DE19944626A1 - Verfahren zur Herstellung von dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der löslichen Überexpression der monomeren Formen der knochenmorphogenetischen Proteine als Fusionen am C-Terminus des Maltosebindungsproteins in einem E.coli-Stamm und deren Rückfaltung und Dimerisierung zu hohen Ausbeuten bei hohen Proteinkonzentrationen ohne Aggregation oder Präzipitation, wobei die Gewinnung der dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteine durch die Einwirkung einer Protease auf die dimeren Fusionsproteine erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein effektives Verfahren zur Herstellung von rekombinanten dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen (Bone morphogenetic proteins, BMPs) nach heterologer Expression in E. coli. Die durch dieses Verfahren hergestellten BMPs können für die Initiierung und Beschleuni­ gung der Knochenheilung und Knorpelgeweberegenerierung benutzt werden.

Die knochenmorphogenetischen Proteine als Mitglieder der großen Transforming growth factor-β (TGF-β) Superfamilie spielen eine wichtige Rolle in der Embry­ onalentwicklung und wirken als entscheidende Regulatoren der Gewebediffe­ renzierung und Organentwicklung. Sie wirken sowohl auf Osteoblasten und Chondrozyten, als auch auf andere Zelltypen. Diese multiplen Signale werden durch Interaktion der BMPs mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren ausgelöst.

Eine für die Medizin interessante Anwendung von BMPs als therapeutische Agentien beruht auf der Induktion der Neubildung und Regenerierung von Knochen und Knorpelgewebe. Bisher sind mindestens 15 verschiedene BMPs in der Literatur beschrieben worden. Sowohl BMP-Extrakte aus Wirbeltierknochen als auch rekombinant hergestellte BMPs wurden bereits im Tiermodell hinsicht­ lich ihrer osteoinduktiven Wirkung evaluiert. Jedoch steht BMP bisher nicht in ausreichender Menge für präklinische Tests und klinische Anwendungen zur Verfügung, da keine effektiven biotechnologischen Verfahren für deren Herstellung existieren.

Die rekombinante Produktion von humanen BMPs ist grundsätzlich in eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen durchführbar. Mit E. coli als rekombinantem Wirt werden inzwischen mehrere für die Humantherapie zugelassene Proteine hergestellt. Allerdings wird bei der Expression von eukaryotischen Proteinen in E. coli häufig die Ausbildung von unlöslichen Präzipitaten (inclusion bodies) beobachtet, da E. coli als prokaryotischer Wirt nicht in der Lage ist, die heterologen Proteine in ihre biologisch aktive Form zu falten. Dies trifft insbesondere auch für die BMPs zu, welche als Vorläufer bestehend aus einem Signalpeptid, einer Prodomäne und einer Carboxy- terminalen Region von 100-140 Aminosäuren synthetisiert werden. Im Bereich der carboxy-terminalen Region der meisten BMPs spielen 7 hochkonservierte Cysteinreste eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Homodimerisierung, welche nach proteolytischer Abspaltung der reifen C-terminalen Region erfolgt. Die biologisch aktiven Formen der BMPs besitzen als gemeinsames Struktur­ element einen sogenannten Cysteinknoten pro Monomereinheit, welcher durch 3 intramolekulare Disulfidbindungen ausgebildet wird. Die Dimerisierung erfolgt meist über eine einzelne intermolekulare Disulfidbrücke.

Aufgrund der beschriebenen Umstände ist es bis jetzt nicht gelungen, rekombi­ nante BMPs löslich in E. coli zu exprimieren und in allen publizierten Fällen wurde die Bildung von unlöslichen inclusion bodies beobachtet.

Für die Gewinnung von korrekt gefalteten heterologen Proteinen aus bakteriellen inclusion bodies sind diverse Methoden bekannt (Lilie H. et al., Current Opin. Biotechn., 9, 497-501 (1998)). Diese Renaturierungsmethoden beinhalten zunächtst eine Solubilisierung der Proteine aus den inclusion bodies durch komplette Denaturierung, in den meisten Fällen wird dafür ein chaotropes Agens benutzt. Wenn die Amino-säuresequenz des Proteins Cysteinreste enthält, ist es erforderlich, die Renaturierung in Gegenwart eines Redoxsystems durchzu­ führen, welches die korrekte Ausbildung von Disulfidbindungen ermöglicht.

In EP 0433225 und im US Pat. Nr. 5,650,494 wird ein Verfahren zur Herstellung von dimeren TGF-β-ähnlichen Proteinen, insbesondere TGF-β2 und TGF-β3, aus E. coli inclusion bodies beschrieben, gekennzeichnet durch Solubilisierung der unlöslichen monomeren Form durch ein chaotropes Mittel und deren Renaturierung in Gegenwart eines solubilisierenden Agens in Form eines milden Detergenz und eines Redoxsystems. Diese Methoden wurden auch zur Renatu­ rierung von humanem BMP-2 (Ruppert R. et al., Eur. J. Biochem., 237, 295-302 (1996)) und DPP (Drosophila Decapentaplegic Proprotein), einem BMP-2-Homo­ logen der TGF-β-Superfamilie (Groppe J. et al., J. Biol. Chem., 273, 29052-29065 (1998)) nach Überexpression in E. coli verwendet, wobei Gesamt­ ausbeuten von 0,5-1% (BMP-2) bzw. 7% (DPP) an biologisch aktivem Protein bezogen auf die inclusion body Fraktion erreicht wurden.

