DE69930938T2

DE69930938T2 - Verfahren zur herstellung eines peptids mit einem pi grösser als 8 oder kleiner als 5

Info

Publication number: DE69930938T2
Application number: DE69930938T
Authority: DE
Inventors: Stephen N. Los Altos POLLITT; I. Douglas Woodside BUCKLEY; A. Peter Menlo Park STATHIS; E. Taymar Menlo Park HARTMAN; Ziyang Union City ZHONG
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-07-09
Also published as: CN1521261A; DE69930938D1; JP2002520018A; WO2000003011A2; US6303340B1; ES2374829T3; EP2305815B1; CA2334160A1; EP2305815A1; PT1095141E; JP4741076B2; CN1170932C; EP1095141B1; CA2334160C; AU4859599A; PT1714972E; CN1242062C; CN1313896A; JP5291137B2; CY1106110T1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, die nützlich in der Herstellung von Peptiden sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren die Herstellung von Peptiden, die pl-Werte unter etwa 5 oder über etwa 8 aufweisen. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Herstellung des natriuretischen Peptids vom B-Typ.
Die vorliegende Erfindung betrifft wirksame Verfahren zur Expression und Gewinnung eines Peptids, insbesondere wenn das Peptid, das man herzustellen wünscht, einen hohen oder niedrigen pl-Wert aufweist, was die Anwendung von Ionenaustausch(er)chromatographie als einen Schritt bei der Aufreinigung des Peptids wünschenswert macht. Die Erfindung wird vermittels eines natriuretischen Peptids vom B-Typ veranschaulicht, das einen relativ hohen pl-Wert aufweist. Nichtsdestotrotz wird der Fachmann anerkennen, dass die hier offenbarten Verfahren in der Herstellung anderer Peptide entweder mit hohem oder mit niedrigem pl-Wert eingesetzt werden können.
Bekanntermaßen ist die Herstellung von Peptiden mit weniger als etwa 50 Aminosäuren Länge durch Expression der Peptid-kodierenden DNA in einer rekombinanten Wirtszelle wie E. coli üblicherweise mit dem Problem des enzymatischen Abbaus des exprimierten Peptids innerhalb der Wirtszelle behaftet. Dies hat den teilweisen oder kompletten Verlust des Peptids zur Folge. Beispielsweise beschreibt die WO97/35009 ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Peptids mit einem hohen oder niedrigen pl-Wert. Jedoch ist das am häufigsten eingesetzte Mittel zur Ausräumung dieses Problems die Insolubilisierung des Peptids innerhalb der Wirtszelle. Die kann durch Expression des Peptids als ein Fusionsprotein erreicht werden, wobei das Peptid mit einem Fusionspartner verknüpft ist. Üblicherweise wird der Fusionspartner mit dem N-Terminus des Peptids verknüpft. Das Fusionsprotein bildet Einschlusskörper innerhalb der Zelle, innerhalb derer das Peptid vor dem Abbau durch proteolytische Enzyme geschützt ist.
Sobald die Einschlusskörper aus der Wirtszelle gewonnen worden sind, muss das Peptid von der Signalsequenz abgetrennt, gereinigt und in aktiver Form wieder gewonnen werden. Die Abtrennung von der Signalsequenz kann dadurch erreicht werden, dass man eine Sequenz von Aminosäuren an der Verbindungsstelle von Signalsequenz und Peptid einfügt, die unter geeigneten Bedingungen spezifisch erkannt und gespalten wird, z.B. durch Säurespaltung oder enzymatische Spaltung. Die enzymatische Spaltung ist für die Herstellung im kommerziellen Umfang durch die hohen Kosten für das Enzym und dessen beschränkte zeitliche Verwendbarkeit häufig nicht praktikabel, selbst wenn man es auf einer immobilisierten Säule einsetzt.
Eine Säurespaltung kann durch Einfügen eines spezifischen Dipeptids an der Verbindungsstelle von Signalsequenz und Peptid erreicht werden, wobei die erste Aminosäure im Dipeptid Asparaginsäure ist. Die Auswahl der zweiten Aminosäure wird die Rate bestimmen, mit der die Dipeptidbindung unter sauren Bedingungen gespalten wird. Falls das gewünschte Peptid irgendwelche internen, durch Säure spaltbare Dipeptidsequenzen aufweist, muss die Spaltstelle an der Verbindung zwischen der Signalsequenz und dem Peptid natürlich mit einer wesentlich höheren Rate durch Säure gespalten werden als dies bei der internen Spaltung der Fall ist, um einen unannehmbar hohen Verlust an Ausbeute zu vermeiden. Die relativen Reaktionsraten von durch Säure spaltbaren Dipeptiden sind wie folgt: Dipeptid Relative Reaktionsrate

Dipeptid Relative Reaktionsrate

Asp-Pro^* 10x

Asp-X X=Gly^*, Ser^*, Leu^*, Ile, Val 1x

Asp-Lys^* 0,5x

Asp-Arg^** 0,2x

^* F. Marcus, Intl. J. Peptide and Protein Res. 25 (1985), 542-546
^** unsere Beobachtungen

Vor der enzymatischen Spaltung oder der Säurespaltung wird das Fusionsprotein in den Einschlusskörpern üblicherweise durch Behandlung mit einem chaotropen Wirkstoff solubilisiert, der die Auffaltung der Proteinstruktur bewirkt. Das solubilisierte Fusionsprotein wird dann gespalten, das gewünschte Peptid isoliert und aufgereinigt und das Peptid wird dann Bedingungen unterworfen, die seine Rückfaltung in eine biologisch aktive Konformation bewirken, z.B. durch Entfernen des chaotropen Wirkstoffes und Oxidation, sofern nötig, um interne Disulfidbrücken auszubilden.
Das als natriuretisches Peptid vom B-Typ oder BNP bekannte Peptid kommt in Menschen als Peptid mit 32 Aminosäuren vor, das in vivo durch Spaltung eines 134 Aminosäuren langen Vorläuferproteins erzeugt wird. Die DNA-Sequenz, welche den menschlichen natriuretischen Vorläufer vom B-Typ kodiert, ist isoliert worden (US-A 5,114,923). Für das natriuretische Peptid vom B-Typ ist in klinischen Versuchen am Menschen gezeigt worden, dass es die Herzfunktion ohne direkte Stimulierung des Herzens (die unerwünschte Nebenwirkungen wie Herzrhythmusstörungen verursachen kann) verbessert und dass es die Werte an Neurohormonen vermindern kann, die mit erhöhter Sterblichkeit und Beschleunigung des Fortschritts des Herzversagens einhergehen. Dementsprechend ist es nützlich bei der Behandlung von Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz.
Während das natriuretische Peptid vom B-Typ bestimmte klinische Vorteile gegenüber anderen Arzneimitteln bei der Behandlung von Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz aufweist, könnten die relativ hohen Kosten bei der Herstellung von Peptidmedikamenten im Vergleich zu den Kosten bei der Herstellung von nicht-peptidischen Medikamenten deren Akzeptanz in der klinischen Praxis behindern. Daher besteht ein Bedarf an der Bereitstellung hocheffizienter Mittel zur Herstellung von natriuretischem Peptid vom B-Typ, wodurch die Kosten minimiert werden können. Die rekombinante Herstellung des Peptids in der Form von Einschlusskörpern bereitet verschiedene Probleme. Der Einsatz enzymatischer Spaltung eines Fusionsproteins zum Erhalt des natriuretischen Peptids vom B-Typ ist wegen der hohen Kosten für die dazu nötigen Enzyme nicht erwünscht. Sofern man sich den relativ hohen pl-Wert des natriuretischen Peptids vom B-Typ (≥ 10) zur Durchführung einer Ionenaustauscherchromatographie als einem Reinigungsschritt zunutze machen möchte, dann muss die Verwendung eines ionischen chaotropen Agens wie Guanidinhydrochlorid vermieden werden, da das ionische Chaotrop mit der Ionenaustauscherchromatographie interferiert. Andererseits ist der Einsatz von Harnstoff, dem am häufigsten eingesetzten nicht-ionischen chaotropen Agens problematisch, falls man Säurespaltung beim Fusionsprotein einsetzen möchte. Bei hoher Temperatur und sauren Bedingungen bewirkt die Anwesenheit von Harnstoff den Abbau des Peptids.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird Säurespaltung des Fusionsproteins in Abwesenheit von chaotropen Agenzien durchgeführt, wodurch ein lösliches natriuretisches Peptid vom B-Typ erhalten wird. Das lösliche Peptid kann vom Fusionspartner und anderen Verunreinigungen, die unlöslich bleiben, durch den Einsatz geeigneter Verfahren abgetrennt werden, die bekanntermaßen für die Trennung von löslichen und unlöslichen Proteinen eingesetzt werden können. Beispiele hierfür sind Ultrafiltration, Diafiltration und Zentrifugation. Da Ultrafiltration und Zentrifugation aus kommerzieller Sicht suboptimale Schritte darstellen, verwendet eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Solubilisierung des unlöslichen Materials, gefolgt von einer Spaltung, der Behandlung mit einem nicht-ionischen chaotropen Agens wie Harnstoff und der Isolierung des natriuretischen Peptids vom B-Typ vermittels Ionenaustauscherchromatographie.
Die vorliegende Erfindung stellt ein wirksames Verfahren zur Herstellung eines Peptids bereit, das einen pl-Wert über etwa 8 oder unter etwa 5 besitzt. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte:

