KR20210064042A - 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 - Google Patents
온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
FGF2 활성을 가지며 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성이 향상된 폴리펩타이드가 제공된다. 폴리펩타이드는 서열번호 1에서 28번째 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환되거나, 78번째 시스테인(C)이 이소류신(I) 또는 류신(L)으로 치환되거나, 96번째 시스테인(C)이 이소류신(I) 또는 트립토판(W)으로 치환되거나 하는 것 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 치환을 포함한다.
Description
본 기재는 온도 안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 FGF2 폴리펩타이드 및 그 용도에 관한 것이다.
FGF(Fibroblast Growth Factor)는 세포의 성장, 증식, 분화를 조절하는 중요한 역할을 수행하는 인자이다. 인체의 각 조직의 기능을 유지하기 위해 다양한 종류의 FGF들이 생성되며, 이들은 세포의 분화와 증식에 고유의 기능을 수행하고 있다. 그러나, 노화가 진행됨에 따라 피부 등 각 조직에서 FGF들의 농도는 점진적으로 낮아지며, 이에 따라 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 피부에 주름이 형성되고 탄력이 감소하게 된다.
다양한 FGF 중에서 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)는 주로 155개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 약 18kDa이다. FGF2는 광범위한 유사분열(mitogenic) 및 세포 생존 활성(cell survival activity)을 가지며, 상처 치유, 혈관 생성, 그리고 신경계의 성장에서 강력한 매개체로서의 역할을 한다.
따라서, FGF2는 혈관신생 촉진, 상처 치유 촉진, 연골형성 또는 골형성의 촉진 및 신경발생을 촉진시키는 의약품으로 개발되고 있을 뿐만 아니라 피부 재생, 주름 제거 또는 탄력 증가를 위한 화장품 원료로도 널리 사용되고 있다. 또한 세포를 만능성 상태로 유지하는 기능 때문에 인간 만능성 줄기 세포(PSC) 배양용 배지 등에도 주요인자로 첨가되고 있다.
이와 같이 인체내에서 다양한 기능을 갖는 FGF2는 열역학적으로 안정성이 상피세포성장인자(EGF), 인슐린유사성장인자(IGF) 그리고 혈관내피세포성장인자(VEGF) 등에 비해 크게 떨어지는 것으로 보고되고 있다. 또한 단백질 분해효소에 의해서 절단되기 쉬운 문제도 있다. 따라서 FGF2가 산업적인 용도에 적합하게 사용되기 위해서는 FGF2의 열역학적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성이 담보되는 것이 필수적인 조건이다.
본 개시는 온도 안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 FGF2 폴리펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 온도 안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 FGF2 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물을 제공하고자 한다.
본 개시는 온도 안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 FGF2 폴리펩타이드를 포함하는 인간 만능성 줄기 세포 배양 배지를 제공하고자 한다.
실시예들에 따른 온도 안정성을 향상시킨 FGF2 폴리펩타이드는 서열번호 1에서 28번째 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환되거나, 78번째 시스테인(C)이 류신(L) 또는 이소류신(I)으로 치환되거나, 96번째 시스테인(C)이 트립토판(W) 또는 이소류신(I)으로 치환되는 것 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 치환을 포함하고, FGF2 고유의 활성을 가지는 온도안정성을 향상시킨(thermally stable) 폴리펩타이드이다.
실시예들에 따른 조성물은 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 폴리펩타이드 및 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체를 포함한다.
실시예들에 따른 인간 만능성 줄기 세포 배양 배지는 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
실시예들에 따른 FGF2 폴리펩타이드는 제품제조 후 야생형 인간 FGF2 폴리펩타이드와 비교시 향상된 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 나타낸다.
온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 폴리펩타이드는 유통과 보관 과정 중에도 기존의 야생 인간 FGF2 제품과 달리 활성 유지가 가능하다. 따라서, 이를 약제학적 또는 화장용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다. 또한, 미분화성 증식을 유도하는 활성이 인간 만능성 줄기 세포 배양 배지의 유효성분으로 사용시 야생형 FGF2 대비 오랜 기간 유지될 수 있다는 장점을 가진다.
도 1은 야생형 FGF2의 폴리펩타이드(서열번호 1)이다.
도 2는 야생형 FGF2과 FGF2 변이체(pQE80_hFGF2(S137P), pQE80_hFGF2 (D28E, S137P))의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 3은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P))의 37℃에서의 안정성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 4는 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P),△9N-hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P))의 45℃에서의 안정성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 5는 야생형 FGF2과 FGF2 변이체(pQE80_hFGF2(S137P), pQE80_hFGF2 (D28E, S137P))의 37℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P))의 37℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 7은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P))의 42℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 8은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 9는 FGF2 변이체(△9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P)의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 2는 야생형 FGF2과 FGF2 변이체(pQE80_hFGF2(S137P), pQE80_hFGF2 (D28E, S137P))의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 3은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P))의 37℃에서의 안정성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 4는 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P),△9N-hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P))의 45℃에서의 안정성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 5는 야생형 FGF2과 FGF2 변이체(pQE80_hFGF2(S137P), pQE80_hFGF2 (D28E, S137P))의 37℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P))의 37℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 7은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)와 FGF2 변이체(△9N-hFGF2(D28E, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P))의 42℃에서의 세포증식활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 8은 야생형 FGF2(△9N-hFGF2)의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 9는 FGF2 변이체(△9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P)의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 측정하기 위한 SDS-PAGE를 나타낸다.
이하 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예들에 대하여 상세히 설명한다. 실시예는 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구체적인 실시예로만 한정되지 않는다.
본 개시에서 사용되는 일부 용어들의 정의가 아래에 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 개시에서 기술된 기법 및 공정들은 일반적으로 통례적인 방법에 따라 수행되며, 이는 본원 전체에 제시된다. 일반적으로, 본 개시에 사용된 명명 및 분자 생물학, 생화학, 분석 화학 및 세포 배양에서의 실험 절차들은 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 바와 동일하다.
변이체
본 개시는 부위 특이적인 돌연변이 유발에 의해 열적으로 안정화된 FGF2 폴리펩타이드를 제공한다. 본 개시에서는 생물정보 분석 및 컴퓨터를 이용한 단백질 설계를 통해 기존에 알려져 있지 않던 신규 위치에서 가장 최적의 아미노산을 합리적으로 예측한 후 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 돌연변이를 제조하였다.
도 1은 야생형 인간 FGF2 폴리펩타이드 서열을 나타낸다.