In den US Patenten Nr. 5,399,677 und 5,804,416 werden in E. coli exprimierte rekombinante BMP-Mutanten von BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7 gefunden, welche im Vergleich zu den Wildtyp-Proteinen ein verbessertes Renaturierungs­ verhalten bei Anwendung der in EP 0433225 beschriebenen Methoden besitzen. Unter Verwendung von ähnlichen Verfahren wurden TGF-β Fusionsproteine mit einem N-terminalem hexa-Histidyl-tag und einem Collagenbindendem Deka­ peptid aus E. coli inclusion bodies renaturiert (WO 98/55137 und Han B. et al., Protein Expr. Purif., 11, 169-178 (1997)).

Für die lösliche Expression von eukaryotischen Proteinen, welche in E. coli inclusion bodies bilden, sind Gen-Fusions-Expressionssysteme mit E. coli Thioredoxin (TrxA) (US Pat. Nr. 5,292,646), E. coli Disulfidoxidoreduktase (DsbA) (US Pat. Nr. 5,914,254) oder E. coli Maltosebindungsprotein (MBP) (US Pat. Nr. 5,643,758) mit Erfolg benutzt worden. So wurde die Expression von löslichen TrxA-BMP-2 (Lavallie E. R. et al., Biotechnology, 11, 187-193 (1993)) bzw. DsbA-TGF-β2 Fusionen (Zang Y. et al., Protein Expr. Purif., 12, 159-165 (1998)) in E. coli beschrieben, es wurden aber keine biologisch aktiven Proteine erhalten.

Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombi­ nanten dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen nach heterologer Expression in einem mikrobiellen Wirt, insbesondere E. coli. Die erfindungsgemäße Lösung beruht auf der unerwarteten und überraschenden Beobachtung, daß die monomeren Formen der knochenmorphogenetischen Proteine als Fusionen am C-Terminus des E. coli Maltosebindungsproteins in löslicher Form in mikrobiellen Wirten überexprimiert werden können. Über­ raschend wurde weiterhin gefunden, daß die löslichen MBP-BMP Fusions­ proteine in Gegenwart eines Renaturierungspuffers bei hohen Konzentrationen des Fusionsproteins zu hohen Ausbeuten rückgefaltet und dimerisiert werden, und daß die biologisch aktiven BMPs aus den dimeren Fusionsproteinen, welche pro Monomereinheit eine Protease-Erkennungssequenz enthalten, durch die Einwirkung einer Protease gewonnen werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von dimeren, biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteinen ist dementsprechend dadurch gekennzeichnet, daß die monomeren Formen der knochenmorphogenetischen Proteine als Fusionsproteine, bestehend aus E. coli Maltosebindungsprotein (MBP), einem Linkerpolypeptid inklusive Proteaseschnittstelle und einem knochenmorphogenetischen Protein (BMP), in löslicher Form in mikrobiellen Wirten überexprimiert und nach der Isolierung aus den Wirtszellen in einem Renaturierungspuffer bei hohen Proteinkonzentrationen ohne Präzipitationen zu hohen Ausbeuten rückgefaltet und dimerisiert werden, wobei die Gewinnung der biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteine nachfolgend durch die Einwirkung einer Protease auf die dimeren Fusionsproteine erfolgt.

Der Begriff knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) bezeichnet die biologisch aktiven, dimeren Formen von BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, bevorzugt die biologisch aktive, dimere Form von BMP-2. Die Konstruktion der BMP-Expressionsvektoren erfolgt nach Standardmethoden (Ausubel et al., Curr. Protocols Mol. Biol., Vol. 1-3, (1987 ff.)). Als Basisvektoren für die Expression von BMP-Fusionsproteinen eignen sich Vektoren, die eine induzierbare Expressionskassette, bestehend aus einem induzierbaren Promoter wie z. B. P_tac, dem malE Gen und einer multiple cloning site (z. B. pMal-c2; New England BioLabs, Inc.), enthalten. Das jeweilige Gen für BMP wird upstream mit verschiedenen Sequenzen versehen, die eine Erkennungssequenz für Endo­ proteasen wie z. B. Factor Xa oder Thrombin enthalten, durch die räumliche Struktur die Erkennung dieser Proteasesequenzen gewährleisten bzw. über zusätzliche Reinigungstags (z. B. (His)₆-tag) verfügen. Durch die Insertion der Expressionskassetten in den Basisvektor, z. B. pMal-c2, entstehen Vektoren für die zytoplasmatische Expression von Maltosebindungsprotein-BMP Fusions­ proteinen. Beispiele für DNA- und Aminosäuresequenzen im Linkerbereich der Vektoren für die Expression von humanem BMP-2 Fusionen sind in der folgen­ den Tabelle aufgelistet (vgl. SEQ ID NO: 1-10).

Die prokaryotischen MBP-BMP-Expressionsvektoren werden mit Methoden, welche dem Stand der Technik entsprechen, in kompetente bakterielle Wirts­ zellen transformiert. Die induzierte Expression der MBP-BMP Fusionsproteine erfolgt vorzugsweise in E. coli, z. B. wird der E. coli K12 Stamm RV308 (Maurer R. et al., J. Mol. Biol. 139, 147-161 (1980)) verwendet. Anstelle dieses E. coli- Stammes können andere dem Fachmann bekannte Stämme verwendet werden.

