ES2263278T3 - Metodo para producir un peptido con un pl por encima de 8 o por debajo de 5. - Google Patents
Metodo para producir un peptido con un pl por encima de 8 o por debajo de 5.Info
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- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12N9/1033—Chloramphenicol O-acetyltransferase (2.3.1.28)
-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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Abstract
Un método para producir un péptido purificado que tiene un pH por debajo de 5 o por encima de 8, que comprende: (a) expresar dicho péptido en una célula hospedante recombinante como una proteína de fusión, en la que el péptido deseado está fusionado en su término N a un asociado de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un residuo Asp en su término C, en la que (i) el tresiduo Asp C-terminal del asociado de fusión y el residuo Nterminal del péptido forman un enlace que es divisible en condiciones ácidas, (ii) el péptido tiene una carga neta lo suficientemente diferente de la del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos indeseados producidos por división con ácido de la proteína de fusión para permitirle ser separado del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos de división por ácido indeseados de la proteína de fusión por cromatografía de intercambio iónico y (iii) la proteína de fusión forma cuerpos de inclusión dentro de la célula hospedante recombinante; (b) recuperar los cuerpos de inclusión de la célula hospedante recombinante; (c) dividir el péptido del asociado de fusión sometiendo la proteína de fusión a condiciones ácidas en ausencia de un caotropo; (d) solubilizar los productos de división insolubles tratándolos con un caotropo no iónico en condiciones que los hacen resultar solubilizados sin degradar la estructura principal del péptido; y (e) aislar el péptido por cromatografía de intercambio iónico.
Description
Método para producir un péptido con un pI por
encima de 8 o por debajo de 5.
Esta invención se refiere a métodos útiles en la
producción de péptidos. En particular, la invención se refiere a la
producción de péptidos que tienen pIs por debajo de aproximadamente
5 o por encima de aproximadamente 8. Una realización preferida de
la invención se refiere a la producción de péptido natriurético de
tipo b.
La presente invención se dirige a métodos
eficaces para expresar y recuperar un péptido, particularmente
cuando el péptido que se desea producir tiene un alto pI o un bajo
pI, lo que hace deseable emplear cromatografía de intercambio
iónico (IEC) como etapa en la purificación del péptido. Se pondrán
ejemplos de la invención con respecto a péptido natriurético de
tipo b, que tiene un pI relativamente alto. No obstante, los
expertos en la técnica apreciarán que los métodos descritos aquí
tendrán aplicabilidad para la producción de otros péptidos que
tengan pI alto o bajo.
Es bien sabido en la técnica que la producción
de péptidos de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud
por expresión de ADN que codifica péptido en una célula hospedante
recombinante tal como E. coli está plagada comúnmente por el
problema de la degradación enzimática del péptido expresado dentro
de la célula hospedante, produciendo una pérdida parcial o completa
del péptido. Por ejemplo, el documento WO 87/35009 describe un
método para producir un péptido purificado que tiene un pI alto o
bajo. Sin embargo, el medio empleado más comúnmente para superar
este problema es insolubilzar el péptido dentro de la célula
hospedante. Esto puede efectuarse expresando el péptido como una
proteína de fusión en la que el péptido está enlazado a un asociado
de fusión. Normalmente, el asociado de fusión estará fusionado al
término N del péptido. La proteína de fusión forma cuerpos de
inclusión dentro de la célula, dentro de la cual se protege al
péptido de degradación por enzimas proteolíticas.
Una vez recuperados los cuerpos de inclusión de
la célula hospedante, debe separarse el péptido de la secuencia
líder, purificarse y recuperarse en forma activa. La separación de
la secuencia líder puede conseguirse poniendo una secuencia de
aminoácidos en la unión de la líder y el péptido, que son
reconocidos y divididos específicamente en condiciones apropiadas,
por ejemplo, división por ácido o división enzimática. La división
enzimática no es práctica frecuentemente para producción a escala
comercial debido al alto coste de la enzima y duración útil
limitada, incluso cuando se emplea en una columna inmovilizada.
La división por ácido puede conseguirse poniendo
un dipéptido específico en la unión de la secuencia líder y el
péptido, en la que el primer aminoácido del dipéptido es ácido
aspártico. La selección del segundo aminoácido determinará la
velocidad a la que se divide el enlace dipéptido en condiciones
ácidas. Por supuesto, si el péptido deseado contiene algunas
secuencias de dipéptido internas que son divisibles por ácido, el
lugar de división en la unión de la líder y el péptido debe
experimentar división por ácido a una velocidad sustancialmente
mayor que la división interna con el fin de evitar pérdidas
inaceptables de rendimiento. Las velocidades de reacción relativas
de dipéptidos divisibles por ácido son como sigue:
Dipéptido | Velocidad de reac. relat. |
Asp-Pro* | 10x |
Asp-X X = Gly*, Ser*, Leu*, Ile, Val | 1x |
Asp-Lys* | 0,5x |
Asp-Arg** | 0,2x |
* F. Marcus, Int. J. Peptide and Protein Res. (1985) 25: 542.546 | |
** Observaciones de los inventores. |
Antes de la división enzimática o por ácido, la
proteína de fusión de los cuerpos de inclusión se solubiliza
normalmente por tratamiento con un agente caotrópico que causa el
despliegue de la estructura de proteína. La proteína de fusión
solubilizada se divide después, el péptido deseado se aísla y
purifica y el péptido se somete a condiciones que lo hacen
replegarse en una conformación activa biológicamente, tal como por
separación del caotropo y oxidación, si es necesario para ocasionar
la formación de enlaces disulfuro internos.
El péptido conocido como péptido natriurético de
tipo b o BNP tiene lugar en seres humanos como un péptido de 32
aminoácidos que se produce in vivo por la división de una
proteína precursora de 134 aminoácidos. Se ha aislado la secuencia
de ADN que codifica el precursor natriurético de tipo b (Patente de
los EE.UU. Nº 5.114.923). Se ha mostrado en pruebas clínicas
humanas que el péptido natriurético de tipo b mejora la
función del corazón sin estimulación cardíaca directa (que puede
causar efectos secundarios dañinos tales como arritmias) y a
niveles disminuidos de neurohormonas asociadas con mortalidad
acrecentada y aceleración de la progresión de fallo cardíaco. Por
consiguiente, es útil en el tratamiento de pacientes con fallo
cardíaco congestivo.
Aunque el péptido natriurético de tipo b ofrece
ciertas ventajas clínicas sobre otros fármacos usados para tratar
pacientes con fallo cardíaco congestivo, el coste relativamente alto
de producción de fármacos péptidos en comparación con fármacos no
péptidos podría presentar un impedimento para su aceptación en la
práctica clínica. En consecuencia, hay necesidad de proporcionar un
medio altamente eficaz para producir péptido natriurético de tipo b
con el fin de minimizar su coste. La producción recombinante del
péptido en forma de cuerpos de inclusión presenta varios problemas.
El uso de división enzimática de una proteína de fusión para
producir péptido natriurético de tipo b es indeseable por el alto
coste de las enzimas que se requerirían. Si se desea tomar ventaja
del pI relativamente alto de péptido natriurético de tipo b (\geq
10) usando cromatografía de intercambio iónico como etapa de
purificación, ha de evitarse el uso de un caotropo iónico tal como
hidrocloruro de guanidina, porque el caotropo iónico interferirá
con la cromatografía de intercambio iónico. Por otra parte, la
urea, el caotropo no iónico usado más comúnmente, es problemática si
se ha de emplear división por ácido de la proteína de fusión. Bajo
condiciones ácidas a alta temperatura, la presencia de urea causa la
degradación del péptido.
En la presente invención, la división por ácido
de la proteína de fusión se realiza en ausencia de caotropos,
produciendo péptido natriurético de tipo b soluble. El péptido
soluble puede separarse del asociado de fusión y otros
contaminantes, que permanecen insolubles, usando cualquier método
conveniente conocido para separar proteínas solubles de proteínas
insolubles, por ejemplo, por ultrafiltración, diafiltración o
centrifugación. Puesto que la ultrafiltración y la centrifugación
son etapas subóptimas desde un punto de vista comercial, una
realización preferida de la invención emplea solubilización de los
materiales insolubles, tras la división, por tratamiento con un
caotropo no iónico tal como urea, y aislamiento de péptido
natriurético de tipo b por cromatografía de intercambio iónico.
