JPH01199998A - 新規ポリペプチド及びそれをコードするdna - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
本発明は、ヒト インターロイキン1ポリペプチド並び
にそのN末端部及びC末端部の部分欠失体のアミノ酸配
列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させた
アミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコード
するDNA及びそれらの製造法に関する。 インターロイキン1は、単球/マクロファージ細胞をは
じめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質であ
る。ヒト インターロイキン1には、大別してα型とβ
型の二種類の分子が存在することが知られている(Fu
rutani、Y、ら、 NucleicAcids
Res、、 14巻、 3167頁、 1986年;
C1ark、B、D、 。 ら* Nuclalc Ac1ds Res、+ 14
巻、 7897頁、 1986年)、その代表的な作用
として、T細胞及びB細胞に対する分化増殖促進作用、
リンパ球活性化作用、マクロファージの活性化作用、発
熱惹起作用、プロスタグランジンE2の産生誘導作用及
び線維芽細胞の増殖促進作用等が知られており [Oppenheim、 J、J、ら、 Immun
ology Today、 7巻。 45頁、 1986年; Dinarello、C,
A、、 Reviews ofInfectious
Diseases、 6巻、51頁、 1984年]
、生体における免疫機構等の調節因子として、重要な役
割を担っており、医薬品としての臨床応用が期待されて
いる。 α型のヒト インターロイキン1ポリペプチドのN末端
側の1〜14個のアミノ酸及び/又はC末端側の1〜4
個のアミノ酸の欠失体(ヨーロッパ公開特許第0188
920号)やα型のヒトインターロイキン1ポリペプチ
ドのN末端がら36番目のAsnが脱アミド化され、A
spに変化したポリペプチドが知られている(Cama
ron、P、M、ら、J、Exp、 Mad、 、+−
164巻、237頁、 1986年; Wingfie
ld、P。 ら、 Eur、J、 Blochem、、 165
巻、537頁、 19B7.年)。 また、異なる遺伝子に由来し上記α型のヒト インター
ロイキン1ポリペプチドのN末端がら第2番目のSet
がAlaにかわっているポリペプチドも知られている(
March、C,J、ら、 Nature、 315
巻。 641頁、 1985年)、β型のヒト インターロイ
キン1ポリペプチドに関しては、そのN末端側の1〜3
個のアミノ酸及び/又はC末端側の1〜3個のアミノ酸
欠失体が知られている(Mosley、B、ら。 Proc、Natl、Acad、Sc1.TJSA、
84巻、 4572頁、 1987年)。 本発明者等は、ヒトインターロイキン1の構造と生物活
性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチドの
アミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換したポ
リペプチドの特性を検索したところ、まったく意外にも
リンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジンE2
の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを見
い出し、本発明を完成するに至った。 本発明のポリペプチドとしては、α型ヒトインターロイ
キン1の部分的アミノ酸変換体、即ち第1表の式[1]
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並びにそ
のN末端から1〜14残基及び/又はC末端から1〜4
残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチドが
挙げられる。 第1表 Ser W Pro Phe Ser Phe Leu
Ser Asn ValLys Tyr Asn P
he Met Arg Ila Ile Ly
s TyrGlu Phe IIs Leu As
n Asp Ala Leu Asn G1n5er
Ile IIs Arg Ala X Asp
Gin Tyr LeuThr Ala Ala
Ala Leu Hls Asn Leu
Asp GluAla Val Lys Phe
Asp Mat Gly Ala Tyr LysS
er Ser Lys Asp Asp Ala Ly
s IIs Thr Vallle Leu Arg
IIs Ser Lys Thr Gln Leu
TyrVal Thr Ala Gin Asp
Glu Asp Gln Pro ValLeu La
u Lys Glu Met Pro Glu
Ile Pro LysTbr Ile Th
r Gly Ser Glu Thr Asn
Leu LeuPhe Phe Trp Glu
Thr Hls Gly Thr Lys
AsnTyr Phe Thr Ser Val
Ala Hls Pro Asn LeuPh
e IIs Ala Thr Lys Gln A
sp Tyr Trp ValCys Leu Al
a Gly Gly Pro Pro Ser
Ile ThrY Phe Gin Ile
Leu Glu Asn Gln Ala式
[I] 但し、上記式中WはSet又はAlaを意味し、XはA
sn又はAspを意味し、YはAsp以外のアミノ酸を
意味する。 更に、本発明の他のポリペプチドとしては、β型のヒト
インターロイキン1の特定部位のアミノ酸変換体、即ち
第2表の式[11で示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド並びにそのN末端から1〜3残基及び/又はC
末端から1〜3残基のアミノ酸又はペプチドが欠失した
ポリペプチドが挙げられる。 第2表 Ala Pro Val Arg Ser Leu A
sn Cys Thr LeuArg Asp Ser
Gin Gin Lys Ser Leu Val
MetSer Gly Pro Tyr Glu Le
u Lys Ala Leu HlsLau Gin
Gly Gin Asp Met Glu Gln G
in ValVal Phe Sar Met Ser
Phe Val Gin Gly GluGlu S
er Asn Asp Lys Ile Pro Va
l Ala LeuGly Leu Lys Glu
Lys Asn Leu Tyr Leu 5erCy
s Val Leu Lys Asp Asp Lys
Pro Thr LauGln Leu Glu S
er Val Asp Pro Lys Asn Ty
rPro Lys Lys Lys Met Glu
Lys Arg Phe ValPha Asn Ly
s Ile Glu IIs Asn Asn Lys
LeuGlu Phe Glu Ser Ala G
in Phe Pro Asn TrpTyr IIs
Ser Thr Ser Gin Ala Glu
Asn MetPro Val Phe Leu Gl
y Gly Thr Lys Gly GlyGin
Asp Ile Thr Z Phe Thr
Met Gln PheVal Ser Ser 式[■] 但し、上記式中Zは、Asp以外のアミノ酸を意味する
。 本発明の好ましいポリペプチドとしては、第1表の式[
I]に示したアミノ酸配列において、WがSetであり
、XがAsnであり、かつYがTyrであるポリペプチ
ド及び第3表の式[mlに示したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが挙げられる。 第3表 Met Arg IIs IIs Lys Tyr G
lu Phe Ile LauAsn Asp Ala
Leu Asn Gin Ser IIs IIs
ArgAla X Asp Gln Tyr Leu
Thr Ala Ala AlaLeu H3s As
n Leu Asp Glu Ala Val Lys
PheAsp Mat Gly Ala Tyr L
ys Ser Ser Lys AspAsp Ala
Lys Ile Thr Val IIs Lsu
Arg l1eSar Lys Thr Gln Le
u Tyr Val Thr Ala GinAsp
Glu Asp Gln Pro Val Leu L
au Lys GluMet Pro Glu
Ile Pro Lys Thr IIs T
hr GlySer Glu Thr Asn Lau
Leu Phe Phe Trp GluThr
Hls Gly Thr Lys Asn Tyr
Phe Thr 5erVal Ala Hls
Pro Asn Leu Phe IIs Al
a ThrLys Gin Asp Tyr Trp
Val Cyg Leu Ala GlyGly Pr
o Pro Ser Ile Thr Y
Phe Gin Ileeu 式[ml 但し、上記式中XはAsn又はAspを意味し、YはT
yrを意味する。 本発明は、前記のポリペプチドの誘導体にも関する。該
ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの値上の側
