KR20010034529A - 마우스 및 사람의 엔도스테틴을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 마우스 또는 사람의 엔도스테틴(endostatin)을 제조하는 방법을 개시한다. 또한, 온길이 또는 절단된 형태의 엔도스테틴을 암호화하는 핵산 및 세균에서 발현된 봉입체로부터 엔도스테틴을 리폴딩(refolding) 및 정제하는 방법을 개시한다.
Description
맥관형성
새로운 혈관의 성장인 맥관형성은 암의 성장 및 전이에서 중요한 역할을 차지한다. 사람의 경우, 종양에서 맥관구조의 정도는 여러가지의 암에 대한 환자 예후와 관련이 있는 것으로 확인되었다(Folkman, J., Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston 333(26): 1757-1763, 1995; Gasparini, G., European Journal of Cancer 32A(14): 2485-2493, 1996; Pluda, J.M., Seminars in Oncology 24(2): 203-218, 1997, Norrby, K., APMIS 105: 417-437, 1997). 정상 성인의 경우, 맥관형성은 창상 치유 및 여성 생식기 계통과 같은 잘 억제된 상태로 제한된다(Battegay, E.J., J Mol Med 73: 333-346, 1995; Dvorak, H.F., New Engl J Med, 315: 1650-1659, 1986).
동물 실험 결과, 종양은 잠복 상태로 존재할 수 있는데, 종양 성장은 고속 증식 및 고속 세포자멸사 사이의 균형에 의해 제한되는 것으로 확인된다(Holmgren, L. et al., Nat. Med. (N.Y.) 1(2): 149-153, 1995; Hanahan, D. et al., Cell 86(3): 353-364, 1996). 맥관형성 표현형으로 변경되면, 종양 세포는 잠복상태로부터 이탈할 수 있을뿐 아니라, 종양 세포의 세포자멸사 속도의 감소로 인하여 급속하게 성장할 수 있다(Bouck, Cancer Cells, 2(6):179-185, 1990; Dameron et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 59: 483-489, 1994). 맥관형성을 억제하는 것은 새로운 혈관 형성을 촉진하는 인자와 새로운 맥관구조의 형성을 억제하는 항맥관형성인자 사이의 균형인 것으로 판단된다(Bouck, N. et al., Advances in Cancer Research 69: 135-173, 1996; O'Reilly et al., Cell 79(2): 315-328, 1994).
염기성 및 산성 섬유아세포 성장 인자(bFGF 및 aFGF) 및 맥관 투과성 인자/맥관 내피세포 성장 인자(VPF/VEGF)를 포함한 여러가지의 부맥관형성 인자(pro-angiogenic factor)가 특성화되었다(Potgens, A.J.C. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 276: 57-70, 1995; Ferrara, N., European Journal of Cancer 32A(14): 2413-2442, 1996; Bikfalvi, A. 등, Endocrine Reviews 18: 26-25, 1997). 또한, 안지오스테틴(O'Reilley 등, Cell 79(2): 315-328, 1994), 엔도스테틴(O'Reilley 등, Cell 88(2): 277-285, 1997), 인터페론-알파(Ezekowitz 등, N. Engl. J. Med., May 28, 326(22) 1456-1463, 1992), 트롬보스포딘(Good 등, Proc Natl Acad Sci USA 87(17): 6624-6628, 1990; Tolsma 등, J. Cell Biol 122(2): 497-511, 1993), 및 혈소판 인자 4(PF4)(Maione 등, Science 247(4983): 77-79, 1990)을 포함한 내인성 항맥관형성 인자가 특성화되었다.
많은 맥관형성 억제제가 임상학적으로 개발되고 있다(참조, Shawver 등, Drug Discovery Today 2(2): 50-63, 1997, 및 상기 문헌의 참조문헌). 인터페론 알파 및 혈소판 인자 F4와 같은 폴리펩티드가 시험 단계에 있다. 안지오스테틴, 가용성 Flt-1 수용체, 및 살균성/투과성 증가 단백질 유도체 23 은 예비임상학적 연구단계에 있다. 또한, 항-avb3항체(LM 609), 항-VEGF, 및 항-Flk-1 단일클론 항체(DC101)와 같은 단일클론 항체가 예비임상학적 연구중에 있다. 황산화된 다당류-펩티도글리칸 복합체인 테코갈란 (DS 4152)이 임상학적 시험중에 있고, bFGF 탄수화물 억제제 (GM1474) 및 bFGF 글리셉터 의태 억제제(GL14.2)가 예비임상학적 연구 단계에 있다. 푸마길린(fumagillin) 유사체인 항생성 AGM1470(TNP470) 및 다음이온성 화합물인 수라민(Suramin)이 임상학적 시험 단계에 있다. 유로키나아제 수용 길항제와 같은 소분자 억제제, 포스파티드산의 억제제, Flk-1의 억제제, 및 VEGF-F11 결합 억제제가 예비 시험단계에 있다. 탈리도미드(thalidomide) 및 이의 유사체, 및 Batimastat/Marimastat와 같은 매트릭스 메탈로프로테나아제 억제제가 임상학적 시험 단계에 있다. 또한, VEGF 수용체를 목표로하는 리보짐 및 VEGF 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 뉴클레오티드가 예비임상학적 단계에 있다.
항맥관형성 치료는 암의 치료를 위한 통상적인 화학요법 치료와 비교하여 몇 가지의 이점을 가질 수 있다. 항맥관형성제는 예비임상학적 시험에서 저독성을 나타내며 약제내성을 전개하는 것으로 관찰되었다(Folkman, J., Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston 333(26): 1757-1763, 1995). 맥관형성은 내피 세포의 침입, 증식 및 전이를 포함한 많은 단계로 이루어진 복잡한 과정이므로, 치료요법들을 결합하여 사용하는 것이 가장 효과적이라는 것을 예상할 수 있다. 실제로, 화학치료 요법과 항맥관형성 요법을 결합한 방법은 예비임상학적 모델에서 유망한 결과를 나타냈다(Teicher, B. A. 등, Breast Cancer Research and Treatment 36: 227-236, 1995; Teicher, B.A. 등, European Journal of Cancer 32A(14):2461-2466, 1996).
엔도스테틴(endostatin)
엔도스테틴은 알파 1 타입 콜라겐 XVIII의 C-말단 분절로부터 유도한 20 kDa 단백질이다. 혈관내피종 세포계(EOMA)로부터 얻은 조절된 세포 배지는 생체외에서 내피세포 증식을 억제하는 인자를 함유하는 것으로 확인되었다(O'Reilley 등, Cell 88: 277-285, 1997). 이러한 억제를 제공하는 상기 인자는 엔도스테틴으로 명명되었다. 바컬로바이러스-감염 곤충 세포(baculovirus-infected insect cell)에서 발현된 상기 단백질의 재조합 형태는 루이스 폐 종양 모델에서 전이의 성장을 억제했고, 이러한 단백질의 불용성 대장균 유도 형태는 몇몇의 종양 모델에서 1차 종양 성장을 예방하는데 효과적인 것으로 확인되었다(O'Reilley 등, Cell 88: 277-285, 1997; Boehm 등, Nature 390: 404-410, 1997).
엔도스테틴의 정제 및 리폴딩(refolding)
지난 20년에 걸쳐서 많은 유형의 발현계가 개발되었지만, 특히 대장균에 근거하는 것과 같은 세균계가 단백질을 공업적 규모로 제조하는데 폭넓게 사용되고 있다. 높은 수준의 발현을 가능하게하고 높은 세포 밀도 및 저비용으로 발효를 수행할 수 있는 벡터(vector)가 대장균-기초 발현계의 광범위한 개발 및 이용에 기여했다. 그러나, 한 가지 중요한 문제는 원하는 재조합 단백질을 함유하는 봉입체를 형성하려는 대장균의 경향이다. 봉입체의 형성은 생물학적 활성 단백질을 회수하기 전에, 생체외 리폴딩과 같은 추가의 하류측 공정을 필요로 한다. 불용성 응집물을 형성하려는 경향은 융합 영역의 크기, 소수성, 부단위 구조 및 사용과 같은 인자와 관련이 있는 것으로 보이지 않는다(Kane J.F. 및 Harley, D.L., Tibtech 6: 95, 1988). 봉입체의 형성은 단백질 합성 속도, 단백질 폴딩 속도, 단백질 응집 속도, 단백질 가수분해 속도, 폴딩 중간체 및 천연 단백질의 용해도 및 열역학적 상태, 및 상기 단백질 종과 샤프롱 단백질의 상호작용에 의하여 결정되는 것으로 판단된다(Rainer Rudolph, In Protein Engineering: Principles and Practice, 발행인 Jeffery L. Cleland 및 Charles S. Craik, p 283-298, Wiley-Liss, Inc., New York, New York, 1996).
