PT96068B - Processo para a producao de proteina biologicamente activa - Google Patents

Description

PROCESSO PARA Α PRODUçsO DE PROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ACTIVA

MEMÓRIA DESCRITIVA

Uffiu

D presente invento diz respeito a um processo para a produção de TSF-β dimérico e hialógicamente activo. novos TBF-jss e composições farmacêuticas contendo-os. TBF-R produzido por este processo pode .ser usado em várias modalidades terapêuticas. 0 referido processo é essencialmente caracterizado por se submeter a forma monoraerica desnaturada tía referida proteína tipo TBF-Ra condições de reenrolamento.

-- Ο presente invento está relacionado com um processo para a preparação de TBF-β (Factor ds Crescimento Transformants tipo β) dimérico, biologicamente activo, com novos TGF-ps e composições farmacêuticas contendo-os, TGF-p produzido de acordo coiii o invento pode ser usado para a promoção e aceleração da cícatrização ds feridas e reparação ds ossos e outros tecidos, no tratamento de cancro, como agente protector da medula óssea, mediador de cardioprotecção, agente anti-inflamatórío ou imuno-supressor ou como regulador do crescimento em culturas de células de mamíferos»

Fundamento do invento

Duas proteínas raoduladoras do crescimento foram originalmente caracterizadas pela sua capacidade para induzir revsrsivelmente a transformação fenotíóica de células de mamífero in vitro e foram portanto designadas Factores de Crescimento Transformantes tipo ® e tipo β (Anzano, M = A„ et al = , (1983) PNAS, 8@, 6264-6268)= Apesar da sua nomenclatura comum TGF-cí e TGF-β mostraram-se proteínas estrutural e funcionalmente distintas cada uma delas autuando através do seu próprio sistema receptor único,, TGF-α que compete com o factor de crescimento epidérmico (EBF) na ligação ao mesmo receptor de superfície celular (Todaro, G.J, et al» (1980) PNAS 77,5258-5262) e que tem homologia de sequências e actividade semelhante ao ESP (Marquardt, H» et al. (1984) Science 223, 1079-1082) ê sintetizado como um precursor transmembranar de 159 aminoácidos ε é processado proteolíticamente num peptídeo de 50 resíduos de aminoácidos (Derynek, R = et al= (1984) Cell 38, 237-297), Como mitogénio potente para células' de mesênquima, TGF-íí è produzido e libertado por numerosas linhas celulares •transformadas e cancros humanos, mas é também exresso em macrófagos activados e noutros tecidos normais, tornando assim pouco claro o seu papel na neoplasia,

TBF-β foi originalmente purificado até ã homogeneidade a partir de plaquetas humanas (Assoin, R=K= st al= (1983) J= Biol= Chem, 258, 7155-7160), placenta humana (Frolík, C = A= et al. (1983) PNAS 30, 3676-3680) e de rim bovino (Roberts, A=B= et al» CÍ983) Biochemistry 22, 5692-5698) e identificado como proteína homodimérica com um peso molecular de 25 0ΘΘ D. Primeiro caracterizado pela sua capacidade para actuar sinergisticaments com EBF ou TGF-α para induzir o crescimento independente de aderência em células NRK não transformadas, recentements mostrou-se que TGF-β tem numerosos efeitos reguladores numa, larga variedade de células τ

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normais e neoplásicas indicando a importância deste proteína como regulador multifuncional da actividade celular» TBF-R pode estimular a mitogénese, proliferação e crescimento celulares, ou pode inibir eficazmente os referidos processos ou pode apresentar outras acções como por exemplo controle da adipogénese» mioqênese, condrioqénese, osteogènese e função das células do sistema imune, estimulação da quimiotaxia ou indução ou inibição da diferenciação dependendo do tipo de célula ou tecido e da presença ou ausência de outros factores de crescimento» Muitas destas scçSss do TI3F--B estão relacionadas com a resposta das células ou tecidos ao «stress» ou danificação e reparo dos danos resultantes» Após inflamação, TBF-β desempenha o principal papel na formação de tecido de granulação, aumenta a expressão de genes associados á formação da matrix extracelular tais como fibronectina, colagénio e vários inibidores de proisasess estimula a contracção da matriz de colagénio pelos fibroblastos, sugerindo um possível papel na contracção do tecido conjuntiva íRaherts, A» s Sporn, K»B = (1988) Adv» Câncer Res» 51, 107-145; Sporn, M»B» e Roberts, A» (1989) J» Amer» Med»Assoe» 262» 938-9415,

Até agora, três tipos distintos de TGF-Ss designados TGF-βί, 7GF-B2 e T8F-B3 que estão funcionalmente muito relacionados e partilham um orau elevado ds rsactividade cruzada entre receptores foram clonados e caracterizados por analise da sequência» Todos os TSF-fls são sintetizados como precursores de 390 a 412 aminoácidos que sofrem clivagem proteolítics para produzir as formas monomêricas» as quais consistem nos 112 aminoácidos C-terminais» Nas suas formas maduras, hiológicasnente aetivas, TSF-fls são homodímeros ligados por pontes dissulfureto, estáveis aos ácidos e ao calor, de duas cadeias polipeptídicas de 112 aminoácidos cada» As sequências de aminoácidos completas do TGF-βί humano (Derynck, R» et al» (19Q5? Nature 316, 701-7055,

murino (Derynck, R, et al» (1986) J = Biol, Chem, 261, 4377-4379) e símio CSharples, K» et al» CÍ987) DMA 6, 239-244) mostram uma notável conservação de sequências» diferindo apenas num único resíduo ds aminoácido, A comparação da sequência de aminoácidos de TGF-βί humano» TGF-R2 humano (de Martin, R= st a», CÍ987) EMBO J„ 6, 3673-3677? Marquardt, H» et al» (1987) J„ Biol» Chem, 262, 12127-12131) e TSF-B3 (Ten Dijke, P, et al= (1988) PNAS85, 4715-4719) demonstrou que as três proteínas apresentam nas suas •formas maduras cerca de 70--80¾ de identidade de sequências» Um TGF-Ri»2 heterodimêrico foi isolado a partir de plaquetas de porco e consiste numa subunidade de TGF-fsí ligada por pontes dissulfureto a uma subunidade de TGF--B2 CCheifetz, S, et al, (1987) Cell 48, 409-415),

Recentemente, foram feitas tentativas com a finalidade de produzir TGF-jls por meio de técnicas recombinan tes em vez de isolamento destes factores a partir de fontes naturais Ce»g= plaquetas) de forma a obter-se quantidades suficientes para testar em várias modalidades terapêuticas» No entanto» provou~se ser extremaments dificil sintetizar TGF—íí reconbinante mantendo ao mesmo tempo a sua actividade biológica» Como se pode ver a partir das sequências descritas na lista de sequências em SEQ ID N2 í, 2 e 3, as formas maduras contendo 112 aminoácidos do TGF-R1, 7GF-B2 e TGF-Í13 contêm? resíduos císteina cada, pelo menos alguns deles estão envolvidos na formação de ligaçSss dissulfureto dentro da mesma cadeia e entre cadeias diferentes o que resulta na estructura terciária complexa das moléculas diméricas biológicamente activas» A expressão hsteróloga de TGF-β pode conduzir a um produto que, apesar de ter a estrutura primária correcta, não se enrola adequadamente para produzir estrutura secundária ou terciária correcta e que portanto não possui actividade biológica» Até à data são desconhecidas as estruccuras secundária e terciária dos T©F-í5s»

TBF-i? nativas, de um modo geral tem-se considerado conveniente expressar os respectivos genes TSF-fl eo células derivadas organismos superiores» A expressão ds TBF-{31 símio e humano sm células de ovário de hamster chinês (CHO) sob o controle do promotor do BV4® está descrito nos Pedidos de Patente Europeia 293=785 e 200=341, respectivamente» T6F-B2 recombinante pôde ser expresso na mesmalinha celular como descrito no Pedido de Patente Europeia 268=561 e na German Offenlegungsschrift 38 33897» fi expressão eucariótica de uma proteína ds fusão de TBf-fl3 ícom TSF-βΙ) está descrita no Pedido tie Patente Europeia 267=463»

Se bem que a expressão de TGF-Rs recombinantes pode ser conseguido em sistemas eucaríóticos» os rendimentos de material correctamente enrolado biològicamente activo obtidos estão ainda longe de serem satisfatórios» Por outro lado, parece improvável que o TGF--R biológicamente activo possa ser obtido quando o respectiva gsns é expresso num hospedeiro microbiano, uma vez que por exemplo nas bactérias as condições intracelulares não conduzem ao reenrolamento, formação de ligações dissulfureto dimerização estabilizada por pontes dissulfureto que é apsrentemente essencial para a actividade» Assim, apenas muito pouco TGF~B2 biològicamente activo foi obtido após expressão do respectivo gene em E. coli sob o controle do promotor de lambda coma descrito no Pedido de Patente Europeia 268=561= Esta ausência de actividade é considerada como senda devida ao facto de a forma dimérica biológicamente activa do TBF-R2 não se formar sspontãneamente a partir da produto de tradução primário monomérico quando exposto a um ambiente redutor dentro das células bacterianas» Uma outra publicação descreve a expressão de cDNA de TBF-R em E» coli sob o controle do promotor trp dando uma banda ds proteína marcada radioactivamente com um peso molecular aparente de 13 000 D nu® auto-radiograma de um gel ds ί

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SDS-poliacrilamida, mas não se (Urushizaki, Y. st al. <1987) Tumor Res, 22, 41-55),

Quando proteínas recombinantes são produzidas sm níveis elevados eni sistemas de expressão bacterianos (tais como E = coli), elas surgem muitas vezes na forma de precipitados intracelulares altamente insolúveis referidos como corpos de inclusão ou corpos refractáveis CBrems, D»N= et al.. (1985) Biochemistry 24, 7662) que podem ser reconhecidos como pontos brilhantes visíveis dentro das células num microscópio ds contraste de fase com ampliações abaixo de ίθΰ® vezes» Estes corpos de inclusão, que podem ser facilmente separados das proteínas bacterianas solúveis, contêm a proteína recombinante numa forma essencialmente desnaturada e reduzida que não apresenta a actividade funcional da sua contraparte natural e que portento não tem utilidade como produto comercial, Assim, de um modo geral concorda-se que a proteína recombinante refractável tem de ser solubilizada em condições que sejam adequadas à manutenção na sua forma desnaturada e subsequentements ser reenrolada de forma a sofrer a transição da forma desenrolada desnaturada para a sstrucíura tridimensional corrrscta funcionalmente activa, a conformação da qual é estabilizada por forças interatómicas relativamente fracastais como ligações de hidrogénio, interseções hidrofóbicas e interacçSes de carqas» No caso das proteínas contendo císteina este processo pode também envolver formação de ligações dissulfureto» Quando a formação das ligações dissulfureto é promovida por via química, deve ser evitada ou pelo menos minimizada a formação incorrscta ds pontes intramoleculares e, no caso de proteínas diméricas ou muitiméricas, pontes intermo!eculares, uma vez que a formação de isómeros incorrectamente enrolados indesejáveis pode dar origem a rneterial não homogénio, complicando assim ulterior purificação de proteína tendo a estrutura pretendida ou pode gerar um proteína

-ή* i com actividade reduzida.

Surgiram várias publicações que descrevem tentativas de regnrolsffisnto para proteínas individuais produzidas em hospedeiros bacterianos ou que de outro modo estão numa forma desnaturada ou não nativa» A formação de um factor estimulador ds colónias humano-1 (CSF-1) dimêrico biologicamente activo após expressão em £=, coli está descrito no Pedido PCT Ne 88/8003 e por Halenbeck_s R, et al = <1989) Biotechnology 7, 710-7Í5, O processo descrito envolve os passos de solubilização inicial dos monómeros de CSF-í isolados a partir de corpos de inclusão em condições redutoras num ambienta caotrópico compreendendo ureia ou hodrocloreto ds guanitíina, reenrolamento que é conseguido por diluição gradual dos agentes caotrópicos e oxidação final das moléculas reenroladas na presença de ar ou de um sistema redox= No Pedido PCT N2 88/8849 está descrito ura processo para a recuperação ds interlsuquins~2 (1L-2) recombinante= caracterizado por 1L-2 isolada a partir ds corpos refractávsis ser desnaturada sm condições redutoras com hidrocloreto de guanidína óM, a IL-2 solúvel ser 2-ϊoxxtíada por uma oxidação controlada na presença de iões Cu’ e a IL-2 oxidada ser reenrolada por redução da concentração do desnsturante na solução, A interleuquina--2 e o interfsrão β ÍIFN-β) foram reenrolados usando SDS para a solubílizsçso s iões Cu' como promotores da oxidação das proteínas totalmente reduzidas (Patente US Np 4,572,798), 0 processo para o isolamento de carpos refractáveis recombinantes como descrito na Patente US IMS 4,620=948 envolve agentes desnaturantes fortes para solubilizar as proteínas₅ condições redutoras para facilitar o enrolamento correcto e substituição do dssnatursnte na presença de ar ou de outros agentes de oxidação para formar novamente as ligações dissulfureto. As proteínas a que o referido processo pode ser aplicado incluem urocinase_? hormona ds crescimento humana» porcina e bovina₅ interferão_? activador do plasminogènio tipo

tecido, proteína ds revestimento de FMD. pro-rsnina e a proteína src. Mo Pedido PCT MQ 86/5809 está descrito um método para rsnatursção de proteínas desenroladas incluindo citocrómio c, ovalbumina e inibidor da tripsina por ligação reversível da proteína desnaturada a uma matrix sólida e sua renaturaçao gradual por diluição do desnaturante. Lima forma monomérics modificada do factor de crescimento derivado de plaquetas humanas (PDSF) expresso em E. coli é S-suIfonatío durante a purificação para proteger as íracçõss tiol e é tíimerizado na presença de agentes de oxidação para dar a proteína activa <Ηορρε₅ J. et al. (1989) Biochemistry 28, 1956).

As referências anteriores são meramente representativas de uma grande quantidade de literatura relacionada com o resnrolamento de proteínas não nativas derivadas de diferentes fontes. Por outro lado os familiarizados com a matéria sabem que o sucesso das experiências de reenrolamento não são previsíveis. Normalmente as experiências mal sucedidas não são relatadas. Não existe a certeza de que qualquer uma das das condições de reenro— laffjento descritas funcione com uma determinada proteína desnaturada como seja o TBF-R. Considerando o facto de que TBF-β é uma proteína dimérica contendo 9 resíduos cístsina por cadeia e uma série de ligações dissulfureto intramoleculares assim como intsrmolsculares, as quais são necessárias para a actividade, é uma tarefa particularmente díficil produzir TSF-β biológicamente activo a partir da sua forma monomérica desnaturada ou não nativa. Não existe na literatura um processo específicodescrito para a preparação de TBF-β dioséríco biológicamente activo a partir da sua forma não nativa.

Ubjsctivo do invento

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar um processo para a produção de proteína do tipo TGF-β dimérioo biologicamente activo a partir da sua forma desnaturada ou outra forma não nativa= Este objectivo foi conseguido por uma descoberta inesperada de que quantidades consideráveis do produto dimérico pretendido podem ser obtidasa quando a forma monoméríca da referida proteína è sujeita a condições de reenrolamento, Surpreendentemente, a produção do dímero activo é conseguida em várias condições num processo de um só passo que è melhor do que os processos de vários passosdescritos em trabalhos anteriores para o reenrolamento de outras proteínas.