a) Exprimieren des Peptids in einer rekombinanten Wirtszelle als Fusionsprotein, in welchem das gewünschte Peptid an seinem N-Terminus mit einem Fusionspartner fusioniert ist, der eine Aminosäuresequenz mit einem Asp-Rest an seinem C-Terminus umfasst, wobei (i) der C-terminale Asp-Rest des Fusionspartners und der N-terminale Rest des Peptids eine Bindung ausbilden, welche unter sauren Bedingungen spaltbar ist; (ii) das Peptid eine ausreichend unterschiedliche Nettoladung von der des Fusionspartners und allen unerwünschten Fragmenten hat, die durch die saure Spaltung des Fusionsproteins entstanden sind, um es von dem Fusionspartner und allen unerwünschten Fragmenten der sauren Spaltung des Fusionsproteins durch Ionenaustauscherchromatographie abtrennen zu können, und (iii) das Fusionsprotein innerhalb der rekombinanten Wirtszelle Einschlusskörper bildet;
b) Gewinnen der Einschlusskörper aus der rekombinanten Wirtszelle;
c) Abspalten des Peptids von dem Fusionspartner, indem das Fusionsprotein sauren Bedingungen in Abwesenheit eines Chaotrops unterworfen wird;
d) Solubilisieren von unlöslichen Spaltprodukten, indem diese mit einem nicht-ionischen Chaotrop unter Bedingungen behandelt werden, die diese solubilisieren ohne die primäre Struktur des Peptids abzubauen; und
e) Isolieren des Peptids durch Ionenaustauscherchromatographie.

Beschrieben wird ferner ein Expressionsvektor, der für die Expression eines Fusionsproteins eingesetzt werden kann, das unter sauren Bedingungen gespalten werden kann, wodurch ein erwünschtes Peptid mit einem pl-Wert über 8 oder unter 5 erhalten wird. Der Vektor umfasst:

(a) einen regulatorischen Bereich, der die Expression des Fusionsproteins in der Wirtszelle steuern kann;
(b) eine DNA-Sequenz, die mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz von modifizierter Chloramphenicol-Acetyltransferase kodiert, in der eine ausreichende Anzahl von Kodons, die Lysin-, Arginin- und/oder Histidinreste kodieren, ausgetauscht wurden durch Kodons, die ungeladene oder negativ geladene Aminosäuren kodieren, so dass der pl-Wert des Fusionsproteins zwischen 6,0 und 8,0 liegt;
(c) ein Asparaginsäure kodierendes Kodon, das mit dem 3'-Ende der modifizierte Chloramphenicol-Acetyltransferase kodierenden DNA-Sequenz entweder direkt oder über eine Linkersequenz verknüpft ist; und
(d) eine das gewünschte Peptid mit einem pl-Wert über 8 oder unter 5 und einem Prolin-, Glycin-, Serin-, Leucin-, Alanin-, Isoleucin- oder Valinrest an seinem N-Terminus kodierende DNA-Sequenz, die an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der die modifizierte Chloramphenicol-Acetyltransferase kodierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Aminosäuresequenz einer modifizierten Chloramphenicol-Acetyltransferase, die als Fusionspartner bei der Herstellung des natriuretischen Peptids vom B-Typ eingesetzt wurde.
2 zeigt die DNA-Sequenz des Wildtyp phoA-Promotors in der oberen Zeile und des modifizierten phoA-Promotors in der unteren Zeile.
3 ist ein Plasmiddiagramm von pTH85.
4 ist ein Plasmiddiagramm von pSP54.
5 ist ein Plasmiddiagramm von pCB101-1.
6 ist ein Plasmiddiagramm von pTH76.
7 ist ein Plasmiddiagramm von pTH53.
Genaue Beschreibung der Erfindung
A. Erfindungsgemäßes Herstellungsverfahren
Das erfindungsgemäße Verfahren wird eingesetzt, um gereinigte Peptide mit einem pl-Wert über etwa 8 und unter etwa 5 herzustellen. Während die Erfindung hier beispielhaft anhand des natriuretischen Peptids vom B-Typ erläutert wird, das einen relativ hohen pl-Wert aufweist, ist anzuerkennen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch auf die Herstellung von Peptiden mit niedrigen pl-Werten angewendet werden kann, sofern das gewünschte Peptid eine ausreichend unterschiedliche Nettoladung von der des Fusionspartners und allen unerwünschten Fragmenten hat, die durch die saure Spaltung des Fusionsproteins entstanden sind aufweist (d.h. Fragmenten, die durch Spaltung an anderen Stellen als der Verbindungsstelle von Fusionspartner und gewünschtem Peptid erhalten wurden), um das gewünschte Peptid von dem Spaltungsgemisch durch Ionenaustauscherchromatographie isolieren zu können. Die Differenz in der Nettoladung zwischen dem Peptid und den anderen Spaltprodukten, einschließlich jeglichem intakten Fusionspartner in dem Spaltungsgemisch, beträgt vorzugsweise mindestens +/-2, stärker bevorzugt mindestens +/-3. Sofern also ein Fusionspartner ausgewählt wird, der eine oder mehrere innere durch Säure spaltbare Stellen aufweist, dann sollte jedes der Spaltprodukte des Fusionspartners eine Nettoladung aufweisen, die sich ausreichend von der des gewünschten Peptids unterscheidet, so dass es durch Ionenaustauscherchromatographie von dem Peptid abgetrennt werden kann.
Der Fusionspartner wird auch mit Blick auf die Bildung von Einschlusskörpern durch das Fusionsprotein ausgesucht. Die Auswahl eines geeigneten Fusionspartners zu diesem Zweck wird teilweise von der Natur des hergestellten Peptids abhängen.
Vorzugsweise enthält der Fusionspartner mindestens etwa 50 Aminosäurereste. Während es keine strikten Obergrenze bezüglich der Anzahl an Aminosäureresten im Fusionspartner gibt, geht diese vorzugsweise nicht über etwa 100 hinaus, da eine größere Anzahl von Aminosäureresten beim Fusionspartner sich üblicherweise in einer niedrigeren Ausbeute an gewünschtem Peptid niederschlägt. Ferner ist bevorzugt, dass ein Fusionspartner nach dem Kriterium ausgewählt wird, dass das Fusionsprotein etwa 25 bis etwa 50 hydrophobe Aminosäurereste enthält, welche die Bildung von Einschlusskörpern fördern.
Der Fusionspartner weist einen Asp-Rest an seinem C-Terminus auf, wo er mit dem N-Terminus des Peptids verknüpft ist.
Vorzugsweise wird der Fusionspartner so gewählt, dass der pl-Wert des Fusionsproteins zwischen 6,0 und 8,0 liegt, stärker bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5. Ein besonders bevorzugter Fusionspartner der vorliegenden Erfindung enthält mindestens einen N-terminalen Bereich einer modifizierten Chloramphenicol-Acetyltransferase. Die Aminosäuresequenz der Chloramphenicol-Acetyltransferase wird so modifiziert, dass eine ausreichende Anzahl von Lysin-, Arginin- und/oder Histidinresten durch ungeladene oder negativ geladene Aminosäuren ersetzt wird, so dass das Fusionsprotein einen pl-Wert zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 aufweist. Zusätzliche Änderungen, die an der Chloramphenicol-Acetyltransferasesequenz vorgenommen werden können, schließen ein: (a) Austausch der Cystein-, Tryptophan- und Methioninreste durch Reste, die nicht Cystein-, Tryptophan- und Methioninreste sind; und (b) Austausch einer oder mehrerer saurer oder basischer Reste, soweit notwendig, durch hydrophobe Reste, um eine Landungsbalance zu erzielen.
Der Austausch der Tryptophan-, Cystein- und Methioninreste dient dazu, unerwünschte oxidative Nebenreaktionen zu vermeiden, in die das gewünschte Peptid einbezogen werden könnte. Der Austausch von Lysin, Arginin und/oder Histidin durch hydrophobe Reste reduziert den pl-Wert und den Prozentsatz geladener Reste im Fusionspartner und führt Hydrophobizität ein, wodurch die Bildung von Einschlusskörpern gefördert wird. Der Asp-Rest am C-Terminus der modifizierten Chloramphenicol-Acetyltransferasesequenz kann mit der Chloramphenicol-Acetyltransferasesequenz direkt oder über eine Linkersequenz verbunden sein. Eine Linkersequenz kann als Ergebnis der Translation von Kodons vorhanden sein, die in den Expressionsvektor eingeführt wurden, um eine Restriktionsspaltstelle zu erhalten. Falls das wunschgemäß durch das erfindungsgemäße Verfahren herzustellende Peptid eine interne durch Säure spaltbare Stelle aufweist, dann muss die an der Verbindungsstelle von Fusionspartner und Peptid gebildete, durch Säure spaltbare Stelle dergestalt sein, dass sie eine höhere Reaktionsrate als die interne Spaltstelle aufweist, wie vorstehend angegeben. So enthält menschliches natriuretisches Peptid vom B-Typ beispielsweise ein internes Arg-Arg-Dipeptid, das anfällig für eine saure Spaltung ist. Erfindungsgemäß haben wir dieses Peptid in Fusion mit einer modifizierten Chloramphenicol-Acetyltransferasesequenz exprimiert, wobei durch die Verbindung des Fusionspartners mit dem natriuretischen Peptid vom B-Typ ein Asp-Ser-Dipeptid gebildet wird. Aufgrund der unterschiedlichen Raten der sauren Spaltung der beiden Dipeptide waren wir in der Lage, gute Ausbeuten an gewünschtem Peptid zu erhalten und zwar ungeachtet des Verlustes von einem Teil des Peptids durch Spaltung an der inneren Spaltstelle. In einer anderen Ausführungsform haben wir das erfindungsgemäße Verfahren dazu benutzt, natriuretisches Peptid von B-Typ (2-32) herzustellen. Dieses Molekül hat eine biologische Aktivität, die der der Form mit voller Länge, also 32 Aminosäuren entspricht und aufgrund der Anwesenheit von Prolin am N-Terminus wird eine noch effizientere Spaltung vom Fusionspartner und gleichzeitig eine erhöhte Ausbeute erreicht.
Das Fusionsprotein wird unter Verwendung bekannter Verfahren zur Herstellung rekombinanter DNA in einer Wirtszelle exprimiert. Es kann jede für die Expression von Proteinen durch rekombinante DNA-Verfahren als nützlich bekannte, geeignete Wirtszelle eingesetzt werden, einschließlich prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen und Zelllinien. E. coli ist eine bevorzugte Wirtszelle. Die Wirtszelle enthält einen Expressionsvektor, der das Fusionsprotein unter der Kontrolle einer regulatorischen Sequenz kodiert, die seine Expression in dem Wirt steuern kann, wie auch einen Replikationsursprung, der in der Wirtszelle funktioniert. Der Vektor kann ferner andere üblicherweise in der rekombinanten DNA-Technologie eingesetzte DNA-Sequenzen enthalten wie Sequenzen, die Selektionsmarker kodieren.
Die den Expressionsvektor enthaltende Wirtszelle wird wachsen gelassen und das Fusionsprotein unter geeigneten Bedingungen exprimiert. Die Bedingungen für das Wachstum der Wirtszelle und die Expression des Fusionsproteins werden sich unterscheiden und zwar abhängig von verschiedenen Faktoren wie der eingesetzten Wirtszelle, dem Promotor und dem bestimmten exprimierten Fusionsprotein. Der Fachmann ist in der Lage, geeignete Bedingungen für das individuell verwendete Wirt-/Vektorsystem zu ermitteln.
Nachdem das Fusionsprotein in der Form von Einschlusskörpern exprimiert worden ist, werden die Einschlusskörper aus den Wirtszellen gewonnen. Dies kann durch bekannte Verfahren geschehen, wie beispielsweise die chemische oder mechanische Lyse der Zellen und die Abtrennung der Einschlusskörper durch Zentrifugation. Üblicherweise verdünnen wir eine Zellpaste in mehreren Volumen eines Lysepuffers und lysieren die Zellen durch mehrere Passagen durch einen AVP Gaulin Homogenierungsapparat bei 9.000-10.000 psi („pounds per square inch"; Pfund pro Quadratzoll). Das Zelllysat wird dann in Puffer weiter verdünnt und zentrifugiert, wodurch die Einschlusskörper erhalten werden.
Die Einschlusskörper werden anschließend sauren Bedingungen unterworfen, wodurch der Fusionspartner vom gewünschten Peptid getrennt wird. Spaltung in saurem Milieu wird in Abwesenheit eines chaotropen Agens durchgeführt, um das Peptid nicht Bedingungen auszusetzen, die seinen Abbau herbeiführen würden. Die Spaltung kann durch Suspendierung der Einschlusskörper in einer wässrigen sauren Lösung bei erhöhter Temperatur erreicht werden. Vorzugsweise werden die Einschlusskörper zu zwischen 5% und 15% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt zu zwischen 5% und 8% (Gew./Vol.) in einer sauren Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 1,7 und 2,2, vorzugsweise zwischen 1,9 und 2,1 suspendiert. Für die Spaltung ist HCl eine bevorzugte Säure. Es können jedoch auch andere Säuren eingesetzt werden, einschließlich beispielsweise Essigsäure und Phosphorsäure. Die Spaltung wird bei einer ausreichend hohen Temperatur und für eine ausreichend lange Zeit durchgeführt, um die Ausbeute zu maximieren. Typischerweise wird die Spaltung bei einer Temperatur zwischen etwa 75°C und etwa 95°C für eine Dauer von etwa 2 bis etwa 10 Stunden durchgeführt. Bei der Herstellung von natriuretischem Peptid vom B-Typ haben wir die Spaltung durch Säure durch Verdünnung der Einschlusskörper auf 10 % (Gew./Vol.) in Wasser, Einstellen des pH-Wertes mit HCl auf 2,0 und Beibehalten der Konditionen bei 85°C für 4,5 bis 5,5 Stunden (vorzugsweise) durchgeführt.
Da Ultrafiltration und Ausfällen aus kommerzieller Sicht suboptimale Schritte darstellen wird bevorzugt, dass der Fusionspartner und das Peptid nach der Spaltung durch Behandlung mit einem nicht-ionischen Chaotrop, vorzugsweise Harnstoff, solubilisiert werden und das Peptid anschließend vermittels Ionenaustauscherchromatographie isoliert wird. Die Suspension wird vorzugsweise auf 50°C oder eine niedrigere Temperatur abgekühlt, beispielsweise unter 40°C, bevor das Chaotrop zugegeben wird. Die Solubilisierung kann durch Zugabe von festem Harnstoff zu einer Konzentration von etwa 3 M bis etwa 7 M und Beibehalten der Bedingungen bei einer Temperatur unterhalb 40°C, vorzugsweise in etwa bei Raumtemperatur (18-25°C) durchgeführt werden.