La presente invención proporciona un método
eficaz para producir un péptido que tiene un pI por encima de
aproximadamente 8 o por debajo de aproximadamente 5. Una realización
preferida del método de la invención comprende las etapas de:
(a) expresar dicho péptido en una célula
hospedante recombinante como una proteína de fusión, en la que el
péptido deseado está fusionado en su término N a un asociado de
fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un
residuo Asp en su término C, en la que (i) el residuo Asp
C-terminal del asociado de fusión y el residuo
N-terminal del péptido forman un enlace que es
divisible en condiciones ácidas, (ii) el péptido tiene una carga
neta lo suficientemente diferente de la del asociado de fusión y
cualesquiera fragmentos indeseados producidos por división con
ácido de la proteína de fusión para que el péptido sea capaz de ser
separado del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos de
división por ácido indeseados de la proteína de fusión por
cromatografía de intercambio iónico y (iii) la proteína de fusión
forma cuerpos de inclusión dentro de la célula hospedante
recombinante;
(b) recuperar los cuerpos de inclusión de la
célula hospedante recombinante;
(c) dividir el péptido del asociado de fusión
sometiendo la proteína de fusión a condiciones ácidas en ausencia de
un caotropo;
(d) solubilizar los productos de división
insolubles tratándolos con un caotropo no iónico en condiciones que
los hacen resultar solubilizados sin degradar la estructura
principal del péptido; y
(e) aislar el péptido por cromatografía de
intercambio iónico.
Se describe también aquí un vector de expresión
que es útil para expresar una proteína de fusión que es divisible en
condiciones ácidas para producir un péptido deseado que un pI por
encima de 8 o por debajo de 5, comprendiendo dicho vector:
(a) una secuencia reguladora capaz de dirigir la
expresión de la proteína de fusión en la célula hospedante;
(b) una secuencia de ADN que codifica al menos
una porción de la secuencia de aminoácidos de cloranfenicol acetil
transferasa (CAT) modificada en la que se ha sustituido un número
suficiente de codones que codifican residuos de lisina, arginina y/o
histidina por codones que codifican aminoácidos sin cargar o
cargados negativamente, de modo que el pI de la proteína de fusión
está entre 6,0 y 8,0;
(c) un codón que codifica ácido aspártico, que
está enlazado al extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica
cloranfenicol acetil transferasa modificada, directamente o a través
de una secuencia enlazadora; y
(d) una secuencia de ADN que codifica el péptido
deseado que tiene un pI superior a 8 o inferior a 5 y que tiene un
residuo de prolina, glicina, serina, leucina, alanina, isoleucina o
valina en su término N, estando enlazada dicha secuencia en su
extremo 5' al extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica la
cloranfenicol acetil transferasa modificada.
La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos de
una cloranfenicol acetil transferasa modificada usada como asociado
de fusión para producir péptido natriurético de tipo b.
La Fig. 2 muestra la secuencia de ADN del
promotor phoA de tipo natural en la línea superior y el
promotor phoA modificado en la línea inferior.
La Fig. 3 es un diagrama de plásmido de
pTH85.
La Fig. 4 es un diagrama de plásmido de
pSP54.
La Fig. 5 es un diagrama de plásmido de
pCB101-1.
La Fig. 6 es un diagrama de plásmido de
pTH76.
La Fig. 7 es un diagrama de plásmido de
pTH53.
El método de la invención se usa para producir
péptidos purificados que tienen pIs superiores a aproximadamente 8 o
inferiores a aproximadamente 5. Aunque se ejemplifica aquí la
invención con respecto a péptido natriurético de tipo b, que tiene
un pI relativamente alto, se apreciará que el método de la invención
también es aplicable a la producción de péptidos con pIs bajos,
siempre que el péptido deseado tenga una carga neta suficientemente
diferente de la del asociado de fusión y cualesquiera fragmentos
indeseados producidos por división con ácido de la proteína de
fusión (es decir, fragmentos producidos por división en lugares
distintos de la unión del asociado de fusión y el péptido deseado)
para permitir aislar el péptido deseado de la mezcla de división por
cromatografía de intercambio iónico. La diferencia de carga neta
entre el péptido y los otros productos de división, incluyendo
cualquier asociado de fusión intacto de la mezcla de división, es
preferiblemente al menos aproximadamente \pm 2, más
preferiblemente al menos aproximadamente \pm 3. Así, si se
selecciona un asociado de fusión que tenga uno o más lugares de
división por ácido internos, cada uno de los productos de división
del asociado de fusión debe tener una carga neta que sea
suficientemente diferente de la del péptido deseado para que pueda
separarse del péptido por cromatografía de intercambio iónico.
El asociado de fusión se selecciona también
considerando la formación de cuerpos de inclusión por la proteína de
fusión. La selección de un asociado de fusión apropiado para este
propósito dependerá, en parte, de la naturaleza del péptido
producido. Preferiblemente, el asociado de fusión contiene al menos
50 residuos de aminoácidos aproximadamente. Aunque no hay un límite
superior estricto en el número de residuos de aminoácidos del
asociado de fusión, se prefiere que no supere aproximadamente 100,
porque un número mayor de residuos de aminoácidos en el asociado de
fusión se traduce generalmente en un menor rendimiento del péptido
deseado. También se prefiere seleccionar un asociado de fusión de
tal modo que la proteína de fusión contenga de alrededor de 25 a
aproximadamente 50 residuos de aminoácidos hidrófobos, que promueven
la formación de cuerpos de inclusión.
El asociado de fusión tiene un residuo Asp en su
extremo C-terminal en el que se une al extremo
N-terminal del péptido.
Preferiblemente, el asociado de fusión se
selecciona de tal modo que el pI de la proteína de fusión esté entre
6,0 y 8,0, más preferiblemente entre 6,5 y 7,5. Un asociado de
fusión de la invención particularmente preferido contiene al menos
una porción N-terminal de una cloranfenicol acetil
transferasa modificada. La secuencia de aminoácidos de la
cloranfenicol acetil transferasa se modifica para sustituir un
número suficiente de residuos de lisina, arginina y/o histidina con
aminoácidos no cargados o cargados negativamente para que la
proteína de fusión tenga un pI entre 6,0 y 8,0, preferiblemente
entre 6,5 y 7,5. Las modificaciones adicionales que pueden hacerse
a la secuencia de cloranfenicol acetil transferasa incluyen: (a)
sustitución de los residuos de cisteína, triptófano y metionina por
residuos distintos de cisteína, triptófano y metionina; y (b)
sustitución de uno o más residuos ácidos o básicos con residuos
hidrófobos según se requiera para conseguir el equilibrio de
cargas.
La sustitución de los residuos de triptófano,
cisteína y metionina sirve para eliminar reacciones secundarias
oxidativas indeseables que podrían implicar al péptido deseado. La
sustitución de residuos hidrófobos por lisina, arginina y/o
histidina reduce el pI y el porcentaje de residuos cargados del
asociado de fusión e introduce hidrofobicidad que promueve la
formación de cuerpos de inclusión. El residuo de Asp en el extremo
C-terminal de la secuencia de cloranfenicol acetil
transferasa modificada puede enlazarse a la secuencia de
cloranfenicol acetil transferasa directamente o a través de una
secuencia enlazadora. Puede estar presente una secuencia enlazadora
como resultado de traducción de codones insertados en el vector de
expresión para proporcionar un lugar de restricción. Si el péptido
que se desea producir por el método de la invención contiene un
lugar de división por ácido interno, el lugar de división por ácido
formado en la unión del asociado de fusión y el péptido debe ser
uno que tenga una velocidad de reacción más alta que el lugar de
división interno, como se ha indicado antes. Por ejemplo, el péptido
natriurético de tipo b humano contiene un dipéptido de
Asp-Arg interno que es susceptible de división por
ácido. Según la presente invención, se ha expresado este péptido
como una fusión con una secuencia de cloranfenicol acetil
transferasa modificada, en la que la unión del asociado de fusión y
el péptido natriurético de tipo b forma un dipéptido de
Asp-Ser. Debido a las velocidades diferenciales de
división por ácido de los dos dipéptidos, se han podido obtener
buenos rendimientos del péptido deseado, no obstante la pérdida de
algún péptido por división en el lugar de división interno.