Descrição detalhada do inventa

presente invento está relacionado com um processo para a produção de uma proteína tipo Factor ds Crescimento Transformante β CTSF-β) dimèrico biológicamente activa, caracte— rizando-se por se submeter a referida proteína tipo TGF-~íi na forma monomérica desnaturada a condiçSes de reenrolamento» termo proteína tipo TGF-íi destina-se a englobar TGF-iâl, T8F-p2 e T8F-p3 de mamífero como seja de origem humana ou animal, e»g» símia, murina, porcina, equina ou bovina, assim como TSF-Rs heterodiméricos consistindo em duas subunidades diferentes de 112 aminoácidos cada» Estão ainda incluídos dentro da definição as proteínas reguladoras do crescimento da super-família TGF-β tendo uma homologia da sequências de pelo menos cerca ds 25% com TSF-βΙ, TGF-P2 ou TGF-B3, como seja o factor supressor da células T de células ds glioblastoma humano CG-TsFs Wrann, M» et al» (1987) EMBO J» 6, 1633—1630), um inibidor do crescimento isolado a partir de meio condicionado de células de rim de macaco BSC-1 Cpolisrginaj Holley, R»W» et al» <1980) PNAS 77, 5989-59925 Ristow, H»J» <1986) PNAS 83, 5531-5533)um peptídeo indutor de cartilagem isolado a partir de tecido ósseo bovino ÍCIF-Bs Seyedin, S»M. et al» (1987) J. Biol» Chem. 262, 1946-1949), TGF-pA de condrócitos tíe embrião ds galinha CJakoMlsw, S»B» et al» (1988) Molecular Endocrinology 2, 1186-1195) s TSF-fSS de Xenopus-Laevis CKondaiah, P» et al», <1990) u» Biol» Chem» 265,1089-1 @93) , assim como fragmentos e mutantes d-as proteínas atrás referidas mantendo a actividade biológica» Ainda incluído dentro da definição de proteína tipo TSF-β estão duas formas de inibina s três formas de activina (proteínas das yónadas que regulam a secreçãc? pela pituitária de hormona estimuladora de folículos), substância inibidora de Mullerian (MIS, que inibe o desenvolvimento do canal de Mullerian nos embriSes machos de

mamíferos), proteínas morfogénicas dos ossos (BMP, um grupo de polipeptídeos envolvidos na indução da íoramção dos ossos e de cartilagens), o produto da transcrição do complexo de genes dscspentsplégicos de Drosophila (dpp, que actua no contrrole da morfogénese do embrião d mosca), ’vg~í Co produto da transcrição de Xonopus que está presente no polo vegetativo dos oócitos) e Vgr-1₅ um gene de mamífero relacionado ÍMason, A» et al» (1986)

Biochem» Biophys» Res» Commun» 135, 957-964; Cate, R» et ai» (1986) Cell 45» 685-698= Wozney, J» M» et al» (1988) Science 242, 1528-1534; padgett, R» et al», (1986) Nature 325, 81-84; Weeks, D»L» e Melton, D»A» (1987) Cell 51, 861-868; Lyons, K = et al» (1989) PNAS 86, 4554-4558)»

As proteínas tipo TGF--R- preferidas são TGF-Rl humano (Derynck, R= et al» (1985) Nature 316, 701-705)» TGF-R2 humano (Marquardt, H» st al» (1987) J» Biol» Chem» 262, 12127-12131) s TBF-R3 (Ten Dijke, P» et ai» (1988) PNAS 85, 4715-4719) com as sequências de aminoácidos descritas na lista de sequências com SEQ ID N2 1, 2 e 3, respectivamente»

As proteínas tipo TGF-β biolóqicamsnte activas foram ariqinslmente definidas como sendo capazes de induzir crescimento independente de aderência de linhas celulares não transformadas (Tucker, R»F- st al» (1983) Câncer Research 43, 1581-1586) ou ds inibir o crescimento de células alvo neoplásicas (Roberts, A» B» et al», (1985) PNAS 82, 119-123)= Actividade biológica tal como aqui é empregue é definida como

a) a actividade promotora da migração celular em fibroblastos 3T3 de Balb/c, a qual pode ser medida por contagem do número de células qus migram para uma cultura em monocamada ferida das referidas células, na presença ds meio sem soro contendo a proteína tipo TBF-β, comparado com o número de

células que migram na ausência de proteína tipo Ηό~·~β ou

b) a actividade prometera do crescimento em fibroblastos normais 3T3 de Balb/c determinado pelo efeito estimulador da proteína tipo TSF-R- na síntese de DNft celular e divisão celular,

c) a inibição do crescimento de células de melanoma A375 determinado por um ensaio colorimétrico que reflete o número de células trartadas com proteína tipo T-SF-β durante um determinado período de cultura comparado com o número de células não tratadas,

d) a cicatrizaçãoacelerada de feridas superficiais de queimaduras por um processo re-epitilialização, em murganhos velhos após várias aplicações tópicas da proteína tipo TGF-β comparado com feridas testemunhas não tratadas,

e) a cicatrização acelerada de feridas profundas feitas por incisão, conforme determinado por medições de resistência à tracção e análises histológicas de biópsias,, sm ratos adultos após uma aplicação tópica da proteína tipo TBF-B comparado com feridas testemunhas não tratadas ou

f) o aumento na formação ds tecido de granulação fibroso, junfcamsnte com um aumento marcado da vascularização da referido tecido, ambos dentro e à volta dos implantes de feridas porosas em ratos adultos após múltiplas injecções locais da proteína tipo TBF-f5 na câmara comparado com câmaras testemunha não tratadas»

A forma monomérica da proteína tipo TBF-B pode ser produzida por meio ds tecnologia ds DNA recombinante ou por

-Í4-

métodos de síntese bem conhecidos» A forma dimérics é a molécula madura biológicamente activa consistindo em cadeias polipsptidicas liqadas por ligações dissulfureto» monómero s sujeito a condições ds reenrolamento que 4 permitem a recuperação do dímero biologicamente activo,. Este processo nao envolve qualquer alteração na estrutura primária <i»e» sequência de aminoácidos) do monómero, mas está relacionado com a formação da conformaçãp tridimensional do produto dimérico que está associado à actividade biológica» Este processo inclui a formação de ligações dissulfureto e a associação de monómeros nas estruturas dimericas»

Antes de se submeter às condições de reenrolamenío, a proteína monomérica tipo TGF~tl tem de estar presente numa forma desnaturada (i=e= desenrolada) » As proteínas podem ser eficazmen--te desnaturados pelos chamados agentes caotrópicos, bem conhecidos na árss,os quais em solução aquosa e em concentrações adequadas alteram a configuração espacial da respectiva proteína através ds alterações da sua superfície, quer por alteração do estado de hidratação quer através da alteração do estado ds hidratação, ambiente do solvente ou interseção solvente-superfície» Exemplos de tais agentes caotrópicos ou desnaturastes incluem ureia, hidrocloreto de guanidina, tioeisnato de sódio sm concentrações na gama entre cerca de 4 e cerca de 9 ii e detergentes tais como SDS, o quais são fornecidos em concentrações na ordem de Θ,βί a 2 por cento» Também, a scidificação da solução aquosa contendo a proteína tipo TGF-fl para um pH de aproximadamente 2 a 4 assim como condições básicas de e»g = pHÍO e acima e temperaturas elevadas resultará na desnaturação do monómero»

Lí termo condições de reen rol emento* refere-se

condições tamponantes em que o monósiero desnaturado pode assumir a conformação associada à actividade biológica» Os sistemas tampão convencionais tais como tampões Tris, fosfato ou citrato podem ser usados a um pH de aproximadamente ó a 10» Nas condições de reenrolamento è promovida a formação de ligações dissulfureto intra e inter cadeias» Tais condições incluem a presença de um agente de solubilização e um sistema redox que permite a oxidação a redução contínua dos pares tiol/dissufureto» 0 sistema tampão pode adicionalments conter sais adequados»

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Us agentes de solubxlxzação adequados são detergentes, de prsferSncia detergentes suaves, solventes orgânicos, misciveis em água ou fosfolipidos ou uma mistura de dois ou mais desses agen tes =

Qs detergentes são compostos tensio-activos, tais como SDS, Tricon ou Tween, usados numa concentração que permite o reenrolamento da proteína tipo TSF-β» São preferidos os detergentes suaves que permitem o enrolamento da proteína tipo TGF-β monomérica na conformação espacial que após dimerização está associada com a actividade biológica, se bem que mantendo o referido monómero numa forma solúvel» Os detergentes suaves» os j quais soluhilizsm proteínas tipo TSF-R sem os inactivar podes?! ser não-iónicos íe»g» digitonina), catiónicos <e»g» N-~l2,3--CDioleiloxi )-propil j--N3N,N-trimetilamónio: Duzgunss, N» et al» (1989) Biochemistry 28, 9179-9184) ou aniónico Ce»g» colato de sódio, desoxicolato de sódio) ou zuiteriónicos Ce,g» sulfobetaínas (Zwittergent), 3-C3-clolamidopropilIdimetilamónio-í-propano-sulfonato CChaps), 3-C3-clolamidopropil}dimetilamónio~2-hidroxi-l-propsnossuífonato CChapso))» Eles estão presentes no tampão de reenrolamento uma concentração entre cerca de ί ε IO© mM, sspscialments na gama de 3© a ó© mM» Os detergentes preferidos são os d e tergentes su i tsri 6ni cos

3-í3~clolamidopropi 1) dimetilamónio-í-propanossul f onato & 3-(3-clolamidopropil )dimetilamónio-S-hidroxi-l-propanossuifonato, O mais preferido é 3-í3~clolamidapropil >di~ meti 1amónio-1-propanossu1fonato»

Solventes orgânicos mísciveis era âgua podem substituir o detergente no tampão tíe reenrolamento, Tais solventes são, por exemplo, acetonitrilo, alcanóis inferiores, especial (isente alcanóis C^-C,, tais como etanol ou isopropanol ou alcanodióis infsΛ-. *t riores, especialmente alcanodióis C^-C_a tais como etilenoglicol, 7 numa gama de concentrações de 1© a 5© por cento por volume,

Coííio alternativa, os fosfolipidos podem substituir o detergente ou o solvente orgânico mísoivel em água no tampão de reenrolamento» Tais: fosfolipidos são por exemplofosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, íosfatidilserina s íosíatidilinositol numa gama de concentrações de ©,í a 5 mg/ml assim como derivados sintéticos ds fosfolipidos ou suas variantes tais como di-hexanoilfosfatidilcolina ou di—heptanoilfosfatidilcolina na mesma gama de concentrações»

Os sitemas rsdox adequados que encorajam a formaçao de dissulfuretos são e„g, combinações de reagentes sulfidrilo/dissulfito de baixo peso molecular tais como glutationa na sua forma oxidada ou reduzida, ditiotreitol na sua forma oxidada ou reduzida, ií-mercaptoetanol ou [5—mercaptoetanol na sua forma oxidada ou reduzida, cistina e a sua forma reduzida ε cistamina e a sua forma reduzida numa concentração entre cerca tíe 1 e cerca de 1©© mM, especilamente entre lei© mM, em que a proporção molar da forma reduzida s oxidada ê entre t©©st e Isl©©, especialmente entre 6§1 e ísó.

□ sistema rsdox preferido sulfidrilo/dissulfito é a —17—

glutationa na sua forma oxidada o reduzida»

Como alternativa, pode ser usado tio-redoxina ou. dissulfito-isoroerase numa gama de concentrações entre cerca de 1© a Í0®0 μα/ml, especialmente entre cerca de 5® e 2®® pg/ml em vez das combinações de reagentes sulfidrilo/dissulfito de baixo peso molecular»

Sais que podem ser usados no tampão de reenrolamento incluem sais de Na', Li', K‘, NN^’, Ca^-’ ou Mn* ‘ com Cl ,

2- i_ o·./* t , !- Br 5 d 5 Hcu_. , 8LL , fosfato acetato, cianato ou rodarsida ou outros compostos de metais alcalinos, metais alclinos terrosos, halogénios ou psaudo-halogénios numa concentração até 3M» é preferido NaCl numa concentração de 1 a 2 M»

Q invento está particularmente relacionado com um processo para a produção ds uma proteína tipo Factor de Crescimento Transforraante β dimérico biologicamente activo, caracterizsndo-se por submeter a forma monomérica desnaturada da referida proteína tipo TGF-β monomérica desnaturada a condiçSes tamponantes compreendendo um sistema redox sulfidrilo/dissulfito de baixo peso molecular na presença de um agente de solubilização a um pH entre cerca de 6 e 1® e a uma temperatura entre cerca de ®*C e cerca ds 37-C» Prefsrencialmente, o pH é de cerca de 8,® e a temperatura é de creca de 4°C=

Numa realização preferida o sistema redox sulfidrilo/dissulf ito é glutationa na sua forma oxidada e reduzida numa concentração de aproximadamente ia 1® mM» em que a proporção molar da forma oxidada e reduzida ê deíslais2eo detergente fraco é 3-C 3-c1olamidopropi1)dimeti1amónio-1-propanossu1τonato numa concentração entre cerca de 3® mM e cerca de 6® mM»

Particularmente, a produção ds uma protsina tipo TGF-β dimérica biológicamente activa é realizada num só passo, em que o ísonóisero da referida proteína è- dissolvido no tampão de reenrolamento e a mistura de reacção è incubada durante 2 a 400 horas a 4°C enquanto decorrem continuamente o reenrolamento e a dimericação» A concentração de protsina durante a reacção de reenrolamento é de crucial importância uma vez que quando é muito elevada os monómeros sofrem uma agragação substancial conduzindo à formação de oligómeros de ordem superior indesejáveis, Ds rendimentos finais do produto dimérico são aumentados se a concentração tíe proteína ί^ΛΓ inferior a cerca de 2 mg/ml, sendo preferida uma gama de concentrações de ©,ΘΙ a 0,5 mg/ml»

Facultativamente, para promover mais a formação ds dissulfuretos deve—-ss adicionar ao tampão de reenrolamento uma quantidade eficaz de um agente promotor de oxidação contenda iões

4- . , . , _ C‘4Cu Ctais como complexos CuCl_, CuCNO^)^, ou o-f enantrol ina/CtC ’ ) Ã4- __ ou xóes Fe“ Ctais como FeCI^ ou Fe^CbU^)-») = Uma quantidade eficaz é a quantidade que será no mínimo necessária para conduzir a oxidação dos grupos sulfidrílo dentro ds um período ds tempo adequado e que seja a proxinied emente equivalente à concentração dos grupos sulfidrilo livres na proteína tipo TGF-β que se destinam a ser envolvidos na formação das ligações dissulfureto pretendidas. As quantidades preferidas variam entre 0,01 e 10ô μη»

Ainda, 0.-» ou ar podem ser facultativamente borbulhados através do tampão de reenrolamento na presença ou na ausância de agentes promotores da oxidação, A oxidação pode também ser efectuada usando I.-, íKamber, B, et aí=, 188®, Helv» 63, 888-815) ou derivados de Benzochinon (Kamber, B. pedido PCT WO 88/01484/,

A sul fonação de proteínas pode ser usada para clivar

ligações dissulfursto e para bloquear os grupos tiol resultantes» Proteínas monomêricas tipo TGF~b podem facultativamente ser

5-sulfanadas e assim etaitado que fiquem oxidadas antes de serem expostas às condições ds reenrolamento» A S-suIfonação è realizada usando sulfito ds sódio na presença ds um agente redutor tal como cíteina, resultando na protecção reversível de resíduos tiol como S-sulfonatos» Em condições de reenrolamento, os grupos protectores são refísovidos pelo de excesso do sistema sulfidrilo/tiissulfito e a dimerização ocorre espontaneamente»

O invento estâ ainda realcionado com um processo psra a produção de uma proteína tipo TBF-β dimérica biologicamente activa, em que a forma monomérica da referida proteína tipo TBF-R é produzida pelos passos des

Ca) cultura de de um hospedeiro microbiano compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora da proteína tipo TBF-R ligada na qrelha de leitura correcta a uma sequência de controle da expressão de modo a que a proteína seja expressa e <h> recuperação da proteína tipo T6F-R numa forma monomérica, desnaturada e solúvel»

Hospedeiros microbianos adequados são estirpes de levedura tais como SaccbarofHycgs cerevisiae ou bactérias tais

Escherichia coli ou Bacillus subtilis» □s hospedeiros microbianos compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora da proteína tipo TBF-R ligada na grelha de leitura correcta a uma sequência de controle de expressão podem ser preparados por técnicas ds DNA recombinante que são bem conhecidas a que compreendem os passos de

- preparação de um vector híbrido compreendendo uma sequência de DNA codificadora da proteína tipo TGF-β sob o controle da expressão de uma sequência de controle da expressão adequada,

- transformação do referido hospedeiro microbiano com o referido vector híbrido e

- selecção das células hospedeiras microbianas adequadas a partir de células hospedeiras não transformadas»

A sequência de nucleótidos codificadora de proteínas tipo TGF-β tais como TSF-βΙ» TGF-$2 ou TGF-Í33 maduras é conhecida CDerynck, R» et al, CÍ9S5) Nature 316, 701-705? Marquardt, H» et al., Í1937) J. Biol. Chem» 262, 12127-12131? Ten Dijke, P. et al. C1988) PNAS 85, 4715-4719) e pode e»g» ser sintetizada quimicamente por métodos conhecidos» Como alternativa, cDNAs codificadores ds proteínas tipo TGF—β podem ser preparados após isolamento do mRNA respectivo a paritr de células ds mamífero produtoras ds proteínas tipo TGF-β» As sequências ds controle da expressão são sequências de promotor que asseguram a expressão eficaz das proteínas tipo TGF-β»

A selecção de um vector adequado ô determinada pela célula hospedeira microbiana disponível para a transformação»

Exemplos de vectores que são adequados para expressão da proteína tipo TGF—β numa estirpe de E„ col1 são faacteriófagos, por exempla derivados do bacíerióíago lambda ou plasmídeos, tais como o plasmídeo pBR322 e seu derivado pPLMu» Os vectores adequados contêm um replicão completo e um gene marcador, o qual torna possível a selecção s identificação dos microorganismos transformados pelos plasmídeos ds expressão por meio de uma caractarísti— ca fenotípica» Os genes marcadores adequados conferem ao

microorganismo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos tais como ampicilina ou tetraciclina e similares»

Vários promotores podem ser usados na regulação da expressão de proteínas tipo TGF-B em E» coll» São usados especialmente promotores de genes fortemente expressos» Promotores adequados são lac, tac, trp e Ipp de E» coli» ainda o promotor do fago lambda N ou do fago lambda pL e outros»

Vectores adequados para a replicação e expressão em B» csrevisiae contêm uma origem de replicação de levedura e uma marca genética selectiva para levedura» Ds vectores híbridos que contêm uma origem de replicação ds levedura, por exemplo oCs) segmentoCs) de replicação autónoma relativamente ao cromossoma, são mantidos extracromossomicamente dentro da célula de levedura após transformação e são replicados autonomamente durante a mitose» Também podem ser usados os vectores híbridos que contêm sequências homólogas do DNA do plasmídeo 2um de levedura» Tais vectores híbridos são integrados por recombinação em plasmídeos 2μ jà presentes dentro da célula ou replicam—se autónomamente» Genes marcadores adequados para levedura são especialmente aqueles que conferem resistência a antibióticos ao hospedeiro ou no caso ds mutantes de levedura auxotróficos» os genes que complementam as lesões do hospedeiro» Os genes correspondentes conferem , por exemplo, resistência ao antibiótico ciclo-heximida ou proporcionam prototrofia num mutante auxotrófico de levedura, por exemplo o gene URAS, L.EU2» HIS5 ou TRPI.