일반적으로 봉입체는 재조합 단백질을 높은 수준으로 발현하는 세포질에서 형성된다. 이러한 봉입체는 위상차 현미경으로 관찰하였을 때 빛을 굴절시키므로 굴절체로 나타내어지기도 한다. 상기 봉입체는 비교적 높은 비 밀도(specific density)를 가지는데 특징이 있고 원심분리에 의하여 용융 세포로부터 펠릿화될 수 있다. 봉입체를 형성하면, 재조합 단백질이 가수분해되는 것을 방지할 수 있는데, 이는 상기 재조합 단백질이 생리적 용매 조건하에서 쉽게 분해되지 않기 때문이다. 봉입체내에 존재하는 단백질을 용해시키기 위하여 6M 구아니딘 히드로클로라이드 또는 6-8M 우레아와 같은 고농도의 변성제가 일반적으로 사용되어 왔다. 여러가지의 봉입체 용해 방법들이 비교되었다(Fisher, B., Summer, L. 및 Goodenough, P. Biotechnol. Bioeng. 1: 3-13, 1992).
원하는 외부 유전자 생성물이 봉입체의 주성분이긴 하지만, 작은 열충격 단백질, 외부막 단백질, 연장 인자 EF-Tu, 및 RNA 폴리머라아제와 같은 기타 숙주 세포 단백질이 상기 생성물내에 풍부하게 존재할 수도 있다(Allen, S.P., Polazzi, J.O. Gierse, J.K., 및 Easton, A.M., J. Bacteriol, 174: 6938-6947, 1992; Hart, R.A., Rinas, U., 및 Bailey, J.E., J. Biol. Chem. 265, 12728-12733, 1990; Hartley, D.L., 및 Kane, J.F., Biochem. Soc. Trans. 16: 101, 1988).
국제 특허 출원 WO 97/15666호에는 대장균 및 바컬로바이러스-감염 곤충 세포로부터 엔도스테틴의 발현, 정제, 및 특성화가 기술되어있다. 상기 세균학적으로 유도된 엔도스테틴은 그의 본래 상태로 리폴딩되지는 않지만, 상기 특허 출원에서는 불용성 현탁액으로 이용되었다. 또한, 상기 특허 출원에는 쥐과 혈관육종 세포계통 EOMA의 조절된 배지로부터 천연 엔도스테틴의 정제가 기술되어 있다. 엔도스테틴은 고전적인 정제 방법을 통해 상기 조절된 배지로부터 정제된다.
엔도스테틴을 리폴딩하는 것에 관한 성공적인 방법은 발표되지 않았다(O'Reilley 등, Cell 88: 277-285, 1997). 상기 문헌의 저자에 의해 특성화된 대장균-유도 엔도스테틴은 PBS에 대한 투석후에 침전하였다. 상기 침전된(리폴딩되지 않은) 물질은 배지에서 불용성이기 때문에 생체외에서 시험될 수 없다. 상기 물질의 작은%가 투석동안 순간적으로 용해되었다. 이러한 물질은 천연 및 가용성 바컬로바이러스-유도 엔도스테틴과 유사한 억제 활성을 가졌다. 대장균-유도 재조합 엔도스테틴을 0.1M 인산나트륨 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.6M 우레아, 2mM 환원 글루타티온, 0.02mM 산화 글루타티온, 및 0.5 M 아르기닌의 존재하에 0.1mg/ml의 최종 농도에서 리폴딩하는 경우, 단백질의 99% 이상이 손실되었다. 이러한 큰 손실로 인하여 상기 물질은 생체내 평가분석에 사용되지 않았다. 대신에, 상기 저자들은 엔도스테틴의 특성화되지않은 불용성(리폴딩되지 않은) 형태를 대부분의 생체내 평가분석에 사용했다. 대장균-유도 엔도스테틴 침전물은 5일간에 걸쳐서 점차적으로 용해하고 병아리 장뇨막(CAM) 평가분석에서 지속적인 항맥관형성 효과를 나타냈다. 상기 물질의 현탁액은 마우스의 주사 부위에 펠릿을 형성하였는데, 이러한 펠릿은 24-84 시간에 걸쳐서 서서히 재흡수되었다.
상기 저자들에 의한 나중의 연구 결과, 폐암종, T241 섬유육종, 또는 B16F10 흑색종을 갖는 마우스를 마우스 엔도스테틴으로 처리하면 약물 내성이 전개되지 않는 것으로 확인되었다(Boehm, T. 등, Nature 390: 404-407, 1997). 세균이 8M 우레아, 10 mM 베타 메르캅토에탄올, 및 10 mM pH 8.0 에서 펠릿화 및 재현탁되고 1 내지 2 시간동안 배양되었다는 것을 제외하곤 상기의 문헌(O'Reilley 등, Cell 88: 277-285, 1997)에서 기술한 바와 같이 대장균-유도 재조합 쥐과 엔도스테인이 제조되었다. 베타 메르캅토에탄올은 나중의 단계에서 제외되었다. 재조합 마우스 엔도스테인은 PBS에 현탁된 상태로 마우스로 운반되었다. 상기 세가지 종양 유형중 한 유형의 종양을 갖는 마우스에게 상기 접종 종양으로부터 떨어진 피하 등부위로, 정제되었으며 약하게 가용성인 엔도스테틴 현탁액이 주사되었다. 종양이 퇴화하는 때 처리를 멈추고 다시 성장하도록 하였다. 치료의 종료후 6, 4, 또는 2 회의 엔도스테틴 처리 사이클후에 종양 성장은 재발하지 않았다.
최근, 사람의 엔도스테인의 순환 형태가 분리 및 특성화되었다(Standker 등, FEBS Letters 420: 129-133, 1997). 고분자량 폴리펩티드(1-20 kDa)가 만성 신부전증 환자로부터 얻은 2,500 리터의 사람 혈액 한외여과물(혈액여과물, HF)로부터 분리되었다. 추출물이 양이온 교환 칼럼에 결합되고 pH 푸울 분별증류(3.6 에서 9.0까지 증가하는 pH를 갖는 7개의 완충액)에 의해 용리되었다. 물을 이용하여 용리시킨후 반전상 HPLC에 의해 정제된 푸울 8에서 고분자량 폴리펩티드가 검출되었다. 분획들을 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화 질량 분석(MALDI-MS)하고, 전기분무 질량분석(ES-MS)에 의해 측정된 정확한 분자량은 18,494 Da인 것으로 확인되었다. 상기 분자내의 시스테인 잔기 1-3 및 2-4는 이황화물 결합에 의해 결합되는 것으로 확인되었다. 정제동안 최종 회수율은 20% 이므로, 혈액 여과물에서 10-11M의 농도를 가지는 것으로 평가되었다. 환자 혈장에서 상기 엔도스테틴 최종 농도는 10-10M 이상인 것으로 평가되었다. 안지오스테틴에 관하여 제안된 바와 같이 조직 결합 엔도스테틴의 푸울이 존재하는 경우가 구별되지 않는다(Kost 등, Eur J. Biochem. 236: 682-688, 1996). 사람의 천연 엔도스테틴(마우스의 엔도스테틴보다 12개 아미노산 만큼 짧음)의 생체외 생물학적 특성화 결과, 상이한 내피 세포 유형에 관한 항증식 활성은 나타나지 않았다. 사람의 엔도스테틴의 재조합 형태의 특성화는 보고되지 않았다. 상기의 저자들은 마우스의 엔도스테틴 형태와 사람의 엔도스테틴 형태의 보고된 활성의 차이는 다음 (i) 내지 (iii)과 같은 몇몇의 인자때문일 수 있는 것으로 판단하고 있다. (i) 상기 두 형태는 상이한 소오스로부터 분리된 것이고 생체외 또는 생체내 평가분석에서 상이한 선택성, 특이성, 또는 효능을 가질 수 있다. (ii) 펩타이드들에 대하여 확인된 후번역적 변경의 차이는 보고된 활성의 불일치의 원인이 될 수 있다. (iii) 사람의 엔도스테틴은 내피 세포의 증식을 반드시 억제하지는 않지만, 복잡한 생체내 계통에서만 관찰될 수 있는 기타 세포 성분에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 마우스 및 사람의 엔도스테틴(endostatin)을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 온길이(full-length) 및 절단 형태(truncated form)의 엔도스테틴을 암호화하는 핵산 및 세균에서 발현된 봉입체(inclusion body)로부터 엔도스테틴을 리폴딩(refolding) 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 클론화된 엔도스테틴 분절의 개략도로서, 콜라겐 XVIII의 C-말단 분절을 도시한다. 플라스미드 pMON24345 (서열 확인 번호: 8)는 마우스 콜라겐 XVIII의 C-말단 분절을 암호화하며, pMON20440(서열 확인 번호: 9)는 사람의 콜라겐 XVIII의 C-말단 분절을 암호화한다.
도 2는 엔도스테틴 리폴딩 과정의 개략도로서, 우레아 및 DTT 또는 시스테인의 존재하에서의 최적 가용화 조건 및 시스테인의 존재하에서의 리폴딩을 도시한다.