E. coli RV308 zeichnet sich dadurch aus, daß er in einem Glukose-Mineralsalz­ medium bei gesteuerter bzw. geregelter Zugabe der C-Quelle zu hohen Zelldichten kultiviert werden kann (Horn U. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 524-532, (1996)). Die Kultivierung von E. coli RV308 mit den jeweiligen Expressionsvektoren erfolgt unter aerob submersen Bedingungen bei 26-30°C mit maximaler spezifischer Wachstumsrate in einer batch-Phase ohne die Anhäufung inhibitorisch wirkender Stoffwechselprodukte und einer fed-batch- Phase bei partieller Substratlimitation. Anschließend erfolgt - bei bevorzugter Verwendung einer induzierbaren Expressionskontrolleinheit - die Induktion der Expression der MBP-BMP Fusionsproteine bei Trockenbiomasse (TBM)- Konzentrationen von 15-20 g/l durchs Zugabe des Induktors, bei Verwendung des Tac-Promoters beispielsweise von IPTG. In einem Zeitraum von 3-4 h nach der Induktion werden TBM-Konzentrationen von 35-55 g/l erreicht und die mono­ meren MBP-BMP Fusionsproteine mit einem Anteil 10-15% vom Gesamtzell­ protein in löslicher Form zytoplasmatisch akkumuliert.

Nach der Abtrennung und dem Aufschluß der E. coli Zellen können die Fusions­ proteine über die MBP-Domäne oder den hexa-Histidyl-tag aus den geklärten Zellaufschlüssen isoliert werden. Für die Reinigung der Fusionsproteine unter Nutzung der Affinität der MBP-Domäne können z. B. Amylose-Chromatographie­ medien verwendet werden, die nach Beladung und Wäsche mit einem Maltose beinhaltenden Puffer eluiert werden können. Eine Reinigung an Metallchelat- Chromatographiemedien durch Benutzung des hexa-Histidyl-tags im Linker­ bereich der Fusionsproteine ist ebenfalls möglich, jedoch ist die Reinigung unter denaturierenden Bedingungen, vorzugsweise in Gegenwart von 6 M Harnstoff durchzuführen, da die nicht nativ vorliegende BMP-Domäne offensichtlich die Zugänglichkeit des hexa-Histidyl-tags behindert. Die Elution erfolgt in diesem Fall ebenfalls mit einem denaturierenden Puffer, welcher Imidazol in geeigneten Konzentrationen enthält.

Die Eluate der Amylose-Affinitätschromatographie und Metallchelat- Chromatographie enthalten lösliche monomere MBP-BMP-Fusionsproteine in hochangereicherter Form, welche erfindungsgemäß ein ideales Zwischenprodukt für die Renaturierung und Dimerisierung der in den Fusionsproteinen enthaltenen BMP-Domänen darstellen, weil die fusionierten MBP-Domänen keine bei Redoxprozessen interferierenden Cysteinreste enthalten. Dabei erweist es sich als vorteilhaft, die MBP-BMP-Fusionsproteine in denaturierter Form für die Renaturierung und Dimerisierung einzusetzen. Die MBP-BMP- Fusionsproteine in den Eluaten der Metallchelat-Chromatographie liegen bereits in denaturierter Form vor, während die entsprechenden Fusionsproteine in Eluaten der Amylose-Affinitätschromatographie durch Zugabe von Harnstoff in fester Form bis zu einer Konzentration von 6 M denaturiert werden.

Die Renaturierung und Dimerisierung der MBP-BMP-Fusionsproteine wird durch eine Verdünnung der Eluate in einen frisch hergestellten Renaturierungspuffer initiiert, welcher ein chaotropes Mittel, ein mildes Detergenz, ein anorganisches Salz und ein Sulfhydryl/Disulfidredoxsystem enthält. Diese Verdünnung erfolgt erfindungsgemäß auf Proteinkonzentrationen von 0,5-1,5 mg/ml, wobei gleichzeitig eine Harnstoffkonzentration von 0,5-1,5 M in den Renaturierungs­ ansätzen eingestellt wird. Der Renaturierungspuffer besteht vorteilhaft aus 25-50 mM Tris/HCl, 0,75-1,5 M NaCl, 2 mM EDTA, 10-30 mM 3-(3-Cholamidopropyl)- dimethylamonio-1-propansulfonat (CHAPS), 2 mM reduziertem Glutathion (GSH) und 1 mM oxidiertem Glutathion (GSSG) mit einem pH von 8,0-9,0. Der Rück­ faltungsprozeß läuft bevorzugt bei einer Temperatur von 25°C in einem Zeit­ raum von 12-72 h ab und führt zu Ausbeuten von <50% dimerem Fusions­ protein. Der Verlauf der Renaturierung und die Dimer-Ausbeuten werden mittels SDS-Polyacrylamid Elektrophorese (SDS-PAGE) unter nichtreduzierenden Bedingungen untersucht. Im Vergleich zu den in EP 0433225 und in den US Pat. Nr. 5,650,494, 5,399,677 und 5,804,416 dargestellten Methoden zeichnet sich das in dieser Erfindung beschriebene Renaturierungsverfahren für rekombinante BMPs durch die hohen Proteinkonzentrationen in den Renaturierungsansätzen verbunden mit hohen Rückfaltungsausbeuten aus, wobei keine Präzipitate oder Agglomerate von Faltungsintermediaten ausbeutevermindernd auftreten.