鎖官能基、N末端のアミノ基又はC末端のカルボキシル
基を利用して形成される誘導体を意味する0例えばカル
ボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一も
しくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のN−アシ
ル誘導体、ヒドロキシル基の0−アシル誘導体、カルバ
モイル基の水解体又はポリエチレングリコール等による
修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又はア
ミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン
、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。 本発明のポリペプチドは、分子間S−8結合により、更
に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体も
本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポ
リペプチドは産生細胞或は産生条件により、N末端にM
etが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするDNAに
b関する。そのDNAの例としては、第4表で掲げた式
[IV]で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(以下、TN−55ポリペプチドという)をコードする
DNAとして、第5表で掲げた式[A]で示される塩基
配列を有するDNA及びその縮重が挙げられる。 第4表 Ser Ser Pro Phe Ser Phe L
eu Ser Asn VatLys Tyr Asn
Pha Met Arg IIs IIs Ly
s TyrGlu Phe IIs Leu As
n Asp Ala Leu Asn G1n5er
Ile IIs Arg Ala Agn As
p Gin Tyr LeuThr Ala Ala
Ala Leu Hls Asn Leu Asp
GluAla Val Lys Phe Asp M
et Gly Ala Tyr LysSer Ser
Lys Asp Asp Ala Lys Ile
Thr Vallle Leu Arg Ile S
er Lys Thr Gln Leu TyrVal
Thr Ala Gln Asp Glu Asp
Gln Pro ValLeu Lau Lys G
lu Met Pro Glu Ile Pro
LysThr IIs Thr Gly Ser G
lu Thr Asn Leu LeuPhe Phe
Trp Glu Thr )11s Gly Th
r Lys AsnTyr Phe Thr Ser
Val Ala Hls Pro Asn L
euPhe Ile Ala Thr Lys G
ln Asp Tyr Trp ValCys Leu
Ala Gly Gly Pro Pro Se
r Ile ThrTyr Phe Gin I
Is Leu Glu Asn Gin Ala式[
IV] 第5表 GAATTCATCCTGAATGACGCCCTCA
ATCAAAGTATAATTCGAGCCAATGA
TCAGTACCTC式[A] 本発明のポリペプチドをコードするDNAは、公知のヒ
ト インターロイキン1或はそのN末端及び/又はC末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするDNAを
公知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第0188
920号に記載の方法を用いて作製し、これを例えばソ
ングらの方法(Wang、 A、 M、ら、 5cie
nce、 224巻、 1431頁、 1984年)や
クンケルらの方法(Kunke 1 、 T、 A、ら
、 Methodsin Enzymol、、 154
巻、367頁、 1987年)に準じて点変異させ目的
とする本発明のDNAを作製するか、或は適当な制限酵
素によりDNA断片を単離し、目的とする箇所の塩基配
列を人為的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドア
ダプターと結合させることにより、本発明のDNAを製
造することができる。 これらのDNAを当該技術分野で公知の技術により適当
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入し
、これを宿主に導入した形質転換体を培養することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる0例
えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩基
配列を有するDNAの5゛末端に翻訳開始コドンATG
を、かつ3゛末端には終止コドンを有するDNA断片を
作製し、これを適当なプロモーター及びSD配列に続い
て結合させ、更にこれをベクターに組み込むことにより
本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製
することができる。プロモーターとしては、例えばla
c、trp、tac。 L二!s、phoA、PL、SV40初期プロモーター
等が挙げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド
(pBR322等)、ファージ(λフアージ誘導体等)
、ウィルス(SV40等)、ランナウェイプラスミド等
が挙げられる。この本発明のポリペプチド生産用の形質
発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンら
の方法(Cohen、 S、 N、ら、 Proc、
Natl、 Acad、Sci、、 tJsA。 69巻、 2110頁、 1972年)に準じて導入
することにより形質転換体を得ることができる1次いで
、この形質転換体をそれに応じた適当な培養条件、下で
培養することにより、目的とするポリペプチド或はその
N末端にMetが結合したポリペプチドを製造すること
ができる。この培養物を、例えばりゾチーム消化と凍結
融解、超音波破砕、フレンチプレス等により破壊したの
ち、遠心分離又は−過することにより本発明のポリペプ
チド含有抽出液を得ることができる。この抽出液を蛋白
質精製の一般的な精製法、例えば限外r過、透析、電気
泳動、塩析分画、ゲルr過分面、イオン交換クロマトグ
ラフィー、抗体カラムを用いるアフィニティークロマト
グラフィー等に従い精製することにより、本発明のポリ
ペプチドを得ることができる。また、このようにして得
たポリペプチドを化学的に修飾することにより、本発明
のポリペプチドの誘導体を得ることができる。 以下に、本発明のポリペプチドの典型的な例として、第
4表に示したアミノ酸配列を有するTN−55ポリペプ
チドの諸性質について述べる。 試験例I TN−55ポリペプチドの物理化学的性状TN−55ポ
リペプチドの分子量、等電点及び部分アミノ酸配列の分
析結果は、次のとおりであった。 分子Iは、SDSを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定し、18±1kDと求められた0等電
点は、等電点電気泳動法により分析した結果、5.7±
0.2であった0本ポリペブチドを、予め4−ビニルピ
リジンで処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダー
ゼ(和光純薬)を用いて35℃で一夜酵素分解したのち
、シンクロパックRP−P300カラム(SynChr
om社、米国)を用いた高速液体クロマトグラフィーに
より分取したペプチド断片及び蛋白分解酵素未処理の本
ポリペプチドについて、自動アミノ酸配列決定装置(4
70A Protein 5equencer、 Ap
plied B1osystems社、米国)により、
それらのアミノ酸配列を決定した。 蛋白分解酵素未処理のTN−55ポリペプチドを用いて
決定した本ポリペプチドのN末端から第40番目までの
アミノ酸配列は、次のとおりであり、第4表に示したア
ミノ酸配列と完全に一致した。 SerSerProPheSerPheLeuSerA
snValLysTyrAsnPheMatArgIl
elleLysTyrGluPhelleLeuAsn
AspAlaLeuAsnGlnSe r I le
I 1eArgAlaAsnAspG1nTyrLeu
一方、蛋白分解酵素分解により調製した二種類のペプチ
ド断片(LP−10断片とLP−12断片と名付ける)
のアミノ酸配列は、次のとおりであった。 LP−10断片のアミノ酸配列; ThrIleThrGlySerGluThrAsnL
euLeuPhePheTrpGluThrHlsGl
yThrLys LP−12断片のアミノ酸配列: GlnAspTyrTrpVa 1CysLeuA1a
G1yG1yProProSe r I 1eThrT
yrPheGlnI 1eLeuGluAsnGlnA
laこれらLP−10断片とLP−12μl片のアミノ
酸配列は、それぞれ第4表に示したアミノ酸配列のN末
端から第101〜119番目の領域及び第136〜15