도 3은 변화하는 pH 조건하에서 마우스 엔도스테틴 리폴딩 생성물을 도시하는 것으로서, 3.5 M 우레아에서 pH 7.5, pH 8.0, 및 pH 8.5일 때의 마우스 엔도스테틴 리폴딩 RP-HPLC 트레이싱을 도시한다.
도 4는 변화하는 우레아 농도 조건하에서 마우스 엔도스테틴 리폴딩 생성물을 도시하는 것으로서, pH 7.5 일 때 3.0, 3.5, 및 4.0 M 우레아에서의 마우스 엔도스테틴 리폴딩 생성물을 도시한다.
도 5는 변화하는 pH 조건하에서 사람의 엔도스테틴리폴딩 생성물을 도시하는 것으로서, 3.5 M 우레아에서 pH 7.5, pH 8.0, 및 pH 8.5일 때의 사람의 엔도스테틴 리폴딩 RP-HPLC 트레이싱을 도시한다.
도 6은 변화하는 우레아 농도 조건하에서 사람의 엔도스테틴 리폴딩 생성물을 도시하는 것으로서, pH 7.5 일 때 3.0, 3.5, 및 4.0 M 우레아에서의 사람의 엔도스테틴 리폴딩 생성물을 도시한다.
도 7은 마우스 엔도스테틴에 의한 HMEC 이동의 억제를 도시한다. 정제된 마우스 엔도스테틴이 HMEC 세포 이동 평가분석에서 15 및 30 ㎍/ml으로 평가분석되었다. 상기 두 농도에서 이동의 억제가 관찰되었다.
도 8은 마우스 엔도스테틴에 의한 CAPE 이동의 억제를 도시한다. 정제된 마우스 엔도스테틴이 5 및 30 ㎍/ml의 농도에서 CPAE 이동의 억제에 대하여 평가분석되었다. 상기 두 농도에서 이동의 억제가 관찰되었다.
도 9는 마우스 엔도스테틴에 의한 내피 세포 증식의 억제를 도시한다. 20 ㎍/ml에서 상당한 억제가 관찰되었다.
도 10은 사람의 엔도스테틴에 의한 내피 세포 증식의 억제를 도시한다. 10 ㎍/ml의 엔도스테틴 농도에서 상당한 억제가 관찰되었다.
본 발명의 한 가지 목적은 세균에서 높은 수준의 엔도스테틴(endostatin)을 발현하기 위한 방법을 설명하는 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 엔도스테틴 봉입체를 가용화한 후 리폴딩(refolding) 및 정제하여 생물학적 활성 물질을 생성할 수 있는 방법을 설명하는 것이다.
마우스 또는 사람의 엔도스테틴 봉입체를 가용화시키는 단계는 증가된 pH에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 가용화 단계에서의 증가된 pH는 약 pH 9 내지 약 pH 11.5인 것이 바람직하다. 상기 증가된 pH 범위는 약 pH 10 내지 약 pH 11인 것이 더욱 바람직하다. 상기 증가된 pH는 약 10.5 인 것이 가장 바람직하다.
마우스 또는 사람의 엔도스테틴 봉입체를 리폴딩(refolding)하는 단계는 거의 중성의 pH에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 가용화 단계에서 상기 거의 중성의 pH는 약 pH 6 내지 약 pH 8.5 인 것이 바람직하다. 마우스의 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 상기 거의 중성 pH는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0 인 것이 더욱 바람직하다. 상기 마우스 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 거의 중성의 pH는 약 7.5인 것이 가장 바람직하다. 상기 사람의 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 거의 중성의 pH는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 것이 더욱 바람직하다. 상기 사람의 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 거의 중성의 pH는 약 7.5 인 것이 가장 바람직하다.
엔도스테틴 유전자 생성물의 농도는 상기 가용화 단계동안 약 0.2 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 2.5 mg/ml인 것이 더욱 바람직하다.
상기 리폴딩 단계동안 엔도스테틴 유전자 생성물의 농도는 약 0.02 내지 약 2mg/ml의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 2.5 mg/ml인 것이 더욱 바람직하다.
상기 가용화 및 리폴딩 단계동안 우레아 및 구아니딘 히드로클로라이드로부터 선택한 변성제를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 변성제는 우레아인 것이 더욱 바람직하다.
상기 가용화 단계동안 우레아의 농도는 약 4 M 내지 약 10 M 인 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 6 M인 것이 더욱 바람직하다.
상기 리폴딩 단계동안 상기 우레아의 농도는 약 2 M 내지 약 4 M 인 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 3.5 M인 것이 더욱 바람직하다.
상기 가용화 단계동안 상기 구아니딘 히드로클로라이드의 농도는 약 2 M 내지 약 8 M인 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 4M인 것이 더욱 바람직하다.
리폴딩 단계동안 구아니딘 히드로클로라이드의 농도는 약 0.2 M 내지 약 2 M인 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 1.5 M인 것이 더욱 바람직하다.
상기 가용화 및 환원 단계는 이황화물 결합을 설프히드릴기(sulfhydryl group)로 환원시킬 수 있는 환원제의 존재하에 수행되는 것이 바람직하다. 상기 환원제는 DTT, BME, 시스테인, 및 환원된 글루타티온(glutathione)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 환원제는 DTT 또는 시스테인 것이 더욱 바람직하다.
상기 DTT는 상기 가용화 단계동안 약 2 mM 내지 약 10 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 5 mM인 것이 바람직하다.
상기 리폴딩 단계동안 상기 DTT는 약 0.5 내지 약 2 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 0.5 mM인 것이 더욱 바람직하다.
상기 환원된 글루타티온은 상기 가용화 단계동안 약 5 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 10 mM인 것이 더욱 바람직하다.
상기 환원된 글루타티온은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.5 mM 내지 약 4 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 1 mM인 것이 더욱 바람직하다.
상기 시스테인은 상기 가용화 단계동안 약 5 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 10 mM인 것이 더욱 바람직하다.
상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.5 mM 내지 약 4 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 1 mM인 것이 더욱 바람직하다.
이황화물 결합의 상호교환을 강화할 수 있는 물질이 상기 리폴딩 단계동안에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 물질은 시스테인 및 산화된 글루타티온으로 리루어진 그룹에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 물질은 시스테인인것이 더욱 바람직하다.
상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.2 mM 내지 약 5 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 농도는 약 1 mM인 것이 더욱 바람직하다.
상기 이황화물 결합은 상기 리폴딩 단계동안 공기 산화를 통해 형성되는 것이 바람직하다. 상기 공기 산화 단계는 약 12 내지 약 96 시간동안 수행되는 것이 바람직하다. 상기 공기 산화 단계는 약 24 내지 약 72 시간동안 수행되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 공기 산화 단계는 약 60 시간동안 수행되는 것이 가장 바람직하다.
상기 리폴딩된 엔도스테틴은 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 RP-HPLC로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법에 의해 더욱 더 정제되는 것이 바람직하다.
상기 발현, 가용화, 리폴딩 및 정제로 이루어지는 방법은 마우스 또는 사람의 엔도스테틴 유전자를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 유전자는 서열 확인 번호 5-9 (SEQ ID NOs: 5-9)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 신규한 단백질은 사람 또는 마우스의 변경된 엔도스테틴 아미노산 서열이며, 상기 단백질은 (메티오닌-1), (알라닌-1), (메티오닌-2, 알라닌-1), (세린-1), (메티오닌-2, 세린-1), (시스테인-1), 또는 (메티오닌-2, 시스테인-1)의 바로 앞에 우선할 수도 있다.
그 밖에, 본 발명은 엔도스테틴, 이의 변이체 및 뮤테인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터, 이와 관련된 미생물 및 진핵 발현계에 관한 것이고, 또 이러한 단백질을 제조하는 방법(발현, 가용화, 리폴딩, 정제 단계 포함)에 관한 것이다.
이러한 서열을 암호화하는 DNA 서열의 클론화는 중간 벡터를 사용하여 달성할 수 있다. 또는 그렇지않으면, 하나의 유전자를 다른 유전자를 함유하는 벡터로 직접 클론화할 수 있다. 상기 DNA 서열을 결합하기 위해서뿐 아니라, 제한 부위가 상기 영역의 내부에 있는 소멸 서열의 교체하기 위해서 링커 및 어뎁터를 사용할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드, 펩티드 링커, 및 기타 폴리펩티드중 하나를 암호화하는 유전자 물질(DNA)이 세균, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 적당한 발현 벡터내로 삽입된다. 상기 형질전환된 유기체 또는 세포계는 성장하고 표준 방법에 의해 단백질이 분리된다. 따라서, 얻어지는 생성물은 전부 또는 일부의 제 2 단백질에 링커 영역에 의해 결합되는 전부 또는 일부의 어떤 단백질을 가지는 신규한 단백질이다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 단백질의 발현에 사용하기 위한 플라스미드 DNA 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 암호화하는 상술한 신규 DNA 서열을 함유한다. 상기 단백질을 발현할 수 있는 미생물 또는 세포계를 형질전환할 수 있는 적절한 벡터로는 사용되는 숙주 세포에 따라 선택되는 전사 및 번역 조절 서열에 결합되는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 있다.
