JP2002520018A

JP2002520018A - ８より上または５未満のｐＩを有するペプチドを産生するための方法

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Publication number: JP2002520018A
Application number: JP2000559232A
Authority: JP
Inventors: エヌ．スティーブンポリッティ，; ダグラスアイ．バックレイ，; ピーターエイ．スタシス，; テイマーイー．ハートマン，; ジャンゾン，
Original assignee: サイオスインコーポレイテッド
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2002-07-09
Anticipated expiration: 2019-07-08
Also published as: EP1095141B1; DK1095141T3; ES2374829T3; CY1112195T1; DE69930938D1; DE69930938T2; EP1714972A2; WO2000003011A2; EP2305815A1; CN1313896A; EP1714972A3; HK1097280A1; JP2011172575A; EP2305815B1; EP1095141A2; CY1106110T1; JP4741076B2; CA2334160C; DK1714972T3; CA2334160A1

Abstract

(57)【要約】８より上または５未満のｐＩを有するペプチドを産生するための方法が記載される。ここで、このペプチドは、酸切断部位を介して融合パートナーに連結される融合タンパク質として発現される。このペプチドは、この融合パートナーから、カオトロープの非存在下で酸切断により放出される。この融合パートナーおよびその酸切断産物は、必要ならば、所望のペプチドの正味電荷とは有意に異なる正味の電荷を有して、このペプチドのイオン交換クロマトグラフィーによる単離を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ペプチドの産生に有用な方法および試薬に関する。詳細には、本発
明は、約５未満または約８より上のｐＩを有するペプチドの産生に関する。本発
明の好ましい実施態様は、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドの産生に関する。

【０００２】（発明の背景）本発明は、特に、産生が所望されるペプチドが高いｐＩまたは低いｐＩ（これ
により、ペプチドの精製工程としてイオン交換クロマトグラフィーを行うことが
望ましくなる）を有する場合に、ペプチドを発現および回収するための効率的な
方法に関する。本発明は、比較的高いｐＩを有するｂ型ナトリウム利尿ペプチド
に関して例証される。それでもなお、当業者は、本明細書で開示される方法およ
び試薬が、高いｐＩまたは低いｐＩのいずれかを有する他のペプチドの産生に対
する適応性を有することを理解する。

【０００３】組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中のペプチドコードＤＮＡの発現に
よる５０アミノ酸未満の長さのペプチドの産生が、宿主細胞内で発現されたペプ
チドの酵素分解によりペプチドの部分的もしくは完全な損失を生じるという問題
に一般的に悩まされていることは、当該分野において周知である。この問題を克
服するために最も一般的に用いられる手段は、宿主細胞内でペプチドを不溶化す
ることである。これは、ペプチドを融合タンパク質として発現することによりも
たらされ得、その融合タンパク質ではペプチドが融合パートナーに連結されてい
る。通常、融合パートナーは、ペプチドのＮ末端に融合される。この融合タンパ
ク質は、細胞内で封入体を形成し、ここで、ペプチドは、タンパク質分解性酵素
による分解から保護される。

【０００４】一旦封入体が宿主細胞から回収されると、ペプチドは、リーダー配列から分離
され、精製され、そして活性形態で回収されるはずである。リーダー配列からの
分離は、適切な条件下で特異的に認識されそして切断される（例えば、酸切断ま
たは酵素的切断）リーダーとペプチドとの連結部にてアミノ酸の配列を置換する
ことにより達成され得る。酵素的切断は、酵素の高い費用および限定された使用
可能期間に起因して、固定されたカラム上で使用する場合でさえも、商業的スケ
ールでの産生にはほとんど実用的ではない。

【０００５】酸切断は、リーダー配列とペプチドとの連結部にて特定のジペプチドを置換す
ることによって達成され得る。ここで、このジペプチドの第１のアミノ酸は、ア
ルパラギン酸である。第２のアミノ酸の選択は、ジペプチド結合が酸性条件下で
切断される速度を決定する。もちろん、所望されるペプチドが酸で切断可能な任
意の内部ジペプチド配列を含む場合、リーダーとペプチドとの連結部の切断部位
は、受容不可能な回収の損失を避けるために、内部切断よりも実質的に速い速度
で酸切断をうけなければならない。酸切断が可能なジペプチドの相対反応速度は
、以下である：

【０００６】

【表１】酵素的切断または酸切断の前に、封入体中の融合タンパク質は、通常、タンパ
ク質構造のアンフォールディングをもたらすカオトロピズム剤を用いた処理によ
り可溶化される。次いで可溶化された融合タンパク質は切断され、所望のペプチ
ドが単離され、そして精製される。そして、このペプチドは、例えば、必要なら
ば内部のジスルフィド結合の形成をもたらすカオトロープおよび酸化の除去によ
り、生物学的に活性な立体配座へと再折り畳みをもたらす条件に供される。

【０００７】ｂ型ナトリウム利尿ペプチドすなわちＢＮＰとして公知のペプチドは、ヒトに
おいて、１３４のアミノ酸前駆体タンパク質の切断によりインビボで産生される
３２のアミノ酸ペプチドとして生じる。ヒトｂ型ナトリウム排泄増加性前駆体を
コードするＤＮＡ配列は、単離されている（米国特許第５，１１４，９２３号）
。ｂ型ナトリウム利尿ペプチドは、ヒトの臨床的試行において、直接的な心臓へ
の刺激なしで心臓機能を改善すること（これは、不整脈のような有害な副作用を
もたらし得る）、および心不全の死亡率および進行の加速の増大に関連する神経
ホルモンのレベルを減少させることが示されている。従って、これは、うっ血性
心不全の患者の処置に有用である。

【０００８】ｂ型ナトリウム利尿ペプチドは、うっ血性心不全の患者を処置するために使用
される他の薬物を超える特定の臨床的利点を提供するが、非ペプチド薬剤と比較
して、比較的高い費用のペプチド薬剤の産生は、臨床的実施におけるその承認に
対して障害を示し得る。結果的に、費用を最小限にするためにｂ型ナトリウム利
尿ペプチドを産生する高い効率的手段を提供する必要性が存在する。封入体の形
態におけるペプチドの組換え産生は、いくつかの問題を示す。ｂ型ナトリウム利
尿ペプチドを得るための融合タンパク質の酵素的切断の使用は、必要とされる酵
素の費用が高いため、望ましくない。精製工程としてイオン交換クロマトグラィ
ーを使用することによる、比較的高いｐＩのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１０
以上）の利用を所望する場合、イオン性カオトロープ（例えば、塩酸グアニジン
）の使用は避けるべきである。なぜならば、イオン性カオトロープは、イオン交
換クロマトグラフィーを干渉するからである。一方、最も一般的に使用される非
イオン性カオトロープである尿素は、融合タンパク質の酸切断を行う場合に疑問
がある。高温の酸性条件下で、尿素の存在は、ペプチドの分解をもたらす。

【０００９】（発明の要旨）本発明において、融合タンパク質の酸切断は、カオトロープの非存在下で行わ
れ、その結果可溶性ｂ型ナトリウム利尿ペプチドを生じる。この可溶性ペプチド
は、不溶性タンパク質から可溶性タンパク質を分離するための任意の公知の簡便
な方法（例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションまたは遠心分離による）
を用いて、不溶性のままである融合パートナーおよび他の夾雑物から分離され得
る。限外濾過および遠心分離は、商業的な観点から最適以下の工程であるので、
本発明の好ましい実施態様は、不溶性物質の可溶化、続いて非イオン性カオトロ
ープ（例えば、尿素）での処理による切断、およびイオン交換クロマトグラフィ
ーによるｂ型ナトリウム利尿ペプチドの単離を使用する。

