatro polinucleótidos mezclados juntos en
una composición única.
Las composiciones de PDGF, KGF, IGF e IGF con
IGFBP, si se mantienen por separado, pueden administrarse de forma
separada o simultáneamente. Adicionalmente, las concentraciones de
cada uno pueden ser diferentes, dependiendo de la potencia del
factor, y de las necesidades del paciente. La administración directa
de las composiciones se conseguirá generalmente por inyección, bien
por vía subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraluminal,
intragástrica, intraintestinal, intravenosa o intramuscular. Otros
medios de administración incluyen administración oral y pulmonar,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas. La dosificación del
tratamiento puede ser un programa de una dosis única o un programa
de múltiples dosis.
Cuando PDGF, KGF, IGF o IGFBP se administran como
polipéptidos, bien juntos o en una composición única, o en
composiciones múltiples, los polipéptidos pueden expresarse mediante
cualquier sistema de expresión apropiado para el polipéptido.
Los sistemas de expresión ejemplares para generar
los polipéptidos PDGF, KGF, IGF e IGFBP o para clonar los
polinucleótidos que los codifican para su aplicación en un protocolo
de terapia génica, se listan más abajo.
Los sistemas de expresión bacterianos pueden
utilizarse con las construcciones presentes. Los elementos de
control para utilizarse en bacterias incluyen promotores, que
contienen de manera opcional secuencias de operador, y sitios de
unión a ribosomas. Los promotores útiles incluyen secuencias
derivadas de enzimas del metabolismo de los azúcares, como
galactosa, lactosa (lac) y maltosa. Ejemplos adicionales
incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas
como triptofano (trp), el sistema de promotor de
\beta-lactamasa (bla), el bacteriófago
\lambdaPL, y T7. Además, se pueden utilizar promotores sintéticos,
como el promotor tac. Los sistemas de promotor de la
\beta-lactamasa y de la lactosa se describen en
Chang et al., Nature (1978) 275: 615, y Goeddel
et al., Nature (1979) 281: 544; el sistema de
promotor de la fosfatasa alcalina y del triptófano (trp) se
describen en Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980)
8: 4057 y EP 36.776 y promotores híbridos como el promotor
tac se describen en la Patente de EEUU No. 4.551.433 y deBoer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:
21-25. Sin embargo, también son adecuados otros
promotores bacterianos conocidos útiles para la expresión de
proteínas eucariotas. Una persona especializada en el tema será
capaz de ligar de manera operativa estos promotores a las secuencias
que codifican PDGF y KGF, por ejemplo, como se describe en
Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269,
utilizando uniones o adaptadores para proporcionar cualquier sitio
de restricción que se requiera. Los promotores para utilizarse en
sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia
Shine-Dalgano (SD) unida de manera operativa al ADN
que codifica el polipéptido diana. Para las células anfitrionas
procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del
polipéptido diana nativo, la secuencia señal puede sustituirse por
una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo
de los líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o
enterotoxina II estable en calor. El origen de replicación del
plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram
negativas.
Los sistemas precedentes son particularmente
compatibles con Escherichia coli. Sin embargo, existen otros
sistemas que se pueden utilizar en anfitriones bacterianos
incluyendo organismos Gram negativos o Gram positivos como
Bacillus spp., Streptococcus spp., Streptomyces
spp., especies de Pseudomonas como P.aeruginosa,
Salmonella typhimurium, o Serratia marcescans, entre
otros. Los métodos para introducir ADN exógeno en estos anfitriones
incluyen habitualmente la utilización de CaCl_{2} o de otros
agentes, como cationes divalentes y DMSO. El ADN también puede
introducirse en las células bacterianas por electroporación,
inyección nuclear, o fusión de protoplastos como se describe de
manera general en Sambrook et al., (1989), citado más arriba.
Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Preferiblemente,
la célula anfitriona debe secretar cantidades mínimas de enzimas
proteolíticas. De manera alternativa, son adecuados métodos de
clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de
polimerasa de ácido nucleico.
También son útiles para la expresión de PDGF para
la invención vectores descritos en EP 0 622 456-A1,
incorporada por referencia en la presente memoria, que describe ADN
para selección y replicación autónoma en células bacterianas.
Las células procariotas utilizadas para producir
el polipéptido diana de esta invención se cultivan en medio
apropiado, como se describe de manera general en Sambrook et
al., citado más arriba.
Los vectores de expresión y transformación, bien
replicones extra cromosómicos o vectores de integración, se han
desarrollado para la transformación en numerosas levaduras. Por
ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para, entre
otras, las levaduras siguientes: Saccharomyces cerevisiae
como se describe en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J.
Bacteriol. (1983) 153: 163; Candida albicans como
se describe en Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986)
6: 142; Candida maltosa como se describe en Kunze
et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141;
Hansenula polymorpha, como se describe en Gleeson et
al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459 y
Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:
302; Kluyveromyces fragilis, como se describe en Das et
al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165;
Kluyveromyces lactis, como se describe en De Louvencourt
et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737 y Van den
Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135;
Pichia guillerimondii, como se describe en Kunze et
al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Pichia
pastoris, como se describe en Cregg et al., Mol. Cell.
Biol. (1985) 5: 3376 y Patentes de EEUU Nos. 4.837.148 y
4.929.555; Schizosaccharomyces pombe, como se describe en
Beach y Nurse, Nature (1981) 300: 706; y Yarrowia
lipolytica, como se describe en Davidow et al., Curr.
Genet. (1985) 10: 380 y Gaillardin et al.,
Curr. Genet. (1985) 10: 49, anfitriones de
Aspergillus como A. nidulans, como se describe en
Ballance et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. (1983)
112: 284-289; Tilburn et al., Gene
(1983) 26: 205-221 y Yelton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:
1470-1474, y A. niger, como se describe en
Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4:
475-479; Trichoderma reesia, como se describe
en EP 0 244 234, y en hongos filamentosos como, por ejemplo,
Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, como se
describe en WO 91/00357.