본 개시에서 용어 '야생형'은 종의 구성원들에서 가장 공통적인 아미노산 서열을 가진 천연형 FGF2를 의미한다. 본 개시에서, 야생형 FGF2는 아미노산 155개 길이의 (서열번호 1, 도 1) 18 kDa 단백질인 인간 FGF2이다.
본 개시에서 '단편'은 FGF2 활성을 가진 FGF2 폴리펩타이드의 기능성 단편을 지칭한다. 또한, 서열번호 1의 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 가진 FGF2 폴리펩타이드의 기능성 단편을 지칭한다. FGF2 폴리펩타이드의 단편은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 치환을 적어도 가진다. 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이 바람직하다. 단편은 온전한 폴리펩타이드 서열 및 구조의 일부로만 구성되는 폴리펩타이드로 의도되며, 변이체의 C-말단 결손 또는 N-말단 결손이 존재할 수 있다. 이러한 기능성 단편은 본 발명에 따른 대상 FGF2 단백질의 세포 결합 영역과 헤파린 결합 세그먼트를 보유할 수 있다.
본 개시에서 '서열 동일성'은 동일한 아미노산 잔기가 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 FGF2 폴리펩타이드에서 발견되는 것을 의미한다. FGF2 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 명시된 연속 세그먼트를 정렬하여 기준 분자에 해당되는 특정 아미노산 서열과 비교하였을 때, 야생형 인간 FGF2 폴리펩타이드가 기준으로서 사용된다. 서열 동일성의 %는, 양쪽 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 측정함으로써 일치된 위치의 수를 산정하고, 이를 기준 분자와 비교하는 세그먼트의 전체 위치 개수로 나누고, 이에 100을 곱하여, 서열 동일성의 %를 산출함으로써, 계산한다. 서열 정렬 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 본원에 사용되는 기준 서열은 본 발명에 따른 특정 대응되는 인간 야생형 FGF2 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 영장류, 돼지, 개, 소, 말 및 인간 등의 포유류 종의 경우, FGF2는 고도로 보존되어 있으며, 광범위한 종들에서 85% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는 서열 동일성은 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 또는 100%이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에 따른 FGF2 단백질의 전장에서 나머지 15% 이하의 아미노산은 예를 들어 FGF2 종의 다른 소스를 이용하거나 또는 당해 기술 분야에 일반적으로 공지된 적합한 비-FGF2 펩타이드 서열 또는 태그의 부가로 인해, 가변적일 수 있음을, 이해할 것이다. 야생형 FGF2에 대해 85% 이상의 동일성을 가진 본 발명의 구현예에 따른 FGF2 단백질은, FGF 패밀리의 다른 멤버들은 일반적으로 매우 낮은 서열 동일성을 가지므로, 비슷한 FGF2 이외의 다른 단백질을 포함할 가능성은 낮다.
본 발명자는 야생형 인간 FGF2에서 28번째 위치 또는 137번째 위치가 FGF2 폴리펩타이드의 열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성과 연관된 위치임을 확인하였다. 그리고, FGF2의 표면에 노출되어 있는 시스테인 중 78번째 위치 또는 96번째 위치의 시스테인이 열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성과 연관된 위치임을 확인하였다.
열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성과 연관된 위치에서 가장 적절한 아미노산으로 바꾸는 것 발명자의 노력(inventive step)을 요하는 것이다.
본 발명자는 28번째 위치의 아스파르트산(D)를 글루탐산(E)으로 치환함으로써 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 137번째 위치의 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환함으로써 열적 안정성을 보다 더 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 28번째 위치와 137번째 위치를 함께 치환함으로써 열적 안정성을 보다 더 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
78번째 위치와 96번째 위치의 경우에는 SDM((http://marid.bioc.cam.ac.uk, University of Cambridge)와 Discovery studio 2019(BIOVIA)을 통해 19개의 돌연변이 후 안정화 비교를 진행하여 확인하였다.
78번째 위치의 경우 SDM 분석결과에서는 류신(L)으로 돌연변이시킬 경우에 예측 값(Predicted pseudo △G) 0.33으로 가장 높게 나왔으며, Discovery studio에서는 이소류신(I)으로 돌연변이시킬 경우에 돌연변이 에너지 변화 값(kcal/mol)이 -1.20으로 가장 안정한 것으로 예측되었다.
96번째 위치의 경우 SDM 분석결과에서는 이소류신(L)으로 돌연변이시킬 경우에 예측 값(Predicted pseudo △G) 0.19으로 가장 높게 나왔으며, Discovery studio에서는 트립토판(W)으로 돌연변이시킬 경우에 돌연변이 에너지 변화 값(kcal/mol)이 -0.39으로 가장 안정한 것으로 예측되었다.
US9169309, US2017-0291931, EP3380508, US20180319857 등에서는 78번째의 시스테인을 세린(S), 티로신(Y)으로 치환하거나, 96번째의 시스테인을 세린(S), 티로신(Y), 트레오닌(T) 또는 아스파라긴(N) 등으로 치환한 내용이 개시되어 있다. 이들 치환된 아미노산의 경우에는 대다수가 친수성이며 전하가 없는 아미노산인 반면, 본 개시에서는 치환된 아미노산은 소수성 아미노산으로 종래의 기술로부터 용이하게 예측할 수 없는 범주로 볼 수 있다.
따라서, 본 개시에서 가능한 변이체는 아래 표 1에 개시된 다양한 변이체중 어느 하나일 수 있다.
| # | 변이체 |
| 1 | (D28E) |
| 2 | (C78I) |
| 3 | (C78L) |
| 4 | (C96I) |
| 5 | (C96W) |
| 6 | (S137P) |
| 7 | (D28E, C78I) |
| 8 | (D28E, C78L) |
| 9 | (D28E, C96I) |
| 10 | (D28E, C96W) |
| 11 | (D28E, C137P) |
| 12 | (C78I, C96I) |
| 13 | (C78I, C96W) |
| 14 | (C78L, C96I) |
| 15 | (C78L, C96W) |
| 16 | (C78I, S137P) |
| 17 | (C78L, S137P) |
| 18 | (C96I, S137P) |
| 19 | (C96W, S137P) |
| 20 | (D28E, C78I, C96I) |
| 21 | (D28E, C78I, C96W) |
| 22 | (D28E, C78L, C96I) |
| 23 | (D28E, C78L, C96W) |
| 24 | (D28E, C78I, S137P) |
| 25 | (D28E, C78L, S137P) |
| 26 | (D28E, C96I, S137P) |
| 27 | (D28E, C96W, S137P) |
| 28 | (C78I, C96I, S137P) |
| 29 | (C78I, C96W, S137P) |
| 30 | (C78L, C96I, S137P) |
| 31 | (C78L, C96W, S137P) |
| 32 | (D28E, C78I, C96I, S137P) |
| 33 | (D28E, C78I, C96W, S137P) |
| 34 | (D28E, C78L, C96I, S137P) |
| 35 | (D28E, C78L, C96W, S137P) |
위의 다양한 변이체들 중, 단일 위치의 돌연변이도 열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성을 향상시킬 수 있지만, 2개 이상의 돌연변이가 열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성 향상에 바람직할 수 있다. 나아가서, 3개 내지 4개의 돌연변이가 보다 열적 안정성 및/또는 단백질 분해효소 저항성 향상에 바람직할 수 있다. 일반적으로, FGF2의 코딩 유전자를 클로닝한 다음 형질전환된 유기체, 바람직하게는 미생물에서 발현시킨다. 숙주 유기체는 발현 조건에서 FGF2를 생산하도록 외래 유전자를 발현한다. 또한, 합성 재조합 FGF2는 진핵 생물, 예를 들어, 효모 또는 인간 세포에서 만들어질 수 있다. FGF2는 재조합 생산 방법에 따라 146개 아미노산 형태, 153-155 아미노산 형태 또는 이의 혼합 형태일 수 있다.
