KR102236855B1 - 단축형 섬유아세포 성장인자-5(FGF5s)의 변이체 및 이를 포함하는 탈모방지용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단축형 섬유아세포 성장인자-5의 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 탈모방지용 조성물을 제공할 수 있다. 구체적으로, 정상 FGF5에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 FGF5s 단백질의 일부 아미노산 서열을 변경함으로써 안정성 및 활성이 향상된 FGF5s 변이체를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 FGF5s 변이체 또는 이를 포함하는 조성물을 피부 또는 모발에 도포함으로써, 모발의 성장 주기 중 성장기를 연장시키고 퇴행기로의 전이를 억제하여 탈모를 방지할 수 있다.
Description
본 발명은 단축형 섬유아세포 성장인자-5(Fibroblast Growth Factor5s; FGF5s)의 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 탈모방지용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, FGF5의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 단축형 섬유아세포 성장인자-5 단백질의 일부 아미노산 서열을 변경함으로써 FGF5s 변이체의 안정성 및 활성을 개선시킨 것이다.
현대사회에서, 탈모는 환경 오염물질에의 노출, 과도한 다이어트에 의한 영양 부족, 식생활 변화에 따른 영양 불균형 및 호르몬 분비 이상, 업무 및 사회활동에 따른 스트레스, 불규칙한 생활습관, 무분별한 화학제제의 사용 등의 요인에 의해 증가하고 있다. 특히 20 내지 30대의 여성 환자들도 급증하고 있으며 발병 연령대도 점점 낮아지는 추세로, 현대인들에게 탈모 예방과 치료에 대한 관심이 매우 높아지고 있다.
현재까지의 알려진 탈모에 대한 일반적 가설은 디하이드로테스토스테론 이론(DHT, Dihydrotestosterone Theory), 중력 이론(Gravity Theory), 혈액 공급 이론 등으로 알려져 있으나 아직까지 정확한 탈모나 발모의 원인 및 기작이 알려져 있지 않은 실정이다. 기존에 사용되고 있는 탈모완화 및 발모촉진제로는 프로페시아와 미녹시딜 등이 있는데 치료를 중단하면 원래대로 돌아가고, 오랫동안 사용하면 피부염 등의 부작용이 있다고 보고되었다. 또한 이미 진행된 탈모에 대해서는 정상으로 회복하는데 어려움이 있고, 원하지 않는 부위에서 체모가 자라거나, 발기부전, 성욕 감퇴 등의 성기능 저하와 어지럼증, 두통, 부종 및 피부 발진 등의 부작용이 나타날 수 있음이 보고되었다.
성장하는 모발은 성장 주기가 있으며, 크게 3~5년의 성장기(Anagen phase), 1~2개월의 퇴행기(Catagen phase) 및 3~5개월의 휴지기(Telogen phase)로 구성된다. 성장기는 모발의 성장이 일어나는 시기이고, 퇴행기는 모발의 성장이 느려지는 시기이며, 휴지기는 모발의 성장이 멈춰 있는 시기이다. 성장기에서 퇴행기로 전이가 일어나는 시기에는 성장기에서 발현되는 많은 성장인자들의 감소되며, 퇴행기로의 전이를 촉진하는 신호전달이 활성화되면서 세포자살유도가 이루어지는 것으로 알려져 있다. 헤어주기에서 대표적인 퇴행기 유도인자로서 FGF5, NT-3, NT-4, BDNF, TGF-β 등이 알려져 있다. 이 시기에서 FGF5의 활성화가 일어나게 되면 FGFR-1에 결합하여 다양한 퇴행기 특징이 나타나게 된다. 특히, FGF5를 영구적으로 결손시킨 쥐의 경우 모길이가 늘어나고 'angora-like' 효과가 나타나는 것으로 보고되었다(Higgins et al).
인간 또는 설치류에서 FGF5의 선택적 스플라이싱에 의해 적은 분자량을 가지는 단축형 FGF5가 형성되며 이는 단축형 FGF5 또는 FGF5s로 표현된다. 적은 분자량을 가지는 FGF5s 단백질은 정상적인 FGF5 단백질이 수용체인 FGFR-1에 결합하는 것을 억제하여 모발세포가 퇴행기로 진입하는 것을 늦추거나 억제하는 것으로 알려져 있다(He et al).
Higgins et al.,(2014) FGF-5 is a crucial regulator of hair length in humans. PNAS 111:10648-10653
He et al.,(2016) Fibroblast growth factor 5-short(FGF-5s) inhibits the activity of FGF-5 in primary and secondary hair follicle dermal papilla cells of cashmere goats Gene 575:393-398
다만, 이러한 FGF5s 단백질은 정제, 보관 또는 가공 단계에서 불활성 이량체 형태가 되어 침전될 수 있어, FGF5를 탈모 관련 치료제로 사용하기에는 화학적/생물학적으로 불안정한 문제를 해소할 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 신규한 단축형 섬유아세포 성장인자-5의 변이체 및 이를 이용한 탈모 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 구현예는 서열번호 3의 아미노산 서열 중 93번째에 위치하는 시스테인이 다른 아미노산으로 치환된, 단축형 섬유아세포 성장인자-5(Fibroblast Growth Factor-5s; FGF5s) 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는 상기 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예는, 상기 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예는, 상기 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체는 구조적으로 안정하여 정제 및 가공과정에서 생물학적 활성이 유지될 수 있다. 본 발명에 따른 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 모낭으로 주입시 보다 효과적으로 noggin, IGF-1, Versican의 감소를 막아, 모발세포의 성장기를 연장시키고 퇴행기로의 전이를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 FGF5s는 탈모방지용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 유비퀴틴이 융합된 FGF5s 단백질과 유비퀴틴이 융합된 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(M: 분자량 마커, 1-2 레인: 공벡터로 형질전환된 대장균, 3-4 레인: pET-UB-FGF5s로 형질전환된 대장균, 5-6 레인: pET-UB-FGF5s(C93S)으로 형질전환된 대장균, P: 세포 파쇄 후에 침전물 분획의 단백질, S: 파쇄 후에 상등액 분획에 존재하는 단백질).
도 2는 유비퀴틴이 융합된 FGF5s 단백질과 유비퀴틴이 융합된 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 anti-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다(M: 분자량 마커, 1-2 레인: 공벡터로 형질전환된 대장균, 3-4 레인: pET-UB-FGF5s로 형질전환된 대장균, 5-6 레인: pET-UB-FGF5s(C93S)으로 형질전환된 대장균, P: 세포 파쇄 후에 침전물 분획의 단백질, S: 파쇄 후에 상등액 분획에 존재하는 단백질).