Las secuencias de control para los vectores de
levadura son conocidas e incluyen regiones promotoras de genes como
alcohol deshidrogenasa (ADH), como se describe en EP 284.044,
enolasa, glucoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
3-fosfoglicerato mutasa, y piruvato quinasa (PyK),
como se describe en EP 329.203. El gen de levadura PHO5, que
codifica la fosfatasa ácida, también proporciona secuencias de
promotor útiles, como se describe en Myanohara et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 1. Otras
secuencias de promotor adecuadas para utilizarse con anfitriones de
levadura incluyen los promotores para la
3-fosfogliceratoquinasa, como se describe en
Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:
2073, u otras enzimas glicolíticas, como piruvato descarboxilasa,
triosafosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa, como se describe
en Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:
149 y en Holland et al., Biochemistry (1978)
17: 4900. Los promotores de levadura inducibles que tienen la
ventaja adicional de una transcripción controlada por las
condiciones de crecimiento, incluyen de la lista anterior y de
otras, las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2,
isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas
con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizarse en
la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman,
EP 073.657. Los amplificadores de levaduras también se utilizan de
manera ventajosa con los promotores de levaduras. Además, los
promotores sintéticos no naturales también funcionan como promotores
en levaduras. Por ejemplo, las secuencias de activación (UAS)
situadas arriba de un promotor de levaduras pueden unirse con la
región de activación de la transcripción de otro promotor de
levaduras, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de estos
promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a
la región de activación de la transcripción de GAP, como se describe
en las Patentes de EEUU Nos. 4.876.197 y 4.880.734. Otros ejemplos
de promotores híbridos incluyen promotores que consisten en las
secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4,
GAL10, o PHO5, combinadas con la región de activación
de la transcripción de un gen de una enzima glicolítica como
GAP o PyK, como se describe en EP 164.556. Es más, un
promotor de levadura puede incluir promotores que aparecen en la
naturaleza que no son de levadura que tienen la capacidad de unirse
a la polimerasa de ARN de levaduras e iniciar la transcripción.
Otros elementos de control que pueden incluirse
en los vectores de expresión de levaduras son terminadores, por
ejemplo, de GAPDH y del gen de la enolasa, como se describe
en Holland et al., J. Biol. Chem. (1981) 256:
1385, y secuencias líder que codifican secuencias señal para la
secreción. El ADN que codifica secuencias señal adecuadas puede
derivarse de genes para proteínas de levaduras que se secretan, como
el gen de la invertasa de levaduras como se describe en EP 012.873 y
JP 62.096.086 y el gen del factor a, como se describe en las
Patentes de EEUU Nos. 4.588.684, 4.546.083 y 4.870.008; EP 324.274;
y WO 89/02463. De manera alternativa, líderes que no son de
levadura, como un líder de interferón, también proporcionan
secreción en levaduras, como se describe en EP 060.057.
Los métodos para introducir ADN exógeno en
anfitriones de levaduras son conocidos en el campo, e incluyen
habitualmente bien la transformación de esferoblastos o de células
de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Las
transformaciones en levaduras pueden llevarse a cabo de acuerdo con
el método descrito en Van Solingen et al., J. Bact.
(1977) 130: 946 y en Hsiao et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1979) 76: 3829. Sin embargo, también
pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células como
inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplastos como se
describe de manera general en Sambrook et al., citado más
arriba.
Para la secreción en levaduras la secuencia señal
del polipéptido diana nativo puede sustituirse por los líderes de la
invertasa, del factor \alpha o de la fosfatasa ácida de levaduras.
El origen de replicación del origen del plásmido 2\mu es adecuado
para levaduras. Un gen de selección adecuado para utilizarse en
levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras
descrito en Kingsman et al., Gene (1979) 7: 141
o en Tschemper et al., Gene (1980) 10: 157. El
gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa
de levadura mutante que no tiene la capacidad de crecer en presencia
de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes
Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos
conocidos que tienen el gen Leu2.
Para la producción intracelular de los
polipéptidos presentes en levaduras, una secuencia que codifica una
proteína de levaduras puede unirse a una secuencia que codifica los
polipéptidos PDGF o KGF para producir una proteína de fusión que
puede romperse intracelularmente por las células de levaduras
después de la expresión. Un ejemplo de una secuencia líder de
levadura de este tipo es el gen de la ubiquitina de levadura.
Los vectores de expresión de baculovirus (BEV)
son virus recombinantes de insectos en los que la secuencia que
codifica un gen extraño que se quiere expresar se inserta detrás de
un promotor de baculovirus en el lugar de un gen vírico, por
ejemplo, polihedrina, como se describe en Smith y Summers, Patente
de EEUU No. 4.745.051.
Una construcción de expresión en la presente
memoria incluye un vector de ADN útil como un intermediario para la
infección o transformación de un sistema de células de insecto, el
vector contiene generalmente ADN que codifica un promotor
transcripcional de baculovirus, de manera opcional pero
preferiblemente, seguido por una secuencia señal de ADN de insecto
capaz de dirigir la secreción de una proteína deseada, y un sitio
para la inserción del gen extraño que codifica la proteína extraña,
estando la secuencia señal de ADN y el gen extraño localizados bajo
el control transcripcional de un promotor de baculovirus, siendo el
gen extraño en la presente memoria la secuencia que codifica el
polipéptido PDGF o KGF.
El promotor para utilizarse en la presente
memoria puede ser una región promotora de la transcripción de
baculovirus derivada de cualquiera de los más de 500 baculovirus que
infectan generalmente insectos, como, por ejemplo, los Órdenes
Lepidoptera, Diptera, Ortoptera, Coleoptera e Hymenoptera,
incluyendo, por ejemplo, pero no estando limitado a, los ADN virales
de Autographo californica MNPV, Bombyx mori NPV,
rrichoplusia ni MNPV, Rachlplusia ou MNPV o
Galleria mellonella MNPV. Así, el promotor de la
transcripción de baculovirus puede ser, por ejemplo, un promotor de
un gen inmediato-temprano de baculovirus IEI o IEN;
una región promotora de un gen inmediato-temprano en
combinación con la de un gen retardado-temprano de
baculovirus seleccionado del grupo que consiste en un fragmento 39K
y HindIII que contiene un gen
retardado-temprano; o un promotor de un gen tardío
de baculovirus. Los promotores inmediatos-tempranos
o retardados-tempranos pueden amplificarse con
elementos amplificadores de la transcripción.
Particularmente adecuado para su utilización en
la presente memoria es el promotor de polihedrina del baculovirus,
que dirige una nivel de expresión alto de un inserto de ADN, como se
describe en Friesen et al., (1986) "The Regulation of
Baculovirus Gene Expresion" en: THE MOLECULAR BIOLOGY OF
BACULOVIRUSES (W. Doerfler, ed.); EP 127.839 y EP 155.476; y el
promotor del gen que codifica la proteína p10, como se describe en
Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:
765-776.
El plásmido que se utiliza en la presente memoria
también contiene habitualmente la señal de poliadenilación de la
polihedrina, como se describe en Miller et al., Ann. Rev.
Microbiol. (1988) 42: 177 y un gen de resistencia a
ampicilina procariota (amp) y un origen de replicación para
selección y propagación en E. coli. El ADN que codifica
secuencias señal adecuadas también puede incluirse y se deriva
generalmente de genes de proteínas de insecto o de baculovirus que
se secretan, como el gen de polihedrina de baculovirus, como se
describe en Carbonell et al., Gene (1988) 73:
409, así como secuencias señal de mamíferos como las derivadas de
genes que codifican el interferon a humano, como se describe en
Maeda et al., Nature (1985) 315:
592-594; el péptido de liberación de gastrina
humano, como se describe en Lebacq-Verheyden et
al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129;
IL-2 humana, como se describe en Smith et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404;
IL-3 de ratón, como se describe en Miyajima et
al., Gene (1987) 58: 273; y glucocerebrosidasa
humana, como se describe en Martin et al., DNA (1988)
7: 99.