Promotores adequados para a expressão em levedura são por exemplo os do genes fiDHI, ADHII ou PHQ5 e também prmotores envolvidos na glicólise, por exemplo o promotor PGK ou GAP»

Facultativamente, as sequências sinal que permitem a

secreção da proteína tipo TSF-ji podem ser incluídos no vector ds expressão» São sequências sinal adequadas e»q» as derivadas do gene da fosfatase ácida (PH05? de levedura ou do gene da invsrtass de levedura»

Os hospedeiros microbianos transfornados são cultivados num meio líquido contendo fontes assimiláveis ds carbono» azoto e sais inorgânicos, aplicando métodos conhecidos»

Podem ser usadas várias fontes de carbono» São exemplos de fontes de carbono preferidas açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol, frutose ou lactose ou um actato como seja acetato de sódio, os quais podem ser usados sózinhos ou em misturas adequadas» Fontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos, tais como casaminoácidos, peptideos s proteínas e seus produtos ds dedeqradação, tais como triptona, peptona ou extractos de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço, assim como sais de amónio, tais como cloreto, sulfato ou nitrato ds amónio que podem ser usados sózinhos ou em misturas adequada» Sais inorgânicos que podem ser usados incluem por exemplo sulfatos, cloretos» fosfatos s carbonatos ds sódio, potássio, magnésio e cálcio» Em adição» o meio nutritivo pode também conter substâncias promotoras do crescimento» Substâncias que podem promover o crescimento incluem por exemplo micronutrientss, tais como ferro» zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais»

A proteína raonomérica tipo TBF-β é recuperada a partir de células hospedeiras microbianas por métodos bem conhecidos» Estes métodos incluem lise ou rebentamento mecânico das células para libertar a proteína pretendida, sequida da separação da proteína tipo TSF~B a partir das proteínas da célula hospedeira, e»g= por precipitação e/ou meios cromatográficos»

Nos casos em que a proteína tipo TSF-B monomérica ê produzida nas células hospedeiras microbianas como um agregado insolúvel (corpo de inclusão) ela tem de ser solubilisada antes de ser exposta a condições ds reenrolamento» Assim, o presente invento está ainda relacionado com ura processo em que a proteína tipo TGF~B monomérico ê prduzida pelos passos dss (a) isolamento da fracção de proteína solúvel em água contenda a proteína tipo TGf-B a partir das células hospedeiras e (b) solubilização da proteína TGF-R»

A solubilizaçao e desnaturação do monómsro é conseguida por acidiíicaçao da suspensão de proteína bruta contendo a proteína tipo TBF~B monomérica na forma insolúvel até um pH de cerca de 1 a cerca de 4, de preferência até cerca de 2,5, facultativaments na presença de um agente redutor» como seja DTT ou pela adição de agentes caotrópicos, de preferência guanidina HC1 ou mais preferencialmente ureia, numa concentração de cerca de 4 s 9 M, pH básica ou temperaturas elevadas como descrito atrás» 0 monómero solubilizado pode ser purificsdo a partir de agentes caotrópicos por diálise e, se surgir um precipitado durante a diálise, por centrifugação adicional» 0 monómero solubilizado é purificado por cromatografia e usado para o reenrolamento para se obter o roduto dimérico biologicamente activo»

Após reenrolamento, o dímero biològicamente activo é purificado para ss remover impurezas» em particular, pirogénios ou outras endotoxinas qus possam estar presentes na preparação após produção da proteína recombinante em células hospedeiras microbianas» A separação do dímero é realizada por cromatografia como seja cromatografia em gel para separação por tamanhos» cromatografia de interacção hidrofóbica ou cromatografia de

permuta ióriica, e»g = numa coluna Mono S e HrLu em fase reversa» presente invento estã ainda relacionado com proteínas do tipo TGF--ÍÍ diméricas biologicamente activas produzidas de acordo com o processo do invento» Estas proteínas tipo TGF-β podem ssr usadas numa variedade de modalidades terapêuticas» invento está ainda relacionado com uma proteína tipo TQF-β monomérica S-sulfonada, a qual pode ssr produzida por

S-sulfonação da proteína tipo TBF-β monomérica» Proteínas tipo TGF-β monoméricas S-sulfonadas são novos compostos, os quais podem ser usados na produção de proteínas tipo TSF-R dlméricas biologicamente activas» □ presente invento diz respeito ainda a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma proteina tipo TGF—β biológicamente activa produzida de acordo com o inventa ou de um seu sal'farmacêuticamente aceitável numa forma de dosagem unitária»

Tal composição está na forma de soluções para infusão ou preparações para administração parenteral, por exemplo intramuscular ou intravenosa, oral ou especialmente local, i»e» tópica, respectivamente» As soluções são preferencialmente soluções ou suspensões aquosas isotónicas que podem ser preparadas por exemplo a partir de preparações liofilizadas que contêm o ingrediente activo sózinho ou juntamente com um veículo farmacêu— ticamente aceitável» As soluções para utilização parenteral são geralmente soluções aquosas. Elas são preparadas de forma convencional e podem conter além do ingrediente activo soro fisiológico, um estabilizante, como seja albumina sérica humana, aminoácidos, tais como arginina ou glicina, e um açúcar, tal como glucose, manose, dextrano ou amido hidroxietilado» □ pH pode ser ~25—

ajustada com um tampão, s»g» um fosfata, succinato ou um aminoácido até cerca de 4,5 a 7, Geralmente os frascos são cheios coo; a solução e liofilizados para armazenamento prolongado.

As composições contêm aditivos convencionais, por exemplo preservastes, estahilizadore, gentes molhantes e/ou emulsionantes, solubilízantes, sais para regulação da pressão osmõtica e/ou tampões =· As presentes composiçSes farmacêuticas, que podem,caso se pretenda, conter outras substâncias farmacológicamente importantes, são produzidas de forma conhecida per ss, por exemplo por meio de processos de mistura, dissolução, liofilização e/ou esterilização convencionais e contêm entre aproximadamente 1 ng e Í00 ug/g, especialmente entre aproximadamente i<? ng ε 10 pg/g de preparação e no caso dos liotilisados até cerca de 10OK do ingrediente activo»

As proteínas tipo TGF-β têm um duplo carácter uma vez que por um lado estimulam a proliferação de certos tipos celulares, nomeadamente fibroblastos e por outro lado inibem a proliferação de outros tipos celulares, nomsadamente células de tumores s células do sistema imune»

As proteínas tipo TGF-β diméricas biologicamente activas produzidos de acordo com o invento, fsculfstivamente na forma dos seus sais, tais como em particular sais de adição ácida não tóxicos, farmacêuticamente aceitáveis, facultativamente na forma de formulações farmacêuticas, são aplicadas numa quantidade eficaz» 0 termo quantidade eficaz significa uma quantidade que exerce uma cicatrização significativa, e„g» uma quantidade que estimula determinadas células para crescerem e que não é tóxico para células normais, Esta quantidade pode ser determinada e»g», por experiências ds crescimento in vitro» Devido ao duplo carácter das proteínas tipo TGF-β, uma quantidade eficaz é também

-2ò-

uma que iniba num grau significativo o crescimento e proliferação de células tumorais e de células do sistema imune» Se se pretender uma utilização no homem ou sm veterinária a quantidade tem de ser ajustada ao tecido particular a ser tratado, ao modo de aplicação, à gravidade da doença e à idade e estado geral do doste a ser tratado» Em geral, as dosagens simples ou diárias para humanos adultos estará na gama de aproximadaments ©,©1 a 2® pg tanto para o efeito estimulador como para o inibidor do c r esc i ssen to»

A composição farmacêutica deste invento tem uma utilização clínico no tratamento de animais, particularmsnte mamíferos, mais particularmente seres humanos e no caso da cicatrização de feridas, mais particularmente de pessoas idosas»

As composições deste invento promovem a migração e proliferação celular» uma vss que a cicatrização de feridas envolve a migração celular e proliferação celular estes resultados in vitro tornam-se directamente importantes para o processo de cicatrização de feridas in vivo»

A prevenção ou tratamento de chaqas em acamados (ulcerações) é uma utilização preferida uma vez que ocorre frequente— mente sm doentes hospitalizados, particularmente em doentes idosos e em cadeiras de rodas» Nas pessoas- mais idosas a cicatrização de feridas é lenta e este grupo ds doentes tende a mostrar uma maior incidência de feridas (não só úlceras decubitus como também diabéticas, mas também traumas, queimaduras s similares) que cicatrização muito lentamente ou não cicatrizam de todo»

São propostos dois tipos ds aplicação das composições deste invento em medicina veterinária e em particular humana»

A primeira aplicação e a preferida é uma aplicação tópica para a promoção de cicatrização de feridas de superfície, particularmente eoi seres humanos mais idosos em que os processos de cicatrização de feridas são notavelmente lentos. Não existem limitações quanto ao tipo tíe ferida que pode ser tratada e estas incluem imas não estão limitadas a) s As úlceras de superfície incluindo úlceras superficiais decúhitas (escaras), diabéticas, dentais, orais, varicoses e hemofílicas?. queimaduras (especial — mente de segundo e terceira grau)| incisões cirúrgicas (incluindo as de cirurgia dental e cosmética)5 feridas de acidentes (incluindo incisões, penetrações, lacerações e outros traumas) e feridas terapêuticamente induzidas (incluindo as induzidas durante radioterapia). Quando aplicadas tópicamente, as composições podem ser combinadas com outros ingredientes, tais como adjuvantes, veículos, agentes solubilisadorss e quaisquer outros factores de crescimento secundários conhecidos ou ainda desconhecidos. Não existem limitações quanto à natureza destes ingredientes excepto eles devere?» ser farmacêutica e fisiológicamente aceitáveis para administração e não devem degradar a actividade ou tornar tóxicos os ingredientes activos das composições. Quando as composições deste inventa são aplicadas na superfície de úlceras, queimaduras, feridas cirúrgicas ou de acidentes, as composições são preferencialmente na forma de um pó, pomada, unguento ou para irrigação ou podem ser impregnados em emplastros transdêrmicos, emplastro adesivo e pensos, de preferência numa forma liquida ou semi-Iiquida, ou podem ser incorporados numa pasta de dentes ou numa goma ou resina para mascar.

A segunda aplicação é uma aplicação sistémica para a cicatrização de feridas internas após cirúrgia ou danificação de tecidos dos orgãos internos sempre que seja impossível ou não seja necessária cirúrgia. Novamente, não existe limitações quanta “28—

não estão limitadasa a) incisões cirúrgicas profundas em orgãos e tecidos internos^ ossos e cartilagens (após fractura); úlceras gástricas·, duodenais s outras úlceras intestinais» Quando aplicado sistémicamente, as composições do invento podem ser formuladas como líquidos, pílulas, comprimidos, pastilhas para administração entérica ou na forma líquida para injecção parenteral» Para o tratamento de incisões internas após cirúrgia, eles podem ser feitos na forma de um irrigante, de preferência em combinação com uma solução salina fisiolóqícamente aceitável. Novamente, os ingredientes activos das composições podem ser combinados com outros ingredientes tais como adjuvantes, veículos, agentes solubilizadores e quaisquer outros fsctores ds crescimento secundários comhecidos ou ainda desconhecidos. Não existem limitações quanto à natureza destes ingredientes excepto deverem ser farmacêutica e fisiológicamente aceitáveis para administração e não devem degradar a actividade ou tornarem tóxicos os ingredientes activos destas composições.

Para a cicatrização das feridas, a quantidade do ingrediente activo a ser aplicado deve ser ajustada ao tipo, gravidade e localização da ferida e também à idade e estado geral do doente a ser tratado» Em geral uma quantidade diária entre 7 cerca ds 1 pg e 2© pg da proteína tipo TGF-β por í cíiró de ferida tem já um efeito cicatrizador significativo. Para a utilização interna deverá ser aplicada uma quantidade maior dependendo do modo de administração devido à diluição da proteína tipo TGF-β nos fluidos do corpo»

Outras utilizações das proteínas tipo TBF-B de acordo com o invento são na reparação ds ossos e tecidos, tratamento de cancro em mamíferos, como um anti-inflamatório ou agente imunossupressor, como regulador do crescimento em culturas de células

de mamífero qu coíbo s^snts protsctor da medula. =í d e c a r d i ο ρ r o t e c ç S o» soiasor >0—

Os exemplos que se seguem ilustram o invento sem o iimitarem«

EXidirUJ ls Clonagem e sequenciaçao de cDNfi de Ί Bi—Bí, jGF~B2 e

ISEdS

A» Cultura de células células de gliosia humano da linha Si~21b (de s-iuralt, B„ st al» (1985) Eur=J=Cancer CIin»Oncol» 21« 207) foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos (Falcon T75> contendo Dulbecco⁵s Modified Eaqle Médium (DMEM, Sibco) e íôa de soro fetal de vitela»

B» Extracção de RIMA

R x IO células da linha celular de glioma humano

CI-215 foram colhidas e homogenizadas em 30 ml de ácido cítrico a 5% com 0,2% Cp/v) de detergente NP4© a 4*C» Os núcleos foram separados do citoplasma por centrifugação a 250® rpm durante 1© minutos a 4^G'C numa centrífuga de bancada Sorvall RT &©Θ©·--Β= O sobrenadante foi csntrifugado a 15®0© rpm durante 30 minutos a 4°C numa centrífuga Sorvai1 RC 5-B com um rotor SS-34» 0 sobrenadaste resultante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 3® ml de ®,2 M TRIS/HC1 CpH 7,5), e mM EDTA, 2a SDS» 25 Ou© unidades 71 de heparina (Sigma) e depois extraído 3 vezes com fenol/clorofórmio Clsl, v/v), o clorofórmio consistindo em 24 partes de clorofórmio e í parte de álcool isoamíliczo ív/v) = À fase aquosa final foram adicionados i volume de acetato de sódio 3M CpH 5,0) e 2,5 volumes de etanol» 0 precipitado de etanol foi lavado duas vezes com etanol a 7©a» 0 sedimento de RIMA foi ressuspenso em 2 ml de mM TRIS/HC1 CpH 7,5), 1 mM EDTA, 0,57 SDS. tfWlffpoliadenilado foi isolado por cromatografia em oliqo-dT celulose como descrito por T» Maniatis em Molecular Clonings A Lahoratory Manual» Cold Spring Harbor Laboratory, Nem York C19B2)»

C« Síntese de cDNA

A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada a partir de 10fJ.g de RNA poli A’ =« 1®® pl de uma solução contendo 5® mM TRIS CpH 8,3), 5® mM KC1, 1© mM MgCl„, 1 mM DTT, 3®ug/ml de oligo-dT 12-18, dATP, dCTP» dSTP e dTTP 1 mM cada, 5® unidades de inibidor de RNAse (Promeqa) e 1Θ®© unidades de transcriptase reversa do Vírus da Leucemia de Moloney <Gitaco~BRL>= A reacção foi incubada durante 1 hora a 37°C» A reacção foi então diluida para 4©© μΐ com um tampão de segunda cadeia contendo 2® mM TR1S/HC1 CpH 7,5/, 5 mn Mg Cl..-,, ί©® mn KC!» Adicionou-se 12,5 unidades de RNAse H CSibco-BRL) e a mistura de reacção foi incubada durante i® minutos a 37 *C» A mistura de reacção foi arrefecida an gelo durante 5 minutos e adicionado 125 unidades de DNA-polimerase I de coli CPromega) = A mistura de rerscção foi então incubada durante mais 2 horas a 16*0= Adicionou-se 4© μΐ de EDTA 0,5 M seguido de uma extracção com fenol/clorofórmio Císí, v/v)» A fase aquosa, foram adicionados 1/1© de volume de acetato de sódio 3M CpH 6,0) e 4 volumes de etanol após o que a mistura de reacção foi precipitada durante 3© minutos a -7®°C» precipitado de etanol foi centrifugado durante 1© minutos a 17 ®ê® ç, o sedimento foi lavado duas vezes com etanol a 707 e seco num Speed-Vac» 0 cDNA de cadeia dupla foi dissolvida em água estéril e sujeito a electroforese num gel deagaross em tampão TRIS-borato CpH 8,8) para avaliar o tamanho e quantidade do cDNA»

o uq do cDNA foram então meti lados ηο5'έί tios fccoRi incubação durante 1 hora a 37°C em íô© μΐ de 5® mM TRIS/HC1 8,®), 0,1 mM EDTA, adsnosil-metionina 8© μΜ e 4© unidades metilase de EcoRI (New Enqland Biolabs)= A mistura de reacção por CpH ds foi extraída com fenol/clorofórmio e o cDNA precipitado com etanol e dissolvido em água estéril como descrito atrás, pg do cDNA foram então preparados para a ligação tíe adaptadores por incubação com 2© unidades de DNA-polimerase de T4 durante 1© minutos a 37*0 sm 200 μΐ de 33 mn TRIS-acetato CpH 7,9), acetato ds potássio 66 mM, acetato de magnésio 1© mii, 0,5 mM DTT s dATP, dGTP, dCTP e dTTP ©,lmM cada, A reacção foi arrefecida até â temperatura ambiente e depois adicionado 2© unidades ds Polimerase Klenow CGibco-BRL) e incubada durante 5 minutos ã temperatura ambiente e 5 minutos em gelo» Após adição de ί© μΐ de 0,5 M EDTA a mistura de reacção foi extraída com fenol/clorofórmio e o cDIMA foi precipitado com etanol e dissolvido em água estéril como descrito atrás.