본원에 제시된 설명은, 야생형 FGF2에서의 일부 변화가 야생형 단백질 보다 높은 온도안정성과 긴 반감기를 가진 FGF2 돌연변이를 구축함을 최초로 입증해준다.
본원에 기술된 치환을 삽입하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 FGF2 단백질은, 본원에 지정된 기준을 충족하는 한, 즉, 야생형 FGF2의 바람직한 생물 활성을 보유하면서 열-안정화되는 한, 예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 영장류, 돼지, 개, 소, 말 및 인간 등의 임의의 포유류에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, 대상 FGF2 단백질은 인간 소스로부터 유래된다. 그러나, 비교의 기준으로 사용되는 서열번호 2의 인간 FGF2 단백질의 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가진, 포유류 FGF2에 대한 모든 생물학적으로 활성인 변이체들이, 본 발명에서 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명에 따른 안정적인 FGF2 폴리펩타이드는, 검출, 정제, 특정 조직 또는 세포에의 태깅, 개선된 안정성, 연장된 활성, 개선된 발현 등을 용이하게 수행하기 위해 사용될 수 있는, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 부가적인 FGF 펩타이드 이외의 서열 또는 태그를 더 포함할 수 있다.
약제학적 및 화장품 조성물
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체는 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체와 함께 약제학적 및/또는 화장품 조성물로 제공될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체는 혈관신생 촉진, 상처 치유 촉진, 연골형성 또는 골형성의 촉진, 또는 신경발생 촉진을 필요로 하는 대상체 또는 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선을 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체는 "원상태" 형태 또는, 원한다면, 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 유도체, 등의 형태로 투여될 수 있으며, 단, 상기 염, 에스테르, 아미드, 전구약물 또는 유도체는 약리적으로 적합하고, 즉, 본 방법(들)에 효과적인 물질에서 선택될 수 있다. 펩타이드의 염, 에스테르, 아미드, 전구약물 및 다른 유도체는 합성 유기 화학 분야의 숙련가에게 공지되고, 예를 들면, 공지의 표준 절차를 사용하여 제조될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 피하, 비경구, 국소, 경구, 코 (또는 그렇지 않으면 흡입된), 직장, 또는 국소 투여를 위해, 예컨대 에어로졸, 크림, 세럼 그리고 패취형태의 경피투여형 제품으로 제형화될 수 있다. 조성물은 투여 방법에 따라서 다양한 단위 복용 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 복용 형태는, 비제한적으로 분말, 정제, 알약, 캡슐, 로젠지, 좌약, 패치, 비강 스프레이, 주사제, 이식가능 지속 방출 제형, 지질 복합체, 등을 포함할 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들이 화장용으로 허용가능한 담체와 조합되어 화장품 조성물을 형성할 경우 충전제(예를 들면 히알루론 충전제, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 마이크로구형체 및 콜라겐 충전제) 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물은 바람직하게는 국소, 피하, 또는 경피 투여용일 수 있다.
본 조성물은 주사용 조성물일 수 있다.
본 조성물은 콜라겐 (예를 들면, 소, 돼지, 또는 인간 콜라겐)히알루론산을 추가로 포함할 수 있다. 콜라겐은 합성 콜라겐일 수 있으며, 히알루론산은 닭벼슬 또는 미생물의 발효 산물일 수 있다.
본 조성물은 마취제 (예를 들면, 리도카인)을 추가로 포함할 수 있다.
본 조성물은 피부 크림(예를 들면, 얼굴 크림)일 수 있다.
본 조성물은 세럼 또는 토너형태의 액상형 제제일 수 있다.
본 조성물은 겔상태의 반고형 제제 일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 U.S. 약전 또는 동물, 더 상세하게는 인간에서 또는 동물, 더 상세하게는 인간에 대해 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에서 열거된 것을 포함한다. "담체"는, 예를 들면, 본 개시에서 기재된 1 이상의 펩타이드와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 보조제 또는 비히클을 의미한다.
약제학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들면, 조성물을 안정화시키거나 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들의 흡수를 증가 또는 감소시키는 것으로 작용하는 1 이상의 생리적으로 허용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리적으로 허용가능한 화합물은 하기를 포함할 수 있다: 예를 들면, 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저분자량 단백질, 보호 및 흡수 인핸서 예컨대 지질, 펩타이드의 청소능 또는 가수분해를 감소시키는 화합물, 또는 다른 부형제, 안정제 및/또는 pH 조절 완충제일 수 있다.
특히 정제, 캡슐, 겔 캡, 등의 제조에서 사용되는 다른 생리적으로 허용가능한 화합물은, 비제한적으로 결합제, 희석제/충전제, 붕해제, 윤활유, 및 현탁화제를 포함할 수 있다.
경구 복용 형태(예를 들면, 정제)를 제조하기 위해서 부형제, 임의의 붕해제, 결합제 및 임의의 윤활유 등이 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들에 부가되고 수득한 조성물은 압축될 수 있다. 필요한 경우, 압축된 생성물은 맛을 차단하거나 장의 용해 또는 지속 방출을 위해 공지된 방법을 사용하여 코팅될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들과 제형화될 수 있는 다른 생리적으로 허용가능한 화합물은 미생물의 성장 또는 작용을 방지하는데 특히 유용한 습윤제, 유화제, 분산제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 부형제는 멸균되고 오염물질이 없는 상태로 사용될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 화장품 용도를 위한 제형에 편입되어 국소로 도포될 수 있고 피부 크림 (예를 들면, 얼굴 크림) 또는 바디 로션, 주름-제거 크림으로서 제형될 수 있거나 화장품, 햇볕차단제, 또는 보습제에 편입될 수 있다.