Zur Entfernung der Renaturierungsreagenzien und zur Vorbereitung der weiteren chromatographischen Reinigung werden die Renaturierungsansätze durch Ultradiafiltration an Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 50 kDa in einen 20-30 mM Tris/HCl Puffer mit einem pH 8,5 umgepuffert. Der umgepufferte Renaturierungsansatz wird anschließend einer Anionen-Austauschchromato­ graphie unterzogen, indem es auf eine Chromatographiesäule gepumpt wird, welche mit einem Anionenaustauscher, z. B. Source 15Q, gepackt ist. Durch Elution dieser Säule mit einem Salzgradienten werden monomere und diniere MBP-BMP Fusionsproteine voneinander getrennt. Die Dinier-haltigen Fraktionen werden vereinigt und anschließend für die Abspaltung der MBP-Domänen je nach Art des Linkerpolypeptids mit geeigneten Mengen Faktor Xa oder Thrombin bei 25°C für 1-8 h inkubiert. Je nach Art des Expressionsvektors und der durch die Erkennungssequenz im Linkerpolypeptid determinierten Protease werden dimere, biologisch aktive BMPs mit bestimmten N-terminalen Amino­ säuresequenzen erzeugt, welche beispielhaft für rhBMP-2 in der folgenden Tabelle dargestellt sind (vgl. SEQ ID. NO: 11-14).

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß in E. coli RV308/pBF012Hisc bzw. E. coli RV308/pBF12hgc exprimierte MBP-BMP-Fusionsproteinen nach der in vitro Renaturierung und Dimerisierung der BMP-Domäne durch Proteolyse mit Faktor Xa zu dinieren BMPs mit einem nativen N-Terminus prozessiert werden können. MBP-BMP-Fusionsproteine mit einer Thrombinerkennungssequenz im Linker­ bereich ergeben nach Proteolyse Dimere mit mindestens 2 zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren.

Für die Isolierung der dimeren, biologisch aktiven BMPs von der abgespaltenen MBP-Domäne hat sich eine Umkehrphasen-Chromatographie (RP-HPLC) als besonders geeignet erwiesen. Dazu wird jeweilige Proteaseansatz mit 30% Acetonitril und 0,1% TFA versetzt und auf eine RP-HPLC Säule appliziert, welche z. B. mit SOURCE 15RPC gepackt ist, und mit einem Acetonitril­ gradienten in 0,1% TFA von 30-50% eluiert wird. Die BMP-Dimer haltigen Fraktionen werden vereinigt und können anschließend lyophilisiert werden.

Die Überprüfung der Aktivität der rekombinanten BMPs wird an einem Oberflächen-Plasmonresonanz Biosensor (BIACORE probe) anhand der spezifischen Bindung an die immobilisierte Ektodomäne des ALK3 Rezeptors (BMPR-IA/Fc Chimäre) durchgeführt. Die Bestimmung der in vitro biologischen Aktivität erfolgt durch die BMP induzierte Expression von alkalischer Phospha­ tase in C2C12 Zellen (Katigari T. et al. Exp. Cell Res. 230, 342-351 (1997)).

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sie sollen diese jedoch in keiner Weise limitieren.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 A. Konstruktion von pBF012c und pE3F012Hisc

Durch Fusion des 3567 bp Xmnl-Ndel Fragments von pMal-c2 (New England BioLabs) mit einem 2757 bp DNA Fragment, bestehend aus der Sequenz für rhBMP-2 (Genosys Biotechnologies Ltd.) und dem Pmel-Ndel-Fragment aus pBAD/gIII (Invitrogen) entsteht das Plasmid pBF012c. In dieses Plasmid wird mittels PCR Technologie eine für 6 × Histidin kodierende Sequenz unmittelbar vor die Factor Xa Erkennungssequenz eingefügt. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pBF012Hisc.

B. Fermentation von E. coli RV308/pBF012Hisc

Der MBP-BMP-Expressionsvektor pBF012Hisc wird mit Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen, in kompetente E. coli RV308 Zellen (ATCC 31608) transformiert. Ausgehend von einer Einzelkolonie erfolgt die Herstellung einer Kryokonserve (Microbank™, Pro-Lab Diagnostics), die bei -70°C gelagert wird. Eine Kugel dieser Konserve wird auf einer LB-Agarplatte mit 100 µg Ampicillin/ml ausgerollt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zusammen­ setzung der synthetischen Glukose-Mineralsalzmedien für die folgenden Vorkulturen und die Hauptkultur ist in Horn U. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 524-532, (1996) beschrieben. Eine Einzelkolonie wird zur Inokulation von 15 ml Vorkulturmedium benutzt. Die Kultivierung erfolgt über Nacht bei 26°C und 200 rpm. Diese Kultur wird zur Inokulation von 100 ml Vorkulturmedium auf eine OD₅₅₀ von ca. 0,01 genutzt. Nach einer Kultivierung über Nacht bei 26°C und 200 rpm wird eine OD₅₅₀ von 4-5 erreicht. Davon werden 8 (500 ml) Erlenmeyer­ kolben mit jeweils 100 ml Vorkulturmedium auf eine OD₅₅₀ von 0,2 inokuliert. Es schließt sich eine Kultivierung bei 26°C und 200 rpm an, bis eine OD₅₅₀ = 2 erreicht ist. Alle Vorkulturen enthalten 100 mg Ampicillin/l.