Alternativamente, se ha utilizado el procedimiento de la invención
para producir péptido natriurético de tipo b (2-32).
Esta molécula tiene actividad biológica equivalente a la de la forma
de 32 aminoácidos de longitud completa y, debido a la presencia de
prolina en su término N, produce una división aún más eficaz del
asociado de fusión, con aumento concomitante de rendimiento.
La proteína de fusión se expresa en una célula
hospedante usando técnicas conocidas de producción de ADN
recombinante. Puede emplearse cualquier célula hospedante adecuada
de la que se sepa que es útil para la expresión de proteínas por
métodos de ADN recombinante, incluyendo células y linajes celulares
hospedantes procariotas y eucariotas. Una célula hospedante
preferida es E. coli. La célula hospedante contiene un vector
de expresión que codifica la proteína de fusión bajo el control de
una secuencia reguladora que es capaz de dirigir su expresión en la
hospedante, así como un origen de replicación que es funcional en la
célula hospedante. El vector puede contener otras secuencias de ADN
empleadas convencionalmente en tecnología de ADN recombinante tales
como secuencias que codifican marcadores seleccionables.
Se desarrolla la célula hospedante que contiene
el vector de expresión y se expresa la proteína de fusión en
condiciones apropiadas. Las condiciones para desarrollar la célula
hospedante y expresar la proteína de fusión variarán dependiendo de
diversos factores tales como la célula hospedante empleada, el
promotor y la proteína de fusión particular expresada. Los expertos
en la técnica son capaces de determinar las condiciones apropiadas
para el sistema de hospedante/vector particular empleado.
Después de expresarse la proteína de fusión en
forma de cuerpos de inclusión, se recuperan los cuerpos de inclusión
de las células hospedantes. Esto puede conseguirse por métodos
conocidos tales como, por ejemplo, lisando las células química o
mecánicamente y separando los cuerpos de inclusión por
centrifugación. Típicamente, se diluye una pasta de células en
varios volúmenes de un tampón de lisis y se lisan las células por
paso múltiple a través un homogeneizador AVP-Gaulin
a 632,76-703,07 kg/cm^{2}. El lisado de células se
diluye después adicionalmente en tampón y se centrifuga para
recuperar los cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión se someten después a
condiciones ácidas para dividir el asociado de fusión del péptido
deseado. La división por ácido se realiza en ausencia de un caotropo
con el fin de evitar someter el péptido a condiciones que causarían
su degradación. La división puede efectuarse suspendiendo los
cuerpos de inclusión en una solución acuosa ácida a temperatura
elevada. Preferiblemente, los cuerpos de inclusión se suspenden
entre el 5% y el 15% p/v, más preferiblemente entre el 5% y el 8%
p/v, en una solución de ácido a un pH entre aproximadamente 1,7 y
2,2, preferiblemente entre 1,9 y 2,1. Un ácido preferido para
realizar la división es HCl, aunque pueden emplearse otros ácidos,
incluyendo a modo de ejemplo ácido acético y ácido fosfórico. La
división se realiza a una temperatura suficiente y durante un tiempo
suficiente para maximizar el rendimiento. Típicamente, la división
se realiza a una temperatura de alrededor de 75ºC a aproximadamente
95ºC durante un período de alrededor de 2 h a aproximadamente 10 h.
En la producción de péptido natriurético de tipo b, se realizó la
división por ácido diluyendo los cuerpos de inclusión al 10% p/v en
agua, ajustando el pH en 2,0 con HCl y manteniendo a 85ºC durante
4,5-5,5 horas,
preferiblemente.
preferiblemente.
Puesto que la ultrafiltración y la precipitación
son etapas subóptimas desde un punto de vista de producción
comercial, se prefiere que, tras la división, el asociado de fusión
y el péptido se solubilicen tratándolos con un caotropo no iónico,
preferiblemente urea, y el péptido se aísle después por
cromatografía de intercambio iónico. La suspensión se enfría
preferiblemente a 50ºC o inferior, por ejemplo, por debajo de 40ºC,
antes de añadir el caotropo. La solubilización puede realizarse
añadiendo urea sólida a una concentración de alrededor de 3 M a
aproximadamente 7 M y manteniendo a una temperatura inferior a 40ºC,
preferiblemente a aproximadamente temperatura ambiente
(18-25ºC).
(18-25ºC).
Después de ajustar el pH entre 3 y 7,5,
preferiblemente 3,8-4,2, la solución que contiene el
asociado de fusión y el péptido divididos puede cargarse después
directamente en una columna de intercambio iónico. Puede emplearse
cualquier columna de intercambio iónico disponible comercialmente
adecuada para el péptido. Para péptido natriurético de tipo b, se
empleó una columna de intercambio iónico de sulfopropilo (Pharmacia
Streamline®). La columna se equilibró y lavó para eluir
contaminantes. El péptido deseado se eluye después de la columna
usando una concentración de sal apropiada. Para péptido natriurético
de tipo b, la elución de la columna se efectuó preferiblemente con
solución de NaCl 0,5-0,6 M.
En muchos casos, el péptido recuperado de la
columna de intercambio iónico se repliega en su conformación
nativa, aunque pueden requerirse etapas adicionales para restaurar
el péptido a una forma activa biológicamente, particularmente
cuando el péptido requiere para actividad la formación de enlaces
disulfuro internos. El péptido natriurético de tipo b contiene dos
residuos de cisteína que deben enlazarse por disulfuro. Esto puede
conseguirse sometiendo el péptido recuperado a condiciones de
oxidación. La oxidación puede efectuarse habitualmente sometiendo
una solución del péptido a calor y agitación bajo aire.
Alternativamente, pueden emplearse oxidantes tales como Cu^{+2},
I_{3}^{-} o
Fe(CN)_{6}^{-3}.
Fe(CN)_{6}^{-3}.
Si se desea, pueden emplearse etapas de
purificación adicionales usando técnicas conocidas por los expertos
en la técnica. Tales etapas pueden incluir, por ejemplo, HPLC, tal
como RP-HPLC o etapas de cromatografía de
intercambio iónico adicionales. En el caso de péptido natriurético
de tipo b, el péptido recuperado se sometió a
RP-HPLC (HPLC de fase inversa), en tampón de acetato
amónico pH 5,0-5,5 y gradiente de elución de
acetonitrilo.
La presente invención describe también un vector
de expresión adecuado para realizar el método de producción de la
invención. El vector de expresión utiliza una secuencia de ADN que
codifica al menos una porción N-terminal de la
secuencia de aminoácidos de cloranfenicol acetil transferasa (CAT)
que se ha modificado de tal modo que se haya sustituido un número
suficiente de codones para residuos de lisina, arginina y/o
histidina por codones para aminoácidos sin cargar o cargados
negativamente de tal modo que el pI de la proteína de fusión esté
entre 6,0 y 8,0, preferiblemente entre 6,5 y 7,5. Ventajosamente,
parte de los residuos de lisina, arginina y/o histidina puede
sustituirse con residuos hidrófobos, que no sólo reducen la carga
neta del asociado de fusión, sino que promueven también la formación
de cuerpos de inclusión dentro de la célula hospedante. Si se desea,
pueden sustituirse uno o más codones para residuos de triptófano,
cisteína y/o metionina en la secuencia nativa de CAT por codones
para residuos distintos de triptófano, cisteína o metionina con el
fin de impedir reacciones secundarias oxidativas indeseables, por
ejemplo, enlace disulfuro con péptido natriurético de tipo b,
siempre que la proteína de fusión resultante tenga un pI en el
intervalo
requerido.
requerido.