또한 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 충전제, 보습제, 비타민 (예를 들면, 비타민 E), 및/또는 착색제/염색약을 임의로 추가로 포함하는 제형에 편입될 수 있다.
적합한 주사가능 화장품 제형은 1 이상의 충전제 물질과 함께 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 편입하는 제형을 비제한적으로 포함할 수 있다. 주사가능 화장품 주름 충전제로서 사용가능한 예시적인 물질은, 비제한적으로, 일시적 (흡수성) 충전제 예컨대 콜라겐 (예를 들면, 합성 콜라겐, 소 콜라겐, 돼지 콜라겐, 인간 콜라겐, 등), 히알루론산 겔, 칼슘 하이드록실인회석 (전형적으로 겔의 형태로 이식됨), 또는 폴리-L-락트산 (PLLA) 등을 포함할 수 있다. 펩타이드는 영구적 (비-흡수성) 충전제를 함유하는 주사가능 화장품 제형에 또한 편입될 수 있다. 예증적인 "영구적" 충전제는, 비제한적으로, 폴리메틸메타크릴레이트 비드 (PMMA 마이크로구형체)를 포함할 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 진피 충전제, 주사가능 제형 등에 편입되거나 함께 투여될 수 있다: 그와 같은 주사가능 제형은 마취제 (예를 들면, 리도카인 또는 그것의 유사체)를 추가로 포함할 수 있다. 주사가능 제형은 실질적으로 멸균되거나 멸균되고/거나 피하 주사가능 충전제용 관리 기관 지침에 부합한다
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 당해기술에서 공지된 임의의 경로를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있고, 그 경로는 예를 들면, 주사로 (예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 진피내), 흡입, 경피 적용, 직장 투여, 질 투여, 또는 경구 투여를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 피하, 경피, 또는 국소 적용을 포함한다.
효과적인 양의 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 국소 (즉, 비-전신) 투여를 통해, 예컨대 말초 근육내, 선상내, 및 피하 투여를 비제한적으로 포함하는 말초 투여에 의해 투여될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들의 투여는 임의의 편리한 방식, 예를 들면, 주사로, 정맥내 및 동맥 스텐트 (용출 스텐트 포함), 카테터, 경구 투여, 흡입, 경피 적용, 직장 투여, 등일 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 투여 전에 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 투여될 특정한 조성물에 의해서, 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정한 방법에 의해서 부분적으로 결정된다.
대상체에서 투여된 용량은, 본원에서 기재된 방법의 맥락에서, 경시적으로 상기 대상체에서 유익한 치료적 반응 (예를 들면, 증가된 피하 지방생성)에 영향을 미치기에 충분해야 한다. 용량은 이용된 특정한 비히클/전달 방법의 효능, 투여 부위, 투여 경로, 및 상기 대상체의 상태, 뿐만 아니라 치료될 대상체의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한, 특정한 대상체에서 특정한 펩타이드의 투여를 동반하는 임의의 부정적인 부작용의 존재, 성, 및 정도에 의해 결정될 것이다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 전신으로(예를 들면, 경구로, 또는 주사제로서) 투여될 수 있다. 펩타이드는 로젠지, 에어로졸 스프레이, 구강청결제, 코팅된 면봉 등과 같은 다양한 형태로 구강에 투여될 수 있다. 다양한 구강, 및 설하 제형 역시 고려될 수 있다. 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 일정 기간에 걸쳐 치료를 제공하기 위해 주사제로서 제형화될 때 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 예를 들면, 피부 표면에, 국소 병변 또는 창상에, 수술 부위 등에 국소로 투여될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 종래의 경피 약물 전달 시스템, 즉, 경피 "패치"를 이용하여 피부를 통해 전달될 수 있고, 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 전형적으로 피부에 부착될 약물 전달 장치로서 제공되는 적층된 구조 내에 함유될 수 있다.
국소 전달을 위한 다른 제형은, 비제한적으로, 연고, 겔, 스프레이, 유체, 및 크림을 포함한다. 연고는 전형적으로 바셀린 또는 다른 석유 유도체에 기초한 반고형 조제물일 수 있다. 다른 담체 또는 비히클과 마찬가지로, 연고 기제는 불활성이고, 안정하고, 무자극이고 비감작이어야 한다. 선택된 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 함유하는 크림은 전형적으로 점성 액체 또는 반고체 에멀젼, 종종 수중유 또는 유중수일 수 있다. 크림 기제는 전형적으로 수세척성이고, 오일상, 유화제 및 수성상을 함유한다. 사용될 특정 연고 또는 크림 기제는, 당해분야의 숙련가에게 의해 인정될 바와 같이, 최적의 약물 전달을 위해 제공될 기제이다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 희석을 위해 준비된 저장 용기(예를 들면, 미리측정된 부피로), 또는 다량의 물, 알코올, 과산화수소, 또는 다른 희석제에의 첨가를 위해 준비된 가용성 캡슐 내에, "농축물"로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩타이드는 추후 재구성을 위해 동결건조될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 다양한 용도를 가질 수 있다. 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 많은 적용에서 용도를 가질 수 있다. 예를 들면, 피하 지방은 피부에 풍만함과 견고함을 제공하므로, 피하 지방의 형성을 향상시키는 것은 성형수술 절차에서 용도를 갖는다. 노화하는 피부는 적은 피하 지방을 함유한다. 따라서 본 개시에서 기재된 하나 이상의 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 원하는 부위에 투여하여 피하 지방 형성을 촉진하는 것은 더 풍만하고 더 어려보이는 피부를 야기할 수 있다. 이 접근법은 종종 낮은 성공률을 나타내는 과정인, 신체의 다른 부위(예를 들면, 허벅지 또는 엉덩이)로부터 지방세포를 이식하는 현재의 방법을 대체할 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 피하 지방 조직을 선택적으로 향상시키기 위해(예를 들면, 내장 지방 및/또는 다른 지방 조직을 실질적으로 증가시키지 않으면서 피하 지방 조직을 향상시키기 위해) 투여될 수 있다. 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들의 투여에 반응하여, 지방세포 형성이 진피 섬유아세포에서 일어나고, 대상에서 선택된 피하 부위 안에서 부피가 추가될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 흉터를 줄이는데 사용될 수 있다. 이것은 하나 이상의 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 흉터 부위를 줄이고/거나 흉터 부위의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 흉터는, 예를 들면, 화상에 의해 생성된 흉터, 수술에 의해 생성된 흉터, 여드름에 의해 생성된 흉터, 생검에 의해 생성된 흉터, 또는 부상으로 생긴 흉터일 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 예를 들면, 피부의 외관을 개선하기 위해, 다양한 화장 과정에서 사용될 수 있다. 이것은 하나 이상의 펩타이드를 대상의 부위에 피부의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 그러한 투여는 입술, 눈꺼풀, 뺨, 이마, 턱, 목 등과 같은 영역에의 피하 투여를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 주름을 줄이고, 처지는 피부를 줄이고, 피부의 표면 질감을 개선하고, 주름을 줄이거나, 제거하거나, 메우고, 노인 반점을 제거하거나 줄이고, 및/또는 눈 아래의 다크써클을 제거하는 이들 방법 등에 사용될 수 있다. 이들 화장 적용은 예시적이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 대상의 부위에서 조직 부피를 개선하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 대상의 부위에서 조직 부피를 증가시키는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 조직 부피의 증가는 유방 조직을 견고하게 하거나 증대시키는 것 및/또는 엉덩이 조직 또는 신체 또는 얼굴의 다른 부위를 견고하게 하거나 증대시키는 것을 포함할 수 있다.
