WO2002044203A2 - Herstellung von rekombinantem bmp-2 - Google Patents

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WO2002044203A2
WO2002044203A2 PCT/EP2001/013840 EP0113840W WO0244203A2 WO 2002044203 A2 WO2002044203 A2 WO 2002044203A2 EP 0113840 W EP0113840 W EP 0113840W WO 0244203 A2 WO0244203 A2 WO 0244203A2
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probmp
buffer
mature
bmp
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Rainer Rudolph
Elisabeth Schwarz
Gerhard Herr
Frank Hillger
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Scil Proteins Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of biologically active drBMP-2 (dr: digit removed) and homologous proteins by naturation of denatured, biologically inactive proBMP-2 and, if appropriate, subsequent cleavage of the propeptide, the natured proform of the protein being already biologically active , per BMP-2 as a new product and its use in the manufacture of an agent for promoting bone growth.
  • drBMP-2 digit removed
  • BMP-2 belongs to the Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) family. These are bone growth factors, the cloning and characterization of which was first achieved in 1 988. The characteristic property of these proteins is the ability to induce endochondral new bone formation [Wozney et al., Science 242 (1 988), 1 528-1 534].
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • BMP-2 belongs to the TGF-jff superfamily together with over 30 other proteins, which have a very high structural similarity to each other, although the sequence identity is partly is only below 30% [Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 93 (1 996), 878-883]. Its main structural feature is the so-called "cystine knot”. This is formed by four anti-parallel? -Strands, two of which are linked together via disulfide bonds. Two cystines together with the peptide structure form a ring through which a third disulfide bridge extends.
  • ß-leaflets are the dominant secondary structural element of these proteins. However, they are longer and more twisted here than in other / ff-rich proteins. Due to the structural relationship of the We postulated proteins of the TGF-? Family to each other that these proteins adopt their native conformation in a similar way, i.e. fold.
  • BMPs and related proteins such as DPP (Decapentaplegic, Drosophila) play an important role in the embryonic development of higher organisms.
  • Defects in BMP or BMP receptor genes or their regulation sometimes lead to severe developmental disorders, such as Fibrodysplasia ossificans progressiva [Kaplan et al., Calcif. Tissue int. 47 (1,990), 1,17-125; Rao et al., Hum. Genet. 90 (1,992), 299-302; Shaf ritz ef al., N. Engl. J. Med. 335 (1996), 555-561] and Dentinogenesis imperfecta [Tabas ef a /., Clin. Orthop.
  • BMP deletion mutants of the mouse die at the embryonic stage or shortly after birth and show malformations of the skeleton and the most diverse organs, such as the heart, kidney and eyes [Dudley ef al., Genes Dev. 9 (1 995), 2795-2807 ; Zhang and Bradley, Development 122 (1996), 2977-2986].
  • BMPs and similar growth factors are only of limited suitability for the treatment of systemic diseases, such as osteoporosis, because they can cause intolerable side effects, such as tumor promotion.
  • BMPs, in particular BMP-2 are rather predestined for local application. These include spinal fusions for degenerative spinal disorders, the regeneration of skull bones, jaw and facial surgery, and the treatment of complicated bone fractures of the extremities.
  • rhBMP-2 rh - recombinant human
  • Human BMP-2 is synthesized in the body in the form of a prepro protein 396 amino acids in length.
  • the signal peptide (pre-sequence) is used in vivo to transport the nascent polypeptide chain into the endoplasmic reticulum (ER).
  • ER endoplasmic reticulum
  • the protein folds to its native conformation, the disulfide bridges are formed (Cys 296 -Cys 361 , Cys 325 -Cys 393 , Cys 329 -Cys 395 , intermolecular: Cys 360 -Cys 360 ), and find it post-translational modifications instead.
  • the latter include the gl ⁇ cosylation of asparagine residues and the incomplete cleavage of the propeptide [Israel et al., Growth Factors 7 (1992), 139-150].
  • the C-terminal 1 14 amino acids (Gln 283 -Arg 396 ) of the precursor protein form the mature BMP-2, whose biologically active form is a disulfide-bridged (Cys 360 -Cys 360 ) homodimer.
  • the protein can be obtained in eukaryotic expression systems [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 87 (1 990), 2220-2224]. Disadvantages are the relatively small amounts of recombinant protein (25 ⁇ g of partially purified BMP-2 per 1 l of medium [Wozney et al., Science 242 (1988), 1 528-1 534]), the relatively high technical outlay and the resultant Costs.
  • the second way involves the use of prokaryotic expression systems. Their advantages lie in the simple technical handling, the low costs and the extraction of very high amounts of protein. In contrast to eukaryotes, however, bacteria are unable to process the precursor protein correctly. The method used hitherto is therefore limited to the expression of the mature domain of BMP-2 (Gln 283 -Arg 396 ). This occurs in the bacteria in an insoluble, biologically inactive form because, inter alia, because of the reducing conditions of the cytosol, the disulfide bridges of the protein cannot be formed. These insoluble protein aggregates are called inclusion bodies (IBs), their isolation and purification, for example, by Marston [Biochem. J. 240 (1 986), 1 -1 2].
  • IBs inclusion bodies
  • the present invention it is possible to achieve a yield of active protein that is over 25 times higher, based on the induced cell mass. Compared to expression in eukaryotic cells, the yield is even about three orders of magnitude higher.
  • the yields in the naturalization of mature BMPs expressed recombinantly in E. coli are very low due to the complicated disulfide pattern (cystine nodes).
  • the basis of the present invention is the hypothesis that the BMP-2 propeptide, like the propeptides of homologous proteins, is jointly responsible for the correct folding of the mature domain.
  • the method according to the invention for the recombinant production of a biologically active protein of the TGF-? Superfamily is characterized in that (a) a protein whose amino terminus consists of the prosequence of a protein of the TGF-? Superfamily or parts thereof to which the mature domain of this or another protein of the TGF-?
  • the superfamily which has at least 35% homology to mature BMP-2, is expressed in prokaryotes under conditions in which at least part of the protein is obtained in the form of inclusion bodies, ( b) the inclusion bodies are isolated and solubilized under denaturing conditions, (c) the naturalization, denatured, monomeric and biologically inactive protein solubilized from the inclusion bodies is naturalized, whereby the folding and dimerization to the soluble, biologically active conformation is made possible and (d) if necessary after the proteolytic release of the mature protein from the naturalization he takes Proform.
  • drBMP-2 is to be understood as the C-terminal domain of BMP-2 from Lys 290 , Arg 291 or Leu 292 (see example 2.2.1) to Arg 396 , the biological activity of which is described by Koenig et al., [Mol. Cell Biol. 14 (1 994), 5961-5974].
  • the amino acids (Gin 283 to Arg 289 , Lys 290 and Arg 291 ) mediate the binding of BMP-2 to heparin.
  • pro sequence Gly 20 -Arg 282
  • propeptide either the entire pro sequence (Gly 20 -Arg 282 ) or a part thereof can be used as the pro sequence or propeptide.
  • the protein When recombinant probmp-2 is overexpressed in the cytoplasm of prokaryotes, the protein accumulates there in the form of inactive, insoluble aggregates [inclusion bodies ⁇ ⁇ Bs).
  • the cells are first fermented by one or more of the usual methods (e.g. high-pressure dispersion, enzymatic lysis or ultrasound) digested, which is preferably done in a neutral to weakly acidic buffer solution, for example 0.1 M Tris / HCl pH 7.0.
  • the cellular DNA is broken down into fragments not cosedimenting with the IBs by mechanical, chemical or, preferably, enzymatic treatment.
  • Insoluble cell components, including the IBs are then separated from the soluble ones in any manner, with the separation being favored by centrifugation.
  • the pellet is washed with solutions which, due to their composition or additives, e.g. Detergents are able to solubilize interfering cell proteins and membrane building blocks but not the recombinant proBMP-2 from the IBs.
  • the remaining insoluble, proBMP-2-containing portion is subsequently solubilized, natured and enzymatically processed according to the invention.
  • the IBs are solubilized, using common denaturing agents (chaotropic substances) or combinations of these.
  • denaturing agents include guandinium salts, eg GdmCI or GdmSCN, as well as urea and its derivatives.
  • concentration of the denaturing agent or mixture is to be adjusted so that the recombinant, sparingly soluble protein can be completely solubilized. In the case of guanidinium chloride, these concentrations are in the range from 3-8 M and that of urea at 6-10 M.
  • a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or ?
  • the pH of the solubilization buffer is preferably adjusted between 8 and 9.
  • the pH of the IB solubilizate is preferred set to 5 or less and, again optionally, excess redox equivalents removed by dialysis, the dialysis buffer, apart from the reducing agent, advantageously having the same composition as the solubilization buffer.
  • the optional modification step and the removal of the excess reducing agent make it possible, if necessary, to pre-purify the IB solubilizate via immobilized metal affinity chromatography (IMAC) if the expression of proBMP-2 was carried out with an N-terminal histidine tag.
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • the process according to the invention for the naturation of rh-proBMP-2 involves reducing the concentration of the denaturing agent (s) to a level which does not act or has a weakly denaturing effect (e.g. ⁇ 0.5 M GdmCI). This is preferably done by slowly continuous or stepwise dilution of the solubilizate in naturalization buffer. In order to maximize the yield of biologically active protein, care must be taken that the mixing takes place as quickly and thoroughly as possible, which e.g. guaranteed by vigorous stirring.
  • dilution is dialysis of the solubilizate against naturation buffer.
  • the conditions must be chosen so that the formation of protein aggregates is minimal.
  • Naturation of the protein can take place during the initial dilution of the denaturing agent.
  • the final concentration of rh-proBMP-2 in the naturation buffer after dilution or dialysis is 10-1000 / g / ml, preferably
  • the pH of the naturation buffer used is 6.5-10, ideally 8-9. All buffers with a neutral to alkaline pK a , preferably tris and phosphate buffers, as well as combinations of these are suitable as buffers. It is also expedient to add low-molecular auxiliaries which increase the naturalization yield [US Pat. No. 5,593,865, Rudolph et al., 1995] to the naturalization buffer.
  • Naturation in the presence of L-arginine is particularly suitable, concentrations of 0.2-2.0 M, preferably 0.5-1.5 M L-arginine, being used.
  • Another component of the naturation buffer is, according to the invention, the combination of reduced and oxidized form of one or more thiol compounds.
  • Such combinations are, for example, reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione, cysteine and cystine, cysteamine and cystamine, and also R-mercaptoethanol and 2,2'-hydroxyethyl disulfide.
  • GSH reduced
  • GSSG oxidized glutathione
  • cysteine and cystine cysteamine
  • cystamine cysteamine
  • cystamine also R-mercaptoethanol
  • 2,2'-hydroxyethyl disulfide R-mercaptoethanol and 2,2'-hydroxyethyl disulfide
  • Glutathione in reduced (GSH) and oxidized (GSSG) form is preferably used in concentrations of up to 10 mM each, ideally in a ratio of 5 mM GSSG to 2 mM GSH.
  • the naturation buffer preferably contains one or more complexing agents, such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), in concentrations of up to 20 mM (preferably about 5 mM), on the one hand the uncontrolled, accelerated oxidation. to prevent the reduced thiol component by metal ions and on the other hand to inhibit metalloproteases by which the renaturate may be contaminated.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the naturalization is expediently carried out at temperatures of 0-20 ° C. above 1-21 d, preferably 5-10 ° C., 5-10 d.
  • dialysis is carried out according to the invention against a preferably acidic (pH 5 5) buffer which does not contain any low-molecular auxiliaries in the sense of the present invention.
  • the dialysis buffer corresponds to the method according to the invention if, as a result of the dialysis, incorrectly folded polypeptide chains and folding intermediates aggregate to the greatest possible extent and can thus be separated off by centrifugation, filtration or another customary method.
  • it is advisable to concentrate the naturation batch for example by cross-flow filtration, which can be followed by an additional incubation period under naturation conditions.
  • the ventilation of the buffer which may also happens in the process of concentration, and the oxidation of free thiol groups accelerates. This can also be achieved by adding oxidizing substances.
  • the separation of monomeric, incorrectly folded or non-dimerized, correctly folded species from the native, dimeric form of the renatured rh-proBMP-2 can be carried out according to the invention using chromatographic Separation processes are carried out, preferably using reversed-phase HPLC.
  • Particularly suitable column materials for this purpose are silica-based C4 matrices or polymer-based particles of comparable or stronger hydrophobicity, a pore diameter of> 300 ⁇ being recommended due to the size of the protein.
  • Suitable eluents are those customary in RP-HPLC, such as acetonitrile, 2-propanol or ethanol.
  • ion pair formers preferably trifluoroacetic acid or perfluorobutyric acid in the usual concentrations, are used.
  • proBMP-2 Another option for the purification of dimeric, naively folded proBMP-2 is the use of heparin affinity chromatography.
  • urea concentrations 2 to 8 mol 1 " ⁇ preferably 5 mol I " 1 are to be used as a buffer additive.
  • HiTrap Heparin Sepharose (Amersham Phamracia Biotech) is particularly suitable as a column material.
  • the monomeric forms of proBMP-2 are eluted from the matrix under 300 mol I "1 NaCl and the dimeric form at higher salt concentrations.
  • the naturation times required for maximum yields of correctly folded rh-proBMP-2 are much longer (1-21 d) than those for rh-proNGF (3 h).
  • the proform of BMP-2 like that of? -NGF, is processed in vivo by prohormone convertases of the furin type. These recognize a dibasic sequence motif at the end of the pro sequence. The last amino acid is Arg 282 .
  • the BMP-2 or jf? -NGF propeptide can be cleaved in vitro by proteases with comparable substrate specificity.