Nach Abschluß der letzten Vorkultur erfolgt mit dieser die Inokulation von 7,2 l Glukose-Mineralsalzmedium in einem 10 l Laborfermenter (B. Braun Biotech), so daß eine OD₅₅₀ von 0,2 erreicht wird. Die Kultivierung erfolgt unter aerob submersen Bedingungen bei einer Temperatur von 26°C, einem pH von 6,8, einem Überdruck von 50 kPa und einer Begasungsrate von 10 l/min. Im Fermentationsverlauf wird der pO₂-Wert über die Rührerdrehzahl bei 20% Sättigung und der pH durch geregelte Dosierung von 25%iger Ammoniaklösung bei 6,8 konstant gehalten. Nach dem Verbrauch der vorgelegten Glukosemenge, signalisiert durch einen Anstieg des pO₂-Wertes, wird die batch-Phase beendet. In der sich anschließenden fed-batch-Phase erfolgt die stetige Zugabe einer Glukose/Magnesiumsulfatlösung (670 g/l Glukose, 19,8 g/l MgSO₄.7H₂O) mit einer Dosierrate, die bei Einhaltung einer partiellen Glukoselimitation ein exponentielles Wachstum der E. coli Zellen mit einer Wachstumsrate von µ < µ_max = 0,23 erzwingt. Bei einer TBM-Konzentration von 16 g/l wird die Expression durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach einer Gesamtinduktionszeit von 4 h wird eine TBM-Konzentration von 36 g/l erreicht, die Feuchtbiomasse (1,44 kg) mit einer BECKMANN Avanti J-20 bei 9000 × g abzentrifugiert und bei -70°C in Portionen gelagert. Die Produktbildung wird mittels SDS-PAGE auf NOVEX NuPAGE 4-12% Gradientgelen und Coomassie Färbung untersucht. Das MBP-BMP-2 Fusionsprotein erscheint als eine 53 kDa Bande unter nichtreduzierenden Bedingungen. Bis zum Fermentationsende wird das monomere MBP-BMP Fusionsprotein (53 kDa) mit einem Anteil ca. 14% vom Gesamtzellprotein in löslicher Form zytoplasmatisch akkumuliert.

C. Reinigung des monomeren MBP-IBMP-2 Fusionsproteins

27,6 g gefrorene Feuchtbiomasse werden in 200 ml 4°C kaltem Aufschlußpuffer (20 mM Tris/HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 1 mM DTT, pH 7,5) resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wird zum Aufschließen der Zellen einmal bei einem Druck von 100 bar durch einen EmulsiFlex-C5 Hochdruckhomogenisator (AVESTIN, Inc.) gepumpt. Unlösliche Bestandteile des Zellaufschlusses werden 20 min bei 30.000 × g und 4°C abzentrifugiert (BECKMANN Avanti J-20, Rotor JA 20). Der Überstand wird anschließend durch eine 1,2 µm Membran filtriert und mit 800 ml kaltem Aufschlußpuffer verdünnt. Das geklärte Rohlysat wird mit einer Flußrate von 5 ml/min auf eine mit 8 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 50 ml Amylose Resin (New England Biolabs) gepackt ist (d = 2,6 cm, h = 9,4 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 12 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5 gewaschen und mit 3 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Maltose, pH 7,5 eluiert. Anhand der AU bei 280 nm wird eine Fraktion mit einem Volumen von 50 ml gesammelt, welche das MBP- BMP-2 Fusionsprotein mit einer Reinheit von <80% enthält.

D. Renaturierung und Dimerisierung des monomeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins

Das Eluat der Amylose Säule wird mit festem Harnstoff auf eine Konzentration von 6 M eingestellt und 1 : 6 in einen frisch hergestellten Renaturierungspuffer verdünnt, so daß eine Endkonzentration von 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 1 M NaCl, 30 mM CHAPS, 2 mM GSH, 1 mM GSSG mit einem pH von 8,5 eingestellt wird. Der Renaturierungsansatz wird 72 h bei 25°C in einem geschlossenem Behälter gelagert. Die Bildung von dimeren MBP-BMP-2 Fusionsproteinen wird mittels SDS-PAGE auf NOVEX NuPAGE 4-12% Gradientgelen und Coomassie Färbung untersucht. Das dimere MBP-BMP-2 Fusionsprotein erscheint als eine 110 kDa Bande unter nichtreduzierenden Bedingungen.

E. Reinigung des dimeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins durch Anionen- Austauschchromatographie

Der 300 ml Renaturierungsansatz aus Beispiel 1D. wird zunächst retentatseitig an einer Pellicon XL Filtereinheit mit einer Biomax 50 kDa Membran (Millipore) auf 150 ml eingeengt und durch Ultradiafiltration mit 600 ml 20 mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, pH 8,5 umgepuffert. Das verbleibende Retentat wird anschließend mit einer Flußrate von 10 ml/min auf eine mit 3 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, pH 8,5 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 150 ml SOURCE 15Q (Amersham Pharmacia) gepackt ist (d = 2,6 cm, h = 28,2 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 2 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, pH 8,5 gewaschen und mit einem NaCl-Gradienten (10 Säulenvolumen, 0-50% 20 mM Tris/HCl, 1 M NaCl, pH 8,5) eluiert. Anhand der AU bei 280 nm werden Fraktionen gesammelt. Nach Analyse durch SDS-PAGE auf NOVEX NuPAGE 4-12% Gradientgelen, werden die MBP-BMP-2-Dimer haltigen Fraktionen vereinigt. Die Proteinkonzentration im Pool der Anionen-Austausch­ chromatographie wird mit dem Coomassie Protein Assay Reagent Kit (PIERCE) bestimmt.

