JP2002504494A

JP2002504494A - マウス及びヒトエンドスタチンの生産方法

Info

Publication number: JP2002504494A
Application number: JP2000532438A
Authority: JP
Inventors: アイハーディング，エリザベス; エヌヴィオランド，バーナード
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2002-02-12
Also published as: CA2321958A1; KR20010034529A; US6653098B1; CZ20003058A3; CN1295580A; IL137995A0; WO1999042486A1; RU2225728C2; NO20004170D0; AU766154B2; AU3294599A; NO20004170L; NZ506466A; PL342495A1; BR9908186A; EP1056780A1; AU766154C

Abstract

(57)【要約】マウス及びヒトエンドスタチンの生産方法を開示する。バクテリア、並びにエンドスタチンの全長を、及びエンドスタチンの切形型をエンコードする核酸にて発現された封入体からエンドスタチンを再生させ、精製させる方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】優先権本出願は、米国特許法第１１９条の下、１９９８年２月２３日に出願した仮出
願番号６０/０７５，５８７号の優先権を主張するものである。

【０００２】発明の分野マウス及びヒトエンドスタチン（endostatin）の生産方法を開示する。バクテ
リア、並びにエンドスタチンの全長を、及びエンドスタチンの切形型をエンコー
ドする核酸にて発現された封入体からエンドスタチンを再生させ、精製させる方
法をも開示する。

【０００３】発明の背景血管形成新しい血管の成長である血管成長は、癌の成長及び転移において重要な役割を
果たす。ヒトにおいて、腫瘍の脈管構造の程度は、さまざまな癌に対する患者の
予測と相関関係があることが示されてきた（Folkman, J. Seminars in Medicine
of the Beth Israel Hospital, Boston 333(26): 1757-1763, 1995; Gasparini
, G., European Journal of Cancer 32A (14): 2485-2493, 1996; Pluda, J. M.
, Seminars in Onocology 24(2): 203-218, 1997; Norrby, K., APMIS 105: 417
-437, 1997）。正常な大人では、血管形成は創傷治癒及び女性生殖系のような十
分な制御された状況に制限される（Battergay, E. J., J. Mol Med 73: 333-346
, 1995;Dvorak, H.F, New Engl J Med, 315: 1650-1659, 1986）。

【０００４】動物実験から、腫瘍は休眠状態で存在し、腫瘍成長は高速度の増殖と高速度の
アポトーシスとの間のバランスにより制限されることが提案されている（Holmgr
en, LらによるNat. Med. (N. Y.) 1(2): 149-154, 1995; Hanahan DらによるCel
l 86(3): 353-364, 1996）。脈管形成表現型へのスイッチにより、たぶん腫瘍細
胞のアポトーシス速度の低下の結果として、腫瘍細胞は休眠から脱し、急速に成
長を開始する（Bouck, Cancer Cells, 2(6): 179-185, 1990; DameronらによるC
old Spring Harb Sysp Quant. Biol, 59: 483-489, 1994）。血管形成の制御は、新しい血管形成を促進させる因子と新血管形成を抑制する因子との間のバラン
スであると考えられている（BouckらによるAdvances in Cancer Research 69: 1
35-173, 1996; O’ReillyらによるCell 79(2):315-328, 1994）。

【０００５】多様なプロ‐血管形成因子は、塩基性及び酸性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ
及びａＦＧＦ）と、血管透過性因子/血管内皮成長因子（ＶＰＦ/ＶＥＧＦ）とを
包含することを特徴する（Potgens, A. J. G.らによるBiol. Chem. Hoppe-Seyle
r 376: 57-70, 1995; Ferrara, N., European Journal of Cancer 32A(14): 241
3-2442, 1996; Bikfalvi, AらによるEndocrine Reviews 18: 26-45, 1997）。数
多の内因性坑血管形成誘導因子は、アンギオスタチンと（angiostatin）(O’Rei
llyらによるCell 79(2): 315-328,1994)、エンドスタチンと（O’ReillyらによるCell 88(2): 277-285, 1997）、インターフェロン‐αと（Ezelowitzらによる
N. Engl. J. Med., May 28, 326(22) 1456-1463, 1992）、トロンボスポンジンと（thrombospondin）(GoodらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87(17): 6624
-6628, 1990; TolsmaらによるJ Cell Biol 122(2): 497-511, 1993)、血小板第四因子と（ＰＦ４）（MaioneらによるScience 247(4938): 77-79, 1990）を含有
することをも特徴とする。

【０００６】多くの血管形成阻害剤が臨床展開中である（ShawverらによるDrug Discovery
Today 2(2): 50-63, 1997及び本文献中の参考文献を参照）。インターフェロン αや血小板第四因子のようなポリペプチドも臨床トライアル中である。アンギオ
スタチンと溶解性Ｆｌｔ‐レセプターと殺菌性/透過性増大タンパク質誘導体２３は前臨床研究中である。ヒトアンチ‐ａ_ｖｂ_３抗体（ＬＭ６０９）、アンチ‐
ＶＥＧＦやアンチ‐Ｆｌｋ‐１モノクローナル抗体（ＤＣ１０１）のようなモノ
クローナル抗体も、前臨床研究中である。テコガラン（Tecogalan）（ＤＳ４１５２）、硫酸多糖‐ペプチドグリカン錯体は臨床トライアル中であり、ｂＦＧＦ
炭水化物阻害剤（ＧＭ１４７４）及びｂＦＧＦ（ＧＬ１４．２）のグリセプター
模倣性阻害剤は前臨床研究中である。抗生物質ＡＧＭ１４７０（ＴＮＰ４７０）
と、フマギリン類似体と、スラミン（Suramin）とポリアニオン性化合物は臨床トライアル中である。ウロキナーゼレセプターアンタゴニスト、ホスファチジン
酸の阻害剤、Ｆｌｋ‐１の阻害剤やＶＥＧＦ‐Ｆｌ１結合の阻害剤のような小さ
な分子の阻害剤も全て前臨床研究中である。サリドマイド及びその類似体、バテ
ィマスタット/マリマスタット（Batimastat/Marimastat）のようなマトリックス
メタロプロテイナーゼ阻害剤は臨床トライアル中である。ＶＥＧＦＲレセプター
及びＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドをターゲットとするリボザイムの
ようなオリゴヌクレオチドも、前臨床トライアル中である。

【０００７】坑血管形成治療により、癌治療の従来の化学療法よりも優れた幾つかの効果を
提供する。坑血管形成剤は前臨床トライアルでは低毒性であり、薬剤耐性の開発
は観察されていない（Folkman, J., Seminar in Medicine of the Beth Israel
Hospital, Boston 333(26): 1757-1763,1995）。血管形成は、侵入、増殖、内皮
細胞の移動を含む多くの工程からなる複雑な過程であるので、組合わせ治療が最
も効果的であることが予想され得る。実際に、坑血管形成治療による化学療法の
組合わせにより、前臨床モデルにおいて将来有望であることが、既に示されてい
る（Teicher, B. A.らによるBreast Cancer Research and Treatment 36: 227-2
36, 1995; Teicher, B. A.らによるEuropean Journal of Cancer 32A(14):2461-
2466, 1996）。

【０００８】エンドスタチンエンドスタチンはα１タイプのコラーゲンＸＶＩＩのＣ末端断片から誘導され
た２０ｋＤａのタンパク質である。血管内皮腫細胞系統（ＥＯＭＡ）からの調製
済み細胞培地は、インビトロにて内皮細胞の増殖を阻害する因子を有すること示
された（O’ReillyらによるCell 88: 277-285, 1997）。上記阻害の原因となる因子はエンドスタチンと名付けられた。バキュロウイルス感染の昆虫細胞にて発
現された上記タンパク質の組換え体は、ルイス肺腫瘍モデルでの癌細胞の転移の
成長を阻害し、上記タンパク質の不溶性大腸菌誘導型は幾つかの腫瘍モデルでの
主要な腫瘍成長を予防するのに効能があることが分かった（O’Reillyらによる.
, Cell 88: 277-285, 1997; BoehmらによるNature 390:404-410, 1997）。