이 때 사용되는 FGF2는 0.01 내지 10ppm의 양으로 사용될 수 있다. 10 ppm 이상에서는 과다한 양으로 이상반응을 유도할 수 있는 부작용의 가능성이 있다. 따라서, 실제적 사용범위는 0.01~10 ppm이며, 바람직하게는 0.01~2 ppm 일 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 또한 대상의 부위 내의 피부를 부드럽게 하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 원하는 부위에서 피부를 부드럽게 하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 상기 부드럽게 하는 것은 여드름에 의해 흉터난 피부를 부드럽게 하는 것, 셀룰라이트의 부위를 부드럽게 하는 것, 임신선을 부드럽게 하거나 줄이는 것, 및/또는 주름을 펴는 것을 포함할 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 대상에서 줄기세포를 피하 지방의 형성으로 동원하는데 사용될 수 있다. 이것은 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 줄기세포를 피하 지방의 형성으로 동원하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 이는, 예를 들면, 다양한 재건 수술 과정 등에서 유용성을 갖는다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 대상에서 조직을 재건하는데 사용될 수 있다. 그러한 재건은, 예를 들면, 유방재건(예를 들면 종양을 제거하는 수술 후), 또는 얼굴 또는 팔다리 재건(예를 들면 자동차 사고 또는 화상 후)을 포함할 수 있다. 이것은 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들을 조직 재건 과정 동안 또는 이후에 조직의 부피를 증가시키는 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 조직 이식 물질 또는 피부 또는 부상된 조직의 치유를 향상시키는 다른 절차와 함께 임의로 사용될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 걸을 때 상기 대상에 의해 경험되는 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 충분한 양으로 투여함으로써 대상에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 사용될 수 있다.
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 체온조절을 증가시키고/거나 면역 기능을 개선하기 위해 피하 지방의 확대를 위해 투여될 수 있다. 대상은 질환을 예방하거나, 비제한적으로 심혈관 질환을 포함하는 증가된 장기 지방과 연관된 진행중인 질환, 및 다른 비만 연관된 질환을 치료하기 위해 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들로 처리될 수 있다.
이들 방법 중 어느 것에서의 투여는 국소 또는 전신일 수 있고, 본원에 기재된 임의의 경로, 예컨대 국소, 피하, 경피, 경구, 코, 질, 및/또는 직장 투여에 의할 수 있다. 바람직하게는, 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 얼굴 크림과 같은 피부 크림의 형태로 국소 투여되거나, 또는 경피 패치를 통해 경피로 투여될 수 있다.
상기 용도 및 방법이 인간에서의 용도와 관련하여 기재되어 있음에도 불구하고, 이들은 또한 동물, 예를 들면, 수의적 용도에 적합하다. 따라서 어떤 바람직한 유기체는, 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 개과, 말, 고양이, 돼지, 유제류, 토끼류 등을 포함한다.
배지
표 1에 개시되어 있는 다양한 변이체들은 적어도 5번의 계대 배양 동안에 미-분화된 상태로 만능성 줄기 세포를 유지시키는데 필요한 양에 해당하는 '배지학적 유효량'으로 포함되어 인간 만능성 줄기 세포 배지로 제공될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포 및 유도된 만능성 줄기 세포 둘 다를 포함하는, 본 개시에서, 용어 '인간 만능성 줄기 세포'는, 동일한 자신의 후대와 인간 신체의 실제 모든 세포 타입을 생성할 수 있게 하는 만능성을 형성하는 능력 - 자가-재생력 (self-renewal capacity) - 을 특징으로 한다.
본 개시에서, 용어 '줄기 세포를 만능성 상태로 유지시킨다'는 것은 실제 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미-분화된 상태로 세포를 유지시키는 것을 의미한다. 이러한 만능성 상태는 FGF2가 가장 중요한 성장인자인 성장인자들의 줄기성(stemness)-지지 칵테일에 의존한다. FGF2는 여러가지 방식으로 자가-재생을 지원한다: 미토겐-활성화된 단백질 키나제 경로를 직접 활성화하고, 형질전환 성장인자 β1 및 액티빈 신호전달을 간접적으로 촉매한다 (Greber, et al. 2008, Stem Cells25, 455-464). FGF2는, 세포 부착 및 생존 기능을 통해, 인간 PSC의 만능성에 복합적으로 기여한다 (Eisellova, et al. 2009, Stem Cells 27, 1847-1857).
본 개시는 조작된 대상 FGF2의 특징 규명, 단백질에서의 치환 효과 입증, 인간 PSC 배양에서 단백질의 이용 방법, 및 인간 PSC를 미분화된 상태로 배양하는데 적합한 본원에 기술된 하나 이상의 내열성 FGF2 단백질을 포함하는 배지를 제공한다. 본원에 제공된 실시예들에서 사용되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC)는 의사에 의한 사전동의 하에 수득된 배반포기 배아로부터 유래되었다. 29-41회 계대의 특징이 잘 규명된 인간 ESC 세포주 (Adewumi, et al. 2007, Nat Biotechnol 25, 803-816) CCTL14 (Centre of Cell Therapy Line)를 사용하였다. 인간 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC)에서와 같이, 야마나카의 칵테일 (Yamanaka's cocktail) 및 센다이 바이러스 형질감염 (Sendai virus transfection)에 의한 피부 섬유모세포의 리프로그래밍을 이용하여 유래된 AM13 세포주는 34-41회 계대 상태를 사용하였다 (Kruta et al. 2014, Stem Cells and Development 23, 2443-2454).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예들을 제시하나, 하기 실험예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: pQE80 벡터를 이용한 돌연변이체들의 구축, 정제 및 열적 안정성 분석
FGF2의 1개 위치의 돌연변이(S137P)와 2개 위치의 돌연변이(D28E, S137P)를 합성하고, His-Tag를 가진 pQE80L 벡터에 서브클로닝하였다. FGF2가 삽입된 재조합 벡터를 Rosetta(DE3)pLysS 세포에 형질전환하여 발현하였다.