  • proBMP-2 The processing of the natural rh-proBMP-2, however, requires completely different conditions than those used for the cleavage of proNGF.
  • pro sequence of BMP-2 with 263 AS used according to the invention is considerably longer than the mature protein (1 14 AS)
  • proBMP-2 propeptide alone Gly 0 -Arg 282
  • proBMP-2 is therefore only soluble in high concentrations at pH ⁇ 5 without any solubilizing additives.
  • proteases trypsin, PACE (paired basic amino acid converting enzymes; eukaryotic endopeptidases that cut according to dibasic motifs)
  • trypsin paired basic amino acid converting enzymes; eukaryotic endopeptidases that cut according to dibasic motifs
  • all non-inhibiting solubilizers in particular urea or trishydroxymethylaminomethane (Tris), are used individually or in combination in concentrations of 1 -5 M or 0.1-2 M, preferably 2-4 M urea Combination with 0.1-1 M Tris.
  • these additives it is possible to keep proBMP-2 in solution in concentrations of> 1 mg / ml even in the pH optimum (7-8) of the proteases used.
  • the buffer conditions for proteolysis are expediently set by dialysis.
  • trypsin-like proteases are preferred which have a mass ratio of 1:10 to 1: 1,000 (trypsin, rh-proBMP-2) are used,. preferably from 1:20 to 1: 100.
  • Incubation is carried out over a period of 1 minute to 24 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, at a temperature of 0-37 ° C., preferably 10-25 ° C.
  • the solubilizer itself acts as a buffer substance and, in the case of urea, additionally Tris buffer in the stated concentrations.
  • a high concentration of Tris for example 0.5 M, also prevents the covalent modification of amino acid side chains by isocyanate possibly formed from the urea.
  • the pH is adjusted to a value which is favorable for the protease in question, preferably 7-8.
  • complexing agents e.g. 1 -20 mM EDTA, appropriate.
  • the proteolysis is by adding one or more protease inhibitors, preferably 1 -5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) or trypsin inhibitor from bovine pancreas or soybeans (BPTI / SBTI) in a 2-20-fold molar excess to trypsin, or by adjusting pH ⁇ 5 by means of Acid stopped [Rudolph ef al.,: Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach, TE Creighton (ed.), 2nd ed. (1997), 57-99].
  • protease inhibitors preferably 1 -5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) or trypsin inhibitor from bovine pancreas or soybeans (BPTI / SBTI)
  • the N-terminus of the mature BMP-2 (Gln 283 -Arg 291 ) is not structured and therefore sensitive to proteases. It also contains some arginine and lysine residues (Arg 289 - 291 , Lys 285,287 ' 290 ).
  • the limited proteolysis with trypsin which preferably cuts after these basic amino acid residues, also leads to the cleavage of the flexible N-terminus from mature BMP-2.
  • the biological activity of the drBMP-2 obtained was demonstrated in animal experiments. According to the invention, it is possible to introduce an additional disulfide bridge for fixing and stabilizing the N-terminus of mature BMP-2, for example similar to that used in the related TGF- /?
  • the precipitated drBMP-2 can then, after separation from the supernatant, be solubilized again in suitable buffers or solvents.
  • This change is preferably carried out at precipitating conditions in the presence of suitable column material, in particular "Fractogel EMD Phenyl S" (Merck) or comparable materials, such as phenylsepharose (Pharmacia), by dialysis. If the material is used in large excess, it can be achieved that the protein binds to it before it aggregates. After the column material has been loaded with protein in this way, the unwanted components can be removed by suitable washing steps.
  • the elution of the drBMP-2 is expediently carried out under mild to strongly denaturing, but in no way reducing conditions.
  • eluents are suitable, inter alia, arginine, urea or guanidinium salts, which can also be used in low concentrations for washing the column material.
  • the frBMP-2 fractions are combined if necessary and dialysed particularly preferably against 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) or ammonium acetate, which are very suitable solvents for the eventual application of BMP-2.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Mature BMP-2 renatured according to the invention and obtained after cleavage of the pro-sequence, can be used in the usual manner for promoting bone growth.
  • the renatured proBMP-2 itself which still contains the entire or a shortened pro sequence, is equivalent in its biological effectiveness to the mature BMP-2 and can be used like this.
  • the invention therefore also relates to a medicament containing proBMP-2 as active ingredient for promoting bone growth. It can contain the complete or a truncated pro sequence.
  • proBMP-2 a combination of proBMP-2 with various medical implant materials for temporary bone replacement (bone replacement materials) and for permanent bone and joint replacement (metal implants, such as hip and knee endoprostheses) is preferably used in traumatology, orthopedics, ENT, maxillofacial surgery and neurosurgery.
  • proBMP-2 can be used as a subsequent implant coating in the form of a thin protein film adhering to all inner and outer surfaces with and without an adhesion promoter (eg silane).
  • an adhesion promoter eg silane
  • proBMP-2 can be used as an integral part of implants by replacing the non-solid educts with chemical ones Polymerization or hardening producible solid end products is added (eg calcium phosphate cements such as Norian SRS, Ostim and others).
  • inorganic and organic materials of natural and artificial origin As implants for transient bone replacement, inorganic and organic materials of natural and artificial origin as well as mixed forms of both come into question.
  • inorganic bone substitute materials are ceramics made from hydroxyapatite, beta-tricalcium phosphate, alpha-tricalcium phosphate, glass ceramics, bio glasses, calcium carbonates, calcium sulfates and other calcium salts, not listed, in crystalline and amorphous form, including injectable calcium phosphate-based bone cements.
  • Endoprostheses and other metal implants such as those for vertebral body stabilization are suitable for permanent bone replacement. These are usually products made of various stainless steels and titanium alloys, some of which are also coated with hydroxylapaptis.
  • proBMP-2 with the complete or truncated pro sequence to which the mature BMP-2 is bound, a medicament containing this substance and a method for producing a medicament for promoting bone growth, as defined in the patent claims.
  • the complete sequence of proBMP-2 from Gly 20 -Arg 396 including 20 amino acids His-Tag and the start codon Met is shown in Table 2.
  • the amino acids Met1 to His20 are part of the His tag encoded by pET-15b.
  • the pro sequence of BMP-2 starts at Gly22.
  • the additional methionine is located between His day and pro sequence.
  • Gly22 to Arg 398 in the sequence shown here correspond to Gly20 to Arg396 in the primary Translation product of the human pre-ProBMP-2 cDNA, to which the sequence information in the text relates.
  • Figure 1 an SDS-PAGE electropherogram
  • Figure 2 UV-CD spectra
  • Figure 3 emission spectra, each from proBMP-2
  • Figure 4 an SDS-PAGE electropherogram
  • Figure 5 an RP-HPLC chromatogram
  • Figure 6 UV-CD spectra
  • Figure 7 MALDI-TOF mass spectrogram, each from drBMP-2
  • FIG 8 an RP-HPLC diagram of rh-proBMP-2
  • Figure 9 histological section of a rh-proBMP-2 implant. Both the inner and the outer surface of the ceramic are covered with bone. The inside of the pores contains bone marrow with numerous fat cells (implant material - dark, bone - light blue). At the bottom left are some muscle fibers (dark blue) and connective tissue.
  • FIG. 10 Histological section of a rh-proBMP-2 implant in high magnification.
  • the bone material top left to bottom right, light blue
  • the ceramic material covers (right, gray).
  • Active osteoblasts are in a row between the bone and the hematopoietic tissue.
  • Figure 1 1 a comparison of the activity of AP in the
  • Embodiment 1 Production of proBMP-2
  • the pcDNA3 vector with inserted pre-probed 77p-2 cDNA served as the starting DNA.
  • the polymerase chain reaction (PCR) was used for the amino acids Gly 20 to Arg 396 of
  • the primers also contained a Nde ⁇ - (5'-) and a t5a / 77HI interface (3'-end). This enabled the subsequent one
  • This vector additionally encodes an N-terminal 6-histidine tag, by means of which the expression rates in E. coli could be increased considerably.
  • nucleotide sequence was determined by means of DNA sequencing [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 74 (1977), 5463-5467].
  • E. coli BL21 (DE3) served as the host strain.
  • the chromosome of these bacteria contains the gene for T7 RNA polymerase, which is under the control of the / ac promoter. Expression of the polymerase can thus be induced by isopropyl-? -D-thiogalactoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl-? -D-thiogalactoside
  • the probmp-2 gene is controlled by a T7 promoter. Induction with IPTG consequently leads to the formation of proBMP-2.
  • the cells were cotransformed with pUBS520.
  • This plasmid contains the gene for an arginine tRNA (dnaY), which is rare in E. coli.
  • the arginine codons (AGA and AGG) recognized by this tRNA are found particularly frequently in eukaryotic genes, including probmp-2.
  • the expression rate of such genes in E. coli depends, among other things. on the availability of this tRNA [Brinkmann et al., Gene 85 (1 989), 109-1 14].
  • IBs inclusion bodies
  • Heparin affinity chromatography on a 1 ml HiTrap Heparin Sepharose was used as the second cleaning method.
  • the proBMP-2-IB solubilisate was used for the naturation with 4 M GdmCI pH
  • the concentration of proBMP-2 was finally 3-4 pM (corresponds to 135-180 pg / ml).
  • the solubilizate was added slowly ( ⁇ 20 ml / h) and with stirring and the mixture was incubated at 5 ° C. for 7 d.
  • the DTT residues introduced with the solubilizate are equivalent to a concentration of a maximum of 0.4 mM GSH.
  • the folding approach was concentrated by means of cross-F / ⁇ w filtration (Filtron Minisette, membrane: 30 kDa open channel). The concentrate was then dialyzed against five times 20 volumes of 50 mM Na acetate pH 5.0 for 24 h each and then aggregated protein was centrifuged for 2 h at 75,000 g. The amount of the protein remaining in solution was determined by absorption at ⁇ - 280 nm and was reproducibly approx. 50%, based on the protein content of the IB solubilizate used.
  • Cleaning proBMP-2 RP-HPLC was used for the analytical or semi-preparative separation of the (incorrectly or correctly folded) monomeric species from native, dimeric rh-proBMP-2.
  • a protein RP column (1 50 x 3.6 mm, YMC) with 0.1% perfluorobutyric acid (HFBA) in H 2 O or ACN was used as the eluent (see Figure 8).
  • HFBA perfluorobutyric acid
  • a separation of monomer and dimer was also achieved with trifluoroacetic acid as ion pair former.
  • the dimer elutes later than the monomer or the monomeric, misfolded species due to its higher hydrophobicity.
  • a column with Source1 5 RPC material (Pharmacia) was used on a semi-preparative scale. The separation profile and the recovery rate (approx. 70%) were comparable to the analytical scale.
  • the SDS-PAGE analysis showed a high purity (> 90%; Figure 1, lane 2-5) of the proBMP-2-IBs prepared according to the invention, so that they could be used for naturation without prior cleaning.
  • the fluorescence and CD spectrometric analyzes carried out with naturalized and again denatured proBMP-2 show clear indications of the presence of secondary and tertiary structures.
  • the shift in the emission maximum of fluorescence from naturalized proBMP-2 to lower wavelengths compared to the denatured protein (Figure 3) is typical for the formation of native tertiary structures.
  • the tryptophan residues of the protein (5 tryptophans per polypeptide chain perBMP-2) get from the polar environment of the solvent into the apolar core of the folding protein, where they are also sterically fixed. Due to the reduced loss of excitation energy, light of higher frequency is emitted. [Schmid: "Optical spectroscopy to characterize protein conformation and conformational changes.” in “Protein Structure: A Practical Approach”, TE Creighton (ed.), 2nd ed. (1,996), pp. 261-297]. It is also clear from the fluorescence spectra that the structure of proBMP-2 undergoes a change at low pH, ie in the range of high solubility of mature and proBMP-2. As our experiments have shown, this can be attributed to partial unfolding of the propeptide (data not shown). MALDI-TOF mass spectrometry and N-terminal sequence analysis
  • the osteoinductive activity of the modified rh-proBMP-2 and rh-drBMP-2 was tested in the ectopic bone induction model on small laboratory animals.
  • defined amounts of the respective factor to be tested 40-200 pg; drBMP-2 or proBMP-2) were applied after sterile filtration to sterile cubic, chemically and pharmacologically inert ceramic implant bodies made of ß-lCP.
  • the factor-coated implants and uncoated but otherwise identical control implants were implanted in 8 adult laboratory rats in the anterior abdominal wall muscles. For this purpose, several, approx. 1 cm long surgical incisions were made into the skin and the uppermost muscle layer underneath after anesthesia. A blunt preparation created a cavity between the two oblique layers of abdominal muscles, the implants were inserted into them and the wounds were closed with surgical sutures. After 30 days of lying, the animals were sacrificed and the implants with the surrounding tissue removed and examined macroscopically and histologically for new bone formation. With all factor-coated implants, new bone formation, accompanied by the formation of hematopoietically active bone marrow, could be clearly determined histologically (see Figures 8 and 9).
  • the enzyme activity in the rh-pro / drBMP-2-containing samples is significantly increased compared to the (-) - controls, but that of the rh-drBMP-2 samples compared to those with rh-proBMP-2 only slightly and not in every Case (exceptions: Tier 4, 6 and 8).
  • rh-proBMP-2 approximately 45 kDa
  • rh-drBMP-2 approximately 45 kDa
  • rh-proBMP-2 in this animal model has an activity which is comparable to the (truncated) mature form of the protein and induces new bone formation.