상술한 바와 같이 변경된 서열을 함유하는 벡터는 본 발명에 포함되고 상기 단백질의 생성에 유용하게 사용된다. 또한, 본 발명의 방법에서 이용되는 상기 벡터는 본 발명의 DNA 암호화 서열과 작동적 결합 관계에 있고 선택된 숙주 세포에서 상기 DNA 암호화 서열의 복제 및 발현을 지시할 수 있는 선택된 조절 서열을 함유한다.
본 발명의 또다른 측면은 이러한 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 신규한 다작용 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 적당한 세포 또는 세포계를 배양하는 것을 포함한다. 예를들어, 여러가지의 대장균 균주가 생명공학 분야에서 숙주 세포로 잘 알려져있다. 이러한 균주의 예로는 대장균 균주 JM101 (Yanisch 등, Gene 33: 103-119, 1985) 및 MON105 (Obukowicz 등, Applied Environmental Microbiology 58: 1511-1523, 1992)가 있다. 또한 본 발명은 박테리오파지 Mu (Weinberg 등, Gene 126: 25-33, 1993)에 기초한 대장균에서 염색체 발현 벡터를 이용하여 다작용 단백질을 발현하는 것을 포함한다. 또한, 여러가지 B. subtilis 균주가 본 발명의 방법에서 이용될 수도 있다. 또한, 당업자에게 알려져있는 많은 효모 세포 균주를 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용할 수 있다.
대장균 세포질에서 발현되는 때, 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 코돈의 5' 말단이 부가되어 상기 단백질의 N-말단에서 Met-2-Ala-1, Met-2-Ser-1, Met-2-Cys-1, 또는 Met-1을 암호화하도록 구성될 수도 있다. 상기 대장균의 세포질에서 제조되는 단백질의 N-말단은 메티오닌 아미노펩티다아제에 의한 후번역 처리에 영향을 받을 수 있고 (Ben Bassat 등, J. Bacteriol. 169:751-757, 1987), 다른 펩티다아제에 의해서도 영향을 받을 수 있으므로 발현시에 상기 메티오닌은 상기 N-말단을 분열시킨다. 본 발명의 단백질은 N-말단에서 Met-1, Ala-1, Ser-1, Cys-1, Met-2-Ala-1, Met-2-Ser-1, 또는 Met-2-Cys-1을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 돌연변이 단백질은 분비 시그날 펩티드를 상기 N-말단에 융합함으로써 대장균에서 발현될 수도 있다. 이러한 시그날 펩티드는 분비 과정의 일부로서 상기 폴리펩티드로부터 분열된다.
정의
하기의 사항은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 약어 및 그에 대한 의미를 나타낸 것이다:
g = 그램
HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피
mg = 밀리그램
ml = 밀리리터
DTT = 디티오트레이톨(dithiothreitol)
RT = 실온
PBS = 인산염 완충 염수
하기의 사항은 본원에서 사용되는 여러가지 용어를 정의한 것이다.
용어 "항종양"은 생체내에서 종양의 성장을 감소 또는 없애거나, 또는 상기 종양을 죽이거나 또는 손상시키는 활성을 의미하는 것이다.
용어 "자연 서열"은 유전자 또는 단백질의 야생 형태 또는 자연 형태와 동일한 아미노산 또는 핵산 서열을 의미하는 것이다.
용어 "돌연변이 아미노산 서열", "돌연변이 단백질", "변이 단백질", "뮤테인", 또는 "돌연변이 폴리펩티드"는 아미노산의 부가, 삭제, 치환 또는 이들의 어떤 조합으로 인해 자연 서열로부터 변화하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 자연 서열로부터 유도되거나 또는 화학적으로 합성되는 계획적으로 제조된 변이체로부터의 누클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하는 것이다.
용어 "엔도스테틴"(endostatin)은 항맥관형성 활성을 갖는 콜라겐 XVIII의 단백질 분절을 의미하는 것이다. 상기 분절의 활성은 맥관형성에 대한 마우스 각막 마이크로포켓 평가분석 또는 생체외에서 내피 세포의 성장 또는 이동의 억제에 의해서 결정될 수 있다. 바람직하게, 마우스의 엔도스테틴은 서열번호 10에서 나타낸 서열을 의미하는 것이고 사람의 엔도스테틴은 서열번호 11에서 나타낸 서열을 의미하는 것이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예시하는 것이지만, 본 발명이 실시예로 제한되지 않음은 물론이다. 당업자는 본 발명의 개시내용을 읽어봄으로써 본 발명의 정신 및 범위를 일탈하지 않고 여러 가지의 다른 실시예를 명백히 알 수 있을 것이다. 이러한 다른 실시예는 모두 청구의 범위내에 포함된다.
일반적 방법
단백질을 클론화, 발현 및 특성화하는 일반적 방법이 다음문헌[T. Maniatis 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 및 이 문헌에 인용된 참조문헌; 및 J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, 및 이 문헌에 인용된 참조문헌]에서 확인되는데, 상기 문헌은 본원에 참조로 인용된다.
달리 언급하지 않는한, 모든 화학약품들은 미합중국 미저리주 세인트루이스시에 소재한 Sigma, Co.로부터 입수한 것이다. 제한 엔도누클레아제 및 T4 DNA 리가아제는 미합중국 메사츄세츠주 비버리에 소재한 New England Biolabs 또는 미합중국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재한 Boehringer Mannheim 또는 미합중국 위스콘신주 매디슨에 소재한 Promega로부터 입수한 것이다.
균주 및 플라스미드
본 발명의 연구에서 사용된 세균 균주는 표 1에서 나타낸다. 이러한 연구에서 사용되거나 또는 제작되는 플라스미드는 표 2에서 나타낸다.
대장균 균주의 형질전환
DH5 알파 및 DH10B (미합중국 메릴렌드주 록크빌에 소재한 Life Technologies), 및 TG1 (미합중국 일리노이즈주 알링턴 헤이츠에 소재한 Amersham Corp.)와 같은 대장균 균주(표 1)를 결찰 반응의 형질전환에 사용한다. 이러한 균주들은 포유류 세포를 트랜스펙션하기 위한 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 사용되는 숙주이다. 세포질 또는 주변세포질 공간에서 본 발명의 단백질을 발현하기 위하여 JM101 (Yanisch-Perron 등, Gene, 33: 103-119, 1985) 및 MON105 (Obukowicz 등, Appl. and Envir. Micr., 58: 1511-1523, 1992)와 같은 대장균 균주를 사용할 수 있다.
DH5 및 DH10B 서브클론화 세포는 수용 세포(competent cell) 상태로 구입한 것으로서 제조자의 지시에 따라 형질전환하기에 적당한 것이다. 대장균 균주 JM101 및 MON105는 CaCl2방법을 이용하여 DNA를 흡수하도록 수용능력을 가지게된다. 대표적으로, 20 내지 50 mL의 세포를, Baush ＆ Lomb Spectronic 분광계 (미합중국 뉴욕주 로체스터)로 측정하였을 때 600 나노미터(OD 600)에서 약 1.0 흡광 단위의 밀도까지 LB 매질(1% Bacto-트립톤, 0.5% Bacto-효모 추출물, 150 mM NaCl)에서 성장시킨다. 상기 세포를 원심분리에 의하여 수집하고 1/5 배지 체적의 CaCl2용액[50 mM CaCl2, 10 mM 트리스-Cl((10 mM 2-아미노-2-(히드록시메틸) 1,3-프로판디올 히드로클로라이드, pH 7.4]에 재현탁하고 4 ℃에서 30분간 유지한다. 상기 세포를 원심분리에 의해 다시 수집하고, 1/10 배지 체적의 CaCl2용액에 재현탁한다. 결찰된 DNA를 0.2 mL의 상기 세포에 부가하고, 이러한 시료를 4 ℃에서 30-60분간 유지한다. 상기 시료를 2분간 42℃까지 상승시키고 1.0mL의 LB를 부가한 다음 37℃에서 1시간동안 교반한다. 상기 시료로부터의 세포를, 암피실린-내성 형질전환체에 대하여 선택할 때 암피실린 (100 마이크로그램/mL, ㎍/mL)를 함유하고 스펙티노마이신-내성 형질전환체에 대하여 선택할 때 스펙티노마이신(75㎍/mL)를 함유하는 플레이트(LB 배지 + 1.5% Bacto-agar)상에 플레이팅한다. 상기 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한다.