Nach Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 3 und 7,5, vorzugsweise 3,8 bis 4,2 kann die die Spaltprodukte Fusionspartner und Peptid enthaltende Lösung direkt auf eine Ionenaustauschersäule geladen werden. Jede kommerziell verfügbare Ionenaustauschersäule kann verwendet werden, die für das zu isolierende Peptid geeignet ist. Für das natriuretische Peptid vom B-Typ wurde eine Sulfopropyl-Ionenaustauschersäule (Pharmacia Streamline^®) verwendet. Die Säule wird äquilibriert und gewaschen, um Verunreinigungen zu eluieren. Das gewünschte Peptid wird anschließend unter Verwendung einer geeigneten Salzkonzentration von der Säule eluiert. Die Elution von der Säule wurde für das natriuretische Peptid vom B-Typ mit einer 0,5–0,6 M, vorzugsweise NaCl-Lösung bewerkstelligt.
In vielen Fällen wird das von der Ionenaustauschersäule erhaltene Peptid sich in seine native Konformation rückfalten. Es können jedoch zusätzliche Schritte nötig sein, um das Peptid in eine biologische aktive Form zurückzuführen, insbesondere wenn das Peptid die Bildung von internen Disulfidbrücken für die Aktivität benötigt. Das natriuretische Peptid vom B-Typ enthält zwei Cysteinreste, die eine Disulfidbrücke bilden müssen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass man das gewonnene Peptid oxidativen Bedingungen unterwirft. Eine Oxidation kann üblicherweise dadurch erreicht werden, dass man eine Lösung des Peptids hitzebehandelt und in Gegenwart von Luft rührt. In einer anderen Ausführungsform können Oxidationsmittel wie Cu⁺², I_3- oder Fe(CN)₆ ^-3 eingesetzt werden.
Sofern gewünscht, können weitere Reinigungsschritte unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Solche Schritte können beispielsweise HPLC wie RP-HPLC oder zusätzliche Ionenaustauscherchromatographie-Schritte einschließen. Im Falle des natriuretischen Peptids vom B-Typ wurde das gewonnene Peptid RP-HPLC in einem Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0–5,5 und einem Acetonitril-Elutionsgradienten unterworfen.
B. Der Expressionsvektor
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner einen Expressionsvektor, der für die Durchführung des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens geeignet ist. Der Expressionsvektor verwendet eine DNA-Sequenz, die mindestens einen N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) kodiert, welche derart modifiziert wurde, dass eine ausreichende Anzahl von Kodons für Lysin-, Arginin- und/oder Histidinreste durch Kodons für ungeladene oder negativ geladene Aminosäuren ersetzt wurde, so dass der pl-Wert für das Fusionsprotein sich zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 bewegt. Vorteilhafterweise können einige der Lysin-, Arginin- und/oder Histidinreste durch hydrophobe Reste ersetzt werden, was nicht nur die Nettoladung des Fusionspartners herabsetzt, sondern auch die Bildung von Einschlusskörpern innerhalb der Wirtszelle fördert. Sofern erwünscht, können eines oder mehrere Kodons für Tryptophan-, Cystein- und/oder Methioninreste in der nativen CAT-Sequenz durch Kodons ersetzt werden, die nicht Tryptophan-, Cystein- und/oder Methionin kodieren, um unerwünschte oxidative Nebenreaktionen zu verhindern, z.B. Disulfidbrückenbildung mit dem natriuretischen Peptid vom B-Typ. Voraussetzung ist allerdings, dass das so erhaltene Fusionsprotein einen pl-Wert im erforderlichen Bereich aufweist.
In 1 stellt die Aminosäuresequenz der oberen Reihe die native Aminosäuresequenz der ersten 78 Aminosäuren vom N-Terminus von CAT her dar. Die untere Reihe stellt die modifizierte CAT-Sequenz dar, welche von dem Vektor kodiert wurde, den wir für die Expression eines Fusionsproteins verwendeten, das geeignet für die Herstellung des natriuretischen Peptid vom B-Typ war. Die fünf Aminosäuren der modifizierten Sequenz beginnend mit Thr (Position 74) stellen eine Linkersequenz dar, die das C-terminale Asp mit der modifizierten CAT-Sequenz verknüpft und eine Agel-Spaltstelle einführt. Die Agel-Spaltstelle wurde durch Mutation der Kodons für die Aminosäuren 74 und 75 hergestellt.
Im Vektor steht die das modifizierte CAT kodierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle einer regulatorischen Sequenz, die die Expression des Fusionsproteins in der Wirtszelle steuern kann. Jeder geeignete Promotor kann eingesetzt werden, z.B. ein trpLE-, phoA- oder lacZ-Promotor. Ein bevorzugter Promotor ist der E. coli phoA-Promotor, der von Wanner, B.L. in „Escherichia coli and Salmonella", 2. Auflage (Neidhardt, P.C. et al (Hrsg.), ASM Press, Washington, D.C.), Seiten 1357 bis 1381 beschrieben wurde. Dieser Promotor initiiert die Transkription der das Fusionsprotein kodierenden DNA-Sequenz in Abwesenheit von Phosphat im Wuchsmedium. Der von uns eingesetzte phoA-Promotor wurde, ausgehend von der nativen E.coli phoA-Sequenz dergestalt mutiert, dass das native GTG-Signal durch ein ATG-Translationsstartkodon ausgetauscht wurde. 2 zeigt die DNA-Sequenz des Wildtyp phoA-Promotors in der oberen Reihe und den modifizierten phoA-Promotor, der von uns zur Herstellung des Expressionsvektors für das natriuretische Peptid vom B-Typ eingesetzt wurde, in der unteren Reihe.
Die das gewünschte Peptid kodierende DNA-Sequenz ist mit ihrem 5'-Ende mit dem Asp-Kodon am 3'-Ende des Fusionspartners verbunden. Die das Peptid kodierende DNA-Sequenz weist an ihrem 5'-Ende ein Kodon für Pro, Gly, Ser oder Leu auf. Die Wahl der spezifischen Aminosäure wird teilweise von der Sequenz des gewünschten Peptids abhängen. Falls das Peptid eine oder mehrere interne, durch Säure spaltbare Stellen aufweist, dann muss die N-terminale Aminosäure so gewählt werden, dass die Spaltstelle an der Verbindung von Fusionspartner und Peptid mit einer höheren Rate gespalten wird als die interne Spaltstelle. Falls die native Sequenz des gewünschten Peptids an ihrem N-Terminus kein Kodon für Pro, Gly, Ser oder Leu aufweist, wird die das Peptid kodierende DNA durch Platzierung eines Kodons für die gewünschte Aminosäure am 5'-Ende modifiziert. Dies wird dazu führen, dass nach der Spaltung des Peptids vom Fusionspartner an seinem N-Terminus eine fremde Aminosäure sitzt, was dann akzeptabel ist, wenn diese nicht mit der biologischen Aktivität interferiert. Beim natriuretischen Peptid vom B-Typ ist die N-terminale Aminosäure Ser. Diese Aminosäure kann an der Verbindungsstelle mit dem Fusionspartner akzeptiert werden, da beim natriuretischen Peptid vom B-Typ nur eine interne, durch Säure spaltbare Stelle, Asp-Arg, vorkommt, die mit einer wesentlich niedrigeren Rate als Asp-Ser gespalten wird.
Der Expressionsvektor kann unter Verwendung bekannter Verfahren der DNA-Rekombination hergestellt und in eine Wirtszelle eingeführt werden.
Die nachfolgenden nicht-beschränkenden Beispiele sollen die Praxis der vorliegenden Erfindung näher erläutern. Das Plasmid pCB 101-1 (Beispiel 1) in einem E. coli W3110 Wirt wurde bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 98774 hinterlegt. Das Plasmid pTH76 (Beispiel 1) in einem E. coli W3110 Wirt wurde bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 98775 hinterlegt. Das Plasmid pTH53 (Beispiel 2) in einem E. coli W3110 Wirt wurde bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 98776 hinterlegt.
Beispiel 1: Synthese und Klonierung eines Gens, das ein Fusionsprotein mit natriuretischem Peptid vom B-Typ kodiert
Das Tetracyclinresistenzplasmid pCB101-1 (5μg), das den trp-Promotor und ein Fusionsprotein kodiert, bestehend aus dem natriuretischen Peptid vom B-Typ, das an das 3'-Ende eines modifizierten N-terminalen Bereiches von 153 Aminosäuren der Chloramphenicol-Acetyltransferase geknüpft worden war, wurde mit NdeI und AgeI gespalten. Das erhaltene Spaltprodukt wurde einer Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel (SeaPlaque, FMC, Rockland, ME) unterworfen und das 3,4 Kbp Fragment wurde ausgeschnitten.
Es wurden Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen hergestellt:
Oligo 1099:
TATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGAT (SEQ ID Nr: 1)
Oligo 1100:
CAGAACATGATATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCC A (SEQ ID Nr: 2)
Oligo 1101:
ATATCCCAATATCATGTTCTGGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAAT CAACC (SEQ ID Nr: 3)
Oligo 1102:
TATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAGAAACCGTAGAAGTTA ATGTT (SEQ ID Nr: 4)
Oligo 1103:
AAAGGCCGGATAAAACAGGTGAACATTAACTTCTACGGTTTCTAAAAAGGCCGT AATATC (SEQ ID Nr: 5)
Oligo 1104:
CAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTTGATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAA ATGTTC (SEQ ID Nr: 6)
Oligo 1105:
CACCTGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCGTTCTGCTGAATGCTCATC CGCTGTTCA (SEQ ID Nr: 7)
Oligo 1106:
CCGGTGAACAGCGGATGAGCATTCAGCAGAACGGCAAGAATGTGAAT (SEQ ID Nr: 8)
Die Oligonukleotide 1100 bis 1105 (jeweils 1 μg) wurden einzeln mit ATP und T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und mit jeweils 1 μg der Oligonukleotide 1099 und 1106 kombiniert. Das Oligonukleotidgemisch wurde anschließend durch Kochen für 7 Minuten denaturiert und allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt. 5 μL dieses 214 μL Reaktionsgemisches wurden mit 1,5 μL des geschmolzenen ausgeschnittenen Fragmentes aus pCB101-1, präpariert wir vorstehend dargestellt, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei Raumtemperatur über Nacht ligiert. Das Gemisch wurde dann erneut geschmolzen und eingesetzt, um den E. coli Stamm MC1061 zur Ausbildung von Tetracyclinresistenz zu transformieren. Acht der so erhaltenen Kolonien wurden auf Plasmide hin untersucht, die ein 317 Bp langes AgeI/MluI-Fragment aufwiesen. Eines dieser Plasmide wurde mit pTH80 bezeichnet. Es kodiert eine modifizierte CAT-Sequenz, fusioniert an natriuerisches Peptid vom B-Typ, unter der Kontrolle von trp.
Es ist wichtig, die Synthese des Fusionsproteins während der Fermentation steuern zu können. Der phoA-Promotor hat den Vorteil, dass er das Zielgen in einem nichtinduzierten Stadium halten kann, bis die volle Induktion durch Erschöpfung von PO₄ erreicht ist. Um das Fusionsprodukt unter die Kontrolle des phoA-Promotors zu stellen, wurde pTH80 mit den Restriktionsenzymen NdeI und HindIII gespalten. Das Spaltprodukt wurde dann einer Elektrophorese über ein 3%-iges Agarosegel (NuSieve, FMC, Rockland, ME) unterworfen und das 332 Bp lange, das CAT-BNP-Fusionsprodukt kodierende Fragment ausgeschnitten. Das Vektorfragment wurde durch Spaltung des Tetracyclinresistenzplasmids, pTH76, mit NdeI und HindIII hergestellt. PTH76 ist pTH80 sehr ähnlich, mit der Ausnahme jedoch, dass der trp-Promotor durch den phoA-Promotor ersetzt ist. Das Vektorfragment wurde durch Spaltung von 2,4 μg pTH76 über Nacht bei 37°C mit NdeI und HindIII und nachfolgender Behandlung mit Phosphatase aus Kälberdarm bei 37°C für eine Stunde isoliert. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches betrug 100 μL. Es wurde eine Ligation zwischen 1 μL des Vektorfragmentes und 3 μL der geschmolzenen, ausgeschnittenen Gelscheibe durchgeführt, die das Insertionsfragment von pTH80 enthielt. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Transformation des Stammes W3110 eingesetzt. Aus den so erhaltenen Kolonien erhaltene DNA wurde auf die Gegenwart einer einzelnen BstXI-Spaltstelle abgesucht. Drei positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Einer von diesem wurde mit pTH85 bezeichnet. 3 ist ein Plasmiddiagramm von pTH85.
Das Plasmid pTH85 und zwei andere positive Klone aus dessen Konstruktion wurden zur Transformation vom E. coli Stamm W3110 eingesetzt, wodurch Tetracyclinresistenz erhalten wurde. Einzelne Kolonien wurden in L-Brühe mit 6,25 μg/mL Tetracyclin inokuliert. Nach 4 Stunden Inkubatonszeit bei 37°C wurde die so erhaltene Kultur eingesetzt, um eine Kultur zu einer optischen Dichte von 0,1 zu inokulieren, die das folgende Medium enthielt:

Glukose 4 g

Casaminosäuren 5 g

1 M Kalium MOPS-Puffer, pH 7,4 40 mL

(NH₄)₂SO₄ 1,24 g

1 M MgSO₄ 2 mL

Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter.

Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurde bei allen Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop mindestens ein Phasen-heller (hell im Phasenkontrastmikroskop) Einschlusskörper beobachtet. Zellen wurden geerntet, 18 Minuten in SDS-Probenpuffer gekocht und damit eine Elektrophorese auf einem Standard Laemmli Tris-Glycin SDS-Polyacrylamidgel durchgeführt. Die ergiebige Ansammlung von natriuretischem Peptid des B-Typ-Fusionsproteins wird durch die Gegenwart einer starken Coomassieblau-Farbbande angezeigt, die bei etwa 12 Kilodalton wandert.
Beispiel 2: Klonierung eines Gens, das ein Fusionsprotein zum natriuretischen Peptids des B-Typs (2-32) kodiert
Säure vermittelte Spaltung läuft am schnellsten an einer Asp-Pro-Peptidbindung ab. Da der zweite Rest des reifen natriuretischen Peptids vom B-Typ ein Pro ist, ist es möglich, die Spaltung des natriuretischen Peptids vom B-Typ vom Fusionspartner durch Expression einer verkürzten Version des natriuretischen Peptids vom B-Typ zu erleichtern, die die Aminosäurereste 2-32 umfasst [natriuretisches Peptid vom B-Typ 2-32]. Eine veränderte Form des AgeI/HindIII Restriktionsfragmentes ohne das erste Serinkodon des reifen natriuretischen Peptids vom B-Typ wurde durch PCR mit der kodierenden Wildtypsequenz unter Verwendung der beiden folgenden Oligonukleotide als PCR-Primer konstruiert:
Oligo 754:
GTGGTGGTACCGGTGGTGACCCGAAAATGGTTCAG (SEQ ID Nr: 9)
Oligo PR1279:
CCTACTCTCGCATGGGGAGA (SEQ ID Nr: 10)
Ein 100 μL Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das 0,4 mM von jedem dNTP, 1,3 μg von jedem Primer, 50 ng vom Plasmid pTH53, das die Sequenz des natriuretischen Peptids vom B-Typ fusioniert an das 3'-Ende eines menschlichen Ubiquitinklons trägt und 1 μL VENT DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) in einem vom Hersteller bereit gestellten Reaktionspuffer enthielt. Die Reaktion wurde über 30 Zyklen bei folgendem Temperaturprogramm durchgeführt: 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für eine Minute. Die erwartete Größe, 167 Bp, wurde durch Agarose-Gelelekrophorese auf 3%-igem Nusieve bestätigt. Das PCR-Reaktionsprodukt wurde zusammen mit dem Plasmidvektor pTH53 einem Doppelverdau mit KpnI und HindIII unterworfen. Der Vektorverdau wurde dann ferner mit Phosphatase aus Kälberdarm für 45 Minuten bei 37°C weiterbehandelt, anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Der Plasmidverdau wurde anschließend in 30 μL Tris-EDTA-Puffer resuspendiert. Der PCR-Verdau wurde einer Elektophorese über 3%-iges Nusieve unterworfen und das 108 Bp Fragment durch Auffangen der wandernden Bande mit DE81-Papier gewonnen. Die Ligation des Vektors und der verdauten PCR-Fragmente wurde in einem 20 μL Reaktionsgemisch durchgeführt, das aus 0,5 μL Vektor-DNA, 0,1 μL PCR-Fragment und 0,5 μL T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) in dem vom Hersteller bereit gestellten Puffer bestand. Die Ligation wurde drei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt, worauf sich eine Transformation in mit CaCl₂ kompetent gemachte E.coli B anschloss. Plasmid-DNA wurde aus zwei der so erhaltenen Transformanten präpariert und Dideoxy-DNA-Sequenzierung wurde eingesetzt, um zu ermitteln, dass die richtige Nukleotidsequenz erhalten worden war. Diese Plasmid wurde als pUDBNP2 bezeichnet und kodiert menschliches Ubiquitin, das im Leseraster mit natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32) fusioniert war.
Für die Konstruktion eines Expressionsplasmids, das ein Fusionsgen von CAT154 mit dem natriuretischen Peptid des B-Typs (2-32) exprimiert, wurde das Plasmid pUDBNP2 als Quelle der das natriuretische Peptid des B-Typs (2-32) kodierenden Sequenz verwendet, während das Plasmid pCB101-1 den CAT154 Fusionspartner kodiert und als Rezipient des Fragmentes des natriuretischen Peptid des B-Typs (2-32) dient. 5 μg pUDBNP2 und 1 μg pCB101-1 wurden jeweils 2 Stunden bei 37°C in einem vom Hersteller (New England Biolabs, Beverly, MA) bereit gestellten Puffer mit AgeI gespalten. Die Spaltprodukte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese auf vollständige Spaltung getestet. DNA wurde mit GeneClean (Bio 101, CA) aus dem Verdauungsgemisch gewonnen und in einem Endvolumen von 15 μL eluiert. Beide Plasmide wurden anschließend in einem vom Hersteller (New England Biolabs, Beverly, MA) bereit gestellten Puffer mit BamHI 1,5 Stunden bei 37°C gespalten. Agarose-Gelelektrophorese zeigte, dass die Spaltung von pUDBNP2 unvollständig war. Daher wurde die partiell gespaltene DNA unter Verwendung von GeneClean wieder gewonnen und wie zuvor erneut mit BamHI gespalten. An diesem Punkt konnte durch Agarose-Gelelektrophorese gezeigt werden, dass sowohl der Verdau von pUDBNP2 wie auch der von pCB101-1 vollständig war. Fragmente für die Ligation wurden durch Elektrophorese über 3%-iges Nusieve und Ausschneiden der 2407 Bp Bande aus dem pUDBNP2 Verdau und der 1562 Bp Bande aus dem pCB101-1 Verdau präpariert. Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von GeneClean isoliert und in einem Endvolumen von 10 μL eluiert. Die Ligation der beiden Fragmente wurde unter Verwendung von 2μL des pUDBNP2 DNA-Fragmentes und 5 μL des DNA-Fragmentes aus pCB101-1 in einem Gemisch zusammen mit 1 μL T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) im vom Hersteller bereit gestellten Puffer über Nacht bei 15°C durchgeführt. Mit dem so erhaltenen Gemisch wurden durch CaCl₂ kompetent gemachte E. coli W3110 transformiert. Plasmid-DNA, präpariert aus sechs Transformanten wurde mit BglI gespalten und Plasmide mit der richtigen Struktur wurden anhand der Gegenwart sowohl des 2845 Bp als auch des 890 Bp Fragmentes identifiziert. Eine erwartete 234 Bp Bande aus dem Tetracyclinresistenz-Bereich ist zu klein, um sichtbar gemacht werden zu können. Zusätzlich wurden für die Plasmid-DNA-Präparation verwendete Kulturen in kleine LB-Kulturen inokuliert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die so erhaltenen Zellen wurden durch Phasenkontrast-Mikroskopie sichtbar gemacht, wohingegen andere Proben in SDS-Probenpuffer gekocht wurden und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wurden. Von den sechs so behandelten Kolonien zeigten die drei mit dem richtigen Restriktionsmuster unter dem Mikroskop auch Phasen-helle Einschlusskörper und eine starke Coomassiegefärbte Bande bei etwa 20.500 Dalton in der SDS-PAGE. Dieses Plasmid wurde als pSP54 bezeichnet. 4 ist eine Plasmiddiagramm von pSP54.
Beispiel 3: Herstellung und Isolierung des natriuretischen Peptids vom B-Typ (1-32)
(a) Fermentation und Zelllyse
E. coli Zellen, die den Expressionsvektor für natriuretisches Peptids vom B-Typ (1-32) (pTH85/TEH102) trugen, wurden im Fed-Batch-Verfahren gezüchtet. Die Induktion der Expression des Fusionsproteins wird in diesem System durch Erschöpfung des Phosphats im Medium durch die Zellen erreicht. Am Ende der Fermentationen wurden 43 L an gesamtem Fermentationsmedium geerntet. Die erhaltene Biomasse wurde durch Zentrifugation des gesamten Fermentationsmediums in 1 L Flaschen gesammelt und bei -70 +/- 10°C gelagert. Die Ausbeute an Biomasse aus 43 Litern Fermentation betrug 4,7 kg Nassgewicht an E. coli Zellen. Die gefrorene Biomasse wurde über Nacht bei Raumtemperatur aufgetaut und auf 25% (Gew./Vol.) in Lysepuffer (20 mM Na_xH_xPO₄, 5 mM EDTA, pH 6,0) verdünnt. Die Zellen wurden mit einem Maton-Gaulin Modell 30CD (9-10.000 psi) Homogenisator mit einem daran angeschlossenen gekühlten Hitzeaustauscher homogenisiert. Die Zelllösung wurde auf 2°C abgekühlt, bevor mit der Lyse begonnen wurde. Die Temperatur wurde während der Lyse unterhalb von 15°C gehalten. Der Durchfluss durch den Homogenisator wurde zurück in die Zelllösung geleitet, um durchschnittlich 6 Passagen durch den Homogenisator zu ermöglichen, wodurch ein Homogenisierungs-Endpunkt von >90% Lyse erreicht wurde, wie mikroskopisch ermittelt wurde.
(b) Gewinnung von Einschlusskörpern durch diskontinuierliche Zentrifugation