  • Table 1 Comparison of the activity of alkaline phosphatase in the implants coated with drBMP-2 or proBMP-2 (in U) -TCP
  • Embodiment 2 Obtaining biologically active drBMP-2 Limited proteolysis of rh-proBMP-2
  • rh-proBMP-2 For the preparative proteolysis of rh-proBMP-2, 50 ml of the naturalized protein was dialyzed against 0.1 M Tris / HCl pH 7.0, 4 M urea, 1 mM EDTA. Aggregates were separated by centrifugation (75,000 g, 1 h) and the protein concentration was determined spectrophotometrically (1, 3 mg / ml). Dialysis losses were 13%. Trypsin (Röche Diagnostics) was used in a ratio of 1: 100 (trypsin: proBMP-2; w / w) and the mixture was incubated for 4 h at 5-7 ° C.
  • the ratio of the different species to each other is about 3: 2: 1 (a: b: c).
  • the cysteines could not be detected, but the following amino acids.
  • the sequence was fully verified at the DNA level. This corresponds to the N-terminus of mature BMP-2 without the heparin binding site.
  • drBMP-2 was used in a reduced and non-reduced form for sequencing. The unreduced form could only be sequenced up to the second serine, which suggests that the subsequent residue is a cystine, that is, part of a disulfide bridge.
  • the proteolysis product thus corresponds to a mature BMP-2 shortened by N-terminal by 7-9 amino acids, which thus lacks the heparin binding site.
  • the size and purity of the drBMP-2 obtained according to the invention was checked using SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions and subsequent silver staining (lanes 6 and 11 in Figure 4). It is 100% dimerized with a purity of over 95%.

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Abstract

Zur rekombinanten Herstellung eines biologisch aktiven Proteins der TGF-β-Superfamilie wird ein Protein dessen Aminoterminus aus der Prosequenz eines Proteins der TFG-β-Superfamilie oder Teilen davon besteht, an den sich die reife Domäne dieses oder eines anderen Proteins der TGF-β-Superfamilie, das mindsten 35 % Homologie zu reiferm BMP-2 aufweist anschlieβt, in Prokaryonten unter Bedingungen exprimiert, bei denen wenigstens ein Teil des Proteins in Form von Einschlusskörpern erhalten wird, die Einschlusskörper werden isoliert un unter denaturierenden Bedingungen solubilisiert, das aus den Einschlusskörpern solubilisierte, denaturierte, monomere und biologisch inaktive Protein wird naturiert unter Faltung und Dimerisierung zur löslichen, biologisch aktiven Konformation und gegebenenfalls nach der Naturierung das reife Protein aus seiner Profrom proteolytisch freigesetzt.

Description

Herstellung von rekombinantem BMP-2
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktivem drBMP-2 (dr: digit removed) und homologer Proteine durch Naturierung von denaturiertem, biologisch inaktivem proBMP-2 und gegebenenfalls anschließender Abspaltung des Propeptids, wobei bereits die naturierte Proform des Proteins biologisch aktiv ist, pro BMP-2 als neues Produkt und dessen Verwendung zur Herstellung eines Mittels zur Förderung des Knochenwachstums.
BMP-2 gehört zur Familie der Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). Es handelt sich dabei um Knochen Wachstumsfaktoren, deren Klonierung und Charakterisierung erstmals 1 988 gelang. Die charakteristische Eigenschaft dieser Proteine ist die Fähigkeit zur Induktion endochondraler Knochenneubildung [Wozney et al., Science 242 (1 988), 1 528-1 534].
Strukturell zählt BMP-2 zusammen mit über 30 weiteren Proteinen zur TGF-jff-Superfamilie, welche eine sehr hohe strukturelle Ähnlichkeit untereinander aufweisen, obwohl die Sequenzidentität z.T. nur unter 30 % beträgt [Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (1 996), 878-883]. Ihr wesentliches Strukturmerkmal ist der sogenannte "Cystin-Knoten". Dieser wird durch vier antiparallele ?-Faltblattstränge gebildet, von denen je zwei über Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind. Dabei formen zwei Cystine zusammen mit dem Peptidgerüst einen Ring, durch den sich eine dritte Disulfidbrücke erstreckt.
ß- Faltblätter sind das dominierende Sekundärstrukturelement dieser Proteine. Sie sind hier jedoch länger und stärker verdreht als in anderen /ff-faltblattreichen Proteinen. Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft der Proteine der TGF- ?-Familie zueinander haben wir postuliert, dass diese Proteine auch auf ähnliche Weise ihre native Konformation einnehmen, also falten.
BMPs und verwandte Proteine, wie DPP (Decapentaplegic, Drosophila), spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung höherer Organismen. Defekte in BMP- bzw. BMP-Rezeptorgenen oder deren Regulation führen zu z.T. schweren Entwicklungsstörungen, wie z.B. Fibrodysplasia ossificans progressiva [Kaplan et al., Calcif. Tissue Int. 47 (1 990), 1 17-125; Rao et al., Hum. Genet. 90 (1 992), 299-302; Shaf ritz ef al., N. Engl. J. Med. 335 (1996), 555-561 ] und Dentinogenesis imperfecta [Tabas ef a/., Clin. Orthop. 293 (1993), 310-31 6]. BMP-Deletionsmutanten der Maus sterben bereits im Embryonalstadium oder kurz nach der Geburt und weisen Fehlbildungen des Skeletts und den verschiedensten Organen, wie Herz, Niere und Augen, auf [Dudley ef al., Genes Dev. 9 (1 995), 2795-2807; Zhang und Bradley, Development 122 (1996), 2977-2986].
BMPs und ähnliche Wachstumsfaktoren sind für die Therapie systemischer Erkrankungen, wie Osteoporose, nur bedingt geeignet, da sie nicht tolerable Nebenwirkungen, wie beispielweise Tumorpromotion, hervorrufen können. BMPs, insbesondere BMP-2, sind vielmehr für die lokal begrenzte Applikation prädestiniert. Dazu zählen u.a. spinale Fusionen bei degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen, die Regeneration von Schädelknochen, kiefer- und gesichtschirurgische Eingriffe, sowie die Behandlung komplizierter Knochenfrakturen der Extremitäten. Für diese Anwendungen konnte der positive Effekt von rhBMP-2 (rh - rekombinant human) auf die Knochenneubildung und damit auf den Heilungsprozess bereits eindrucksvoll in mehreren Tiermodellen demonstriert werden [Lane et al., Clin. Orthop. 361 (1 999), 21 6-227; Marden et al., J. Biomed. Mat. Res. 28 ( 1 994), 1 1 27-1 138; Mayer et al., Plast. Recontr. Surg. 98 ( 1 996), 247-259; Sandhu und Boden, Orthop. Clin. North Am. 29 (1 998), 621 -631 ; Toriumi et al., Arch. Otolyryngol. Head Neck Surg. 1 17 (1 991 ), 1 101 -1 1 12; Yasko et al., J. Bone Joint Surg. (Am.) 74 (1992), 659-670]. Für spinale Fusionsoperationen liegen sogar schon die ersten klinischen Studien vor [Boyne et al., Int. J. Periodontics Restorative Dent. 17 (1997), 1 1 -25; Howell et al., Int. J. Periodontics Restorative Dent 17 (1997), 124-139]. Ebenfalls sinnvoll ist der Einsatz von rhBMP-2 für die Fixierung von künstlichen Gelenken oder Verschraubungen im umgebenden Knochengewebe, wie sie beispielsweise zur Stabilisierung von Frakturen verwendet werden.
Dem routinemäßigen Einsatz von BMPs in der klinischen Praxis stehen neben den noch fehlenden Studien - und auch diesen selbst - vor allem die hohen Kosten für die Proteingewinnung im Weg. Durch das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren lässt sich biologisch aktives BMP-2, wie auch verwandte BMPs, mit geringem technischen Aufwand und bisher nicht für möglich gehaltenen Ausbeuten kostengünstig in hoher Reinheit rekombinant herstellen.
Humanes BMP-2 wird im Körper in Form eines Präproproteins von 396 Aminosäuren Länge synthetisiert. Das Signalpeptid (Präsequenz) dient in vivo zum Transport der nascierenden Polypeptidkette ins endoplasmatische Retikulum (ER). Nach dem Import in das ER faltet das Protein zu seiner nativen Konformation, es werden die Disulfidbrücken ausgebildet (Cys296-Cys361, Cys325-Cys393, Cys329-Cys395, intermolekular: Cys360-Cys360), und es finden posttranslationale Modifikationen statt. Zu letzteren gehören die Glγcosylierung von Asparaginresten und die zum Teil unvollständige Abspaltung des Propeptids [Israel et al., Growth Factors 7 (1992), 139-150]. Die C-terminalen 1 14 Aminosäuren (Gln283-Arg396) des Vorläuferproteins bilden das reife BMP-2, dessen biologisch aktive Form ein di- sulfidverbrücktes (Cys360-Cys360) Homodimer ist.
Die Gewinnung von BMP-2 aus Knochengewebe ist mit erheblichem Aufwand und nur geringen Ausbeuten verbunden (40/t/g BMP-Gemisch aus 40 kg bovinen Knochenpulvers) [Wozney ef al., Science 242 (1 988), 1 528-1 534]. Zudem ist die Isolierung aus humanem Knochenmaterial ethisch fragwürdig und birgt Gefahren durch Verunreinigung mit Pathogenen (Prionen, HCV etc.). Die Verwendung homologer Proteine aus Schweinen oder Rindern ist aus immunologischer Sicht ebenfalls riskant.
• Daher wird die rekombinante Herstellung von BMP-2 favorisiert. Dafür kommen vorrangig zwei Möglichkeiten in Betracht. Zum einen kann das Protein in eukaryotischen Expressionssystemen gewonnen werden [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1 990), 2220-2224]. Nachteile sind hierbei die relativ geringen Mengen rekombinanten Proteins (25 μg partiell gereinigtes BMP-2 je 1 I Medium [Wozney et al., Science 242 (1988), 1 528-1 534]), der verhältnismäßig hohe technische Aufwand und die daraus resultierenden Kosten.
Der zweite Weg beinhaltet die Verwendung prokaryotischer Expressionssysteme. Deren Vorteile liegen in der einfachen technischen Handhabung, den geringen Kosten und der Gewinnung sehr hoher Proteinmengen. Im Gegensatz zu Eukaryoten sind Bakterien jedoch nicht in der Lage, das Vorläuferprotein korrekt zu prozessieren. Daher beschränkt sich das bislang verwendete Verfahren auf die Expression der reifen Domäne von BMP-2 (Gln283-Arg396). Diese fällt in den Bakterien in einer unlöslichen, biologisch inaktiven Form an, da u.a. wegen der reduzierenden Bedingungen des Cytosols, die Disulfidbrücken des Proteins nicht ausgebildet werden können. Diese unlöslichen Proteinaggregate werden als inclusion bodies (IBs) bezeichnet, deren Isolierung und Reinigung beispielsweise von Marston [Biochem. J. 240 (1 986), 1 -1 2] beschrieben worden ist.
Das Verfahren von Ruppert f al., [Eur. J. Biochem. 237 (1996), 295-302] zur Naturierung von reifem BMP-2 basiert auf dem US-Patent 5,650,494
[Cerletti et al., 1 997], welches sich auf TGF-R-ähnliche Proteine bezieht, wozu auch BMP-2 gehört. Das Verfahren beinhaltet die Naturierung der monomeren, denaturierten reifen Form TGF-/_?-ähnlicher Proteine in Gegenwart eines milden Detergens zur biologisch aktiven Konformation. Im Fall von BMP-2 wurden so nur Ausbeuten von 0,2 mg aktiven Proteins je 1 g Zellen erhalten [Ruppert ef al., Eur. J. Biochem. 237 (1996), 295-302].
Mit der vorliegenden Erfindung ist es aber möglich, eine über 25fach höhere Ausbeute an aktivem Protein, bezogen auf die induzierte Zellmasse, zu erzielen. Verglichen mit der Expression in eukaryotische Zellen ist die Ausbeute sogar um etwa drei Größenordnungen höher.
Die Ausbeuten bei der Naturierung von in E. coli recombinant exprimierten reifen BMPs sind aufgrund des komplizierten Disulfidmusters (Cystinknoten) sehr gering. Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Hypothese, dass das BMP-2-Propeptid, wie auch die Propeptide homologer Proteine, für die korrekte Faltung der reifen Domäne mitverantwortlich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines biologisch aktiven Proteins der TGF- ?-Superfamilie, ist dadurch gekennzeichnet, dass (a) ein Protein, dessen Aminoterminus aus der Prosequenz eines Proteins der TGF- ?-Superfamilie oder Teilen davon besteht, an den sich die reife Domäne dieses oder eines anderen Proteins der TGF- ?-Superfamilie, das mindestens 35 % Homologie zu reifem BMP-2 aufweist, anschließt, in Prokaryonten unter Bedingungen exprimiert wird, bei denen wenigstens ein Teil des Proteins in Form von Einschlusskörpern erhalten wird, (b) die Einschlusskörper isoliert und unter denaturierenden Bedingungen solubilisiert werden, (c) das aus den Einschlusskörpern solubilisierte, denaturierte, monomere und biologisch inaktive Protein naturiert wird, wodurch die Faltung und Dimerisierung zur löslichen, biologisch aktiven Konformation ermöglicht wird und (d) gegebenenfalls nach der Naturierung die proteolytische Freisetzung des reifen Proteins aus seiner Proform erfolgt. Unsere in v/fro-Renaturierungsversuche haben gezeigt,, dass es erfindungsgemäß möglich ist, auch in Abwesenheit von Detergentien bei Verwendung der hypothetischen Proform von BMP-2 (Gly20-Arg396) und anschließender Abspaltung des Propeptids (Gly20-Arg282), mit geringem Aufwand große Mengen an biologisch aktivem drBMP-2 zu erhalten. Unter drBMP-2 ist hierbei die C-terminale Domäne von BMP-2 von Lys290, Arg291 bzw. Leu292 (siehe Beispiel 2.2.1 ) bis Arg396 zu verstehen, deren biologische Aktivität von Koenig et al., [Mol. Cell Biol. 14 (1 994), 5961 --5974] beschrieben wurde. Die Aminosäuren (Gin283 bis Arg289, Lys290 bzw. Arg291) vermitteln die Bindung von BMP-2 an Heparin.