군체를 취하여 LB + 적절한 항생물질 (100㎍/mL 암피실린 또는 75㎍/mL 스펙티노마이신)에 접종하고 교반하면서 37℃로 성장시킨다.
DNA 분리 및 특성화
플라스미드 DNA는 당업자에게 알려져있는 상업적으로 입수가능한 키트를 이용하여 다수의 상이한 방법으로 분리할 수 있다. 플라스미드 DNA를 Promega WizardTMMiniprep 키트(미합중국 위스콘신주 메디슨), Qiagen QIAwell 플라스미드 분리 키트(미합중국 캘리포니아주 체츠워쓰) 또는 Qiagen Plasmid Midi 또는 Mini 키트를 이용하여 분리한다. 상기의 키트는 플라스미드 DNA 분리를 위해 상기의 일반적 과정에 따라 이용된다. 간략히 말해서, 세포들을 원심분리(5000 x g)에 의해 펠릿화하고, 순서적인 NaOH/산 처리를 이용하여 플라스미드 DNA를 방출하고, 원심분리(5000 x g)하여 세포 부스러기를 제거한다. 플라스미드 DNA를 함유하는 상징액을 DNA-결합 수지를 함유하는 칼럼에 적재하고, 상기 칼럼을 씻은 다음, 플라스미드 DNA를 용리시킨다. 상기 플라스미드를 갖는 군체에 대하여 스크리닝한 후, 대장균 세포를 50-100 mL의 LB + 적절한 항생물질에 접종하고, 공기 배양기에서 교반하면서 37 ℃로 밤새 성장시킨다. 상기 정제된 플라스미드 DNA는 DNA 서열화, 제한 효소 소화, DNA 서열의 서브클론화, 및 대장균, 포유류 세포, 또는 기타 세포 유형으로의 트랜스펙션에 사용된다.
서열 확인
정제된 플라스미드 DNA를 탈이온화 H2O에 재현탁하고, Bausch and Lomb Spectronic 601 UV 분광계에서 260/280 nm의 흡광도를 측정하여 상기 DNA의 농도를 측정한다. ABI PRISMTMDyeDeoxyTM말단 서열화 화학제(미합중국 캘리포니아주 린콜 시티에 소재한 Perkin Elmer Corp.의 Applied Biosystems Division) 키트(부품 번호 401388 또는 402078)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 DNA 시료를 서열화하고, 상기 서열화 혼합물에 5% DMSO를 부가하여 변경한다. 서열화 반응을 추천된 증폭 조건에 따라 DNA 열 사이클러 (미합중국 코네티컷주 노르워크에 소재한 Perkin Elmer Corporation)에서 수행한다. Centri-SepTM스핀 칼럼(미합중국 뉴저지주 아델피아에 소재한 Princeton Separations)을 이용하여 시료를 정제하여 과량의 연료 종결암호를 제거하고 동결건조한다. 형광 염료 표지 서열화 반응물을 탈이온화 포름아미드에 재현탁하고 ABI 모델 373A 및 모델 377 자동화 DNA 서열기를 이용하여 변성 4.75% 폴리아크릴아미드-8M 우레아 겔상에서 서열화한다. 중복되는 DNA 서열 분절을 Sequencher DNA 분석 소프트웨어(미합중국 미시간주 앤 아버에 소재한 Gene Codes Copporation)를 이용하여 분석하고 매스터 DNA 콘티그(contig)로 만들었다.
대장균에서 엔도스테틴의 소규모 발현
플라스미드를 가지는 대장균 균주 MON105 또는 JM101을 New Brunswick Scientific (미합중국 뉴저지주 에디슨)으로부터 입수한 공기 배양기 모델 G25에서 교반하면서 M9 + 카사미노산 배지에서 37 ℃로 성장시킨다. 0.1 N NaOH중의 날리딕스산(10mg/mL)이 50 ㎍/mL의 최종 농도까지 부가되는 1.0의 값에 도달할 때 까지 OD600에서 성장을 관찰한다. 다음에, 상기 배지를 37 ℃에서 3-4 시간동안 교반한다. 원하는 유전자 생성물의 생성을 극대화하기 위하여 상기 배양 기간동안 고도의 통기성을 유지한다. 봉입체(IB)의 존재하에 광학 현미경을 이용하여 세포를 검사한다. 1 mL 분획의 상기 배지를 제거하여, 펠릿화된 세포를 비등시키고, 환원 완충액으로 처리하고 SDS-PAGE를 통해 전기영동하여 단백질 함량을 분석한다(Maniatis 등, "Molecular Clonings: A Laboratory Manual", 1982). 상기 배지를 원심분리(5000 x g)하여 상기 세포를 펠릿화한다.
대장균에서 엔도스테틴의 대규모(10L) 발현
엔도스테틴 분자를 10 L Biostat ETM발효기(미합중국 펜실베이니아주 알렌타운에 소재한 B. Brown Biotech Inc.)에서 스케일링했다. 사용된 발효 배지는 2% 카사미노산 (미합중국 미시간주 디트로이트에 소재한 Difco Laboratories) 및 글루코스가 보충된 M9 염이었다. 약 1 ml의 해동된 배지를, 1.0 L의 매질을 함유하는 3.8 L Fernbach 교반 플라스크에 옮기고 37 ℃에서 250 rpm의 교반 속도로 12 시간동안 배양했다. 다음에, 상기 교반 플라스크 배지를 사용하여 9.0 L의 매질을 함유하는 10 L 발효기를 접종했다. 발효 조건은 다음과 같았다: 교반=1000 rpm, 스파저 공기 유속=15 리터/분, pH 조절= NH4OH의 부가에 의해 7.0, 배압= 10 psi, 용해된 산소 조절= 30% 이상, 및 온도=37℃. 글루코스는 처음에는 15g/l의 1회분으로 부가되고, 50% 글루코스 공급원료의 부가에 의하여 2-5 g/l로 조절되었다. 상기 발효 배지를 초기 OD (550nm)=12-15까지 성장시키고 50mg/l의 날리딕스산(nalidixic acid)을 이용하여 유도했다. 상기 유도후 4시간이 되었을 때 연속 흐름 원심 분리에 의하여 발효액을 수집했다.
10L 규모 봉입체 분리
10 L 발효액으로부터의 세포 페이스트를 약 6.0L의 50 mM 트리스/150 mM EDTA 완충액에 재현탁시켰다. 상기 재현탁액을 10,000 psi 및 8℃의 온도에서 microfluidizerTM(미합중국 메사츄세츠주 뉴우톤)에 1회 통과시켰다. 다음에, 회수한 균질물을 15,000 x G로 25분간 회전시키고 Ultra-Turrax 믹서를 이용하여 균일하게 혼합했다. 다음에, 상기 세포 페이스트 현탁액을 10,000 psi 압력으로 작동하는 MicrofluidizerTM(미합중국 메사츄세츠주 뉴우톤)를 통해 2회 통과시켜서 균질화했다. 상기 균질물을 얼음 중탕에 위치한 스테인레스강 용기에 모아서 6℃ 이하의 온도로 유지했다. 다음에, 상기 세포 균질물을 15,000 x g으로 30분간 원심분리하고 상징액을 제거하여 봉입체를 분리했다. 다음에, 상기 봉입체를 냉각된 탈이온수에 재현탁시키고 15,000 x g으로 30분간 원심분리하여 총 2회 세척했다. 다음에, 엔도스테틴 봉입체를 -70℃로 냉동시켰다.
봉입체의 소규모 분리
330 ml 대장균 배지로부터 얻은 세포 펠릿을 15 mL의 초음파 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁시킨다. 이러한 재현탁된 세포를 Sonicator Cell Disruptor (Model W-375, 미합중국 뉴욕주 파밍데일에 소재한 Heat Systems-Ultrasonics)의 마이크로팁 프로브(microtip probe)를 이용하여 초음파 처리한다. 상기 세포를 분열시키고 봉입체 (IB)를 세척하기 위하여 초음파 완충액에서 세 번의 초음파 라운드(round)를 이용한다. 상기 제 1 초음파 라운드는 3분의 초음파 발사후 1분의 초음파발사로 이루어지고, 나머지 두 라운드는 각각 1분간의 초음파발사로 이루어진다.
봉입체 펠릿으로부터 사람 및 마우스 단백질의 추출 및 리폴딩
모든 단계는 4℃에서 수행된다. 마우스의 엔도스테틴 봉입체를 6M 우레아, 5mM DTT, 50mM 비스-트리스 프로판, pH 10.8에서 2.5 mg/ml 엔도스테틴 농도로 용해시켰다. 상기 용액을 2시간동안 교반한 후 시스테인(원료 0.2M, pH 10.5)을 10mM까지 부가하였다. 이를 5분간 혼합한 다음, 3.5M 우레아, 100mM 비스-트리스 프로판 pH 7.0에서 0.25mg/ml의 엔도스테틴 농도가 되도록 희석하였다. 다음에, 60 시간동안 교반하여 반전위상 HPLC에 의해 평가분석되는 바와같이 단백질의 리폴딩을 종료했다.