【００１０】本発明は、約８より上または約５未満のｐＩを有するペプチドを産生するため
の効率的な方法を提供する。本発明の方法の好ましい実施態様は、以下の工程：（ａ）このペプチドを、所望のペプチドが融合パートナーに対してそのＮ末端
で融合された融合タンパク質として組換え宿主細胞中で発現させる工程であって
、この融合パートナーは、そのＣ末端でＡｓｐ残基を有するアミノ酸配列を含み
、ここで、（ｉ）融合パートナーのＣ末端Ａｓｐ残基およびペプチドのＮ末端残
基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、（ｉｉ）このペプチドが、融合パ
ートナーの正味の電荷と十分異なる正味の電荷、およびペプチドがその融合パー
トナーから分離され得る融合タンパク質の酸切断により産生される任意の望まし
くないフラグメント、およびイオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク
質の任意の望ましくない酸切断フラグメントを有し、そして（ｉｉｉ）この融合
タンパク質が組換え宿主細胞内に封入体を形成する、工程；（ｂ）この組換え宿主細胞から封入体を回収する工程；（ｃ）融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することによ
って、このペプチドを融合パートナーから切断する工程；（ｄ）この不溶性切断産物を、そのペプチドの一次構造を変性することなく可
溶化させる条件下で非イオン性カオトロープで処理することによって、可溶化さ
せる工程；ならびに（ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによりそのペプチドを単離する工程、を包含する。

【００１１】８より上または５未満のｐＩを有する所望のペプチドを生じる酸性条件下で切
断可能な融合タンパク質を発現するのに有用なベクターがまた、本明細書中で提
供され、このベクターは、以下：（ａ）宿主細胞中で融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列；（ｂ）改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配
列の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列であって、ここで、リジン、アルギ
ニンおよび／またはヒスチジン残基をコードする十分な数のコドンが、融合タン
パク質のｐＩが６．０と８．０との間である荷電されていないかもしくは負に荷
電したアミノ酸をコードするコドンで置換されている、ＤＮＡ配列；（ｃ）改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする
ＤＮＡ配列の３’末端に、直接かまたはリンカー配列を介して連結される、アス
パラギン酸をコードするコドン；および（ｄ）８より上または５未満のｐＩを有し、かつそのＮ末端でプロリン、グリ
シン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有する所
望のペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、ここでこの配列は、改変型クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の５’末
端から３’末端で連結される、ＤＮＡ配列、を含む。

【００１２】（発明の詳細な説明）（Ａ．本発明の産生方法）本発明の方法は、約８より上または約５より下のｐＩを有する精製されたペプ
チドを産生するために用いられる。本明細書中において、本発明はｂ型ナトリウ
ム利尿ペプチド（これは、比較的高いｐＩを有する）に関して例示されるが、所
望のペプチドが、融合パートナーの正味の電荷、および融合タンパク質の酸切断
によって産生される任意の所望でないフラグメント（すなわち、融合パートナー
および所望のペプチドの結合以外の部位での切断によって産生されたフラグメン
ト）の正味の電荷と十分に異なる正味の電荷を有し、その所望のペプチドがイオ
ン交換クロマトグラフィーによって切断混合物から単離されることを可能にする
場合に、本発明の方法はまた、低いｐＩを有するペプチドの産生にも適用可能で
あることが理解される。ペプチドと他の切断産物（切断混合物中におけるインタ
クトな任意の融合パートナーを含む）との間の正味の電荷の違いは、好ましくは
少なくとも約±２、より好ましくは少なくとも約±３である。従って、１つ以上
の内部酸切断部位を有する融合パートナーが選択されるならば、融合パートナー
の切断産物の各々は、イオン交換クロマトグラフィーによって所望のペプチドか
ら分離され得るように、所望のペプチドの電荷と十分に異なる、正味の電荷を有
するべきである。

【００１３】融合パートナーはまた、融合タンパク質による封入体の形成に考慮を払って選
択される。この目的のための適切な融合パートナーの選択は、部分的には、産生
されるペプチドの性質に依存する。好ましくは、その融合パートナーは、少なく
とも約５０アミノ酸残基を含む。融合パートナーのアミノ酸残基の数に厳格な上
限は存在しないが、約１００を超えないことが好ましい。なぜなら、融合パート
ナー中のより大きい数のアミノ酸残基は、一般的に、所望のペプチドのより低い
収量に転換されるからである。融合タンパク質が、封入体の形成を促進する、約
２５〜約５０の疎水性アミノ酸残基を含むように、融合パートナーを選択するこ
ともまた、好ましい。

【００１４】融合パートナーは、そのＣ末端にＡｓｐ残基を有し、ここでそれはペプチドの
Ｎ末端と結合する。

【００１５】好ましくは、融合パートナーは、融合タンパク質が、６．０と８．０との間、
より好ましくは６．５と７．５との間のｐＩであるように選択される。本発明の
特に好ましい融合パートナーは、改変されたクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのＮ末端部分を少なくとも含む。クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼのアミノ酸配列は、十分な数のリジン、アルギニン、および
／またはヒスチジン残基を、電荷を有さないか、または負に荷電しているアミノ
酸で置換するように改変され、その結果、融合タンパク質が６．０と８．０との
間、より好ましくは６．５と７．５との間のｐＩを有する。クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ配列になされ得るさらなる改変には：（ａ）シス
テイン、トリプトファン、およびメチオニン残基の、システイン、トリプトファ
ン、およびメチオニン以外の残基による置換；および（ｂ）電荷のバランスを達
成するために必要とされるような、１つ以上の酸性残基または塩基性残基の疎水
性残基への置換が挙げられる。

【００１６】トリプトファン残基、システイン残基、およびメチオニン残基の置換は、所望
されない酸化的な副反応（所望のペプチドを含み得る）を除去するために働く。
リジン、アルギニン、および／またはヒスチジンの疎水性残基での置換は、ｐＩ
および融合パートナーの荷電した残基の割合の両方を減少させ、そして封入体形
成を促進する疎水性を導入する。改変されたクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ配列のＣ末端のＡｓｐ残基は、直接的またはリンカー配列を通し
て、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ配列に連結され得る。リ
ンカー配列は、制限部位を提供するために発現ベクターに挿入されたコドンの翻
訳の結果として存在し得る。本発明の方法によって産生することが望まれるペプ
チドが、内部の酸切断部位を含むならば、融合パートナーとそのペプチドとの連
結で形成される酸切断部位は、上記に示したような内部切断部位よりも速い反応
の速度を有するものであるに違いない。例えば、ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチ
ドは、酸分解に感受性である内部Ａｓｐ−Ａｒｇジペプチドを含む。本発明に従
って、本発明者らは、改変されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ配列との融合物としてこのペプチドを発現した。ここで融合パートナーとｂ
型ナトリウム利尿ペプチドの結合は、Ａｓｐ−Ｓｅｒジペプチドを形成する。２
つのジペプチドの酸切断の差示的な速度に起因して、本発明者らは、内部切断部
位における切断によるいくつかのペプチドの損失に関わらず、所望のペプチドの
良好な収量を得ることができた。あるいは、本発明者らは、本発明の手順を利用
して、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドを産生した（２−３２）。この分子は、全長
３２アミノ酸型と等価な生物学的活性を有し、そしてそのＮ末端のプロリンの存
在に起因して、融合パートナーから、付随する収量の増加を伴う、なおより効率
的な切断を生じる。

【００１７】融合タンパク質は、組換えＤＮＡ産生の公知の技術を用いて、宿主細胞中で発
現される。組換えＤＮＡ法によるタンパク質の発現のために有用であることが公
知である任意の適切な宿主細胞が利用され得、これらには、原核生物および真核
生物宿主の細胞および細胞株が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉは好ましい宿主である。
宿主細胞は、宿主におけるその発現を指向し得る調節配列、ならびに宿主細胞中
で機能的である複製起点の制御下で融合タンパク質をコードする発現ベクターを
含む。そのベクターは、組換えＤＮＡ技術において慣用的に利用される他のＤＮ
Ａ配列（例えば、選択マーカーをコードする配列）を含み得る。

【００１８】発現ベクターを含む宿主細胞は増殖され、そして融合タンパク質は適切な条件
下で発現される。宿主細胞の増殖のための条件および融合タンパク質の発現は、
種々の因子（例えば、使用される宿主細胞、プロモーター、および発現される特
定の融合タンパク質）に依存して変化する。当業者は、使用される特定の宿主／
ベクター系についての適切な条件を決定し得る。