Se han identificado y pueden utilizarse en la
presente memoria numerosas cepas de baculovirus y variantes y las
células de insecto anfitrionas permisivas correspondientes de
anfitriones como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes
aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito),
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx
mori. Véase, por ejemplo, la descripción en Luckow et
al., Bio/Technology (1988) 6:
47-55, Miller et al., en GENETIC ENGINEERING
(Setlow, J.K. et al., eds.), Vol. 8 (Plenum Publishing,
1986), pág. 277-279, y Maeda et al.,
Nature (1985) 315: 592-594. Algunas de
estas cepas víricas se encuentran disponibles, por ejemplo, la
variante L-1 de Autographa californica NPV y
la cepa Brn-5 de Bombyx mori NPV. Estos virus
pueden utilizarse como los virus para la transfección de células
anfitrionas como células de Spodoptera frugiperda.
Pueden utilizarse otros genes de baculovirus
además del promotor de polihedrina para que el sistema de expresión
de baculovirus sea más ventajoso. Éstos incluyen
inmediatos-tempranos (alfa),
retardados-tempranos (beta), tardíos (gamma), o muy
tardíos (delta), de acuerdo con la fase de la infección vírica
durante la cual se expresen. La expresión de estos genes se produce
de manera secuencial, probablemente como resultado de un mecanismo
"en cascada" de la regulación transcripcional. Así, los genes
inmediatos-tempranos se expresan inmediatamente
después de la infección, en ausencia de otras funciones víricas, y
uno o más de los productos génicos resultantes inducen la
transcripción de los genes retardados-tempranos.
Algunos productos de los genes retardados-tempranos
inducen, a su vez, la transcripción de genes tardíos, y finalmente,
se expresan los genes muy tardíos bajo el control de productos
génicos expresados previamente de una o más de las clases tempranas.
Un componente relativamente bien definido de esta cascada de
regulación es IEI, un gen inmediato-tardío preferido
del virus de polihedrosis nuclear de Autographo californica
(AcMNPV). IEI se expresa en ausencia de otras funciones víricas y
codifica un producto que estimula la transcripción de numerosos
genes de la clase retardada-temprana, incluyendo el
gen 39K preferido, como se describe en Guarino y Summers, J.
Virol. (1986) 57: 563-571 y J.
Virol. (1987) 61: 2091-2099 así como la de genes
tardíos como se describe en Guanno y Summers, Virol. (1988)
162: 444-451.
Los genes inmediatos-tempranos
como se ha descrito arriba pueden utilizarse en combinación con una
región promotora de un gen de baculovirus de la categoria
retardado-temprano. A diferencia de los genes
inmediatos-tempranos, los mencionados genes
retardados-tempranos requieren la presencia de otros
genes o productos génicos víricos como los de los genes
inmediatos-tempranos. La combinación de genes
inmediatos-tempranos puede realizarse con cualquiera
de las numerosas regiones promotoras de genes
retardados-tempranos como 39K o con uno de los
promotores de genes retardados-tempranos encontrados
en el fragmento HindIII del genoma del baculovirus. En el
caso presente, la región promotora 39K puede unirse al gen extraño
que se quiere expresar de manera que la expresión pueda ser
controlada por la presencia de IEI, como se describe en L.A. Guarino
y Summers (1986a), citado más arriba; Guarino y Summers (1896b)
J. Virol. (1986) 60: 215-223, y
Guarino et al., (1986c) J. Virol. (1986) 60:
224-229.
Adicionalmente, cuando se utiliza una combinación
de genes inmediatos-tempranos con una región
promotora de genes retardados-tempranos, la
expresión de genes heterólogos puede amplificarse mediante la
presencia de una secuencia amplificadora en unión cis directa con la
región promotora de los genes retardados-tempranos.
Estas secuencias amplificadoras se caracterizan por amplificar la
expresión de genes retardados-tempranos en
situaciones en las que el gen inmediato-temprano o
su producto está limitado. Por ejemplo, la secuencia amplificadora
hr5 puede unirse directamente, en cis, a la región promotora del gen
retardado-temprano, 39K, amplificando de esta manera
la expresión del ADN heterólogo clonado como se describe en Guarino
y Summers (1986a), (1986b), y Guarino et al., (1986).
El gen de polihedrina se clasifica como un gen
muy tardío. Por lo tanto, la transcripción a partir del promotor de
polihedrina requiere la expresión previa de un número desconocido,
pero probablemente grande, de otros productos génicos víricos y
celulares. Debido a esta expresión retardada del promotor de
polihedrina, los BEV más recientes, como el sistema BEV ejemplar
descrito por Smith y Summers por ejemplo en la Patente de EEUU No.
4.745.051, expresarán genes extraños únicamente como resultado de la
expresión génica del resto del genoma vírico, y solamente cuando la
infección vírica esté muy avanzada. Esto representa una limitación
para la utilización de los BEV existentes. La capacidad de la célula
anfitriona para procesar proteínas sintetizadas de nuevas desciende
al progresar la infección por baculovirus. De esta manera, la
expresión génica a partir del promotor de polihedrina se produce
cuando la capacidad de la célula anfitriona para procesar proteínas
sintetizadas de nuevas se encuentra potencialmente reducida para
determinadas proteínas como el activador de plasminógeno de tejido
humano. Como consecuencia, la expresión de glicoproteínas que se
secretan en sistemas BEV es complicada debido a la secreción
incompleta del producto génico clonado, quedando por lo tanto el
producto génico clonado atrapado en la célula en una forma procesada
incompleta.
Aunque se ha reconocido que una secuencia señal
de insectos puede utilizarse para expresar una proteína extraña que
puede romperse para producir una proteína madura, la presente
invención se lleva a la práctica, preferiblemente, con una secuencia
señal de mamíferos, por ejemplo, la secuencia señal de PDGF o la de
KGF o la de IGF o la de IGFBP.
Una secuencia señal de insectos ejemplar adecuada
para la presente memoria es la secuencia que codifica un péptido de
la hormona adipoquinética de Lepidopteros (AKH). La familia AKH
consiste en neuropéptidos cortos que regulan la movilización y
metabolismo de la energía de sustrato en insectos. En una
realización preferida, puede utilizarse una secuencia de ADN que
codifica un péptido señal AKH del Lepidóptero Manduca sexta.
También pueden emplearse otros péptidos señal AKH de insectos, como
los del locus del Ortóptero Schistocerca gregaria. Otra
secuencia señal de insectos ejemplar es la secuencia que codifica
proteínas de la cutícula de Drosophila como CP1, CP2, CP3 o CP4.