F. Proteolytische Spaltung des dimeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins mit Faktor Xa

Der Pool der Anionen-Austauschchromatographie (ca. 150 ml) wird mit 2 M CaCl₂ auf eine Endkonzentration von 2 mM eingestellt und mit Faktor Xa (NOVAGEN) auf ein Verhältnis von 11 Einheit Faktor Xa pro 50 µg Protein versetzt. Nach einer Inkubation von E3 h bei 25°C wird die Spaltung mit 1 mM Benzamidin abgebrochen.

G. Reinigung des dimeren BMP-2 durch RP-HPLC

Der Spaltansatz aus Beispiel 1F. wird mit Acetonitril auf einen Gehalt von 30% und mit TFA auf einen Gehalt von 0,1% eingestellt. Diese Lösung wird mit einer Flußrate von 10,6 ml/min auf eine mit 4 Säulenvolumen 0,1% TFA in 30% Acetonitril equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 65 ml SOURCE 15RPC (Amersham Pharmacia) gepackt ist (d = 2,6 cm, h = 12,2 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 2 Säulenvolumen 0,1% TFA in 30% Acetonitril gewaschen und mit einem Acetonitrilgradienten in 0,1% TFA (15 Säulenvolumen, 30-50% Acetonitril) eluiert. Anhand der AU bei 280 nm werden Fraktionen gesammelt. Nach Analyse durch SDS-PAGE auf NOVEX NuPAGE 4-12% Gradientgelen, werden die BMP-2-Dimer haltigen Fraktionen vereinigt. Das BMP-2 Dimer erscheint als eine 26 kDa Bande unter nichtreduzierenden Bedin­ gungen. Die Proteinkonzentration im Pool der RP-HPLC wird durch die Messung der Extinktion bei 280 nm gegen 0,1% TFA unter Benutzung des auf der Aminosäurezusammensetzung basierenden theoretischen Extinktionskoeffi­ zienten (Pace C. N. et al., Protein Science, 4, 2411-2423 (1995)) bestimmt. Aus dem Pool der RP-HPLC werden Portionen zu 100 µg BMP-2 lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

Beispiel 2 A. Konstruktion von pMalcbmp

Die Sequenz für rhBMP-2 (Genosys Biotechnologies Ltd.) wird zwischen Ncol und den mit Mung Bean Nuclease behandelten DraIII Ort in einen pET32a Vektor (Novagen) inseriert, bei dem die Sequenz zwischen der Erkennungs­ sequenz für Thrombin und dem Ncol Ort mit PCR Technologie entfernt worden war. Aus dem entstandenen Vektor wird das 526 bp MscI-HindIII Fragment isoliert und mit dem 6555 bp EcI136II-HindIII Fragment von pMal-c2 (New England BioLabs) fusioniert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pMalcbmp.

B. Fermentation von E. coli RV308/pMalcbmp und Reinigung des monomeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins

Der MBP-BMP-Expressionsvektor pMalcbmp wird mit Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen, in kompetente E. coli RV308 Zellen transformiert. Die Fermentation von E. coli RV308/pMalcbmp erfolgte wie in Beispiel 1B. beschrie­ ben. 20,9 g gefrorene Feuchtbiomasse werden in 200 ml 4°C kaltem Aufschluß­ puffer (20 mM Tris/HCl, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff, 1 mM PMSF, 20 mM Mercaptoethanol, pH 8,0) resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wird zum Aufschließen der Zellen einmal bei Einem Druck von 100 bar durch einen EmulsiFlex-C5 Hochdruckhomogenisator (AVESTIN, Inc.) gepumpt. Unlösliche Bestandteile des Zellaufschlusses werden 20 min bei 30.000 × g und 4°C abzentrifugiert (BECKMANN Avanti J-20, Rotor JA 20). Der Überstand wird anschließend durch eine 1,2 µm Membran filtriert. Das geklärte Rohlysat wird mit einer Flußrate von 10 ml/min auf eine mit 5 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff, pH 8,0 equilibrierte Chromatographiesäule gepumpt, welche mit 50 ml TALON Superflow (CLONTECH Laboratories Inc.) gepackt ist (d = 2,6 cm, h = 9,4 cm). Nach der Beladung wird die Säule mit 5 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff, 10 mM Imidazol, pH 8,0 gewaschen und mit 5 Säulenvolumen 20 mM Tris/HCl, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff, 100 mM Imidazol, pH 8,0 eluiert. Anhand der AU bei 280 nm wird eine Fraktion mit einem Volumen von 85 ml gesammelt, welche das MBP-BMP-2 Fusionsprotein mit einer Reinheit von <80% enthält.