【００１９】融合タンパク質が封入体の形態で発現された後に、その封入体は、宿主細胞か
ら回収される。これは、公知の方法、例えば、細胞を化学的または機械的に溶解
し、そして遠心分離によって封入体を分離することによって達成され得る。代表
的には、本発明者らは、細胞ペーストを数倍容量の溶解緩衝液中で希釈し、そし
て９，０００〜１０，０００ｐｓｉで、ＡＶＰＧａｕｌｉｎホモジナイザーに
複数回通すことによって、細胞を溶解する。次いで、この細胞溶解物は、緩衝液
中でさらに希釈され、そして遠心分離されて封入体が回収される。

【００２０】次いで封入体は、所望のペプチドから融合パートナーを切断するために酸条件
に曝される。酸切断は、ペプチドの分解を引き起こす条件にペプチドを曝すこと
を避けるために、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の非存在下で行われる。
切断は、封入体を、温度を上昇させた水性酸性溶液中で懸濁することによっても
たらされ得る。好ましくは、封入体は、５％と１５％との間のｗ／ｖで、より好
ましくは、５％と８％との間のｗ／ｖで、約１．７と２．２との間、より好まし
くは１．９と２．１との間のｐＨの酸性溶液中に懸濁される。ＨＣｌが、切断を
実行するための好ましい酸であるが、他の酸（例として酢酸およびリン酸を含む
）が使用され得る。切断は、収量を最大化するために十分な温度および十分な時
間で実行される。代表的には、切断は、約７５℃〜約９５℃までの温度で、約２
時間〜約１０時間までの時間で実行される。ｂ型ナトリウム利尿ペプチドの産生
の際に、本発明者らは、好ましくは、封入体を水中で１０％ｗ／ｖまで希釈する
こと、ＨＣｌでｐＨを２．０に調節すること、および８５℃で４．５〜５．５時
間維持することによって酸切断を行った。

【００２１】商品生産の観点から、限外濾過および沈殿は最適以下の工程であるので、切断
後、融合パートナーおよびペプチドは、非イオン性カオトロープ（好ましくは尿
素）でそれらを処理することにより可溶化され、次いでそのペプチドは、イオン
交換クロマトグラフィーによって単離されることが好ましい。この懸濁物は、カ
オトロープの添加前に、好ましくは５０℃以下（例えば、４０℃より下）まで冷
却される。可溶化は、固体の尿素を約３Ｍ〜約７Ｍの濃度まで添加し、そして４
０℃より下の温度（好ましくはおよその室温（１８〜２５℃））で維持すること
によって実行され得る。

【００２２】ｐＨを、３と７．５との間、好ましくは３．８〜４．２に調製した後、次いで
、切断された融合パートナーおよびペプチドを含む溶液は、直接的にイオン交換
カラムにロードされ得る。ペプチド単離のために適切な任意の市販のイオン交換
カラムが使用され得る。ｂ型ナトリウム利尿ペプチドについて、本発明者らは、
スルホプロピルイオン交換カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ
（登録商標））を使用した。このカラムは平衡化され、そして夾雑物を溶離する
ために洗浄された。次いで、所望のペプチドが、適切な塩濃度を用いてカラムか
ら溶出される。ｂ型ナトリウム利尿ペプチドについて、カラムからの溶出は、好
ましくはＮａＣｌ溶液の０．５〜０．６Ｍを用いてもたらされた。

【００２３】多くの場合において、イオン交換カラムから回収されたペプチドは、そのネイ
ティブな高次構造に再フォールディングされるが、さらなる工程が、そのペプチ
ドを生物学的に活性な型に回復させるために必要であり得る（特に、そのペプチ
ドがその活性に内部のジスルフィド結合の形成を必要とする場合）。Ｂ型ナトリ
ウム利尿ペプチドは、ジスルフィド結合しなければならない２つのシステイン残
基を含む。このことは、回収されたペプチドを酸化的な条件に曝すことによって
達成され得る。酸化は、通常、そのペプチドの溶液を加熱することおよび大気下
で攪拌することによってもたらされ得る。あるいは、Ｃｕ⁺²、Ｉ₃ ^-、またはＦｅ
（ＣＮ）₆ ^-3のような酸化剤が使用され得る。

【００２４】所望の場合、当業者に公知の技術を用いるさらなる精製工程が使用され得る。
このような工程には、例えば、ＨＰＬＣ（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ）またはさら
なるイオン交換クロマトグラフィー工程）が挙げられ得る。ｂ型ナトリウム利尿
ペプチドの場合、回収されたペプチドは、酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．０〜
５．５およびアセトニトリル溶出勾配中のＲＰ−ＨＰＬＣに供された。

【００２５】（Ｂ．本発明の発現ベクター）本発明はまた、本発明の産生方法を実行するために適切な発現ベクターを提供
する。この発現ベクターは、リジン残基、アルギニン残基、および／またはヒス
チジン残基についての十分な数のコドンが、電荷を有さないかまたは負に荷電し
ているアミノ酸についてのコドンによって置換されており、その結果、融合タン
パク質のｐＩは、６．０と８．０との間、好ましくは６．５と７．５との間であ
るように改変された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）のアミノ酸配列のＮ末端部分を少なくともコードするＤＮＡ配列を利用する
。有利には、リジン残基、アルギニン残基、および／またはヒスチジン残基のう
ちのいくつかは、疎水性残基で置換され得る。この疎水性残基は融合パートナー
の正味の電荷を減少するだけではなく、宿主細胞中での封入体の形成を促進もす
る。所望される場合、ＣＡＴのネイティブな配列中のトリプトファン残基、シス
テイン残基、および／またはメチオニン残基についての１つ以上のコドンは、所
望されない酸化的な副反応（例えば、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドとのジスルフ
ィド結合）を防ぐために、トリプトファン、システイン、またはメチオニン以外
の残基についてのコドンによって置換され得る（得られる融合タンパク質が必要
とされる範囲のｐＩを有する場合）。

【００２６】図１において、一番上の行のアミノ酸配列は、ＣＡＴのＮ末端由来の最初の７
８アミノ酸のネイティブなアミノ酸配列を表す。一番下の行は、本発明者らがｂ
型ナトリウム利尿ペプチドの産生に適切な融合タンパク質を発現するために使用
したベクターによってコードされた、改変されたＣＡＴ配列を表す。Ｔｈｒ（７
４位）で始まる改変された配列の５つのアミノ酸は、Ｃ末端Ａｓｐを改変された
ＣＡＴ配列と一つにし、そしてＡｇｅＩ部位を導入する連結配列を表す。このＡ
ｇｅＩ部位は、アミノ酸７４および７５についてのコドンを変異させることによ
って作製された。

【００２７】本発明のベクターにおいて、改変されたＣＡＴをコードするＤＮＡ配列は、調
節配列の制御下にあり、この調節配列は、宿主細胞において融合タンパク質の発
現を指向し得る。任意の適切なプロモーター（例えば、ｔｒｐＬＥ、ｐｈｏＡま
たはｌａｃＺプロモーター）が、使用され得る。好ましいプロモーターは、Ｗａ
ｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ第２版（Ｎｅｉｄｂａｒｄｔ、Ｐ．Ｃ．ら編、ＡＳＭＰｒｅｓｓ
，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１３５７〜１３８１頁に記載される、Ｅ．
ｃｏｌｉｐｈｏＡプロモーターである。このプロモーターは、増殖培地中でホ
スファターゼの非存在下において、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転
写を開始する。本発明者らが使用したｐｈｏＡプロモーターは、ネイティブＥ．
ｃｏｌｉｐｈｏＡ配列から変異されて、ネイティブＧＴＧシグナルのためのＡ
ＴＧ翻訳開始シグナルを置換した。図２は、上の行に野生型ｐｈｏＡプロモータ
ーのＤＮＡ配列、および下の行にｂ型ナトリウム利尿ペプチドのための発現ベク
ターを生成するために本発明者らによって使用された改変されたｐｈｏＡプロモ
ーターを示す。