도 3은 FGF5s 단백질을 Ni-친화컬럼크로마토그래피 방법으로 정제한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 4는 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 Ni-친화컬럼크로마토그래피 방법으로 정제한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 FGF5s 단백질과 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 환원 및 비환원 조건에서 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(1 레인: 분자량 마커, 2 레인: 환원된 조건에서 FGF5s 단백질, 3 레인: 환원된 조건에서 FGF5s(C93S) 변이체 단백질, 4 레인: 비환원 조건에서 FGF5s 단백질, 5 레인: 비환원 조건에서 FGF5s(C93S) 변이체 단백질).
도 6은 FGF5 단백질 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 FGF5s 또는 FGF5s(C93S)의 농도에 따라 FGF5 단백질의 세포 증식 효과가 억제되는 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 FGF5, FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 처리에 의해 인간 모유두세포(Dermal papilla cells) 내 모발 관련 유전자들의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 9는 FGF5, FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 처리에 의해 인간 외측모근조세포(outer root sheath cells, ORS) 내 모발 관련 유전자들의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 10은 계면활성제인 SDS(sodium dodecyl sulfate) 존재 하에서 FGF5s(C93S) 활성이 유지되고 있음을 나타낸 것이다.
도 11은 계면활성제인 LES(Disodium laureth sulfosuccinate) 존재 하에서 FGF5s(C93S) 활성이 유지되고 있음을 나타낸 것이다.
도 12는 FGF5s(C93S) 단백질을 함유하는 크림제형의 탈모완화 임상효과를 나타낸 것이다.
도 2는 유비퀴틴이 융합된 FGF5s 단백질과 유비퀴틴이 융합된 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 anti-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 나타낸 것이다(M: 분자량 마커, 1-2 레인: 공벡터로 형질전환된 대장균, 3-4 레인: pET-UB-FGF5s로 형질전환된 대장균, 5-6 레인: pET-UB-FGF5s(C93S)으로 형질전환된 대장균, P: 세포 파쇄 후에 침전물 분획의 단백질, S: 파쇄 후에 상등액 분획에 존재하는 단백질).
도 3은 FGF5s 단백질을 Ni-친화컬럼크로마토그래피 방법으로 정제한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 4는 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 Ni-친화컬럼크로마토그래피 방법으로 정제한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 FGF5s 단백질과 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 환원 및 비환원 조건에서 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(1 레인: 분자량 마커, 2 레인: 환원된 조건에서 FGF5s 단백질, 3 레인: 환원된 조건에서 FGF5s(C93S) 변이체 단백질, 4 레인: 비환원 조건에서 FGF5s 단백질, 5 레인: 비환원 조건에서 FGF5s(C93S) 변이체 단백질).
도 6은 FGF5 단백질 농도에 따른 세포 증식 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 FGF5s 또는 FGF5s(C93S)의 농도에 따라 FGF5 단백질의 세포 증식 효과가 억제되는 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 FGF5, FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 처리에 의해 인간 모유두세포(Dermal papilla cells) 내 모발 관련 유전자들의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 9는 FGF5, FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 처리에 의해 인간 외측모근조세포(outer root sheath cells, ORS) 내 모발 관련 유전자들의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 10은 계면활성제인 SDS(sodium dodecyl sulfate) 존재 하에서 FGF5s(C93S) 활성이 유지되고 있음을 나타낸 것이다.
도 11은 계면활성제인 LES(Disodium laureth sulfosuccinate) 존재 하에서 FGF5s(C93S) 활성이 유지되고 있음을 나타낸 것이다.
도 12는 FGF5s(C93S) 단백질을 함유하는 크림제형의 탈모완화 임상효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 측면으로, 서열번호 3의 아미노산 서열 중 93번째에 위치하는 시스테인(Cys)이 다른 아미노산으로 치환된, 단축형 섬유아세포 성장인자-5(Fibroblast Growth Factor-5s) 변이체를 제공할 수 있다. 이때, 치환 가능한 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 라이신(Lys), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 아이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글라이신(Gly), 프롤린(Pro) 및 발린(Val)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
구체적으로, 상기 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체는 FGF5s 내에 존재하는 유일한 시스테인인 93번째 유리 시스테인 잔기가 세린 또는 글라이신으로 치환된 것일 수 있다.
FGF5s 단백질은 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명은 이 중 93번째 위치의 시스테인 잔기가 세린 또는 글라이신으로 치환된 FGF5s 변이체를 제공할 수 있다. 상기 시스테인은 정상적인 FGF5s 단백질에서는 93번째 위치의 시스테인 잔기에 대응되는 것이다. 구체적으로, 상기 FGF5s 변이체는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 FGF5s 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 FGF5s(C93S)일 수 있다.
또한, 상기 FGF5s 변이체는 FGF5s의 기능을 변형시키지 않는 한 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통해 변형될 수 있으며, 이렇게 변형된 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 7과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다. 통상, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)에 의해 수행될 수 있다.
FGF5는 모발 성장 매커니즘 중 퇴행기를 야기함으로써, 모발 성장의 억제 또는 탈모를 야기시키는 역할을 하는 것으로 알려진 268개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다(서열번호 1). 또한, FGF5에서 선택적 스플라이싱에 의해 123개의 아미노산으로 이루어진 FGF5s 단백질이 발현될 수 있다(서열번호 3). 이때, FGF5s가 FGF5의 수용체인 FGFR-1에 경쟁적으로 결합하여 FGFR-1의 활성화를 방지함으로써, FGF5에 대하여 길항작용을 하는 것이 알려져 있다. 즉, FGF5s 단백질은 FGF5 단백질에 의한 모발의 성장저해 또는 탈모를 억제하거나 지연시키는 효과가 있음에도 불구하고, 정제 과정 중 이량체화되는 등 생물학적 안정성이 좋지 못해 탈모 치료제로 쓰이기에 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 FGF5s의 생물학적 활성을 유지 또는 상승시키면서도 정제, 보관, 가공 및 투여 시 안정성을 담보할 수 있는 방안을 고안하던 중에, 구조적으로 안정한 변이체의 개발에 성공하였다.
본 발명의 다른 측면은, 전술한 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공할 수 있고, 예를 들어, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩할 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기 서열을 가질 수 있다. 또한, 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩할 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 8의 염기 서열을 가질 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 신호 서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "신호 서열"은 생물학적 활성 분자 약물 또는 융합 단백질의 분비를 지시하는 단편을 의미하며, 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 본 발명의 신호 서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드다. 본 발명에서 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호 서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다. 신호 서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 서열은 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다.