9番目の領域のアミノ酸配列と一致した。 試験例2 TN−55ポリペプチドの生物活 (1)リンパ球活性化作用 リンパ球活性化作用を、下記の方法により測定した。即
ち、TN−55ポリペプチド溶液を5%ウシ胎児血清を
含む組織培養用培地RPMI−1640(Flow L
abs、 、米国)にて希釈した。各希釈液の50μl
を96穴平底型プレートの各ウェルに注入し、その各ウ
ェルに20μg / m l濃度のフィトヘマグルチニ
ン−P (Difco Labs、 、米国)の50μ
lを添加し、更にC3H/ Heマウスの胸腺細胞懸濁
液(200万個/m1)の100ulを添加して、5%
炭酸ガス含有空気中37℃で3日間培養した。培養終了
約18時間前に、[3H]−チチミンの1μCiを添加
し、細胞内に取り込まれた
にそのN末端部及びC末端部の部分欠失体のアミノ酸配
列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させた
アミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコード
するDNA及びそれらの製造法に関する。 インターロイキン1は、単球/マクロファージ細胞をは
じめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質であ
る。ヒト インターロイキン1には、大別してα型とβ
型の二種類の分子が存在することが知られている(Fu
rutani、Y、ら、 NucleicAcids
Res、、 14巻、 3167頁、 1986年;
C1ark、B、D、 。 ら* Nuclalc Ac1ds Res、+ 14
巻、 7897頁、 1986年)、その代表的な作用
として、T細胞及びB細胞に対する分化増殖促進作用、
リンパ球活性化作用、マクロファージの活性化作用、発
熱惹起作用、プロスタグランジンE2の産生誘導作用及
び線維芽細胞の増殖促進作用等が知られており [Oppenheim、 J、J、ら、 Immun
ology Today、 7巻。 45頁、 1986年; Dinarello、C,
A、、 Reviews ofInfectious
Diseases、 6巻、51頁、 1984年]
、生体における免疫機構等の調節因子として、重要な役
割を担っており、医薬品としての臨床応用が期待されて
いる。 α型のヒト インターロイキン1ポリペプチドのN末端
側の1〜14個のアミノ酸及び/又はC末端側の1〜4
個のアミノ酸の欠失体(ヨーロッパ公開特許第0188
920号)やα型のヒトインターロイキン1ポリペプチ
ドのN末端がら36番目のAsnが脱アミド化され、A
spに変化したポリペプチドが知られている(Cama
ron、P、M、ら、J、Exp、 Mad、 、+−
164巻、237頁、 1986年; Wingfie
ld、P。 ら、 Eur、J、 Blochem、、 165
巻、537頁、 19B7.年)。 また、異なる遺伝子に由来し上記α型のヒト インター
ロイキン1ポリペプチドのN末端がら第2番目のSet
がAlaにかわっているポリペプチドも知られている(
March、C,J、ら、 Nature、 315
巻。 641頁、 1985年)、β型のヒト インターロイ
キン1ポリペプチドに関しては、そのN末端側の1〜3
個のアミノ酸及び/又はC末端側の1〜3個のアミノ酸
欠失体が知られている(Mosley、B、ら。 Proc、Natl、Acad、Sc1.TJSA、
84巻、 4572頁、 1987年)。 本発明者等は、ヒトインターロイキン1の構造と生物活
性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチドの
アミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換したポ
リペプチドの特性を検索したところ、まったく意外にも
リンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジンE2
の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを見
い出し、本発明を完成するに至った。 本発明のポリペプチドとしては、α型ヒトインターロイ
キン1の部分的アミノ酸変換体、即ち第1表の式[1]
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並びにそ
のN末端から1〜14残基及び/又はC末端から1〜4
残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチドが
挙げられる。 第1表 Ser W Pro Phe Ser Phe Leu
Ser Asn ValLys Tyr Asn P
he Met Arg Ila Ile Ly
s TyrGlu Phe IIs Leu As
n Asp Ala Leu Asn G1n5er
Ile IIs Arg Ala X Asp
Gin Tyr LeuThr Ala Ala
Ala Leu Hls Asn Leu
Asp GluAla Val Lys Phe
Asp Mat Gly Ala Tyr LysS
er Ser Lys Asp Asp Ala Ly
s IIs Thr Vallle Leu Arg
IIs Ser Lys Thr Gln Leu
TyrVal Thr Ala Gin Asp
Glu Asp Gln Pro ValLeu La
u Lys Glu Met Pro Glu
Ile Pro LysTbr Ile Th
r Gly Ser Glu Thr Asn
Leu LeuPhe Phe Trp Glu
Thr Hls Gly Thr Lys
AsnTyr Phe Thr Ser Val
Ala Hls Pro Asn LeuPh
e IIs Ala Thr Lys Gln A
sp Tyr Trp ValCys Leu Al
a Gly Gly Pro Pro Ser
Ile ThrY Phe Gin Ile
Leu Glu Asn Gln Ala式
[I] 但し、上記式中WはSet又はAlaを意味し、XはA
sn又はAspを意味し、YはAsp以外のアミノ酸を
意味する。 更に、本発明の他のポリペプチドとしては、β型のヒト
インターロイキン1の特定部位のアミノ酸変換体、即ち
第2表の式[11で示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド並びにそのN末端から1〜3残基及び/又はC
末端から1〜3残基のアミノ酸又はペプチドが欠失した
ポリペプチドが挙げられる。 第2表 Ala Pro Val Arg Ser Leu A
sn Cys Thr LeuArg Asp Ser
Gin Gin Lys Ser Leu Val
MetSer Gly Pro Tyr Glu Le
u Lys Ala Leu HlsLau Gin
Gly Gin Asp Met Glu Gln G
in ValVal Phe Sar Met Ser
Phe Val Gin Gly GluGlu S
er Asn Asp Lys Ile Pro Va
l Ala LeuGly Leu Lys Glu
Lys Asn Leu Tyr Leu 5erCy
s Val Leu Lys Asp Asp Lys
Pro Thr LauGln Leu Glu S
er Val Asp Pro Lys Asn Ty
rPro Lys Lys Lys Met Glu
Lys Arg Phe ValPha Asn Ly
s Ile Glu IIs Asn Asn Lys
LeuGlu Phe Glu Ser Ala G
in Phe Pro Asn TrpTyr IIs
Ser Thr Ser Gin Ala Glu
Asn MetPro Val Phe Leu Gl
y Gly Thr Lys Gly GlyGin
Asp Ile Thr Z Phe Thr
Met Gln PheVal Ser Ser 式[■] 但し、上記式中Zは、Asp以外のアミノ酸を意味する
。 本発明の好ましいポリペプチドとしては、第1表の式[
I]に示したアミノ酸配列において、WがSetであり
、XがAsnであり、かつYがTyrであるポリペプチ
ド及び第3表の式[mlに示したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが挙げられる。 第3表 Met Arg IIs IIs Lys Tyr G
lu Phe Ile LauAsn Asp Ala
Leu Asn Gin Ser IIs IIs
ArgAla X Asp Gln Tyr Leu
Thr Ala Ala AlaLeu H3s As
n Leu Asp Glu Ala Val Lys
PheAsp Mat Gly Ala Tyr L
ys Ser Ser Lys AspAsp Ala
Lys Ile Thr Val IIs Lsu
Arg l1eSar Lys Thr Gln Le
u Tyr Val Thr Ala GinAsp
Glu Asp Gln Pro Val Leu L
au Lys GluMet Pro Glu
Ile Pro Lys Thr IIs T
hr GlySer Glu Thr Asn Lau
Leu Phe Phe Trp GluThr
Hls Gly Thr Lys Asn Tyr
Phe Thr 5erVal Ala Hls
Pro Asn Leu Phe IIs Al