En la Fig. 1, la secuencia de aminoácidos en la
línea superior representa la secuencia de aminoácidos nativa de los
primeros 78 aminoácidos del término N de CAT. La línea inferior
representa la secuencia de CAT modificada que se codificó por el
vector que se usó para expresar una proteína de fusión adecuada para
la producción de péptido natriurético de tipo b. Los cinco
aminoácidos de la secuencia modificada que comienza con Thr
(posición 74) representa una secuencia de enlace que une el Asp
C-terminal con la secuencia de CAT modificada y que
introduce un lugar de AgeI. El lugar de AgeI se produjo mutando los
codones para los aminoácidos 74 y 75.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica
CAT modificada está bajo el control de una secuencia reguladora que
es capaz de dirigir la expresión de la proteína de fusión en la
célula hospedante. Puede emplearse cualquier promotor adecuado, por
ejemplo, un promotor trpLE, phoA o lacZ. Un
promotor preferido es el promotor phoA de E. coli
descrito por Wanner, B.L. en Escherichia coli and Salmonella,
2ª edición (Neidhardt, P.C. et al. Reds., ASM Press,
Washington, D.C.), págs. 1357-1381. Este promotor
inicia la transcripción de la proteína de fusión que codifica la
secuencia de ADN en ausencia de fosfato en el medio de crecimiento.
El promotor phoA que puede emplearse se mutó de la secuencia
de phoA de E. coli nativa para sustituir la señal de
GTG nativa por una señal de iniciación de la traducción de ATG. La
Fig. 2 muestra la secuencia de ADN del promotor phoA de tipo
natural en la línea superior y el promotor phoA modificado
empleado por los inventores para producir el vector de expresión
para péptido natriurético de tipo b en la línea de abajo.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
deseado está enlazada en su extremo 5' al codón de Asp en el extremo
3' del asociado de fusión. La secuencia de ADN que codifica el
péptido tiene, en su extremo 5', un codón para Pro, Gly, Ser o Leu.
El aminoácido particular escogido dependerá en parte de la secuencia
del péptido deseado. Si el péptido contiene uno o más lugares de
división por ácido internos, el aminoácido
N-terminal debe seleccionarse de tal modo que el
lugar de división en la unión del asociado de fusión y el péptido se
divide a una velocidad mayor que la del lugar de división interno.
Si la secuencia nativa del péptido deseado no contiene un codón de
Pro, Gly, Ser o Leu en su término N, el ADN que codifica el péptido
se modifica sustituyendo un codón por el aminoácido deseado en el
extremo 5'. Se apreciará que esto producirá un aminoácido extraño en
el término N del péptido tras la división del asociado de fusión,
que puede ser aceptable si no interfiere con la actividad biológica.
En el caso de péptido natriurético de tipo b, el aminoácido
N-terminal es Ser. Este aminoácido es aceptable en
la unión con el asociado de fusión, porque el péptido natriurético
de tipo b contiene sólo un lugar de división por ácido interno,
Asp-Arg, que se divide a una velocidad mucho más
baja que Asp-Ser.
El vector de expresión puede prepararse e
incorporarse a una célula hospedante usando técnicas muy conocidas
de recombinación de ADN.
Los siguientes ejemplos no limitativos se
pretenden para ilustrar adicionalmente la práctica de la invención
descrita aquí. El plásmido pCB101-1 (Ejemplo 1) en
un hospedante W3113 de E. coli se ha depositado en la
American Type Culture Collection, Manassas, VA, con el nº de
admisión ATCC 98774. El plásmido pTH76 (Ejemplo 1) en un hospedante
W3113 de E. coli se ha depositado en la American Type Culture
Collection, Manassas, VA, con el nº de admisión ATCC 98775. El
plásmido pTH53 (Ejemplo 2) en un hospedante W3113 de E. coli
se ha depositado en la American Type Culture Collection, Manassas,
VA, con el nº de admisión ATCC 98776.
El plásmido resistente a tetraciclina
pCB101-1 (5 \mug), que codifica el promotor
trp y una proteína de fusión consistente en el péptido
natriurético de tipo b fusionado al extremo 3' de una porción
N-terminal de 153 aminoácidos modificada de
cloranfenicol acetil transferasa, se digirió con NdeI y AgeI. El
digerido resultante se sometió a electroforesis en un gel de
agarosa del 1% (SeaPlaque, FMC, Rockland, ME) y se cortó el
fragmento de
3,4 kpb.
3,4 kpb.
\newpage
Se sintetizaron oligonucleótidos siguiendo las
siguientes secuencias:
Se fosforilaron individualmente los
oligonucleótidos 1100-1105 (1 \mug cada uno) por
tratamiento con ATP y quinasa de polinucleótido T_{4} y se
combinaron con 1 \mug cada uno de los oligonucleótidos 1099 y
1106. La mezcla de oligonucleótidos se desnaturalizó después por
ebullición durante 7 minutos y se la dejó enfriarse gradualmente a
temperatura ambiente. Cinco \mul de estos 214 \mul de mezcla de
reacción se ligaron con 1,5 \mul del fragmento cortado fundido de
pCB101-1 preparado antes usando ligasa de ADN
T_{4} a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se
re-fundió después y se usó para transformar la cepa
MC1061 de E. coli a resistencia a tetraciclina. Se examinaron
plásmidos que tenían un fragmento de AgeI/MluI de 317 pb en ocho de
las colonias resultantes. Un plásmido tal se denominó pTH80, que
codifica una secuencia de CAT modificada fusionada a natriurético de
tipo b bajo el control de trp.
\newpage
Es importante ser capaces de controlar la
síntesis de la proteína de fusión durante la fermentación. El
promotor phoA tiene la ventaja de ser capaz de mantener el
gen objetivo en estado no inducido hasta conseguir la inducción
total por agotamiento de PO_{4}. Para poner la fusión bajo el
control del promotor phoA, se digirió pTH80 con enzimas de
restricción NdeI y HindIII. Se sometió después el digerido a
electroforesis en un gel de agarosa del 3% (NuSieve, FMC, Rockland,
ME) y se cortó el fragmento de 332 pb que codificaba la fusión
CAT-BNP. El fragmento de vector se preparó por
digestión del plásmido de resistencia a tetraciclina, pTH76, con
NdeI y HindIII. El pTH76 es muy similar al pTH80 excepto que se
sustituyó el promotor trp por el promotor phoA. El
fragmento de vector se aisló por digestión de 2,4 \mug de pTH76
con NdeI y HindIII a 37ºC durante la noche seguido por tratamiento
con fosfatasa intestinal de becerro a 37ºC durante una hora. El
volumen final de la mezcla de reacción fue 100 \mul. Se realizó
una ligación entre 1 \mul del fragmento de vector y 3 \mul de
una rebanada de gel cortada fundida que contenía el fragmento de
inserto de pTH80. Tras incubación durante la noche a temperatura
ambiente, se usó la mezcla para transformar la cepa W3110. Se
examinó la presencia de un lugar de BstXI único en el ADN preparado
de las colonias resultantes. Se confirmaron tres clones positivos
por determinación de secuencia de ADN. Uno de éstos se denominó
pTH85. La Fig. 3 es un diagrama de plásmido de pTH785.
El plásmido pTH785 y oros dos clones positivos
de su construcción se usaron para transformar cepa W3110 de E.
coli a resistencia a tetraciclina. Se inocularon colonias
simples en caldo L con 6,25 \mug/ml de tetraciclina. Después de 4
horas de incubación a 37ºC, se usó el cultivo resultante para
inocular un cultivo que contenía los siguientes medios a una
densidad óptica de 0,1:
Glucosa | 4 g |
Casaminoácidos | 5 g |
Tampón de MOPS potásico 1 M, pH 7,4 | 40 ml |
(NH_{4})_{2}SO_{4} | 1,24 g |
MgSO_{4} 1 M | 2 ml |
Agua hasta un volumen final de 1 litro |
Después de incubar durante la noche a 37ºC,
podían observarse que todas las células bajo microscopía de
contraste de fase tenían al menos un cuerpo de inclusión brillante
de fase. Las células se recuperan e hirvieron durante 18 minutos en
tampón de muestra de SDS y se sometieron a electroforesis en un gel
de Tris-glicina SDS poliacrilamida de Laemmli
estándar. La acumulación abundante de la proteína de fusión de
péptido natriurético b se indica por la presencia de una banda de
coloración Coomassie fuerte a aproximadamente 12 kdaltons.