C. Renaturierung und Dimerisierung des monomeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins

Das Eluat der TALON Superflow Säule wird 1 : 6. in einen frisch hergestellten Renaturierungspuffer verdünnt, so daß eine Endkonzentration von 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 1 M NaCl, 30 mM CHAPS, 2 mM GSH, 1 mM GSSG mit einem pH von 8,5 eingestellt wird. Der Renaturierungsansatz wird 24 h bei 25°C in einem geschlossenem Behälter gelagert. Die Bildung von dimeren MBP-BMP- 2 Fusionsproteinen wird mittels SDS-PAGE auf NOVEX NuPAGE 4-12% Gradientgelen und Coomassie Färbung untersucht. Das dimere MBP-BMP-2 Fusionsprotein erscheint als eine 110 kDa Bande unter nichtreduzierenden Bedingungen. Die weitere Reinigung des dimeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins erfolgt analog zu Beispiel 1E.

D. Proteolytische Spaltung des dimeren MBP-BMP-2 Fusionsproteins mit Thrombin

Der Pool der Anionen-Austauschchromatographie wird mit 0,5 M MgSO₄ auf eine Endkonzentration von 2,5 mM eingestellt und mit humanem Thrombin (Sigma) auf ein Verhältnis von 2 Einheiten Thrombin pro mg Protein versetzt. Nach einer Inkubation von 2 h bei 25°C wird die Spaltung mit 1 mM Benzamidin abgebro­ chen. Die Reinigung des dimeren BMP-2 durch RP-HPLC erfolgt wie in Beispiel 1G. beschrieben.

Beispiel 3 Herstellung von dimerem BMP-2 auf der Basis des Expressionssystems E. coli RV308/pBF012c

Die Herstellung des Plasmids pBP012c ist in Beispiel 1A. beschrieben. Die Fermentation, Renaturierung, Proteolyse und Reinigung erfolgt wie in den Beispielen 1B. bis 1G. beschrieben.

Beispiel 4 A. Konstruktion von pBF12hgsc

Durch Anwendung der PCR-Technologie wird der Expressionsvektor pBF12hgsc aus pBF012Hisc (Beispiel 1A.) konstruiert. Die Sequenz für die Aminosäuren GSGS wird mit geeigneten Primern vor die Faktor Xa Erkennungssequenz inseriert.

B. Herstellung von dimerem BMP-2 auf der Basis des Expressionssystems E. coli RV308/pBF12hgsc

Die Fermentation, Renaturierung, Proteolyse und Reinigung erfolgt wie in den Beispielen 1B. bis 1G. beschrieben.

Beispiel 5 A. Konstruktion von pMalxbmp

Der Expressionsvektor pMalxbmp wird mit PCR-Technologie direkt aus pMalcbmp (Beispiel 2A.) generiert. Durch Verwendung geeigneter Primer werden die Sequenzen für die Thrombinerkennungssequenz und rhBMP-2 fusioniert.

B. Herstellung von dimerem BMP-2 auf der Basis des Expressionssystems E. coli RV308/pMalxbmp

Die Fermentation, Renaturierung, Proteolyse und Reinigung erfolgt wie in den Beispielen 1B. bis 1E., 2D. und 1G. beschrieben.

Beispiel 6 Bestimmung der BMP-Konzentration mit BIACORE probe

Ein BIACORE Sensor Probe CM5 wird zunächst mit NHS und EDC (Amine Coupling Kit, Biacore AB) nach einer Standardvorschrift (Sensor Probe CM5 Handbook) aktiviert. Anschließend erfolgt innerhalb von 10 min die Immobili­ sierung von Streptavidin (Sigma) aus einer Lösung von 500 µg/ml in 10 mM NaAc, pH 4,7 an der Sensorspitze, wobei nach der Deaktivierung mit 1 M Ethanolamin, pH 8,5 ein Immobilisierungsniveau von 10-15 kRU Streptavidin erreicht wird.

Zu einer Lösung von 100 µg einer rhBMPR-IA/Fc-Chimäre (R & D Systems Inc.) in 100 µl 50 mM NaHCO₃, pH 8,2 werden 7,5 µl einer frisch hergestellten Lösung von 1 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin (PIERCE) in 1 ml H₂O gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur wird die Mischung in HBS-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20, pH 7,4) mit einer NAP-5 Entsalzungssäule (Amersham Pharmacia) umgepuffert. Das Volumen der umgepufferten Lösung mit der biotinylierten Rezeptorchimäre wird mit einer Ultrafree 0,5/10 kDa Zentrifugen-Filtrationseinheit (Millipore) auf 100 µl reduziert. Diese Lösung wird zur Immobilisierung der biotinylierten rhBMPR- IA/Fc-Chimäre an der mit Streptavidin modifizierten Sensorspitze benutzt, wobei ein Niveau von 10-12 kRU innerhalb von 1-5 min Kontaktzeit erreicht wird. Der so vorbereitete Sensor wird für die Generierung einer Standardkurve 1 min mit BMP-2 Lösungen in Referenzpuffer (0-50 µg/ml) kontaktiert. Nach 20 s wird die gebundene BMP-2 Menge als kRUs in Referenzpuffer gemessen. Der BMP-2 Standard wurde aus E. coli inclusion bodies (Ruppert R. et al., Eur. J. Biochem., 237, 295-302 (1996)) gewonnen. Die Regenerierung des Sensors zwischen den Messungen erfolgt innerhalb 1 min mit 10 mM Glycin/HCl, pH 1,7.