Adaptadores sintéticos de 12-meros fosforilados em 5^? CNew England Biolabs N2 1070? foram então ligados a 5 pg de cDNA em 100 μΐ ds uma solução contenda 1Θ gg ds adaptador em 50 mM TR1S/HC1 CpH 7,8), 10 mM MgCl₇, 2© mM DTT, 1 mM ATP a 16*C usando 4000 unidades de DNA-ligase de T4 (New England Biolabs), A ligass foi então inactivada pelo calor a 70°C durante 10 minutos, a reacção foi diluida para 500 μΐ em 10 mM TRIS/HC1 CpH 7=5), 6 mM MgCI^? 100 mM NaCl s digerido com ÍOO© unidades de EcoRI (Bosbringer) durante ó horas a 37°C, 5© yl de 0=5 M EDTA foram adicionados e a mistura ds reacção foi aquecida a 7©*C durante í® minutos, A mistura de reacção aquecida foi adicionada directamente a uma coluna Bio-gel AÍ5M (200-4©© mesh, Bio—Rad) para remover os fragmentos de adaptador monómeros, D cDNA de mais de 3©© pb elui no volume de exclusão.

D» ClQn^qgíQ sm lambda qtíl

Prepararam-se os braços de lambda gtíl por digestão de Í00 μ-g de DMA do vector lambda com EcoRI (New England Biolabs) de acordo com o fornecedor» 0 DMA digerido foi dssfosforilado usando 1 unidade de Fosfatase Alcalina ds Intestino da Vitela da Boehringsr Msnnheim como descrito» 20-30 ng de cDNA da coluna de Bio-qsl A15M foram caprecipitadas em etanol com 1 μς da braços de qtll desfosforílados e ressuspensos em 10 μΐ de uma solução contendo 5® mM TRIS/HC1 CpH 7,8), 1® mM MgCi_o, 20 mM DTT, í mM ' 4 __ ” ftsP, 15% de polietiienoglicol (PM 0000) ε 200 unidades de DNA-ligase de T4» A mistura de ligação foi incubada durante 2 horas a 16°C» A mistura de reacção foi centrifugada durante 10 minutos e o sedimento foi ressupenso em 10 μΐ de ãgua estéril e depois empacotado in vitro durante 3 horas ã temperatura ambiente de acordo com o fornecedor CPromega)» 0,5 ml de tampão de diluição do fago SM contendo 5Θ mM TR1S/HC1 (pH 7,5), 1ΘΘ mM NaCl» i®ô mM MqSO^ g 0,01% de gelatina foram adicionados e estabilizados com 25 μΐ de clorofórmio. Um total de 500 fagos foram amplificados em í€í placas de YT (15 cm de diâmetro) usando ®₃7% de agarose-YT (Sigma) com células E. coli Y 1096 como descrito (Young, R» e Davis, R» (1983) PNAS 8«, 1194).

J

E= Despiste s_selecção ds cionss contendo xnserçSes de iBt-βί,

TGF-R2 a TSF-B5

Fizeram-se seis réplicas em filtros de nylon ÍCuno) a partir das lô placas YT s os fagos nos filtros foram desnaturados com 0,5 Μ NaOH, 1,5 M MaCl e neutralizado como descrito em Molecular Clonings A Laboratory Manual (7= Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1982). Os filtros foram colocados em 0,2 x SSC, ®,2% SDS a 90°C durante 15 minutas e depois pré-hibridado durante 4 horas a 45°C em 2 x SSC, 1% SDS,

®,1% Focoll, 0,1% poliviniloirrolidona, ©,1% albumina sérica bovina, 5& mii NaPO_a CpH 6,8), 5® ng/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, ©,ΐμρ/οΐ de oligo A 12-18 e 1©0 pg/ml de RNA l' poli A . Cada uma das 6 réplicas foi hibridada durante a noite a

45°C no tampão de pré-hifaridação a que foram adicionados seis __ ' 77 oligàmeros diferentes de 3V pb marcados com 'Ή ivsr abaixo) para -s uma concentração de 2 x 1®“ cpm/ml=.

Os seis oligómeros usados na hibridação foram sintetizados num Sintetizador de DNA Applied Biosystem a correspondem â sequência de nucleótidos codificadores dos primeiros aminoácidos (oligómeros 1, 3 e 55 ou dos últimos aminoácidos (oligómeros 2, 4 e 6) das formas maduras (112 aminoácidos) ds TGF-βί (ver BEQ ID NS1), TGF-B2 (ver SEQ ID NS2) e TGF-R3 (ver SEQ ID NQ3) respectivamente »

Os dois oligómeros usados na detecção das sequências TSF-βΙ sãos

	1) 2)	5S 55	GCC CTG GAC ACC	AAC TAT TGC	TTC AGC TCC ACG GAG AAG	3’ 3,
TCA GCT	GCA CTT	GCA GGA	GCG	CAC	GAT	CAT	GTT GGA CAG
u			US :	dois oligómeros	usados	na	detecção de sequências
	TGF-B2 são:
	3)	5*	GCT TTG	GAT GC6	GCC TAT	TGC	TTT	AGA	AAT	6TG CAG GAT	”3 ·„·
	4)	5”	TTA GCT	GCA TTT	GCA AGA	CTT	TAC	AAT	CAT	ATT AGA AAG	35
			Ds	dois oligómeros	usados na	detecção das sequências

lGr-βό são:

5) 5·’ GCT TTG GAC ACC A AT TAC TGC TTC CGC AAC TT6 GAG GAG 3’

6) 5’ TCA BCT ACA TTT ACA ASA CTT CAC CAC CAT STT BSA SAS 3’

4© ng de cada um dos oligómeros foram marcados oo sou —o _ extremo 3’ usando P-dATr e 2© unidades de transferase terminai

CGibco-BRL) em 20 μΐ de tampão de reacção contendo cacodilato de potássio 1Θ0 mM ÍpH 7,2), 2 mM CoCl^ e 0,2 mM DTT durante 1 hora z.

a 37*C = A mistura de reacção foi filtrada em gel numa coluna de Sephadex G~5© = Qs oligómeros marcados eluidos da coluna foram aquecidos- a 95*C durante 5 minutos e adicionados ao tampão de pre-hibridação como descrito atrás»

As réplicas í a 6 foram hibridadas com os oligómeros 1 a ò₅ respectivamente» Após hibridação» os filtros foram lavados duas vezes cada um com 2 x SSC, 1 x SSC e 0,1 x SSC â temperatura ambiente dyurante 15 minutos» As placas positivas foram identificadas por autorradiografia e foram despistadas repetindo o processo descrita atrás até todas as placas na placa serem positivas» Uma placa isolada foi eluida em í ml de tampão de diluição de fagos SM íver secção 1»D)_S 1©S gl foram adicionados a 1 ml de células E, colí Y 109© e a mistura foi mantida durante 2© minutos à temperatura ambiente» As células ds E» coli Y í©9© e os fagos adicionados a 1©© ml de meio YT contendo ®_s2a de maltoss e incubado a 37°C durante 7 horas» Após adição de 1 ml de clorofórmio às células Usadas, o DNA fágico foi purificado de acordo com o método descrito em ’^$Molecular Cloninos A Laboratory Manual” <T» Maniatis, Cold Sprino Harbour Laboratory, New York, 1982)» O DNA purificado foi dissolvido em 1 ml de 1® mM TRIS/HC1 ÍpH 7»5)_r, 1 mM EDTA e 1®® μΐ foram digeridos totalmente num volume de 1 ml com EcoRI seguindo as recomendações do fabricante íBoehringer)„ A reacção com enzima foi extraída com fenol/clorofórmio e precipitada com stanol» As inserções EcoRI de cDNA foram purificadas por electroforese em gel íUItrapure BRL) usando papel NA-45 DEAE CSchleicher and SchuelD» 0 DNA foi eluido em 5© mM TRIS/HC1 ÍpH

7,5) ₅ 5 mri EDTA,

M NaCl

precipitado com etanol» 0 sedimento resultante foi lavado duas vezes com etanol a 7®% e ressuspsnso sm i® mM TRIS/HC1 (pH 7,55_s í mM EDTA, —F. aequsneiação das inserções de cvNft

As inserções EcoRl de cDNA foram subclonadas em Bluescript KS’ Vector íStratagene)= A identidade do cDNA foi confirmada por sequenciação ds cadeia dupla de acordo com o método descrito por F=, Sanger et al» (1977) PNAS74, 5463 usando os oliqórasros acima (ver secção 1»E) s um kit Sequenase (U = S, Biochemicals)= A sequência de nucleótidos cobrindo os 112 aminoá— eidos dos TGF-Blg TGF-B2 e TGF-B3 maduros estão descritas em SEQ ID N9 1, 2,, e 3, respectivamente»

G, Amplificação das inser-çSess de cDNA e subclonaqem no plasmiriso

Os oligómeros acima (ver secção i»E) para identificação das sequências de TSF-fílj T8F-ÍÍ2 e TSF-B3 foram usados para amplificar as inserções de cDNA cotíificadores das formas maduras j de 112 aminoácidos (incluindo o codão de paragem).

As inserções EcoRl de cDNA dos plasmídeos Bluescript K3‘ (ver secção 1=F> foram purificadas em gel como descrito atrás (secção Í=E»)» 50 ng de cada uma das inserções de cDNA foram y amplificadas na presença de 2 x 2 ug dos dois oligómeros respecdivos por uma reacção em cadeia com polimerase numa mistura de reacção de 100 μο contendo 10 mM TRIS/HC1 (pH 8,35)₅ 50 mM KC1, 1_?5 mM MgCl»-., ®₅®5% (p/v) NP-40_? ®₃®5X Cp/v) T^sen 20 e dATP₃ dGTP₃ dCTP e dTTP 20® mM cada usando 5 unidades de polimerase Tag (Perkin-Elmer Cetus)» Realizaram-se 3® ciclos de amplificação nas

temperaturas que se seguem usando um Bloco de Aquecimento Perkin-Elmer Cetus; 93°C/0,1 minutos, 55*C/0,2 minutos, 71*0/1,5 minutos» Os fragmentos resultantes de 339 pb cobrindo as sequências codificadoras de TBF-βΙ, TGF~p2 e TBF-R3, respectivamente foram purificadas em gel e subclonadas no plasmideo PSsm--5ZFC + > CPromega) digerido com Ncol, desfosforilado com Fosfatase Alcalina de Intestino ds Vitela íBoehrinoer) e preenchido com polimerase Klenow CBibco—5RL)= As construções resultantes foram designadas pSKM 125 íTGF-íil), pSKM 740 <TBF»Í32) e pGKM 126 <TSF~js3) e foram usados para transformar células competentes E»_coli Y 1Ô9Ô íver exemplo 2), Os clones portadores das inserções correctas codificadoras de Tí3F~{51, TBF-Í52 e TBF-f33 foram designados como E, coli Y 1090/p6KM 125 (TGF-βΙ), E, coli Y1090/pGKM 740 (Τ6Ρ-β2) s E» coli Yí090/pBKM 126 CTBF-R3), respectivamente»

EXEMPLO 2; Expressão de TSF-βΙ» TSF-S2 s TSF-fi5 sm E» coli

A» Métodos gerais

Estirpe bacteriana CE» calih

LC 137; btpR^, lon_RÇS lac,^ ^maiaffl^{!f trp}am^{5 phc}W ^r5pL* tsxssTní©» 5upC._h<_ CSoff» S»A = et ai» (1984) PNAS 81, 6647-6651)»

P1 asirsí deos s ¹ J pPLMus Sueli_?B. et al» (1985) hfucleic Acids Res» 13, 1923-1938)» Este pasmídeo é portador do promotor do bacteriófago lambda Pj_ com o sítio tíe ligação aos ribossomas do qene ner do fago Mu (Van Leerdam, E = ' et al»» (1982) Virology 123» 19-285 » polpas Plasmídeo codificador de um repressor termo-sensível de lambda CI_R_-, e que confere resistência à canamicina (Remault, E» et al» (1983) Gene 22, 103-1135=

El^trgígrese . aB.,,pel com SpS '

J A electroforese sm gel de poliacrilamida e SDS CSDS-PA8E) e coloração de proteínas foi feito conmo descrito por anteriormente (Laemmli, U»K» (1970) Nature 227, 6©©—6855 usando a célula Miniprotean II da BIORAD e géis de poliacrilamida de Imm de espessura»

Indução pelo calors ml de meio LB (Maniatis et al» (1982), Molecular Cloning, Cold Sprinq Harbor Laboratory, Neu? York) num tubo de cultura de 20 ml contendo ampicilina s canamicina (LB/amp/can) 4©

μρ de cada foram inoculados com uma colónia isolada e incubados oom agitação durante a noite a 30*C = 5 ml desta cultura crescida durante a noite foram adicionados a 15 ml de L.B/amp/ean num frasco Erlenmeyer de 10® ml. ESte frasco foi transferido para um banho maria oom agitaçãoa 42°. Antes da transferência retirou-se uma amostra ds 2ml (condições de não indução) e após a transferência (condições de indução) retiraram-se amostras de 1 ml com intervalos de í hora. As células foram sedimentadas por centrifugação (5 min. 1® D©® rpm numa centrífuga Eppendorf) e o sobrenadante foi rejeitado. 0 sedimento foi ressupenso em l®0 μΐ de tampão de amostra para SDS—ΡΑΒΕ s aquecido durante 1® min a 95°C. Usaram~se amostras de 5 μΐ para SDS-PABE.