La división por ácido tiene lugar más
rápidamente en un enlace de péptido Asp-Pro. Puesto
que el segundo residuo de péptido natriurético de tipo b maduro es
Pro, es posible facilitar la división del péptido natriurético de
tipo b del asociado de fusión expresando una versión truncada de
péptido natriurético de tipo b que comprende los residuos de
aminoácidos 2-32 [péptido natriurético de tipo b
(2-32)]. Una forma alterada del fragmento de
restricción de AgeI/HindIII que carecía del codón de serina inicial
del péptido natriurético de tipo b maduro se construyó por PCR de
la secuencia de codificación de tipo natural usando los siguientes
dos oligonucleótidos como cebadores de PCR:
Se preparó una mezcla de reacción de 100 \mul
que contenía 0,4 mM de cada dNTP, 1,3 \mug de cada cebador, 50 ng
de plásmido pTH53 que llevaba la secuencia de péptido natriurético
de tipo b fusionada en el extremo 3' a un clon de ubiquitina humana
y 1 \mul de polimerasa de ADN VENT (New England Biolabs, Beverly,
MA) en un tampón de reacción proporcionado por el fabricante. La
reacción se efectuó durante 30 ciclos del siguiente programa de
temperaturas: 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC
durante 1 minuto. El tamaño anticipado, 167 pb, se verificó por
electroforesis en gel de agarosa sobre 3% de Nusieve. El producto de
reacción PCR, junto con el plásmido vector pTH53, se sometieron
después a doble digestión con KpnI y HindIII. El digerido del vector
se trató adicionalmente con fosfatasa intestinal de becerro durante
45 minutos a 37ºC seguido por extracción con fenol y precipitación
con etanol. El digerido del plásmido se resuspendió después en 30
\mul de tampón de Tris-EDTA. El digerido de PCR se
sometió a electroforesis sobre 3% de Nusieve y se recuperó el
fragmento de 108 pb por interceptación de la banda migrante con
papel DE81. La ligación del vector y fragmentos digeridos de PCR se
realizó en una mezcla de reacción de 20 \mul consistente en 0,5
\mul de ADN de vector, 0,1 \mul de fragmento de PCR y 0,5
\mul de ligasa de ADN T_{4} (New England Biolabs, Beverly, MA)
en el tampón suministrado por el fabricante. La ligación se efectuó
a temperatura ambiente durante 3 horas seguida por transformación en
E. coli B competente con CaCl_{2}. Se preparó ADN de
plásmido a partir de dos de los transformantes resultantes y se usó
determinación de secuencia didesoxi para determinar que se había
obtenido la secuencia de nucleótidos correcta. Este plásmido se
denominó pUDBNP2 y codifica ubiquitina humana fusionada en marco a
péptido natriurético de tipo b (2-32).
Para la construcción de un plásmido de expresión
que exprese una fusión génica de CAT154 a péptido natriurético de
tipo b (2-32), se usó plásmido pUDBNP2 como fuente
de la secuencia de codificación del péptido natriurético de tipo b
(2-32), mientras que el plásmido
pCB101-1 codifica el asociado de fusión CAT154 y se
usará como receptor del fragmento de péptido natriurético de tipo b
(2-32). Cinco microgramos de pUDBNP2 y 1 \mug de
pCB101-1 se digirieron cada uno con AgeI en el
tampón suministrado por el fabricante (New England Biolabs, Beverly,
MA) durante 2 horas a 37ºC. Se comprobó en los digeridos que se
había completado por electroforesis en el gel de agarosa. Se
recuperó ADN de la mezcla de digestión usando GeneClean (Bio101, CA)
y se eluyó en un volumen final de 15 \mul. Ambos plásmidos se
digirieron después con BamHI en el tampón suministrado por el
fabricante (New England Biolabs, Beverly, MA) durante 1,5 horas a
37ºC. La electroforesis en gel de agarosa mostró que la digestión
de pUDBNP2 era incompleta, por tanto, se recuperó el ADN
parcialmente digerido usando Gene Clean y se redigirió con BamHI
como antes. En este punto, la electroforesis en gel de agarosa
mostró que ambos digeridos de pUDBNP2 y pCB101-1
eran completos. Se prepararon fragmentos para ligación por
electroforesis sobre 3% de Nusieve cortando la banda de 2407 pb del
digerido de pUDBNP2 y la banda de 1562 pb del digerido de
pCB101-1. Se recuperaron fragmentos de ADN usando
Geneclean y se eluyeron en un volumen final de 10 \mul. La
ligación de los dos fragmentos se consiguió usando 2 \mul del
fragmento de ADN de pUDBNP2 y 5 \mul del fragmento de ADN de
pCB101-1 en una mezcla con 1 \mul de ligasa de ADN
T_{4} (New England Biolabs, Beverly, MA) en el tampón suministrado
por el fabricante a 15ºC durante la noche. La mezcla resultante se
transformó en E. coli W3110 competente con CaCl_{2}. El
ADN de plásmido preparado a partir de seis de los transformantes
resultantes se digirió con BglI y se identificaron plásmidos que
tenían la estructura correcta en base a la presencia de fragmentos
de 2845 pb y 890 pb. Una banda de 234 pb esperada procedente de la
región de resistencia a tetraciclina es demasiado pequeña para ser
visualizada. Además, se inocularon también cultivos usados para
preparación de ADN de plásmido en pequeños cultivos LB y se
incubaron durante la noche a 37ºC. Las células resultantes se
visualizaron por microscopía de contraste de fases mientras otras
partes alícuotas se hirvieron en tampón de muestra de SDS y se
analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. De las
seis colonias tratadas de esta forma, las tres que dieron el modelo
de restricción correcto mostraron también la presencia de cuerpos de
inclusión brillantes de fase en microscopio y la presencia de una
banda de coloración de Coomassie fuerte a aproximadamente 20.500
daltons en SDS-PAGE. Este plásmido se denominó
pSP54. La Fig. 4 es un digrama de plásmido de pSP54.
Se fermentaron en modo de alimentación
discontinua células de E. coli que albergaban el vector de
expresión (pTH 85/TEH 102) de péptido natriurético de tipo b
(1-32). La inducción de la expresión de proteína de
fusión en este sistema se ocasiona permitiendo a las células agotar
el fosfato del medio. Se cosecharon al final de las fermentaciones
cuarenta y tres litros de caldo de fermentación completo. La biomasa
resultante se recogió por centrifugación de caldo de fermentación
completo en botellas de 1 l y se guardó a -70 \pm 10ºC. La
producción de biomasa de 43 litros de fermentación fue 4,7 kg de
peso húmedo de células de E. coli. La biomasa congelada se
descongeló durante la noche a temperatura ambiente y se diluyó hasta
25% p/v usando tampón de lisis (Na_{x}H_{x}PO_{4} 20 mM, EDTA
5 mM, pH 6,0). Se homogeneizaron las células usando un
homogeneizador Maton-Gaulin Modelo 30CD
(632,8-703,1 kg/cm^{2}) con un intercambiador de
calor refrigerado en línea. La solución de células se enfrió a 2ºC
antes de iniciar la lisis y se mantuvo la temperatura por debajo de
15ºC durante toda la lisis. El flujo a través del homogeneizador se
encaminó de vuelta a la solución de células para permitir una media
de 6 pasadas a través del homogeneizador para conseguir el punto
final de homogeneización de > 90% de lisis como se apreció por
examen microscópico.