a ThrLys Gin Asp Tyr Trp
Val Cyg Leu Ala GlyGly Pr
o Pro Ser Ile Thr Y
Phe Gin Ileeu 式[ml 但し、上記式中XはAsn又はAspを意味し、YはT
yrを意味する。 本発明は、前記のポリペプチドの誘導体にも関する。該
ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの値上の側
鎖官能基、N末端のアミノ基又はC末端のカルボキシル
基を利用して形成される誘導体を意味する0例えばカル
ボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一も
しくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のN−アシ
ル誘導体、ヒドロキシル基の0−アシル誘導体、カルバ
モイル基の水解体又はポリエチレングリコール等による
修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又はア
ミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン
、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。 本発明のポリペプチドは、分子間S−8結合により、更
に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体も
本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポ
リペプチドは産生細胞或は産生条件により、N末端にM
etが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするDNAに
b関する。そのDNAの例としては、第4表で掲げた式
[IV]で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(以下、TN−55ポリペプチドという)をコードする
DNAとして、第5表で掲げた式[A]で示される塩基
配列を有するDNA及びその縮重が挙げられる。 第4表 Ser Ser Pro Phe Ser Phe L
eu Ser Asn VatLys Tyr Asn
Pha Met Arg IIs IIs Ly
s TyrGlu Phe IIs Leu As
n Asp Ala Leu Asn G1n5er
Ile IIs Arg Ala Agn As
p Gin Tyr LeuThr Ala Ala
Ala Leu Hls Asn Leu Asp
GluAla Val Lys Phe Asp M
et Gly Ala Tyr LysSer Ser
Lys Asp Asp Ala Lys Ile
Thr Vallle Leu Arg Ile S
er Lys Thr Gln Leu TyrVal
Thr Ala Gln Asp Glu Asp
Gln Pro ValLeu Lau Lys G
lu Met Pro Glu Ile Pro
LysThr IIs Thr Gly Ser G
lu Thr Asn Leu LeuPhe Phe
Trp Glu Thr )11s Gly Th
r Lys AsnTyr Phe Thr Ser
Val Ala Hls Pro Asn L
euPhe Ile Ala Thr Lys G
ln Asp Tyr Trp ValCys Leu
Ala Gly Gly Pro Pro Se
r Ile ThrTyr Phe Gin I
Is Leu Glu Asn Gin Ala式[
IV] 第5表 GAATTCATCCTGAATGACGCCCTCA
ATCAAAGTATAATTCGAGCCAATGA
TCAGTACCTC式[A] 本発明のポリペプチドをコードするDNAは、公知のヒ
ト インターロイキン1或はそのN末端及び/又はC末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするDNAを
公知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第0188
920号に記載の方法を用いて作製し、これを例えばソ
ングらの方法(Wang、 A、 M、ら、 5cie
nce、 224巻、 1431頁、 1984年)や
クンケルらの方法(Kunke 1 、 T、 A、ら
、 Methodsin Enzymol、、 154
巻、367頁、 1987年)に準じて点変異させ目的
とする本発明のDNAを作製するか、或は適当な制限酵
素によりDNA断片を単離し、目的とする箇所の塩基配
列を人為的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドア
ダプターと結合させることにより、本発明のDNAを製
造することができる。 これらのDNAを当該技術分野で公知の技術により適当
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入し
、これを宿主に導入した形質転換体を培養することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる0例
えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩基
配列を有するDNAの5゛末端に翻訳開始コドンATG
を、かつ3゛末端には終止コドンを有するDNA断片を
作製し、これを適当なプロモーター及びSD配列に続い
て結合させ、更にこれをベクターに組み込むことにより
本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製
することができる。プロモーターとしては、例えばla
c、trp、tac。 L二!s、phoA、PL、SV40初期プロモーター
等が挙げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド
(pBR322等)、ファージ(λフアージ誘導体等)
、ウィルス(SV40等)、ランナウェイプラスミド等
が挙げられる。この本発明のポリペプチド生産用の形質
発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンら
の方法(Cohen、 S、 N、ら、 Proc、
Natl、 Acad、Sci、、 tJsA。 69巻、 2110頁、 1972年)に準じて導入
することにより形質転換体を得ることができる1次いで
、この形質転換体をそれに応じた適当な培養条件、下で
培養することにより、目的とするポリペプチド或はその
N末端にMetが結合したポリペプチドを製造すること
ができる。この培養物を、例えばりゾチーム消化と凍結
融解、超音波破砕、フレンチプレス等により破壊したの
ち、遠心分離又は−過することにより本発明のポリペプ
チド含有抽出液を得ることができる。この抽出液を蛋白
質精製の一般的な精製法、例えば限外r過、透析、電気
泳動、塩析分画、ゲルr過分面、イオン交換クロマトグ
ラフィー、抗体カラムを用いるアフィニティークロマト
グラフィー等に従い精製することにより、本発明のポリ
ペプチドを得ることができる。また、このようにして得
たポリペプチドを化学的に修飾することにより、本発明
のポリペプチドの誘導体を得ることができる。 以下に、本発明のポリペプチドの典型的な例として、第
4表に示したアミノ酸配列を有するTN−55ポリペプ
チドの諸性質について述べる。 試験例I TN−55ポリペプチドの物理化学的性状TN−55ポ
リペプチドの分子量、等電点及び部分アミノ酸配列の分
析結果は、次のとおりであった。 分子Iは、SDSを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定し、18±1kDと求められた0等電
点は、等電点電気泳動法により分析した結果、5.7±
0.2であった0本ポリペブチドを、予め4−ビニルピ
リジンで処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダー
ゼ(和光純薬)を用いて35℃で一夜酵素分解したのち
、シンクロパックRP−P300カラム(SynChr
om社、米国)を用いた高速液体クロマトグラフィーに
より分取したペプチド断片及び蛋白分解酵素未処理の本
ポリペプチドについて、自動アミノ酸配列決定装置(4
70A Protein 5equencer、 Ap
plied B1osystems社、米国)により、
それらのアミノ酸配列を決定した。 蛋白分解酵素未処理のTN−55ポリペプチドを用いて
決定した本ポリペプチドのN末端から第40番目までの
アミノ酸配列は、次のとおりであり、第4表に示したア
ミノ酸配列と完全に一致した。 SerSerProPheSerPheLeuSerA
snValLysTyrAsnPheMatArgIl
elleLysTyrGluPhelleLeuAsn
AspAlaLeuAsnGlnSe r I le
I 1eArgAlaAsnAspG1nTyrLeu
一方、蛋白分解酵素分解により調製した二種類のペプチ
ド断片(LP−10断片とLP−12断片と名付ける)
のアミノ酸配列は、次のとおりであった。 LP−10断片のアミノ酸配列; ThrIleThrGlySerGluThrAsnL
euLeuPhePheTrpGluThrHlsGl