Preparação de células competentes=

Células competentes de E. coli foram processo de cloreto de cálcio como descrito em (1982), Molecular Cloninq, Cold Spring Hsrbor York. As células portadoras do plasmídeo pc a 3®*C = preparadas pelo naniatis et al. Laboratory, New foram cultivadas

B. Construção dos vectores de expressão prLiiu.hlBr-lsl, pPLnu. hTBF-B2 e pPLnu. hTBF~íi5 e expressão de TGF-B1, TGF-R2 e

TGF-R3

Células de E„ coli ΥΙθνΟ/ρΒΚΜ >25. E. coli Υί®90/ρΒΚπ 74® e E. coli Yí©9©/pSKM Í26 (ver exemplo Í.B) foram cultivadas em meio LB e o DNA de plasmídeo foi preparado pelo método de Birnboim. H.C. e Doly, H. (1979) Nucleic Acids Research 7, 1513= pg de DNA de plasmídeo foram totalmente cortados em 5® μΐ ds tampãc? de restrição com Ncol s Sall CpBKM125)_s Ncol e EcoRV (pGKM740) ou apenas Ncol (pGKNÍ2ó) seguindo as recomendações do fornecedor (Boehringer)» 0 DNA foi precipitado pela adição de 5

μΐ d acetato de sódio 3 M, 10© mij nqCl„_? 5 mM EDTA e 15® μΐ de stanoi» Após incubação a ~7®*C durante 15 min o DNA foi sedimentado por centrifugação a 13 ôô© g durante 15 min num rotor 8834 numa centrífuga Sorvai1= 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento rsssuspenso em 8© μΐ ds ©,©89 n TRIS-borato, ácido bórico 0,089 M e ®₃®02 m EDTA (tampão TBE5 contendo ©,257 de azul de bromofenol s ©,257 de xileno cianol» 4 vezes amostras ds 2© μΐ foram submetidas a electroforess através dsum gel de 1% de agarose em tampão TBE contendo ©₃5 pg/ml de brometo de etídio a 5® volts até a marca de azul de bromofenol atingir o fundo do gel de 1© cm ds comprimento e ©,8 cm de espessura» Os fragmentos de DNA codificadores de TGF-βΙ, TGFB2 e TGF-B3 maduros, respectivamente, foram visualizados sob luz UV de comprimento ds onda curto, cortados cosi uma lâmina de barbear e electroeluidos do pedaço de gel num sistema Schleicher & Schull Biotrap aplicando 2©© mamp durante 1,5 horas» Qs fragmentos de DNA eluidosforam precipitados (ver atrás) e ressuspensos em 2© μΐ ds TE» μΐ do plasmídeo pPLMu foram linearizados com Ncol s Sall, Ncol ε EcoRV ou Ncol sózínho e purificados em gel como descrito atrás para os fragmentos de DNA» 10© ng de DNA do vector pPLMu linearizado s purificado ε 3 vezes o equivalente molar do respectivo fragmento ds DNA purificado foram incubados a 4*C durante 15 horas em 2© μΐ de tampão de ligação (7© mM TRIS/HC1, pH 7,5, 1® írM MgCl^, 5 mM DTT, ®,1 mfj adenosina-trifosfato) contendo 1 unidade de DMA-ligase (Boehringsr)»

1© μΐ da mistura de ligação foram adicionados a 2©© μΐ de células ds E» coliLC 137 competentes frias (4*0 portadoras do plasmídeo pcl^-»» Após 3© min as células submetidas a choque térmico por incubação durante 1,5 minutos num banho maria a 42°C„ Adicionou-se 2 ml de meio LB e a cultura foi agitada durante 6© minutos a 3©*C» Amostras de 2©© μΐ foram semeadas em placas LB-4ί-

3®^i:>C = Colónias isoladas foram cultivadas e o DNAde plasotídeo analisado» A subclonagem dos fragmentos ds DMA codificadores de TGF-iil, TGF-f!2 e TGF-{s3 sm pPLMu resulta nos plasmídeos pPLMu»hTSF-Bl₃ pPLMu „ hTGF~fl2 e pPLMu,hTBF~B3, respectivamente» Os clones contendo as construções acima foram referidas como E» colil-C 137/pPLMu.hTGF~g>i _s E» coliLC 137/pPLMu=hT6F~B2 e E»_coli

LC 137/pPLMuh»7BF-B3, respectivamente»

E» coliLC Í37/pPLMu»hTBF-βί3 E» coliLC 137/pPLMu=hTBF-R2 e E» coliLC 137/pPLMu = hTBF-fí3 foram induzidas pelo calor <vsr exemplo 2»A) e as proteínas expressas foram analisadas por SDS-PAGE» TGF-B1 s TBF-B2 e TBF-B3 todas surgem como proteínas induzidas pelo 2 noras após a indução térmica migrando com um peso molecular médio aparente de aproximadamente 12 888 D»

C= Fermentação dos transformantes

Culturas crescidas durante a noite de E» coliLC 137/pPLMuh»TGF-|U _? E» coliLC 137/pPLMuh»TGF-js2 e E» coliLC í37/pPL!íuh»TBF-|33 em frascos Erlsnmeyer de 2 1 contendo 75© ml de meio LB com 4© mg/ml ampicilina a canamicina foram cultivadas a 3©°C» 3©0 ml de culturas crescidas durante a noite foram adicionadas a 75© ml de meio LB contendo antibióticos conforme mencionado atrás em frascos Erlsnmeyer e aquecidas a 42°C por agitação durante aproximadamente 35 minutos num banho maria a 65*C» Gs frascos foram então transferidos para um agitador a 42°C e incubadas durante 3 horas» Os frascos foram arrefecidos até 12 uC num banho maria com gelo e as células foram colhidas após centrifugação durante Í0 minutos a Q 000 rpm num rotor BSA (Sorvall)»

ce-revisiae

As sequências codificadoras ds TGf-βΙ, TGF-R2 e TGF—p3 maduros foram expressos em Saccharomyces cerevisiae sob o controle do promotor induzivel da fosfatase ácida ds levedura (PHD5)

Os vectores de expressão foram construídos em dois

A. construção do plasmídeo pJDB207/PHO5-RIT 12,

B= construção dos plasmídeos pJDB207R/PHO5~TBF~Bl, PJDB207R/PHO5-TBF-B2 e pJDB207R/PHD5-TGF~B3, em que A) proporciona o vector tíe levedura e o terminsdor da transcrição da PH05 e B) proporciona as cassetes de expressão com uma inserção codificadora de TGF-βΙ, TGF-R2 e TGF--B3, respectivamente, sob o controle do promotor de RHQ5,

A- Construção do plasmídeo _PdDB207/FHO5-RIT 12 plasmídeo p31RIT 12 (Pedido de patente europeia ER 277,313) foi linearizada com a endonuclsasa de restrição Sall» A digestão parcial com HindiII na presença de brometo de etídio resulta num fragmento SalI/HindIII de í kb compreendendo a sequência Sall/BamHI de 276 pb oo pBR322, o promotor de 534 pb da fosfatase ácida de levedura PH05, a sequência sinal da invertase de levedura Ccodificadora ds 19 aminoácidos) e o terminador da tanscrição de PH05, O fragmento SalI/HindIII de 1 Kb do p31RIT 12 foi cionado no vector vai-vem de levedura-E, coli pJDB207 (Beggs, J,D» em;; Molecular Senetics im Yeast, Aifred Benzon Symposium 16, Copenhaqen, 1981, ρρ= 383-389), que tinha sido cortado com Sall s HindiII, 0 plasmídeo resultante contendo a inserção de 1 Kb foi referido como pJDB2@7/PH05-RIT 12,

tL construção do plasmídeo pJUK2e/K/wHUb-iiíF-B2 plasmídeo pGKM740 íT6F~R2) (ver exemplo 1»G) foi cortado com Ncol» Os extremos coesivos foram preenchidos numa reacção com DMA-polimerase Klenow» Adicionou-se o adaptador EcoRI C5^?-CCGGãATTCCGGj Biolabs) e a mistura ligada, 0 plasmídeo circular resultante foi referido como pSKrlAófeQ ÍTSF-B2? e cortado com EcoRI e Sall, Um fragmento EcoRI/SalI de 0,4 Kb foi isolado a partir de um gel de agarose, purificado e ressuspenso em água estéril numa concentração de 25 ug/ml» 0 fragmento contem a sequência codificadora madura do TGF-βΖ com um ATG na mesma grelha ds leitura do codão GCT que define o aminoácido Ala do TGF-B2 maduro,

D promotor PHQ5 foi isolado a partir do plasmídeo p31RIT Í2 Cver atrás) num fragmento BamHí/EcoRI de 534 pb, 0 plasmídeo pJDB207/PHO5-RIT 12 foi cortado com BamHI e Xhol, □ fragmento grande BamHI/Xhol ds 6,3 Kb foi isolado, 0 terminador da transcrição de PHQ5 mantem-se no fragmento, 0 fragmento BamHI/EcoRí do promotor PHQ5, o fragmento EcoRI/SalI codificador de TGF-fi2 e o fragmento vector BamHI/Xhol foram ligados. Um cisne correcto com o qene TSF~B2 sob o controle do promotor de PHO5 cloriado numa orientação contrária ao sentido dos ponteiros do relógio em pJDB2©7 foi referido como pJDB207R/PHO5-TSF-p2,

De forma análoga, os TBF-βΙ e TGF-R3 maduros foram expressos em 3, cerevisiae, Qs plasmídeos contendo as sequências codificadoras de TGF-pl s de TGF-B3 são pGKM125 e pBKM126, respectivamente (ver exemplo 1»G)= Após digestão destes plasmídeos com Ncol, adiçãodos adaptadores EcoRI e ligação, os plasmídeos circulares resultantes foram cortados con» EcoRI s Sall, Qs

fragmentos tcoRI/Sali foram clonados em pdD82®/ como descrito atrás» Ds plasmídeos resultantes foram referidos como pJDB2®7/PHQ5~TGF--í31 e pJDB207/F^!HG5-TGF-fl3,

C» Transfarmação ds S. csrsvisias estirpe GRF19

Saccbaromyces cerevisiae estirpe GRF18 (MATa,_______his3-l1, — — P his3-lo, leu2-ó, Ieu2-íí2, csn'¹, DSM 366o) foi transformada com os plasmídeos pdDB2©7R/PHQ5-TSF~R1 pJDB2®7R/PH05-TBF-B2 pJDB207R/PHO5-TSF~S3 usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen,, A» et al» (1978) RNAS 75, 1929» As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura deficiente em leucina» Colónias de levedura isoladas foram repicadas e referidas como

Saccharomyces cerevisiae 8RF18/pJDB2077PHOS-TGF-p1

Saccharomyces cerevisiae BRF18/pJDB2©7/PH05-T8F-ís2 s

Saccharomyces cerevisiae 8RF18/pJDB2©7/PH05~-T6F-ÍÍ3»

D. Fermentação de.transformantes de S» cerevisiae e preparação de extractos celulares

Os transformantes de levedura» como referido atrás, contêm plasmídeos com cassetes de expressão controladas pelo promotor de PH05 e portanto requerem desrepressão do promotor par-a a expressão de TGF-βΙ, TGF—íí-2 ou TSF~íí-3» Os transformantes

foram cultivados individualmente em duas pré-culturas sucessivas í. IO ml e .50 ml) sm meio mínimo para levedura com alto teôr de P_. preparado de acordo com a receita da Base Azotada para Leveduras da Difco sem aminoácidos mas contendo 10 gZI ds L-asparagina em vez de <ΝΗ_Λ ),-,30,=, 1 oZI de L-histidina e 20 qZI de glucose» As células da segunda pré-cultura foram lavadas sm 0,9% de NaCl e todas as células foram usadas para inocular í©© ml de meio mínimo com baixo teôr de P^ preparado de acordo com a receita do meio Base Azotada para Leveduras da Difco (sem aminoácidos), mas contendo ©,©3 g/1 de ΚΗ,,ΡΟ^, í© gZI de L-sspsrsgina, í gZI de L-histidina e 20 gZI de glucose» As culturas foram agitadas a 30°C a 180 rpm»

As células de 10 ml de cultura foram colhidas às 5 h, 24 h ε 48 h por centrifugação a 3000 rpm a lavadas uma vez em ©,9% de NaCl» 0 sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise Cfosfato de potássio 66 mM pH 7,4, Zwitterqent 4 mM (Cslbíochem)3= Adicionou-se 8 g de esferas de vidro (0,5-©,75 mm de diâmetro) e a suspensão foi agitada vígorosamente 4-5 vezes durante 2 min cada num Vortex Mixer no frio, D extracto celular foi decantado para retirar as esferas de vidro» Os detritos celulares no extracto foram sedimentados por centrifugação durante 5 min a 3©©© rpm a 4°C» 0 sobrenadante e os sedimentos foram separados e guardados a —20^OC.

EXEMPLO 4; Produção de TSF-βίTSF-βΞ s TGF-B5 diméricos biológicaasnte activos

Os processos descritos abaixo para a produção TGF-B2 dimérico biologicamente activo pode aplicado por analogia para a recuperação de TBF-pl, TBF-B3 e outras “proteínas tipo TBF-B” diméricas biologicamente activas, respectivamente»

A. Recuperação de TGF—P2 monomérico não solúvel a partir de E.

coli

Células de E» coli LC 137/pPLMu„hTBF-R2 foram fermentadas como descrito no Exemplo 2 = C = 0 rebentamento das células e recuperação de TBF-B2 não solúvel foi realizado s 4°C» Cerca de 18 g ds células molhadas foram rsssuspensas em 6© ml de ©,1 M TRIS/HC1, í© mM EDTA, 1 mM PMSF ÍPhenyl Methan Sulphonyl Fluoride), pH 8,3 (tampão de disrupção)» As células foram passadas duas vezes através de uma prensa francesa (8LM Instruments, Inc») de acorda com as instruções dos fabricantes e o volume foi levado a 2©© ml com tampão de disrupção» A suspensão foi centrifugada durante 2© minutos- a 15 ©©© g. O sedimento obtido foi ressuspenso em 1©© ml de tampão de disrupção contendo ί M NaCl e centrifugado durante 1© min como atrás» 0 sedimento foi ressuspenso em 1©© ml de tampão de disrupção contendo 1% Tricon X-Ι©© (piares) _e novamente centrifugado durante í© min como atrás» 0 sedimento lavado foi então suspenso em 5© ml de 2© mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% DTT s homogenizadas num triturador de tecidos de Teflon» A suspensão resultante contem TGF-B2 monomérico bruto numa forma insolúvel»

-47“ h„ Solubil ização s purificação de lBF-«2 aonomérico

ί® ml da suspensão de TBF-{i2 obtida de acordo com o exemplo 4„A ou 4»C foram acidificados coo ãcido acético a 107 até pH2,5 e centrifugados numa centrífuga Eppendorf durante 10 min ã temperatura ambiente» □ sobrenadante foi cromatografado numa coluna de Sephacryl S-IO® (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) em ácido acético a 107 num fluxo de 1,4 mlzmin» (Como alternativa, a cromatograf ia pode ser efectuada em Sephacryl 5---1Θ® HR (Pharmacia) e a colunas eluida com ácido acética a 17 ou 5 mM HC1, respectivamente») As fracções contendo TBF--B2 monomêrico desnaturado eluindo entre 19® min e 22® min foram reunidas» Este material foi usado no reenrolamento para se obter TGF-ÍÍ2 dimérico biologicamente activo (exemplos 4=B=K»L) ou ainda mais purificados para análise estrutural (exemplo 4.D.5»

Recuperação_ds, ,lGr-;i2_monomérico_a partir de Accharomycss csrgvisíae

□ sedimento de células rebentadas obtido a partir de 5Θ® ml de fermentação efectuada como descrita no exemplo 3»D fai suspenso em 2© ml de ureia 4M, ©,i M TRIS, 17 DTT, pH 8»©, A mistura foi mantida á temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação intermitente no vortex todos os 5 minutos» □ material insolúvel foi removido por centrifugação a 30 ©O© g durante 3© minutos a 4°C e o sobrenadante ajustado a pH 2,5 com ácido acético e dialisado abundantemente contra ácido acética a 57 durante a noite a 4*C, A solução foi centrifugada como atrás e o sobrenadante clarificado foi concentrado por ultrafiltração numa membrana YM 1© CAmicon) para um volume final de 4 ml» A amostra foi então cromatografada em Sephacryl S-l®© HR CPharmacia) em ácido acético a 57 como descrito no exemplo 4»B dando TGF—]s2 monomérico»

D= Purificação de lGr~B2 monomérico por KK-HhLu

Amostras das fracçSes reunidas da coluna de Sephacryl S-ί©© (exemplo 4,B) foram purificadas numa coluna de HPLC em fase reversa vydac 2Í4TP5415 (4,6 χ 15© mm, The Separations Group, Hesperia, CA, USA), A coluna foi equilibrada nurna mistura de 7©X TFA ©,i% sm água e 3©% TFA ©,©8% em acetonitrilo e o produto foi eluido por um gradiente linear durante 3© min terminando com uma mistura de 55% TFA ©,1a em água e 45% TFA ©,©8% em acetonitrilo num fluxo de 1 ml/min» 0 material eluido foi controlado por absorvância a 216 nm e os picos individuais foram colhidos manualmente de acordo com a absorvância de UV = TGF-p2 monomérico desnaturado foi eluido em 21,5 min» Dependendo das colunas individuais de ds fass reversa usadas na separação a mesma preparação de TGF-Í32 ê eluida á volta de 16 min e 18 min, respectivamente,

As fracçSes de TSF-R2 foram analisadas por RP-HPLC usando a mesma coluna s sistema solvente empregues atrás» TGF-B2 foi eluido por um gradiente linear durante 42 minutos começando sm i©©% TFA ©,1a sm água s terminando com uma ínistura de 3©X TFA em água e 7©X TFA ©,©8% em acetonitrilo» TGF»B2 foi eluido como um único pico após 3©,4 min» Dependendo da coluna individual usada os tempos de retenção foram de 29 min e 29,9 min, respectivamsnte»

TGF-p2 foi analisado após mistura de TBF-B2 porcina natural quimicamente reduzida (British Biotechriology Limited» Oxford, UK) que tem uma estrutura primária idântica â do TGF-R2 humano (fnarquardt, H. et al» (1987) J, Biol» Cbem» 2ó2, 12127•-Ί2131)» A mistura elui como um único pico confirmando a identidade do material»

Análise do iSi—jsv monsmérico psr SDb-HAiãb

Amostras individuais da coluna do Sephacryl S-Í00 (exemplo 4»D) foram secas sob vácuo e analisadas por 3DS--PAGE (Laemmli, U»K = (197©) Nature 227, 680) em géis verticais de 15% de poliacrilamida coradas com azul de Coomassis E-25®= Obteve-se uma única banda com um peso molecular aparente ds cerca de 12 ©00 D indistinta do T8F~B2 porcino natural reduzido»

F= Determinação da sequência ds aminoácidos N-tsrmínal do iSf-jf?

monomérico

TGF-B2 do exemplo 4»B foi evaporado sob vácuo, dissolvido em 25 μΐ de ácido acético e sujeito a dsterminaçSo da sequência de aminoácidos num sequenciador ds proteínas de fase gasosa modelo 47®A (Applied Biosystems)»

A sequência de aminoácidos N-terminal és ί© 15 A1a-Lsu-Asp-A1a-A1a-T i r-X-Fen-Arg-Asn-Va1-G1n-Asp-Asn-XX-Leu-Arg-Pro em que X denota um aminoácido não identificado positivamente»

De um modo semelhante, a sequência de aminoácidos N-terminal foi determinada para o derivado 4-vinilpiridina do TGF-B2 preparada como descrito por Narquardt, H» et al» (Í987) J» Biol» Chem» 262, 12127-12131.