중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호 서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시 이후에, 신호 서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호 서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호 서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 분비 신호 서열은 야생형 FGF5s에 포함된 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 FGF5s 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다.
또한, 본 발명의 FGF5s 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터는 유도성 발현 벡터의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현 벡터로부터 융합 단백질의 발현을 유도한다. 발현 벡터는 플라스미드일 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 재조합 융합 단백질을 암호화하고 있는 유전자와 선별 마커에 대한 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드이고, 숙주 세포는 플라스미드를 유지하도록 하는 선별 조건하에서 배양된다.
상기 발현 벡터는 단백질 코딩 서열 이외에 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 전사 종결 인자, 및 번역 개시 및 정지 신호 등의 단백질 발현과 관련된 조절 요소를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 조절되는 유도성 프로모터로서, 예를 들어, T7 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터 및 trc 프로모터로부터 유래한 프로모터일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 용어, "형질주입된", "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
적절한 숙주 세포는, 본 발명의 DNA 서열이 형질주입 또는 형질감염되어, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있으며, 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 숙주 세포는 대장균 세포, 불사의 하이브리도마 세포, NS/0 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 인간 양수 유래 세포(CapT cell) 또는 COS 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 FGF5s 변이체를 발현시키는데 사용된 숙주 균주는 대장균이며, 상기 유전자 및 이들의 사용 방법은 당 업계에 공지되어 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 전술한 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 조성물은 이들의 제조에 통상적으로 적용될 수 있는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
포함될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 경피 투여 제제 및 국소 적용을 위한 피부 외용 제제로 제제화될 수 있다. 구체적으로, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형으로 제제화될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 전술한 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 적절하게 선정하여 배합할 수 있다. 첨가 가능한 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 제형으로 제제화될 수 있으며, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 팩, 앰플, 에어로졸의 제형으로 제조될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 탈모의 예방 또는 개선용의 약학 또는 화장료 조성물일 수 있으며, 본 발명에서 탈모는 원형 탈모증, 유전성 안드로겐 탈모증, 휴지기 탈모증, 외상성 탈모증, 발모벽, 압박성 탈모증, 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 매독성 탈모증, 지루 탈모증, 증후성 탈모증, 반흔성 탈모증 및 선천성 탈모증 중 선택된 적어도 하나일 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 변이체 혹은 조성물과 병용하여 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 유래 FGF5s 단백질을 코딩하는 cDNA 유전자 클로닝
먼저, 인간 유래 FGF5s를 재조합 단백질로 발현시키기 위하여, 인간 유래 상피 세포로부터 총 RNA를 추출하여 이로부터 cDNA를 합성하였다. 인간 유래 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast cell)를 10% 혈청 배지에서 5% 이산화탄소 37℃ 조건하에서 배양하였다(1x106 cell). 이후, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)을 직접 가하였다. RNA 추출물이 가해진 혼합물을 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤, 약 12,000 xg로 10분간 원심분리 하였다. 다음으로, 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고, 12,000 xg로 10분간 다시 원심분리하였다. 이후, 액체를 제거하고, 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 RNA를 건조시켰다.
RNAase가 없는 정제 증류수를 약 50 ul를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다. cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2 ug에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행시켰다. 그후, 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. 이후, 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하고, 이를 자연형 FGF5s 유전자의 중합효소 연쇄반응의 주형으로 사용하였다.
인간 유래 진피 섬유아세포로부터 시그널 펩타이드 서열(서열번호 1에서 1 내지 21번째 잔기의 아미노산)이 제거된 FGF5s의 유전자를 얻기 위하여 아미노 말단 22번째 아미노산인 글라이신을 시작으로 암호화하는 프라이머(T2FGF5s)와 카르복실 말단을 암호화하는 프라이머(XFGF5s)를 합성한 다음, 상기에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 각 프라이머의 서열은 아래 표 1에 기재한 바와 같다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| T2FGF5s | 5'-AAA AAA CCG CGG TGG TGG GGA GAA GCG TCT CGC CCC-3' | 서열번호 10 |
| XFGF5s | 5'-AAA AAA CTC GAG TCA TCT GTG AAC TTG GCT TAA CAT ATT GGC TTC GTG GG-3' | 서열번호 11 |
0.2 pmol 프라이머(T2FGF5s)와 0.2 pmol 프라이머(XFGF5s)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 증폭 반응을 40주기로 수행하였다. 반응 후에 증폭된 약 0.4 kbp의 DNA 절편을 1% 아가로스겔에서 전기 영동하여 분리 한 다음, pGEM-T easy(Promega, USA) 벡터에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하였다. 이렇게 얻어진 DNA들을 염기서열 분석한 결과, 인간 유래 FGF5s 단백질을 암호화하는 cDNA를 수득하였음을 확인하였다. 수득된 FGF5s 유전자를 pTA-FGF5s 라고 명명하였으며 이의 염기서열은 서열번호 4의 염기 서열과 갖다.
실시예 2. 자연형 FGF5s 단백질 발현 벡터 제조
유비퀴틴이 융합된 형태의 FGF5s 단백질을 제조하기 위하여 유비퀴틴이 융합된 형태의 FGF5s를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였다. 유비퀴틴 유전자를 얻기 위하여 프라이머(NdeUB)와 프라이머(T2UB)를 제조하였다. 각 프라이머의 서열은 아래 표 2에 기재한 바와 같다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| NdeUB | 5'-GGA TTC CAT ATG CAA CTT TTC GTC AAA ACT CTA AC-3' | 서열번호 12 |
| T2UB | 5'-ATG ACC ACC GCG GAG TCT CAA CAC CAA-3' | 서열번호 13 |
0.2 pmol 프라이머(NdeUB)와 0.2 pmol 프라이머(T2UB)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 증폭 반응을 25주기로 수행하여 유전자 유비퀴틴(UB)를 수득하였다. 증폭된 유비퀴틴 유전자를 제한효소 NdeI과 SacII로 절단하고, 플라스미드 pTA-FGF5s를 제한효소 SacII와 XhoI으로 절단하여 2% 아가로스겔 전기영동하여 각각 210 bp 와 380 bp의 DNA 단편을 얻은 후에 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단된 pET15b 벡터에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하여 플라스미드 pET-UB-FGF5s를 얻었다. 이렇게 얻어진 단일 콜로니를 LB 액상 배지에서 37℃ 진탕배양기에서 배양하여 세포밀도가 OD600에서 약 0.2 흡광도에 도달하는 시점에 최종 0.5 mM 농도가 되게 이소프로필씨오갈락토사이드(Isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가한 후 약 4시간 더 진탕 배양을 실시하였다.