【００２８】所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その５’末端で融合パートナーの
３’末端でのＡｓｐコドンに連結される。このペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、その５’末端で、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＬｅｕのコドンを有する。
選択される特定のアミノ酸は、所望のペプチドの配列に一部依存する。このペプ
チドが１つ以上の内部酸切断部位を含む場合、Ｎ末端アミノ酸は、この融合パー
トナーおよびこのペプチドの接合部での切断部位が内部切断部位よりも速い速度
で切断されるように選択されなければならない。所望のペプチドのネイティブ配
列がそのＮ末端にＰｒｏ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＬｅｕコドンを含まない場合、
このペプチドをコードするＤＮＡは、５’末端で所望のアミノ酸のコドンを置換
することによって改変される。これは、このペプチドのＮ末端での外来アミノ酸
を生じ、続いて生物学的活性を妨害しない場合に受容可能であり得る融合パート
ナーからの切断を生じることが理解される。ｂ型ナトリウム利尿ペプチドの場合
において、Ｎ末端アミノ酸はＳｅｒである。このアミノ酸は、融合パートナーと
の接合部で受容可能である。なぜなら、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドは、唯一の
内部酸切断部位であり、Ａｓｐ−Ｓｅｒよりも非常に低速度で切断されるＡｓｐ
−Ａｒｇを含むからである。

【００２９】本発明の発現ベクターは、周知のＤＮＡ組換え技術を使用して、宿主細胞へ調
製および組み込まれ得る。

【００３０】以下の非限定的な実施例は、本明細書中に記載される本発明の実施をさらに例
示することを意図する。Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０宿主中のプラスミドｐＣＢ１
０１−１（実施例１）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（登録番号ＡＴＣＣ９８７７４を有
する）で寄託されている。Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０宿主中のプラスミドｐＴＨ
７６（実施例１）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（登録番号ＡＴＣＣ９８７７５を有する
）で寄託されている。Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０宿主中のプラスミドｐＴＨ５３
（実施例２）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（登録番号ＡＴＣＣ９８７７６を有する）で
寄託されている。

【００３１】（実施例１）（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドに対する融合タンパク質をコードする遺伝子の
合成およびクローニング）ｔｒｐプロモーターをコードするテトラサイクリン耐性プラスミドｐＣＢ１０
１−１（５μｇ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの改
変された１５３アミノ酸のＮ末端部分の３’末端に融合したｂ型ナトリウム利尿
ペプチドからなる融合タンパク質を、ＮｄｅＩおよびＡｇｅＩを用いて消化した
。得られた消化物を、１％アガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ，ＦＭＣ，Ｒｏ
ｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動に供し、そして３．４Ｋｂｐのフラグメント
を切り出した。

【００３２】オリゴヌクレオチドを、以下の配列を有するように合成した：

【００３３】

【化１】オリゴヌクレオチド１１００〜１１０５（各１μｇ）を、ＡＴＰおよびＴ₄ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いる処理によって個々にリン酸化し、そして各１μ
ｇのオリゴヌクレオチド１０９９および１１０６と組み合わせた。次いで、この
オリゴヌクレオチドの混合物を、７分間、煮沸によって変性させ、そして室温ま
で徐々に冷却させた。この２１４μｌの反応混合物の５μｌを、Ｔ₄ＤＮＡリガ
ーゼを使用して室温で一晩、上記で調製した１．５μｌのｐＣＢ１０１−１の溶
融し切り出したフラグメントに連結した。次いで、この混合物を再溶融し、そし
てＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１をテトラサイクリン耐性に形質転換するために使
用した。得られた８つのコロニーを、３１７ｂｐのＡｇＩ／ＭｌｕＩフラグメン
トを有するプラスミドについてスクリーニングした。このようなプラスミドの１
つを、ｐＴＨ８０（ｔｒｐの制御下でｂ型ナトリウム排泄増加性に融合する改変
されたＣＡＴ配列をコードする）と命名した。

【００３４】発酵の間に融合タンパク質の合成を制御し得ることは、重要である。ｐｈｏＡ
プロモーターは、ＰＯ_4-の枯渇によって十分な誘導が達成されるまで、誘導され
ない状態において標的遺伝子を維持し得る利点を有する。ｐｈｏＡプロモーター
の制御下に融合物を配置するために、ｐＴＨ８０を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。次いで、この消化物を３％アガロースゲル（Ｎ
ｕｓｉｅｖｅ，ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動し、そしてＣＡ
Ｔ−ＢＮＰ融合物をコードする３３２ｂｐのフラグメントを切り出した。このベ
クターフラグメントを、テトラサイクリン耐性プラスミドであるｐＴＨ７６の、
ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化によって調製した。ｐＴＨ７６は、
ｔｒｐプロモーターがｐｈｏＡプロモーターによって置換されていることを除い
て、ｐＴＨ８０と非常に類似している。このベクターフラグメントを、２．４μ
ｇのｐＴＨ７６の、３７℃、一晩でのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消
化によって単離し、続いて、３７℃で１時間、ウシ腸ホスファターゼを用いて処
理した。反応混合物の最終容量は１００μｌであった。連結を、１μｌのベクタ
ーフラグメントと、ｐＴＨ８０由来の挿入フラグメントを含む３μｌの溶融し切
り出したゲル切片との間で実施した。室温での一晩のインキュベーション後、こ
の混合物を使用して、Ｗ３１１０株を形質転換した。得られたコロニーから調製
したＤＮＡを、固有のＢｓｔＸＩ部位の存在についてスクリーニングした。これ
らの陽性コロニーを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。これらのうちの１つを
、ｐＴＨ８５と命名した。図３は、ｐＴＨ８５のプラスミドのダイアグラムであ
る。

【００３５】プラスミドｐＴＨ８５およびその構築物由来の２つの他の陽性コロニーを使用
して、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０をテトラサイクリン耐性に形質転換した。単一
コロニーを、６．２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬブロスへ播種
した。３７℃での４時間のインキュベーション後、得られた培養物を使用して、
０．１の光学密度まで、以下の培地を含む培養物に播種した：グルコース４ｇカザミノ酸５ｇ１ＭＭＯＰＳカリウム緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．２４ｇ１ＭＭｇＳＯ₄ ２ｍｌ水（最終容量１Ｌになるまで）。

【００３６】３７℃で一晩のインキュベーション後、全ての細胞を、位相差顕微鏡下で少な
くとも一相の明るい封入体を有することを観察した。細胞を回収し、そしてＳＤ
Ｓサンプル緩衝液中で１８分間煮沸し、そして標準ＬａｅｍｍｌｉＴｒｉｓ−
ｇｌｙｃｉｎｅＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ｂ−ナトリ
ウム利尿ペプチド融合タンパク質の大量の蓄積を、非常にクーマーシー染色され
る、約１２Ｋダルトンで移動するバンドの存在によって示す。

【００３７】（実施例２）（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２〜３２）に対する融合タンパク質をコード
する遺伝子のクローニング）酸切断は、Ａｓｐ−Ｐｒｏペプチド結合で最も迅速に生じる。成熟ｂ型ナトリ
ウム利尿ペプチドの第２の残基はＰｒｏであるので、アミノ酸残基２〜３２を含
むｂ型ナトリウム利尿ペプチドの短縮型バージョン[ｂ型ナトリウム利尿ペプチ
ド（２〜３２）]の発現によって、融合パートナーからのｂ型ナトリウム利尿ペ
プチドの切断を容易にすることが可能である。成熟ｂ型ナトリウム利尿ペプチド
の最初のセリンコドンを欠失するＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの
変更した形態を、以下の２つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用
いて、野生型コード配列のＰＣＲによって構築した：