【０００９】エンドスタチンの精製及び再生多くのタイプの発現系が過去２０年以上にわたり開発されてきたが、バクテリ
ア系、特に大腸菌に基づく系は、工業的スケールでのタンパク質生産に幅広く利
用されている。高レベルの発現を可能にするベクターと、高細胞密度で発酵を行
うことが出来る能力が、大腸菌に基づく発現系の活発な開発と利用に寄与した。
しかしながら、一つの重要な問題として、大腸菌が所望の組換えタンパク質を含
有する封入体を生成させやすいことにある。封入体生成には、生物学的に活性な
タンパク質が回収される前に、インビトロでの再生のような追加の下流プロセシ
ングは必要である。不溶性凝集体を生成しやすい傾向には、サイズ、疎水性、サ
ブユニット構造のような因子、又は融合ドメインの使用と相関関係はない（Kane
J. F.とHarley, D. L., Tibtech 6: 95, 1988）。封入体生成はタンパク質の合
成速度、フォールド形成速度、凝集速度及びタンパク質分解速度、フォールド形
成中間体及び天然タンパク質の溶解性及び熱力学、並びにチャペロンタンパク質
と上記種との相互作用により決定される（Rainer Rudolph, In Protein Enginee
ring: Principles and Practice, Edited by Jeffrey L. ClelandとCharles S.
Craik, p 283-298, Wiley‐Liss, Inc., New York, New York, 1996）。

【００１０】通常、封入体は高レベルで組換えタンパク質を発現する細胞の細胞質にて生成
する。封入体は位相コントラスト顕微鏡により観察した際に光を屈折させ、よっ
てしばしば屈折体といわれる。封入体は比較的高い有効濃度により特徴付けられ
、遠心分離により溶解細胞からペレット化される。封入体の生成は、組換えタン
パク質が生理溶媒条件下で容易に崩壊しないので、タンパク質分解から組換えタ
ンパク質を保護する。６Ｍのグアニジン塩酸塩又は６乃至８Ｍの尿素のような高
濃度の変性剤は、封入体に存在するタンパク質を可溶化させるために、通常利用
される。多様な封入体可溶化プロトコールが比較されている（Fisher, B., Summ
er, L.とGoodenough, P. Biotechnol. Bioeng. 1: 3-13, 1992）。

【００１１】所望の外来遺伝子産物は封入体の主成分であるが、小さな熱ショックタンパク
質、外膜タンパク質、延長因子ＥＦ‐ＴｕやＲＮＡポリメラーゼのような他の宿
主細胞タンパク質も、かかる合成に富化される（Allen, S. P., Polazzi, J. O.
Dierse, J. KとEaston, A. M., J. Bacteriol. 174: 6938-6947, 1992; Hart, R
. A., Rinas, U.,とBailey, J. E., J. Biol. Chem. 265: 12728-12733, 1990;
Hartley, D. L., とKane, J. F., Biochem. Soc. Trans. 16: 101，1988）。

【００１２】国際出願ＷＯ第９７/１５６６６号には、大腸菌及びバキュロウイルス感染昆虫細胞からのエンドスタチンの発現、精製及び特性が開示されている。細菌誘導
エンドスタチンは天然状態に再生されないが、大部分の上記研究の不溶性懸濁液
として利用された。上記開示では、マウス血管内皮腫細胞系統ＥＯＭＡの調製済
培地から天然エンドスタチンの精製が記載されている。エンドスタチンは上記調
製済培地から、古典的精製法により精製された。

【００１３】エンドスタチンを再生させる試みはうまくいっていないことが記載されていた
（O’ReillyらによるCell 88: 277-285, 1997）。大腸菌誘導組換えエンドスタチンは、上記著者らにより、ＰＢＳに対する透析の後に沈殿させることにより特
徴付けられる。培地にて溶解しないため、沈殿（非再生）材料はインビトロでは
試験されていなかった。その材料の僅かな割合（未特定）は、透析中、ＰＢＳ中
に自発的に可溶化させた。本材料は、ナイーブ及び溶解バキュロウイルス誘導エ
ンドスタチンの双方として、内皮細胞活性にて同程度の阻害活性を有していた。
大腸菌誘導組換えエンドスタチンが、最終濃度０．１ｍｇ/ｍｌで０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．６Ｍ尿素、２ｍＭ
の減少グルタチオン、０．０２ｍＭ酸化グルタチオンと０．５Ｍのアルギニンの
存在下で再生すると、タンパク質の９９％以上を失う。この大きな損失はインビ
ボアッセイでの本材料の使用を妨げる。代わりに、その著者らは、インビボの多
くの研究にて、エンドスタチンからの特性のわからない不溶性（非再生）型を利
用した。沈殿した大腸菌誘導エンドスタチンは５日以上かけて徐々に溶解し、ひ
な絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにて、坑血管形成効果を維持させることが観察さ
れた。マウス注射の部位にペレットを形成させる同じ材料の懸濁液は、２４乃至
４８時間をかけてゆっくりと再吸収された。

【００１４】同じグループによるその後の研究により、肺カルチノーマ、Ｔ２４１繊維肉腫
又はＢ１６Ｆ１０メラノーマを有するマウスがマウスエンドスタチンにより処置
されると、薬剤耐性が発現しない(Boehmらによるnature 390: 404-407, 1997)。
大腸菌誘導組換えマウスエンドスタチンは、バクテリアをペレット化し、８Ｍ尿
素、１０ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、１０ｍＭでｐＨ８．０にて再懸濁さ
せて１乃至２時間インキュベートさせた以外は、前記したように調製された（O ’ReillyらによるCell 88:277-285, 1997）。β‐メルカプトエタノールをその後の工程で除去した。組換えマウスエンドスタチンを、ＰＢＳ中の懸濁液として
マウスへ運んだ。三つの腫瘍タイプの一つの腫瘍を有するマウスは、精製したが
あまり溶解性のないエンドスタチン懸濁液を、接種腫瘍から離れた部位の皮下背
部に注射した。腫瘍が退縮し、その後再成長した際に、処置を止めた。治療を停
止させた際、エンドスタチン処理の６、４又は２サイクル後に、腫瘍成長は再発
しなかった。

【００１５】最近、ヒトエンドスタチンの循環形が分離され、特性が解明された（Standker
らによるFEBS Letters 420: 129-133, 1997）。高分子量ペプチド（１乃至２０ｋＤａ）が、慢性腎不全の患者から得られた２、５００リットルのヒト血液の限
界ろ過によるろ液（hemofiltrate, ＨＦ）から分離された。抽出物は合成用カチ
オン交換カラムに拘束され、ｐＨプール分画（３．６から９．０へ増加したｐＨ
を有する７つの緩衝液）により溶出された。高分子量ペプチドはプール８にて検
出され、水で溶出し、その後逆相ＨＰＬＣで精製した。アリコートはマトリック
スアシストレーザ脱着イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ）を行い、正確な分
子量をエレクトロスプレイ質量分析（ＥＳ‐ＭＳ）により、１８、４９４Ｄａと
求めた。分子中のシステイン残基１‐３及び２‐４は、ジスルフィドブリッジで
リンクしていることが判明した。精製中の最終回収は２０％の範囲であると評価
され、血液ろ過液中で１０^−１１Ｍ以上の濃度であった。患者の血漿中でのエン
ドスタチンの生じた濃度１０^−１０Ｍ又はそれ以上の範囲であると見積られた。
アンギオスタチンで提案されたような、エンドスタチン結合組織のプールが存在
するか否かは公知ではない（KostらによるEur. J. Biochem. 236: 682-688, 199
6）。天然ヒトエンドスタチンのインビボでの生物学的特性は、さまざまな内皮細胞タイプにて坑増殖活性を示さなかった。ヒトエンドスタチンの組換え体の特
性は報告されていない。著者らは、エンドスタチンのマウス形とヒト形との報告
されている活性の差異は、幾つかの因子に起因するものと推測している。（ｉ）
二つの形は異なるソースから分離されており、インビトロアッセイ及びインビボ
アッセイにて、異なる選択性、特異性及び効能を有し、（ii）ペプチドにて発見
された翻訳後の変化における差異は報告された活性の矛盾を説明し、（iii）ヒトエンドスタチンは必ずしも内皮細胞の増殖を阻害しないが、インビボ系の複合
体のみに観察可能である他の細胞成分に間接的に影響を及ぼす。