yThrLys LP−12断片のアミノ酸配列: GlnAspTyrTrpVa 1CysLeuA1a
G1yG1yProProSe r I 1eThrT
yrPheGlnI 1eLeuGluAsnGlnA
laこれらLP−10断片とLP−12μl片のアミノ
酸配列は、それぞれ第4表に示したアミノ酸配列のN末
端から第101〜119番目の領域及び第136〜15
9番目の領域のアミノ酸配列と一致した。 試験例2 TN−55ポリペプチドの生物活 (1)リンパ球活性化作用 リンパ球活性化作用を、下記の方法により測定した。即
ち、TN−55ポリペプチド溶液を5%ウシ胎児血清を
含む組織培養用培地RPMI−1640(Flow L
abs、 、米国)にて希釈した。各希釈液の50μl
を96穴平底型プレートの各ウェルに注入し、その各ウ
ェルに20μg / m l濃度のフィトヘマグルチニ
ン−P (Difco Labs、 、米国)の50μ
lを添加し、更にC3H/ Heマウスの胸腺細胞懸濁
液(200万個/m1)の100ulを添加して、5%
炭酸ガス含有空気中37℃で3日間培養した。培養終了
約18時間前に、[3H]−チチミンの1μCiを添加
し、細胞内に取り込まれた
【3H】−チミジン量を計測
した。陰性対照には、供試試料のかわりに5%ウシ胎児
血清を含むRPMI−1640培地を添加した系におけ
るマウスの胸!!細胞培養時の[3H]−チミジン取り
込み量を示した。第6表に示すごとく、強いリンパ球活
性化作用を認めた。 (以下余白) 第6表 陰性対照 6.740 (2)プロスタグランジンE2産生誘導能TN−55ポ
リペプチドのヒト骨肉腫細胞MG−63細胞(Amer
ican Type Ca1l Co11ection
CRL1427)を標的細胞とするプロスタグランジ
ンE2産生誘導能を、前記のリンパ球活性化作用の測定
に用いた同じ試料原液を用い、以下の方法に従って測定
した。即ち、TN−55ポリペプチド溶液を10%0%
ウシ胎清、非必須アミノ酸及びピルビン酸ナトリウムを
含む組織培養用培地MEMア−ル液(Flow Lab
s、)にて希釈した。 各希釈液の100μmを24穴
平底型プレートの各ウェルに注入し、更に各ウェル当り
約2万個のMG−63細胞を含む細胞懸濁液の400μ
lを添加して、5%炭酸ガス含有空気中37℃で48時
間培培養た。培養終了後、培養上清を採取しその上清中
のプロスタグランジンE2含量を、RIAキット(E、
1.duPont da Nemours & Co
、 、 米国)を用いて測定した。陰性対照には、供
試試料のかわりに上記の培養液を添加した系におけるM
G−63細胞の培養上清中のプロスタグランジンE2f
fiを示した。 第7表に示すごとく、プロスタグランジンE2産生誘導
能は殆ど認められなかった。 第7表 の最終希釈倍数 産生遊離量(ng/m1)500
0、36 5、800 0.30 50、000 0.1B 500、000 0.1B 5、000.800 0.2150、000
.000 0.1B陰性対照
0.18 以上の結果から、TN−55ポリペプチドは、強いリン
パ球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロス
タグランジンE2産生誘導能は認められず、極めて特徴
的な特性を有するポリペプチドであることが証明された
。 尚、本明細書では記載の簡略化のなめに以下の略号を使
用する。 A アデニン Cシトシン G グアニン T チミン DNA デオキシリボ核酸 CDNA 相補cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA ATP アデノシン三リン酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸dCTP
デオキシシチジン三リン酸dGTP デオキシ
グアノシン三リン酸dTTP デオキシチミジン三
リン酸bp 塩基対 kbp キロ塩基対 kD キロダルトン SDS ラウリル硫酸ナトリウム以下に実施例を
挙げて本発明を更に具体的に説明する。。 (以下余白) 実施例I TN−55ボ1ペプ ドの 口 前記第4表の式[IV]で示されるアミノ酸配列を有す
るTN−55ポリペプチドを以下の方法で製造した。 (1)形質発現プラスミドの構築 参考例2に記載の組み換え体プラスミドpHIP312
ECを出発材5料として用い、このプラスミドDNA中
のヒトインターロイキン1ポリペプチドのC末端から第
9番目のアミノ酸(Asp)をコードするコドン(G
A C)を、クンケルらの方法(Kunke l 、
T、 A、ら、 Methods in Enzymo
l、、 154巻。 367頁、 1987年)に準じた部位特異的変異誘導
法によりチロシンに対応するコドンTACに変換するこ
とにより、TN−55ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミド(pHTN55)を構築した。 その構築方法は以下のとおりであり、部位特異的変異誘
導には、MtlTA−GENEインビトロムタジェネシ
スキット(Bio−Rad Labs、 、米国)を用
いた。 即ち、プラスミドpHIP312Ecを制限酵素pvu
I[とHindnIにて消化し、ヒト インターロイキ
ン1ポリペプチドをコードする領域及び大腸菌トリプト
ファンプロモーター領域を含むDNA断片を単離した。 このDNA断片を、M13mp19ベクターの制限酵素
HindmとHincll認識部位間に挿入した。この
組み換え体DNAを大腸菌JM105株に感染させ、こ
れを培養して該ファージを採取した0次いで、このファ
ージを大腸菌CJ236株に感染させるとともに、ウリ
ジン(1μg/ml)及びクロラムフェニコール(20
)t g/ml)を含有する2 X T Y培地[組成
:1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%塩化
ナトリウム]中、37℃で5時間培養し、その培養上清
からファージDNAを精製分離した。培養容量10m1
当り、約2μgのファージDNAが得られた。 別途、下記式[B]、で示される塩基配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。 5°−CTATCACTTACTTTCA−3′[B]
この塩基配列は、第8表の塩基配列において第787番
目の塩基を除いて、第779〜794番目の配列と一致
する。この化学合成りNAを変異誘導プライマーという
。 この変異誘導プライマーの5′末端にリン酸基を付加し
、このプライマーを先に調製したファージDNAとアニ
ール[r液[組成:2mM塩化マグネシウム及び50m
M塩化ナトリウムを含む20mM)リス塩酸緩衝液(p
H7,4)]中、70℃で10分間反応させのち、1分
間に1℃の割合で30℃まで徐々に冷却し、ブライマー
をファージDNAに結合させた0次いで、T4DNAポ
リメラーゼ!及びT4DNAリガーゼを用いてdGTP
、dATP、dCTP、dTTP及びATP等の存在下
で、ファージDNAに対して相補的なりNAを合成し環
状二本fiDNAとした。これを大腸菌JM105株に
感染させ、各クローンについてそれぞれ培養し、その培
養菌体から複製型二本鎖DNAを単離した。その塩基配
列は、培養上清から単離した単鎖DNAを用いて蛋白翻
訳領域を中心に塩基配列を決定し、TN−55ポリペプ
チドをコードする塩基配列を有していることを確認した
0次いで、複製型二本鎖DNAから制限酵素HpaIと
XhoIによる消化にて、該蛋白翻訳領域を含むDNA
断片を切り出した。このDNA断片を、TN−55DN
A断片という。 別途、参考例1に記載の組み換え体プラスミドpHlP
H383aから制限酵素旦J2j−I とXhoI
を用いて、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点を含
む大きなりNA断片を切り出し、これを上記のTN−5
5DNA断片とT4DNAリガーゼを用いて結合させる
ことにより、形質発現プラスミドp HTN 55を構
築した。 この形質発現プラスミドp HTN 55を、次の方法
に従って大腸菌H8101株に導入し形質転換体を作製
した。即ち、大腸菌H8101株をLB培地[組成:1
%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウ
ム(p)(7,5)]に接種し、30℃で一夜培養した
。その菌体懸濁液の1mlを100m1のLB培地に接
種し、濁度(波長600nmの吸光度)が約0.6に達
するまで、30℃で培養した。この培養液を氷水中で3
0分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。 この菌体を50m1の50mM塩化カルシウム液中に再
懸濁させ、氷水中で60分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取し20%グリセリンを含む50mM塩化カ
ルシウム液の10m1に懸濁させた。この懸濁液に上記
の形質発現プラスミドpHTN55を添加し、氷水中で
20分間、室温で10分間反応させたのち、LB培地を
添加して37℃で60分間振盪培養した。その菌体懸濁
液の一定量を、25μg/ml濃度のアンピシリンを含
むLB寒天平板(寒天濃度1.5%)に播き、37℃で
一夜培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このア
ンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体をHBIOI
/p)(TM01と名付け、TN−55ポリペプチドの
生産菌とした。 (2)TN−55ポリペプチドの製造 第1項で得たTN−55ポリペプチド生産菌HB10t
/P)ITN55を、LB培地にて37℃で−後培養し
たのち、その菌体懸濁液を約100倍量の栄養培地[組
成:1.5%リン酸二ナトリウム・12水塩、0.3%
リン酸−カリウム、0.1%塩化アンモニウム、2 m
g / 1ビタミンB1.0.5%カザミノ酸、2m
M硫酸マグネシウム、0.1mM塩化カルシウム、1%
トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム
、0.4%グリセリン]に接種し、更にインドール−3
−アクリル酸を最終濃度20μg / m 1になるよ
うに添加したのち28時間培養した。菌体を遠心分離に
より採取し、0.1%リゾチーム及び30mM塩化ナト
リウムを含む50mM)リス塩酸緩衝液(p H8,0
)に懸濁させた。氷水中で30分間靜靜置たのちドライ
アイス/エタノール浴での凍結と37℃での融解を繰り
返して菌体を破壊した。 これに1150容量の10%ポリエチレンイミンを加え
て静置ののち遠心分離にて菌体残金等を除いた抽出液を
得た。この抽出液に硫酸アンモニウムを最終70%飽和
になるように添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を
採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、5mMリン酸
塩緩衝化生理食塩液(pH6,5)[以下、PBSと記
す]に対して透析したのちセファクリルS−200カラ
ム(Pharmacia、スウェーデン)を用いるゲル
沢過に付した9分子量約15〜20kDの溶出位置に相
当する画分からTN−55ポリペプチドを含む溶出液を
爪め、これを予めPBSにて平衡化したDEAE−セフ
ァロースCL−6Bカラム(Pharmacia)に負
荷し、PBSにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たTN−55ポリペプチドを、PBS中0〜0.5Mの
塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出したところ、TN−5
5ポリペプチドの計算分子量と一致する分子量を有する
ポリペプチドが、二分画に分離されて溶出された。低濃
度の塩化ナトリウムで溶出された画分をTN−55(a
)ポリペプチド画分と名付け、より高い塩化ナトリウム
濃度で溶出された画分をTN−55(b)ポリペプチド
画分と名付けた。 TN−55(a)ポリペプチド画分をPBSに対して透
析したのち、予めPBSにて平衡化したS−セファロー
スファーストフローカラム(Pharmacia)に負
荷し、PBSにてカラムを洗浄し、次いでPBS中0〜
0.25Mの塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出した。T
N−55(a)ポリペプチド画分を集め限外濾過にて濃
縮したのち、トヨパールHW−55カラム(東ソー)を
用いるゲル濾過により精製し、最終的に5DS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認めない高
度精製品を得た。 ここで得たTN−55(a)ポリペプチド画分から精製
分離したポリペプチドを、前記試験例(1)及び(2)
に供した。 前記試験例の結果等により、このポリペプチドが目的と
するT没−55ポリペプチドであると結論された。 実施例2 TN−55ポリペプチドの脱アミド体の製造TN−55
ポリペプチドのアミノ酸配列中、N末端から第36番目
のアミノ酸がAspに変化したポリペプチド(T N
−55Aspポリペプチドという)を以下の方法により
分離精製した。 実施例1第2項に記載したDEAE−セファロースCL
−6Bカラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩
化ナトリウム濃度で溶出されたTN−55(b)ポリペ
プチド画分に含まれるポリペプチドを、実施例1第2項
記載の方法に準じて精製した。即ち、S−セファロース
ファーストフローカラムクロマトグラフィー及びトヨ
パールHW−55カラムを用いるゲルー過により精製し
、高度精製品を得た。 このTN−55(b)ポリペプチド画分から単離精製し
たポリペプチドのアミノ酸配列を、N末端から順次エド
マン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのN
末端から40番目までのアミノ酸配列は、次のとおりで
あった。 SerSerProPheSerPheLeuSerA
snValLysTyrAsnPheMetArgIl
elleLysTyrGluPhelleLeuAsn
AspAlaLeuAsnGlnSerI le I
leArgAlaAspAspGlnTyrL、eu即
ち、N末端から第36番目のアミノ酸はAspと同定さ
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、TN
55Aspポリペプチドであると結論された。尚、
このTN−55Aspポリペプチドの等電点は、等電点
電気泳動法により5.4±0.2と求められた。 実施例3 T N −55(141)ポリペプチドの製造前記第3
表の式[I11]に示したアミノ酸配列を有するポリペ
プチド(但し、第3表中のX !、tAsnであり、Y
はTyrである)、即ちTN−55ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中、N末端から14残基のへブチド及びC末端
から4残基のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応
するポリペプチド[TN −55(141)ポリペプチ
ドという]を以下の方法により分離精製した。 (1)形質発現プラスミドの構築 ヨーロッパ公開特許第0188920号に記載の方法で
得たヒト インターロイキン1前駆体ポリペプチドをコ
ードするクローン化cDNAが組み込まれた組み換え体
プラスミドpHL4から、制限酵素PstIによる消化
にて、cDNA領域を切り出した。このcDNAがコー
ドするヒトインターロイキン1前駆体ポリペプチドのア
ミノ酸配列及びその塩基配列を第8表に示す、このクロ
ーン化cDNAから、制限酵素EcoRIとm96 I
による消化にて、第8表に示した塩基配列の第398〜
769番目までに相当するDNA断片を単離した。 このDNA断片に、下記の式[C]及び[D]で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを7
4DNAリガーゼを用いて結合させた。 式[C]及び[D]の化学合成オリゴヌクレオチドアダ
プターの塩基配列は、次の通りである。 ここで得られたDNA断片を、I L 1 (141)
l!lr片という。 形質発現ベクターpEP302を、古谷らの方法(Fu
rutani、Y、ら、 Nuclelc Ac1ds
Res、、 13巻、5869頁、 1985年)
に従って作製し、これを制限酵素mIとBamHIにて
消化し、大腸菌トリプトファンプロモーター領域部分及
びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりNA断片を単
離した。この断片に下記式[Elで示される化学合成オ
リゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガーゼを用
いて結合させた。 更に、この得られたDNA断片を、上記のIL 1 (
141)断片と、T4DNAリガーゼを用いて結合させ
ることにより、TN−55(141)ポリペプチド生産
用の形質発現プラスミドを構築した(図1参照)、この
形質発現プラスミドをpHTN 55 (141)と名
付けた。 (2) TN 55 (141)ポリペプチドの製造
第1項で作製した形質発現プラスミドをpHTN 55
(141)を用いて実施例1に記載した方法に準じて
、形質転換体を作製し、その培養菌体よりT N −5
5(141)ポリペプチドを分離精製した。 得られたT N −55(141)ポリペプチド精製品
について、そのN末端部分のアミノ酸配列をエドマン分
解法により分析した結果、そのN末端から第40番目ま
でのアミノ酸配列は、次のとおりであり、前記第3表の
式[11[]に示したアミノ酸配列と一致した(但し、
第3表中のXはAsnである)。 MatArgIleIleLysTyrG1uPheI
leLauAsnAspA1aLeuAsnG1nSe
rlleIleArgA1aAsnAspGlnTyr
LeuThrA1aAlaA1aLeuH35AsnL
euAspG1uA1aVa ILysPheまた、カ
ルボキシペプチダーゼ酵素分解及びアミノ酸分析の結果
では、ロイシンが検出された。 このT N −55(141)ポリペプチドの精製過程
中、実施例2に示したと同様により酸性側の等電点を有
する脱アミド体の存在を1ii認した。その脱アミド体
ポリペプチドのアミノ酸配列分析の結果から、N末端か
ら第22番目のアミノ酸がAspに変化していることを
確認した。 T N −55(141)ポリペプチドの等電点は5.