Actualmente, el vector de transferencia más
utilizado que puede utilizarse en la presente memoria para
introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores,
conocidos por las personas especializadas en el tema, también pueden
utilizarse en la presente memoria. Los materiales y métodos para los
sistemas de expresión baculovirus/células de insecto están
disponibles comercialmente en un kit de compañías como Invitrogen
(San Diego CA) ("MaxBac" kit). Las técnicas utilizadas en la
presente memoria son conocidas para las personas especializadas en
el tema y se describen en Summers y Smith, A MANUAL OF METHODS FOR
BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, Texas A&M
University (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol.
(1983) 3: 2156, y Luckow y Summers (1989). Éstas incluyen,
por ejemplo, la utilización de pVL985 que altera el codon de inicio
de polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación
BamH1 32 pares de bases por debajo de ATT, como se describe
en Luckow y Summers, Virology (1989) 17: 31.
Así, por ejemplo, para la expresión en células de
insecto de los polipéptidos presentes, la secuencia de ADN deseada
puede insertarse en el vector de transferencia, utilizando técnicas
conocidas. Una célula de insecto anfitriona puede cotransformarse
con el vector de transferencia que contiene el ADN deseado insertado
junto con el ADN genómico del baculovirus salvaje, normalmente
mediante cotransfección. El vector y el genoma vírico se recombinan
lo que resulta en un virus recombinante que puede identificarse y
purificarse fácilmente. El virus recombinante empaquetado puede
utilizarse para infectar células anfitrionas de insecto para
expresar los polipéptidos PDGF y KGF.
Otros métodos que se pueden aplicar en la
presente memoria son los métodos estándar para el cultivo de células
de insecto, la cotransfección y la preparación de plásmidos se
explican en Summers y Smith (1987), citado más arriba. Esta
referencia también está relacionada con los métodos estándar para
clonar genes en vectores de transferencia AcMNPV, el aislamiento de
ADN de plásmidos, la transferencia de genes al genoma de AcmMNPV, la
purificación de ADN vírico, el marcaje radiactivo de proteínas
recombinantes y la preparación de medio de cultivo de células de
insecto. Los procedimientos para el cultivo de virus y células se
describen en Volkman y Summers, J. Virol. (1975) 19:
820-832 y Volkman et al., J. Virol.
(1976) 19: 820-832.
Los promotores típicos para la expresión en
células de mamífero incluyen el promotor temprano de SV40, el
promotor de CMV, el promotor del virus tumoral de ratón LTR, el
promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) y el promotor del
virus del herpes simple, entre otros. También pueden utilizarse en
construcciones de mamíferos otros promotores no víricos, como un
promotor derivado del gen de la metalotioneina murina. La expresión
en mamíferos puede ser constitutiva o regulada (inducible),
dependiendo del promotor. Típicamente, también están presentes
secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación,
localizadas 3' respecto al codon de parada de la transcripción.
Preferiblemente, también está presente una secuencia para optimizar
el inicio de la traslación, localizada 5' respecto a la secuencia
que codifica el polipéptido PDGF o el polipéptido KGF. Ejemplos de
señales de terminación de la transcripción/poliadenilación incluyen
aquellas derivadas de SV40, como se describe en Sambrook et
al., (1989), citado previamente. También pueden diseñarse en las
construcciones de la presente invención intrones que contienen
sitios de rotura del donante y del receptor.
También pueden utilizarse en la presente memoria
elementos amplificadores para incrementar los niveles de expresión
de las construcciones de mamíferos. Ejemplos incluyen el
amplificador del gen temprano de SV40, como se describe en Dijkema
et al., EMBO J. (1985) 4: 761 y el
amplificador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR)
del Virus de Sarcoma Rous, como se describe en Gorman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777 y del
citomegalovirus humano, como se describe en Boshart et al.,
Cell (1985) 41: 521. También puede estar presente una
secuencia líder que incluye una secuencia que codifica un péptido
señal, para proporcionar la secreción de la proteína extraña en
células de mamífero. Preferiblemente, hay sitios de procesamiento
codificados entre el fragmento líder y el gen de interés de manera
que la secuencia líder pueda romperse bien in vivo o in
vitro. El líder tripartito de adenovirus es un ejemplo de una
secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña
en células de mamífero.
Existen vectores de expresión que proporcionan
los medios para la expresión transitoria en células de mamífero de
ADN que codifica el polipéptido diana. En general, la expresión
transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es
capaz de replicarse de manera eficaz en una célula anfitriona, de
manera que la célula anfitriona acumula muchas copias del vector de
expresión y, a su vez, sintetiza niveles altos de un polipéptido
deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de
expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión
adecuado y una célula anfitriona, permiten la identificación
positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados,
así como el rastreo rápido de estos polipéptidos para encontrar las
propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los
sistemas de expresión transitorios son particularmente útiles par
fines de identificación de análogos y variantes del polipéptido
diana que tienen una actividad semejante a la del polipéptido
diana.
El vector de expresión descrito en EP 0622 456 A1
para la expresión de la cadena B de PDGF es también útil para la
invención para la expresión de PDGF mediante un promotor vírico
funcional en células de mamífero.
Una vez completos, los vectores de expresión de
mamíferos pueden utilizarse para transformar una cualquiera de
numerosas células de mamífero. Los métodos para introducir
polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son conocidos en
el campo e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación
con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de
protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos
en liposomas, y microinyección directa de ADN en el núcleo. Los
aspectos generales de las transformaciones en sistemas de células
anfitrionas de mamíferos los ha descrito Axel en EEUU 4.399.216.
También se conocen las líneas celulares de
mamífero disponibles como anfitrionas e incluyen líneas celulares
inmortalizadas que se pueden obtener de la American Type Culture
Collection (ATCC), incluyendo pero sin estar limitadas a, células de
ovario de hamster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de
hamster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma
hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón
embrionarias humanas, células sertoli de ratón, células de riñón
caninas, células de pulmón humanas, células hepáticas humanas,
células de tumor mamario de ratón, así como otras.
Las células anfitrionas de mamífero utilizadas
para producir el polipéptido diana de esta invención pueden
cultivarse en varios medios. Los medios disponibles comercialmente
como Ham's F10 (Sigma), Medio Mínimo Esencial ([MEM], Sigma),
RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle Modificado por
Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para el cultivo de células
anfitrionas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y
Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes y Sato,
Anal. Biochem. (1980) 102: 255, Patentes de EEUU Nos.
4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, ó 4.560.655, WO 90/103430, WO
87/00195, y EEUU RE 30.985, pueden utilizarse como medio de cultivo
para las células anfitrionas. Cualquiera de estos medios puede
suplementarse, cuando se considere necesario, con hormonas y/o otros
factores de crecimiento como insulina, transferrina, o factor de
crecimiento epidérmico, sales (como cloruro sódico, calcio,
magnesio, y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como
adenosina y timidina), antibióticos (como Gentamicina M), elementos
traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente
en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o
una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier
suplemento necesario a las concentraciones apropiadas que resultará
conocido por aquellas personas especializadas en el tema. Las
condiciones de cultivo, como temperatura, pH, y semejantes, son las
utilizadas previamente con la célula anfitriona seleccionada para la
expresión, y resultarán aparentes para una persona especializada en
el tema.