【００１６】発明の要約本発明の目的は、バクテリアにて高レベルのエンドスタチンを発現させる方法
を提供することである。

【００１７】本発明の別の態様は、エンドスタチン封入体が可溶化され、その後再生、精製
され、生物学的に活性な材料を産出させる効率的な方法を提供することである。

【００１８】好ましくは、マウス又はヒトエンドスタチン封入体を可溶化させる工程は、高
ｐＨで行われる。可溶化工程での高ｐＨは、より好ましくはｐＨ約９乃至ｐＨ約
１１．５の範囲のｐＨで行われる。さらに好ましくは、高ｐＨの範囲がｐＨ約１
０乃至ｐＨ約１１の範囲である。高ｐＨは約１０．５であることが、最も好まし
い。

【００１９】マウスエンドスタチン封入体又はヒトエンドスタチン封入体を再生させる工程
は、中性近傍のｐＨで行うことが好ましい。可溶化工程での中性近傍のｐＨはｐ
Ｈ約６乃至ｐＨ約８．５の範囲のｐＨで行うことが好ましい。マウスエンドスタ
チンを再生させるための中性近傍ｐＨの範囲は、ｐＨ約７乃至ｐＨ約８．０であ
ることがさらに好ましい。マウスエンドスタチンを再生させる中性近傍のｐＨ範
囲はｐＨ約７．５であることが最も好ましい。ヒトエンドスタチンの再生のため
の中性近傍のｐＨ範囲は、ｐＨ約７．０乃至ｐＨ約８．０であることが好ましい
。ヒトエンドスタチンを再生させるための中性近傍ｐＨ範囲はｐＨ約７．５が最
も好ましい。

【００２０】エンドスタチン遺伝子産物の濃度は、可溶化工程中、約０．２乃至２０ｍｇ/ ｍｌの濃度で存在することが好ましい。さらにその濃度は約２．５ｍｇ/ｍｌであることが好ましい。

【００２１】エンドスタチン遺伝子産物の濃度は、再生工程中、約０．０２乃至２ｍｇ/ｍｌの濃度で存在することが好ましい。その濃度は約０．２５ｍｇ/ｍｌであることが好ましい。

【００２２】尿素及びグアニジン塩酸塩から選択した変性剤は、可溶化工程及び再生工程中
に利用されることが好ましい。その変性剤は尿素であることが、さらに好ましい
。

【００２３】可溶化工程中、尿素の濃度は約４Ｍ乃至約１０Ｍであることが好ましい。その
濃度は約６Ｍであることがさらに好ましい。

【００２４】尿素の濃度は、再生工程中、約２Ｍ乃至約４Ｍであることが好ましい。その濃
度は約３．５Ｍであることがより好ましい。

【００２５】可溶化工程中、グアニジン塩酸塩の濃度は約２Ｍ乃至約８Ｍであることが好ま
しい。その濃度は約４Ｍであることがさらに好ましい。

【００２６】再生工程中、グアニジン塩酸塩の濃度は、約０．２Ｍ乃至約２Ｍであることが
好ましい。その濃度は約１．５Ｍであることがさらに好ましい。

【００２７】可溶化工程及び再生工程は、ジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元させ
ることが出来る還元剤の存在下で実行することが好ましい。その還元剤はＤＴＴ
、ＢＭＥ、システイン及び還元グルタチオンからなる群から選択されることが好
ましい。その還元剤はＤＴＴ又はシステインであることがさらに好ましい。

【００２８】可溶化工程中、ＤＴＴは約２Ｍ乃至約１０ｍＭの濃度で存在することが好まし
い。その濃度は約５ｍＭであることがさらに好ましい。

【００２９】再生工程中、ＤＴＴは約０．５ｍＭ乃至約２ｍＭの濃度で存在することが好ま
しい。その濃度は約０．５ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３０】可溶化工程中、還元グルタチオンは約５ｍＭ乃至約２０ｍＭの濃度で存在する
ことが好ましい。その濃度は約１０ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３１】再生工程中、還元グルタチオンは約０．５ｍＭ乃至約４ｍＭの濃度で存在する
ことが好ましい。その濃度は約１ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３２】可溶化工程中、システインは約５ｍＭ乃至約２０ｍＭの濃度で存在しているこ
とが好ましい。その濃度は約１０ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３３】再生工程中、システインは約０．５ｍＭ乃至約４ｍＭの濃度で存在することが
好ましい。その濃度は約１ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３４】再生工程中、ジスルフィド結合の相互交換を向上させ得る作用物質を存在させ
ることが好ましい。その作用物質はシステイン及び酸化グルタチオンから選択さ
れることが好ましい。その作用物質はシステインであることがさらに好ましい。

【００３５】再生工程中、システインは約０．２ｍＭ乃至約０．５ｍＭの濃度で存在するこ
とが好ましい。その濃度は約１ｍＭであることがさらに好ましい。

【００３６】再生工程中、ジスルフィドは空気酸化を介して形成することが好ましい。その
空気酸化工程は約１２時間乃至約９６時間の亘り行われることが好ましい。その
空気酸化工程は、約２４時間乃至約７２時間に亘り行われることがより好ましい
。空気酸化工程は約６０時間に亘り行われることがさらに好ましい。

【００３７】再生エンドスタチンは、以下のものに限定されないが、イオン交換クロマトグ
ラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ及びＲＰ‐ＨＰＬＣからなる群から選
択された方法により、さらに精製されることが好ましい。

【００３８】発現、可溶化、再生及び精製の方法は、マウス又はヒトの何れかのエンドスタ
チン遺伝子を利用することが好ましい。上記遺伝子は、配列番号５乃至配列番号
９からなる群から選択されることがさらに好ましい。

【００３９】本発明の新規なタンパク質は、修飾ヒト又はマウスエンドスタチンアミノ酸配
列であり、前記タンパク質の直ぐ前には、任意の（メチオニン^‐１）、（アラニ
ン^‐１）、（メチオニン^‐２、アラニン^‐１）、（セリン^‐１）、（メチオニン ^‐２、セリン^‐１）、（システイン^‐１）又は（メチオニン^‐２、システイン^‐ ^１）がある。

【００４０】さらに、本発明は、エンドスタチンを、エンドスタチンの変異体を及び突然変
異タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと、
関連微生物及び真核生物発現系と、上記タンパク質を生産（発現工程、可溶化工
程、再生工程、精製工程を含む）方法に関する。

【００４１】上記タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列のクローン化は、中間体ベクター
の使用により行われる。あるいは、ある遺伝子が他の遺伝子を含むベクターに直
接クローン化され得る。リンカー及びアダプターはＤＮＡ配列に参加する、並び
に損失配列を交換するために利用可能であり、制限部位は関心のある領域の内部
にあった。よって、あるポリペプチド、ペプチドリンカー及び他のポリペプチド
をエンコードする遺伝材料（ＤＮＡ）は、バクテリア、酵母、昆虫細胞又は哺乳
類細胞を形質転換させるために利用する適切な発現ベクターに挿入される。変換
生物又は変換細胞系統は成長し、標準的な技法によりタンパク質が分離される。
したがって、生じた産物はリンカー領域により第二のタンパク質の全て又はある
部分へ参加させた全て又はある部分のタンパク質を有する新しいタンパク質であ
る。

【００４２】本発明の別の態様は、上記タンパク質の発現に利用されるプラスミドＤＮＡベ
クターに関する。上記ベクターは、本発明の新規なポリペプチドをコードする、
前記した新規なＤＮＡ配列を含む。タンパク質を発現させ得る微生物又は細胞系
統を形質転換され得る適切なベクターは、使用した宿主細胞に応じて選択した転
写及び翻訳調節配列に参加したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む
発現ベクターを包含する。

【００４３】前記したように修飾配列を導入させたベクターは本発明の範囲に含まれ、タン
パク質の生産に有用である。本発明の方法に利用するベクターには、本発明の配
列をコードするＤＮＡと操作的に関連し、選択宿主細胞にて複製及びその発現を
導き得る選択調節配列を含む。