A sequência de aminoácidos N-terminal és

Als-Leu-Asp-Als-Alã-Tir-CiB-Fen-Ãrg-Asrj-Vsl-Bln-Asp-ftsn-X2© 25

Cis-Leu-Arg-Pro-Leu-Tir-I le-Asp-Fen-X-Arg-Aisp-Leuem que X significa um aminoácido não identificado positivamsnte» Císteina foi determinada conto S-piridiletilcístsina»

6. Geração Τ6Ε-β2 dimérico biologicamente activo mq de TBF-B2 monomérico desnaturado do exemplo 4»B foi dissolvido em 140 ml de 5© mM Tris/HCl pH S,©, 1 M NaGI, 5 mM EDTA, glutationa reduzida 2 mM, glutationa oxidada í mM e 33 mM Chaps (Calbiochem)» Após 72 horas a 4*C o pH da solução foi ajustado a pH 2,5 com HC1 e a mistura concentrada 1© vezes por ultrafiltração numa membrana YM 1© CAmicon, Danvers, MA, USA) numa célula com agitação da Amicon» A solução concentrada foi diluída para o volume original com 1© mM HC1 e concentrado para um volume final de í© ml pelo mesmo método» G precipitado formado foi removido por centrifugação a 5®©© g durante 3© minutos» 0 sobrenadante contem TSF-js2 dimérico ligado por pontes dissulfureto conforme avaliado por SDS-PAGE em condiçSes não redutoras» A actividade biológica da preparação foi medida pela migração celular e ensaio de crescimento (exenjplo 5»A) e pelo ensaio de inibição do crescimento celular (exemplo 5=B>»

Como alternativa, em vez de se usar TGF-ÍJ2 monomérico, usou-ss o derivado S-suTfonado de TGF-p2 (exemplo 4»M) para a geração de TGF-R2 dimérico activo aplicando essencialmente o processo descrito neste exemplo com excepção da concentração de cloreto de sódio que é 2M_ A purificação e isolamento do TGF—(Ϊ-2 dimérico foi efectuada com os mesmos métodos do TGF-B2 dimérico gerado a partir da proteína monomsrica não derivatisada (exemplo

4.H e 4» D»

H» Isolamento de ιΒι—f52 dimêrico por cromatografia ds permuta catíóníca numa coluna Mono S

A solução concentrada do exemplo 4»B foi aplicada num fluxo de 1 ml/min numa coluna Mono S HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada numa mistura de 85a de tampão A (acetato de sódio, 2® mM, 3®x isopropanol, pH 4,©= e 15X tampão B (tampão A contendo cloreto de sódio 1 M) = A coluna foi então lavada no mesmo fluxo mantendo constante a composição da mistura tampão até a leitura de absorvância a 28© nm ter atingido o nível da linha de base, seguido de um gradiente linear durante 2© minutos começando quando da injecção nas condições de equilíbrio e terminando com uma mistura de S©5C tampão Α/5©λ tampão B = TGF-R2 dimêrico biologicamente activo foi eluido 9 minutos após o começo do gradiente e colhido manualmente» Conforme avaliado pela determinação pela actividade biológica, 8DS-PAGE sm condições não redutoras e RP-HPLC não se encontrou qualquer T8F—R2 dimêrico na fracção do volume de exclusão» Em adição, não se detectou TBF~B2 monomérico por SDS-PASE no pico de T8F-R2 dimêrico eluido da coluna pelo gradiente salino»

-J

I Furitcoaçao.....de „ lGr-H2 dimêrico

TBF-Í52 dimêrico do exemplo 4»B foi diluído com o mesmo volume de ©,1X TFA em água e sujeito a RP--HPLC numa coluna vydac 2Í4TP5415 (4,6 x 15© mm, The Separatíons Broup, USA) equilibrada numa mistura de S©a TFA ©,Ía sm água e 2©% TFA ©,©8a sm acetonitrilo» A coluna foi eluida por um gradiente linear durante 4® minutos começando quando da injecção nas condições de equilíbrio e terminando com uma mistura de 6©X TFA, ©,1X em ãgua e 4©% TFA ©,©8X em acetonitrilo num fluxo de 1 ml/min» 0 material eluido —52—

foi controlado por absorvância a 216 nm» □ TSF-Í32 foi eluido com um tempo de retenção de 32,7 min e colhido manualmente» A análise por SDS-PAGE em condições não redutoras revelou uma única banda bem definida com o peso molecular aparente de aproximadamente 25 cD» 0 TGF~i52 dimérico obtido tinha um elevado grau de pureza»

J = Método I alternativo para a obtenção de TSF-fi? dimérico aio16gicamente activo

76F-R2 fflonomêrico do exemplo 4»B foi dissolvido numa concentração ds @,1 mg/ml en* fosfato de sódio 5® mM, pH 8,®, NaCl 2 M, 5 mM EDTA, císteina 2,5 mM, cistina 1 mMe Chaps 50 mM (Calbiochem) = Após 3®® horas a 4*C o pH foi ajustado a pH 2,5 com 107 TFA» Em seguida adicionou-se 3® mq/ml ds Sepralyte C-í Cgrau preparativo, 4® pm, Analytichem INterantional, Harbdr City, CA, USA), pré-tratado sequenciadamente com ®,i% TFA em acetonitrilo e 0₅1X TFA em água e a mistura foi suavemente agitada durante 3® roiná temperatura ambiente» 0 gel foi filtrado através de um filtro de vidro coberto com Sepralyte C-í lavada de fresco C2©7 da quantidade adicionada à solução de reenrolamento)„ 0 gel foi lavado primeiro com (5 vezes o volume de gel) tampão A ί©»2 M MaCI/Θ,ίΖ TFA/água), em sequida com uma mistura ds 8®% tampão A s 207 tampão B <©,087 TFA em actonitrilo)» 0 TGF-jT2 foi eluido com uma mistura de 7®7 tampão A e 3®a tampão B« 0 material eluido foi aplicado directamente numa coluna Mono S HR 5/5 (Pharmacia)» A purificação s isolamento do TGF-R2 foram realizados como nos exemplos 4=H e 4»I, respectivamente»

Como alternativa, acetonitrilo em tampão A e tampão B, respectivamente, usado na lavagem do gel Seprslyte C-í e na eluição do TGF-p2 foi substituído por isopropanol» A lavagem foi então efectuada coni uma mistura de 9®% tampão A s 1©7 tampão B a a eluição do TSF~B2 foi conseguida com um gradiente descontinuo

-53“ (passos de 27 ds tampão B) tampão A s 2ôX de tampão B tampão A e 3ôs do tampão B, to nos exemplos 4»H e 4=1,

começando com uma mistura de S©% de s terminando com uma mistura de 767 de restante do processo é como descrirespect i vamen te,

K- Método alternativo II para obtenção de SSF~B2 dimérico biologicamente activo

TGF~!i2 monomérico do exemplo 4„B foi dissolvido numa concentração de ®,5 mg/ml em 10© mM Tris/HCl, pH 8,5, ί M NaCl, 5

--mM EDTA, ylutationa reduzida 1 mM, glutationa oxidada 1 mM e 5© mM Chaps Ccalbiochem)= Após 45® horas a 4°C a mistura foi ajustada a pH 4,0 com ácido acético, diluida pela adição de 7 volumes ds acetato de sódio 2© mM, pH 4,© e bombeada para uma coluna Mono S HR 5/5 (Pharmacia), 0 restante do processo foi como no exemplo 4=H e 4=1, respectivamente,

L. Método alternativo III para a_obtenção de_T6F-R2 dimérico biologicamente activo usando tio-redoxina como agente promotor de dissoljitos

T6F-R2 monomérico do exemplo 4,B foi dissolvido numa concentração de ®,©25 mg/ml em IO© mM Tris/HCl, pH 8,ô, 5© mM Chaps, ®,©5 mg/ml de tio-redoxina, A mistura foi incubada a 4*C durante 24 horas. Conforme determinado pela migração celular e ensaio de crescimento (exemplo 5=A) o rendimento do TBF-B2 dimérico, reenrolado s activo foi semelhante ao do método descrito no exemplo 4 = B = A purificação e isolamento ds TBF-{52 dimérico foi como nos exemplos 4,H e 4,1, TGF-Í32 foi separado da tio-redoxina pela coluna Mono S do exemplo 4,H=

-54—

hl» Preparação de Τ8Ε-β2 8—sulfonsdo e sua utilização na obtenção de Τ6Γ-Ρ2 dimèrico biologicamente activo

TGF-R2 monomérico do exemplo 4»B foi dissolvido à temperatura ambiente em ureia óM, 10Θ mM Tris/HCI, pH 8»®, sulfito de sódio 5@ mm e 0,2 mM císteina» A formação ds TGF-B2 S-suItonado foi controlada por RP-HPLC usando as condições do exemplo 4 = D = G tempo de retenção de TGF-Ç52 S-sulfanado foi de 31,8 min» Após completa a reacção, o pH da solução foi ajustado a pH 2,® com IN HC1» Ao TSF~fJ2 S-sulíonado foi retirado o sal numa coluna de FPLC Fast Desalting Column HRIG/IO (Pharmacia) em 1® mM HC1» 0 reenrolamsnto do TGF~|Í2 S-sul tonado para dar TGF-fB2 dimèrico activo foi feito essencialmente de acordo com o processo do exemplo 4 = 8 =

N» Reciclagem do TGF-R2 incorrectamente enrolado

Ao material não ligado â coluna Mano 8 do exemplo 4,,H adicionou—se hidrocloreto de guanidina sólido e DTT piara dar uma concentração de 6M e 5 mM, respectivamente e o pH foi ajustado a pH 8,5 cooí Tris sólido» Após 1 hora à temperatura ambiente a mistura foi sujeita a RP-HPLC usando a mesma coluna e o sistema solvente do exemplo 4 = D» TGF-ís2 monomérico reduzido foi colhido e retirado o acetonitrilo sob vácuo» Esta preparação foi então sujeita ao processo de reenrolamento do Exemplo 4»B ou 4»C, melhorando assimo rendimento total do TGF-p2 dimèrico reenrolsdo»

0= Obtenção.de TSF-IS hsterodimsrico biologicamente activo

TGF-íls heterodiméricos consistindo em duas cadeias polipeptidicas diferentes ligadas por pontes dissulfureto ds 112 aminoácidos cada podem ser preparadas submetendo quantidades equimolares dos dois monómeros rsspectivos a condições de

reenrolamento doe dímsros foi realizada de acordo com os Exemplos 4»H e 4»I permitindo a separação da forma neterodimérica de entre os homodimeros»

P. Mapeamento de peptídeos e determinação da sequência dos

TSF-βΙ» TGF-βΞ e TGF-B3 monomérioos» respectivamente ug <6,7 nmoles) de TGF-f32 recombinante S-piridiletilado descrito no Exemplo 4»F foram secos numa centrífuga sob vácuo e redissolvidos em 2ô© Gl de 5 mM HC1 =, Adicionou-se 2®® ul de tampão Tris-acetato, pH 7,8, contendo o detergente Zwitteroent 3-12 (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) 1© mM e misturou-se com a solução ds proteína» A clivagem foi realizada com 2 pg (dissolvida em 5© μΐ de água) de endoproteinase Asp-N Cdo mutante fragi de Pseudomonas-, Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG) a 37°C» Após Í3 horas, adicionou-se 5© ul de TFA a 1©7 CvZv) e a mistura foi separada por RP-HPLC numa coluna de poro estreito C4 (Vydac 214TP52, 2,1x25© mm) com um gradiente linear de 5 a 4©7 (vZv) de acetonitrilo em ©,Í7 TFAZágua em 35 min num fluxo de ®,1 ml/min e detecção por UV a 216 nm» Os picos colhidos foram analisados por espectroscopia da massa como descrito no exemplo 4=8»

A comparação da massa molecular medida Cem Daltons. D) dos peptídeos na sua forma protonada CM+H’’) com a massa molecular calculada permite a seguinte identificação?

I SfíipQ de	Μ-Η-Γ	Massa M CD)
Rstenção C min)	CD)	Calculada
16,1	-“.z. A J	^A·^· ã
•73 _ 9	1832,3	1831,1
25,9	1292,5	1291,5
2v - ©	1307,7	1306,6
1 r, ώ	1320,0	1318,5
32 ? 1	1421,1	1419,7
33?©	3132,3	3131,5
36,9	3425,3	3424,9
44,5	3739,5	3739,5

TGF-βί 5

NT1NPEASASPCCVSQ

DAAYCFRNVQ

DNCCLRPLY

DTQHSRVLSLY

DNCCLRPLY1

DTQHSRVLSLYNTIWPEASASPC

CVSQ

DLGWKWIHEPKGYWANFCASACP YLWSS

DLEPLTILYYIQKTPKIEQLSNM IVKSCKCS

pg <2,5 nmoles) de TGF-pl recombinante S~piridiletilado (preparado de modo semelhente a TGF-B2 recombinante S-piridiletilado) foram clivados com 1_?5 pg de endoproteinase Lis-C usando o mesmo processo da digestão de TGF-B2 excepto o tempo de incubação ser de 9 h e um gradiente linear de 12 a 27X de acetonitrilo sm 9© min foi usado numa coluna CÍB ívydac 2ÍBTP5205, 2,1x50 mm)„

Tempo ds	-S- S---5JULJ • = = £ 5 CD)	Massa M (u) Celoulsdâ	sequência do Keptídeo
	Retenção Crain)
	f-. 31 '7 ? ·*ΐ*	810,6	808,9	WIHEPK
—	J ·—1 X 1 j x_	619,2	617,7	DLGWK
	2®,4	1584,6	1584,6	ALDTNYCFSSTEK
J	?ζΖί _ Φ	1613,-3	1611,9	VEQLSMMÍVRSCK
50 , £5	1869,8	1868,3	NCCVRQLYIDFRK
	79,8	287552	2874,3	8YHANFCLSPCPY1WSLDTQYSK
	87 51	4189,1	4189.0	VLALYNQHNP8ASAAPCCVPQAL EPLPIVYYVSRKPK
	89,8	3965,®	3963,7	VLãLYNQHNPBASAAPCCvPQAL

EPLPIVYYVGRK

2© ug (1,46 nmoles) de TGF-R-3 recombinante S-piridilstilado (preparado de forma semelhante ao TBF~ô2 recombinante S-piridiletoxilado) foram digeridos com 0,4 wg de endoproteinase Asp-N como descrito para TGF-R2 excepto o tempo de incubação ser 22,5 horas e a separação ser efectuada numa coluna C18 (Vydac 218TP52©5₅ 2,1x5© mm) com um gradiente linear de 16 a 327 de acetonitrilo em 8© min=

	lempo de Retenção C min)	-Ϊ-* M.&.U 2 : - Π CD)	Massa M CD) Calculada	Sequência do reptideo
	*7 - v?	130E‘ , ©	1306,6	ENCCVRPLY
-	S 8	1381.®	1379,5	DTNYCFRNLE
	1 1 Π 6	1205,5	1206,3	DTTHSTVLGLY
		1252,4	125®,4	DTNYCFRNL
□	19-4	1421,5	1421,5	DTTHSTVLBLYNT
		1551,2	1551,9	. DLEPLT1LYYVBR

	3©30,4	3®29s4	DTTHSTVLBLYNTLNPEASASPC CVPQ
39,8	2782,6	2781,2	DTNYCERNLEENCCVRPLΥI
45,6	3457,3	3456,®	dlswknvhepkgyyanfcsgpcp

YLRSA

3726.5 3725,5 u

82,6

6736,9 6736.9

DLEPLTILYYVSRTPKVEQLSNMM VKSCKCS

DTTH8TVLBLYNTLNPEA3ASPC CVPQDLEPLT1LYYVSRTPKVEQL SNMVVKSCKCS δ» Caracterizacao estrutural do il3r--p2 monomérico sspresscs em

Saccharoíiiyces cerevisiae ΐ-

Uma amostra do fnsterial do exemplo 4,0 foi ainda purificado por RP-HPLC como descrita na Exemplo 4 = D e a sequência de aminoácidos N-terminal foi determinada como descrito no exemplo 4 = F,