Para fines de terapia génica, los polinucleótidos
que codifican PDGF y KGF, o PDGF, KGF e IGF, o PDGF, KGF, IGF e
IGFBP, pueden administrarse al animal para su expresión. Los
polinucleótidos pueden administrarse bien como tales, o pueden
unirse con otros polinucleótidos para la administración, como con
vectores víricos. Estos polinucleótidos pueden también encapsularse
en liposomas u otros medios de administración convencionales en el
campo. Más abajo se detallan ejemplos de la utilización de
protocolos de terapia génica para la administración de KGF, PDGF,
IGF, e IGFBP.
Cuando se aplican técnicas de terapia génica a la
invención, KGF y PDGF pueden expresarse mediante diferentes vectores
o mediante el mismo vector; también KGF, PDGF e IGF pueden
expresarse mediante diferentes vectores o mediante el mismo vector;
también KGF, PDGF, IGF e IGFBP pueden expresarse mediante diferentes
vectores o mediante el mismo vector. El control de la regulación de
cada producto génico es distinto y una persona especializada en el
campo de la terapia génica y de la expresión puede seleccionar las
secuencias reguladoras apropiadas para KGF y PDGF, o cuando se
administre también IGF, también las secuencias reguladoras
apropiadas para KGF, PDGF e IGF, y cuando se administre también
IGFBP, también las secuencias reguladoras apropiadas para IGFBP.
De manera alternativa, los vectores que
comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican los
polipéptidos KGF y PDGF, y también el polipéptido IGF cuando también
se administra IGF, y también el polipéptido IGFBP cuando también se
administra IGFBP, pueden utilizarse directamente para la terapia
génica y pueden administrarse utilizando protocolos estándar de
administración génica. A este respecto, las secuencias de
nucleótidos que codifican los polipéptidos KGF y PDGF, y también IGF
cuando se administra IGF, e IGFBP cuando de administra IGFBP, pueden
integrarse de manera estable en el genoma de la célula anfitriona o
mantenerse en un elemento episomal estable en la célula anfitriona.
Los métodos para la administración génica se conocen en el campo,
como se describe en la Patente de EEUU No. 5.399.346.
Las estrategias de terapia génica para la
administración de construcciones de la invención pueden utilizar
aproximaciones de vectores víricos o no víricos en una modalidad
in vivo o ex vivo. La expresión de esta secuencia
codificadora puede inducirse utilizando promotores de mamífero
endógenos o heterólogos. La expresión in vivo de la secuencia
codificadora puede ser constitutiva o regulada.
Para la administración utilizando vectores
víricos, se puede utilizar cualquiera de un número de vectores
víricos, como se describe en Jolly, Cancer Gene Therapy
1: 51-64 (1994). Por ejemplo, la secuencia
codificadora puede insertarse en plásmidos diseñados para la
expresión en vectores retrovíricos, como se describe en Kimura et
al., Human Gene Therapy (1994) 5:
845-852, vectores adenovíricos, como se describe en
Connelly et al., Human Gene Therapy (1995) 6:
185-193, vectores víricos
adeno-asociados, como se describe en Kaplitt et
al., Nature Genetics (1994) 6:
148-153 y vectores sindbis. Los promotores adecuados
para utilizarse con estos vectores incluyen el LTR retrovírico
Moloney, el promotor de CMV y el promotor de albúmina de ratón. Los
virus libres incompetentes en cuanto a la replicación pueden
producirse e inyectarse directamente en el animal o en humanos o
mediante transducción de una célula autóloga ex vivo, seguido
de inyección in vivo como se describe en Zatloukal et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:
5148-5152.
La secuencia codificadora alterada también puede
insertarse en un plásmido para la expresión del polipéptido in
vivo o ex vivo. Para la terapia in vivo, la
secuencia codificadora puede administrarse mediante inyección
directa en el tejido o por infusión intravenosa. Los promotores
adecuados para ser utilizados de esta manera incluyen promotores
endógenos y heterólogos como CMV. Es más, se puede construir un
promotor sintético T7T7/T7OB de acuerdo con Chen et al.
(1994), Nucleic Acids Res. 22:
2114-2120, donde la polimerasa T7 está bajo el
control regulador de su propio promotor y dirige la transcripción de
la secuencia codificadora, que también está localizada bajo el
control de un promotor T7. La secuencia codificadora puede
inyectarse en una formulación que comprende un tampón que puede
estabilizar la secuencia codficadora y facilitar la transducción de
la misma en células y/o proporcionar selección, como se describe en
Zhu et al., Science (1993) 261:
209-211.
La expresión de la secuencia codificadora in
vivo después de la administración para fines de terapia génica
mediante vectores víricos o no víricos puede regularse para una
obtener una eficacia y seguridad máximas mediante la utilización de
promotores de expresión génica regulados, como se describe en Gossen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:
5547-5551. Por ejemplo, la secuencia codificadora
puede regularse por promotores que responden a tetraciclina. Estos
promotores pueden regularse de una manera positiva o negativa
mediante tratamiento con la molécula reguladora.
Para la administración no vírica de la secuencia
codificadora, la secuencia puede insertarse en vectores
convencionales que contienen secuencias de control convencionales
para un nivel de expresión alto, y después pueden incubarse con
moléculas de transferencia génica sintéticas como cationes
poliméricos que unen ADN como polilisina, protamina, y albúmina,
unidas a ligandos diana de la célula como asialoorosomucoide, como
se describe en Wu y Wu, J. Biol. Chem. (1987) 262:
4429-4432; insulina, como se describe en Hucked
et al., Biochem. Pharmacol. 40:
253-263 (1990); galactosa, como se describe en Plank
et al., Bioconjugate Chem. 3:
533-539 (1992); lactosa, como se describe en Midoux
et al., Nucleic Acids Res. 21:
871-878 (1993); o transferrina, como se describe en
Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
3410-3414 (1990). Otros sistemas de administración
incluyen la utilización de liposomas para encapsular ADN que
comprende el gen bajo el control de diferentes promotores activos
específicos de un tejido o ubicuos, como se describe en Nabel et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
11307-11311 (1993), y Philip et al., Mol.
Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994). Otros
tipos de administraciones no víricas adecuadas para ser utilizadas
incluyen sistemas de administración mecánicos como la aproximación
biolística, como se describe en Woffendin et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 (24):
11581-11585. Más aún, la secuencia codificadora y el
producto de su expresión pueden administrarse a través de la
deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados. Otros
métodos convencionales para la administración génica que pueden
utilizarse para la administración de la secuencia codificadora
incluyen, por ejemplo, la utilización de una pistola de partículas
para la transferencia génica de mano, como se describe en EEUU
5.149.655; utilización de radiación ionizante para activar la
transferencia génica, como se describe en EEUU 5.206.152 y la
solicitud PCT WO 92/11033.