실시예 3. 변이체인 FGF5s(C93S) 발현 벡터의 제조
FGF5s 코딩영역 중 93번째 시스테인을 세린으로 치환하기 위하여 프라이머(FGF5sC93S-S)와 프라이머(FGF5sC93S-AS)를 합성하였다. 각 프라이머의 서열은 아래 표 3에 기재한 바와 같다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| FGF5sC93S-S | 5'-GCC TCT ACT CCA GAG TGG GCA TCG GTT TC-3' | 서열번호 14 |
| FGF5sC93S-AS | 5'-CCG ATG CCC ACT CTG GAG TAG AGG CTG CCG GTC C-3' | 서열번호 15 |
상기 실시예에서 얻은 플라스미드 pET-UB-FGF5s를 주형으로 하여 0.2pmol 프라이머(T2FGF5s)와 0.2 pmol 프라이머(FGF5sC93S-AS)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 증폭 반응을 25주기로 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 N-DFGF5sC93S라 하였다(서열번호 6). 상기 실시예에서 얻은 플라스미드 pET-UB-FGF5s를 주형으로 하여 0.2 pmol 프라이머(FGF5sC93S-S)와 0.2 pmol 프라이머(XFGF5s)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 증폭 반응을 25주기로 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 C-DFGF5sC93S라 하였다.
DNA 단편 N-DFGF5sC93S과 DNA 단편 C-DFGF5sC93S를 주형으로 하여 0.2 pmol 프라이머(T2FGF5s)와 0.2 pmol 프라이머(XFGF5s)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 증폭 반응을 25주기로 수행하였다. 반응 후에 증폭된 약 380 bp의 DNA 절편을 제한효소 SacII와 XhoI으로 절단한 후 1% 아가로스겔에서 전기 영동하여 분리 한 다음, 실시예 2에서 얻은 제한효소 NdeI과 SacII로 절단된 유비퀴틴 유전자와 함께 제한효소 NdeI 과 XhoI으로 절단된 pET15b 벡터에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하여 플라스미드 pET-UB-FGF5s(C93S)을 얻었다(서열번호 9).
플라스미드 pET-UB-FGF5s(C93S)을 사용하여 대장균 BL21(DE3)pLys.S 균주를 형질전환시키고, 항생제 앰피실린이 첨가된 Luria-Bertani(LB) 고체배지에서 얻어진 콜로니들을 LB 액상 배지에서 37℃ 진탕배양기에서 배양하여 세포밀도가 OD600에서 약 0.2 흡광도에 도달하는 시점에 최종 0.5 mM 농도가 되게 IPTG를 첨가한 후 약 4시간 더 진탕 배양을 실시하였다.
실시예 2와 실시예 3의 대장균 세포의 일부를 원심 분리하여 수득한 다음, 세포를 파쇄한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 약 20 kDa크기의 유비퀴틴이 융합된 형태의 FGF5s 단백질 및 유비퀴틴이 융합된 형태의 FGF5s(C93S) 단백질이 발현되었음을 확인하였다. 동시에 이 단백질 전기영동 젤을 His에 대한 모노클로날 항체(anti-His)를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 전기영동에서 확인한 FGF5s 단백질 및 FGF5s(C93S) 단백질의 발현 여부를 재확인하였다.
실시예 4. 대장균 유래 FGF5s 및 FGF5s(C93S) 변이체 단백질 분리 및 정제
실시예 4.1. FGF5s 단백질의 분리 및 정제
유비퀴틴(UB)이 융합된 형태의 FGF5s를 발현하는 대장균 BL21(DE3) 생산 균주를 LB 액상 배지에서 접종하고 37℃에서 진탕배양기에서 배양하였다. 흡광도가 OD600에서 0.4에 도달할 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 추가 진탕배양하여 UB-FGF5s 융합단백질을 발현시켰다. 배양 종료 후 원심분리를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 PBS를 이용하여 1회 세척한 다음, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 용액을 이용하여 세포를 현탁시켰다. 현탁된 세포는 소니케이터를 이용하여 세포파쇄과정을 수행하였다. 파쇄된 세포액은 고속 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상등액을 분리하고 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 50 mM Tris, 100mM EDTA, pH 8.0 용액을 이용하여 현탁한 후 원심분리하여 생성된 봉입체를 세척 및 회수하였다. 세척과정을 총 3회 실시한 후 최종적으로 봉입체를 회수하였다.
회수된 봉입체는 50 mM Tris, 6 M Guanidine-HCl, pH 9.0으로 현탁한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 50 mM Tris, 8 M UREA, pH 9.0 용액을 이용하여 5배 희석하고 사전 패킹된 니켈 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. UB-FGF5s가 포함된 용액을 로딩 후에 50 mM Tris, 8 M UREA, 500 mM NaCl, pH 9.0 용액으로 결합하지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척하고, 50 mM Tris, 8 M UREA, 500 mM NaCl, 500 Imidazole, pH 9.0 용액을 이용하여 Imidazole 농도 구배를 이용하여 UB-FGF5s 단백질을 용출하였다.
첫번째 니켈 크로마토그래피에서 UB-FGF5s가 포함된 용출용액은 투석여과막을 이용하여 버퍼교환을 수행하였으며, 버퍼 교환에는 50 mM Tris, pH 9.0 용액을 이용하였다. UB-FGF5s 단백질의 N-말단에 결합되어 있는 유비퀴틴을 제거하기 위하여 버퍼교환이 끝난 단백질 용액을 20℃에서 효소 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 1(UBP-1)을 첨가하여 12시간 반응시킨 다음 유비퀴틴을 제거하였다.
유비퀴틴이 절단된 FGF5s 혼합 용액을 CM 이온교환수지가 사전 패킹된 컬럼에 로딩하여 2차 정제를 수행하였다. 혼합 용액을 컬럼에 로딩 후에 50 mM Tris, pH 9.0 용액을 이용하여 결합되지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척용액을 흘려주었으며, 50 mM Tris, 1M NaCl, pH 9.0 용액을 이용하여 NaCl 농도구배로 FGF5s 단백질을 정제하였다. 용출된 단백질은 단백정량 및 SDS-PAGE를 이용하여 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 유비퀴틴이 제거된 고순도의 FGF5s 단백질이 수득된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4.2. FGF5s(C93S) 변이체 단백질의 분리 및 정제
유비퀴틴(UB)이 융합된 형태의 FGF5s(C93S)를 발현하는 대장균 BL21(DE3) 생산 균주를 LB 액상 배지에서 접종하고 37℃에서 진탕배양기에서 배양하였다. 흡광도가 OD600에서 0.4에 도달할 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 추가 진탕배양하여 UB-FGF5s(C93S) 융합단백질을 발현시켰다. 배양 종료 후 원심분리를 이용하여 세포를 회수하고, 회수된 세포는 PBS를 이용하여 1회 세척한 다음, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 용액을 이용하여 세포를 현탁시켰다. 현탁된 세포는 소니케이터를 이용하여 세포 파쇄 과정을 수행하였다. 파쇄된 세포액은 고속 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상등액을 분리하고 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 50 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 8.0 용액을 이용하여 현탁한 후 원심분리하여 생성된 봉입체(Inclusion body)를 세척 및 회수하였다. 세척과정을 총 3회 실시한 후 최종적으로 봉입체를 회수하였다.