10ml LB media(Ambrothia) (0.25g 사용)에 접종하고 암피실린(Ampicillin, 50mg/ml)을 10ul을 첨가 후 37℃에 전 배양하였다.
전배양액 10ml과 암피실린(Ampicillin, 50mg/ml) 1ml을 1L LB media(ambrothia)(25g 사용)에 접종하여 37℃에서 본 배양하였다. OD600의 수치가 0.6일 때 4℃냉장고에서 배양액을 10분간 냉각시켜준 후 베타-디-1-티오갈락토피라노사이드 (β-D-l-thiogalactopyranoside; IPTG) 0.5mM을 첨가하여 20℃에서 20시간 발현을 유도한 대장균 세포를 얻었다.
발현된 pQE80_FGF2는 용해완충용액(20mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl, 3mM DTT)에 녹여서 초음파 처리 후 13000 r.p.m에 30분 동안 원심분리를 수행한 다음 정제하였다.
원심분리 후, 최적으로 용해된 상층액은 Heparin 비즈가 있는 컬럼에 주입하였다. 컬럼에 주입된 pQE80_FGF2 단백질 부피의 3배 되는 첫 번째 세척(wash) 완충용액(20mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl, 3mM DTT)과 두 번째 세척(wash) 완충용액 (20mM Tris pH 8.0, 500mM NaCl, 3mM DTT)으로 씻고, 60ml 용리완충용액(elution buffer), 20mM Tris pH 8.0, 1800mM NaCl, 3mM DTT)으로 용리하여 1차 정제하였다.
마지막으로 pQE80_FGF2 단백질 분획은 HiLoadTM 16/60 Superdex 75(Amersham Biosciences) 컬럼과 1X PBS 버퍼(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4), (WELGENE)를 이용한 젤 여과 방법에 의해 정제되었다.
정제된 FGF2 단백질 들은 1X PBS 버퍼를 기본 사용하여 0.5mg/ml 농도로 37℃에서 0, 2, 4, 6일 동안 반응하였으며 코마쉬 블루 염색시약으로 염색하여 15% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 도 2에 그 결과가 예시되어 있다.
도 2에 예시되어 있는 바와 같이, 15% SDS-PAGE를 통해 확인된 FGF2 폴리펩타이드 밴드들로부터 두 변이 폴리펩타이드 (pQE80_hFGF2(S137P), pQE80_hFGF2 (D28E, S137P)) 모두 변이되지 않은 hFGF2 (야생형) 폴리펩타이드 보다 SDS-PAGE상 안정성이 개선되었음을 알 수 있다.
실험예 2: pET17b 벡터를 이용한 돌연변이체들의 구축, 정제 및 열적 안정성 분석
FGF2의 1개 위치의 돌연변이(S137P), 2개 위치의 돌연변이(D28E, S137P), 4개 위치의 돌연변이((D28E, C78L, C96I, S137P), (D28E, C78L, C96W, S137P), (D28E, C78I, C96I, S137P), (D28E, C78I, C96W, S137P))를 합성하고, His를 가진 pET17b 벡터에 서브클로닝하였다. FGF2가 삽입된 재조합 벡터를 Rosetta(DE3)pLysS 세포에 형질전환하여 발현하였다.
10ml LB media(Ambrothia) (0.25g 사용)에 접종하고 암피실린(Ampicillin, 50mg/ml)을 10ul을 첨가 후 37℃에 전 배양하였다.
전배양액 10ml과 암피실린(Ampicillin, 50mg/ml) 1ml을 1L LB media(ambrothia)(25g 사용)에 접종하여 37℃에서 본 배양하였다. OD600의 수치가 0.6일 때 4℃냉장고에서 배양액을 10분간 냉각시켜준 후 베타-디-1-티오갈락토피라노사이드 (β-D-l― thiogalactopyranoside; IPTG) 0.5mM을 첨가하여 20℃에서 20시간 발현을 유도한 대장균 세포를 얻었다.
발현된 pET17b_FGF2는 용해완충용액(20mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl, 3mM DTT)에 녹여서 초음파 처리 후 13000 r.p.m에 30분 동안 원심분리를 수행한 다음 정제하였다.
원심분리 후, 최적으로 용해된 상층액은 Heparin 비즈가 있는 컬럼에 주입하였다. 컬럼에 주입된 pET17b_FGF2 단백질 부피의 3배 되는 첫 번째 세척(wash) 완충용액(20mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl, 3mM DTT)과 두 번째 세척(wash) 완충용액 (20mM Tris pH 8.0, 500mM NaCl, 3mM DTT)으로 씻고, 60ml 용리완충용액(elution buffer), 20mM Tris pH 8.0, 1800mM NaCl, 3mM DTT)으로 용리하여 1차 정제하였다.
4개 위치 돌연 변이체들은 친화성 크로마토그래피 방법에서 완충용액과 용리완충용액 모두에서 3mM DTT를 포함하지 않도록 제조한 용액을 사용하여 정제하였다.
마지막으로 pET17b_FGF2 단백질 분획은 HiLoadTM 16/60 Superdex 75(Amersham Biosciences) 컬럼과 1X PBS 버퍼(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4), (WELGENE)를 이용한 젤 여과 방법에 의해 정제되었다.
37℃안정성 실험
정제된 FGF2 단백질 들은 1X PBS 버퍼를 기본 사용하여 0.5mg/ml 농도로 37℃에서 0, 3, 6, 9일 동안 반응하였으며 코마쉬 블루 염색시약으로 염색하여 15% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 도 3에 그 결과가 예시되어 있다.
도 3에 예시되어 있는 바와 같이, 15% SDS-PAGE를 통해 확인된 FGF2 폴리펩타이드 밴드들로부터 변이체들의 열적 안정성이 향상되었음을 알 수 있다.