Diskontinuierliche Zentrifugation wurde in 1 L Polypropylenflaschen unter Verwendung einer gekühlten Sorvall RC-3B Zentrifuge mit einem H6000 Rotor durchgeführt. Das E. coli Zelllysat wurde in Lysepuffer auf 12,5% Startzellgewicht verdünnt und in einer Sorvall RC-3B Zentrifuge mit einem H6000A Rotor bei 4.500 UpM (5894 g) 40 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Einschlusskörperpellet (905 g) bei 2-8°C gelagert.
(c) Saure Spaltungsreaktion
Die Reaktionsgemische für die Spaltung durch Säure wurden aus der vorstehend beschriebenen Einschlusskörperpräparation aufbereitet. Die Einschlusskörper wurden der Lagerung bei 2-8°C entnommen und mit einem Hand-Homogenisator mit deionisiertem Wasser ad 1980 mL resuspendiert (100g Einschlusskörper/220 mL). Ein Aliquot dieser Suspension, das 100g Nassgewicht entsprach, wurde weiter prozessiert. Die Einschlusskörperpräparation wurde mit 780 mL deionisiertem Wasser verdünnt, wodurch eine 10%-ige Nassgewichtsuspension erhalten wurde. Der pH-Wert der Einschlusskörpersuspension wurde mit konzentrierter Salzsäure (~ 4 mL) auf 1,99 eingestellt. Dazu war kräftiges Rühren erforderlich, da die Lösung zwischen pH 4,5 und pH 3,0 eindickte.
Die vorstehend beschriebene Einschlusskörpersuspension wurde in ein Temperatur kontrolliertes mit Glas ausgekleidetes Reaktionsgefäß gegeben, das mit Rührer, Probenauslassöffnung und Anschlüssen ausgestattet war, um eine inerte Gasatmosphäre bereit zu stellen. Inertes Gas wurde bei geöffnetem Auslass bei 5 psi in das Reaktionsgefäß geleitet. Die Temperaturkontrolle wurde angeschaltet und auf den geeigneten Wert eingestellt. Das Timing der Reaktion begann an diesem Punkt. Es wurde bis 40°C erhitzt, wonach der Auslass geschlossen und das Aufbauen eines Drucks von 5 psi im Reaktionsgefäß zugelassen wurde. Das Reaktionsgefäß wurde während der Dauer der Temperaturanpassung gelegentlich geöffnet, um diesen Staudruck aufrecht zu erhalten. Das Reaktionsgemisch erreichte innerhalb von 15 Minuten einen Wert, der innerhalb von 5°C bezogen auf die gewünschte Temperatur lag. Die Temperatur wurde kontrolliert bei 85 +/- 0,5°C während der Reaktionsdauer gehalten. Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen (1 Stunde und 30 Minuten) zum Zwecke einer RP-HPLC Analyse auf Freisetzung von natriuretischem Peptid des B-Typs entnommen. Die Probenentnahme wurde so durchgeführt, dass zunächst das Gaseinlassventil geschlossen wurde, dann das Reaktionsgefäß bis zum Erreichen atmosphärischen Drucks geöffnet wurde und schließlich eine 1 mL Probe mit einer Einmal-Spritze aus der Probenauslassöffnung entnommen wurde. Die Probenauslassöffnung wurde dann geschlossen, das Gaseinlassventil wieder geöffnet, das Gefäß 5 bis 10 Sekunden ventiliert und schließlich wurde der Auslass geschlossen, um das Gefäß wieder unter Druck zu setzen.
Die Reaktion wurde nach 4,5 Stunden durch Abkühlung auf Eis auf 2-8°C beendet. Die Lösung wurde während der Abkühlung fortdauernd gerührt. Die Verminderung der Temperatur auf <40°C wurde innerhalb <20 Minuten erreicht. Am Ende der Abkühlungsperiode wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 2N NaOH auf 2,9 eingestellt. Der Gehalt an natriuretischem Peptid vom B-Typ in dieser Lösung wurde durch die RP-HPLC Peakfläche zu 1,92 g an natriuretischem Peptid vom B-Typ/L bestimmt. Die Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 +/- 10°C eingefroren.
(d) IEC (Ionenaustausch(er)säulen)-Aufreinigung des natriuretischen Peptids vom B-Typ (1-32) aus dem Säurespaltung-Reaktionsgemisch
Für eine IEC-Aufreinigung des natriuretischen Peptids vom B-Typ (1-32) wurden vier Reaktionsgemische aus den sauren Spaltungen, wie vorstehend beschrieben hergestellt, zusammengefasst. Es wurden 260 g festen Harnstoffs zu 1 L an Reaktionsgemisch aus der sauren Spaltung hinzugegeben, wodurch eine 3,5 M Harnstoffkonzentration erhalten wurde. Das Endvolumen betrug 1,3 L. Die Lösung enthielt 0,6 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ/mL oder 780 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ. Die Lösung wurde auf eine gepackte Säule Whatman Express-Ion Exchanger S (Sulfoxyethyl-Ionenaustauscherharz) ad 8 mg hBNP/mL Harz, basierend auf dem RP-HPLC-Test, geladen. Die Säule wurde aufeinander folgend mit 200 mL 3,5 M Harnstoff, 50 mM Essigsäure, pH-Wert 3,5, 500 mL 50 mM Essigsäure, 600 mL 10 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,2 und schließlich mit 1 L 55 mM NaCl in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8 gewaschen. Die Elution des nun vollständig reduzierten natriuretischen Peptids vom B-Typ von der Säule wurde mit einem Stufengradienten von 1 L 500 mM NaCl in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8 durchgeführt. Der Elutionspeak von 150 mL wurde gesammelt und auf Gehalt an natriuretischem Peptid vom B-Typ untersucht (590 mg insgesamt). Der Elutionspool wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 +/- 10°C gelagert.
(e) Disulfidbrückenbildung
145 mL des Eluens von der Ionenaustauschersäule wurden über Nacht bei 4°C aufgetaut und anschließend auf Raumtemperatur erwärmt. Die Lösung wurde mit 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8 auf 1,4 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ/mL verdünnt. Disulfidbrückenbildung wurde erreicht durch Luftoxidation bei 35°C für 6 Stunden unter mäßigem Rühren. Die Reaktion wurde durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 5,0 durch Zugabe von 5 M Essigsäure beendet. Der Oxidationspool wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 +/- 10°C gelagert.
(f) Reverse Phase HPLC Aufreinigung von natriuretischem Peptid vom B-Typ
Die Oxidationspools aus zwei der wie vorstehend beschriebenen Oxidationsreaktionen wurden über Nacht bei 2-8°C aufgetaut und anschließend auf Raumtemperatur erwärmt. Der pH-Wert wurde mit 5 N Ammoniumhydroxid auf 5,5 eingestellt. Diese Lösung (869 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ in 756 mL) wurde bei 10,6 mL/Min. auf eine präparative RP-HPLC (Zorbax Pro 10/150 C8) unter Mischen des Lösungsmittels (Beladung:Puffer B 85:15) geladen, um 6% Acetonitril in der Beadung zu erhalten. Die Harzbeladung betrug 9,8 mg/mL Harz. Die Elution wurde bei derselben Flussrate gemäß der nachstehend dargelegten Tabelle durchgeführt. Puffer A ist gereinigtes Wasser, Puffer B ist 40%-iges Acetonitril, Puffer C ist 1 M Ammoniumacetat, pH 5,5.
Fraktionen des Elutionspeaks wurden durch analytische RP-HPLC analysiert und Fraktionen mit einer Reinheit >96% wurden gepoolt. Der RP-HPLC Pool enthielt 406 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ (1-32).
(g) Charakterisierung von natriuretischem Peptid vom B-Typ (1-32) aus der sauren Spaltreaktion
Der Haupt-RP-HPLC-Peak aus einer ähnlichen Präparation von natriuretischem Peptid vom B-Typ nach saurer Spaltung, IEC Chromatographie und RP-HPLC wurde durch Aminosäure-Sequenzierung des vollständigen N-Terminus, Aminosäurenanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert. In jeder Hinsicht war das nach diesem Verfahren hergestellte Peptid von synthetischem natriuretischem Peptid vom B-Typ Standard nicht zu unterscheiden.
Beispiel 4: Reinigung von natriuretischem Peptid vom B-Typ (1-32) aus dem Säurespaltung-Reaktionsgemisch durch Ultrafiltration/Diafiltration
Als Alternative zur Solubilisierung des Reaktionsgemisches der sauren Spaltung für die Chromatographie kann das lösliche natriuretische Peptid vom B-Typ aus dem Roh-Reaktionsgemisch der sauren Spaltung durch Diafiltration isoliert werden. Das reduzierte natriuretische Peptid vom B-Typ passiert durch den Filter und die Aggregate mit einem höheren Molekulargewicht und das unlösliche Material werden zurück gehalten. Das natriuretische Peptid vom B-Typ passiert frei durch die Membran und wird im Filtrat gefunden.
Ein Filtron Ultrasette Filter mit einem Molekulargewichts-Nennausschlusswert von 300 kD (Filtron Katalognummer OS100C72) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Diafiltration ausgerichtet. Die Vorrichtung wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit 20 mM Natriumacetat, 150 mM Natriumchlorid, pH 4,0 äquilibriert.