【００４４】上記タンパク質を生産する方法は、本発明の別の態様である。本発明のその方
法には、新規な多機能タンパク質の発現をコードするＤＮＡ配列を含むベクター
で変換された適当な細胞又は細胞系統を培養することが含まれる。適切な細胞又
は細胞系統はバクテリア剤棒である。例えば、大腸菌のさまざまな菌株は、バイ
オテクノロジーの分野では宿主として周知である。かかる菌株の例には、大腸菌
菌株ＪＭ１０１（Yanicha-PerronらによるGene 33:103-119, 1985）やＭＯＮ１０５（ObukowiczらによるApplied Environmental Microbiology 58: 1511-1523,
1992）がある。さらに、本発明には多機能タンパク質の発現も含まれ、バクテリオファージＭｕを基礎とする大腸菌の染色体発現ベクターを利用する（Weinbe
rgらによるGene 126:25-33, 1993）。B.subtilisのさまざまな菌株は、本方法に
も利用される。当業者に公知である酵母細胞の多くの菌株も、本発明のポリペプ
チドの発現の宿主細胞として利用可能である。大腸菌細胞質にて発現すると、本
発明のタンパク質をエンコードする遺伝子は、遺伝子コドンの５’末端で、タン
パク質のＮ末端のMet^-2-Ala^-1、Met^-2-Ser^-1、Met^-2-Cys^-1又はMet^-1をエンコー
ドするように添加されるように構築される。大腸菌の細胞質にて生産されるタン
パク質のＮ末端は、メチオニンアミノペプチダーゼによる転写後のプロセシング
により（Ben BassatらによるJ. Bacteriol. 169: 751-757, 1987）、他のペプチ
ダーゼにより影響を受け、発現の際にメチオニンはＮ末端で開裂する。本発明の
タンパク質には、Ｎ末端にてMet^-1、Ala^-1、Ser^-1、Cys^-1、Met^-2-Ala^-1、Met^-2 -Ser^-1、Met^-2-Cys^-1を有するポリペプチドを含む。上記突然変異タンパク質は分泌シグナルペプチドをＮ末端に融合させることにより、大腸菌でも発現される
。本シグナルペプチドは分泌過程の一部としてポリペプチドから開裂される。

【００４５】定義以下は、本願で相互交換可能に利用される略称とそれに対応する意味のリスト
である。

【００４６】ｇとはグラムのことであり、ＨＰＬＣとは高速液体クロマトグラフィーのことであり、ｍｇとはミリグラムであり、ＤＴＴとはジチオトレイトールのことであり、ＲＴとは室温のことであり、ＰＢＳとはリン酸緩衝化生理食塩水のことである。

【００４７】以下は、本願で利用するさまざまな用語の定義のリストである。

【００４８】用語「坑腫瘍」とは、インビトロの腫瘍の成長を遅延させる、若しくはその成
長を阻止する、又は腫瘍を死滅させる、さもなくば腫瘍を損傷させる活性を有す
ることを意味する。

【００４９】用語「天然配列」とは、遺伝子又はタンパク質の野性型若しくは天然形と同じ
であるアミノ酸配列若しくは核酸配列のことをいう。

【００５０】用語「突然変異アミノ酸配列」、「突然変異タンパク質」、「変異タンパク質
」、「突然変異タンパク質」又は「突然変異ポリペプチド」とは、アミノ酸付加
、アミノ酸欠失、アミノ酸置換若しくはそれらの何れかの組合わせに起因して天
然配列から変化したアミノ酸配列を、又は天然配列又は化学的な合成由来の意図
的に作られた変異体からヌクレオチドによりエンコードされたアミノ酸配列を有
するポリペプチドのことをいう。

【００５１】用語「エンドスタチン」とは、坑血管形成活性を有するコラーゲンＸＶＩＩＩ
のタンパク質断片のことをいう。前記断片の活性は血管形成のマウス角膜マイク
ロポケットアッセイにより、又はインビトロの内皮細胞の成長若しくは移動の阻
害により求められる。好ましくは、マウスエンドスタチンは、配列番号１０で記
述される配列を意味し、ヒトエンドスタチンは配列番号１１に記述される配列を
意味する。

【００５２】発明の詳細な説明以下の例は、本発明を詳細に説明する。もっとも、本発明は特定例に制限され
るものではないことは理解される。本発明の開示内容を精読すれば、本発明の精
神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな他の実施例は当業者には理解され
る。かかる他の全ての例は、本発明の特許請求の範囲に包含されるものと考える
。

【００５３】一般的方法タンパク質のクローニング、発現及びキャラクラリゼーションの一般的な方法
は、本願の引用文献に編入されるＴ. ManiatisらによるMolecular Cloning, A l
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982とその引用文献と、並びにJ. SambrookらによるMolecular Cloning, A Laboratory Manua, 第二版、
Colding Spring Harbor Laboratory, 1989とその引用文献とに記載されている。

【００５４】特に断りがない限り、全てのスペシャリティケミカルズは、ミズーリー州セン
トルイスにあるシグマ社から購入した。制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮ
Ａリガーゼはマサチューセッツ州ベバーリにあるニューイングランドバイオラボ
社、又はインディアナ州インディアナポリスにあるベーリンガーマンハイム社若
しくはウィスコンシン州マディソンにあるプロメガ社から購入した。

【００５５】菌株及びプラスミド本願に研究に利用したバクテリア菌株を表１に掲載する。本願の研究に利用し
た若しくは本願研究のためのプラスミド類を表２に掲載する。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００５８】

【表３】

【００５９】

【表４】

【００６０】大腸菌の菌株の形質転換ＤＨ５α及びＤＨ１０Ｂ（メリーランド州ロックビルにあるライフテクノロジ
ー社製）やＴＧ１（イリノイ州アーリントンハイツにあるアメリシャム社製）の
ような大腸菌の菌株（表１）を連結反応の形質変換用に利用し、哺乳類細胞のト
ランスフェクション用のプラスミドを調製するために利用した宿主である、ＪＭ
１０１（Yanisch‐PerronらによるGene, 33: 103-119, 1985）やＭＯＮ１０５（
ObukowiczらによるAppl. And Envir. Micr., 58: 1511-1523, 1992）のような大
腸菌の菌株は、細胞質若しくは周縁細胞質空間にて本発明のタンパク質を発現さ
せるために利用され得る。

【００６１】ＤＨ５α及びＤＨ１０Ｂサブクローニング効率細胞は、能力細胞として購入し
、製造者プロトコールに従い形質変換用に用意した。大腸菌の菌株ＪＭ１０１及
びＭＯＮ１０５を応答能のあるようにし、ＣａＣｌ_２法を利用してＤＮＡを集め
る。通常、２０乃至５０ｍＬの細胞がＬＢ培地（１％のBacro-tryptone、０．５
％のBacto-yeast抽出物、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）にて成長して、バウシュエンドロムスペクトロニック分光器（Baush&Lomb Spectronic spectrophotome
ter、ニューヨーク州ロチェスターにある）により測定して、６００ｎｍで略１．０吸光度の濃度になる。その細胞を遠心分離により集め、ＣａＣｌ_２溶液（５
０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐Ｃｌ（１０ｍＭの２‐アミノ‐２‐
（ヒドロキシメチル）‐１、３‐プロパンジオール塩酸塩、ｐＨ７．４）の５分
に１の培地体積中にて再懸濁させ、４℃で３０分間保持させる。細胞を再び遠心
分離により集め、ＣａＣｌ_２溶液の１０分の１の培地体積に再懸濁させる。連結
ＤＮＡを０．２ｍＬの上記細胞に添加し、そのサンプルを４℃で３０乃至６０分
間保持させる。そのサンプルを２分間４２℃へシフトさせ、３７℃で１時間振と
うさせる前に、１．０ｍＬのＬＢを添加する。上記サンプルからの細胞を、アン
ピシリン（ampicillin）耐性形質変換体を選択する際のアンピシリン（１００μ
ｇ/ｍＬ）、若しくはスペクチノマイシン（spectinomycin）形質変換体を選択す
る際のスペクチノマイシン（７５μｇ/ｍＬ）の何れかを含有するプレート（ＬＢ培地プラス１．５％Bacto-agar）に広げる。そのプレートを３７℃で一晩イン
キュベートさせる。

【００６２】コロニーを集め、ＬＢプラス適切な抗生物質（１００μｇ/ｍＬのアンピシリン又は７５μｇ/ｍＬのスペクチノマイシン）へ接種させ、振とうさせながら３７℃で成長させる。