사람의 엔도스테틴 봉입체를 10 mM 시스테인, 6M 우레아, 50 mM 비스-트리스 프로판, pH 10.8에서 2.5 mg/ml의 엔도스테틴 농도로 용해시켰다. 이를 2시간동안 교반한 다음, 10 mM 시스테인(원료 0.2M, pH 10.5)를 부가하고 5분간 혼합했다. 다음에, 상기 용액을 3.0M 우레아, 100mM 비스-트리스 프로판, pH 7.5에서 0.25mg/ml의 엔도스테틴 농도가 되도록 혼합하고, 60시간동안 교반하여 리폴딩 단계를 종결했다.
정제
산 침전을 이용한 후 술포-프로필 칼럼상에서 칼럼 크로마토그래피하여 마우스 또는 사람의 엔도스테틴을 정제했다. 상기 리폴딩된 시료를 한외여과하여 약 10배 농축하고 아세트 산을 이용하여 pH를 5.0으로 저하시켰다. 다음에, 상기 물질을 5mM 아세트산, pH 5.0에 대하여 투석하였다. 얻어지는 침전물을 여과로 제거하고 그 여액을 Pharmacia S-Sepharose HP 칼럼에 부가했다. 상기 칼럼을 1 칼럼 체적의 평형 완충액으로 세척하고 상기 단백질을 20 칼럼 체적의 50mM 인산염, pH 6.5를 이용하여 용리시켰다. 얻어지는 분획들을 SDS-겔 전기영동으로 분석하고, 합쳐서 PBS에 대하여 투석한 다음 냉동시켰다.
일부의 경우에 있어서, 상기 리폴딩된 단백질은 적당한 기질에 부착된 단클론 항체 또는 수용체 서브유니트와 같은 친화성 물질을 이용하여 친화성 정제될 수 있다. 또한, 이온 교환, 겔 투과 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 반전 위상 HPLC와 같은 여러가지의 크로마토그래피 방법중 어떤 방법을 이용하여 정제할 수도 있다. 이러한 방법 및 다른 단백질 정제 방법이 다음문헌[Methods in Enzymology, Volume 182 "GUide to Protein Purification", 발행 Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, California, 1990]에 상세히 기술되어 있다.
단백질 특성화
상기 정제된 단백질을 RP-HPLC, 전기분무 질량 분광분석, 아미노산 서열화 및 SDS-PAGE를 이용하여 분석한다. 아미노산 조성, RP-HPLC, 및 Bradford 단백질 측정에 의하여 단백질 정량화를 수행한다. 일부의 경우에 있어서, 단백질의 정체를 확인하기 위하여 전기분무 질량 분광분석과 함께 트립신 펩타이트 지도작성(mapping)을 수행한다.
내피세포 증식 평가분석
다음문헌[Cao 등, J. Biol. Chem. 271: 29461-29467, 1996]에서 기술한 바와 같이 내피세포 증식 평가분석을 수행했다. 간략히 말해서, 사람 피부의 미세 혈관 내피 세포(HdMVEC, Clonetics) 또는 소의 부실 피질 미세혈관 내피 세포(BacEnd, Incell, 미합중국 텍사스주 샌 안토니오)를 5% 열불활성화된 송아지 혈청(FBS, Hyclone), 항생물질, 100 ㎍/ml 헤파린 (Sigma) 및 100 ㎍/ml 내피세포 유사분열물질 (Biomedical Technologies)를 함유하는 MCDB131에서 유지했다. 통로 2-5에서 합쳐지는 일분자층들을 0.05% 트립신에 분산시키고, 완전 배지에 재현탁시켰다. 1.25 x 104개의 세포를 함유하는 500 ㎍의 완전 배지를 0.1% 젤라틴이 코팅된 24-웰 조직 배양 플레이트(Sigma)의 웰에 접종했다. 상기 세포를 37 ℃/5% CO2에서 밤새 배양하면서, 상기 배지를 5% FBS 및 여러농도의 억제제를 함유하는 250 ㎕의 배지로 교체했다. 배양후 30분후, 1 ng/ml bFGF (R＆D Systems)를 함유하는 250㎕의 배지를 부가하고 상기 세포를 72 시간동안 배양하면서, 상기 세포를 트립신화하고 쿨터 계수기를 이용하여 집계했다.
내피세포 이동 평가분석
다음문헌[Gately 등, Cancer Res. 56: 4887-4890, 1996)에서 기술된 바와 같이 내피세포 이동 평가분석을 수행했다. 내피 세포의 이동을 억제하려는 에도스테틴의 능력을 평가하기 위하여, 8 mm 공극 사이즈의 폴리카본에이트 막을 함유하는 트랜스웰 챔버(Costar)에서 이동 평가분석을 수행했다. 상기 평가분석에서 이용된 세포는 사람의 미세혈관 내피세포(Emory University, 미합중국 GA 애틀랜타)이거나 또는 소의 폐동맥 내피세포(미합중국 미저리주 세인트루이스에 소재한 Monsanto)였다. 상기 세포를 MCDB131 + 0.1% BSA (사람 세포) 또는 DMEM + 0.1%BSA(소의 세포)에서 사용하기 전에 밤새 쇠약하게 만든후, 회수하고, 동일 배지에서 106세포수/ml의 농도로 재현탁했다. 상기 트랜스웰의 하부측을 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 2 x 105의 세포를 상기 상부 챔버에 부가했다. 상기 트랜스웰을 상기 하부 챔버에 있는 화학유인제(bFGF 또는 VEGF)를 함유하는 웰쪽으로 이동시켰다. 37℃에서 밤새이동시켰다. 다음에 상기 막을 고정하고 오염시킨 다음, 상기 막의 하부측으로 이동한 세포수를 3개의 높은 동력장(powered field)에서 집계했다.
실시예 1: pMON24345 (서열 확인번호:8)의 제작 및 높은 수준의 마우스 엔도스테틴을 생성하는 균주의 선택
5 ㎍의 마우스 RNA (미합중국 캘리포니아주 폴로 알토에 소재한 Clontech Laboratories)를 500 ng의 랜덤 헥사머 프라이머(random hexamer primer; 미합중국 위스콘신주 매디슨에 소재한 Promega Corporation)과 혼합하고, 65℃에서 10분간 가열하고, 얼음위에서 2분간 냉각했다. 상기 RNA/프라이머 혼합물에, 20 유니트의 Rnasin (Promega), SuperScript II 완충액, 0.01 M의 최종 농도까지의 DTT, 0.005M 최종 농도까지의 dNTP 믹스(Boehringer), 및 200 유니트의 SuperScript II 전사효소(Life Technologies Inc.)를 부가했다. 상기 반응물을 42℃에서 1.5 시간동안 배양하고, 70℃에서 5분간 배양하여 상기 효소를 불활성화했다. 2 유니트의 대장균 RNase H (Life Technologies Inc.)를 부가하고 상기 반응물을 37℃에서 20분간 배양하여 RNA를 제거했다. 1.6 mM의 최종 농도까지 dNTPs, 50 pmol의 5 프라임 마우스 엔도스테틴 프라이머 (서열 확인번호:1), 50 pmol의 3 프라임 엔도스테틴 프라이머 (서열확인번호:2), 고적합도 PCR 완충액, 및 2.5 유니트의 고적합도 효소(Boehringer)를 부가하면서 폴리머라아제 사슬 반응시켜서 이중 가닥 DNA를 생성했다. 상기 반응 혼합물을 95℃에서 3분간 배양한 다음, 15초 94℃ 배양, 30초 50℃ 배양, 및 4분 72℃ 배양의 사이클을 10회 반복하고, 15초 94℃ 배양, 30초 50℃ 배양, 및 4분 20초 확장/사이클 72℃ 배양의 사이클을 15회 반복했다. 최종적으로 상기 반응물을 72℃에서 7분간 배양했다.