La centrifugación discontinua se realizó en
botellas de polipropileno de 1 l usando una centrífuga Sorvall
RC-3B refrigerada con rotor H6000. El lisado de
células de E. coli se diluyó con tampón de lisis hasta 12,5%
de peso de células de partida y se centrifugó en una centrífuga
Sorvall RC-3B equipada con un rotor H6000A a 4.500
rpm (5894 g) durante 40 minutos. Se decantó el sobrenadante y el
glóbulo de cuerpo de inclusión (905 g) se guardó a
2-8ºC.
Las mezclas de reacción de división por ácido se
prepararon a partir de la preparación de cuerpos de inclusión
descrita antes. Los cuerpos de inclusión se retiraron del
almacenamiento a 2-8ºC y se resuspendieron usando
un homogeneizador de mano hasta 1980 ml (100 g de cuerpos de
inclusión/220 ml) con agua desionizada. Se elaboró adicionalmente
una parte alícuota de esta suspensión equivalente a 100 g de peso
húmedo. La preparación de cuerpos de inclusión se diluyó con 780 ml
de agua desionizada para producir una suspensión del 10% de peso
húmedo. Se ajustó el pH de la suspensión de cuerpos de inclusión con
ácido clorhídrico concentrado (\sim4 ml) en 1,99. Se requirió
agitación vigorosa a medida que la solución espesaba entre pH 4,5 y
3,0.
La suspensión de cuerpos de inclusión descrita
antes se puso en un recipiente de reacción revestido de vidrio de
temperatura controlada equipado con agitación, abertura de muestras
y conexiones para proporcionar una atmósfera de gas inerte. Se
permitió fluir gas inerte al recipiente de reacción a 0,35
kg/cm^{2} con la ventilación abierta. Se encendió el controlador
de temperatura y se ajustó en la regulación apropiada. La medición
del tiempo de reacción comenzó en este punto. Se permitió proceder
el calentamiento a 40ºC, en cuyo momento se cerró la ventilación y
se permitió presurizar el recipiente de reacción a 0,35 kg/cm^{2}.
El recipiente de reacción se ventiló ocasionalmente durante el
período de ajuste de temperatura para mantener esta presión de
cabeza. La mezcla de reacción estuvo dentro de 5ºC de la temperatura
deseada en 15 minutos. La temperatura se controló en 85 \pm 0,5ºC
durante todo el período de reacción. Se tomaron muestras a
intervalos regulares (1 hora y 30 minutos) para análisis
RP-HPLC de liberación de péptido natriurético de
tipo b. El muestreo se realizó cerrando primero la válvula de
entrada de gas, ventilando después el recipiente a presión
atmosférica y retirando finalmente una muestra de 1 ml por la
abertura de muestras con una jeringa desechable. La abertura de
muestras se cerró después, se volvió a abrir la válvula de entrada
de gas, se dejó ventilarse el recipiente durante
5-10 segundos y se cerró finalmente la ventilación
para permitir represurizarse el recipiente.
Se terminó la reacción después de 4,5 horas por
enfriamiento a 2-8ºC en hielo. La solución se agitó
continuamente durante el enfriamiento. La reducción de temperatura a
< 40ºC en < 20 minutos. Al final del período de enfriamiento,
se ajustó el pH de la mezcla de reacción en 2,9 con NaOH 2 N. El
contenido de péptido natriurético de tipo b de esta solución se
determinó por área de pico de RP-HPLC como 1,92 g de
péptido natriurético de tipo b/l. Esta solución se congeló a -70
\pm 10ºC hasta tratamiento adicional.
Para purificación de IEC de péptido natriurético
de tipo b (1-32), se combinaron cuatro mezclas de
reacción de división por ácido, preparadas como se ha descrito
antes, y se añadieron 260 g de urea sólida a 1 l de mezcla de
reacción de división por ácido para dar una concentración de urea
3,5 M. El volumen final fue 1,3 l. Esta solución contenía 0,6 mg de
péptido natriurético de tipo b/ml o 780 mg de péptido natriurético
de tipo b. La solución se cargó en una columna rellena de Whatman
Express-Ion Exchanger S (resina de intercambio
iónico de sulfoxietilo) a razón de 8 mg de hBNP/ml de resina, en
base al ensayo de RP-HPLC. La columna se lavó
secuencialmente con 200 ml de urea 3,5 M, ácido acético 50 mM pH
3,5, 500 ml de ácido acético 50 mM, 600 ml de ditiotreitol (DTT) 10
mM, fosfato sódico 50 mM pH 7,2 y finalmente con 1 l de NaCl 55 mM
en fosfato sódico 50 mM pH 6,8. La elución del péptido natriurético
de tipo b totalmente reducido ahora de la columna se realizó con un
gradiente de etapas de 1 l de NaCl 500 mM en fosfato sódico 50 mM pH
6,8. Se recogió el pico de elución de 150 ml y se analizó el
contenido de péptido natriurético de tipo b (590 mg total). El
agrupamiento de elución se guardó a -70 \pm 10ºC hasta elaboración
adicional.
Se descongelaron 145 ml del eluyente de la
columna de intercambio iónico durante la noche a 4ºC y se dejó
después calentarse a temperatura ambiente. La solución se diluyó con
fosfato sódico 50 mM pH 6,8 a 1,4 mg de péptido natriurético de tipo
b/ml. La formación de enlace disulfuro se consiguió por oxidación
con aire a 35ºC durante 6 horas con agitación moderada. La reacción
se terminó por acidificación a pH 5,0 por adición de ácido acético 5
M. El agrupamiento de oxidación se guardó a -70 \pm 10ºC hasta
elaboración adicional.
Los agrupamientos de oxidación de dos reacciones
de oxidación realizadas como se ha descrito antes se descongelaron a
2-8ºC durante la noche y se dejaron calentarse a
temperatura ambiente. Se ajustó el pH en 5,5 con hidróxido amónico 5
N. Esta solución (869 mg de péptido natriurético de tipo b en 756
ml) se cargó a 10,6 ml/min en RP-HPLC preparativa
(Zorbax Pro 10/150 C8) con mezclado de disolvente (Carga: Tampón B
85:15) para obtener 6% de acetonitrilo en la carga. La carga de
resina fue 9,8 mg/ml de resina. La elución se realizó con el mismo
caudal según la tabla indicada después. El Tampón A es agua
purificada, el Tampón B es acetonitrilo al 40%, el Tampón C es
acetato amónico 1 M pH 5,5.
Etapa | Volumen (ml) | Carga % | Tampón A % | Tampón B % | Tampón C % |
Carga | 890 | 85 | 15 | ||
Lavado | 353 | 60 | 15 | 25 | |
Inicio de gradiente | 60 | 15 | 25 | ||
Fin de gradiente | 441 | 35 | 40 | 25 | |
Guardado | 177 | 35 | 40 | 25 |
Se analizaron fracciones del pico de elución por
RP-HPLC analítica y se agruparon fracciones de >
96% de pureza. El agrupamiento de RP-HPLC contenía
406 mg de péptido natriurético de tipo b (1-32).
El pico principal de RP-HPLC de
una preparación similar de péptido natriurético de tipo b después de
división por ácido, cromatografía IEC y RP-HPLC se
caracterizó por determinación de secuencia de aminoácidos
N-terminal completa, análisis de aminoácidos y
espectrometría de masas de electropulverización. En todos los
aspectos, el péptido producido por este procedimiento era
indistinguible de péptido natriurético de tipo b sintético
estándar.
Como alternativa a la solubilización de la
mezcla de reacción de división por ácido para cromatografía, el
péptido natriurético de tipo b soluble puede aislarse de la mezcla
de reacción de división por ácido cruda mediante diafiltración. El
péptido natriurético de tipo b reducido pasa a través del filtro y
se retienen los agregados de mayor peso molecular y material
insoluble. El péptido natriurético de tipo b pasa libremente a
través de la membrana y se encuentra en el filtrado.
Un filtro Filtron ultrasette con corte de peso
molecular nominal de 300 kD (Filtron, Cat OS100C72) se puso en modo
de diafiltración según la instrucción del fabricante. El dispositivo
se lavó con H_{2}O destilada y se equilibró después con acetato
sódico 20 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 4,0.