A sequência de aminoácidos és .J 5 1Θ 15

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tir-X-Fen-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X20 25

X-Leu-Arg-Pro-Leu-Tir-Ile-Asp-Fen-Lís-Arg-Asp-Leu-Bli em que X significa um aminoácido não identificado positivamente,

R. Reenrolamento do TBF-β? monomérico expresso em Saccharomyces cerevisiae e isolamento e caracterização de TGF-β? dimérico reenrolamento do T8F~jJ2 monomérico expresso em Saccharomyces cerevisiae s o isolamento de TGF-p2 dimérico biologicamente activo foi efectuado como descrito no exemplo 4,S, 4,H s 4,1, respectivamente=

S« Massa molecular de iuF-p2 dimérico

Uma amostra de 6 pg de TGi-~B2 monomérico e de 2© μα de TBF-R-2 dimérico biológicamente activo obtido no exemplo 4, D e 4,1, respectivamente foi dissolvido em ácido acético a 25%, adsorvido em nitrocelulose e analisado num BID IDN 2© Plasmai Desorption Mass Spectrometer (Applied Biosystems, Uppssls, Sweoen)» As massas moleculares determinadas foram

M- 12^?73tí,ô para TBF = ís2 monomérico (Massa calculada M© 12^719,7)

M= 25^?422_s© para TBF-R2 dimérico (Massa calculada

M= 25^?421_g2 assumindo todas as císteinas como dissulfitos)

T. Massa molecular de TBF-R3 dímérics

TBF-B3 dimérico biologicamente activa foi preparado de modo semelhante a TBF-fiZ descrito nos exemplos 4»A» 4 = 3» 4»B» 4 = H s 4,1, A massa molecular de TSF-p3 dimérico biologicamente activo foi determinado como descrito no exemplo 4»S» A massa molecular encontrada foi;

M= 25*434,© (Massa calculada M= 25*42/,2 assumindo que todas as císteinas como dissulfitos)

EXEMrLQ bs lestes ds actividade in vitro pgra SGF-fil, TGl—p2 e TGF-B3

A. Migração celular e ensaio de crescimento ensaio baseia-se na actividade quimiotática de TGF-β em fibroblastos (Postlethwaite, A»E» et al. (1987) bsExp-ned, 165, 251) e foi efectuado como descrito por Burk, R» (1973) PNAS 7©, 369,

A actividade promotora da migração celular de TGF=B1, TGF~(52 e TGF-fs3 foi testada medindo o número de fibroblastos 373 normais de Balb/c que migram num período de cultura de 22 horas para uma cultura em monocamada ferida das referidas células em meio sem soro CDuIbecco^?s Modified Eagle Médium, Gibco) contendo TGE-fií, TBF-Í32 ou TGF-B3 respectivamente, comparado com o número de fibroblastos que migram para uma cultura em monocamada ferida na ausência de TBF--Í3,

A actividade promotora do crescimento de TSF-fil, TGF-Í32 e TGF-B3 foi determinada pelo efeito estimulador na sinisss ds DNA celular s divisão celular. Esta actividade é aparente nas referidas culturas em monocamadas observadas ao microscópio óptico após um período de cultura de 44 horas e é quantificado por ía) contagem do número de núcleos celulares, em qualquer campo de observação, nas culturas das referidas células cultivadas em meio sem soro contendo TGF-βΙ, TSF-B2 ou TSF-R3, respectivamente, comparado com o número de núcleos celulares contados, em qualquer campo, em culturas crescidas na ausência de TGF-ji ou

íb) medindo a actividade de incorporação de timidina marcada rad ioactivamente com ³H ern culturas das referidas células cultivadas em meio sem soro contendo TSF-βί, TSF-ÍÍ2 ou 7GF-js3, respectivamente, comparado com a quantidade de incorporação de ’^-’H-timidina em culturas cultivadas na ausência de TSF-β»

Nestas experiências de dose/resposta as concentrações cias proteínas TSF—fií, TGF-Í32 ou TGF-|33 (ver exemplo 4»K) na gama de 0,1 a 1000 pg por mililitro de meio de cultura são suficientes para induzir 5ôa da migração máxima s resposta de promoção do crescimento»

B= Ensaio de inibição do crescimento celular

D ensaio colorimétrico baseia-se no efeito inibidor de TGF-β no crescimento das células ds mslanoma humano A 375 (Brown, T»J = et sl» (1987) J„ Immunol» 139,2977)= As amostras de TGF-B1, TBF~R2 e TGF--.B3 foram diluidas seriadamente <ls3) em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano (Falcon) contendo meio EPMí-1640 (Gibco) e 5% de soro fetal de vitela- As cavidades testemunha receberam apenas meio» 1,5 χ 10⁴ células de melanoma A375 foram adicionados- a cada cavidade» Após um período de incubação de 72 noras a 37°C em 5% de C0„₅ as monocamadas de células A375 foram lavadas uma vez, fixadas e coradas com violeta ds cristal durante 15 minutos» 0 corante não ligado foi removido por lavagem intensa» As células coradas foram lisadas com ácido acético a 33% para libertação do corante (o qual está confinado aos núcleos celulares) e mediu-se a DO foi medido a 590 nm com um Multiskan—8 Channel Photomeier equipado com um Olivetti !j 24 PC para calcular a actividade dos compostos a testar» Uma vez que a intensidade de coloração em cada uma das cavidades está directa— mente relacionado com o númerods núcleos (e portanto com o número

υ —6à“

EXfcMFLu às lestes ds actividade in vivo para o resnrolamento_ds

TGF-βt_s T6F-B2 e T6F-B5

A. Cura de feridas com alguma espessura, enumurganhos velhos έ do conhecimento geral que os processos de cura de feridas torna-se dífioil con- a idade avançada (Grove, 6 = 0» C19Q2) Arch» Dermatol» Res» 272í3815 s portanto representam um grave problema no campo da medicina qriãtrica» Assim» os efeitos biológicos in vivo dos TGF~Bs diméricos, rsenrolados e activos na cura de feridas com alguma espessura (formadas por queimaduras do segundo grau) foram investigados numa situação de cicatrização de feridas parcialmente deficiente ou inibida, nomeadaments em animais velhos, usando o rpotocolo que se segue semelhante ao descrita por Schultz, G»S» et al» (1987) Science 235s35©»

Foram feitas danificações térmicas isoladas no tórax dorsal de ratinhos C57/BL6 velhos (com 45© ou mais dias ds idade) anestesiados» cujas costas foram préviamente barbeadas e depiladas com cortador de cabelo comercial, através de uma única aplicação de 1© segundos de um molde metálico Clxl cm, 8 g) que foi prêviamente equilibrado a 8©°C num banho maria» A bolha j resultante foi removida cirúrgicamente e as queimaduras tratadas diáriamente, durante 5 dias, com uma aplicção tópica de 25 μϊ de solução tampão veículo estéril (consistindo em ©,8% ρ/v de hidroxipropilcelulose numa solução de histidina. í© mM» NaCl 14© mM, pH 7,4) contendo várias quantidades (5©© ng, 1Θ© ng ou i© ng) ._x da forma de TGF-β dimérica, rsenrolada ε activa, ou com solução tampão sózinha ou deixadas por tratar» Todos os materiais aplicados tópicamente são estéreis, sem endotoxinas s sem pirogénios, e todos os murganhos foram colocados em gaiolas individuais durante a experiência» Cada grupo experimental consistiu em 5 animais»

Após 5 dias de tratamento com TGF—β, os murganhos foram anestesiados, as bolhas (se presentes) removidas cirúrgicamente das queimaduras e as queimaduras foram fotografadas» As áreas das squsimaduras que regeneraram o epitélio foram contornadas numa transparência de projector e a percentagem de cada uma das áreas tía queimadura inicial que se curou foi calculada por planimstrie» Os resultados foram também comparados com o processo de regeneração epitelial em murganhos C57/BL6 jovens C56--S4 dias ds idade) com queimaduras idênticas que foram deixadas por tratar durante a duração da experiência»

Um exemplo de tal experiência usando T(3F~|52 dimérico, reenrolado e activo está apresentado na tabel que se segue onde os valores mostrados representam a média e gama das avaliações dos grupos» ,ÍÍȣ㒠f^E·”3

Φ'

X νε X no

F*;

•v>

Jcs I Κη*%

X V3V3

J snf p$sn

C3 j

J

:Câ

1C •4- Ç»

Os resultados das análises planimétricas mostrados na tabela atrás demonstram que a aplicação tópica do TBF-B2 dimérico, rsenrolado © activo diariamente durante 5 dias num tampão veiculo adequado estimula e acelera a regeneração epitelial em feridas com alguma espessura em murganhos velhos numa forma dependente da dose (Grupos 1-3? quando comparado com tampão veículo apenas ou feridas não tratadas (Grupos 4 & 5 respectivamente)» Ds murganhos jovens são aparentemente suficientemente competentes para rs--epitslizar com êxito as suas feridas na ausência de qualquer TGF-β aplicado topicamente CGrupo 6)= As análises histológicas revelam o grau de aumenta do processo de re-epitelização juntamente com uma hiperquerafose da epiderme regenerada no dia 6 nas feridas tratadas com TGF—β»

B= Cura ds feridas profundas em ratos adultos

Os efeitos biológicos de TGf-f3s diméricos, reenrolados e activos foram também investigadas num segundo modelo de reparação de feridas in vivo, designadamente na cura de feridas profundas Cfonsadas por incisão cirúrgica) es ratos adultos, usando o protocolo que se segue semelhante ao descrito por Mustoe, T»fí = et al» CÍ9S7? Science 257s1533»

Incisões isoladas lineares de 5 cm de comprimento foram •feitas com tesoura cirúrgica 1,5 cm de ambos os lados da linha média dorsal de ratos machos Wistsr anestesiados com pentobarbitons (300-35© g) cujas costas foram préviamente barbeadas e depiladas com um cortador de cabelo comercial» Nos grupos experimentais, as arestas das incisões do lado esquerdo (observados com α 1 ad o dorsal para cima) receberam aplicações tópicas simples (1Θ® μΐ) ds um tampão veículo estéril (consistindo em 0,87 ρ/v de hidroxipropilcsluloss numa solução ds histidina Í0 mM, 14© mM NaCl, pH 7,4) contendo várias quantidades de (2 pg, lug, ®,1 pg

ou 0,01 μα) ds uma forma ds TSF-β dimérica» resnrolada e activa» As arestas das incisões contralaterais do lado direito receberam correspondentes quantidades iguais ds uma testemunha placebo (Albumina Sérica Bovina) no referido tampão veiculo e as arestas das incisões nos animais testemunha receberam tampão veículo acenas nas incisões do lado esquerdo e nenhum tratamento nas incisões do lado direitoapós corte cirúrgico» Todos os materiais aplicados topicamente estão estéreis, sem endotoxinas e apirogénicos. As arestas de cada uma das feridas foram então revestidas com 5 suturas de 5-Θ Ethilon horizontais, descontínuas colocadas ao acaso» Todos os animais foram colocados em gaiolas individuais separadamente e as feridas ficaram a cicatrizar durante períodos de tempo variáveis até 21 dias inclusive pés—tratamento» Após o sacrifício dos animais toda a pele dorsal de cada um foi removida e dissecada toda a gordura subcutânea da face inferior da pele usando um bistúri cirúrgico» Um molde consistindo em duas lâmina cirúrgicas paralelas (8 mm de distância entre as lâminas) foi então usado para retirar tiras de pele (entre suturas en* cada incisão) para medições ds força de resistência ã tracçao» Retirarara-se amostras de um extremo de cada incisão para análise histológica» A força máxima tolerada por cada amostra de pele retirada foi medida com um Universal Tensile Strength Machins Modsl 1445Θ1 (Zwick, Ulm, FRG)» As medições foram realizadas em tiras ds 3© mm x 8 mm que foram seguras entre ganchos hidráulicos e depois esticadas até ao ponto de ruptura a uma velocidade de 1® mm por minuto, com a aplicação máxima registada num registador» As medições forais feitas em amostras em triplicado de cada urna das feridas e os grupos experimentais consistiram em 4 animais» A força de ruptura não foi medida em feridas mostrando sinais de infecção ou com hemorregia significativa (menos de 3% de todas as feridas)= um exemplo de uma destas experiências usando IUI--B2

= ? rssn

UOSS de I til—β2 por incisSoipg)

Proporção de foPçtrde tracção do tratamento TGF-issPlacebo no

(^proporção ua tampão veiculo apenas v nenhum tratamento)

dos na tabela atrás demonstram que uma única aplicação tópica do TGF~B2 dimérico, reenrolado e activo num tampão veiculo adequada aumenta a força de ruptura até duas vezes e acelera a cura de feridas profundas causadas por uma incisão em ratos adultos de uma forma dependente da dose durante um período de tempo de 21 dias (grupos 1-4) quando comparado contra o grupo testemunha (Brupo 5)» As análises histológicas revelam o aumento marcado do influxo ds células isanonucleares, fibrofalastos e produção ds colgénio nas feridas tratadas com TBF-R durante um período de 21 dias comparado com as feridas testemunhas» Também è evidente uma hiperqueratose transitória nas feridas tratadas com TBF-R até aos 14 dias após o tratamento»

-= Modelo de implante de tsridas ea ratos adultos

Os efeitos biológicos dos TSF-Rs diméricos» reenrolados e activos foram também investigados num terceiro modelo in vivo de reparação de ferida» designadamsnte no que respeita ao crescimento celular, vascularização e formação de tecido de granulação fibroso dentro e à volta de um um implante consistindo numa câmara porosa sm ratos adultos baseado num protocolo semelhante ao descrito por Sporn, M=B» et al» (1983) Science 219g1529» Tubos vazios rígidos de polItetrafluoroetileno (diâmetros interno e externo de 10 e 12 mm respectivamente; 32 mm de comprimento), cada um perforado por aprosimadamsnte 25© buracos regulamente espaçados C1 mm de diâmetro) e fechados em cada um dos extremos com uma tampa removível de material idêntico, foram esterilizados com qás e Inseridos cirúrgicamente sufacutâneamente, da forma simétrica, através de pequenas incisões nos flancos dorsais de ratos Wistsr adultos (35Θ-40© g5 anestesiados com pentobarbitona» Uma gaiola de tecido esterilizada com gás foi implantada em cada um dos flancos e as

-74* Λ

incisões foram fechadas com um único agrafo cirúrgico (Clay-Adams Auto-Clipe, 9 mm) que foram removidos 5 dias após a cirurgia» Após a inserção cirúrgica as câmaras ficaram encapsuladas com tecido conjuntivo fibroso se bem que haja uma ausência relativa de células dentro das próprias câmaras» Este modelo proporciona um espaço estéril,definido e fechado dentro de cada uma das câmaras em que podem ser quantifiçados vários parâmetros de uma resposta de cicatrização de feridas.. Os animais foram usados em experimentação 14 dias após a implantação das câmaras após total cicatrização da incisão cirúrgica»

Nesta altura injecções diárias de 1©© ul de solução tampão estéril (consistindo em ®,©57 p/v de hidroxipropil celulose numa solução de histidina í© mn, 14© mM MsCl, pH 7,4) contendo varias quantidades Cl μα, ©,i μα ou ©,®1 μα) de uma forma de TGF-β dimêrico, reenrolado e activa foram dadas directamente nas câmaras do lado esquerdo (conforme observado com o lado dorsal para cima) » As- câmaras do lado direito receberam correspondem tes quantidades iguais de uma testemunha placebo (Albumina sérica bovina) na referido tampão veiculo» Os animais testemunha receberam apenas tampão veículo nas câmaras do lado esquerdo enquanto as câmaras do lado direita permaneceram não tratadas ao longo da experiência» Os grupos experimentais consistiram em 5 animais» As injecções foram dadas uma vez ao dia durante 5 dias e todos os materiais injecfados estavam estéreis, sem toxinas e apirogénicos» Todos os animais fora colocados sm gaiolas individuais durante a experiência e foram mortos 24 horas após- a última série de injecções» As câmaras foram então removidas de cada animal por técnica asséptica e o tecido fibroso da parte de dentro de cada câmara foi pesado» A proteína serosa total no fluido da câmara foi calculada usando o método de Lowry st al» (1951) d, Biol» Chem» 195s 26-5» Prepararam-se amostras de tecido fibroso removido de dentro e de fora de cada uma das câmaras para

análise histológica» A esterilidade testada por incubação das amostras de fluido da câmara em placas de infusão de cérebro/coração durante 72 horas a 37°C» Não houve crescimento mostrando ausência de infecção ou rejeição(menos de 37 de todas as câmaras)»

Um exemplo de tais experiências usando ΪΘΕ--β2 dimérico» reenrolado e activa esta apresentado na Tabela que se segue onde os valores apresentados representam as proporções médias das medições obtidas para proteína em 5 pares de câmaras (esquerda v direita) de cada grupo animais» (3 Π

J

tabela atrás demonstram que a injecção local de TBF-B2 dimérico, reenrolado s activo diáriamente durante 5 dias num tampão veiculo adequado aumenta até 3 vezes a acumulação de tecido fibroso total, numa forma dependente da dose, nas câmaras do lado esquerdo comparado com as câmaras contralaterais do lado direito que receberam correspondentes quantidades iguais de uma proteína placebo» Um aumento pequeno dependente da dose na quantidade de proteína serosa nas cãmras do ladoesquerdo também foi observado após injecçSes múltiplas com TBF-R2 (Bruços i-3) » Não surgiram diferenças aparentes entre as câmaras do lado esquerdo e direito no grupo testemunha (Brupo 5>»

Na biópsia post-mortem de animais nos Grupos 1-3 observou-se constantemente que as câmaras do lado esquerdo tratadas com TBF-β estão mais firmemente ligadas ao tecidoconjuntivo circundante do corpo do que as câmaras contra-laterais do lado direito que receberam injecçSes ds placebo» Ainda, as análises histológicas mostraram que a espessura e vasculsrida.de do tecido fibroso circundante das câmaras tratadas com TSF-β ê marcadamente superior do que as do tecido circundante das câmaras tratadas com placebo» Também são evidentes folhas ds fibroblastos migrantes e de células mononucleares dentro do tecido fibroso dentro das câmaras tratadas com TSF—β» Não ss observaram diferenças aparentes na espessura ou vascularidade do tecido fibroso envolvendo as câmaras, nem no grau de ligação das camârss ao tecido conjuntivo da parede do corpo no grupo testemunha (Brupo 4;» Estes resultados sugerem que a difusão do TBF-β a partir da câmara é responsável pelas diferenças observadas no efeito» Encontrou—se um. infiltrado estéril ds células inflamatórias, consistindo pretiomlnantemente em macrófaqos, no fluido seroso das câmaras tratadas com TBF-β, enquanto o fluido da câmara contra-lateral tratada com placebo mostra uma predominância de

leucócitos polimorfonucleares. Os conteúdos de um total de 40 câmaras nos Brupos 1-4 mostrados no Exemplo estavam estéreis após incubação das amostras dos conteúdos das câmaras na infusão de cérebro/coração durante 72 horas a 37 *C»

I

J.