밀도 측정은 imageJ 프로그램(Wanyne Rasband)을 사용하여 SDS-PAGE 젤의 밀도를 측정하였다. 그 결과가 아래 표 2에 기재되어 있다.
| 변이체 | 0일 | 3일 | 6일 | 9일 |
| △9N_hFGF2 | 100 | 84 | 69 | 65 |
| △9N_hFGF2(D28E, S137P) | 100 | 100 | 65 | 17 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P) | 100 | 86 | 102 | 89 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P) | 100 | 98 | 102 | 103 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P) | 100 | 99 | 96 | 94 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P) | 100 | 112 | 92 | 65 |
단위 %표 2의 결과로부터 4개 위치의 변이체들이 야생형 hFGF2 보다 열적 안정성이 향상되었음을 알 수 있다. 특히, △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P)의 경우에 다른 변이체들 대비 열적 안정성이 상대적으로 더 우수함을 알 수 있다.
45℃ 안정성 실험
정제된 FGF2 단백질 들은 1X PBS 버퍼를 기본 사용하여 0.5mg/ml 농도로 45℃에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6일 동안 반응하였으며 코마쉬 블루 염색시약으로 염색하여 15% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 도 4에 그 결과가 예시되어 있다.
도 4에 예시되어 있는 바와 같이, 15% SDS-PAGE를 통해 확인된 FGF2 폴리펩타이드 밴드들로부터 변이체들의 열적 안정성이 향상되었음을 알 수 있다.
밀도 측정은 imageJ 프로그램(Wanyne Rasband)을 사용하여 SDS-PAGE 젤의 밀도를 측정하였다. 그 결과가 아래 표 3에 기재되어 있다.
| 0일 | 1일 | 2일 | 3일 | 4일 | 5일 | 6일 | 7일 | |
| △9N_hFGF2 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| △9N_hFGF2(D28E, S137P) | 100 | 73 | 54 | 37 | 17 | 9 | 3 | 2 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P) | 100 | 93 | 62 | 41 | 38 | 16 | 22 | 15 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78L, C96W, S137P) | 100 | 76 | 20 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P) | 100 | 84 | 72 | 54 | 49 | 38 | 35 | 31 |
| △9N_hFGF2(D28E, C78I, C96W, S137P) | 100 | 58 | 21 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 |
표 3의 결과로부터 모든 변이체들이 야생형 hFGF2 보다 열적 안정성이 향상되었음을 알 수 있다. 특히, △9N-hFGF2(D28E, C78L, C96I, S137P), △9N-hFGF2(D28E, C78I, C96I, S137P)의 경우에 다른 변이체들 대비 열적 안정성이 상대적으로 더 우수함을 알 수 있다.
실험예 3: pQE80 벡터를 이용한 돌연변이체들의 세포증식능 확인
실험예 1과 동일한 방법으로 제조한 돌연변이체들에 대해서 BALB3T3 세포를 사용하였고, 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지에서 배양 및 유지하였다. FGF2에 의한 세포증식활성을 확인하기 위해서 세포는 인슐린(insulin) 10 ug/ml, 덱사메타손(dexamethasone) 1 uM, 트랜스페린(transferrin) 10 ug/ml, 아셀렌산나트륨(sodium selenite) 10 ng/ml, 오브알부민(ovalbumin) 100 ug/ml, 피브로넥틴(fibronectin) 5 ug/ml을 포함하는 F12/DMEM 배지에서 배양하였다.
96 웰 플레이트에 세포수 0.5 x 104 /well 로 배양하였고, 헤파린(heparin) (10 ug/ml) 과 함께 FGF2 (0.3 ng/ml)로 42시간 처리하였다. 세포수 증가는 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]를 사용하여, 전자 매개체(electron mediator)와 세포내 탈수소효소(dehydrogenases)에 의해 형성되는 WST-8 포르마잔(formazan) 생성 정도를 측정함으로써 확인하였다. WST-8 포르마잔 생성 정도는 흡광도 (450 nm)을 통하여 확인할 수 있다. 실험은 3번 반복하였고, '평균 ± 표준편차' 방식으로 표현하였다. FGF2 단백질들은 37℃에서 0, 2, 4, 6일 동안 각각 보관한 후, 세포증식활성 변화를 확인하였다.
그 결과가 도 5에 예시되어 있다. 도 5를 참조하면, hFGF2는 37℃ 보관 후 2일 조건에서 활성 감소가 관찰되었고, 37℃ 보관 4일 이후로는 37℃ 보관 0일 단백질의 60% 수준의 활성만이 관찰되었다. 반면, hFGF2 S137P 변이체는 37℃ 보관 2일 조건에서 hFGF2 보다 더 낮아진 활성이 관찰되었고, 37℃ 보관 4일 조건에서는 37℃ 보관 0일 단백질의 60% 수준의 활성만이 관찰되었다. 반면, hFGF2 D28E+S137P 변이체는 37℃ 보관 날짜가 길어질수록 활성 감소가 나타나기는 하나, hFGF2와 hFGF2 S137P 변이체보다는 활성 감소가 훨씬 적게 나타남을 알 수 있다.
실험예 4: pET17b 벡터를 이용한 돌연변이체들의 세포증식능 확인
실험예 2와 동일한 방법으로 제조한 돌연변이체들에 대해서 BALB3T3 세포를 사용하였고, 10% bovine serum을 포함한 DMEM 배지에서 배양 및 유지하였다. FGF2에 의한 세포증식활성을 확인하기 위해서 세포는 인슐린(insulin) 10 ug/ml, 덱사메타손(dexamethasone) 1 uM, 트랜스페린(transferrin) 10 ug/ml, 아셀렌산나트륨(sodium selenite) 10 ng/ml, 오브알부민(ovalbumin) 100 ug/ml, 피브로넥틴(fibronectin) 5 ug/ml 을 포함하는 F12/DMEM 배지에서 배양하였다.
96 웰 플레이트에 세포수 0.5 x 104 /well 로 배양하였고, 헤파린(heparin) (10 ug/ml) 과 함께 FGF2 (0.3 ng/ml)로 42시간 처리하였다. 세포수 증가는 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]를 사용하여, 전자 매개체(electron mediator)와 세포내 탈수소효소(dehydrogenases)에 의해 형성되는 WST-8 포르마잔(formazan) 생성 정도를 측정함으로써 확인하였다. WST-8 포르마잔 생성 정도는 흡광도 (450 nm)을 통하여 확인할 수 있다. 실험은 3번 반복하였고, '평균 ± 표준편차' 방식으로 표현하였다. FGF2 단백질들은 37℃에서 0, 3, 6, 9, 12일 동안 각각 보관한 후, 세포증식활성 변화를 확인하였다.