Diese eher unspezifische Wechselwirkung moduliert zwar die Wirkung von BMP-2, ist jedoch für dessen biologische Aktivität nicht essentiell [Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237 (1 996), 295-302].
Erfindungsgemäß kann als Prosequenz bzw. Propeptid entweder die gesamte Prosequenz (Gly20-Arg282) oder ein Teil davon verwendet werden.
Um die Expressionsrate von probmp-2 in Prokaryoten zu erhöhen ist es erfindungsgemäß möglich, am 5 '-Ende der dieses Gen codierenden Sequenz eine fa^-Sequenz, z.B. einen Histidin-Tag, anzufügen, oder die Codons von probmp-2 durch Mutagenese für die prokarytische Expression zu optimieren. Auch die Expressionsverstärkung gemäß US-Patent 5,336,602 [Brinkmann et al., 1 993] sowie eine Kombination aus diesen Methoden ist möglich.
Bei der Überexpression von rekombinantem probmp-2 im Cytoplasma von Prokaryoten fällt das Protein dort in Form inaktiver, unlöslicher Aggregate [inclusion bodies~\Bs) an. Zu ihrer Isolierung werden die Zellen nach der Fermentation zunächst durch eines oder mehrere der üblichen Verfahren (z.B.: Hochdruckdispersion, enzymatische Lyse oder Ultraschall) aufgeschlossen, was vorzugsweise in einer neutralen bis schwach sauren Pufferlösung geschieht, beispielsweise 0, 1 M Tris/HCI pH 7,0.
Die zelluläre DNA wird durch mechanische, chemische oder, vorzugsweise, enzymatische Behandlung in nicht mit den IBs cosedimentierende Fragmente zerlegt. Unlösliche Zellbestandteile, einschließlich der IBs, werden dann in beliebiger Weise von den löslichen abgetrennt, wobei die Separation durch Zentrifugation favorisiert wird. Das Pellet wird mit Lösungen gewaschen, die aufgrund ihrer Zusammensetzung bzw. ihrer Zusätze, wie z.B. Detergentien, in der Lage sind, störende Zellproteine und Membranbausteine jedoch nicht das rekombinante proBMP-2 aus den IBs zu solubilisieren. Der verbleibende unlösliche, proBMP-2-haltige Anteil wird erfindungsgemäß nachfolgend solubilisiert, naturiert und enzymatisch prozessiert.
Vor der Naturierung werden die IBs solubilisiert, wobei gebräuchliche Denaturierungsmittel (chaotrope Substanzen) bzw. Kombinationen aus diesen zum Einsatz kommen. Dazu zählen u.a. Guandiniumsalze, z.B. GdmCI oder GdmSCN, sowie Harnstoff und dessen Derivate. Die Konzentration des Denaturierungsmittels bzw. -gemisches ist dabei so einzustellen, dass das rekombinante, schwer lösliche Protein vollständig solubilisiert werden kann. Im Fall von Guanidiniumchlorid liegen diese Konzentrationen im Bereich von 3-8 M und in dem von Harnstoff bei 6-10 M. Um ferner das so denaturiert lösliche, cystinhaltige Protein vollständig zu monomerisieren ist der Zusatz eines Reduktionsmittels, wie z.B. Dithiothreitol (DTT) oder ?-Mercaptoethanol, oder einer Kombination aus Reduktionsmitteln bevorzugt, wobei der pH des Solubilisierungspuffers vorzugsweise zwischen 8 und 9 eingestellt wird. Im Anschluss an die Solubilisierung oder parallel zu dieser ist es außerdem möglich, die freien Cysteine, beispielsweise mit oxidiertem Glutathion, kovalent zu modifizieren. Nach der Solubilisierung bzw. der optionalen kovalenten Modifikation der Cysteine werden der pH des IB-Solubilisats vorzugsweise auf 5 oder weniger eingestellt und, wiederum optional, überschüssige Redoxäquivalente durch Dialyse entfernt, wobei der Dialysepuffer, abgesehen vom Reduktionsmittel, zweckmäßigerweise die gleiche Zusammensetzung hat wie der Solubilisierungspuffer. Schließlich werden die während des Solubilisierungsprozesses unlöslich verbliebenen Bestandteile abgetrennt (Zentrifugation oder Filtration) und verworfen. Der optionale Modifizierungsschritt und die Entfernung des überschüssigen Reduktionsmittels ermöglichen ggf. eine Vorreinigung des IB-Solubilisats über Immobilisierte Metall- Affinitätschromatographie (IMAC), sofern die Expression von proBMP-2 mit N-terminalem Histidin-Tag erfolgte.
Der erfindungsgemäße Prozess der Naturierung von rh-proBMP-2 beinhaltet die Verringerung der Konzentration der(/des) Denaturierungsrnittel(s) auf ein nicht oder nur schwach denaturierend wirkendes Niveau (z.B. < 0,5 M GdmCI). Das geschieht bevorzugt durch langsam kontinuierliche oder schrittweise Verdünnung des Solubilisats in Naturierungspuffer. Um die Ausbeute an biologisch aktivem Protein zu maximieren ist darauf zu achten, dass die Durchmischung dabei möglichst rasch und gründlich erfolgt, was z.B. durch starkes Rühren gewährleistet ist.
Eine Alternative zur Verdünnung ist die Dialyse des Solubilisats gegen Naturierungspuffer. Die Bedingungen sind in jedem Fall so zu wählen, dass die Bildung von Proteinaggregaten minimal ist. Bereits während der initialen Verdünnung des Denaturierungsmittels kann eine Naturierung des Proteins stattfinden. Die Endkonzentration von rh-proBMP-2 im Naturierungspuffer beträgt nach Verdünnung bzw. Dialyse 10-1000 / g/ml, vorzugsweise
Figure imgf000009_0001
Eine optimale Proteinkonzentration ist dann gewährleistet, wenn die unproduktive Aggregation falsch gefalteter Polypeptidketten und
Faltungsintermediate (ein Prozess > 2. Ordnung [Kiefhaber et al.,
Biotechnology (N.Y.) 9 (1991 ), 825-829]) deutlich langsamer abläuft als die Faltung der einzelnen Polypeptidketten zur nativen Konformation (Prozess 1 . Ordnung).
Der pH des verwendeten Naturierungspuffers beträgt 6,5-10, idealerweise 8-9. Als Puffer kommen somit alle, einen neutralen bis alkalischen pKa aufweisenden, vorzugsweise Tris- und Phosphatpuffer, sowie Kombinationen aus diesen in Frage. Ferner ist der Zusatz niedermolekularer Hilfsstoffe, welche die Naturierungsausbeute erhöhen [US-Patent 5,593,865, Rudolph et al., 1995], zum Naturierungspuffer zweckmäßig. Besonders geeignet ist die Naturierung in Gegenwart von L-Arginin, wobei Konzentrationen von 0,2-2,0 M , bevorzugt 0,5-1 ,5 M L-Arginin, eingesetzt werden. Eine weitere Komponente des Naturierungspuffers ist erfindungsgemäß die Kombination von reduzierter und oxidierter Form einer oder mehrerer Thiolverbindungen. Solche Kombinationen sind beispielsweise reduziertes (GSH) und oxidiertes (GSSG) Glutathion, Cystein und Cystin, Cysteamin und Cystamin, sowie R-Mercaptoethanol und 2,2 '-Hydroxyethyldisulfid. Mit Hilfe eines solchen künstlichen Redoxsystems lässt sich die Naturierung des Proteins thermodynamisch kontrollieren. Die für die korrekte Faltung der Polypeptidketten notwendige Möglichkeit zur Ausbildung der Disulfidbrücken [Creighton, Biochemistry 378 (1997), 731-744] wird durch das Vorhandensein der oxidierten Form, die Möglichkeit zum Wiederaufbrechen falsch gebildeter Cystine (reshuffling) durch das der reduzierten Form der Thiolkomponente gewährleistet [Creighton et al., Trends Biotechnol. 13 (1995), 18-23].
Bevorzugt wird Glutathion in reduzierter (GSH) und oxidierter (GSSG) Form in Konzentrationen von jeweils bis zu 10 mM verwendet, idealerweise in einem Verhältnis von 5 mM GSSG zu 2 mM GSH.
Der Naturierungspuffer enthält erfindungsgemäß bevorzugt einen oder mehrere Komplexbildner, wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), in Konzentrationen von bis zu 20 mM (bevorzugt ca. 5 mM), um zum einen die unkontrollierte, beschleunigte Oxidation . der reduzierten Thiolkomponente durch Metallionen zu unterbinden und zum anderen Metalloproteasen, durch die das Renaturat kontaminiert sein kann, zu inhibieren.
Erfindungsgemäß erfolgt die Naturierung zweckmäßig bei Temperaturen von 0-20 °C über 1 -21 d, vorzugsweise 5-10 °C, 5-10 d.
Die relativ langen Renaturierungszeiten lassen sich durch die kovalente Dimerisierung der proBMP-2-Polypeptidketten erklären. Unsere Versuche haben gezeigt, dass für diesen Vorgang unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung nicht die Proteinkonzentration, sondern die Oxidation von freien Thiolgruppen geschwindigkeitsbestimmend ist.
Nach Abschluss des Naturierungsprozesses wird erfindungsgemäß gegen einen vorzugsweise sauren (pH ≤ 5) Puffer dialysiert, der keine niedermolekularen Hilfsstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung enthält. Der Dialysepuffer entspricht dabei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn durch die Dialyse falsch gefaltete Polypeptidketten und Faltungs- intermediate weitestgehend aggregieren und somit durch Zentrifugation, Filtration oder eine andere übliche Methode abgetrennt werden können. Vor der Dialyse ist eine Konzentrierung des Naturierungsansatzes, beispielsweise durch Cross-Flow- Filtration, zweckmäßig, an die sich eine zusätzliche Inkubationszeit unter Naturierungsbedingungen anschließen kann. Verkürzend auf die Naturierungszeit kann sich die Belüftung des Puffers auswirken, die u.U. auch beim Prozess der Konzentrierung geschieht, und die Oxidation freier Thiolgruppen beschleunigt. Dies kann ebenso durch Zusatz oxidierend wirkender Substanzen erreicht werden.
Die Trennung von monomeren, falsch gefalteten bzw. nicht dimerisierten, korrekt gefalteten Spezies von der nativen, dimeren Form des renaturierten rh-proBMP-2 kann erfindungsgemäß mit Hilfe chromatographischer Trennverfahren erfolgen, wobei vorzugsweise reversed-phase-HPLC verwendet wird. Als Säulenmaterialien eignen sich hierfür vor allem silicabasierte C4-Matrizes bzw. polymerbasierte Partikel vergleichbarer oder stärkerer Hydrophobizität, wobei ein Porendurchmesser von > 300 Ä aufgrund der Größe des Proteins empfehlenswert ist. Als Eluenten eignen sich die in der RP-HPLC üblichen, wie Acetonitril, 2-Propanol oder Ethanol. Erfindungsgemäß kommen dabei lonenpaarbildner, vorzugsweise Trifluoressigsäure bzw. Perfluorbuttersäure in den gängigen Konzentrationen, zum Einsatz.
Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung von dimeren, naiv gefalteten proBMP-2 ist der Einsatz der Heparin-Affinitätschromatographie. Dabei sind zur Erhöhung der Löslichkeit des Proteins und zur Vermeidung unspezifischer Wechselwirkungen zwischen proBMP-2 und Säulenmaterial Harnstoff konzentrationen von 2 bis 8 mol l"\ vorzugsweise 5 mol I"1 als Pufferzusatz zu verwenden. HiTrap Heparin-Sepharose (Amersham Phamracia Biotech) ist dabei als Säulenmaterial besonders geeignet. Die monomeren Formen von proBMP-2 werden dabei unter 300 mol I"1 NaCI und die dimere Form bei höheren Salzkonzentrationen von der Matrix eluiert.
Für den nicht zur TGF- ?-Familie zählenden Nerven wachstumsfaktor ?-NGF wurde bereits ein Verfahren zur Gewinnung des biologisch aktiven Proteins aus seiner inaktiven, denaturierten Proform in WO 00/221 19 [Rattenholl et al., 2000] beschrieben. ß-NGF und BMP-2 unterscheiden sich insbesondere in der Länge ihrer Prosequenz (/?-NGF-103 AS; BMP-2-263 AS). Auch in der Tertiärstruktur gibt es wesentliche Unterschiede [McDonald und Hendrickson, Cell 73 (1 993), 421 -424]. Es ist daher nicht überraschend, dass die vorliegende Erfindung in wesentlichen Punkten von WO 00/221 19 differiert. Die für maximale Ausbeuten an korrekt gefalteten rh-proBMP-2 erforderlichen Naturierungszeiten sind wesentlich länger (1-21 d) als die für rh-proNGF (3 h). Die Proform von BMP-2 wird, wie auch die von ?-NGF, in vivo durch Prohormonkonvertasen des Furintyps prozessiert. Diese erkennen ein dibasisches Sequenzmotiv am Ende der Prosequenz. Deren letzte Aminosäure ist Arg282. In vitro kann das Propeptid von BMP-2 bzw. jf?-NGF durch Proteasen mit vergleichbarer Substratspezifität abgespalten werden.