La aplicación de la tecnología de terapia génica
respecto a los péptidos y polipéptidos de la invención y a sus
análogos o variantes puede hacerse cuando sea beneficioso para
tratar una herida mediante terapia génica, por ejemplo, con heridas
crónicas como úlceras, o con cualquier herida en la que las células
en el sitio de la herida respondan a un protocolo de terapia
génica.
En general, la terapia génica puede aplicarse de
acuerdo con la invención en todas las situaciones en las que sea
beneficiosa para cicatrizar una herida mediante la administración de
acuerdo con un protocolo de terapia génica de una cantidad
suficiente de un péptido de la invención o de su análogo, variante,
o negativo dominante, por ejemplo, para modular la actividad normal
de las interacciones de unión. Puede requerirse una administración
posterior dependiendo de la condición de la herida y del entorno con
el que se presenta.
Los vectores que codifican los polipéptidos KGF,
PDGF, IGF, e IGFBP también pueden empaquetarse en liposomas antes de
su administración al sujeto o a células derivadas de él. La
encapsulación lipídica se logra, generalmente, utilizando liposomas
que son capaces de unir o atrapar de manera estable y de retener
ácido nucleico. La proporción de ADN condensado respecto a la
preparación de lípidos puede variar pero generalmente es alrededor
de 1:1 (mg ADN:micromoles de lípido), o más de lípido. Para una
revisión de la utilización de liposomas como vehículos para la
administración de ácidos nucleicos, véase, Hug y Sleight,
Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1-17
(1991); Straubinger et al., Methods of Enzymology,
101: 512-527 (1983).
Las preparaciones de liposomas para utilizarse en
la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas
positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo
particularmente preferidos los liposomas catiónicos. Se ha visto que
los liposomas catiónicos median la administración intracelular de
ADN de plásmido (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1987) 84: 7413-7416); de ARNm
(Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86: 6077-6081); y de factores de la
transcripción purificados (Debs et al., J. Biol. Chem.
(1990) 265: 10189-10192), en una forma
funcional.
Los liposomas catiónicos se pueden obtener
fácilmente. Por ejemplo, liposomas N[1-2,
3-dioleiloxi]propil]-N,N,N-trietilamonio
(DOTMA) están disponibles bajo la marca registrada Lipofectin, de
GIBCO BRL, Grand Island, NY (Véase, también, Felgner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:
7413-7416). Otros liposomas disponibles
comercialmente incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE
(Boehringer). Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir
de materiales que se obtienen fácilmente utilizando técnicas
conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, Szoka et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:
4194-4198; Publicación PCT No. WO 90/11092 para una
descripción de la síntesis de DOTAP liposomas
(1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano.
De manera similar, los liposomas aniónicos y
neutros se obtienen fácilmente, por ejemplo de Avanti Polar Lipids
(Birmingham, AL), o pueden prepararse fácilmente utilizando
materiales que se obtienen fácilmente. Estos materiales incluyen
fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina,
dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG),
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales
pueden también mezclarse con los materiales de partida DOTMA y DOTAP
en las proporciones adecuadas. Los métodos para preparar liposomas
utilizando estos materiales son bien conocidos en el campo.
Los liposomas pueden comprender vesículas
multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequeñas (SUV), o
vesículas unilamelares grandes (LUV). Los diferentes complejos
liposoma-ácido nucleico se preparan utilizando métodos conocidos en
el campo. Véase, por ejemplo, Straubinger et al., en
Methods of Immunology (1983), Vol. 101, pág.
512-527; Szoka et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1978) 75: 4194-4198;
Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975)
394: 483; Wilson et al., Cell (1979) 17:
77); Deamer y Bangham Biochim. Biophys. Acta (1976)
443: 629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. (1977) 76: 836; Fraley et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3348); Enoch y
Strittmatter Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:
145); Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:
10431; Szoka y Papahadjopuolos Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1978) 75: 145; y Schaefer-Ridder et
al., Science (1982) 215: 166.
Los lipsomas se incluyen en la definición de un
vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico. El término
"liposomas" se refiere a, por ejemplo, las composiciones de
liposomas descritas en la Patente de EEUU No. 5.422.120, WO
95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 y EP 524.968 B1. Los liposomas
pueden ser vehículos farmacéuticos para los polinucleótidos o los
polipéptidos de la invención, para una combinación de los dos. El
agente terapéutico puede conjugarse con un liposoma, o puede
conjugarse con un polímero de hidrogel, y el polímero de hidrogel (o
un componente de un polímero de hidrogel) puede conjugarse o
encapsularse mediante un liposoma.
Los vectores recombinantes (tanto si están
encapsulados o no en liposomas), pueden administrarse en
composiciones farmacéuticas como se describe más arriba. Las
composiciones farmacéuticas comprenderán material genético
suficiente para producir una cantidad terapéutica eficaz del análogo
o de los análogos, como se describe más arriba. Para los fines de la
presente invención, una dosis eficaz será de aproximadamente 0,05
mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de las construcciones de ADN en el
individuo al que se administran.
Una vez formuladas, las composiciones de la
invención pueden administrarse directamente al sujeto o,
alternativamente, en el caso de los vectores descritos más arriba,
se pueden administrar ex vivo a células derivadas del sujeto.
Los métodos para la administración ex vivo y la
reimplantación de células transformadas en un sujeto son conocidos
en el campo y están descritos en, por ejemplo, WO 93/14778.
Generalmente, estos métodos incluyen transfección mediada por
dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada
por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación,
encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección
directa del ADN en el núcleo, todos ellos conocidos en el campo.
La administración de las combinaciones
terapéuticas de la invención puede conseguirse, por ejemplo,
mediante cremas tópicas, espuma, inyección, aerosol de aerosol, en
una matriz de gel, una esponja, gotas, y un lavado. La
administración puede ser, por ejemplo, una administración local,
oral, intradérmica, subcutánea, intraluminal, intragástrica, e
intraperitoneal con una formulación apropiada de la composición
seleccionada compuesta por una combinación de los agentes
terapéuticos apropiados para un tratamiento particular.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden
administrarse en una dosificación y cantidad eficaces desde un punto
de vista terapéutico, en el procedimiento de un protocolo eficaz
desde un punto de vista terapéutico para el tratamiento del
paciente. Las dosificaciones iniciales y cualquier dosificación
posterior dependerán de la edad, del peso, de la condición del
paciente y de la enfermedad, de la herida, del trastorno o de la
condición biológica que se está tratando. Dependiendo del agente
terapéutico, la dosificación y el protocolo de la administración
variarán, y la dosificación también dependerá del método de
administración seleccionado, por ejemplo, administración local o
sistémica.