4±0.2であり、その脱アミド体ポリペプチドの等電
点は5.2±0.2と求められた。 参考例1 形質発現プラスミドpHlPH383aの構築ヒト イ
ンターロイキン1前駆体ポリペプチドをコードするクロ
ーン化CDNA(第8表参照)が組み込まれた組み換え
体プラスミドpHL4から、制限酵素PstIによる消
化にて、cDNA領域を切り出した。このクローン化c
DNAから、制限酵素EcoRIとBstNIにて消化
し、第8表に示した塩基配列の第398〜808番目ま
でに相当するDNA断片を単離した。 このDNA断片に、下記の式[F]及び[Glで示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT
4DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
DNA断片を、SD−IL1断片という、但し、式[F
]の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、下
記式[a]〜〔8]で示される5種類のDNA断片を、
順次結合させて作製したDNAアダプターである(以下
、化学合成りNA[F]と記す)。 5’−AACTAGTACGCAAGTTCAC[a]
3’−TTGATCATGCGTTCAAGTGCAT
T5’−GTAAAAGGAGGTTTAAA
[b]3’−TTCCT
CCAAATTTAATAC5’−TTATGTCAT
CACCTTTTAG
[c13’−AGTAGTGGAAAATCGAAG
G3’−CTAGTAGTTTATGCTTAA式[G
lの化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。 別途に、形質発現ベクターpEP302を、制限酵素旦
り立IとBamHIにて消化し、大腸菌トリプトファン
プロモーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含
む大きなりNA断片(以下、ベクター断片という)を単
離した。このベクター断片と上記の5D−ILL断片を
、T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、
ヒト インターロイキン1ポリペプチド生産用の形質発
現プラスミドを構築した(第2図参照)。 この形質発現プラスミドをpHlPH383aと名付け
た。 参考例2 多 プラスミド HIP312ECの 築プラスミ
ドpBR322を、制限酵素AvalとPvunにて消
化し、得られた大きなりNA断片(約3.7 k b
p >を単離した。このDNA断片の両端を、DNAポ
リメラーゼI(クレノーフラグメント)及びdGTP、
dATP、dCTP、dTTPを用いて平滑末端とした
のちT4DNAリガーゼにて結合させ、pBR322の
複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させたプラス
ミドベクター(pBRS6という)を作製した。 このプラスミドベクターpBR36を、制限酵素F、c
oRIにて消化し、直鎖状DNAとしたのち、その両端
をDNAポリメラーゼエ(クレノーフラグメント)及び
dGTP、dATP、dCTP、dTTPを用いて平滑
末端とした。このDNA断片の両端に、下記式[H]で
示されるオリゴヌクレオチド リンカ−をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。 化学合成リンカ−の塩基配列は、次の通りである。 5′−CCTCGAGG−3°
[H]次いで、得られたDNA断片を制限酵素Pst工
とXhoIにより消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子
を含む大きなりNA断片を単離した。このDNA断片を
、pBR86−断片という。 別途、参考例1に記載した組み換え体プラスミドpHl
PH383aを、制限酵素Pst I とXhoIに
より消化し、ヒト インターロイキン1ポリペプチドを
コードする領域を含むDNA断片を単離した。このDN
A断片を、上記のpBR86−断片と結合させることに
より、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するヒト イン
ターロイキン1ポリペプチド生産用形質発現プラスミド
を構築した(第3図参照)。 この形質発現プラスミドをpHI P312ECと名付
けた。 (以下余白) 第8表 ヒトインターロイキン1(α型)前駆体ポリペプチドを
゛コードするcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列 ATGGCCAAAGTTCCAGACATGTTTG
AAGAC(30)CTGAAGAACTGTTACA
GTGAAAATGAAGA’A (60)GACAG
TTCCTCCATTGATCATCTGTCTCTG
(90)AATCAGAAATCCTTCTATCA
TGTAAGCTAT (120)GGCCCACTC
CATGAAGGCTGCATGGATCAA (15
0)TCTGTGTCTCTGAGTATCTCTGA
AACCTCT (180)AAAACATCCAAG
CTTACCTTCAAGGAGAGC(210)Ls
uLysLysArgArgLeuSe rLeuse
rGlnCTGAAGAAGAGACGGTTGAG
TTTAAGCCAA (270)ThrValIle
LeuArglleSsrLysThrGlnACCG
TGATTCTAAGAATCTCAAAAAC:TC
AA(570)LeuTyrValThrAlaGln
AspGluAspGlnTTGTATGTGACTG
CCCAAGATGAAGACCAA(600)Pro
VallauLeuLygGluMetProGluI
leCCAGTGCTGCTGAAGGAGATGCC
TGAGATA(630)ProLysThrlleT
hrGlySerGluThrAgnCCCAAAAC
CATCACAGGTAGTGAGACCAAC(66
0)LeuLeuPhePheTrpGluThrH1
sG1yThrCTCCTCTTCTTCTGGGA八
ACTCACGGCACT(690)LysAsnTy
rPheThrSerValAlaHlsPr。 AAGAACTATTTCACATCAGTTGCCC
ATCCA(720)AsnLeuPhelleAla
ThrLysGlnAspTyrAACTTGTTTA
TTGCCACAAAGCAAGACTAC(750)
TrpValCysLeuAlaGlyGlyProP
roSerTGGGTGTGCTTGGCAGGGGG
GCCACCCTCT(780)11eThrAspP
heGln11eLsuGluAsnG1nATCAC
TGACTTTCAGATACTGGAAAACCAG
(810)Ali*** CGTAG 零本本は、翻訳終止コドンを意味する。 (以下余白)
した。陰性対照には、供試試料のかわりに5%ウシ胎児
血清を含むRPMI−1640培地を添加した系におけ
るマウスの胸!!細胞培養時の[3H]−チミジン取り
込み量を示した。第6表に示すごとく、強いリンパ球活
性化作用を認めた。 (以下余白) 第6表 陰性対照 6.740 (2)プロスタグランジンE2産生誘導能TN−55ポ
リペプチドのヒト骨肉腫細胞MG−63細胞(Amer
ican Type Ca1l Co11ection
CRL1427)を標的細胞とするプロスタグランジ
ンE2産生誘導能を、前記のリンパ球活性化作用の測定
に用いた同じ試料原液を用い、以下の方法に従って測定
した。即ち、TN−55ポリペプチド溶液を10%0%
ウシ胎清、非必須アミノ酸及びピルビン酸ナトリウムを
含む組織培養用培地MEMア−ル液(Flow Lab
s、)にて希釈した。 各希釈液の100μmを24穴
平底型プレートの各ウェルに注入し、更に各ウェル当り
約2万個のMG−63細胞を含む細胞懸濁液の400μ
lを添加して、5%炭酸ガス含有空気中37℃で48時
間培培養た。培養終了後、培養上清を採取しその上清中
のプロスタグランジンE2含量を、RIAキット(E、
1.duPont da Nemours & Co
、 、 米国)を用いて測定した。陰性対照には、供
試試料のかわりに上記の培養液を添加した系におけるM
G−63細胞の培養上清中のプロスタグランジンE2f
fiを示した。 第7表に示すごとく、プロスタグランジンE2産生誘導
能は殆ど認められなかった。 第7表 の最終希釈倍数 産生遊離量(ng/m1)500
0、36 5、800 0.30 50、000 0.1B 500、000 0.1B 5、000.800 0.2150、000
.000 0.1B陰性対照
0.18 以上の結果から、TN−55ポリペプチドは、強いリン
パ球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロス
タグランジンE2産生誘導能は認められず、極めて特徴
的な特性を有するポリペプチドであることが証明された
。 尚、本明細書では記載の簡略化のなめに以下の略号を使
用する。 A アデニン Cシトシン G グアニン T チミン DNA デオキシリボ核酸 CDNA 相補cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA ATP アデノシン三リン酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸dCTP
デオキシシチジン三リン酸dGTP デオキシ
グアノシン三リン酸dTTP デオキシチミジン三
リン酸bp 塩基対 kbp キロ塩基対 kD キロダルトン SDS ラウリル硫酸ナトリウム以下に実施例を