Die Prozessierung des naturierten rh-proBMP-2 erfordert jedoch gänzlich andere Bedingungen als die für die Spaltung von proNGF angewandten. Obwohl die erfindungsgemäß verwendete Prosequenz von BMP-2 mit 263 AS wesentlich länger als das reife Protein (1 14 AS) ist, hat sich bei unseren Versuchen überraschenderweise gezeigt, dass die Löslichkeitseigenschaften von proBMP-2 von dessen reifer Domäne determiniert werden. proBMP-2 ist daher, im Gegensatz zum BMP-2-Propeptid allein (Gly 0-Arg282), ohne lösungsvermittelnde Zusätze nur bei pH < 5 in hohen Konzentrationen löslich. Bei saurem pH ist eine effektive Prozessierung der Proform mit Hilfe von Proteasen (Trypsin, PACE (paired basic amino acidconverting enzymes; nach dibasischen Motiven schneidende, eukaryotische Endopeptidasen)) nicht möglich. Um eine proteolytische Spaltung dennoch zu ermöglichen, kommen erfindungsgemäß alle nicht inhibierenden Lösungsvermittler besonders Harnstoff oder Trishydroxymethylaminomethan (Tris) in Konzentrationen von 1 -5 M bzw. 0,1-2 M einzeln oder in Kombination zum Einsatz, vorzugsweise 2-4 M Harnstoff in Kombination mit 0,1 -1 M Tris. Mit Hilfe dieser Zusätze ist es möglich, proBMP-2 in Konzentrationen von > 1 mg/ml auch im pH-Optimum (7-8) der verwendeten Proteasen in Lösung zu halten.
Die Einstellung der Pufferbedingungen für die Proteolyse erfolgt zweckmäßigerweise durch Dialyse. Erfindungsgemäß werden trypsin- ähnliche Proteasen favorisiert, die in einem Massenverhältnis von 1 :10 bis 1 : 1 000 (Trypsin, rh-proBMP-2) zum Einsatz kommen, . bevorzugt von 1 :20 bis 1 : 100. Inkubiert wird über einen Zeitraum von 1 min bis 24 h, bevorzugt 30 min bis 6 h, bei einer Temperatur von 0-37 °C, bevorzugt 10-25 °C. Als Puffersubstanz fungiert im Fall von Tris der Lösungsvermittler selbst und im Fall von Harnstoff zusätzlich Trispuffer in den angegebenen Konzentrationen. Eine hohe Konzentration von Tris, z.B. 0,5 M, verhindert zudem die kovalente Modifikation von Aminosäureseitenketten durch eventuell aus dem Harnstoff gebildetem Isocyanat.
Der pH wird auf einen für die betreffende Protease günstigen Wert, vorzugsweise 7-8, eingestellt. Um unspezifischen proteolytischen Abbau durch Metalloproteasen zu unterdrücken ist erfindungsgemäß der Zusatz von Komplexbildnern, z.B. 1 -20 mM EDTA, zweckmäßig. Die Proteolyse wird durch Zusatz eines oder mehrerer Proteaseinhibitoren, bevorzugt 1 -5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) oder Trypsininhibitor aus Rinder- pankreas oder Sojabohnen (BPTI/SBTI) in 2-20fachem molaren Überschuss zu Trypsin, bzw. durch Einstellung von pH < 5 mittels Säure abgestoppt [Rudolph ef al.,: Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach, T.E. Creighton (Hrsg.), 2. Aufl. (1997), 57-99].
Der N-Terminus des reifen BMP-2 (Gln283-Arg291) ist nicht strukturiert und daher proteaseempfindlich. Er enthält zudem einige Arginin- und Lysinreste (Arg289-291, Lys285,287'290). Die limitierte Proteolyse mit Trypsin, das bevorzugt nach diesen basischen Aminosäureresten schneidet, führt daher auch zur Abspaltung des flexiblen N-Terminus von reifem BMP-2. Die biologische Aktivität des erhaltenen drBMP-2 wurde im Tierversuch nachgewiesen. Erfindungsgemäß ist es möglich, ggf. durch Protein Engineering eine zusätzliche Disulfidbrücke zur Fixierung und Stabilisierung des N-Terminus von reifem BMP-2 einzuführen, z.B. ähnlich wie sie im verwandten TGF-/? vorkommt, um so die Heparinbindestelle von BMP-2 vor proteolytischem Abbau zu schützen. Unsere Versuche zur limitierten Proteolyse von r h - p r o B M P - 2 i n A b w e s e n h e i t e r f i n . d u n g s g e m ä ß e r Lösungsvermittlerkonzentrationen bei dann entsprechend geringen Proteinkonzentrationen haben gezeigt, dass das Propeptid aus mindestens einer, nach Abspaltung vom reifen Protein noch immer weitgehend protease- resistenten Domäne besteht. In den verwendeten Konzentrationen der zum Einsatz kommenden Lösungsvermittler wirken diese selbst z.T. schwach denaturierend. Das hat zur Folge, dass das nicht durch intrachenare Disulfidbrücken stabilisierte Propeptid von BMP-2 strukturell destabilisiert, proteaselabil und somit unter den erfindungsgemäßen Bedingungen der limitierten Proteolyse abgebaut werden kann.
Für die Reinigung der Proteolyseprodukte bietet sich aufgrund der extremen Hydrophobizität von nativem BMP-2 [Scheufler et al., J. Mol. Biol. 287 (1999), 103-1 15] die Reinigung über hydrophobe Wechselwirkungen an. Erfindungsgemäß kommen hierfür bevorzugt Säulenmaterialien zum Einsatz, an die das erhaltene drBMP-2 stark bindet, wohingegen die übrigen Abbauprodukte, sowie die verwendete Protease bzw. der Inhibitor mit dem Material nur schwach wechselwirken. Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Pufferbedingungen nach der Proteolyse so zu verändern, dass das drBMP-2 präzipitiert und die übrigen Abbauprodukte, die Protease bzw. ihr(e) lnhibitor(en) in Lösung verbleiben. Das präzipitierte drBMP-2 kann dann, nach Separation vom Überstand, in geeigneten Puffern bzw. Lösungsmitteln wieder solubilisiert werden. Bevorzugt erfolgt diese Veränderung zu präzipitierenden Bedingungen in Gegenwart von geeignetem Säulenmaterial, besonders "Fractogel EMD Phenyl S" (Merck) oder vergleichbaren Materialien, wie Phenylsepharose (Pharmacia), durch Dialyse. Wird das Material in großem Überschuss eingesetzt, kann erreicht werden, dass das Protein an dieses bindet bevor es aggregiert. Nachdem das Säulenmaterial auf diese Weise mit Protein beladen worden ist, können die unerwünschten Komponenten durch geeignete Waschschritte entfernt werden. Die Elution des drBMP-2 erfolgt zweckmäßigerweise unter mild bis stark denaturierenden, aber keinesfalls reduzierenden Bedingungen. Als Elutionsmittel eignen sich je nach Säulenmaterial dementsprechend u.a. Arginin, Harnstoff oder Guanidiniumsalze, die in niedrigen Konzentrationen auch zum Waschen des Säulenmaterials Verwendung finden können. Nach der Elution werden die drBMP-2 enthaltenen Fraktionen ggf. vereinigt und besonders bevorzugt gegen 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) oder Am- moniumacetat dialysiert, welche für die schließliche Applikation von BMP-2 sehr geeignete Lösungsmittel darstellen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Proteolyseprodukte überreι erse./p/7ase-Materialien, bevorzugt C4-RP-HPLC, zu trennen, wobei die Elution vorzugsweise mit 0, 1 % TFA im Acetonitrilgradienten erfolgt.
Erfindungsgemäß renaturiertes und nach Abspaltung der pro-Sequenz erhaltenes reifes BMP-2 kann in der dafür üblichen Weise zur Förderung des Knochenwachstums verwendet werden. Überraschenderweise ist jedoch auch das renaturierte proBMP-2 selbst, welches die gesamte oder eine verkürzte pro-Sequenz noch enthält, in seiner biologischen Wirksamkeit dem reifen BMP-2 äquivalent und kann wie dieses eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein proBMP-2 als Wirkstoff enthaltendes Arzneimittel zur Förderung des Knochenwachstums. Es kann die komplette oder eine trunkierte pro-Sequenz enthalten. Bevorzugt wird erfindungsgemäß eine Kombination von proBMP-2 mit verschiedenen medizinischen Implantatmaterialien für den vorübergehenden Knochenersatz (Knochenersatzmaterialien) sowie für den permanenten Knochen- und Gelenkersatz (Metallimplantate, wie Hüft- und Kniegelenksendoprothesen) in Traumatologie, Orthopädie, HNO, MKG und Neurochirurgie verwendet. Hierbei kann zum einen proBMP-2 als nachträgliche Implantatbeschichtung in der Art eines dünnen auf allen inneren und äußeren Oberflächen anhaftenden Proteinfilms mit und ohne Haftvermittler (z.B. Silan) zur Anwendung kommen. Zum zweiten kann proBMP-2 als integraler Bestandteil von Implantaten verwendet werden, indem dieses den nicht festen Edukten solcher durch chemische Polymerisation oder Aushärtung herstellbaren festen Endprodukten zugesetzt wird (z.B. Calciumphosphatzemente wie Norian SRS, Ostim u.a.).
Als Implantate für den transienten Knochenersatz kommen anorganische und organische Materialien natürlichen und künstlichen Ursprungs sowie Mischformen aus beiden in Frage. Beispiele für anorganische Knochenersatzmaterialien stellen Keramiken aus Hydroxylapatit, beta- Tricalciumphosphat, alpha-Tricalciumphosphat, Glaskeramiken, Biogläser, Calciumcarbonate, Calciumsulfate und sonstige nicht aufgeführte Caiciumsalze in kristalliner und amorpher Form einschließlich injizierbarer Calciumphosphat-basierter Knochenzemente dar. Geeignete organische Materialien stellen unter anderem Kollagene, Knochengewebe, demineralisierte Knochenmatrix, gelierfähige Polysaccharide wie Hyaluronsäure, biokompatible Kunststoffe, wie Polymilchsäure, Polymethylacrylate, Polyethylenglykole u.a.m. in verschiedensten Misch- und Verarbeitungsformen dar. Für den dauerhaften Knochenersatz kommen Endoprothesen und andere Metallimplantate wie solche für die Wirbelkörperstabilisierung in Betracht. Üblicherweise handelt es sich hierbei um Produkte aus verschiedenen Edelstahlen und Titanlegierungen, die zum Teil auch mit Hydroxylapaptibeschichtungen versehen sind.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind daher proBMP-2 mit der kompletten oder trunkierten pro-Sequenz an die das reife BMP-2 gebunden ist, ein diese Substanz enthaltendes Arzneimittel und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung des Knochenwachstums, wie in den Patentansprüchen definiert. Die vollständige Sequenz von proBMP-2 von Gly20-Arg396, einschließlich 20 Aminosäuren His-Tag und dem Startcodon Met ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Aminosäuren Met1 bis His20 sind Bestandteil des von pET-15b codierten His-Tags. Die Prosequenz von BMP-2 beginnt bei Gly22. Zwischen His-Tag und Prosequenz befindet sich das zusätzliche Methionin. Gly22 bis Arg 398 in der hier dargestellten Sequenz entsprechen Gly20 bis Arg396 im primären Translationsprodukt der humanen Prä-ProBMP-2-cDNA, auf welches sich die Sequenzangaben im Text beziehen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der Zeichnung. In dieser stellen dar:
Abbildung 1 ein SDS-PAGE-Elektropherogramm Abbildung 2 UV-CD-Spektren Abbildung 3 Emissionsspektren, jeweils von proBMP-2 Abbildung 4 ein SDS-PAGE-Elektropherogramm Abbildung 5 ein RP-HPLC-Chromatogramm Abbildung 6 UV-CD-Spektren, Abbildung 7 MALDI-TOF-Massenspektrogramm, jeweils von drBMP-2
Abbildung 8 ein RP-HPLC Diagramm von rh-proBMP-2 Abbildung 9 histologischer Schnitt eines rh-proBMP-2- Implantats. Sowohl die innere als auch die äußere Oberfläche der Keramik sind mit Knochensubstanz bedeckt. Das Poreninnere enthält Knochenmark mit zahlreichen Fettzellen (Implantatmaterial - dunkel, Knochen - hellblau). Links unten sind einige Muskelfasern (dunkelblau) sowie Bindegegebe zu sehen.
Abbildung 10 Histologischer Schnitt eines rh-proBMP-2- Impantats in starker Vergrößerung. Das Knochenmaterial (links oben bis rechts unten, hellblau) befindet in sehr engem Kontakt zu dem von ihm bedeckten Keramikmaterial (rechts, grau) . Zwischen Knochensubstanz und hematopoietischem Gewebe befinden sich aktive Osteoblasten in einer Reihe. Abbildung 1 1 ein Vergleich der Aktivität der AP in den
Implantaten.
Beispiele
Ausführungsbeispiel 1 : Herstellung von proBMP-2
Klonierung der prob7?7p-2-cDNA in einen Escherichia co//-Expressionsvektor
Zur Klonierung der prob77?p-2-cDNA wurde das T7-Expressionssystem der Firma Novagen [Studier und Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986), 1 13-130] verwendet.
Als Ausgangs-DNA diente der pcDNA3-Vektor mit inserierter präprobt77p-2-cDNA (Boehringer-Mannheim GmbH). Durch Polymerase- kettenreaktion (PCR) wurde die für die Aminosäuren Gly20 bis Arg396 von
BMP-2 kodierende DNA erhalten. Dabei wurden Mutageneseprimer verwendet, mit deren Hilfe am 5'-Ende ein Methionincodon für den
Translationsstart eingeführt und das Stopcodon am 3'-Ende in ein für E. cσ// typisches überführt sowie durch ein zweites Stopcodon ergänzt wurde.