【００３８】

【化２】１００μｌの反応混合物を、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．３μｇの各プライ
マー、ヒトユビキチンのクローンに対して３’末端に融合したｂ型ナトリウム利
尿ペプチド配列を保有する５０ｎｇのプラスミドｐＴＨ５３、および１μｌのＶ
ＥＮＴＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、製造業者によって提供される反応緩衝液中に含むように
調製した。この反応を、以下の温度プログラムの３０サイクルの間実施した：９
４℃１分間、５５℃２分間、および７２℃１分間。予測サイズ（１６７ｂｐ）を
、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ上のアガロースゲル電気泳動によって確認した。次いで，
このＰＣＲ反応生成物を、ベクタープラスミドｐＴＨ５３と共に、ＫｐｎＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩを用いる２重消化（ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）に供
した。次いで、このベクター消化物を、ウシ腸ホスファターゼを用いて４５分間
３７℃で、続いてフェノール抽出およびエタノール沈殿によってさらに処理した
。次いで、このプラスミド消化物を、３０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に
再懸濁した。このＰＣＲ消化物を、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ上での電気泳動に供し、
そして１０８ｂｐのフラグメントを、ＤＥ８１紙を用いて、移動するバンドの妨
害によって回収した。このベクターおよびＰＣＲで消化したフラグメントの連結
を、製造業者によって供給された緩衝液中に、０．５μｌのベクターＤＮＡ、０
．１μｌのＰＣＲフラグメント、および０．５μｌのＴ₄ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含有する２０
μｌの反応混合物中で実施した。この連結を室温で３時間実施し、続いて、Ｃａ
Ｃｌ₂コンピテントＥ．ｃｏｌｉＢへ形質転換した。プラスミドＤＮＡを、２
つの得られた形質転換体から調製し、そしてジデオキシＤＮＡ配列決定を使用し
て、正確なヌクレオチド配列が得られたことを決定した。このプラスミドをｐＵ
ＤＢＮＰ２と命名し、そしてこれは、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２〜３２）
にインフレームで融合するヒトユビキチンをコードする。

【００３９】ＣＡＴ１５４のｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２〜３２）への遺伝子融合物を
発現する発現プラスミドの構築のために、プラスミドｐＵＤＢＮＰ２をｂ型ナト
リウム利尿ペプチド（２〜３２）コード配列の供給源として使用したが、一方、
プラスミドｐＣＢ１０１−１はＣＡＴ１５４融合パートナーをコードし、そして
ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２〜３２）フラグメントのレシピエントとして使
用する。５マイクログラムのｐＵＤＢＮＰ２および１μｇのｐＵＢ１０１−１を
各々、製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）によって供給された緩衝液中でＡｇｅＩを用いて、３７℃で２時間、消化
した。消化物を、アガロースゲル電気泳動によって完了についてチェックした。
ＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１，ＣＡ）を使用して消化混合物か
ら回収し、そして１５μｌの最終容量中に溶出した。次いで、両方のプラスミド
を、製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）によって供給された緩衝液中で、１．５時間、３７℃でＢａｍＨＩを用いて
消化した。アガロースゲル電気泳動は、完了するまでｐＵＤＢＮＰ２消化を示し
、それによって、部分的に消化したＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎを使用して回
収し、そして以前のようにＢａｍＨＩを用いて消化した。この時点で、アガロー
スゲル電気泳動は、完了するまでｐＵＤＢＮＰ２消化物およびｐＣＢ１０１−１
消化物の両方を示した。連結のためのフラグメントを、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ上で
の電気泳動によって調製し、ｐＵＤＢＮＰ２消化物から２４０７ｂｐのバンドお
よびｐＣＢ１０１−１消化物から１５６２ｂｐのバンドを切り出した。ＤＮＡフ
ラグメントを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを用いて回収し、そして１０μｌの最終容量
中で溶出した。２つのフラグメントの連結を、１５℃で一晩、製造業者によって
供給された緩衝液中に１μｌのＴ₄ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を有する混合物中で、２μｌのｐＵＤ
ＢＮＰ２ＤＮＡフラグメントおよびｐＣＢ１０１−１由来の５μｌのＤＮＡフ
ラグメントを使用して達成した。得られた混合物を、ＣａＣｌ₂コンピテントＥ
．ｃｏｌｉＷ３１１０へ形質転換した。得られた６つの形質転換体から調製し
たプラスミドＤＮＡを、ＢｇｌＩを用いて消化し、そして正確な構造を有するプ
ラスミドを２８４５ｂｐおよび８９０ｂｐのフラグメントの両方の存在に基づい
て同定した。テトラサイクリン耐性領域から生じる予測される２３４ｂｐバンド
は非常に小さいので可視化されない。さらに、プラスミドＤＮＡ調製物のために
使用される培養物もまた、小さなＬＢ培養物へ播種し、そして３７℃で一晩イン
キュベートした。得られた細胞を位相差顕微鏡によって可視化し、一方、他のア
リコートをＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気始動によって分析した。この方法で処理した６つのコロニーのうち、正
確な制限パターンを得た３つはまた、顕微鏡において明るい相の封入体の存在、
およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で約２０、５００ダルトンで強力にクーマーシー染色
されたバンドの存在を示した。このプラスミドをｐＳＰ５４と命名した。図４は
、ｐＳＰ５４のプラスミドのダイアグラムである。

【００４０】（実施例３）（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１−３２）の生成および単離）（（ａ）発酵および細胞溶解）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１−３２）発現ベクター（ｐＴＨ８５／ＴＥＨ
１０２）を保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を流加様式で発酵させた。この系における
融合タンパク質の発現の誘導は、細胞に、培地からのリン酸塩を枯渇させること
によって引き起こされる。４３リットルの全発酵ブロスを、発酵の終了時に収集
した。全発酵ブロスを遠心分離することによって、得られたバイオマスを１Ｌの
瓶に収集し、そして−７０±１０℃にて保存する。４３リットルの発酵物からの
バイオマス収量は、湿重量４．７ｋｇのＥ．ｃｏｌｉ細胞であった。凍結したバ
イオマスを室温で一晩で解凍し、そして溶解緩衝液（２０ｍＭのＮａ_XＨ_XＰＯ₄
、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を用いて、２５％ｗ／ｖに希釈した。直列に
冷却した熱交換機を備えたＭａｔｏｎ−ＧａｕｌｉｎＭｏｄｅｌ３０ＣＤ（
９−１０、０００ｐｓｉ）ホモジナイザーを用いて、細胞をホモジナイズした。
細胞溶液を溶解を開始する前に２℃に冷却し、そして溶解の間は１５℃未満に温
度を維持した。ホモジナイザーを通した流れを細胞溶液に逆戻りさせて、顕微鏡
試験によって測定される場合に９０％を超える溶解の均質化終点を達成するため
に、平均６回ホモジナイザーを通過させる。

【００４１】（（ｂ）バッチ遠心法による封入体の回収）バッチ遠心法を、１Ｌのポリプロピレン瓶内で、Ｈ６０００ローターを備えた
冷却したＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機を使用して実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ
細胞溶解物を、溶解緩衝液で出発細胞重量の１２．５％まで希釈し、そしてＨ６
０００Ａローターを備えたＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機内で、４５００ｒ
ｐｍ（５８９４ｇ）にて４０分間遠心分離した。上清をデカントし、そして封入
体のペレット（９０５ｇ）を２〜８℃にて保存した。

【００４２】（（ｃ）酸切断反応）酸切断反応混合液を、上記のように調製された封入体から調製した。封入体を
２〜８℃の貯蔵機から取り出し、そして手動ホモジナイザーを用いて、脱イオン
水で１９８０ｍＬ（封入体１００ｇ／２２０ｍＬ）に再懸濁した。１００ｇ湿重
量と等価なこの懸濁物のアリコートを、さらに加工処理した。封入体調製物を、
７８０ｍＬの脱イオン水で希釈して、１０％湿重量の懸濁液を産生した。封入体
懸濁物のｐＨを、濃塩酸（約４ｍＬ）で１．９９に調整した。この溶液はｐＨ４
．５〜３．０で濃厚になるので、激しい攪拌を必要とした。