결찰 완충액중의 25 ng의 벡터인 1 유니트의 T4 리가아제에 1 ㎕의 PCR 반응물을 부가하여 이중 가닥 DNA를 pCRII 벡터(Invitrogen)로 서브클론화했다. 상기 리가아제 반응물을 12℃에서 밤새 배양했다. 상기 결찰된 DNA를 DH5 알파 수용 세포(Life Technologies Inc., 미합중국 메릴렌드주 록크빌)내로 형질전환하고 LB 앰프(amp) 플레이트상에서 성장시켰다. 또한, EcoRI 소화에 의해 측정된 바와같은 삽입물을 갖는 두 개의 분리물을 특성화했다. 상기 두 분리물, 즉 pMON24342 (서열 확인 번호: 5) 및 pMON24343의 cDNA 삽입물을, 표준 디데옥시 기술을 이용한 DNA 서열화에 의해 분석했다. 정확한 암호화 DNA 서열을 구성하기 위하여, pMON24342 및 pMON24343를 ApaI로 소화시켰다. 상기 ApaI 마우스 엔도스테틴 DNA 분절 및 상기 pMON24342 벡터 + 5 프라임 마우스 엔도스테틴 암호화 DNA 서열을, Quaex II 겔 추출 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 분리했다. 상기 분절들을 50mM 트리스-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 50 ㎍/ml BSA 및 1 유니트 T4 리가제에서 일제히 결찰했다. 상기 재구성된 플라스미드를 DH5 알파 수용성 세포내로 형질전환하여 pMON24344 (서열 확인 번호: 7)를 생성했다. 상기 플라스미드 pMON24344를 NcoI 및 HindIII를 이용하여 소화시키고 상기 단편을 Quaex II 겔 추출 키트를 이용하여 분리했다. 상기 pMON24344 NcoI/HindIII 분절을 50 mM 트리스 pH7.5, 10 mM MgCl2, 50 ㎍/ml BSA 및 1 유니트의 T4 리가아제에서 NcoI/HindIII-소화된 디포스포릴화(dephosphorylated) pMON5723 대장균 발현 벡터내로 결찰했다. 상기 결찰된 DNA를 Spec LB 플레이트상에 선별된 MON105 및 분리물내로 형질전환하여 pMON24354(서열 확인 번호:8)을 생성했다. pMON24345를 가지는 대장균 MON105를 10 mg/ml 날리딕스산을 이용하여 유도하고 상기 세포에서 발현된 마우스 엔도스테틴을 SDS-PAGE에 의하여 관찰했다.
실시예 2: 사람의 엔도스테틴을 암호화하는 pMON 20440 (서열 확인 번호: 9)의 구성
5 ㎍의 사람의 RNA (미합중국 캘리포니아주 폴로 알토에 소재한 Clontech Laboratories)를 500 ng의 랜덤 헥사머 프라이머와 혼합하고, 65℃에서 10분간 가열하고, 얼음위에서 2분간 냉각했다. 상기 RNA/프라이머 혼합물에, 20 유니트의 Rnasin (Promega), SuperScript II 완충액, 0.01 M 의 최종 농도까지의 DTT, 0.005M 최종 농도까지의 dNTP 믹스(Boehringer), 및 200 유니트의 SuperScript II 전사효소(Life Technologies Inc.)를 부가했다. 상기 반응물을 42℃에서 1.5 시간동안 배양하고, 70℃에서 5분간 배양하여 상기 효소를 불활성화했다. 2 유니트의 대장균 RNase H (Life Technologies Inc.)를 부가하고 상기 반응물을 37℃에서 20분간 배양하여 RNA를 제거했다. 1.6 mM의 최종 농도까지 dNTPs, 50 pmol의 사람의 5 프라임 엔도스테틴 프라이머 (서열 확인번호: 3), 50 pmol의 사람의 3 프라임 프라이머 (서열확인번호:4), 고적합도 PCR 완충액, 및 2.5 유니트의 고적합도 효소(Boehringer)를 부가하면서 폴리머라아제 사슬 반응시켜서 이중 가닥 DNA를 생성했다. 상기 반응 혼합물을 95℃에서 3분간 배양한 다음, 15초 94℃ 배양, 30초 50℃ 배양, 및 4분 72℃ 배양의 사이클을 10회 반복하고, 15초 94℃ 배양, 30초 50℃ 배양, 및 4분 20초 확장/사이클 72℃ 배양의 사이클을 15회 반복했다. 최종적으로 상기 반응물을 72℃에서 7분간 배양했다.
상기 이중 가닥 DNA를 NcoI 및 HindIII를 이용하여 소화시키고, 50 mM 트리스-HCl pH7.5, 10 mM MgCl2, 50 ㎍/ml BSA 및 1 유니트의 T4 리가아제에서 NcoI/HindIII-소화된 디포스포릴화(dephosphorylated) NcoI/HindIII 대장균 발현 벡터내로 결찰했다. 상기 결찰된 DNA를 Amp LB 플레이트상에 선별된 대장균주 MON105 및 분리물내로 형질전환하여 pMON20440(서열 확인 번호:9)을 생성했다. pMON20440을 가지는 대장균주 MON105를 10 mg/ml 날리딕스산을 이용하여 유도하고 상기 세포에서 발현된 사람의 엔도스테틴을 SDS-PAGE에 의하여 관찰했다.
실시예 3: 마우스 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 방법
모든 단계는 4 ℃에서 수행된다. 마우스 엔도스테틴 봉입체를 6M 우레아, 5mM DTT, 50mM 비스-트리스 프로판, pH 10.8에서 2.5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 상기 용액을 2시간동안 교반한 후 시스테인(원료 0.2M, pH 10.5)을 10 mM까지 부가하였다. 이를 5분간 혼합한 다음, 3.5M 우레아, 100mM 비스-트리스 프로판에서 0.25mg/ml 엔도스테틴 농도까지 희석하였다. 다음에, 60 시간동안 교반하여 반전 위상 HPLC에 의해 평가분석되는 바와 같이 단백질의 리폴딩을 종료하였다. 다른 pH 조건 및 우레아 농도가 사용될 수 있지만, 효율은 더 낮아질 수 있다. 도 3및 4는 변화하는 pH 조건 및 우레아 농도하에서 마우스 엔도스텐틴 리폴딩 생성물의 트레이싱(tracing)을 도시한다. 도 7, 8 및 9는 내피세포 증식 및 세포 이동 평가분석에서 정제된 마우스 엔도스테틴의 억제 활성을 도시한다.
실시예 4: 사람의 엔도스테틴을 리폴딩하기 위한 방법
모든 단계는 4℃에서 수행된다. 사람의 엔도스테틴 봉입체를 10mM 시스테인, 6M 우레아, 50 mM 비스-트리스 프로판, pH 10.8에서 2.5mg/ml 엔도스테틴 농도로 용해시켰다. 상기 용액을 2 시간동안 교반한 후 10 mM 시스테인(원료 0.2M, pH 10.5)을 부가하고 5분간 혼합했다. 다음에, 상기 용액을 3.0M 우레아, 100mM 비스-트리스 프로판, pH 7.5에서 0.25mg/ml 엔도스테틴 농도까지 희석하고 60 시간동안 교반하여 리폴딩 단계를 종료했다. 다른 pH 조건 및 우레아 농도가 사용될 수 있지만, 효율이 저하된다. 도 5 및 도 6은 변화하는 pH 조건 및 우레아 농도에서 사람의 엔도스테틴 리폴딩 생성물의 HPLC 트레이싱을 도시한다. 도 10은 내피 세포 증식 평가분석에서 사람의 정제된 엔도스테틴의 억제 활성을 도시한다.
당업자는 상기에 설명한 본 발명의 가용화, 리폴딩, 및 정제 조건이 세균으로부터 엔도스테틴을 정제하기위한 종래 방법이상으로 극적인 개선을 제공한다는 것을 알 수 있다. 예비임상학적 연구 및 임상학적 시험에서 사용하기 위한 엔도스테틴을 상업적인 규모로 제조하는데는 원하는 생물학적 특성을 가지는 가용성의 적당히 리폴딩된 물질이 막대한 양으로 필요하다. 엔도스테틴이 치료제로서 상업적으로 발전하는데는 모든 이용시에 반응을 나타내는 철저하게 특성화된 물질이 필요하다. 따라서, 가용성의 적당히 리폴딩된 엔도스테틴은 이러한 단백질의 유효성, 효능, 약동학적 특성 및 약물학적 특성의 시험관내 평가분석 및 생체내 연구에서 확인되는 바와 같이 불용성 물질의 현탁액보다 더욱 바람직하다. 상기에 설명된 엔도스테틴을 발현, 가용화, 리폴딩, 정제 및 특성화하기 위한 본 발명의 극적으로 개선된 방법은 에도스테틴, 엔도스테틴 분절, 뮤테인, 인서테인(insertein), 퍼뮤테인, 또는 이들의 키메라뿐 아니라, 이들과, 암을 포함한 맥관형성 장애 치료용 화합물로서 유용하게 사용되는 기타 항맥관형성 단백질 또는 작은 분자와의 접합체(conjugate)를 개발하는데 목표를 둔 차후의 연구를 크게 촉진할 수 있다.
본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허 또는 특허출원의 모든 개시 내용이 본원에 참조로 인용된다.