Außerdem enthielten die Primer eine Nde\- (5'-) bzw. eine t5a/77HI-Schnittstelle (3'-Ende). Das ermöglichte die anschließende
Klonierung in den Expressionsvektor pET-15b (Novagen). Dieser Vektor codiert zusätzlich einen N-terminalen 6-Histidin-Tag, durch welchen sich die Expressionsraten in E. coli beträchtlich steigern ließen.
Die Nucleotidsequenz wurde nach Abschluss der Klonierung mittels DNA-Sequenzierung [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977),.5463-5467] überprüft.
Folgende Primer wurden verwendet: forward primer „PrimerFwProBMP": \
NM ' |
5 ' -cg gaa ttc caj.t atg ggt gcg gct ggc ctc gtt cc-3 ' j
Met Gly Ala Ala Gly Leu Val j j
H2N→ | j reverse primer „PrimerRevBMP": ! I Barriül < |
5'-cc gga tcc tta cta gcg aca ccc aca acc-3 ' , I
Stp Stp Arg Cys Gly Cys Gly ,
HOOC<— i
Als Wirtsstamm diente E. coli BL21 (DE3). Das Chromosom dieser Bakterien enthält das Gen für die T7-RNA-Polymerase, welches unter Kontrolle des /ac-Promotors steht. Die Expression der Polymerase kann somit durch lsopropyl- ?-D-thiogalactosid (IPTG) induziert werden. Das probmp-2-Gen wird von einem T7-Promotor kontrolliert. Die Induktion mit IPTG führt folglich zur Bildung von proBMP-2. Zur weiteren Erhöhung der Expressionsrate wurden die Zellen mit pUBS520 cotransformiert. Dieses Plasmid enthält das Gen für eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (dnaY). Die von dieser tRNA erkannten Arginincodons (AGA und AGG) finden sich dagegen besonders häufig in eukaryotischen Genen, so auch in probmp-2. Die Expressionsrate solcher Gene in E. coli hängt u.a. von der Verfügbarkeit dieser tRNA ab [Brinkmann et al., Gene 85 (1 989), 109-1 14].
Expression von humanem proBMP-2 in E.coli
Für die Anzucht des rekombinanten Bakterienstammes wurde ein geeignetes Volumen 2ΥT-Medium, i.d.R. 1 ,5 I, mit 100 pg/ml Ampicillin und 50 pg/ml Kanamycin versetzt und mit einer Einzelkolonie beimpft.
2-YT-Medium (1 I):
1 7 g Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCI Die Kultur wurde bei 37 °C und 1 60-200 rpm geschüttelt. Induziert wurde mit 1 mM IPTG bei einer OD600 von 1 -1 ,3. Anschließend wurde für weitere 3-4 h bei gleicher Temperatur geschüttelt und so reproduzierbar Zelldichten nach Induktion von OD600 3-3,5 erzielt. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 g. 3-3,5 g Zellen (Feuchtmasse) je 1 I Medium konnten so gewonnen werden. Alternativ zum sofortigen Zellaufschluss wurden die Zellen zunächst in flüssigem Stickstoff und danach bei -20 °C eingefroren.
Isolierung der inclusion bodies (IBs)
Bei der rekombinanten prob/77p-2-Expression bilden sich in den Bakterienzellen Aggregate, inclusion bodies (IBs). Die Präparation dieser IBs erfolgte nach Rudolph et al.,: "Folding proteins", in "Protein Function: A Practical Approach", T.E. Creighton (Hrsg.), 2. Aufl. (1 997), 57-99.
Je 5 g Zellpellet wurden in 25 ml 100 mM Tris/HCI pH 7,0, 1 mM EDTA resuspendiert. Nach Hinzufügen von 1 ,5 mg Lysozym je 1 g Zellfeuchtmasse folgte eine dreissigminütige Inkubation der Zellsuspension bei 4 °C. Schließlich wurden die Zellen mittels Hochdruckdispersion (Gaulin-Homogenisator) aufgebrochen. Nach Zugabe von 3 mM MgCI2 und 10 pg/ml DNase wurde das Homogenat für weitere 30 min bei 25 °C inkubiert. Im Anschluss daran wurden 0,5 Volumenanteile 60 mM EDTA, 6 % Triton X-100, 1 ,5 M NaCI pH 7,0 hinzugefügt und die Inkubation bei 4 °C für 30 min fortgesetzt, um unlösliche Zellbestandteile zu solubilisieren. Die IBs blieben unter diesen Bedingungen unlöslich und konnten durch Zentrifugation bei 39.000 g abgetrennt werden. Um überschüssiges Detergens aus den IBs wieder zu entfernen, wurden diese noch fünfmal mit 100 mM Tris/HCI pH 7,0, 20 mM EDTA gewaschen, abschließend aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Auf diese Weise konnten aus 1 g induzierter £.co//-Zellen reproduzierbar 1 80-210 mg IBs gewonnen werden, die bei einem Proteingehalt von 30-35 % 90-95 % rh-pro-BMP-2 enthielten.
Solubilisierung der IBs
100-1 50 mg IB-Pellet wurden 4 h bei 25 °C in 1 ml 100 mM Tris/HCI pH 8,0, 6 M GdmCI, 100 mM DTT, 1 mM EDTA solubilisiert. Danach wurde der pH mit Essigsäure auf 3-4 eingestellt und die unlöslichen Bestandteile bei 1 6.000 g über 20 min in der Zentrifuge pelletiert. Der Überstand wurde anschließend in der Ultrazentrifuge bei 266.000 g noch einmal für 30 min zentrifugiert, um Mikroaggregate abzutrennen. Die Proteinkonzentration wurde mittels Absorptionsmessung bei /1 = 280 nm bestimmt [Gill und von Hippel, Anal. Biochem. 182 (1 989), 31 9-326] und betrug 30-52 mg/ml.
Reinigung von proBMP-2
Wiederfindungsrate (ca. 70 %) waren dabei mit dem analytischen Maßstab vergleichbar.
Als zweite Reinigungsmethode kam Heparin-Affinitätschromatographie auf einer 1 ml HiTrap Heparin Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) zum Einsatz. Als Puffersystem wurden:
- 0, 1 mol r1 Tris pH 7,56, 6 mol I"1 Harnstoff (Puffer A) und
- 0, 1 mol I'1 Tris/HCI pH 7,5 6 mol r1 Harnstoff, 1 mol I 1 NaCI (Puffer B) verwendet. Die Säule wurde mit Puffer A über mehr als 10 Säulenvolumen äquilibriert. Verunreinigungen wurden mit einem Gradienten von 0 bis 20 % Puffer B eluiert. Die Trennung von monomeren und dimerem proBMP-2 erfolgte mit einem Gradienten von 20 bis 50 % Puffer B in 30 min bei einem Fluss von 1 ml min"1. Naturierung von rh-proBMP-2 im präparativen Maßstab
Das proBMP-2-IB-Solubilisat wurde für die Naturierung mit 4 M GdmCI pH
4 verdünnt, sodass die Endkonzentration von GdmCI nach vollständiger Verdünnung des Solubilisats in Faltungspuffer 50-60 mM erreichte. Die
Konzentration an proBMP-2 betrug schließlich 3-4 pM (entspricht 135-180 pg/ml).
Faltungspuffer: 100 mM Tris/HCI pH 8,0
1 M L-Arginin
5 mM GSSG
2 mM GSH 5 mM EDTA
Nach dem Filtrieren und Entgasen des Faltungspuffers wurde das Solubilisat langsam ( ~ 20 ml/h) und unter Rühren hinzugegeben und der Ansatz 7 d bei 5 °C inkubiert. Die mit dem Solubilisat eingeschleppten DTT-Reste sind dabei einer Konzentration von maximal 0.4 mM GSH äquivalent.
Die Konzentrierung des Faltungsansatzes erfolgte mittels Cross-F/σw-Filtration (Filtron Minisette, Membran: 30 kDa open Channel). Das Konzentrat wurde anschließend gegen fünfmal 20 Volumen 50 mM Na-Acetat pH 5,0 für je 24 h dialysiert und danach aggregiertes Protein für 2 h bei 75.000 g abzentrifugiert. Die Menge des in Lösung verbliebenen Proteins wurde durch Absorption bei λ - 280 nm bestimmt und betrug reproduzierbar ca. 50 %, bezogen auf den Proteingehalt des eingesetzten IB-Solubilisats.
Reinigung von proBMP-2 Für die analytische bzw. semipreparative Trennung der (falsch oder korrekt gefalteten) monomeren Spezies von nativem, dimerem rh-proBMP-2 wurde RP-HPLC eingesetzt. Im analytischen Maßstab wurde unter anderem eine Protein-RP-Säule ( 1 50 x 3,6 mm, YMC) mit 0, 1 % Perfluorbuttersäure (HFBA) in H2O bzw. ACN als Laufmittel verwendet (siehe Abbildung 8). Auch mit Trifluoressigsäure als lonenpaarbildner wurde eine Trennung von Monomer und Dimer erreicht. Das Dimer eluiert - wie bei reifem BMP-2 - aufgrund seiner höheren Hydrophobizität später als das Monomer bzw. die monomeren, falschgefalteten Spezies. Im semipreparativen Maßstab kam eine Säule mit Source1 5 RPC-Material (Pharmacia) zum Einsatz. Das Trennprofil und die Wiederfindungsrate (ca. 70 %) waren dabei mit dem analytischen Maßstab vergleichbar.
Charakterisierung von rh-proBMP-2
Reinheitsanalyse und Molekulargewichtsbestimmung mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die SDS-PAGE-Analyse ergab eine hohe Reinheit ( > 90 %; Abbildung 1 , Bahn 2-5) der erfindungsgemäß präparierten proBMP-2-IBs, sodass diese ohne vorherige Reinigung für die Naturierung eingesetzt werden konnten.
SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen (Zugabe von lodacetamid führt zur irreversiblen, oxidativen Modifikation freier Thiolgruppen) zeigt einen hohen kovalenten Dimerisierungsgrad ( ≥ 90 %) von naturiertem proBMP-2 und ist ein Hinweis auf die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken und damit der nativen Struktur des Proteins (Abbildung 1 , Bahn 6).
N-terminaleSequenzanalyse Nach SDS-PAGE und Western-Blot auf eine PVDF-Memran erfolgte die N-terminale Sequenzierung [Edman und Begg, Eur. J. Biochem. 1 (1 967), 80-91 ]. Sie ergab für naturiertes proBMP-2 folgende Aminosäuresequenz: Gly-Ser-Ser-His-His-
Das entspricht dem N-Terminus von rekombinantem proBMP-2 mit Histidin-Tag nach Abspaltung des Startmethionins.
Circular-Dichroismus-Spektrometrie und Fluoreszenzspektroskopie
Die mit naturiertem und wieder denaturiertem proBMP-2 durchgeführten fluoreszenz- und CD-spektrometrischen Analysen lassen deutliche Hinweise auf das Vorhandensein von Sekundär- und Tertiärstruktur erkennen. Die starke Differenz zwischen der Elliptizität von naturiertem und denaturiertem proBMP-2 im Bereich um Λ = 220 nm des Fern-UV-CD-Spektrums (Abbildung 2) erlaubt die Feststellung, dass beim erfindungsgemäßen Prozess der Naturierung die Ausbildung von Sekundärstrukturelementen erfolgt. Die Verschiebung des Emissionsmaximums der Fluoreszenz von naturiertem proBMP-2 zu niedrigeren Wellenlängen gegenüber dem denaturierten Protein (Abbildung 3) ist typisch für die Ausbildung nativer Tertiärstrukturen. Dabei gelangen die Tryptophanreste des Proteins (5 Tryptophane je Polypeptidkette proBMP-2) aus der polaren Umgebung des Lösungsmittels in den apolaren Kern des sich faltenden Proteins, wo sie zudem sterisch fixiert sind. Durch den so verringerten Verlust von Anregungsenergie wird Licht höherer Frequenz emittiert. [Schmid: "Optical spectroscopy to characterize protein conformation and conformational changes." in "Protein Structure: A Practical Approach", T.E. Creighton (Hrsg.), 2. Aufl. (1 996), S. 261 -297]. Aus den Fluoreszenzspektren wird auch deutlich, dass die Struktur von proBMP-2 bei niedrigem pH, also im Bereich hoher Löslichkeit von reifem und proBMP-2, eine Veränderung erfährt. Wie unsere Experimente ergeben haben, kann dies auf eine partielle Entfaltung des Propeptids zurückgeführt werden (Daten nicht gezeigt). MALDI-TOF-Massenspektrometrie und N-terminale Sequenzanalyse
- apparente Molekularmasse: 89803,0078 Da - siehe Abbildung 7
- berechnete Molekularmasse (ohne Startmethionin): 89801 ,2 Da
Biologische Aktivität von rh-proBMP-2 und rh-drBMP-2
Die osteoinduktive Aktivität des modifizierten rh-proBMP-2 und rh-drBMP-2 wurde im ektopen Knocheninduktionsmodell an Laborkleintieren geprüft. Hierzu wurden definierte Mengen des jeweiligen zu prüfenden Faktors (40-200 pg; drBMP-2 bzw. proBMP-2) nach Sterilfiltration auf sterile würfelförmige, chemisch und pharmakologisch inerte keramische Implantatgrundkörper aus ß-lCP aufgebracht.