【００６３】ＤＮＡ分離及びキャラクタリゼーションプラスミドＤＮＡは、当業者には公知の市販キットを利用して、数多くの異な
る方法で分離できる。プラスミドＤＮＡは、（ウィスコンシン州マディソンにあ
る）プロメガ社製Wizard^TMミニ分取キット、（カリフォルニア州チャッツウォー
スにあるQiagen QIAwell プラスミド分離キット又はQiagen プラスミドミディ若しくはミニキットを利用して分離される。上記キットは、プラスミドＤＮＡ分
離に対して同じ一般的プロトコールに従う。簡単に述べると、細胞を遠心分離（
５０００ｘｇ）によりペレット化させ、プラスミドＤＮＡを連続させたＮａＯＨ
/酸処理により放出させて、細胞片を遠心分離（１００００ｘｇ）により除去した。（プラスミドＤＮＡを含有する）上澄液をＤＮＡ結合樹脂を詰めたカラムに
載せ、そのカラムを洗浄し、プラスミドＤＮＡを溶出させる。関心のあるプラス
ミドでコロニーをスクリーニングした後、大腸菌を５０乃至１００ｍｌのＬＢプ
ラス適切な抗生物質へ接種させ、振とうさせながら、インキュベータにて、３７
℃で一晩成長させる。精製プラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定に利用し、さらに
、制限酵素消化、ＤＮＡ断片の追加のサブクローニング及び大腸菌、哺乳類細胞
若しくは他の細胞系統へのトランスフェクションに利用する。

【００６４】配列確認精製プラスミドＤＮＡを脱イオンＨ_２Ｏに再懸濁させ、その濃度をバウシュエ
ンドロムスペクトロニック６０１ＵＶ分光器にて、２６０/２８０ｎｍの吸光度を測定することにより算出する。ＤＮＡサンプルはＡＢＩＰＲＩＳＭ^ＴＭＤｙｅ
Ｄｅｏｘｙ^ＴＭターミネータ配列決定化学（カルフォルニア州リンカーンシティ
にあるパーキンエルマーコーポレーションの応用バイオシステムディビジョン）
のキット（パートナンバー４０１３８８又は４０２０７８）を利用し、製造者推
奨のプロトコールに従い、通常、配列決定用の混合物に５％のＤＭＳＯを添加し
て修飾させて、配列決定を行う。配列決定反応は、推奨増幅条件に従い、ＤＮＡ
サーマルサイクラー（コネチカット州ノーウォークにあるパーキンエルマーコー
ポレーション）により行う。サンプルを精製して、（ニュージャージー州アデル
フィアにあるプリンストンセパレーション社製）Centri‐Sep^TMスピンカラムにより過剰の色素ターミネータを除去し、凍結乾燥させる。蛍光色素標識配列決定
反応は脱イオン化ホルムアミド中で再懸濁させ、ＡＢＩモデル３７３Ａ及び３７
７自動ＤＮＡシーケンサーを利用して、変性４．７５％ポリアクリルアミド‐８
M尿素ゲルにて配列決定する。オーバラップＤＮＡ配列断片が解析され、（ミシガン州アンアーバーにあるジーンコードコーポレーション社製）シーケンサーＤ
ＮＡ解析ソフトウェアを利用して、マスターＤＮＡコンティグ（contigs）に集める。

【００６５】大腸菌におけるエンドスタチンの小規模の発現関心のあるプラスミドに宿す大腸菌の菌株ＭＯＮ１０５若しくはＪＭ１０１は
、（ニュージャージー州エディソンにある）ニューブルンスウィックサイエンテ
ィフィック社から市販されているインキュベータモデルＧ２５内で振とうさせな
がら、Ｍ９プラスカザアミノ酸培地中３７℃で成長する。成長は吸光度が１．０
の値に達するまでＯＤ_６００で監視し、そのときに１ＮのＮａＯＨ中のナリジキ
シン酸（１０ｍｇ/ｍＬ）を添加して最終濃度を５０μｇ/ｍＬにする。その後、
培養をさらに３乃至４時間、３７℃で振とうさせる。所望の遺伝子産物の最大の
生産を達成させるために、培養中、かなりのガス抜きを行って維持する。封入体
の有無を、光顕微鏡下で、その細胞を調べる。ペレット化させた細胞を沸騰させ
、緩衝液を還元し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを介して電気泳動にて処理することによる
タンパク質含有量の解析のために、培養の１ｍＬアリコートを除去する（Maniat
isらによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 1982を参照）。その
培養を遠心分離し（５０００ｘｇ）細胞をペレット化させる。

【００６６】大腸菌内でのエンドスタチンの大規模な（１０Ｌスケール）発現エンドスタチン分子を１０ＬのバイオスタットＥＴＭ発酵槽（ペンシルベニア
州のアレンタウンにあるＢ．ブラウンバイオテックインク社製）でスケールアッ
プさせた。利用した発酵培地は、２％カザアミノ酸（ミシガン州デトロイトにあ
るDifcoラボラトリーズ社製）で補充したＭ９塩であった。約１ミリリットルの解凍培養を１．０Ｌの培地を含む３．８Ｌのファーンバッチシェイクフラスコに
移動させ、１２時間２５０ｒｐｍの振とう速度で、３７℃にてインキュベートさ
せた。それから、本シェークフラスコ培養を利用して、９．０Ｌの培地を含有す
る１０Ｌ発酵槽へ接種させた。発酵条件は以下のようであった。攪拌は１０００
ｒｐｍであり、スパージャーエアフロー速度は１５Ｌ/分であり、ｐＨはＮＨ_４ＯＨの添加により７．０に制御し、背圧は１０ｐｓｉであり、溶解酸素を３０％
以下に制御し、温度を３７℃とした。初期にはグルコースが１５ｇ/ｌで処理され、５０％グルコース供給ストックの添加により２乃至５ｇ/ｌと制御した。発酵培養は成長して、初期ＯＤ（５００ｎｍ）は１２乃至１５となり、５０ｍｇ/ ｌのナリジキシン酸が派生した。連続フロー遠心分離により、派生後４時間、発
酵を進行させた。

【００６７】１０Ｌスケールの封入体分離１０Ｌの発酵からの細胞ペーストを５０ｍＭＴｒｉｓ/１５０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液の略６．０Ｌに再懸濁させた。再懸濁液を８℃に維持させた温度で、１０，
０００ｐｓｉで、（マサチューセッツ州ニュートンの）マイクロフルディザー（
登録商標）に１回通過させた。その後、回収ホモジネートを２５分間１５，００
０ｘＧで回転させ、混合させてUltr‐Turraxミクサーと整合させた。細胞ペース
ト再懸濁液を細胞懸濁液を、１０，０００ｐｓｉ圧力で動作させながら、２回（
マサチューセッツ州ニュートンの）マイクロフルディザー（登録商標）に通過さ
せて均質化させた。ホモジネートの温度は、氷浴に配置させたステンレススチー
ル容器に集めて、６℃以下に維持させた。それから、３０分間１５，０００ｘｇ
で細胞ホモジネートの遠心分離により、封入体を分離し、上澄液を捨てた。次に
、冷D．I．中に封入体を再懸濁させ、３０分間１５，０００ｘｇで遠心分離を全
体で２回行って、封入体を洗浄した。その後、エンドスタチン封入体を-７０℃ で凍結させた。

【００６８】封入体の小規模スケールでの分離３３０ｍＬの大腸菌培養からの細胞ペレットを、１５ｍＬの超音波緩衝液（５
０ｍＭTris‐HCl、ｐH８．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁させる。上記再懸
濁細胞を、（ニューヨーク州ファーミングデールにあるヒートシステムウルトラ
ソニックスインクのモデルＷ‐３７５の）超音波細胞破壊器のマイクロチッププ
ローブを利用して超音波処理する。超音波緩衝液中での３回の超音波処理と、そ
れに続く遠心分離が利用され、細胞を粉砕し、封入体（ＩＢ）を洗浄する。超音
波処理の第1回目は３分間のバーストと、それに続く１分間のバーストを行い、超音波処理の最後の２回の処理は、各１分間の処理を行う。

【００６９】封入体ペレットからヒト及びマウスタンパク質の抽出及び再生全ての工程は４℃で行う。マウスエンドスタチン封入体を、２．５ｍｇ/ｍｌエンドスタチンで、６Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭBis-Trisプロパン、ｐH ８．０中に溶解させた。本溶液を２時間攪拌し、その後シスチン（ストック０．
２Ｍ、ｐＨ１０．５）を添加した。この溶液を５分間混合し、それから３．５Ｍ
尿素、１００ｍＭBis-Trisプロパン、ｐＨ７．０中で０．２５ｍｇ/ｍｌエンドスタチンに希釈した。それから６０分間攪拌し、逆相ＨＰＬＣにより評価できる
タンパク質の再生を完了させた。