그 결과가 도 6에 예시되어 있다. 도 6을 참조하면, △9_hFGF2 (야생형)은 37℃ 보관 3일 조건에서 활성이 감소되어 있었고, 37℃ 보관 6일 이후로는 활성을 거의 잃어버리는 결과를 확인하였다. △9_hFGF2 D28E+S137P 변이체는 야생형 단백질 보다 오래 활성을 가지는 결과를 보였으며, 37℃ 9일 보관 후로는 활성이 감소하는 결과를 나타내었다. 이들과 다르게, △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P 변이단백질과 △9_hFGF2 D28E + C78I + C96I + S137P 변이체는 37℃ 12일 보관 조건까지도 활성에 감소가 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 실시예들에 따른 변이체들이 37℃에서는 단백질의 활성이 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
FGF2 단백질들은 45℃에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일동안 각각 보관한 후, 세포증식활성 변화를 확인하였다. 그 결과가 도 7에 예시되어 있다. 도 7을 참조하면, △9_hFGF2 (야생형)은 45℃ 보관 1일 조건에서부터 활성이 급격히 감소하였음을 확인하였고, 45℃ 보관 2일 조건에서부터 활성을 거의 잃어버리는 결과를 확인하였다. △9_hFGF2 D28E+S137P 변이단백질은 야생형 단백질 보다 오랫동안 활성이 관찰되는 결과를 보였으나, 45℃ 2일 보관 이후로 활성을 떨어지는 결과를 나타내었다. 이들과 다르게, △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P 변이단백질과 △9_hFGF2 D28E + C78I + C96I + S137P 변이단백질의 활성이 45℃에서 보관날짜에 따라 조금씩 감소하기는 하지만, 야생형보다는 오랫동안 활성이 유지되며, 45℃ 6일 보관에서도 여전히 2배 이상의 증식 활성능이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5: pET17b 벡터를 이용한 돌연변이체들의 단백질 분해효소 절단에 대한 저항성 확인
실험예 2와 동일한 방법으로 제조한 △9_hFGF2 (야생형)과 △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P 변이단백질의 단백질 분해효소 절단에 대한 저항성을 측정하였다.
도 8 및 도 9는 각각 △9_hFGF2 (야생형)과 △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P 변이단백질의 SDS-PAGE를 측정한 결과를 나타낸다. 도 8 및 도 9에서 1번은 단백질 분해효소 처리 후 인큐베이션 없이 바로 측정한 경우를, 2번은 단백질 분해효소 처리 후 37 ℃에서 3시간 인큐베이션한 후 측정한 경우를, 3 내지 14번은 FGF2 0.25mg/mL에 대해서 12가지의 서로 다른 종류의 단백질 분해효소를 각각 0.0025mg/mL 처리한 후 37℃ 에서 3시간 인큐베이션한 후에 측정한 결과를 나타낸다.
각 밴드의 밀도 측정은 imageJ 프로그램(Wanyne Rasband)을 사용하여 SDS-PAGE 젤의 밀도를 측정하였다. 그 결과가 아래 표 4에 기재되어 있다.
| 번호 | 단백질 분해효소 | △9_hFGF2 (야생형) | △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P |
| 1 | X | 100 | 100 |
| 2 | X | 85 | 89 |
| 3 | α-Chymotrypsin (α-C) | 33 | 83 |
| 4 | Trypsin (TR) | 21 | 68 |
| 5 | Elastase (EL) | 70 | 82 |
| 6 | Papain (PA) | 84 | 95 |
| 7 | Subtilisin (SU) | 20 | 79 |
| 8 | Endoproteinase Glu-C (EG-C) | 82 | 93 |
| 9 | Proteinase K (P-K) | 35 | 79 |
| 10 | Clostripain (Endoproteinase-Arg-C) (CL) | 46 | 85 |
| 11 | Pepsin (PE) | 90 | 84 |
| 12 | Thermolysin (TH) | 47 | 81 |
| 13 | Bromelain (BR) | 85 | 90 |
| 14 | Actinase (A-E) | 11 | 66 |
도 8 및 도 9의 결과와 표 4의 내용으로부터 △9_hFGF2 (야생형) 보다 △9_hFGF2 D28E + C78L + C96I + S137P 변이단백질이 단백질 분해효소에 대한 저항성이 전반적으로 향상됨을 알 수 있다.
특히, α-Chymotrypsin (α-C), Trypsin (TR), Subtilisin (SU), Proteinase K (P-K), Clostripain (Endoproteinase-Arg-C) (CL), Thermolysin (TH), Actinase (A-E) 에 대한 저항성이 상대적으로 많이 향상되었음을 알 수 있다.
상기에서는 다양한 실시예들에 대하여 설명하였지만, 권리범위는 이에 의해 한정되는 것이 아니다. 구현되는 형태는 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 권리 범위에 속하는 것은 당연하다.
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<220>
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<400> 1
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
20 25 30
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
35 40 45
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu
50 55 60
Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
85 90 95
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115 120 125
Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130 135 140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145 150 155
Claims (8)
- 서열번호 1에서 28번째 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환되거나,
78번째 시스테인(C)이 이소류신(I) 또는 류신(L)으로 치환되거나,
96번째 시스테인(C)이 이소류신(I) 또는 트립토판(W)으로 치환되거나 하는 것 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 치환을 포함하고,
FGF2 활성을 가지는 온도안정성이 향상된(thermally stable) 폴리펩타이드. - 제1 항에 있어서,
137번째 세린(S)이 프롤린(P)으로 더 치환된 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드. - 제2 항에 있어서,
상기 치환은 2개, 3개 또는 4개인 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드. - 제3 항에 있어서,
상기 28번째 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환되고,
상기 78번째 시스테인(C)이 이소류신(I) 또는 류신(L)으로 치환되고,
상기 96번째 시스테인(C)이 이소류신(I)으로 치환되고,
상기 137번째 세린(S)이 프롤린(P)으로 치환된 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드. - 제3 항에 있어서,
상기 28번째 아스파르트산(D)이 글루탐산(E)으로 치환되고,
상기 78번째 시스테인(C)이 이소류신(I)으로 치환되고,
상기 96번째 시스테인(C)이 이소류신(I)으로 치환되고,
상기 137번째 세린(S)이 프롤린(P)으로 치환된 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드. - 제1 항에 있어서,
상기 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 이의 단편과 적어도 85% 이상의 서열 상동성을 가지는 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드. - 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 따른 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드; 및
약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물. - 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 따른 온도안정성이 향상된 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 인간 만능성 줄기 세포 배양 배지.
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