La herida a la que se aplican las combinaciones
terapéuticas puede ser interna o externa, y pueden dirigirse hacia
cualquier tejido que presente una herida, por ejemplo tejido
epitelial. Para la administración tópica de IGF, se puede aplicar
una formulación de óxido de zinc, que induce la producción local de
IGF, como se describe en Tarnow et al., Scand. J. Plast.
Reconstr. Hand Surg. 28: 255-259 (1994).
La administración de las combinaciones terapéuticas de la invención
puede conseguirse con cualquier combinación de los agentes
terapéuticos, por ejemplo, mediante la administración de PDGF y KGF
seguida de IGF con IGFBP, o mediante la administración de PDGF, KGF,
IGF, e IGFBP al mismo tiempo o casi al mismo tiempo. Las
dosificaciones de cada agente terapéutico para una determinada
herida y para un paciente particular, se diseñan para conseguir una
dosis con una eficacia máxima para el agente terapéutico. Las
dosificaciones apropiadas para un tratamiento dado dependen de la
combinación particular de los agentes terapéuticos seleccionados
para el tratamiento. Por ejemplo, se ha visto que IGF solo es menos
potente que IGF administrado conjuntamente con IGFBP.
Las dosis para una herida particular se
determinarán para un paciente de manera individual, y dependen del
tamaño de la herida, del tipo del daño, y de la composición que se
aplica. Las dosis para los agentes terapéuticos individuales se han
determinado dentro de unos intervalos. Por ejemplo, se ha
determinado que una dosis eficaz de PDGF es 5 ng/mm^{2} o mayor
cuando es aplicado por vía tópica como se describe en la Patente de
EEUU No. 4.861.757 y al menos 1 ng/ml de concentración local de una
isoforma de PDGF (por ejemplo, PDGF-AA,
PDGF-BB, o PDGF-AB), hasta
aproximadamente 30 ng/ml de concentración local aplicada a una
población de fibroblastos como se describe en Lepisto et al.,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:
393-399 (1995). PDGF puede administrarse en una
formulación en gel de carboximetilcelulosa a concentraciones de
aproximadamente 10 \mug/gm a aproximadamente 500 \mug/gm de gel,
de aproximadamente 20 \mug/gm a aproximadamente 200 \mug/gm, y
de aproximadamente 30 \mug/gm a aproximadamente 100 \mug/gm de
gel, de manera óptima aproximadamente 100 \mug/gm de gel. La
eficacia del PDGF se ha conseguido en el intervalo de
aproximadamente 3 \mug/ml de disolución a aproximadamente 300
\mug/ml de disolución administrada.
Aproximadamente 50 \mul de KGF de una
concentración de aproximadamente 5 \mug/ml es eficaz para la
cicatrización de heridas mediante aplicación tópica al tejido
epitelial como se describe en Sotozono et al., Invest.
Opthal. Vis. Science 36: 1524-29 (1995). Como se
describe en la Patente de EEUU No. 4.861.757, una cantidad eficaz de
IGF cuando se coadministra con PDGF está en el intervalo de al menos
2,5 ng/mm^{2} a aproximadamente 5 ng/mm^{2}, con una proporción
de PDGF a IGF en el intervalo de aproximadamente 1:10 a
aproximadamente 25:1 peso/peso, siendo las proporciones más eficaces
PDGF a IGF de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 peso/peso.
Se ha visto que IGFBP administrada en combinación con IGF incrementa
la cicatrización de heridas a dosis de aproximadamente 5 \mug de
IGF con aproximadamente 1,5 \mug de IGFBP fosforilada en una
proporción molar de aproximadamente 11:1 IGF:IGFBP, como se describe
en Jyung et al., Surgery 115: 233-239
(1994).
Para la administración de los polipéptidos
terapéuticos, por ejemplo, los polipéptidos PDGF, KGF, IGF e IGFBP,
la dosificación puede estar en el intervalo de aproximadamente 5
\mug a aproximadamente 50 \mug/kg de tejido al que la aplicación
se dirige, también de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5
mg/kg, también de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500
\mug/kg de tejido, y de aproximadamente 200 a aproximadamente 250
\mug/kg. Para los polinucleótidos terapéuticos, por ejemplo en un
protocolo de administración de terapia génica, dependiendo de la
fuerza de la expresión del polinucleótido en el paciente, para una
administración dirigida a un tejido, los vectores que contienen
construcciones que se expresan incluyendo secuencias codificadoras
de PDGF, KGF, IGF, e IGFBP pueden administrarse en un intervalo de
aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para
administración local en un protocolo de terapia génica, también de
aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, también de
aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg de ADN, de
aproximadamente 5 \mug de ADN a aproximadamente 500 \mug de ADN,
y de aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug durante
una administración local en un protocolo de terapia génica, y
aproximadamente 250 \mug por inyección o administración. Los
factores como el método de acción y la eficacia de la transformación
y de la expresión son, por lo tanto, consideraciones que afectarán
la dosificación requerida para determinar la eficacia de la
administración de agentes de ADN terapéuticos. Cuando se desee una
expresión mayor, en un área de tejido mayor, un sitio de herida
puede requerir, para lograr un resultado terapéutico positivo,
cantidades de ADN mayores o volver a administrar las mismas
cantidades en un protocolo sucesivo de administraciones, o numerosas
administraciones en diferentes partes de tejido adyacentes o
próximas. En todos los casos, la experimentación rutinaria en
ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para un
efecto terapéutico óptimo, para cada agente terapéutico, para cada
protocolo de administración, y la administración a pacientes
específicos también se ajustará dentro de intervalos eficaces y
seguros dependiendo de la condición del paciente y de la respuesta a
las administraciones iniciales.
Los objetivos, características y ventajas
adicionales de la presente invención resultarán aparentes a partir
de la descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la
descripción detallada, aunque indica realizaciones preferidas de la
invención, se proporciona con fines ilustrativos solamente, ya que a
partir de esta descripción detallada resultarán aparentes para las
personas especializadas en el tema varios cambios y modificaciones
dentro del espíritu y el ámbito de la invención. Los ejemplos
siguientes son solamente ejemplares, y no pretenden limitar la
invención.
La presente invención se ilustrará ahora por
referencia a los ejemplos siguientes que muestran realizaciones
particularmente ventajosas. Sin embargo, debe apreciarse que estas
realizaciones son ilustrativas y no debe interpretarse que
restringen la invención en ningún caso.
Se tratan quemaduras de segundo grado con una
formulación en aerosol que incluye 10 \mug/ml de KGF, 30 ng/ml de
una isoforma de PDGF, 10 ng/ml de IGF-I, y 30 ng/ml
de IGFBP-1. Se deja secar el pulverizado al aire. Se
sugiere cada dos horas otra aplicación.