회수된 봉입체는 50 mM Tris, 6M Guanidine-HCl, pH 9.0으로 녹인 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 50 mM Tris, 8M UREA, pH 9.0 용액을 이용하여 5배 희석하고 사전 패킹된 니켈 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. UB-FGF5s(C93S)가 포함된 용액을 로딩 후에 50 mM Tris, 8M UREA, 500 mM NaCl, pH 9.0 용액으로 결합하지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척하고, 50 mM Tris, 8M UREA, 500 mM NaCl, 500 Imidazole, pH 9.0 용액을 이용하여 Imidazole 농도구배를 이용하여 UB-FGF5s(C93S) 단백질을 용출하였다.
첫번째 니켈 크로마토그래피에서 UB-FGF5s(C93S)가 포함된 용출용액은 투석여과막을 이용하여 버퍼교환을 수행하였으며, 버퍼교환에는 50 mM Tris, pH 9.0 용액을 이용하였다.
UB-FGF5s(C93S) 단백질의 N-말단에 결합되어 있는 유비퀴틴을 제거하기 위하여 버퍼교환이 끝난 단백질 용액을 20℃에서 효소 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 1(UBP-1)을 첨가하여 12시간 반응시킨 다음 유비퀴틴을 제거하였다.
유비퀴틴이 절단된 FGF5s(C93S) 혼합 용액을 CM 이온교환수지가 사전 패킹된 컬럼에 로딩하여 2차 정제를 수행하였다. 혼합 용액을 컬럼에 로딩 후에 50 mM Tris, pH 9.0 용액을 이용하여 결합되지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척용액을 흘려주었으며, 50 mM Tris, 1M NaCl, pH 9.0 용액을 이용하여 NaCl 농도구배로 FGF5s(C93S) 단백질을 정제하였다. 용출된 단백질은 단백정량 및 SDS-PAGE를 이용하여 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 고순도의 유비퀴틴이 제거된 FGF5s(C93S) 단백질이 수득된 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4.3. 환원 및
비환원
조건 하에서
정제된 자연형
FGF5s와
FGF5s(C93S) 변이체 단백질
상기 실시예 4.1. 및 실시예 4.2.에서 최종 정제된 FGF5s와 FGF5s(C93S) 변이체 단백질을 각각 1XPBS 완충용액에 밤새 투석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 투석한 단백질 용액을 환원과 비환원 조건 하에서 각 SDS-PAGE 전기영동을 한 결과 FGF5s의 경우 비환원 조건에서 거의 대부분의 단백질들이 이량체를 형성하는 것을 확인 할 수 있었으며, 대조적으로 본 발명에 따른 FGF5s(C93S) 변이체의 경우는 비환원 조건 하에서도 단량체로 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. FGF5s 및 FGF5s(C93S) 단백질의 활성 측정
실시예 5.1. FGF5 단백질에 의한 세포 증식 활성 측정
FGF5에 의한 세포 증식 효과를 측정하기 위하여 마우스 섬유아세포(Balb/c3T3 cell)의 세포 증식에 대해 정제된 FGF5 단백질을 농도 별로 처리하여 세포의 성장률을 측정하였다. 먼저 하루 전날 마우스 섬유아세포를 10%의 우아혈청(bovine calf serum)이 포함된 배지에서 96웰 플레이트에 약 103 cell/well로 넣고 24시간 배양하였다. 이후, 0.5% 우아혈청과 5 ug/ml의 헤파린을 포함한 배지로 치환한 후에 FGF5 단백질을 농도 별로 각 well에 넣어서 72시간 동안 더 배양하였다. 세포 증식의 정도는 MTT assay 방법을 이용하여 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. FGF5의 농도에 따라 마우스 섬유아세포의 증식이 비례적으로 일어남을 알 수 있었으며 약 20 ng/ml의 농도에서 최대 증식을 유도할 수 있었음을 확인하였다.
실시예
5.2.
FGF5s
및
FGF5s(C93S)의
FGF5에
의해 유도되는 세포증식
억제능
비교
상기 실시예 4에서 제조된 FGF5s와 FGF5s(C93S) 단백질들이 마우스 섬유아세포에서 FGF5가 유도하는 세포 증식을 억제하는지 알아보기 위해서 다음과 실험을 실시하였다. 하루 전날 마우스 섬유아세포를 10%의 우아혈청(bovine calf serum)이 포함된 배지에서 96웰 플레이트에 약 103cell/well로 넣고 24시간 배양하였다. 이후 0.5% 우아혈청, 5 ug/ml의 헤파린, 그리고 20 ng/ml의 FGF5 단백질이 포함된 배지로 치환한 후에 FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 단백질을 농도 별로 각 well에 넣어서 72시간 동안 더 배양하였다. 세포 증식의 정도를 MTT assay 방법을 이용하여 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. FGF5s(C93S)를 처리한 경우가 FGF5s에 비하여 같은 농도에서 FGF5에 의한 세포 증식을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다.
실시예
5.3. 인간 피부 유두종(human dermal papilla) 세포에서
FGF5
및 FGF5s 단백질 처리에 따른 유전자 발현 비교
모낭에 존재하는 인간 피부 유두종 세포에서 상기 실시예 1에서 얻어진 FGF5의 단독 처리와 또는 FGF5s 및 FGF5s(C93S) 단백질의 동시 처리에 따른 유전자의 발현 변화 여부를 알아보기 위하여 다음과 같이 세포기반 분석 실험을 진행하였다.
먼저 인간 피부 유두종 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 인간 피부 유두종 세포 약 5x105 세포를 6-웰 플레이트에 배양을 하여 24시간 후에 다음과 같은 조건으로 단백질을 처리하였다:
1) 단백질을 처리하지 않은 대조군
2) 20 ng/ml의 FGF5를 처리하여 24시간 동안 배양한 군
3) 20 ng/ml FGF5와 1 ug/ml FGF5s를 동시 처리하여 24시간 동안 배양한 군
4) 20 ng/ml FGF5와 1 ug/ml FGF5s(C93S)를 동시 처리하여 24시간 동안 배양한 군.