[표]
표1 : 균주
| 명칭 | 설명 또는 유전자형 | 참조문헌/출처 |
| DH5αTM | F-, phi80 dlacZdeltaM15,delta(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, lambda-, thi-1, gyrA96, relA1 | Life Technologies, Rockville, Maryland |
| DH10B | F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φdlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λrpsL nupG | Life Technologies, Rockville, Maryland |
| JM101(ATCC#33876) | delta(pro lac), supE, thi, F'(traD36, proA+B+, lacIq, lacZdeltaM15) | Yanisch-Perron, et al., Gene, 33: 103-119, 1985 |
| MON105(ATCC#55204) | F-, lambda-,IN(rrnD, rrnE)1, rpoD+, rpoH358 | Obukowicz, et al., Appl. and Envir. Micr., 58: 1511-1523, 1992 |
| TG1 | delta(lac-pro),supE,thi-1, hsdD5/F"(traD36, proA+B+, lacIq, lacZdeltaM15) | Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois |
표 3: 플라스미드
| 플라스미드 | 서열확인번호 | 상품명 | 설명 | 출처 |
| pMON2341 | AmpR | 대장균 recA1 프로모터 및 G10L 리보솜 결합 부위, 클로르암페니콜 아세틸 전사효소 유전자(cat3) 및 ori M13을 함유하는 Amp-내성 대장균 발현 벡터 | Lab collection | |
| pMON5723 | SpecR | 대장균 recA1 프로모터 및 G10L 리보솜 결합 부위를 함유하는 Spec-내성 대장균 발현 벡터 | (Olins 및 Rangwala, Methods Enzymol. 185(Gene Expression Technol.): 115-119, 1990) | |
| pCRII | AmpR | 상업적인 PCR 분절(TA)클론화 벡터 | Invitrogen | |
| pMON24342 | #5 | AmpR | pCRII(TA) 클론화 벡터 + 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 PCR 분절(자연 마우스 콜라겐 XVIII C-말단 포함). pCRII에서의 EcoRI 분절(아미노산 1104-1288) | 본 발명 |
| pMON24343 | #6 | AmpR | pCRII(TA) 클론화 벡터 + 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 PCR 분절(자연 마우스 콜라겐 XVIII C-말단 포함). pCRII에서의 EcoRI 분절(아미노산 1104-1288) | 본 발명 |
| pMON24344 | #7 | AmpR | pCRII(TA) 클론화 벡터 + 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 PCR 분절(자연 마우스 콜라겐 XVIII C-말단 포함). pCRII에서의 EcoRI 분절(아미노산 1104-1288) | 본 발명 |
| pMON24345 | #8 | SpecR | pMON5723 NcoI/HindIII + 마우스 엔도스테틴의 NcoI/HindIII 분절(자연 마우스 콜라겐 XVIII C-말단 포함)(아미노산 1104-1288) | 본 발명 |
| pMON20440 | #9 | SpecR | pMON2341 NcoI/HindIII + 사람의 엔도스테틴을 암호화하는 NcoI/HindIII(사람의 자연 콜라겐 XVIII C-말단 영역 포함) | 본 발명 |
표 3: 서열 확인에 관한 표
| 서열 확인 번호 | 서열 | 설명 |
| 1 | gcgcgcccatggctcatactcatcaggac; | 마우스 엔도스테틴에 대한 5 프라임 PCR 프라이머 |
| 2 | gcgcgcaagcttattatttggagaaagaggtcatgaag; | 마우스 엔도스테틴에 대한 3 프라임 PCR 프라이머 |
| 3 | GCGCGCCCAT GGCTCACAGC CACCGCGACTTCCAGCCGGT GCTCCACCTG GTTGCGCTCAACAGCCCCCT G; | 사람의 엔도스테틴에 대한 5 프라임 PCR 프라이머 |
| 4 | GCGCGCAAGC TTATTACTTG GAGGCAGTCATGAAGCTGTT CTCAATGCAG AGCACGATGTAGGCGTGATG GCAGCTCGC; | 사람의 엔도스테틴에 대한 3 프라임 PCR 프라이머 |
| 5 | 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 pMON42342 EcoR1 삽입물 | |
| 6 | 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 pMON42343 EcoR1 삽입물 | |
| 7 | 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 pMON42344 EcoR1 삽입물 | |
| 8 | 마우스 엔도스테틴을 암호화하는 pMON42345 EcoR1 삽입물 | |
| 9 | 사람의 엔도스테틴을 암호화하는 pMON20440 | |
| 10 | AHTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLSGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRGSVPIVNLKDEVLSPSWDSLFSGSQGQLQPGARIFSFDGRDVLRHPAWPQKSVWHGSDPSGRRLMESYCETWRTETTGATGQASSLLSGRLLEQKAASCHNSYIVLCIENSFMTSFSK; | 마우스 엔도스테틴 아미노산 서열 |
| 11 | AHSHDRFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTA-SK; | 사람의 엔도스테틴 아미노산 서열 |
Claims (49)
- (a) 엔도스테틴(endostatin) 유전자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계와;(b) 상기 유전자 발현 생성물을 회수하는 단계와;(c) 상기 유전자 생성물을 상승된 pH에서 가용화하는 단계와;(d) 상기 가용화된 유전자 생성물을 거의 중성의 pH에서 리폴딩(refolding)하는 단계와;(e) 상기 유전자 생성물의 적당히 폴딩된 형태를 분리하는 단계를 포함하는 엔도스테틴 제조 방법.
- (a) 엔도스테틴 유전자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계와;(b) 상기 유전자 발현 생성물을 회수하는 단계와;(c) 상기 유전자 생성물을 거의 중성의 pH에서 리폴딩하는 단계와;(d) 상기 유전자 생성물의 적당히 폴딩된 형태를 분리하는 단계를 포함하는 엔도스테틴 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 가용화 단계에서 상기 상승된 pH는 약 pH 9 내지 약 pH 11.5인 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 상승된 pH는 약 pH 10 내지 약 pH 11인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 상승된 pH는 약 pH 10.5인 방법.
- 제 1 또는 3항에 있어서, 상기 리폴딩 단계에서 거의 중성 pH는 약 pH 6 내지 약 pH 8.5인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계에서 거의 중성 pH는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계에서 거의 중성 pH는 약 pH 7.5인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계에서 거의 중성 pH는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0인 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계에서 거의 중성 pH는 약 pH 7.5인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용화 단계동안 우레아가 약 4 M 내지 약 10 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 가용화 단계동안 우레아가 약 6 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계동안 우레아가 약 0.5 M 내지 약 5 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계동안 우레아가 약 3.5 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용화 단계동안 구아니딘 히드로클로라이드가 약 2 M 내지 약 8 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 가용화 단계동안 구아니딘 히드로클로라이드가 약 4 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계동안 구아니딘 히드로클로라이드가 약 0.2 M 내지 약 2 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계동안 구아니딘 히드로클로라이드가 약 1.5 M의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 디설파이드 결합을 술포히드릴기로 환원시킬 수 있는 환원제의 존재하에서 수행되는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 환원제는 DTT, BME, 시스테인, 및 환원된 글루타티온으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 DTT는 상기 가용화 단계동안 약 2mM 내지 약 10 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 DTT는 상기 가용화 단계동안 약 5 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 DTT는 상기 리폴딩 단계동안 약 0.2mM 내지 약 2 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 DTT는 상기 리폴딩 단계동안 약 0.5 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 환원된 글루타티온은 상기 가용화 단계동안 약 5 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 상기 환원된 글루타티온은 상기 가용화 단계동안 약 10 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 환원된 글루타티온은 상기 리폴딩 단계동안 약 1 mM 내지 약 4 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 환원된 글루타티온은 상기 리폴딩 단계동안 약 2 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 가용화 단계동안 약 5 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 가용화 단계동안 약 10 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.5 mM 내지 약 4 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 1 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 디설파이드 결합의 상호교환을 강화할 수 있는 물질이 상기 리폴딩 단계동안 존재하는 방법.
- 제 33 항에 있어서, 상기 물질은 시스테인 및 산화된 글루타티온으로부터 선택되는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.2 mM 내지 약 5 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 35 항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 리폴딩 단계동안 약 1 mM의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리폴딩 단계동안 디설파이드 결합이 공기 산화를 통해 형성되는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 상기 공기 산화 단계는 약 12 내지 약 96 시간동안 수행되는 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 공기 산화 단계는 약 24 시간 내지 약 72 시간동안 수행되는 방법.
- 제 39 항에 있어서, 상기 공기 산화 단계는 약 60 시간동안 수행되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 생성물은 상기 가용화 단계동안 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 유전자 생성물은 상기 가용화 단계동안 약 2.5 mg/ml의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 생성물은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 농도로 존재하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 상기 유전자 생성물은 상기 리폴딩 단계동안 약 0.25 mg/ml의 농도로 존재하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 RP-HPLC로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법을 이용하여 상기 엔도스테틴을 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 엔도스테틴 유전자는 사람이 아닌 동물의 엔도스테틴을 암호화하는 DNA로 이루어지는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 엔도스테틴 유전자는 서열확인번호: 5, 서열확인번호: 6, 서열확인번호: 7 및 서열확인번호:8로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 엔도스테틴 유전자는 사람의 엔도스테틴을 암호화하는 DNA로 이루어지는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 엔도스테틴 유전자는 서열확인번호:9로 이루어지는 방법.
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