Se preparó como se ha descrito antes un litro de
mezcla de reacción de división por ácido. Esta solución contenía
705 mg de péptido natriurético de tipo b reducido, determinado por
área de pico de RP-HPLC (RT 112/123, 1/26/96). Esta
solución se puso en una botella Pyrex de 2 l y se añadieron 60 ml de
cloruro sódico 5 M. La mezcla se agitó en hielo durante 25 minutos
y se añadieron después 60 ml de agua destilada y 100 ml de acetato
sódico 0,2 M, pH 4,0. Se continuó la agitación durante otros 20
minutos en hielo. Se hizo circular después la mezcla a través del
dispositivo de diafiltración usando una bomba peristáltica con el
caudal de circulación mantenido en 2 l/min. La salida del filtrado
se cerró completamente al inicio de la circulación. Después de
aproximadamente dos minutos de circulación, la salida del filtrado
se abrió lentamente y se controló el caudal de filtrado en un caudal
medio de 53,5 ml/min (intervalo 25-82 ml/min). Se
añadió a la botella de 2 l tampón de diafiltración, acetato sódico
20 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 4,0, con el mismo caudal con que se
separaba el filtrado del filtro con el fin de mantener la solución
de diafiltración en volumen constante. Con estos ajustes, la presión
transmembrana se mantuvo en < 0,7 kg/cm^{2} durante todo el
procedimiento de diafiltración completo. Después de recoger un total
de 5.700 ml de filtrado, se detuvo la adición de diluyente a la
solución de diafiltración. Se recogió 1 l de filtrado adicional
antes de completar el procedimiento de diafiltración. Al final del
procedimiento de diafiltración se había recogido un volumen total
de 6,7 l de filtrado. La cuantificación de péptido natriurético de
tipo b en el filtrado por RP-HPLC mostró una
recuperación de 550 mg de péptido natriurético de tipo b o 78%.
Se fermentaron en modo de alimentación
discontinua células de E. coli que albergaban el vector de
expresión pSP54 de péptido natriurético de tipo b
(2-32). Este sistema usa el promotor trp y la
expresión de la proteína de fusión se induce por adición de ácido
indolacrílico. Se cosechó al final de la fermentación caldo de
fermentación completo (4,7 litros). La biomasa resultante se recogió
por centrifugación de caldo de fermentación completo en botellas de
1 l y se guardó a -70 \pm 10ºC. La producción de biomasa de 4,7
litros de fermentación fue 432 g de peso húmedo de células de E.
coli. La biomasa congelada se descongeló durante la noche a
temperatura ambiente y se diluyó hasta 25% p/v usando tampón de
rotura (Na_{x}H_{x}PO_{4} 20 mM, EDTA 5 mM, pH 6,0). Se
homogeneizaron las células usando un homogeneizador AVP Gaulin
Modelo 30CD (632,8-703,1 kg/cm^{2}) con un
intercambiador de calor refrigerado en línea. La solución de células
se enfrió a 2ºC antes de iniciar la rotura y se mantuvo la
temperatura por debajo de 15ºC durante toda la lisis. El flujo a
través del homogeneizador se encaminó de vuelta a la solución de
células para permitir una media de 4 pasadas a través del
homogeneizador para conseguir el punto final de homogeneización de
> 90% de rotura como se apreció por examen microscópico.
La centrifugación discontinua se realizó en
botellas de polipropileno de 1 l usando una centrífuga Sorvall
RC-3B refrigerada con rotor H6000. El lisado de
células de E. coli se diluyó con tampón de lisis hasta 12,5%
de peso de células de partida y se centrifugó en una centrífuga
Sorvall RC-3B equipada con un rotor H6000A a 4.500
rpm (5894 g) durante 40 minutos. Se decantó el sobrenadante y el
glóbulo de cuerpo de inclusión (111,5 g) se guardó a -70 \pm
10ºC.
La mezcla de reacción de división por ácido se
preparó a partir de las preparaciones de cuerpos de inclusión
descritas antes. Se retiraron cuerpos de inclusión (55,8 g) del
almacenamiento a -70 \pm 10ºC y se resuspendieron usando un
homogeneizador de mano hasta 558 ml con agua desionizada para
producir una suspensión del 10% en peso húmedo. Se ajustó el pH de
la suspensión de cuerpos de inclusión con ácido clorhídrico 1 M
(\sim28 ml) en 2,0. Se requirió agitación vigorosa a medida que la
solución espesaba entre pH 4,5 y 3,0.
La preparación de cuerpos de inclusión se puso
en un recipiente de reacción revestido de vidrio de temperatura
controlada equipado con agitación, abertura de muestras y conexiones
para proporcionar una atmósfera de gas inerte. Se permitió fluir gas
inerte (Ar) al recipiente de reacción a 0,35 kg/cm^{2} con la
ventilación abierta. Se encendió el controlador de temperatura y se
ajustó en la regulación apropiada. La medición del tiempo de
reacción comenzó en este punto. Se permitió proceder el
calentamiento a 40ºC, en cuyo momento se cerró la ventilación y se
permitió presurizar el recipiente de reacción a 0,35 kg/cm^{2}. El
recipiente de reacción se ventiló ocasionalmente durante el período
de ajuste de temperatura para mantener esta presión de cabeza. La
mezcla de reacción estuvo dentro de 5ºC de la temperatura deseada en
15 minutos. La temperatura se controló en 85 \pm 1,5ºC durante
todo el período de reacción. Se tomaron muestras a intervalos
regulares (30 minutos) para análisis RP-HPLC de
liberación de péptido natriurético de tipo b (2-32).
El muestreo se realizó cerrando primero la válvula de entrada de
gas, ventilando después el recipiente a presión atmosférica y
retirando finalmente una muestra de 1 ml por la abertura de muestras
con una jeringa desechable. La abertura de muestras se cerró
después, se volvió a abrir la válvula de entrada de gas, se dejó
ventilarse el recipiente durante 5-10 segundos y se
cerró finalmente la ventilación para permitir represurizarse el
recipiente.
Se terminó la reacción después de 2,0 horas por
enfriamiento a 20ºC en hielo. La solución se agitó continuamente
durante el enfriamiento. Al final del período de enfriamiento, se
añadieron a la mezcla de reacción 28 ml de ácido fosfórico 1 M
(final 50 mM) y se ajustó el pH de la mezcla de reacción en 2,8 con
NaOH 10 N. El contenido de péptido natriurético de tipo b
(2-32) de esta solución se determinó por ensayo de
RP-HPLC como 0,45 g de péptido natriurético de tipo
b reducido (2-32)/l (223 mg de péptido natriurético
de tipo b reducido total (2-32)). Esta solución se
congeló a -70 \pm 10ºC hasta tratamiento adicional.
Se adsorbió péptido natriurético de tipo b
(2-32) de la mezcla de reacción de división por
ácido con pH ajustado por incubación discontinua con resina de
intercambio catiónico SP-Spherodex LS. Se
descongelaron 500 ml de la mezcla de reacción de división por ácido
descrita antes en un baño de agua caliente durante 1,5 horas, hasta
que la temperatura alcanzó 22ºC. Se añadió resina
SP-Spherodex LS (50 ml), lavada según las
instrucciones del fabricante, a la mezcla de reacción descongelada
en un recipiente de vidrio con agitación moderada. Se agitó la
mezcla durante 90 minutos a temperatura ambiente y se tomaron
muestras del sobrenadante a intervalos de 30 minutos. Se dejó
sedimentar la resina al final del mezclado durante 5 minutos. Se
decantó el sobrenadante y se lavó tres veces la resina con 250 ml de
ácido acético 50 mM. Se rellenó después una columna (2,5 x 11,5 cm)
con la resina y se lavó adicionalmente con 2 volúmenes de columna
(CV) de ácido acético 50 mM pH 3,5 a razón de 8 ml/min. Se lavó
después la columna cn 4 CV de fosfato sódico 50 mM pH 7,2. Se
realizó reducción en columna lavando la columna con 4 CV de
ditiotreitol (DTT) 10 mM, fosfato sódico 50 mM pH 7,2. Finalmente,
se lavó la columna con 4 CV de fosfato sódico 50 mM pH 7,2 seguido
por 5 CV de fosfato sódico 50 mM pH 7,2 que contenía NaCl 200 mM. La
elución del péptido natriurético de tipo b (2-32)
totalmente reducido ahora de la columna se realizó en dos etapas
con NaCl 450 mM y 1 M en fosfato sódico 50 mM pH 7,2. El
agrupamiento de elución de 330 ml se recogió y analizó en él el
contenido de péptido natriurético de tipo b (2-32)
(total 148 mg, rendimiento 66%). El agrupamiento de elución procedió
directamente a formación de enlace disulfuro.