단백질 처리 후 약 24시간을 더 배양한 후, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충용액을 첨가하여 2회 세척하고 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo 34-22Fisher Scientific)액을 직접 가하였다. 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤 12,000 xg로 10분간 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고 12,000 xg로 10분간 원심분리한 뒤 액체를 제거한 후 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에 서 건조시켰다. RNAase가 없는 정제 증류수 50 ul를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다. cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2 ug에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행 시킨 후 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. 반응 후 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 뒤 RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하여 cDNA를 얻었다. FGF5에 의해 활성화 되는 것으로 알려진 유전자들의 발현 변화 여부를 하기 표 4에 나타난 프라이머들을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Quantitative RT-PCR)을 수행하였다.
이때 보정을 위한 유전자로서 β-액틴 유전자와 18S 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 FGF5는 STAT3 유전자, S6 유전자 및 GAS1유전자를 증가시키는 것을 알 수 있었고, 또한 FGF5에 의해 증가된 유전자 발현은 FGF5s 및 FGF5s(C93S)에 의해 억제되었음을 알 수 있었다. FGF5에 의해 발현된 유전자의 억제 효과는 FGF5s 보다 FGF5s(C93S)가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
5.4. 인간
외측모근조
세포에서
FGF5
및
FGF5s
단백질 처리에 따른 유전자 발현 비교
모낭에 존재하는 인간 외측모근조(outer root sheath cells, ORS)세포에서 상기 실시예 1에서 얻어진 FGF5의 단독 처리와 또는 FGF5s 및 FGF5s(C93S)단백질의 동시 처리에 따른 유전자의 발현 변화 여부를 알아보기 위하여, 상기 실시예 5.3과 동일하게 세포기반 분석 실험을 진행하였다.
표 5에 나타난 프라이머들을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Quantitative RT-PCR) 수행하였다.
이때 보정을 위한 유전자로서 β-액틴 유전자와 18S 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 FGF5는 keratin26 유전자와 PKD1 유전자, PKD2 유전자, stat3유전자를 증가시키는 것을 알 수 있었고, 또한 FGF5에 의해 증가된 유전자 발현은 FGF5s 및 FGF5s(C93S)에 의해 억제되었음을 알 수 있었다. FGF5에 의해 발현된 유전자의 억제 효과는 FGF5s 보다 FGF5s(C93S)가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 계면활성제에 따른 FGF5sC93S 단백질 활성 존재 유무 측정
실시예 6.1. SDS 계면활성제 존재 하에서 FGF5s(C93S) 단백질 활성 측정
샴푸에서 일반적으로 사용하는 계면활성제 존재 하에서 FGF5s(C93S)의 활성이 유지되는지 여부를 확인하고자 하였다.
유비퀴틴(UB)이 융합된 형태의 FGF5s(C93S)를 발현하는 대장균 BL21(DE3) 생산 균주를 각각 LB 액상 배지에 접종하고 37℃에서 진탕배양기에서 배양하였다. 흡광도 OD600에서 0.4에 도달할 때, 0.5 mM의 IPTG를 첨가하여 4시간 동안 추가 진탕배양하여 UB-FGF5s(C93S) 융합단백질을 발현시켰다. 배양 종료 후, 원심분리를 이용하여 세포를 회수하고, 회수된 세포는 PBS를 이용하여 1회 세척한 다음, 50 mM의 Tris, 100 mM의 NaCl 및 pH 8.0 용액을 이용하여 세포를 현탁시켰다. 현탁된 세포는 소니케이터를 이용하여 세포 파쇄 과정을 수행하였다. 파쇄된 세포액은 고속 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상등액을 분리하고 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 50 mM의 Tris, 100 mM의 EDTA 및 pH 8.0 용액을 이용하여 현탁한 후, 원심분리하여 생성된 봉입체(Inclusion body)를 세척 및 회수하였다. 세척과정을 총 3회 실시한 후 최종적으로 봉입체를 회수하였다. 회수된 봉입체는 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 녹인 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 0.22 um 필터링 하여 10%의 우아혈청(bovine calf serum)이 포함된 배지를 이용하여 희석하였다. 희석한 샘플은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 농도를 확인하였다.
농도가 확인된 단백질 샘플의 활성을 알아보기 위해, 하루 전날 마우스 섬유아세포를 10%의 우아혈청(bovine calf serum)이 포함된 배지에서 96웰 플레이트에 약 1X103 세포/웰로 넣고 24시간 배양하였다. 이후, 0.5% 우아혈청, 5 ug/ml의 헤파린, 그리고 20 ng/ml의 FGF5 단백질이 포함된 배지로 치환한 후에 UB-FGF5s(C93S) 단백질을 농도 별로 각 웰에 넣어 72시간 동안 더 배양하였다. 세포 증식의 정도를 MTT assay 방법을 이용하여 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 결과를 통해, FGF5s(C93S)는 농도 의존적으로 계면활성제 SDS 존재 하에서도 FGF5의 활성을 억제하고 있음을 알 수 있었다.
실시예
6.2.
LES
계면활성제 존재하에
FGF5s
및
FGF5sC93S
단백질 세포 증식 활성 측정
상기 실시예 6.1과 같은 실험방법을 통해, 대장균에서 발현된 FGF5s 및 FGF5sC93S 봉입체를 회수하였다. 회수된 봉입체는 2% LES(Disodium laureth sulfosuccinate)로 녹인 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 0.22 um 필터링 하여 10%의 우아혈청이 포함된 배지를 이용하여 희석하였다. 희석한 샘플은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 농도를 확인하였다.