Ein Liter des Reaktionsgemisches aus der sauren Spaltung wurde, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Diese Lösung enthielt 705 mg an reduziertem natriuretischem Peptid vom B-Typ, wie durch den RP-HPLC Peakbereich ermittelt wurde (RT 112/123, 1/26/96). Diese Lösung wurde in eine 2L Pyrexflasche überführt und 60 mL 5M Natriumchlorid wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 25 Minuten auf Eis gerührt und anschließend 60 mL destilliertes Wasser und 100 mL 0,2 mM Natriumacetat, pH 4,0 zugegeben. Es wurde für weitere 20 Minuten auf Eis gerührt. Das Gemisch wurde anschließend durch die Diafiltrationsvorrichtung zirkuliert, wobei eine peristaltische Pumpe eingesetzt wurde und die Zirkulationsrate bei 2 L/Min. gehalten wurde. Der Filtrat-Auslass war zu Beginn der Zirkulation vollständig geschlossen. Nach etwa 2 Minuten Zirkulation wurde der Filtrat-Auslass langsam geöffnet und die Flussrate des Filtrats wurde kontrolliert bei einer durchschnittlichen Rate von 53,5 mL/Min. (Bereich 25-82 mL/Min.) gehalten. Zu der 2 L Flasche wurde Diafiltrationspuffer, 20 mM Natriumacetat, 150 mM Natriumchlorid, pH 4,0 mit der gleichen Rate zugegeben, wie dem Filter Filtrat entnommen wurde, um die Diafiltrationslösung bei einem konstanten Volumen zu halten. Bei diesen Einstellungen wurde der Transmembrandruck während des gesamten Diafiltrationsverfahrens bei <10 psi gehalten. Nachdem insgesamt 5.700 mL Fitrat gesammelt worden waren, wurde die Zugabe von Verdünnungsmittel zur Diafiltrationslösung gestoppt. Ein zusätzlicher Liter Filtrat wurde gesammelt, bevor der Diafiltrationsprozess abgeschlossen worden war. Am Ende des Diafiltrationsverfahrens war ein Gesamtvolumen von 6,7 L Filtrat gesammelt worden. Die Quantifizierung des natriuretischen Peptids vom B-Typ im Filtrat durch RP-HPLC zeigte eine Ausbeute von 550 mg des natriuretischen Peptids vom B-Typ oder 78%.
Beispiel 5: Herstellung und Isolierung des natriuretischen Peptids vom B-Typ (2-32)
(a) Fermentation und Zelllyse
E. coli Zellen, die den Expressionsvektor pSP54 für natriuretisches Peptid vom B-Typ (2-32) trugen, wurden in Fed-Batch-Art fermentiert. Dieses System verwendet den trp-Promotor und die Expression des Fusionsproteins wird durch Zugabe von Indolacrylsäure induziert. Die gesamte Fermentationsbrühe (4,7 Liter) wurde am Ende der Fermentation geerntet. Die so erhaltene Biomasse wurde durch Zentrifugation der gesamten Fermentationsbrühe in 1 L Flaschen gesammelt und bei -70 +/- 10°C gelagert. Die Ausbeute an Biomasse aus 4,7 Litern Fermentation betrug 432 g Nassgewicht an E. coli Zellen. Die gefrorene Biomasse wurde über Nacht bei Raumtemperatur aufgetaut und unter Verwendung von Aufbruchpuffer (20 mM Na_xH_xPO₄, 5 mM EDTA, pH 6,0) auf 25% (Gew./Vol.) verdünnt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines AVP Gaulin 30CD-Modells (9-10.000 psi) mit einem daran angeschlossenen gekühlten Wärmeaustauscher homogenisiert. Die Zelllösung wurde auf 2°C abgekühlt, bevor mit dem Aufbrechen begonnen wurde und die Temperatur während der Lyse unterhalb von 15°C gehalten. Der Durchfluss durch den Homogenisator wurde zurück in die Zelllösung geleitet, um durchschnittlich 4 Passagen durch den Homogenisator zu ermöglichen, wodurch ein Homogenisierungs-Endpunkt von >90% Aufbrechen erreicht wurde, wie mikroskopisch ermittelt wurde.
(b) Gewinnung von Einschlusskörpern durch diskontinuierliche Zentrifugation
Diskontinuierliche Zentifugation wurde in 1 L Polypropylenflaschen unter Verwendung einer gekühlten Sorvall RC-3B Zentrifuge mit einem H6000 Rotor durchgeführt. Das E. coli Zelllysat wurde in Lysepuffer auf 12,5% Startzellgewicht verdünnt und in einer Sorvall RC-3B Zentrifuge mit einem H6000A Rotor bei 4.500 UpM (5894 g) 40 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Einschlusskörperpellet (111,5 g) bei -70 +/- 10°C gelagert.
(c) Saure Spaltungsreaktion
Das Reaktionsgemisch für die Spaltung durch Säure wurde aus den vorstehend beschriebenen Einschlusskörperpräparationen aufbereitet. Die Einschlusskörper (55,8 g) wurden der Lagerung bei -70 +/- 10°C entnommen und mit einem Hand-Homogenisator mit deionisiertem Wasser ad 538 mL resuspendiert, wodurch eine 10%-ige Nassgewichtsuspension erzeugt wurde. Der pH-Wert der Einschlusskörpersuspension wurde mit 1 M Salzsäure (~ 28 mL) auf 2,0 eingestellt.
Dazu war kräftiges Rühren erforderlich, da die Lösung zwischen pH 4,5 und pH 3,0 eindickte.
Die Einschlusskörperpräparation wurde in ein Temperatur-kontrolliertes, mit Glas ausgekleidetes Reaktionsgefäß gegeben, das mit Rührer, Probenauslassöffnung und Anschlüssen ausgestattet war, um eine inerte Gasatmosphäre bereit zu stellen. Inertes Gas (Ar) wurde bei geöffnetem Auslass bei 5 psi in das Reaktionsgefäß geleitet. Die Temperaturkontrolle wurde angeschaltet und auf den geeigneten Wert eingestellt. Das Timing der Reaktion begann an diesem Punkt. Es wurde bis 40°C erhitzt, wonach der Auslass geschlossen wurde und man in dem Reaktionsgefäß einen Druck aufbauen ließ, der 5 psi erreichte. Das Reaktionsgefäß wurde während der Dauer der Temperaturanpassung gelegentlich geöffnet, um diesen Staudruck aufrecht zu erhalten. Das Reaktionsgemisch erreichte innerhalb von 15 Minuten einen Wert, der innerhalb von 5°C bezogen auf die gewünschte Temperatur lag. Die Temperatur wurde kontrolliert bei 85 +/- 1,5°C während der Reaktionsdauer gehalten. Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen (1 Stunde und 30 Minuten) zum Zwecke einer RP-HPLC Analyse auf Freisetzung von natriuretischem Peptid des B-Typs (2-32) entnommen. Die Probenentnahme wurde so durchgeführt, dass zunächst das Gaseinlassventil geschlossen wurde, dann das Reaktionsgefäß bis zum Erreichen atmosphärischen Drucks geöffnet wurde und schließlich eine 1 mL Probe mit einer Einmal-Spritze aus der Probenauslassöffnung entnommen wurde. Die Probenauslassöffnung wurde dann geschlossen, das Gaseinlassventil wieder geöffnet, das Gefäß 5 bis 10 Sekunden ventiliert und schließlich wurde der Auslass geschlossen, um das Gefäß wieder unter Druck zu setzen.
Die Reaktion wurde nach 2,0 Stunden durch Abkühlung auf Eis auf 20°C beendet. Die Lösung wurde während der Abkühlung fortdauernd gerührt. Am Ende der Abkühlungsperiode wurden 28 mL 1 M Phosphorsäure zu dem Reaktionsgemisch gegeben (50 mM Endkonzentration) und der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 10N NaOH auf 2,8 eingestellt. Der Gehalt an natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32) in dieser Lösung wurde durch einen RP-HPLC-Test zu 0,45 g an reduziertem natriuretischem Peptid vom B-Typ(2-32)/L (223 mg reduziertes Gesamtnatriuretisches Peptid vom B-Typ (2-32)) bestimmt. Die Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 +/- 10°C eingefroren.
(d) Diskontinuierliche Ionenaustauscher-Aufreinigung des natriuretischen Peptids vom B-Typ (2-32) aus dem Säurespaltung-Reaktionsgemisch
Das natriuretische Peptid vom B-Typ (2-32) wurde mittels diskontinuierlicher Inkubation mit SP-Spherodex LS Kationenaustauscherharz aus dem Säurespaltungs-Reaktionsgemisch adsorbiert, dessen pH-Wert eingestellt worden war. 500 mL des Reaktionsgemisches aus der Spaltung mit Säure, wie vorstehend beschrieben, wurden 1,5 Stunden in einem Bad mit warmem Wasser aufgetaut und zwar bis die Temperatur 22°C erreichte. SP-Spherodex LS Harz (50 mL), gewaschen gemäß der Anleitung vom Hersteller, wurde unter mäßigem Rühren zu dem aufgetauten Reaktionsgemisch in ein Glasgefäß zugegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt und Proben des Überstandes in Abständen von 30 Minuten entnommen. Man ließ das Harz sich am Ende des Mischvorgangs 5 Minuten setzen. Der Überstand wurde dekantiert und das Harz drei Mal mit 250 mL 50 mM Essigsäure gewaschen. Das Harz wurde dann auf eine Säule (2,5 × 11,5 cm) gepackt und dann mit 2 Säulenvolumina (SV) 50 mM Essigsäure, pH 3,5 bei 8 mL/Min. gewaschen. Anschließend wurde die Säule mit 4 SV 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 gewaschen. Die Reduktion auf der Säule wurde durch Waschen der Säule mit 4 SV 10 mM Dithiothreitol (DTT) 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 durchgeführt. Schließlich wurde die Säule mit 4 SV 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 und nachfolgend mit 5 SV 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 enthaltend 200 mM NaCl gewaschen. Die Elution des nun vollständig reduzierten natriuretischen Peptids vom B-Typ (2-32) von der Säule wurde in zwei Schritten bei 450 mM und 1 M NaCl in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 durchgeführt. Der Elutionspool von 330 mL wurde gesammelt und auf Gehalt an natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32) untersucht (148 mg insgesamt, 66% Ausbeute). Mit dem Elutionspool wurde direkt zur Disulfidbrückenbildung übergegangen.