Implantatspezifikationen:
Hersteller — Fa. Mathys, Bettlach, Schweiz
Handelsname — chronOs
Phasenreinheit — > 95 % ß-lCP
Porenvolumenanteil — 72 + /- 6 % Porengröße — 80-650 pm
Porenstruktur — interkonnektierend
Festigkeit — 7,7 + /- 1 ,2 MPa
Die faktorbeschichteten Implantate sowie unbeschichtete, aber ansonsten identisch behandelten Kontrollimplantate wurden 8 ausgewachsenen Laborratten in die vordere Bauchwandmuskulatur implantiert. Hierzu wurden nach Narkotisierung mehrere, ca. 1 cm lange chirugische Schnitte in die Haut und die darunter liegende oberste Muskellage gesetzt. Durch stumpfe Präparation wurde zwischen den zwei schrägen Lagen Bauchmuskukatur ein Hohlraum erzeugt, in diesen die Implantate eingebracht und die Wunden durch chirurgische Nähte verschlossen. Nach 30 Tagen Liegedauer wurden die Tiere geopfert und die Implantate mit umgebendem Gewebe entnommen und makroskopisch und histologisch auf Knochenneubildung untersucht. Bei allen faktorbeschichteten Implantaten konnte eine Knochenneubildung, begleitet von der Bildung von hämatopoetisch aktivem Knochenmark, histologisch eindeutig festgestellt werden (siehe Abbildungen 8 und 9). Die biologische Wirksamkeit betrug somit für beide Faktoren jeweils 100 % (1 6/1 6 bei proBMP-2; 8/8 bei drBMP-2). Damit konnte der Nachweis der osteoinduktiven Aktivität durch die Bildung von Knochengewebe im normalerweise nicht zur Knochenbildung fähigen Muskelgewebe eindeutig erbracht werden. Qualitative Unterschiede im histologischen Ergebnis zwischen proBMP-2 und reifem drBMP-2 konnten nicht beobachtet werden. Die Kontrollimplantate führten in keinem Falle zur Knochenneubildung. Statt dessen wurden diese ausschließlich bindegewebig eingescheidet.
Ein weiterer Nachweis für die Neubildung von aktivem Knochengewebe unter dem Einfluss von rh-proBMP-2 bzw. rh-drBMP-2 wurde durch die Messung der Aktivität Alkalischer Phosphatase (AP) in den Implantaten erbracht. Hierfür wurde die Hälfte eines jeden Implantats unmittelbar nach der Explantation tiefgefroren und bei -80 °C gelagert. Für die Extraktion der Alkalischen Phosphatase und Ermittlung der enzymatischen Aktivität wurden die Implantate aufgetaut und in 0, 1 M Tris/HCI, 1 % Triton X-100 pH 7,4 (bei 4 °C) mit Hilfe eines Potter S Homogenisators (B. Braun Biotech) aufgesclossen und unlösliche Bestandteile mittels Zentrifugation abgetrennt. Der klare Überstand wurde nachfolgend für die Bestimmung der Aktivität Alkalischer Phosphatase mit dem Testkit Ecoline 25 (Merck) verwendet. Die Konzentration des bei diesem Test freigesetzten 4- Nitrophenols wurde bei 25 °C und λ = 405 nm über 5 min verfolgt und die enzymatische Aktivität nach Gleichung 1 berechnet,
Akt: = Vb + Vs • ΔE • 1000 e - Vs - d t (1 ) wobei Vb das Volumen des Puffers (1 ml) und Vs das der Probe (25 ml) ist. Entsprechend der Herstellerangaben wurde e = 18518 I x mol"1 x cm"1 als molarer Absorptionskoeffizient von 4-Nitrophenol angenommen. Die Einheit der resultierenden Aktivität istpmol x min"1 x ml"1. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 1 und Abbildung 10 zusammengefasst. Die Enzymaktivität in den rh-pro/drBMP-2-haltigen Proben ist gegenüber den (-)-Kontrollen signifikant erhöht, die der rh-drBMP-2-Proben gegen denen mit rh-proBMP-2 jedoch nur geringfügig und auch nicht in jedem Fall (Ausnahmen: Tier 4, 6 und 8). Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Molekulargewichte von rh-proBMP-2 (ca. 45 kDa) und rh-drBMP-2 (ca. 12 kDa) sowie der Tatsache, dass die rh-proBMP-2-Proben nicht gereinigt eingesetzt wurden und somit noch falschgefaltete, monomere Spezies in einem Anteil von bis zu 10 % enthielten, lässt sich feststellen, dass rh-proBMP-2 in diesem Tiermodell eine der (trunkierten) reifen Form des Proteins vergleichbare, Knochenneubildung induzierende Aktivität besitzt.
Tabelle 1 : Vergleich der Aktivität Alkalischer Phosphatase in den mit drBMP-2 oder proBMP-2 beschichteten Implantaten (in U) -TCP
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Ausführungsbeispiel 2: Gewinnung von biologisch aktivem drBMP-2 Limitierte Proteolyse von rh-proBMP-2
Zur präparativen Proteolyse von rh-proBMP-2 wurden 50 ml des naturierten Proteins gegen 0,1 M Tris/HCI pH 7,0, 4 M Harnstoff, 1 mM EDTA dialysiert. Aggregate wurden durch Zentrifugation abgetrennt (75.000 g, 1 h) und die Proteinkonzentration spektrophotometrisch bestimmt (1 ,3 mg/ml). Die Verluste durch die Dialyse betrugen 13 %. Trypsin (Röche Diagnostics) wurde im Verhältnis von 1 : 100 (Trypsin: proBMP-2; w/w) eingesetzt und der Ansatz 4 h bei 5-7 °C inkubiert. Die Inaktivierung von Trypsin erfolgte mit einem 8-fachen molaren Überschuss an Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI; Sigma). Die Dialyse des gesamten Ansatzes gegen harnstofffreien Puffer (0,1 M Tris/HCI pH 7,0) fand in Gegenwart von hydrophoben Säulenmaterial (20 ml Fractogel-Phenyl, Merck) statt. Das so mit drBMP-2 beladenene Säulenmaterial wurde in eine Leersäule (XK-16, Pharmacia) gefüllt und anschließend mit:
• 5 SV (Säulenvolumen) Niedrigsalzpuffer (Dialysepuffer),
• 5 SV 50 mM Na-Acetat pH 5,0,
• 2 SV 50 mM Na-Acetat pH 5,0, 4 M Harnstoff und • 2 SV 50 mM Na-Acetat pH 5,0, 1 M L-Arginin
gewaschen. Eluiert wurde mit 6 M GdmCI, 0,2 M Essigsäure. Die drBMP-2-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und gegen 0,1 % TFA dialysiert. Es konnte keine Aggregatbildung festgestellt werden. Das Dialysat wurde sterilfiltriert und die Proteinkonzentration spektrophotometrisch bestimmt (1 ,3 mg/ml). Die Ausbeute an so gewonnenem BMP-2 betrug ca. 50 % bezogen auf das für die limitierte Proteolyse eingesetzte Renaturat. Aus 1 I Eco//-Kultur lassen sich somit ca. 17 mg biologisch aktiven drBMP-2s gewinnen bzw. 5,2 (entspricht 5,6 mg reifes BMP-2 incl. N-terminaler Heparinbindestelle), bezogen auf 1 g (Feuchtmasse) induzierter Ecσ//-Zellen. Mit dem von Ruppert etal., [Eur. J. Biochem. 237 (1 996), 295--302] beschriebenen Verfahren wurden dagegen nur 0,2 mg BMP-2 je 1 g Zellen erhalten.
Charakterisierung von drBMP-2
Analyse der Proteolyseprodukte durch N-terminale Sequenzierung
Nach SDS-PAGE und Westem-Blot auf eine PVDF-Memran erfolgte die N-terminale Sequenzierung [Edman und Begg, Eur. J. Biochem. 1 (1967), 80-91 ]. Sie ergab für erfindungsgemäß generiertes drBMP-2 folgende Aminosäuresequenzen: a) Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-Arg- b) Lys-Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys- c) Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-
Das Verhältnis der verschiedenen Spezies zueinander beträgt etwa 3:2: 1 (a:b:c). Die Cysteine konnten nicht detektiert werden, jedoch die darauf folgenden Aminosäuren. Die Sequenz wurde jedoch auf DNA-Ebene vollständig verifiziert. Das entspricht dem N-Terminus von reifem BMP-2 ohne die Heparinbindestelle. drBMP-2 wurde in reduzierter und nicht reduzierter Form zur Sequenzierung eingesetzt. Die nicht reduzierte Form konnte lediglich bis zum zweiten Serin sequenziert werden, was dafür spricht, dass der nachfolgende Rest ein Cystin, also Bestandteil einer Disulf idbrücke ist. Insgesamt entspricht somit das Proteolyseprodukt einem N-terminal um 7-9 Aminosäuren verkürzten reifen BMP-2, dem somit die Heparinbindestelle fehlt.
Unter den hier beschriebenen Bedingungen der limitierten Proteolyse werden nicht disulfidverbrückte Peptidketten abgebaut, sodass schließlich nur zu 100 % kovalent dimerisiertes drBMP-2 gewonnen wird. Reinheitsanalyse von drBMP-2 mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und HPLC
Die Größe und Reinheit des erfindungsgemäß gewonnenen drBMP-2 wurde mit SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen und anschließender Silberfärbung kontrolliert (Bahn 6 und 1 1 in Abbildung 4). Es ist zu 100 % dimerisiert bei einer Reinheit von über 95 %.
Weiterhin wurde zur Überprüfung von Reinheit und Homogenität von drBMP-2 Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC; Vydac C4) eingesetzt. drBMP-2 eluierte dabei in einem homogenen Peak bei 46,57 % Acetonitril und 0, 1 % TFA (Abbildung 5), was für die einheitliche Strukturierung und insbesondere Disulfidverbrückung des Proteins spricht.
Circular-Dichroismus-Spektrometrie
Die starke Differenz zwischen der Elliptizität von naturiertem und denaturiertem drBMP-2 und besonders dem reduzierten und denaturierten reifen BMP-2 (IB-Solubilisat) im Bereich 210-230 nm des Fern- UV-CD-Spektrums (Abbildung 6) erlaubt die Feststellung, dass beim erfindungsgemäßen Prozess der Naturierung des Proproteins die Ausbildung von Sekundärstrukturelementen auch in der reifen Domäne des Proteins erfolgt.
Tabelle 2
Betreff: 3 letter code proBMP (incl. 20 AA His-Tag)
MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis etGlyAlaAlaGly e Val '
ProGluLeuGlyArgArgLysPheAlaAlaAJaSerSerGlyArgProSerSerGlriProSerAspGluVal euS eirGlu ' - - .
PheGluLeuArg euLeuSerMetPheGly euLysGlnArgProThrProSerArgAspAlaValValProProT yrMet
LeuAspLeuTyrArgArgHisSerGlyGlnProGlySerProAlaProAspHisArg euGluArgAlaAlaSerA rgAla ' ' •
AsnThrValArgSerP eHisHisGluGluSerLeuGluGlu euProGluThrSerGlyLysThrThrArgArgP hePhe
PheAsnLeuSerSerlleProThrGluGluP elleThrSerAlaGluLeuGlnValP eArgGluGlnMetGlnA spAla
LeuGlyAsnAsnSerSerPheHisHisArglleAsnlleTyrGluIlelleLysProAlaThrAlaAsnSerLysP hePro
ValT rArgLeuLeuAspT rArg euValAsnGlnAsnAlaSerArgTrpGluSerP eAspValThrProAlaV alMet
ArgTrpThrAlaGlnGlyHisAlaAsnHisGlyPheValValGluValAlaHisLeuGluGluLysGlnGlyValS erLys
ArgHisValArglleSerArgSerLeuHisGlnAspGluHisSerTrpSerGlnlleArgProLeuLeuValThrP heGly
HisAspGlyLysGlyHisProLeuHisLysArgGluLysArgGlιιAlaI.ysHisLysGlrιArgLysArg eu ysS erSer
Cys ysArgHisProLeuTyrValAspPheSerAspValGlyTrpAsnAspTrpIleValAlaProProGlyTyrH isAla
PheTyrCysHisGlyGluCysProPhePro etiAlaAspHisLeizAsnSerThrAsriHisAlalleValGlnThr euVal
AsnSerValAsnSerLysIleProLysAlaCysCysValProThrGluLeuSerAlalleSerMet euTyrLeuA spGlu.
AsnGlu ysValValLe LysAsnTyrGlnAspMetValValGluGlyCysGlyCysArg

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines biologisch aktiven Proteins der TGF-/?-Superfamilie, d ad u rch g e k e n nze i c h n et, d ass
(a) ein Protein, dessen Aminoterminus aus der Prosequenz eines Proteins der TGF-?-Superfamilie oder Teilen davon besteht, an den sich die reife Domäne dieses oder eines anderen
Proteins der TGF-?-Superfamilie, das mindestens 35 % Homologie zu reifem BMP-2 aufweist anschließt, in Prokaryonten unter Bedingungen exprimiert wird, bei denen wenigstens ein Teil des Proteins in Form von Einschlusskörpern erhalten wird,
(b) die Einschlusskörper isoliert und unter denaturierenden Bedingungen solubilisiert werden,
(c) das aus den Einschlusskörpern solubilisierte, denaturierte, monomere und biologisch inaktive Protein naturiert wird, wodurch die Faltung und Dimerisierung zur löslichen, biologisch aktiven Konformation ermöglicht wird und
(d) gegebenenfalls nach der Naturierung die proteolytische
Freisetzung des reifen Proteins aus seiner Proform erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d ad u rc h ge ke n n ze i c h n et, dass man drBMP-2 herstellt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ke n n zei c h n et, , dass das Proprotein zur Steigerung der Expression in Prokaryonten mit einem aminoterminalen Affinitätsmarker, insbesondere einer Polyhistidinsequenz modifiziert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass als Expressionsvektor ein pET Vektor, insbesondere pET-15b verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ken n zei c h n et, dass die Codonauswahl des Expressionskonstrukts für die Translation im Wirtsorganismus optimiert ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ken n ze i c h n et, dass im Wirtsorganismus seltene tRNAs, die für die Translation des Expressionskonstrukts erforderlich sind, ebenfalls überexprimiert werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ke n nzeic h n et, dass die Überexpression mit dem T7-Expressionssystem in BL21(DE3) erfolgt und dass mit dem Expressionskonstrukt das Gen für die in Escherichia coli seltene Arginin tRNA (dnaY) cotransformiert wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad urc h g e ke n nze ic h n et, dass der Zellaufschluss durch Hochdruckdispersion, enzymatische Lyse oder Ultraschall erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ken n zei ch n et, dass die Reinigung der Einschlusskörper durch Waschen mit einer detergenzhaltigen Lösung erfolgt, wobei die Detergenzkonzen- tration so gewählt wird, dass störende Zellproteine und Membranbestandteile, aber nicht die Einschlusskörper solubilisiert werden.
10. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, d ad u rch ge ke n n zeic h n et, dass das Detergenz Triton X100 ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch g eken n zeich n et, dass zur Solubilisierung der Einschlusskörper chaotrope Substanzen oder Kombinationen chaotroper Substanzen verwendet werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u rc h g e ken n zei c h n et, dass als chaotrope Substanz Guanidiniumchlorid in einer
Konzentration von 3 bis 8 M oder Harnstoff in einer Konzentration von 6 bis 10 M verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch ge kennzeich n et, dass die Solubilisierung unter reduzierenden Bedingungen erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, d a d u rc h g e ken n z eic h n et, dass als Reduktionsmittel Dithiothreitol oder/und ß-
Mercaptoethanol verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch ge ke n nze i ch n et, dass nach der Solubilisierung die freien Cysteine kovalent modifiziert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, d ad u rc h g e ken n ze i c h n et, dass nach der Solubilisierung das Reduktionsmittel entfernt wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
d ad u rc h g e ken n ze i c h n et, dass nach der Solubilisierung eine Vorreinigung unter denaturierenden Bedingungen erfolgt.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ken nze ic h n et, dass die Naturierung des Proproteins durch Verringerung der Konzentration des oder der Denaturierungsmittel(s) auf ein nicht oder nur schwach denaturierendes Niveau erfolgt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, d ad u rc h g e ken nz e i c h n et, dass die Verringerung der Konzentration des oder der Denatu- rierungsmittei(s) durch langsame kontinuierliche oder schrittweise
Verdünnung des Solubilisats in Naturierungspuffer erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, d ad u rc h g e ke n nz e i ch n et, dass beim Verdünnen eine möglichst gründliche Durchmischung, z.B. durch Rühren erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 18, d ad urc h geken nzeichnet, dass die Verringerung der Konzentration des oder der De- naturierungsmittel durch Dialyse des Solubilisats gegen Naturierungspuffer erfolgt.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n nze i ch n et, dass ein Naturierungspuffer mit neutralem bis alkalischem pH-Wert verwendet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, d a d u rc h g e ke n nze i ch n et, dass der Naturierungspuffer L-Arginin enthält.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h ge ke n nze i ch n et, dass der Naturierungspuffer mindestens eine Thiolkomponente in reduzierter und oxidierter Form enthält.
25. Verfahren nach Anspruch 24, d ad u rc h g e ke n nze i ch n et, dass die Thiolkomponente GSH/GSSH ist.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n nze i c h n et, dass man die Probe nach Abschluss des Naturierungsprozesses gegen einen sauren Puffer dialysiert.
27. Verfahren nach Anspruch 26, d a d u rc h g eken nz e i ch n et, dass die Probe vor der Dialyse gegen den sauren Puffer aufkonzentriert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, d a d u rch gekennze i c h n et, dass die im Sauren unlöslichen Bestandteile abgetrennt werden.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n nze i c h n et, dass die Proform chromatographisch gereinigt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass die Reinigung mittels RP-HPLC erfolgt.
31. Verfahren nach Anspruch 29, d a d u rch geke n n ze i ch n et, dass die Reinigung mittels Heparin-Affinitätschromatograüphie erfolgt.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n nze i c h n et, dass die Spaltung der Proform zur biologisch aktiven Form enzymatisch durch eine Protease erfolgt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, d a d u rc h g e ke n nze i c h n et, dass man als Protease eine Prohormonkonvertase verwendet.
34. Verfahren nach Anspruch 32, d a d u rc h g e ke n nze ic h n et, dass man eine Protease verwendet, die ein dibasisches Sequenzmotiv erkennt.
35. Verfahren nach Anspruch 32, d ad u rch gekennzeichnet, dass man eine Protease verwendet, die in P1 -Position (unmittelbar aminoterminal der Schnittstelle) einen basischen Rest bevorzugt.
36. Verfahren nach Anspruch 35, d ad u rch geken nzei ch net, dass die Spaltung durch Trypsin erfolgt.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, d ad urch geken nzei chn et, dass man zur Limitierung der Proteolyse mindestens einen
Proteaseninhibitor zusetzt.
38. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch geken nzei chn et, dass man die Löslichkeit des freigesetzten Proteins bei dem pH, bei dem die Spaltung stattfindet, durch Lösungsvermittler, die das Enzym nicht inhibieren, erhöht.
39. Verfahren nach Anspruch 38, d a d u r c h g e ke n n z e i c h n et , dass man als Lösungsvermittler Trishydroxymethylaminomethan oder/und Harnstoff verwendet.
40. Verfahren nach Anspruch 39, d a d u rc h ge ke n nze i c h n et, dass man 0,1 bis 2 molar Trishydroxymethylaminomethan oder/und 1 bis 5 molar Harnstoff verwendet.
41. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass man das reife bzw. trunkierte reife Protein durch Präzipitation oder/und hydrophobe Chromatographie reinigt.
42. Verfahren nach Anspruch 41 , d a d u rc h ge ken n ze ic h n et, dass man isoelektrisch präzipitiert und das ausgefällte Protein in saurer Lösung resolubilisiert.
43. Verfahren nach Anspruch 41, d ad u rc h ge ken n ze i c h n et, dass man durch Verminderung der Lösungsvermittlerkonzentration präzipitiert.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 43, d ad u rch g eke n n zei ch n et, dass man in Gegenwart von chromatographischem Material präzipitierende Bedingungen einstellt.
45. Verwendung der nach Anspruch 1a bis c erhaltenen Proform von BMP-2 zur Herstellung eines Arzneimittels.
46. Verwendung nach Anspruch 45 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung von Knochenheilungs- und
Knochenneubildungsprozessen.
47. proBMP-2 mit der Aminosäuresequenz Gly20-Arg396 von Tabelle 2 und identische Sequenzen, denen ein Teil der pro-Sequenz Gly20- Arg282 fehlt, erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 1..
48. Mittel zur Förderung des Knochenwachstums, g e ke n nzei ch net d u rch einen Gehalt an proBMP-2 gemäß Tabelle 2 mit der vollständigen oder trunkierten pro-Sequenz Gly20-Arg282 als Wirkstoff.
49. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Förderung des Knochenwachstums, d ad u rch gekennzeich n et, dass proBMP-2 gemäß Tabelle 2 mit der vollständigen oder trunkierten pro-Sequenz Gly20-Arg282 in eine zur Verabreichung geeignete Zubereitung formuliert wird.
50. Verfahren nach Anspruch 49, d ad u rch ge kennzeich n et, dass die Zubereitung ein physiologisch verträgliches Trägermaterial umfasst, welches mit dem proBMP-2-Wirkstoff beschichtet oder imprägniert ist.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006508049A (ja) * 2002-08-13 2006-03-09 ワイエス 増殖因子βタンパク質を形質転換するための可溶化賦形剤としてのペプチド
CN104961820A (zh) * 2015-06-02 2015-10-07 烟台正海生物科技股份有限公司 一种重组人骨形态发生蛋白-2的循环层析复性方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050282713A1 (en) * 2004-03-31 2005-12-22 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Hydrodynamic bearing device and spindle motor using the same
CN1824773B (zh) * 2005-02-25 2010-06-23 东北师范大学遗传与细胞研究所 人睾丸特异性蛋白50基因表达调节剂筛选系统及筛选其基因表达调节剂的方法
CA2612479A1 (en) * 2005-06-29 2007-05-10 Cameron Malcolm Lang Clokie Production of bone morphogenic proteins (bmps) in transgenic mammals
CN100410371C (zh) * 2006-05-13 2008-08-13 暨南大学 一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法
US8114428B2 (en) * 2007-03-08 2012-02-14 Sbf Synthetic Bone Factory Gmbh Methods for manufacturing a composition for treating bone and/or cartilage defects
CA2688232A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Induce Biologics Inc. A method of enhancing recombinant protein production
AU2009200540A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-21 Induce Biologics Inc. Use of immobilized antagonists for enhancing growth factor containing bioimplant effectiveness
WO2010098421A1 (ja) * 2009-02-27 2010-09-02 株式会社オステオファーマ 改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質
US8825859B2 (en) * 2009-12-23 2014-09-02 Citrix Systems, Inc. System and methods for mixed mode of IPv6 and IPv4 DNS of global server load balancing
WO2011079198A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Citrix Systems, Inc. Systems and methods for mixed mode of ipv6 and ipv4 dns of global server load balancing
US9098335B2 (en) 2009-12-23 2015-08-04 Citrix Systems, Inc. Systems and methods for managing spillover limits in a multi-core system
US9757330B2 (en) 2013-10-18 2017-09-12 Industrial Technology Research Institute Recipe for in-situ gel, and implant, drug delivery system formed thereby
CN104163865A (zh) * 2014-07-01 2014-11-26 杭州瑞固生物技术有限公司 优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的dna序列及其编码蛋白质
CN111574583B (zh) * 2020-04-10 2021-06-25 上海海路生物技术有限公司 蛋白复性试剂及其应用
CN114133444A (zh) * 2021-11-25 2022-03-04 中国人民解放军总医院第四医学中心 人源bmp2及其类似物的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5013649A (en) * 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
WO1997000886A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
WO1998055137A1 (en) * 1997-06-03 1998-12-10 Nimni Marcel E Bone morphogenetic proteins and their use in bone growth
WO2000056879A1 (en) * 1999-03-22 2000-09-28 Universität Zürich TRANSFORMING GROWTH FACTOR (TFG) β SUPERFAMILY ANTAGONISTS

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5674844A (en) * 1991-03-11 1997-10-07 Creative Biomolecules, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US6395883B1 (en) * 1991-03-11 2002-05-28 Curis, Inc. Soluble morphogenic protein complex compositions of matter
WO1993005751A2 (en) * 1991-08-30 1993-04-01 Creative Biomolecules, Inc. Osteogenic proteins in the treatment of bone deseases
CN1165189A (zh) * 1996-05-10 1997-11-19 中国人民解放军第四军医大学 大肠杆菌表达制备具诱骨活性的人骨形成蛋白-3

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5013649A (en) * 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
WO1997000886A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
WO1998055137A1 (en) * 1997-06-03 1998-12-10 Nimni Marcel E Bone morphogenetic proteins and their use in bone growth
WO2000056879A1 (en) * 1999-03-22 2000-09-28 Universität Zürich TRANSFORMING GROWTH FACTOR (TFG) β SUPERFAMILY ANTAGONISTS

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EPODOC [Online] EUROPEAN PATENT OFFICE, THE HAGUE, NL; XP002216822 & CN 1 165 189 A (NO 4 ARMY MEDICAL SCHOOL) 19. November 1997 (1997-11-19) *
EDER J. ET AL.: "Pro-sequence-assisted protein folding" MOLECULAR MICROBIOLOGY, Bd. 16, Nr. 4, 1995, Seiten 609-614, XP008008992 *
GRAY A.M. ET AL.: "Requirement for Activin A and Transforming Growth Factor-beta 1 Pro-Regions in Homodimer Assembly" SCIENCE, Bd. 247, Nr. 4948, 16. März 1990 (1990-03-16), Seiten 1328-1330, XP001109030 *
LILIE H. ET AL.: "Advances in refolding of proteins produced in E.coli" CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, Bd. 9, 1998, Seiten 497-501, XP002216689 *
RUDOLPH R ET AL: "IN VITRO FOLDING OF INCLUSION BODY PROTEINS" FASEB JOURNAL, Bd. 10, Nr. 1, 1996, Seiten 49-56, XP000605154 ISSN: 0892-6638 *
RUPPERT R ET AL: "HUMAN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 CONTAINS A HEPARIN-BINDING SITE WHICH MODIFIES ITS BIOLOGICAL ACTIVITY" EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, Bd. 237, Nr. 1, April 1996 (1996-04), Seiten 295-302, XP000891887 ISSN: 0014-2956 *
See also references of EP1339744A2 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006508049A (ja) * 2002-08-13 2006-03-09 ワイエス 増殖因子βタンパク質を形質転換するための可溶化賦形剤としてのペプチド
CN104961820A (zh) * 2015-06-02 2015-10-07 烟台正海生物科技股份有限公司 一种重组人骨形态发生蛋白-2的循环层析复性方法
CN104961820B (zh) * 2015-06-02 2018-07-20 烟台正海生物科技股份有限公司 一种重组人骨形态发生蛋白-2的循环层析复性方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE10059336A1 (de) 2002-06-13
US7354901B2 (en) 2008-04-08
CN1484651A (zh) 2004-03-24
EP1339744A2 (de) 2003-09-03
CN100469790C (zh) 2009-03-18
JP2004514441A (ja) 2004-05-20
DE50115313D1 (de) 2010-03-04
ATE455126T1 (de) 2010-01-15
US20040018595A1 (en) 2004-01-29
EP1339744B1 (de) 2010-01-13
WO2002044203A3 (de) 2003-04-10
AU2002220734A1 (en) 2002-06-11

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