농도가 확인된 단백질 샘플의 활성을 알아보기 위해, 하루 전날 마우스 섬유아세포를 10%의 우아혈청이 포함된 배지에서 96웰 플레이트에 약 103 세포/웰로 넣고 24시간 배양하였다. 이후, 0.5%의 우아혈청, 5 ug/ml의 헤파린, 그리고 20 ng/ml의 FGF5 단백질이 포함된 배지로 치환한 후에 FGF5s 또는 FGF5s(C93S) 단백질을 농도 별로 각 웰에 넣어서 72시간 동안 더 배양하였다. 세포 증식의 정도를 MTT assay 방법을 이용하여 측정하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
상기 결과를 통해, FGF5s(C93S)는 농도 의존적으로 계면활성제 LES 존재 하에서도 FGF5의 활성을 억제하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 제조합 FGF5s 단백질을 포함하는 크림의 탈모완화 효과 확인
실시예
7.1. 재조합
FGF5s
단백질을 포함하는 수용성 미세입자 및 이를 포함하는 크림 제조
2 g의 히알루론산, 4 g의 물 및 2, 000 ug의 정제된 FGF5s 단백질을 배합한 후 혼합용액을 모서리가 뽀족하게 각이 진 다면체 형태의 작은 구멍이 형성된 몰드에 로딩하였다. 그리고, 상기 로딩된 용액을 건조시켜 끝이 뽀족하게 각이 진 미세입자를 다량 제조하였다. 상기 제조된 끝이 각이 진 수용성 미세입자 1 g과 아스코빅애씨드, 판테놀 등과 같은 증량용 부형제 입자 11 g을 올리브오일, 토코페릴 아세테이트를 포함하는 유상 성분 88 g에 가열한 상태에서 혼합하였다. 이후, 상기 혼합믈을 교반기에서 천천히 1시간 이상 충분히 균일하게 혼합하였다. 이후, 상기 혼합물을 30℃까지 냉각시켜, FGF5s 단백질이 포집된(entrapped) 끝이 각이 진 형태의 수용성 미세입자가 유성 성분에 현탁(suspension)된 페이스트 형태의 크림 조성물을 제조하였다.
실시예 7.2. 재조합 FGF5s 단백질을 포함하지 않는 조성물의 제조
상기 7.1의 대조군으로서, FGF5s 단백질, 아스코빅애씨드, 판테놀, 토코페릴 및 아세테이트를 제외한 페이스트 형태의 조성물을 제조하였다. 이때, 상기 제조는 상기 실시예 7.1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 7.3. 제조합 FGF5s 단백질을 포함하는 크림의 탈모완화 효과 확인
상기 실시예 7.1에서 제조한 크림 조성물을 시험시료료 하여 탈모완화 효과에 대한 임상시험을 실시하였으며, 대조시료로는 실시예 7.2에서 제조한 크림 조성물을 사용하였다. 상기 시료는 이중맹검법과 무작위배정을 통하여 피험자에게 배포하였으며, 대조군 20명 및 시험군 20명을 대상으로 24주 동안 탈모완화 임상시험을 실시하였다. 시료는 매일 1회 내용물 0.5 g을 적용 두피 부위에 바른 후, 30초간 두드리면서 문지른 다음, 미온수를 적용 두피 부위에 뿌려주고 마사지 하듯이 부드럽게 문질러 주었다. 이후, 별도의 추가 조치를 하지 않아도 되나, 적용 두피 부위를 세척하고자 할 경우에는 10분 후에 세척하도록 하였다. 탈모완화 임상효과에 대한 결과는 표 6 및 도 12에 나타내었다.
| 구 분 | 0 주차 | 8 주차 | 24 주차 |
| 시험군 | 96.45 ± 18.05 | 103.25 ± 20.22 | 103.05 ± 18.61 |
| 대조군 | 89.40 ± 13.92 | 88.55 ± 10.57 | 89.80 ± 15.61 |
도 12에 나타난 바와 같이, 대조군과 시험군의 시험 전후 모발 수(N/cm2) 및 변화 정도를 측정한 결과, 시험군의 경우 시험 전과 비교하여 24주차에서 통계적으로 유의한 수준(P<0.05)으로 모발수가 증가하는 효과를 확인할 수 있었다.
<110> Paean Biotechnology Inc.
<120> FIBROBLAST GROWTH FACTOR-5S MUTANTS AND COMPOSITION COMPRISING
SAME FOR PREVENTING HAIR LOSS
<130> FPD/201904-0066
<150> KR 10-2018-0117376
<151> 2018-10-02
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5
<400> 1
Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Arg Gly Ser Ser Ser Arg Gln
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln
65 70 75 80
Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly
85 90 95
Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser
100 105 110
His Glu Ala Asn Met Leu Ser Val Leu Glu Ile Phe Ala Val Ser Gln
115 120 125
Gly Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met
130 135 140
Ser Lys Lys Gly Lys Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys
145 150 155 160
Lys Phe Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser
165 170 175
Ala Ile His Arg Thr Glu Lys Thr Gly Arg Glu Trp Tyr Val Ala Leu
180 185 190
Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lys Pro
195 200 205
Gln His Ile Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lys Gln Ser Glu Gln
210 215 220
Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Lys Pro Pro
225 230 235 240
Ser Pro Ile Lys Pro Lys Ile Pro Leu Ser Ala Pro Arg Lys Asn Thr
245 250 255
Asn Ser Val Lys Tyr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Gly
260 265
<210> 2
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5
<400> 2
atgagcttgt ccttcctcct cctcctcttc ttcagccacc tgatcctcag cgcctgggct 60
cacggggaga agcgtctcgc ccccaaaggg caacccggac ccgctgccac tgataggaac 120
cctagaggct ccagcagcag acagagcagc agtagcgcta tgtcttcctc ttctgcctcc 180
tcctcccccg cagcttctct gggcagccaa ggaagtggct tggagcagag cagtttccag 240
tggagcccct cggggcgccg gaccggcagc ctctactgca gagtgggcat cggtttccat 300
ctgcagatct acccggatgg caaagtcaat ggatcccacg aagccaatat gttaagtgtt 360
ttggaaatat ttgctgtgtc tcaggggatt gtaggaatac gaggagtttt cagcaacaaa 420
tttttagcga tgtcaaaaaa aggaaaactc catgcaagtg ccaagttcac agatgactgc 480
aagttcaggg agcgttttca agaaaatagc tataatacct atgcctcagc aatacataga 540
actgaaaaaa cagggcggga gtggtatgtg gccctgaata aaagaggaaa agccaaacga 600
gggtgcagcc cccgggttaa accccagcat atctctaccc attttctgcc aagattcaag 660
cagtcggagc agccagaact ttctttcacg gttactgttc ctgaaaagaa aaagccacct 720
agccctatca agccaaagat tcccctttct gcacctcgga aaaataccaa ctcagtgaaa 780
tacagactca agtttcgctt tggataa 807
<210> 3
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s
<400> 3
Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Arg Gly Ser Ser Ser Arg Gln
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln
65 70 75 80
Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly
85 90 95
Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser
100 105 110
His Glu Ala Asn Met Leu Ser Gln Val His Arg
115 120
<210> 4
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s
<400> 4
atgagcttgt ccttcctcct cctcctcttc ttcagccacc tgatcctcag cgcctgggct 60
cacggggaga agcgtctcgc ccccaaaggg caacccggac ccgctgccac tgataggaac 120
cctagaggct ccagcagcag acagagcagc agtagcgcta tgtcttcctc ttctgcctcc 180
tcctcccccg cagcttctct gggcagccaa ggaagtggct tggagcagag cagtttccag 240
tggagcccct cggggcgccg gaccggcagc ctctactgca gagtgggcat cggtttccat 300
ctgcagatct acccggatgg caaagtcaat ggatcccacg aagccaatat gttaagccaa 360
gttcacagat ga 372
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s(C93S)
<400> 5
Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Arg Gly Ser Ser Ser Arg Gln
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln
65 70 75 80
Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Ser Arg Val Gly
85 90 95
Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser
100 105 110
His Glu Ala Asn Met Leu Ser Gln Val His Arg
115 120
<210> 6
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s(C93S)
<400> 6
atgagcttgt ccttcctcct cctcctcttc ttcagccacc tgatcctcag cgcctgggct 60
cacggggaga agcgtctcgc ccccaaaggg caacccggac ccgctgccac tgataggaac 120
cctagaggct ccagcagcag acagagcagc agtagcgcta tgtcttcctc ttctgcctcc 180