(e) Disulfidbrückenbildung beim natriuretischen Peptid vom B-Typ (2-32)
Die 330 mL des Eluens aus der Ionenaustauschersäule enthielten 0,45 mg an natriuretischem Peptid des B-Typs (2-32)/mL und wurde mit 2N HCl auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Disulfidbrückenbildung wurde erreicht durch Zugabe von 11 mL 15 mM K₃Fe(CN)₆ zur Lösung unter einer Argonatmosphäre bei 2-8°C für 11 Stunden. Die Reaktion wurde durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 5,0 durch Zugabe von 3,4 mL 5 M Essigsäure beendet. Die Ausbeute der Oxidationsreaktion betrug 121 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32), was einer Schritt („step")-Ausbeute von 82% entspricht. Der Oxidationspool wurde über Nacht bei 2-8°C gelagert.
(f) Reverse Phase HPLC Aufreinigung von natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32)
Der Oxidationspool wurde auf Raumtemperatur erwärmt und weiter durch RP-HPLC aufgereinigt. Acetonitril (18 mL) wurde zu 342 mL des Oxidationspools gegeben, wodurch 360 mL an Ladung erhalten wurden. Der pH-Wert wurde mit 10 N Ammoniumhydroxid auf 5,5 eingestellt. Diese Lösung (160 mL enthaltend 51 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32)) wurde bei 4,5 mL/Min. auf eine RP-HPLC-Säule (Vydac C4 214TP1010) geladen. Die Harzbeladung betrug 3 mg/mL. Die Elution wurde bei derselben Flussrate, gemäß der nachstehend dargelegten Tabelle durchgeführt. Puffer A ist 5%-iges Acetonitril, 50 mM Ammoniumacetat, pH 5,0, Puffer Bist 50%-iges Acetonitril, 50 mM Ammoniumacetat, pH 5,0.
Fraktionen des Elutionspeaks wurden manuell gesammelt, durch analytische RP-HPLC analysiert und vor dem Poolen 3 Tage bei 2-8°C gelagert. Fraktionen mit einer Reinheit >95% wurden gepoolt, wodurch ein endgültiger Pool von >97% Reinheit (analytische RP-HPLC) erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 48 mg an natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32) oder 94% Schritt-Ausbeute.
(g) Charakterisierung von natriuretischem Peptid vom B-Typ (2-32) aus der sauren Spaltreaktion
Der Haupt-RP-HPLC-Peak aus einer ähnlichen Präparation von natriuretischem Peptid vom B-Typ nach saurer Spaltung, IEC Chromatographie and RP-HPLC wurde durch Aminosäure-Sequenzierung des vollständigen N-Terminus, Aminosäurenanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse aller drei Tests ergaben, dass das nach diesem Verfahren hergestellte Peptid natriuretisches Peptid vom B-Typ (2-32) war.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines aufgereinigten Peptids, das einen pl-Wert unter 5 oder über 8 besitzt, umfassend: a) Exprimieren des Peptids in einer rekombinanten Wirtszelle als Fusionsprotein, in welchem das gewünschte Peptid an seinem N-Terminus mit einem Fusionspartner fusioniert ist, der eine Aminosäuresequenz mit einem Asp-Rest an seinem C-Terminus umfasst, wobei (i) der C-terminale Asp-Rest des Fusionspartners und der N-terminale Rest des Peptids eine Bindung ausbilden, welche unter sauren Bedingungen spaltbar ist; (ii) das Peptid eine ausreichend unterschiedliche Nettoladung von der des Fusionspartners und allen unerwünschten Fragmenten hat, die durch die saure Spaltung des Fusionsproteins entstanden sind, um es von dem Fusionspartner und allen unerwünschten Fragmenten der sauren Spaltung des Fusionsproteins durch Ionenaustauscherchromatographie abtrennen zu können, und (iii) das Fusionsprotein innerhalb der rekombinanten Wirtszelle Einschlusskörper bildet; b) Gewinnen der Einschlusskörper aus der rekombinanten Wirtszelle; c) Abspalten des Peptids von dem Fusionspartner, indem das Fusionsprotein sauren Bedingungen in Abwesenheit eines Chaotrops unterworfen wird; d) Solubilisieren von unlöslichen Spaltprodukten, indem diese mit einem nicht-ionischen Chaotrop unter Bedingungen behandelt werden, die diese in Lösung bringen ohne die primäre Struktur des Peptids abzubauen; und e) Isolieren des Peptids durch Ionenaustauscherchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein einen pl-Wert zwischen 6,0 und 8,0 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein einen pl-Wert zwischen 6,5 und 7,5 besitzt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, außerdem umfassend das isolierte Peptid Bedingungen zu unterwerfen, die dazu führen, dass es sich in eine biologisch aktive tertiäre Struktur rückfaltet und alle intramolekularen Disulfidbindungen ausbildet, die für eine biologische Aktivität notwendig sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das gewünschte Peptid keine interne Dipeptidsequenz enthält, die unter sauren Bedingungen spaltbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid ein oder mehrere interne Dipeptidsequenzen enthält, die unter sauren Bedingungen bei einer Spaltgeschwindigkeit spaltbar sind, die niedriger ist als die des Dipeptids, das sich aus dem C-terminalen Aminosäurerest des Fusionspartners und dem N-terminalen Aminosäurerest des Peptids gebildet hat.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid ein natriuretisches Peptid vom B-Typ ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das nichtionische Chaotrop, das in Schritt (d) eingesetzt wird, Harnstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Peptid mit Harnstoff in einer Konzentration von etwa 3 M bis etwa 7 M behandelt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid in seiner biologisch aktiven Konformation mindestens eine Disulfidbindung zwischen Cystein-Resten enthält, und wobei das Verfahren einen Schritt (f) umfasst, der die Bildung von Disulfidbindungen bewirkt, wobei der Schritt unter oxidierenden Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines aufgereinigten Peptids, das einen pl-Wert unter 5 oder über 8 besitzt, umfassend: a) Exprimieren des Peptids in einer rekombinanten Wirtszelle als Fusionsprotein in welchem das gewünschte Peptid an seinem N-Terminus mit einem Fusionspartner fusioniert ist, der eine Aminosäuresequenz mit einem Asp-Rest an seinem C-Terminus umfasst, wobei (i) der C-terminale Asp-Rest des Fusionspartners und der N-terminale Rest des Peptids eine Bindung ausbilden, welche unter sauren Bedingungen spaltbar ist; (ii) das Peptid eine ausreichend unterschiedliche Nettoladung von der des Fusionspartners und allen unerwünschten Fragmenten hat, die durch die saure Spaltung des Fusionsproteins entstanden sind, um es von dem Fusionspartner und allen unerwünschten Fragmenten der sauren Spaltung des Fusionsproteins durch Ionenaustauscherchromatographie abtrennen zu können, und (iii) das Fusionsprotein innerhalb der rekombinanten Wirtszelle Einschlusskörper bildet; b) Gewinnen der Einschlusskörper aus der rekombinaten Wirtszelle; c) Abspalten des Peptids von dem Fusionspartner, indem das Fusionsprotein sauren Bedingungen in Abwesenheit eines Chaotrops unterworfen wird; d) Entfernen unlöslicher Spaltprodukte aus dem Spaltgemisch durch Ultrafiltration, Diafiltration oder Zentrifugation; und e) Isolieren des Peptids durch Ionenaustauscherchromatographie.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Peptid im Anschluss an Schritt (e) ein oder mehreren zusätzlichen Aufreinigungsschritten unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Peptid ein natriuretisches Peptid vom B-Typ ist und es im Anschluss an eine "Reverse Phase-HPLC-Chromatographie" einer zusätzlichen Ionenaustauscherchromatographie nach Schritt (e) unterworfen wird.