【００４３】上記の封入体懸濁液を、攪拌、サンプルポート、および不活性ガス大気を提供
するためのコネクションを備える、温度制御されたガラス被覆反応容器内に配置
した。不活性ガスは、通気孔の開口とともに５ｐｓｉで反応容器に流入される。
温度制御器を作動状態にし、そして適切な設定に調整した。反応のタイミングを
この時点で開始した。加熱を４０℃まで進めさせ、この時点で通気孔を閉鎖し、
そして反応容器を５ｐｓｉまで加圧させた。圧力水頭を維持するために、温度調
整の期間に時折、反応容器を開口した。この反応混合物を、１５分間、所望の温
度の５℃の範囲内にした。温度を、反応期間を通して８５±０．５℃に制御した
。サンプルを、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド放出のＲＰ−ＨＰＬＣ分析のために
、規則的な間隔（１時間および３０分間）に採取した。最初にガス入口弁を閉鎖
し、次いで、大気圧まで容器を開口し、そして最後にディスポーザブル注射器を
用いて、サンプリングポートから１ｍＬのサンプルを回収することによりサンプ
リングを行った。次いで、サンプリングポートを閉鎖し、ガス入口弁を再開し、
この容器を５〜１０秒間開口し、そして最終的に通気孔を閉鎖して容器を再加圧
させた。

【００４４】反応を、氷上で２〜８℃まで冷却することによって、４．５時間後に終了させ
た。この溶液を冷却の間中連続的に攪拌した。４０℃未満への温度の低下を、２
０分間未満に達成した。冷却期間の終了時に、反応混合液のｐＨを、２ＮのＮａ
ＯＨで２．９に調整した。この溶液のｂ型ナトリウム利尿ペプチド含有量を、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣピーク範囲によって、１．９２ｇｂ型ナトリウム利尿ペプチド／
Ｌと測定した。この溶液を、さらなる加工処理まで−７０±１０℃にて保存した
。

【００４５】（（ｄ）酸切断反応混合物由来のｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１−３２）の
ＩＥＣ精製）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１−３２）のＩＥＣ精製のために、上記のよう
に調製される４つの酸切断反応混合液を組み合わせ、そして２６０ｇの固形尿素
を１Ｌの酸切断反応混合液に添加して、３．５Ｍの尿素濃度を与えた。最終容量
は、１．３Ｌであった。この溶液は、０．６ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド
／ｍＬまたは７８０ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチドを含んだ。この溶液を、
ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイに基づいて、ＷｈａｔｍａｎＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ
ＥｘｃｈａｎｇｅｒＳ（スルホキシエチルイオン交換樹脂）の充填されたカ
ラム上に、８ｍｇｈＢＮＰ／ｍＬ樹脂にてロードした。カラムを以下を用いて
連続的に洗浄した：２００ｍＬの３．５Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）、
５００ｍＬの５０ｍＭ酢酸、６００ｍＬの１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ
）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、そして最終的に、１Ｌの５０
ｍＭリン酸ナトリウム中５５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）。ここで完全に還元
されたｂ型ナトリウム利尿ペプチドのカラムからの溶出を、１Ｌの５０ｍＭリン
酸ナトリウム中５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）の段階的勾配によって実施
した。１５０ｍＬの溶出ピークを収集し、そしてｂ型ナトリウム利尿ペプチド含
有量について分析した（合計５９０ｍｇ）。この溶出プールをさらなる加工処理
まで−７０±１０℃にて保存した。

【００４６】（（ｅ）ジスルフィド結合形成）１４５ｍＬのイオン交換カラム溶出物を、４℃で一晩解凍し、次いで、室温ま
で暖めた。溶液を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を用いて１．４ｍ
ｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド／ｍＬに希釈した。ジスルフィド結合形成は、
穏和な攪拌を伴う３５℃で６時間の空気酸化（ａｉｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）に
よって達成した。反応を５Ｍ酢酸の添加によるｐＨ５．０への酸性化によって終
了させた。酸化プールを、さらなる加工処理まで−７０±１０℃にて保存した。

【００４７】（（ｆ）ｂ型ナトリウム利尿ペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製）上記のように実施された２つの酸化反応由来の酸化プールを２〜８℃にて一晩
解凍し、そして室温まで暖めた。５Ｎ水酸化アンモニウムで５．５に調整した。
この溶液（７５６ｍＬ中の８６９ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド）を、ロー
ド中で６％アセトニトリルを得るための溶媒混合液（ロード：緩衝液Ｂ８５：
１５）を用いて調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＺｏｒｂａｘＰｒｏ１０／１５０
Ｃ８）上に１０．６ｍＬ／分間にてロードした。樹脂ローディングは、９．８ｍ
ｇ／ｍＬ樹脂であった。溶出を、以下に概説される表に従って、同じ流速で実施
した。緩衝液Ａは精製水であり、緩衝液Ｂは４０％アセトニトリルであり、緩衝
液Ｃは１Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）である。

【００４８】

【表２】溶出ピークの画分を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、そして９６％を超
える純度の画分をプールした。ＲＰ−ＨＰＬＣプールは、４０６ｍｇのｂ型ナト
リウム利尿ペプチド（１−３２）を含んだ。

【００４９】（（ｇ）酸切断反応からのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（１−３２）の特徴づ
け）酸切断、ＩＥＣクロマトグラフィー、およびＲＰ−ＨＰＬＣ後のｂ型ナトリウ
ム利尿ペプチドの類似した調製物由来の主要なＲＰ−ＨＰＬＣピークを、完全Ｎ
末端アミノ酸配列決定、アミノ酸分析およびエレクトロスプレー質量分析法によ
って特徴付けした。すべての局面において、この手順によって生成されたペプチ
ドは、合成ｂ型ナトリウム利尿ペプチド標準から区別不能であった。

【００５０】（実施例４）（限外濾過／ダイアフィルトレーションによる酸切断反応混合液からのｂ型ナ
トリウム利尿ペプチド（１−３２）の精製）クロマトグラフィーのための酸切断混合液の可溶化に対する代替として、可溶
性ｂ型ナトリウム利尿ペプチドは、ダイアフィルトレーションによって粗酸切断
反応混合液から単離され得る。還元されたｂ型ナトリウム利尿ペプチドをフィル
ターに通し、そして高分子量凝集物および不溶性物質を保持した。ｂ型ナトリウ
ム利尿ペプチドは自由に膜を通過し、そして濾液中に見出される。

【００５１】名目上の３００ｋＤの分子量カットオフを有するＦｉｌｔｒｏｎｕｌｔｒａ
ｓｅｔｔｅフィルター（Ｆｉｌｔｒｏｎ、カタログ番号ＯＳ１００Ｃ７２）を、
製造業者の指示に従って、ダイアフィルトレーション様式に組み立てた。デバイ
スを蒸留水で洗浄し、次いで２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ４．０）で平衡化した。

【００５２】１リットルの酸切断反応混合物を上記のように調製した。この溶液は、ＲＰ−
ＨＰＬＣピーク面積（ＲＴ１１２／１２３、１／２６／９６）により決定した
場合、７０５ｍｇの還元されたｂ型ナトリウム利尿ペプチドを含有した。この溶
液を、２ＬＰｙｒｅｘビンに移し、そして６０ｍＬの５Ｍ塩化ナトリウムを添
加した。混合物を氷上で２５分間攪拌し、次いで６０ｍＬの蒸留水および１００
ｍＬの０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を添加した。氷上でさらに２０分
間攪拌を続けた。次いで、混合物を、蠕動ポンプを２Ｌ／分の循環速度を維持し
ながら用いるダイアフィルトレーションデバイスを通して循環した。濾過物排出
口循環の開始時に完全に密閉した。約２分間の循環後、濾過排出口をゆっくりと
開け、そして濾過流速を平均速度５３．５ｍＬ／分（２５〜８２ｍＬ／分の範囲
）に制御した。ダイアフィルトレーション緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）を、ダイアフィルトレーション溶液を維
持するために一定の容量でフィルターから取り除いた濾過物と同じ速度で２Ｌビ
ンに添加した。これらの設定で、膜貫通圧を、全ダイアフィルトレーション過程
を通して、１０ｐｓｉよりも低く維持した。合計で、５，７００ｍＬの濾過物を
収集した後、ダイアフィルトレーション溶液への希釈剤の添加を停止した。さら
なる１Ｌの濾過物を、ダイアフィルトレーション過程を完了する前に収集した。
ダイアフィルトレーション過程の最後に、総容積６．７Ｌの濾過物を収集した。
ＲＰ−ＨＰＬＣによる、濾過物中のｂ型ナトリウム利尿ペプチドの定量は、５５
０ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチドすなわち７８％の回収を示した。