【００７０】ヒトエンドスタチン封入体を、２．５ｍｇ/ｍｌエンドスタチンで、６Ｍ尿素、５０ｍＭBis-Trisプロパン、ｐH１０．８中に溶解させた。本溶液を２時間攪拌させ、その後１０ｍＭのシスチン（ストック０．２Ｍ、ｐＨ１０．５）を添加
し、５分間混合した。それから、本溶液を３．０Ｍ尿素、１００ｍＭBis-Trisプ
ロパン、ｐＨ７．５中で０．２５ｍｇ/ｍｌに希釈し、６０時間攪拌して再生工程を終了させた。

【００７１】精製マウス若しくはヒトエンドスタチンの精製は、酸沈殿とその後のスルホプロピ
ルカラムのカラムクロマトグラフィーを利用して、同じ方法により行った。限界
ろ過と酢酸によりｐＨを５．０まで低下させて、再生サンプルを約１０倍濃縮し
た。これを専らｐＨ５．０の５ｍＭ酢酸に対して透析させた。沈殿物をろ過によ
り除去し、ろ液をファルマシアＳ-セファローズＨＰカラムに載せた。そのカラムを平衡緩衝液の１カラム体積で洗浄し、２０カラム体積の、ｐＨ６．５の５０
ｍＭのリン酸塩から０．４Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液へとグラジエ
ントのかかった２０カラム体積を利用して、タンパク質を溶出させた。フラクシ
ョンをＳＤＳ-ゲル電気泳動及び分取ＨＰＬＣにより解析し、プールし、ＰＢＳに対して透析し、凍結した。

【００７２】ある場合では、再生タンパク質は、モノクローナル抗体又は適当なマトリック
スに付いたレセプターサブユニッのようなアフィニティ試薬を利用して、トアフ
ィニティ精製される。精製は、イオン交換、ゲルろ過若しくは疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣのような多様なクロマトグラフィー法の何れ
かを利用して行うこともできる。上記及び多のタンパク質精製法は、Methods in
Enzymology, Volume 182「Guide to Protein Purification」Murray Deutscher
編集、Academic Press, San Diego, California, 1990に、詳細に説明されている。

【００７３】タンパク質キャラクタリゼーション精製タンパク質を分取ＨＰＬＣ、エレクトロスプレイ質量分析、アミノ酸配列
及びＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより解析する。タンパク質定量は、アミノ酸組成、分取
ＨＰＬＣ及びブラッドフォードタンパク質決定により行った。ある場合、トリプ
シンペプチドマッピングをエレクトロスプレイ質量分析と共に行い、タンパク質
の同定を確認した。

【００７４】内皮細胞増殖アッセイ内皮細胞増殖アッセイは、Caoらの報告にように行った（J. Biol. Chem. 271:
29461-29467, 1996）。簡単には、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（HdMVERC、クロティックス）若しくはウシ副腎皮質微小血管内皮細胞（BacEnd、テキサス洲サン
アントニオにあるインセル社製）を、５％の熱不活性胎児ウシ血清（FBS、ハイクローン社製）と、抗生物質と、１００μｇ/ｍｌヘパリン（シグマ社製）と１００μｇ/ｍｌ内皮マイトジェン（バイオメディカルテクノロジー社製）とを含有するＭＣＤＢ１３１中に維持させた。２乃至５の継代の融合性単層を０．０５
％のトリプシンに分散させ、完全培地に再懸濁させた。１．２５ｘ１０^４細胞を
含有する５００μｌの完全培地を、０．１％ゼラチン（シグマ社製）で塗布した
２４‐ウエル組織培養プレートのウエルに接種させる。細胞を３７℃/５％ＣＯ _２で、一晩インキュベートさせ、そのときに培地を、５％ＦＢＳとさまざまな濃
度の阻害剤とを含有する２５０μｌの培地と交換する。３０分間のインキュベー
ション後、１ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含有する２５０μ ｌの培地を添加し、細胞をさらに７２時間インキュベートさせ、そのときに細胞
をトリプシンで処理し、クールターカウンターで計数した。

【００７５】内皮細胞移動アッセイ内皮細胞移動アッセイは、既出の方法と本質的には同じように行った（Gately
らによるCancer Res. 56:4887-4890, 1996）。内皮細胞の移動を阻害するエンド
スタチンの能力を求めるために、移動アッセイを８ｍｍポアサイズのポリカーボ
ネート膜を有するトランスウェルチャンバー（コスター社製）にて行った。本ア
ッセイに利用した細胞は、ヒト微小血管内皮細胞（ジョージア洲アトランタにあ
るエモリー大学）又はウシ肺動脈内皮細胞（ミズーリ州セントルイスにあるモン
サント社製）のいずれかであった。ＭＣＤＢ１３１+０．１％ＢＳＡ（ヒト細胞）又はＤＭＥＭ+０．１％ＢＳＡ（ウシ細胞）にて使用する前に細胞を飢餓させ、収穫させ、１０^６細胞/ｍｌで同じ培地に再懸濁させた。トランスウェルの低部を、上部チャンバーに２ｘ１０^５細胞を添加する前に、３７℃で３０分間、０
．１％のゼラチンで塗布した。そのトランスウェルを低部チャンバーのケモアト
ラクタント（ｂＦＧＦ若しくはＶＥＧＦ）を含有するウェルに移動させた。移動
は３７℃で一晩行った。それから、膜を固定、染色し、膜の低部に移動した細胞
の数を３高電力場で計数した。

【００７６】例１：ｐＭＯＮ２４３４５（配列番号８）の構築と高レベルのマウスエンドス
タチンを生産する菌株の選択全体のマウスＲＮＡ（カリフォルニア州パロアルトにあるクローンテックラボ
ラトリーズ社製）の５μｇを５００ｎｇのランダム六量体プライマー（ウィスコ
ンシン州マディソンにあるプロメガコーポレーション社）と混合し、６５℃で１
０分間加熱し、その後氷上で２分間冷却した。ＲＮＡ/プライマー混合物に、（プロメガ社製）Rnasin、SuperScriptII緩衝液、ＤＴＴの２０ユニットを添加して、０．０１Ｍ、ｄＮＴＰミックス（ベーリンガー社製）の最終濃度と、SuperS
criptII転写酵素（ライフテクノロジー社製）の０．００５Ｍで２００ユニットの最終濃度にした。反応を１．５時間４２℃でインキュベートし、７０℃で５分
間反応をインキュベートすることにより、酵素を不活性化させた。大腸菌Rnase Ｈ（ライフテクノロジー社）の２ユニットを添加し、３７℃で２０分間反応をイ
ンキュベートさせることによりＲＮＡを除去した。ｄＨＴＰの添加によりポリメ
ラーゼチェインリアクションにより、二本鎖ＤＮＡを発生させ、５プライムマウ
スエンドスタチンプライマー（配列番号１）の１．６ｍＭ、で５０ピコモルと、
３プライムマウスエンドスタチンプライマー（配列番号２）の５０ピコモルと、
高複製ＰＣＲ緩衝液、２．５ユニットの高複製酵素（ベーリンガー社製）の最終
濃度にした。反応混合物を９５℃で３分間インキュベートし、１５秒９４℃のイ
ンキュベーション、３０秒５０℃のインキュベーション、４分７２℃のインキュ
ベーションをを１０回繰返し、１５秒９４℃のインキュベーション、３０秒５０
℃のインキュベーション、４分プラス２０秒、７２℃エクステンションインキュ
ベーションを１５回繰り返した。最終的に、反応を７２℃で７分間インキュベー
トさせた。