AQiiiOGj ©Π X -3. r~*

Do υ.<Π CUQCh ampreendsndo ©,βί a 2Θ

X h-3.Fl ÍlSd j»V2 Z ÍTí 1 r₄ ΓΈ:

OOd Ο SO Γ Ο Γ od Li SÍdO ;S'O tl VcàfínSn tS «

Si:-s£?

B” Pomada

Ingredientes:

Trioisato ds sorbitano 5 = ©

Cêra,mierocristalína 3,®

Parafina líquida leve 9,®

Xsopropilmíristato 1©,®

Alcoóis de lanolina 3,®

Substância activa, proteína tipo TGF-β Ι,βχί®

Propilenoglicol 2,®

Glicerina 2,®

Sulfato de magnésio, hidrato ©,7

Água dssionisada 65,3

Preservativos q»s»

Dissolver a substância activa na fase aquosa, com aquecimento suave e dispersar a solução na fase lípidica fundida» Arrefecer até à temperatura ambiente s homoqsnizar» de modo semelhante pode ser produzida uma pomada compreendendo ©,©1 a 2® pg/ml₅ respectivamente» Desta pomada ·?

aplica-se ίϋ© μί/οπΛ ds ferida»

-X

C» Solução parenteral

Ingredientes?

Substância activa, proteína iAlbunsina sêrica humana

Arginina ou glicina tipo 1 mq/mí mg/ml mg/ml

S--20 mq/ml jH □ açúcar é glucose, manose, dextrano, amido hidroxieti-lado ou uma mistura deles,

Fizeram~se ampolas com ©,©5 mg de proteína tipo TSF-β/0,5 ml e liofilisaram-se.

Depósito de microorganismos

Os microorganismos que se seguem foram depositados na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen CDSM), Mascherodsr Wsg íb, D--330© Braunschwsíiy (FRG) s

Microorganismos

E, coliLC 137/pPLMu = hTSF-Bl E» coliLC i37/pPLMu,hTSF-f32 E* coliLC i37/pPLMu.hTGF-β3

a de depósito	Número de	acesso
de Novembro,1989	DSM	5656
ds Novembro,1989	DSM	5657
de Novembro,1989	DSM	5653
de Março,1986	DSM	3665

ί

SEQ ID NS 1

Tipo de Sequências Nucleótidos com correspondente polipsptídeo Comprimento da Sequências 339 pares de bases Tipo de Cadeias Dupla

Topologias Linear

Fontes cDNA humano

Fonte experimental imediatas E= coli LC 137/pPLMu»hTÊF-Bl ÍDSM 5656-3

Caracteristicass de 1 a 336 região codificadora de TGF-Ri

GCT Ala

TTG Leu

GAC Asp

ACC AAT

TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG

39

Thr

Asn 5

Tyr Cys

Phe

Arg Asn 10

Leu

Glu

Glu

AAC

TGC

TGT

GTG

CGC

CCC

CTC

TAC

ATT

GAC

TTC

CGA

CAG

78

Asn

Cys

Cys

Vai

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Gin

15

20

25

GAT Asp

CTG Leu

GGC TGG AAG Gly Trp Lys 30

TGG GTC Trp Vai

CAT GAA CCT AAG GGC

TAC Tyr

117

His

Glu 35

Pro

Lys

Gly

TAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

CCA

TAC

CTC

CGC

156

Tyr

Ala

Asn

Phe

Cys

Ser

Gly

Pro

Cys

Pro

Tyr

Leu

Arg

40

45

50

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

TAC

195

Ser

Ala

Asp

Thr

Thr

His

Ser

Thr

Vai

Leu

Gly

Leu

Tyr

55

60

65

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

234

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Cys

Cys

70

75

GTG

CCC

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

273

Vai

Pro

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

80

85

90

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

312

Vai

Gly

Arg

Thr 95

Pro

Lys

Vai

Glu

Gin 100

Leu

Ser

Asn

Met

GTG	GTG	AAG	TCT	TGT	AAA	TGT	AGC TGA	339
Vai	Vai	Lys	Ser	Cys	Lys	Cys	Ser

105 110

SEQ ID MS 2

Tipo de Sequências Nucleótidos com correspondente polipeptideo Comprimento da Sequências 339 pares de bases Tipo de Cadeias Dupla

Τ o po1og i as Linssr Fontes cDMA humano

X

Fonte experimental imediatas E» coli LC 137ZpPLMu„hTtjF--R2 CDBM 5657)

Característicass de 1 a 336 região codificadora de TGF-B2

GCT

TTG

GAT

GCG

GCC

TAT

TGC

TTT

AGA

AAT

GTG

CAG

GAT

39

Ala

Leu

Asp

Ala

Ala 5

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn 10

Vai

Gin

Asp

AAT

TGC

TGC

CTA

CGT

CCA

CTT

TAC

ATT

GAT

TTC

AAG

AGG

78

Asn

Cys 15

Cys

Leu

Arg

Pro

Leu 20

Tyr

Ile

Asp

Phe

Lys 25

Arg

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

ATA

CAC

GAA

CCC

AAA

GGG

TAC

117

Asp

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

Ile

His

Glu 35

Pro

Lys

Gly

Tyr

AAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

CCG

TAT

TTA

TGG

156

Asn 40

Ala

Asn

Phe

Cys

Ala 45

Gly

Ala

Cys

Pro

Tyr 50

Leu

Trp

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

TAT

195

Ser

Ser

Asp 55

Thr

Gin

His

Ser

Arg 60

Vai

Leu

Ser

Leu

Tyr 65

AAT Asn

ACC Thr

ATA Ile

AAT Asn

CCA GAA GCA TCT GCT

TCT CCT Ser Pro 75

TGC Cys

TGC Cys

234

Pro Glu 70

Ala

Ser

Ala

GTG

TCC

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

273

Vai

Ser

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

80

85

90

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

312

Ile

Gly

Lys

Thr

Pro

Lys

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Met

100

ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TAA Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser 105 110

339

•J

GCC	CTG	GAC	ACC	AAC	TAT	TGC	TTC
Ala	Leu	Asp	Thr	Asn 5	Tyr	Cys	Phe
•AAC	TGC	TGC	GTG	CGG	CAG	CTG	TAC
Asn	Cys 15	Cys	Vai	Arg	Gin	Leu 20	Tyr
GAC	CTC	GGC	TGG	AAG	TGG	ATC	CAC
Asp	Leu	Gly	Trp 30	Lys	Trp	ile	His
CAT	GCC	AAC	TTC	TGC	CTC	GGG	ccc
His 40	Ala	Asn	Phe	Cys	Leu 45	Gly	Pro
AGC	CTG	GAC	ACG	CAG	TAC	AGC	AAG
Ser	Leu	Asp 55	Thr	Gin	Tyr	Ser	Lys 60
AAC	CAG	CAT	AAC	CCG	GGC	GCC	TCG
Asn	Gin	His	Asn	Pro 70	Gly	Ala	Ser
GTG	CCG	CAG	GCG	CTG	GAG	CCG	CTG
Vai	Pro 80	Gin	Ala	Leu	Glu	Pro 85	Leu

AGC Ser	TCC ACG GAG AAG	39
Ser 10	Thr Glu Lys
ATT	GAC	TTC	CGC	AAG	78
Ile	Asp	Phe	Arg 25	Lys
GAG	CCC	AAG	GGC	TAC	117
Glu 35	Pro	Lys	Gly	Tyr
TGC	CCC	TAC	ATT	TGG	156
Cys	Pro	Tyr 50	ile	Trp
GTC	CTG	GCC	CTG	TAC	195
Vai	Leu	Ala	Leu	Tyr

GCG GCG Ala Ala 75	CCG Pro	TGC Cys	TGC Cys	234
CCC	ATC	GTG	TAC	TAC	273
Pro	Ile	Vai	Tyr	Tyr
			90

GTG	GGC	CGC	AAG	CCC	AAG	GTG	GAG
Vai	Gly	Arg	Lys 95	Pro	Lys	Vai	Glu

CAG	CTG	TCC	AAC	ATG	312
Gin	Leu	Ser	Asn	Met

100

TGA

ATC	GTG	CGC	TCC	TGC	AAG	TGC	AGC
Ile	Vai	Arg	Ser	Cys	Lys	Cys	Ser
105					110

339

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES lâ= - Processo para a produção de uma proteína tipo Factor de Crescimento Transformante tipo β CTFS-β) dimerico, biologicamente activo ou um seu sal, caracterizado por se submeter a forma monomérica desnaturada da referida proteína tipo TGF-fi a condições de reenrolamento.

   21, — Processo ds acordo coo? a reivindicação 1 caracterizado por as condições de reenrolamento incluírem um agente de solubilização.

   31. - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o agente de solubilização ser seleccionado do grupo constituido por um detergente suave, um solvente orgânico miscível em ãgua ou um fosfolípido, ou ou uma mistura de dois ou mais destes agentes»

   4s» - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma monomérica da referida proteína tipo

   TBF—(3 ser produzida pelos passos des

   Ca) cultura de um hospedeiro microbiano compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificadora da proteína tipo TGF-Js ligada na grelha de leitura correcta a uma sequência de controle da expressão de tal forma que é expressa a referida proteína, <b) recuperação da proteína tipo TBF-β numa forma desnaturada, monomsrica e solúvel.

   5ã« - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a proteína tipo TBF-R monomérica estar presente como um agregado insolúvel nas células hospedeiras microbianas e s por o processo compreender ainda os passos des

   Ca) isolamento da fracção proteica insolúvel em água contenda a proteína tipo TBF-β a partir das células hospedeiras e

   Cb) solubilizsção da proteína tipo TGF-β»

   6â» - Processo ds acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o hospedeiro microbiano ser uma levedura ou uma bactéria»

   7e» - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a sequência de nucleotídeos codificar urna proteína seleccionada do grupo constituído por TSF-Ri, TBF-R2 e TSF-R3»

   8s» - Processo de acordo com a reivindicação o caracterizado por o agregada insolúvel ser solubilizado a um pH desde aproximadamente 1 -até aproximadamente 4 resultante da proteína tipo TGF--R ser cromatografia„ e por o monomero purificado pior reivindicação

   9ãi» - Processo de acordo co® a caracterizado por a forma insolúvel da proteína tipo TSF-β ssr solutilizada a um pH de aproximadamente 2,5» lôâ» - Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o agregado insolúvel ser solubilizado com um agente caotrópico» llé» - Processo de acordo com a reivindicação 1© caracterizado por se usar como agente caotrópico ureia ou guanidina-Hol»

   12ã. - de acordo com a reivindicação íi caracterizado por O -SCI SFI TIS csotrópico ter uma . concentração de aproximadamente 4 até aproximadamente 9 M» 13s = - Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por se usar um detergente como agente caotrópico»

   14ã« - Processa ds acorda com a reivindicação 2 y-JI caracterizado por o monómero estar sujeito à condição de rsenrolamento compreendendo um sistema redox sulfidrilo/dissulfito de baixo peso molecular na presença de um agente de solubilização a um pH entre aproximadamente 6 e 1@ e a uma temperatura entre aproximadamente ft°C e 37°C»

   ISã» - Processo ds acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o sistema redox sulfidrilo/dissulfito ser seleccionado do grupo constituído por glutationa na sua forma oxidada e reduzida, ditiotreitol na sua forma oxidada e reduzida, li—rasrcaptostanol na sua forma oxidada e reduzida, cistina e a sua forma reduzida e cístamina e a sua forma reduzida numa concentração entre aproximadamente 1 e 1®0 mM, sm que a razão molara entre a forma oxidada e a reduzida está entre lOôsl -a ÍSÍ00= íóâ» - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o sistema redox sulfidrilo/dissulfito ser glutationa na sua forma oxidada e reduzida numa concentração entre cerca ds i s iS mM, em que a razão molar da forma oxidada e reduzida está entre ósí s ls6=

   Í7ã»

   Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o sistema redox sulfidrilo/dissulfito de baixo

   peso molecular ser SUbstituitíO por tio-redoxina ou dissulfito-isomerase numa con c en traç 3 o en tre cerca ds i® s 10®© pq/ml. 1SS. - Processo i de acordo com a reivindicação 17

   caracterizado por o sistema redox sulfidrilo/dissulfito de baixo peso molecular ser substituído por tio-redoxina numa concentração entre aproximadamente 5© e 20® p.g/ml.

   -J

   19s. - Processo caracterizado por o agente suave tis acordo com s reivindicação 3 de solubilização ser um detergente
2. 2®ã-« -· Processo de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por o detergente suave ser um detergente não-iónico, iónico ou zuiteriónico.

   21ã. - Processo de scortío com a reivindicação 19 caracterizado por o detergente ser seleccionado do grupo constituído por sulfobetaínas, 3”C3~-clolamidopropi1ídimeti1amonio—1—propana—sulfornato,

   3-<3~clolamidopropi1)dimetilamonio-S-nitiroxi-l—propano-sulfonato, digitonina, colato e dssoxicolato numa concentração entre aproximadamente lei®® mM.

   22ã = - Processo de acordo com a reivindicação lv caracterizado por o detergente ser 3-C3~clolamidopropil)dimeti1amonio-i-propano—sulfonato numa concentração entre cerca de 3® mn e 6® mM.

   23ã= - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o agente de solubilização ser um solvente

   -90.-

   24s. = — Processo de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o solvente orgânico mícivel em agua ser scetonitrilo, um alcanol inferior ou um alcandiol inferior, numa concentração entre cerca ds lô e 5® X por volume»

   25â, -- Processo de acordo com a reivindicação ã caracterizado por o agente ds solubilização ser um fosfolípido»

   26ã» - Processo de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por o fosfolípido ser seleccionado do grupo constituido por fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfafcidilserina e fosfstidilinositol numa gama.de concentrações de 0,1 a 5 mg/ml,

   27ã» ~ Processo de acordo com a reivindicação Í4 caracterizado por o pH ser cerca de 8,© e a temperatura ser cerca de 4*C»

   28ã» -- Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por as condições ds reenrolamento comtsrsm ainda iões metálicos numa concentração entre cerca de ©,©í e ί©© μΜ,

   29ã, ~ Processo de cordo com a reivindicação 23 carac terizado por os iões metálicos serem Cu‘ ou te'”' ,
3. 3©â» -· ' Processo de acordo com caracterizado por se fazer borbulhar CL, tampão, a reivindicação 14 através do sistema

   3íl» - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o sistema redox sulfidrilo/dissulfito ser entre aproximadamente i e oxidada e reduzida é de Isl a 1:2 e em que o agente de solubilização é 3~-{3~clolamidopropil )dimetilamonio-l-propano-sulfonato numa concentração entre cerca de 3@ mM e 60 mM»

   32â» - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a proteína dimérica obtida ser purificada por c raita t og rafia»

   Lisboa, 4 de Dezembro de 1990