Se ajustaron en pH 6,8 con HCl 2 N los 330 ml de
eluyente de la columna de intercambio iónico que contenían 0,45 mg
de péptido natriurético de tipo b (2-32)/ml. La
formación de enlace disulfuro se consiguió por adición de 11 ml de
K_{3}Fe(CN)_{6} 15 mM a la solución bajo argón a
2-8ºC durante 11 horas. La reacción se terminó por
acidificación a pH 5,0 por adición de 3,4 ml de ácido acético 5 M.
El rendimiento de la reacción de oxidación fue 121 mg de péptido
natriurético de tipo b (2-32), un rendimiento de
etapa del 82%. El agrupamiento de oxidación se guardó a
2-8ºC durante la noche.
El agrupamiento de oxidación se dejó calentarse
a temperatura ambiente y se purificó adicionalmente por
RP-HPLC. Se añadió acetonitrilo (18 ml) a 342 ml de
agrupamiento de oxidación para dar 360 ml de carga. Se ajustó el pH
en 5,5 con hidróxido amónico 10 N. Esta solución (160 ml que
contenían 51 mg de péptido natriurético de tipo b
(2-32)) se cargó a 4,5 ml/min en la columna de
RP-HPLC (Vydac C4214TP1010). La carga de resina fue
3 mg/ml. La elución se realizó con el mismo caudal según la tabla
indicada después. El Tampón A es acetonitrilo al 5%, acetato amónico
50 mM pH 5,0, el Tampón B es acetonitrilo al 50%, acetato amónico 50
mM pH 5,0.
Etapa | Volumen (ml) | Carga % | Tampón A % | Tampón B % |
Carga | 160 | 100 | ||
Lavado | 67,5 | 100 | ||
Inicio de gradiente | 100 | |||
Fin de gradiente | 180 | 60 | 40 |
Se recogieron manualmente fracciones del pico de
elución, se analizaron por RP-HPLC analítica y se
guardaron a 2-8ºC durante 3 días antes de agrupar.
Se agruparon las fracciones de pureza > 95% para dar un
agrupamiento final de > 97% de pureza por
RP-HPLC analítica y una producción de 48 mg de
péptido natriurético de tipo b (2-32) o un
rendimiento de etapa del 94%.
El pico principal de RP-HPLC de
una preparación similar de péptido natriurético de tipo b después de
división por ácido, cromatografía IEC y RP-HPLC se
caracterizó por determinación de secuencia de aminoácidos
N-terminal completa, análisis de aminoácidos y
espectrometría de masas de electropulverización. Los resultados de
los tres ensayos indicaron que el péptido producido por este
procedimiento era péptido natriurético de tipo b
(2-32).
Claims (13)
1. Un método para producir un péptido purificado
que tiene un pH por debajo de 5 o por encima de 8, que
comprende:
(a) expresar dicho péptido en una célula
hospedante recombinante como una proteína de fusión, en la que el
péptido deseado está fusionado en su término N a un asociado de
fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un
residuo Asp en su término C, en la que (i) el tresiduo Asp
C-terminal del asociado de fusión y el residuo
N-terminal del péptido forman un enlace que es
divisible en condiciones ácidas, (ii) el péptido tiene una carga
neta lo suficientemente diferente de la del asociado de fusión y
cualesquiera fragmentos indeseados producidos por división con ácido
de la proteína de fusión para permitirle ser separado del asociado
de fusión y cualesquiera fragmentos de división por ácido indeseados
de la proteína de fusión por cromatografía de intercambio iónico y
(iii) la proteína de fusión forma cuerpos de inclusión dentro de la
célula hospedante recombinante;
(b) recuperar los cuerpos de inclusión de la
célula hospedante recombinante;
(c) dividir el péptido del asociado de fusión
sometiendo la proteína de fusión a condiciones ácidas en ausencia de
un caotropo;
(d) solubilizar los productos de división
insolubles tratándolos con un caotropo no iónico en condiciones que
los hacen resultar solubilizados sin degradar la estructura
principal del péptido; y
(e) aislar el péptido por cromatografía de
intercambio iónico.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que la proteína de fusión tiene un pI entre 6,0 y 8,0.
3. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que la proteína de fusión tiene un pI entre 6,5 y 7,5.
4. El método de alguna reivindicación
precedente, que comprende además someter el péptido aislado a
condiciones que hacen que se repliegue a una estructura terciaria
activa biológicamente y forme algunos enlaces disulfuro
intramoleculares necesarios para actividad biológica.
5. El método de alguna reivindicación
precedente, en el que el péptido deseado no contiene secuencia de
dipéptido interna que sea divisible en condiciones ácidas.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que el péptido contiene una o más
secuencias de dipéptidos internas que son divisibles en condiciones
ácidas a una velocidad de división inferior que la del dipéptido
formado por el residuo de aminoácidos C-terminal del
asociado de fusión y el residuo de aminoácidos
N-terminal del péptido.
7. El método de alguna reivindicación
precedente, en el que el péptido es péptido natriurético de tipo
b.
8. El método de alguna reivindicación
precedente, en el que el caotropo no iónico empleado en la etapa (d)
es urea.
9. El método de la reivindicación 8ª, en el que
el péptido se trata con urea en una concentración de alrededor de 3
M a aproximadamente 7 M.
10. El método de alguna reivindicación
precedente, en el que el péptido, en su conformación activa
biológicamente, contiene al menos un enlace disulfuro entre los
residuos de cisteína y en el que el método comprende una etapa (f)
de ocasionar la formación de enlaces disulfuro, realizándose la
etapa en condiciones oxidantes.
11. Un método para producir un péptido
purificado que tiene un pI por debajo de 5 o por encima de 8, que
comprende:
(a) expresar dicho péptido en una célula
hospedante recombinante como una proteína de fusión, en la que el
péptido deseado está fusionado en su término N a un asociado de
fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un
residuo Asp en su término C, en la que (i) el tresiduo Asp
C-terminal del asociado de fusión y el residuo
N-terminal del péptido forman un enlace que es
divisible en condiciones ácidas, (ii) el péptido tiene una carga
neta lo suficientemente diferente de la del asociado de fusión y
cualesquiera fragmentos indeseados producidos por división con
ácido del asociado de fusión para permitirle ser separado del
asociado de fusión y cualesquiera fragmentos de división por ácido
indeseados de la proteína de fusión por cromatografía de intercambio
iónico y (iii) la proteína de fusión forma cuerpos de inclusión
dentro de la célula hospedante recombinante;
(b) recuperar los cuerpos de inclusión de la
célula hospedante recombinante;
(c) dividir el péptido del asociado de fusión
sometiendo la proteína de fusión a condiciones ácidas en ausencia de
un caotropo;
(d) separar los productos de división insolubles
de la mezcla de división por ultrafiltración, diafiltración o
centrifugación y
(e) aislar el péptido por cromatografía de
intercambio iónico.
12. El método de alguna reivindicación
precedente, en el que el péptido se somete a una o más etapas de
purificación adicionales subsiguientes a la etapa (e).
13. El método de la reivindicación 12ª, en el
que el péptido es péptido natriurético de tipo b y se somete,
secuencialmente a cromatografía HPLC de fase inversa y una
cromatografía de intercambio iónico adicional subsiguiente a la
etapa (e).
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