tcctcccccg cagcttctct gggcagccaa ggaagtggct tggagcagag cagtttccag 240
tggagcccct cggggcgccg gaccggcagc ctctactgca gagtgggcat cggtttccat 300
ctgcagatct acccggatgg caaagtcaat ggatcccacg aagccaatat gttaagccaa 360
gttcacagat ga 372
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s(C93G)
<400> 7
Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro
20 25 30
Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Arg Gly Ser Ser Ser Arg Gln
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln
65 70 75 80
Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Gly Arg Val Gly
85 90 95
Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser
100 105 110
His Glu Ala Asn Met Leu Ser Gln Val His Arg
115 120
<210> 8
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5s(C93G)
<400> 8
atgagcttgt ccttcctcct cctcctcttc ttcagccacc tgatcctcag cgcctgggct 60
cacggggaga agcgtctcgc ccccaaaggg caacccggac ccgctgccac tgataggaac 120
cctagaggct ccagcagcag acagagcagc agtagcgcta tgtcttcctc ttctgcctcc 180
tcctcccccg cagcttctct gggcagccaa ggaagtggct tggagcagag cagtttccag 240
tggagcccct cggggcgccg gaccggcagc ctctacggca gagtgggcat cggtttccat 300
ctgcagatct acccggatgg caaagtcaat ggatcccacg aagccaatat gttaagccaa 360
gttcacagat ga 372
<210> 9
<211> 537
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UB-FGF5s(C93S)
<400> 9
atgcaacttt tcgtcaaaac tctaacaggg aagactgtaa ccctagaggt tgaatcttcc 60
gacactattg acaacgtcaa aagtaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 120
cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 180
atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtgg ggagaagcgt 240
ctcgccccca aagggcaacc cggacccgct gccactgata ggaaccctag aggctccagc 300
agcagacaga gcagcagtag cgctatgtct tcctcttctg cctcctcctc ccccgcagct 360
tctctgggca gccaaggaag tggcttggag cagagcagtt tccagtggag cccctcgggg 420
cgccggaccg gcagcctcta ctccagagtg ggcatcggtt tccatctgca gatctacccg 480
gatggcaaag tcaatggatc ccacgaagcc aatatgttaa gccaagttca cagatga 537
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2FGF5s
<400> 10
aaaaaaccgc ggtggtgggg agaagcgtct cgcccc 36
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XFGF5s
<400> 11
aaaaaactcg agtcatctgt gaacttggct taacatattg gcttcgtggg 50
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NdeUB
<400> 12
ggattccata tgcaactttt cgtcaaaact ctaac 35
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2UB
<400> 13
atgaccaccg cggagtctca acaccaa 27
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5sC93S-S
<400> 14
gcctctactc cagagtgggc atcggtttc 29
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF5sC93S-AS
<400> 15
ccgatgccca ctctggagta gaggctgccg gtcc 34
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stat3 Forward primer
<400> 16
gcctctactc cagagtgggc atcggtttc 29
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stat3 Reverse primer
<400> 17
ccgatgccca ctctggagta gaggctgccg gtcc 34
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6 Forward primer
<400> 18
gcctctactc cagagtgggc atcggtttc 29
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6 Reverse primer
<400> 19
ccgatgccca ctctggagta gaggctgccg gtcc 34
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS1 Forward primer
<400> 20
tacctgacct actgcggcaa a 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS1 Reverse primer
<400> 21
ggcatagcca gcatgtcctc 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Keratin26 Forward primer
<400> 22
cactggtcgg ctaactgg 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Keratin26 Reverse primer
<400> 23
cacgcccttc tgatttgt 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PKD1 Forward primer
<400> 24
aattcctaat ggggccaatc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PKD1 Reverse primer
<400> 25
tgaccacatt ttctcccaca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PKD2 Forward primer
<400> 26
gagatgaaat taaagagtgc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PKD2 Reverse primer
<400> 27
gaatttgaag agcttaatcc 20
Claims (12)
- 서열번호 3의 아미노산 서열 중 93번째에 위치하는 시스테인이 세린(Ser)으로 치환된, 단축형 섬유아세포 성장인자-5(Fibroblast Growth Factor-5s; FGF5s) 변이체.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는, 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체. - 제1항에 따른 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드.
- 제4항에 있어서,
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는, 뉴클레오타이드. - 제4항에 따른 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터가 도입된 숙주 세포.
- 제1항에 따른 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 제형인, 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 탈모는 원형 탈모증, 유전성 안드로겐 탈모증, 휴지기 탈모증, 외상성 탈모증, 발모벽, 압박성 탈모증, 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 매독성 탈모증, 지루 탈모증, 증후성 탈모증, 반흔성 탈모증 및 선천성 탈모증 중 선택된 적어도 하나인, 탈모 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 따른 단축형 섬유아세포 성장인자-5 변이체를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선용 화장료 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 조성물은 샴푸, 린스, 트리트먼트, 팩, 앰플, 에어로졸의 모발 외형제 제형인, 탈모 개선용 화장료 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180117376 | 2018-10-02 | ||
| KR20180117376 | 2018-10-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=70292036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020190089269A KR102236855B1 (ko) | 2018-10-02 | 2019-07-24 | 단축형 섬유아세포 성장인자-5(FGF5s)의 변이체 및 이를 포함하는 탈모방지용 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102236855B1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160083383A (ko) * | 2014-12-30 | 2016-07-12 | (주)피앤피바이오팜 | 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도 |
| KR101754272B1 (ko) * | 2015-04-03 | 2017-07-06 | (주)피앤피바이오팜 | 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도 |
-
2019
- 2019-07-24 KR KR1020190089269A patent/KR102236855B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200038167A (ko) | 2020-04-10 |
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