【００５３】（実施例５：ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）の生成および単離）（（ａ）発酵および細胞溶解）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）発現ベクターｐＳＰ５４を保有する
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、流加培養様式で発酵させた。この系は、ｔｒｐプロモータ
ーを用い、そして融合タンパク質発現はインドールアクリル酸の添加により誘導
される。全発酵培養液（４．７リットル）を、発酵の最後に採取した。生じるバ
イオマスを１Ｌビン中の全発酵培養液を遠心分離することにより収集し、そして
−７０±１０℃で保存した。４．７リットルの発酵物から得たバイオマスは、湿
重量４３２ｇのＥ．ｃｏｌｉ細胞であった。凍結バイオマスを室温で一晩解凍し
、そしてクラック緩衝液（２０ｍＭＮａ_xＨ_xＰＯ₄、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
６．０）を用いて２５％ｗ／ｖに希釈した。細胞を、ＡＶＰＧａｕｌｉｎ
Ｍｏｄｅｌ３０ＣＤ（９−１０，０００ｐｓｉ）を用いて、冷蔵熱交換に従
ってホモジナイズした。細胞溶液を、破壊を開始する前に２℃冷し、そして溶解
の間、温度を１５℃未満に保った。ホモジナイザーを通した流れは、顕微鏡実験
により測定されるように＞９０％破壊のホモジナイゼーション終点に達するまで
平均４回ホモジナイザーを通ることを可能にするために細胞溶液中に戻した。

【００５４】（（ｂ）バッチ遠心分離による封入体の回収）バッチ遠心分離を、Ｈ６０００ローターを用いる冷蔵ＳｏｒｖａｌｌＲＣ−
３Ｂ遠心分離を用いて１Ｌのポリプロピレンボトルにおいて行なった。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞溶解物を１２．５％開始細胞重まで溶解物緩衝液で希釈し、そして４５
００ｒｐｍ（５８９４ｇ）でＨ６０００Ａローターを用いるＳｏｒｖａｌｌＲ
Ｃ−３Ｂ遠心分離装置において、４０分間遠心分離した。上清を静かにデカント
し、そして封入体ペレット（１１１．５ｇ）を−７０±１０℃で保存した。

【００５５】（（ｃ）酸切断反応）酸切断反応混合物を、上記の封入体調製物から調製した。封入体（５５．８ｇ
）を、−７０±１０℃の保存から取りだし、そして携帯型ホモジナイザーを用い
て、脱イオン水を用いて５５８ｍＬに再懸濁し、１０％湿重量の懸濁物を得た。
封入体上清のｐＨを、１Ｍの塩酸（約２８ｍＬ）を用いて、２．０に調製した。
激しい攪拌が、溶液がｐＨ４．５〜３．０の間で濃縮されるにつれて必要とされ
た。

【００５６】封入体調製物は、温度を制御した、ガラスライン反応容器装置におくこの装置
は、攪拌するサンプルポートおよび不活性ガス雰囲気を提供するように接続部を
有する。不活性ガス（Ａｒ）を、５ｐｓｉで通気開口（ｖｅｎｔｏｐｅｎ）を
用いて反応容器中に流した。温度のコントローラーを作動させ、そして適切な設
定に調節した。反応のタイミングをこの時点で開始した。加熱を４０℃まで進行
させ、この時点で通気口を閉じ、そして反応容器を５ｐｓｉに加圧した。この反
応容器を、このヘッドの圧力を維持するように温度を調節する期間の間、時折通
気した。反応混合物を１５分以内で所望される温度の５℃以内にした。温度は、
反応期間を通して、８５±１．５℃に制御した。サンプルを、ｂ型ナトリウム利
尿ペプチド（２−３２）放出の、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のために、通常の間隔（３
０分）で採取した。サンプリングを、まずガス注入口のバルブを閉じ、次いで、
雰囲気圧に容器を通気し、そして最後に、使い捨てのシリンジを用いて、サンプ
リングポートから１ｍＬのサンプルを取り出すことにより行なった。次いで、サ
ンプリングポートを閉じ、ガス注入口を再度開き、容器を５〜１０秒通気させ、
そして最後に、通気口を閉じて、容器を再加圧させた。

【００５７】反応を、２．０時間後、氷上で２０℃に冷却することにより終結した。溶液を
、冷却中連続して攪拌した。冷却期間の終了時、２８ｍＬの１Ｍのリン酸を、反
応混合物（最終５０ｍＭ）に添加し、そして反応混合物のｐＨを１０ＮＮａＯ
Ｈを用いて２．８に調整した。この溶液のｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３
２）含量を、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより、０．４５ｇの還元されたｂ型ナト
リウム利尿ペプチド（２−３２）／Ｌ（総量２２３ｍｇの還元されたｂ型ナトリ
ウム利尿ペプチド（２−３２））として決定した。この溶液をさらなる処理まで
、−７０±１０℃で凍結した。

【００５８】（（ｄ）酸切断反応混合物からのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）の
バッチイオン交換精製）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）を、ＳＰ−ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬ
Ｓカチオン交換樹脂とのバッチインキュベーションにより、ｐＨ調整酸切断反応
混合物から吸収した。上記の５００ｍＬの酸切断反応混合物を、温度が２２℃に
達するまで、１．５時間温浴槽において解凍した。製造者の指示に従って洗浄し
たＳＰ−ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳ樹脂（５０ｍＬ）を、穏やかに攪拌しながら
、ガラス容器中の解凍した反応混合物に添加した。混合物を、９０分間、周囲温
度で攪拌し、そしてサンプルの上清を３０分間隔で採取した。この樹脂を、５分
間の混合の最後に沈下させた。上清を静かにデカントし、そして樹脂を、３回、
２５０ｍＬの５０ｍＭ酢酸を用いて洗浄した。次いで、この樹脂を、カラム（２
．５×１１．５ｃｍ）に詰め、そして２カラム容積（ＣＶ）の５０ｍＭ酢酸（ｐ
Ｈ３．５）を用いて、８ｍＬ／分にてさらに洗浄した。次いで、このカラムを、
４ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄した。カラム上での還
元を、カラムを４ＣＶの１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ７．２）を用いて洗浄することにより行なった。最後に、カ
ラムを、４ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで２
００ｍＭのＮａＣｌを含有する５ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）で洗浄した。カラムから、今や完全に還元されたｂ型ナトリウム利尿ペプチド
（２−３２）の溶出を、２段階で、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中
、４５０ｍＭおよび１ＭＮａＣｌで行なった。３３０ｍＬの溶出プールを収集
し、そしてｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）含量を分析した（総量１４
８ｍｇ、６６％収量）。溶出プールは、直接ジスフィルド結合形成に用いた。

【００５９】（（ｅ）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）のジスフィルド結合形成）１ｍＬあたり０．４５ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）を含有
する３３０ｍＬのイオン交換カラム溶出物を、２ＮのＨＣｌを用いて、ｐＨ６．
８にｐＨ調整した。ジスフィルド結合形成を、アルゴン下で、１１時間２〜８℃
にて１１ｍＬの１５ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆の溶液への添加により達成した。反
応を、３．４ｍＬの５Ｍ酢酸の添加によるｐＨ５．０への酸性化により終結した
。酸化反応物の収率は、１２１ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）
、８２％段階収量であった。酸化プールを２〜８℃で一晩保存した。

【００６０】（（ｆ）ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）の逆相ＨＰＬＣ精製）酸化プールを、室温に加温し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製した。
アセトニトリル（１８ｍＬ）を、３４２ｍＬの酸化プールに添加し、３６０ｍＬ
ロードを得た。ｐＨを、１０Ｎの水酸化アンモニウムを用いて５．５に調整した
。この溶液（５１ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）を含有する１
６０ｍＬ）を、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＶｙｄａｃＣ４２１４ＴＰ１０１０
）上に４．５ｍＬ／分でロードした。樹脂のロードは、３ｍｇ／ｍＬであった。
溶出を、同じ流速で、以下の概説表に従って行なった。緩衝液Ａは、５％アセト
ニトリル、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）であり、緩衝液Ｂは、５０
％アセトニトリルであり、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）である。