Una herida suturada se cierra y se aplica en la
sutura antes del vendaje un bálsamo tópico compuesto de 10% KGF y 5%
PDGF. Se vuelve a aplicar el bálsamo 3 veces diariamente.
Una formulación de 20% de óxido de zinc que
contiene también 5% KGF, 2,5% PDGF, y 10% IGFBP se aplica a
abrasiones menores, quemaduras solares e irritaciones para una
cicatrización más rápida de estas heridas.
Se utiliza una formulación de liposomas para
encapsular ADN de KGF, PDGF, IGF e IGFBP, cada uno en un vector para
la expresión. La proporción de ADN por peso es 10:5:2,5:7,5,
respectivamente. La composición de liposomas se administra en una
cápsula en gel por la boca para el tratamiento de úlceras
gastrointestinales con readministración diaria durante un periodo de
aproximadamente un mes, o hasta que una mejora significativa indique
una reducción en la frecuencia de administración.
Claims (40)
1. Una composición farmacéutica para la
reparación de tejidos epiteliales, que comprende un primer
polipéptido que tiene la actividad biológica de un factor de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y un segundo
polipéptido que tiene la actividad biológica del factor de
crecimiento de los queratinocitos (KGF).
2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el primer polipéptido comprende un
polipéptido PDGF de longitud completa.
3. Una composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el primer polipéptido comprende un fragmento
activo biológicamente de un polipéptido PDGF de longitud
completa.
4. Una composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el primer polipéptido comprende la cadena
PDGF A o la cadena PDGF B.
5. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el primer
polipéptido se produce por expresión de una molécula de ADN que
codifica PDGF en una célula anfitriona, donde la célula anfitriona
comprende una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula
de mamífero o una célula de insecto.
6. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el segundo
polipéptido comprende un KGF de longitud completa.
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el segundo
polipéptido comprende un fragmento activo biológicamente de un
polipéptido KGF de longitud completa.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el segundo
polipéptido se produce por expresión de una molécula de ADN que
codifica KGF en una célula anfitriona, donde la célula anfitriona
comprende una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula
de mamífero o una célula de insecto.
9. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende
también un tercer polipéptido que tiene la actividad biológica del
factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF).
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9, donde el tercer polipéptido comprende IGF de
longitud completa.
11. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9, donde el tercer polipéptido comprende un
fragmento de IGF activo biológicamente.
12. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9, donde IGF comprende IGF-1 o
IGF-2.
13. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el tercer
polipéptido se produce por expresión de una molécula de ADN que
codifica IGF en una célula anfitriona, donde la célula anfitriona
comprende una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula
de mamífero o una célula de insecto.
14. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende también
un cuarto polipéptido que tiene la actividad biológica de una
proteína transportadora del factor de crecimiento semejante a la
insulina (IGFBP).
15. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 14, donde el cuarto polipéptido comprende una
IGFBP de longitud completa.
16. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 14, donde el cuarto polipéptido comprende un
fragmento de una IGFBP activa biológicamente.
17. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 14, donde la IGFBP comprende
IGFBP-1, IGFBP-2,
IGFBP-3, IGFBP-4,
IGFBP-5 o IGFBP-6.
18. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde el cuarto
polipéptido se produce por expresión de una molécula de ADN que
codifica una IGFBP en una célula anfitriona, donde la célula
anfitriona comprende una célula bacteriana, una célula de levadura,
una célula de mamífero o una célula de insecto.
19. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además
comprende un vehículo aceptable desde un punto de vista
farmacéutico.
20. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende
una crema, una espuma, una disolución inyectable, un aerosol, una
matriz de un gel, una esponja, gotas o un lavado.
21. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para utilizarse
en un método para reparar tejidos epiteliales.
22. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 21, donde el tejido epitelial se selecciona de
piel, revestimiento gástrico o revestimiento intestinal.
23. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 21, donde la composición farmacéutica se aplica
localmente, oralmente, intradérmicamente, subcutáneamente,
intraluminalmente, intragástricamente o intraperitonealmente.
24. Una combinación que comprende una composición
farmacéutica que comprende PDGF y una composición farmacéutica que
comprende KGF para utilizarse en un método para reparar o prevenir
el daño en células epiteliales donde las composiciones farmacéuticas
se administran de manera simultánea o separada.
25. La combinación de acuerdo con la
reivindicación 24, donde la composición farmacéutica que comprende
PDGF y la composición farmacéutica que comprende KGF son la misma
composición farmacéutica.
26. La combinación de acuerdo con la
reivindicación 24, donde la aplicación de PDGF y KGF es
simultánea.
27. La combinación de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 26, que comprende además una
composición que comprende IGF para utilizarse en un método para
reparar o prevenir el daño en células epiteliales.
28. La combinación de acuerdo con la
reivindicación 27, que comprende además una composición que
comprende una IGFBP para utilizarse en un método para reparar o
prevenir el daño en células epiteliales.
29. Una composición farmacéutica que comprende
una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, donde la
primera molécula de ADN comprende una primera secuencia de
nucleótidos que codifica PDGF y la segunda molécula de ADN comprende
una segunda secuencia de nucleótidos que codifica KGF para
utilizarse en un método para reparar el daño en células epiteliales
que comprende aplicar la composición farmacéutica a la célula
epitelial.
30. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 29, donde la primera molécula de ADN comprende
además una secuencia de nucleótidos que codifica un líder de
secreción, donde el líder de secreción es suficiente para la
secreción de PDGF.
31. Una composición farmacéutica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde la segunda
molécula de ADN comprende además una secuencia de nucleótidos que
codifica un líder de secreción, donde el líder de secreción es
suficiente para la secreción de KGF.
32. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde la primera y
la segunda molécula de ADN están presentes en el mismo plásmido o en
plásmidos separados.
33. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, donde la primera
molécula de ADN está encapsulada en un liposoma.
34. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, donde la segunda
molécula de ADN está encapsulada en un liposoma.
35. Una composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, que comprende además
una tercera molécula de ADN que codifica IGF.
36. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 35, que comprende además una cuarta molécula de
ADN que codifica una IGFBP.
37. Un kit que comprende una composición
farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 20 e instrucciones para su utilización para la prevención o
reparación de células epiteliales.
38. Un kit que comprende una composición
farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
29 a 36.
39. Utilización de un primer polipéptido que
tiene la actividad biológica de un factor de crecimiento derivado de
las plaquetas (PDGF) y de un segundo polipéptido que tiene la
actividad biológica del factor de crecimiento de los queratinocitos
(KGF) en la fabricación de un medicamento para utilizarse en la
reparación del daño en células epiteliales.
40. Utilización de una primera molécula de ADN
que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica PDGF
y de una segunda molécula de ADN que comprende una segunda secuencia
de nucleótidos que codifica KGF en la fabricación de un medicamento
para utilizarse en la reparación del daño en células
epiteliales.
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