Zur Testung der spezifischen Bindung an den rhBMPR-IA Rezeptor werden jeweils 100 µg der nach Beispiel 1G. und 2D. hergestellten BMPs in 1 ml H₂O gelöst und 1 : 10 in Referenzpuffer auf eine Proteinkonzentration von 10 µg/ml verdünnt. Diese Proben werden an dem mit rhBMPR-IA beschichteten Sensor vermessen. Die BMP-Konzentration wird aus der Standardkurve berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Beispiel 7 BMP induzierte Aktivität der alkalischen Phosphatase in C2C12 Zellen

Die murine myoblastäre Zellinie C2C12 (ATCC Nr. CRL = 1772) wird in DMEM plus 10% FBS gehalten. Zum Testen wird die Kultur 1 : 4 bis 1 : 6 mit DMEM/2% FBS verdünnt. Jeweils 100 µl werden in den Vertiefungen einer 96-well Mikro­ titerplatte kultiviert. Am nächsten Tag wird das Medium gegen DMEM/2% FBS plus eine Verdünnungsreihe von BMP-2 ausgetauscht. Die höchste BMP-2 Konzentration liegt bei 0,5 bis 1 µM. Nach 3 Tagen wird das Medium abgesaugt, die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und dann mit 100 µl Aufschluß­ puffer (1% NP-40, 0,1 M Glycin/NaOH, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, pH 9,6) 1 h geschüttelt. Nach Zugabe von 100 µl ALP Puffer (0,1 M Glycin/NaOH, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, pH 9,6; 10 mg/ml p-Nitrophenylphosphat) wird nach 15 bis 30 min die Extinktion bei 405 nm gemessen. Der ED₅₀-Wert für BMP-2 liegt bei etwa 30 nM.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung von dimeren, biologisch aktiven knochenmorpho­ genetischen Proteinen (BMPs), dadurch gekennzeichnet, daß die monomeren Formen der knochenmorphogenetischen Proteine als Fusionsproteine, bestehend aus E. coli Maltosebindungsprotein (MBP), einem Linkerpolypeptid inklusive Proteaseschnittstelle und einem knochenmorphogenetischen Protein (BMP), in löslicher Form in mikrobiellen Wirten überexprimiert und nach der Isolierung aus den Wirtszellen in einem Renaturierungspuffer bei hohen Proteinkonzentrationen ohne Präzipitationen zu hohen Ausbeuten rückgefaltet und dimerisiert werden, wobei die Gewinnung der biologisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteine nachfolgend durch die Einwirkung einer Protease auf die dimeren Fusionsproteine erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als mikrobieller Wirt E. coli mit einem Expressionsplasmid verwendet wird, das eine für ein MBP-BMP Fusionsprotein kodierende DNA-Sequenz enthält, die unter der Kontrolle einer induzierbaren Expressions-Kontrollsequenz steht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkerpolypeptid Erkennungssequenzen für die Protease Faktor Xa oder Thrombin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkerpolypeptid zusätzlich einen hexa-Histidyl-tag enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung des mikrobiellen Wirtes zwecks Überexpression der Fusionsproteine bei hohen Zelldichten in einem Glukose-Mineralsalzmedium durch gesteuerte bzw. geregelte Zugabe der C-Quelle erfolgt, und anschließend die Produktbildung induziert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen nach der Kultivierung mittels Zentrifugation aus der Kulturbrühe abgetrennt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die löslich exprimier­ ten, monomeren MBP-BMP-Fusionsproteine durch Hochdruckhomogenisation aus den Wirtszellen freigesetzt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die löslichen monomeren MBP-BMP-Fusionsproteine mit einem Amylose-Medium durch Affinitäts- Chromatographie aus dem geklärten Zellaufschluß isoliert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die löslichen monomeren MBP-BMP-Fusionsproteine durch Metallchelat-Chromatographie aus dem geklärten Zellaufschluß isoliert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die löslichen monomeren MBP-BMP-Fusionsproteine aus den Eluaten der Amylose-Affinitäts- Chromatographie oder Metallchelat-Chromatographie auf eine Konzentration von 0,5 bis 1,5 mg/ml in einen Renaturierungspuffer, welcher ein chaotropes Mittel, ein mildes Detergenz, ein anorganisches Salz und ein Sulfhydryl/Disulfidredoxsystem enthält, verdünnt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß 3-(3- Cholamidopropyl)-dimethylamonio-1-propansulfonat (CHAPS) mit einer Konzen­ tration von 10-30 mM als mildes Detergenz verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung aus 2 mM reduziertem und 1 mM oxidiertem Glutathion als Sulfhydryl/Disulfidredoxsystem verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die löslichen monomeren MBP-BMP-Fusionsproteine bei 25°C in einem Zeitraum von 12-72 h rückgefaltet und dimerisiert werden, wobei Ausbeuten von <50% erreicht werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dimeren, biolo­ gisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteine durch die Einwirkung von 0,5-2 Einheiten Faktor Xa pro mg dimerem MBP-BMP-Fusionsprotein innerhalb von 4-8 h gewonnen werden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dimeren, biolo­ gisch aktiven knochenmorphogenetischen Proteine durch die Einwirkung von 1-4 Einheiten Thrombin pro mg dimerem MBP-BMP-Fusionsprotein innerhalb von 1-4 h gewonnen werden.