【００６１】

【表３】溶出ピークの画分を手動で収集し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、そして
プールするまで３日間、２〜８℃で保存した。＞９５％純度の画分をプールし、
最終的に、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより＞９７％純度のプールを得、そして４８
ｍｇのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）の収量すなわち９４％の段階収
率であった。

【００６２】（（ｇ）酸切断反応からのｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）の特徴付
け）酸切断、ＩＥＣクロマトグラフィー、およびＲＰ−ＨＰＬＣ後の、ｂ型ナトリ
ウム利尿ペプチド（２−３２）の同様の調製物からの主なＲＰ−ＨＰＬＣピーク
を、完全なＮ末端アミノ酸配列分析、アミノ酸分析、およびエレクトロスプレー
質量分析により特徴付けた。３つ全てのアッセイの結果は、このプロトコルによ
り産生したペプチドがｂ型ナトリウム利尿ペプチド（２−３２）であったことを
示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドを産生するために融合パートナーとして
使用される、改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ
酸配列を示す。

【図２】図２は、上方の線上に野生型ｐｈｏＡプロモーターのＤＮＡ配列、下方の線上
に改変型ｐｈｏＡプロモーターのＤＮＡ配列を示す。

【図３】図３は、ｐＴＨ８５のプラスミドの図である。

【図４】図４は、ｐＳＰ５４のプラスミドの図である。

【図５】図５は、ｐＣＢ１０１−１のプラスミドの図である。

【図６】図６は、ｐＴＨ７６のプラスミドの図である。

【図７】図７は、ｐＴＨ５３のプラスミドの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 2450 ＢＡＹＳＨＯＲＥＰＡＲＫＷＡＹ，ＭＯＵＮＴＡＩＮＶＩＥＷ，ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ 94043，Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者スタシス，ピーターエイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94025，メンロパーク，フローレンスレーン 975，アパートメントエフ (72)発明者ハートマン，テイマーイー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94025，メンロパーク，フローレンスレーン 975，アパートメントエフ (72)発明者ゾン，ジャンアメリカ合衆国カリフォルニア 94587，ユニオンシティー，デルベールプレイス 30535 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 FA10 GA11 HA01 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA01 EA20 FA16 FA74 GA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】５未満または８より上のｐＩを有する精製ペプチドを産生す
るための方法であって、以下の工程；（ａ）組換え宿主細胞において、融合タンパク質として該ペプチドを発現させ
る工程であって、該融合タンパク質において、所望のペプチドが、そのＣ末端に
Ａｓｐ残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該所望のペプチドの
Ｎ末端で融合され、ここで（ｉ）該融合パートナーのＣ末端Ａｓｐ残基および該
ペプチドのＮ末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、（ｉｉ）該ペ
プチドが、該融合パートナーの正味の電荷とは有意に異なる正味の電荷、および
該融合パートナーの該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメント
であって、該ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって該融合タンパ
ク質の該融合パートナーおよび任意の所望でない酸切断フラグメントから分離さ
れることを可能にする、フラグメント、を有し、そして（ｉｉｉ）該融合タンパ
ク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程；（ｂ）該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程；（ｃ）該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することに
よって、該融合パートナーから該ペプチドを切断する工程；（ｄ）不溶性切断産物を、該ペプチドの一次構造を崩壊せずに可溶化させる条
件下で、非イオン性カオトロープで処理することによって可溶化する工程；なら
びに（ｅ）該ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】前記融合タンパク質が、６．０と８．０との間のｐＩを有す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記融合タンパク質が、６．５と７．５との間のｐＩを有す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】生物学的に活性な三次構造へと再折り畳みさせ、そして生物
学的活性に必要な任意の分子内ジスルフィド結合を形成させる条件に、前記単離
されたペプチドを供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記所望のペプチドが、酸性条件下で切断可能な内部ジペプ
チド配列を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ペプチドが、１つ以上の内部ジペプチド配列を含み、該
内部ジペプチド配列は、前記融合パートナーのＣ末端アミノ酸残基および該ペプ
チドのＮ末端アミノ酸残基によって形成されるジペプチドの切断速度よりも遅い
切断速度で、酸性条件下で切断可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記ペプチドが、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドである、請求
項１に記載の方法。
【請求項８】工程（ｄ）で使用される前記非イオン性カオトロープが尿素
である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記ペプチドが、約３Ｍ〜約７Ｍの濃度の尿素で処理される
、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記ペプチドが、その生物学的に活性なコンフォメーショ
ンにおいて、システイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、そ
して工程（ｆ）が、ジスルフィド結合の形成を生じる酸化条件下で行われる、請
求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記ペプチドが、ｂ型ナトリウム利尿ペプチドである、請
求項９に記載の方法。
【請求項１２】５未満または８より上のｐＩを有する精製ペプチドを産生
するための方法であって、以下の工程；（ａ）組換え宿主細胞において、融合タンパク質として該ペプチドを発現させ
る工程であって、該融合タンパク質において、所望のペプチドが、そのＣ末端に
Ａｓｐ残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該所望のペプチドの
Ｎ末端で融合され、ここで（ｉ）該融合パートナーのＣ末端Ａｓｐ残基および該
ペプチドのＮ末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、（ｉｉ）該ペ
プチドが、該融合パートナーの正味の電荷とは有意に異なる正味の電荷、および
該融合パートナーの該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメント
であって、該ペプチドが、イオン交換クロマトグラフィーによって該融合タンパ
ク質の該融合パートナーおよび任意の所望でない酸切断フラグメントから分離さ
れることを可能にする、フラグメント、を有し、そして（ｉｉｉ）該融合タンパ
ク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程；（ｂ）該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程；（ｃ）該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することに
よって、該融合パートナーから該ペプチドを切断する工程；（ｄ）不溶性切断産物を、該切断混合物から、限外濾過、ダイアフィルトレー
ション、または遠心分離によって除去する工程；ならびに（ｅ）該ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】前記ペプチドが、工程（ｆ）に続いて１つ以上のさらなる
精製工程に供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記ペプチドがｂ型ナトリウム利尿ペプチドであり、そし
て該ペプチドが、連続して、工程（ｆ）に続く逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
およびさらなるイオン交換クロマトグラフィーに供される、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１５】融合タンパク質の宿主細胞における発現のためのベクター
であって、該融合タンパク質は、酸性条件下で切断可能であり、８より上または
５未満のｐＩを有する所望のペプチドを生成し、該ベクターは、以下：（ａ）該宿主細胞における該融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列；（ｂ）改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列であって、ここでリジン、アルギニン
および／またはヒスチジン残基をコードする十分な数のコドンが、該融合タンパ
ク質のｐＩが６．０と８．０との間であるように荷電していないかまたは負に荷
電したアミノ酸をコードするコドンと置換された、ＤＮＡ配列；（ｃ）改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤ
ＮＡ配列の３’末端に、直接またはリンカー配列を介してのいずれかで連結され
るアスパラギン酸をコードするコドン；ならびに（ｄ）８より上または５未満のｐＩを有し、そしてそのＮ末端で、プロリン、
グリリン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有す
る所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該配列が、その５’末端で
、該改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ配列をコードするＤ
ＮＡ配列の３’末端に連結される、ＤＮＡ配列、を含む、ベクター。
【請求項１６】改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを
コードする前記ＤＮＡ配列におけるリジン、アルギニンおよび／またはヒスチジ
ン残基をコードする１つ以上のコドンが、疎水性アミノ酸をコードするコドンと
置換されている、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】前記コードされた融合タンパク質が、６．５〜７．５のｐ
Ｉを有する、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】前記コードされたペプチドが、ｂ型ナトリウム利尿ペプチ
ドである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】前記調節配列が、ｐｈｏＡプロモーターを含む、請求項１
５に記載のベクター。
【請求項２０】前記コードされた改変クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼが、少なくともクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼの５０Ｎ末端アミノ酸残基に対応する５０残基を含む、請求項１５に記載のベ
クター。
【請求項２１】請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２】請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２６】請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。