【００７７】二本鎖ＤＮＡを、１μｌのＰＣＲ反応を２５ｎｇのベクター、連結緩衝液中の
１ユニットのＴ４リガーゼに添加して、ｐＣＲＩＩベクター（インビトロン社製
）にサブクローニングした。連結反応を１２℃で一晩インキュベートさせた。連
結ＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞（メリーランド州ロックビルにあるライフ
テクノロジーインク製）に形質変換させ、ＬＢａｍｐプレート上で成長させた。
大腸菌消化により求めた挿入断片のある二つの分離体を、さらにその特性を調べ
た。二つの分離体のｃＤＮＡ挿入断片であるｐＭＯＮ２４３４２（配列番号５）
とｐＭＯＮ２４３４３（配列番号６）を、標準的なジデオキシ技法を利用して、
ＤＮＡ配列決定により解析した。正しくＤＮＡ配列をコードするよう構築するた
めに、ｐＭＯＮ２４３４２及びｐＭＯＮ２４３４３双方をＡｐａＩで消化させた
。ＡｐａＩマウスエンドスタチンＤＮＡ断片とｐＭＯＮ２４３４２ベクタープラ
スＤＮＡ配列をコードする５プライムマウスエンドスタチンとを、QiaexIIゲル抽出キット（ドイツ国のQiagenにある）を利用して分離した。断片を、５０ｍＭ
Tris‐HCl、ｐH7.5、１０ｍMMgCl_２、５０μｇ/ｍｌBSAと１ユニットのT4リガー
ゼ中で一緒に連結された。再構築されたプラスミドをDH5αコンピテント細胞に形質変化させて、pMON24344（配列番号７）を発生させた。プラスミドpMON24344
をNcoIとHindIIIで消化させ、QiaexIIゲル抽出キットで断片を分離した。pMON24
344NcoI/HindIII断片を、50mMTris、pH7.5、10mMMgCl_２、50μg/mlBSAと１ユニットのT4リガーゼ中でNcoI/HibdIII消化脱リン酸pMON５７２３大腸菌発現ベクタ
ーを連結させた。連結DNAをMON１０５へ形質変換させ、SpecLBプレートにて選択
して分離させてpMON２４３４５（配列番号８）を発生させた。PMON24345に宿る大腸菌の菌株MON105を１０mg/mlナリジキシン酸で誘導させ、上記細胞で発現されたマウスエンドスタチンをSDS‐PAGEで監視した。

【００７８】例２：ヒトエンドスタチンをエンコードするpMON20440（配列番号９）の構築全体のヒトRNA（カリフォルニア州パロアルトにあるクローンテックラボラトリーズ社製）の5μgを500ｎgのランダム六量体プライマーと混合し、６５℃で１
０分間加熱し、氷上で２分間冷却した。RNA/プライマー混合物に、２０ユニット
のRnasin（プロメガ社製）、SuperScriptII緩衝液、DTTを添加し、0.01MｄNTPミ
ックス（ベーリンガー社製）の最終濃度と、0.005Mで、２０ユニットのSuperScr
iptII転写酵素の最終濃度にした。反応を42℃で1.5時間インキュベートさせ、反
応を70℃で5分間インキュベートさせることにより、酵素を不活性化させた。２ユニットの大腸菌RnaseHを添加し、反応を37℃20分間インキュベートさせること
により、RNAを除去した。二本鎖DNAを、ｄHTPの添加により、ポリメラーゼチェインリアクションにより発生させ、1.6mM、50ピコモルの５プライム人エンドスタチンプライマー（配列番号３）、50ピコモルの３プライムヒトプライマー（配
列番号４）、高複製PCR緩衝液と2.5ユニットの高複製酵素（ベーリンガー社製）
の最終濃度にした。反応混合物を95℃で3分間インキュベートし、15秒94℃のインキュベートと、30秒55℃のインキュベートと、４分72℃のインキュベーション
を10回繰返し、それから15秒94℃のインキュベーション、30秒50℃のインキュベ
ーション、４分プラス２０秒の72℃のエクステンションインキュベーションを１
５回繰返した。最終的に、反応を72℃7分間インキュベートさせた。

【００７９】二本鎖DNAをNcoIとHindIIIで消化し、50mMTris‐HCｌ、ｐH7.5、10mMMgCl_２、
50μg/mlBSAと1ユニットのT4リガーゼ中で、NcoI/HindIII消化脱リン酸pMON2341
大腸菌発現ベクターへ連結した。連結DNAを大腸菌の菌株MON１０５へ形質変換さ
せ、AmpLBプレートで選択分離し、pMON20440（配列番号９）を発生させる。PMON
20440に宿る大腸菌の菌株MON105を10ng/mlナリジキン酸で誘発させ、上記細胞で
発現されたヒトエンドスタチンをSDS‐PAGEで監視した。

【００８０】例３：マウスエンドスタチンの再生方法全ての工程を４℃で行った。マウスエンドスタチン封入体を、2.5mg/mlで、６
M尿素、5mMBIS‐Trisプロパン、pH10.8に溶解させた。本溶液を2時間攪拌させ、
続いてシスチン（ストック溶液0.2M、pH10.5）を添加して10mMとした。これを５
分間混合させて、3.5M尿素、100mMBis‐Trisプロパン、pH7.0中で、0.25mg/mlエ
ンドスタチンに希釈した。60時間攪拌させて、逆相HPLCにより評価し、タンパク
質の再生が終了した。他のpH条件及び尿素濃度も利用可能であるが、低効率であ
る。図３及び図４は、それぞれ、さまざまなpH条件及び尿素濃度下で、エンドス
タチン再生産物のHPLC記録を示す。図７、図８及び図９は、内皮細胞増殖及び細
胞移動アッセイでの精製マウスエンドスタチンの阻害活性を示す。

【００８１】例４：ヒトエンドスタチンの再生方法全ての工程を４℃で行った。ヒトエンドスタチン封入体を2.5mg/mlで、10mMシ
ステイン、6M尿素、50mMBis‐Trisプロパン、pH10.8で溶解させた。本溶液を２時間攪拌し、続いて10mMシスチン（0.2MでpH10.5のストック溶液）を添加し、５
分間混合させた。本溶液を希釈し、3.0M尿素、100mMBis‐Trisプロパン、pH7.5 中で0.25mg/mlにし、６０時間攪拌させて再生工程を終了させた。他のpH条件及び尿素濃度も利用可能であるが、低効率である。図５及び図６は、それぞれさま
ざなまpH条件と尿素濃度下でのヒトエンドスタチン再生産物のHPLC記録を示す。
図１０は、内皮細胞増殖アッセイにおける精製ヒトエンドスタチンの阻害活性を
示す。

【００８２】当業者には、前記概略した可溶化、再生及び精製条件により、バクテリアから
エンドスタチンを精製する公知の方法に対して、劇的な改良を提供するものであ
ることを認めることができる。前臨床用研究及び臨床トライアルに使用する商業
スケールでのエンドスタチンの生産には、所望の生物学的特性を有する大量の可
溶性再生材料が必要である。治療産物としてのエンドスタチンの商業的開発には
、全ての適用にて同じ挙動をする全特性が既知である材料を必要とする。したが
って、可溶性再生エンドスタチンは、インビトロ用の、及び効果、効能、薬物速
度論、上記タンパク質の薬力学のインビボ研究用の不溶性材料の懸濁液よりも一
層望ましい。本願で開示された上記材料の発現、可溶化、再生、精製及びキャラ
クタリゼーションの劇的に改良された方法により、エンドスタチン、エンドスタ
チン断片、突然変異タンパク質、挿入断片、パームテイン（permutein）、それらのキメラ、又は他の坑血管形成タンパク質、若しくは癌を含む血管形成疾患に
て化合物として有用である小さな分子と上記物質類との複合体を開発する以後の
研究目的を、大いに容易化させる。

【００８３】本願で引用した全ての文献、特許及びその出願は、本願の述べたように、全体
の引用文献に編入される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】クローン化されたエンドスタチン断片の略図を示す。コラーゲンＸＶIIIのＣ末端断片を示す。プラスミドpMON24345（配列番号８）
はマウスコラー全ＸＶIIIのＣ末端断片をエンコードし、プラスミドpMON20440（
配列番号９）はヒトコラーゲンＸＶIIIのＣ末端断片をエンコードする。

【図２】エンドスタチン再生手順の略図である。尿素及びDTT若しくはシステイン存在下での最適可溶化条件と、システイン存在下での再生の概略を示す。

【図３】さまざまなｐＨ条件下でのマウスエンドスタチン再生産物を示す。３．５Ｍ尿素中でのｐＨ７．５、ｐＨ８．０及びｐＨ８．５におけるマウスエ
ンドスタチン再生産物のＲＰ‐ＨＰＬＣ記録。

【図４】さまざまな尿素濃度下でのマウスエンドスタチン再生産物を示す。ｐＨ７．５における３．０Ｍ尿素、３．５Ｍ尿素及び４．０Ｍ尿素でのマウス
エンドスタチン再生産物のＲＰ‐ＨＰＬＣ記録。

【図５】さまざまなｐＨ条件下でのヒトエンドスタチン再生産物を示す。３．５Ｍ尿素中でのｐＨ７．５、ｐＨ８．０及びｐＨ７．５におけるヒトエン
ドスタチン再生産物のＲＰ‐ＨＰＬＣ記録。

【図６】さまざまな尿素濃度下でのマウスエンドスタチン再生産物を示す。ｐＨ７．５における３．０Ｍ尿素、３．５Ｍ尿素及び４．０Ｍ尿素でのマウス
エンドスタチン再生産物のＲＰ‐ＨＰＬＣ記録。

【図７】マウスエンドスタチンによるＨＭＭＥＣ移動の阻害を示す。精製マウスエンドスタチンは、１５μｇ/ｍｌ及び３０μｇ/ｍｌでのＨＭＥＣ
細胞移動アッセイにてアッセイした。移動の阻害は両濃度で観察された。

【図８】マウスエンドスタチンによるＣＰＡＥ移動の阻害を示す。精製マウスエンドスタチンは、５μｇ/ｍｌ及び３０μｇ/ｍｌでのＣＰＡＥ移
動の阻害に対してアッセイされた。

【図９】マウスエンドスタチンによる内皮細胞増殖の阻害を示す。マウスエンドスタチンによる内皮細胞増殖の阻害を示し、顕著な阻害は２０μ
ｇ/ｍｌで観察された。

【図１０】ヒトエンドスタチンによる内皮細胞増殖の阻害を示す。ヒトエンドスタチンによる内皮細胞増殖の阻害を示し、顕著な阻害はエンドス
タチンの１０μｇ/ｍｌで観察された。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年４月１２日（２０００．４．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CE02 CE04 CE08 CE10 CE11 CE12 DA05 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 EA28 FA74 GA01 GA06 GA21 GA23 GA26 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）エンドスタチン遺伝子を発現する宿主細胞を培養させ
る工程と、（ｂ）前記遺伝子発現の産物を回収する工程と、（ｃ）高ｐＨにて前記遺伝子産物を可溶化させる工程と、（ｄ）略中性近傍のｐＨで前記可溶化遺伝子産物を再生させる工程と、（ｅ）前記遺伝子産物の適切なフォールド形を分離する工程と、を含むエンドスタチンの生産方法。
【請求項２】（ａ）エンドスタチン遺伝子を発現する宿主細胞を培養する
工程と、（ｂ）前記遺伝子発現の産物を回収する工程と、（ｃ）略中性近傍のｐＨで前記遺伝子産物を再生させる工程と、（ｄ）前記遺伝子産物の適切なフォールド形を分離する工程と、を含むエンドスタチンの生産方法。
【請求項３】前記可溶化工程の高ｐＨは約ｐＨ９乃至約ｐＨ１１．５であ
る請求項１に記載の生産方法。
【請求項４】前記高ｐＨは約ｐＨ１０乃至約ｐＨ１１である請求項３に記
載の生産方法。
【請求項５】前記高ｐＨは約ｐＨ１０．５である請求項４に記載の生産方
法。
【請求項６】前記再生工程の中性近傍のｐＨは約ｐＨ６乃至約ｐＨ８．５
である請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項７】前記再生工程の中性近傍のｐＨは約ｐＨ７．０乃至約ｐＨ８
．０である請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】前記再生工程の中性近傍のｐＨは約ｐＨ７．５である請求項
７に記載の生産方法。
【請求項９】前記再生工程の中性近傍のｐＨは約ｐＨ７．０乃至約ｐＨ８
．０である請求項６に記載の生産方法。
【請求項１０】前記再生工程の中性近傍のｐＨは約ｐＨ７．５である請求
項９に記載の生産方法。
【請求項１１】前記可溶化工程中に、尿素が約４Ｍ乃至約１０Ｍの濃度で
存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項１２】前記可溶化工程中に、尿素が約６Ｍの濃度で存在する請求
項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】前記再生工程中に、尿素が約０．５Ｍ乃至約５Ｍの濃度で
存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項１４】前記再生工程中に、尿素が約３．５Ｍの濃度で存在する請
求項１３に記載の生産方法。
【請求項１５】前記可溶化工程中に、グアニジン塩酸塩が約２Ｍ乃至約８
Ｍの濃度で存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項１６】前記可溶化工程中に、グアニジン塩酸塩が約４Ｍの濃度で
存在する請求項１５に記載の生産方法。
【請求項１７】前記再生工程中に、グアニジン塩酸塩が約０．２Ｍ乃至約
２Ｍの濃度で存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項１８】前記再生工程中に、グアニジン塩酸塩が約１．５Ｍの濃度
で存在する請求項１７に記載の生産方法。
【請求項１９】ジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元させ得る還元
剤の存在下で行う請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項２０】前記還元剤はＤＴＴ、ＢＭＥ、システイン及び還元グルタ
チオンからなる群から選択される請求項１９に記載の生産方法。
【請求項２１】ＤＴＴは前記可溶化工程中に、約２ｍＭ乃至約１０ｍＭの
濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２２】ＤＴＴは前記可溶化工程中に、約５ｍＭの濃度で存在する
請求項２１に記載の生産方法。
【請求項２３】ＤＴＴは前記再生工程中に、約０．２ｍＭ乃至約２ｍＭの
濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２４】ＤＴＴは前記再生工程中に、約０．５ｍＭの濃度で存在す
る請求項２３に記載の生産方法。
【請求項２５】還元グルタチオンは前記可溶化工程中に、約５ｍＭ乃至約
２０ｍＭの濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２６】還元グルタチオンは前記可溶化工程中に、約１０ｍＭの濃
度で存在する請求項２５に記載の生産方法。
【請求項２７】還元グルタチオンは前記再生工程中に、約１ｍＭ乃至約４
ｍＭの濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２８】還元グルタチオンは前記再生工程中に、約２ｍＭの濃度で
存在する請求項２７に記載の生産方法。
【請求項２９】システインは前記可溶化工程中に、約５ｍＭ乃至約２０ｍ
Ｍの濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項３０】システインは前記可溶化工程中に、約１０ｍＭの濃度で存
在する請求項２９に記載の生産方法。
【請求項３１】システインは前記再生工程中に、約０．５ｍＭ乃至約４ｍ
Ｍの濃度で存在する請求項２０に記載の生産方法。
【請求項３２】システインは前記再生工程中に、約１ｍＭの濃度で存在す
る請求項３１に記載の生産方法。
【請求項３３】前記再生工程中に、ジスルフィド結合の相互交換を向上さ
せ得る薬剤が存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項３４】前記薬剤はシスチン及び酸化グルタチオンから選択される
請求項３３に記載の生産方法。
【請求項３５】シスチンは前記再生工程中、約０．２ｍＭ乃至約５ｍＭの
濃度で存在する請求項３４に記載の生産方法。
【請求項３６】シスチンは前記再生工程中に、約１ｍＭの濃度で存在する
請求項３５に記載の生産方法。
【請求項３７】ジスルフィド結合は前記再生工程中の空気酸化工程により
形成される請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項３８】前記空気酸化工程は約１２時間乃至約９６時間に亘り行わ
れる請求項３７に記載の生産方法。
【請求項３９】前記空気酸化工程は約２４時間乃至約７２時間に亘り行わ
れる請求項３８に記載の生産方法。
【請求項４０】前記空気酸化工程は約６０時間に亘り行われる請求項３９
記載の生産方法。
【請求項４１】前記遺伝子産物は前記可溶化工程中に、約１乃至約２０ｍ
ｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４２】前記遺伝子産物は前記可溶化工程中に、約２．５ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項４１に記載の生産方法。
【請求項４３】前記遺伝子産物は前記再生工程中に、約０．１乃至約５ｍ
ｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４４】前記遺伝子産物は前記再生工程中に、約０．２５ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する請求項４３に記載の生産方法。
【請求項４５】イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィー及び分取高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択された方法
により、エンドスタチンを精製する精製工程をさらに含む、請求項１又は２に記
載の生産方法。
【請求項４６】前記エンドスタチン遺伝子は非ヒトである、動物エンドス
タチンをエンコードするＤＮＡを含む請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４７】前記エンドスタチン遺伝子は、配列番号５、配列番号６、
配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される請求項１又は２に記載の生
産方法。
【請求項４８】前記エンドスタチン遺伝子はヒトエンドスタチンをエンコ
ードするＤＮＡを含む請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４９】前記エンドスタチン遺伝子は配列番号９を含む請求項１又
は２に記載の生産方法。