挙げて本発明を更に具体的に説明する。。 (以下余白) 実施例I TN−55ボ1ペプ ドの 口 前記第4表の式[IV]で示されるアミノ酸配列を有す
るTN−55ポリペプチドを以下の方法で製造した。 (1)形質発現プラスミドの構築 参考例2に記載の組み換え体プラスミドpHIP312
ECを出発材5料として用い、このプラスミドDNA中
のヒトインターロイキン1ポリペプチドのC末端から第
9番目のアミノ酸(Asp)をコードするコドン(G
A C)を、クンケルらの方法(Kunke l 、
T、 A、ら、 Methods in Enzymo
l、、 154巻。 367頁、 1987年)に準じた部位特異的変異誘導
法によりチロシンに対応するコドンTACに変換するこ
とにより、TN−55ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミド(pHTN55)を構築した。 その構築方法は以下のとおりであり、部位特異的変異誘
導には、MtlTA−GENEインビトロムタジェネシ
スキット(Bio−Rad Labs、 、米国)を用
いた。 即ち、プラスミドpHIP312Ecを制限酵素pvu
I[とHindnIにて消化し、ヒト インターロイキ
ン1ポリペプチドをコードする領域及び大腸菌トリプト
ファンプロモーター領域を含むDNA断片を単離した。 このDNA断片を、M13mp19ベクターの制限酵素
HindmとHincll認識部位間に挿入した。この
組み換え体DNAを大腸菌JM105株に感染させ、こ
れを培養して該ファージを採取した0次いで、このファ
ージを大腸菌CJ236株に感染させるとともに、ウリ
ジン(1μg/ml)及びクロラムフェニコール(20
)t g/ml)を含有する2 X T Y培地[組成
:1.6%トリプトン、1%酵母エキス、0.5%塩化
ナトリウム]中、37℃で5時間培養し、その培養上清
からファージDNAを精製分離した。培養容量10m1
当り、約2μgのファージDNAが得られた。 別途、下記式[B]、で示される塩基配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。 5°−CTATCACTTACTTTCA−3′[B]
この塩基配列は、第8表の塩基配列において第787番
目の塩基を除いて、第779〜794番目の配列と一致
する。この化学合成りNAを変異誘導プライマーという
。 この変異誘導プライマーの5′末端にリン酸基を付加し
、このプライマーを先に調製したファージDNAとアニ
ール[r液[組成:2mM塩化マグネシウム及び50m
M塩化ナトリウムを含む20mM)リス塩酸緩衝液(p
H7,4)]中、70℃で10分間反応させのち、1分
間に1℃の割合で30℃まで徐々に冷却し、ブライマー
をファージDNAに結合させた0次いで、T4DNAポ
リメラーゼ!及びT4DNAリガーゼを用いてdGTP
、dATP、dCTP、dTTP及びATP等の存在下
で、ファージDNAに対して相補的なりNAを合成し環
状二本fiDNAとした。これを大腸菌JM105株に
感染させ、各クローンについてそれぞれ培養し、その培
養菌体から複製型二本鎖DNAを単離した。その塩基配
列は、培養上清から単離した単鎖DNAを用いて蛋白翻
訳領域を中心に塩基配列を決定し、TN−55ポリペプ
チドをコードする塩基配列を有していることを確認した
0次いで、複製型二本鎖DNAから制限酵素HpaIと
XhoIによる消化にて、該蛋白翻訳領域を含むDNA
断片を切り出した。このDNA断片を、TN−55DN
A断片という。 別途、参考例1に記載の組み換え体プラスミドpHlP
H383aから制限酵素旦J2j−I とXhoI
を用いて、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点を含
む大きなりNA断片を切り出し、これを上記のTN−5
5DNA断片とT4DNAリガーゼを用いて結合させる
ことにより、形質発現プラスミドp HTN 55を構
築した。 この形質発現プラスミドp HTN 55を、次の方法
に従って大腸菌H8101株に導入し形質転換体を作製
した。即ち、大腸菌H8101株をLB培地[組成:1
%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウ
ム(p)(7,5)]に接種し、30℃で一夜培養した
。その菌体懸濁液の1mlを100m1のLB培地に接
種し、濁度(波長600nmの吸光度)が約0.6に達
するまで、30℃で培養した。この培養液を氷水中で3
0分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。 この菌体を50m1の50mM塩化カルシウム液中に再
懸濁させ、氷水中で60分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取し20%グリセリンを含む50mM塩化カ
ルシウム液の10m1に懸濁させた。この懸濁液に上記
の形質発現プラスミドpHTN55を添加し、氷水中で
20分間、室温で10分間反応させたのち、LB培地を
添加して37℃で60分間振盪培養した。その菌体懸濁
液の一定量を、25μg/ml濃度のアンピシリンを含
むLB寒天平板(寒天濃度1.5%)に播き、37℃で
一夜培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このア
ンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体をHBIOI
/p)(TM01と名付け、TN−55ポリペプチドの
生産菌とした。 (2)TN−55ポリペプチドの製造 第1項で得たTN−55ポリペプチド生産菌HB10t
/P)ITN55を、LB培地にて37℃で−後培養し
たのち、その菌体懸濁液を約100倍量の栄養培地[組
成:1.5%リン酸二ナトリウム・12水塩、0.3%
リン酸−カリウム、0.1%塩化アンモニウム、2 m
g / 1ビタミンB1.0.5%カザミノ酸、2m
M硫酸マグネシウム、0.1mM塩化カルシウム、1%
トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム
、0.4%グリセリン]に接種し、更にインドール−3
−アクリル酸を最終濃度20μg / m 1になるよ
うに添加したのち28時間培養した。菌体を遠心分離に
より採取し、0.1%リゾチーム及び30mM塩化ナト
リウムを含む50mM)リス塩酸緩衝液(p H8,0
)に懸濁させた。氷水中で30分間靜靜置たのちドライ
アイス/エタノール浴での凍結と37℃での融解を繰り
返して菌体を破壊した。 これに1150容量の10%ポリエチレンイミンを加え
て静置ののち遠心分離にて菌体残金等を除いた抽出液を
得た。この抽出液に硫酸アンモニウムを最終70%飽和
になるように添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を
採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、5mMリン酸
塩緩衝化生理食塩液(pH6,5)[以下、PBSと記
す]に対して透析したのちセファクリルS−200カラ
ム(Pharmacia、スウェーデン)を用いるゲル
沢過に付した9分子量約15〜20kDの溶出位置に相
当する画分からTN−55ポリペプチドを含む溶出液を
爪め、これを予めPBSにて平衡化したDEAE−セフ
ァロースCL−6Bカラム(Pharmacia)に負
荷し、PBSにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たTN−55ポリペプチドを、PBS中0〜0.5Mの
塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出したところ、TN−5
5ポリペプチドの計算分子量と一致する分子量を有する
ポリペプチドが、二分画に分離されて溶出された。低濃
度の塩化ナトリウムで溶出された画分をTN−55(a
)ポリペプチド画分と名付け、より高い塩化ナトリウム
濃度で溶出された画分をTN−55(b)ポリペプチド
画分と名付けた。 TN−55(a)ポリペプチド画分をPBSに対して透
析したのち、予めPBSにて平衡化したS−セファロー
スファーストフローカラム(Pharmacia)に負
荷し、PBSにてカラムを洗浄し、次いでPBS中0〜
0.25Mの塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出した。T
N−55(a)ポリペプチド画分を集め限外濾過にて濃
縮したのち、トヨパールHW−55カラム(東ソー)を
用いるゲル濾過により精製し、最終的に5DS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認めない高
度精製品を得た。 ここで得たTN−55(a)ポリペプチド画分から精製
分離したポリペプチドを、前記試験例(1)及び(2)
に供した。 前記試験例の結果等により、このポリペプチドが目的と
するT没−55ポリペプチドであると結論された。 実施例2 TN−55ポリペプチドの脱アミド体の製造TN−55
ポリペプチドのアミノ酸配列中、N末端から第36番目
のアミノ酸がAspに変化したポリペプチド(T N
−55Aspポリペプチドという)を以下の方法により
分離精製した。 実施例1第2項に記載したDEAE−セファロースCL
−6Bカラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩
化ナトリウム濃度で溶出されたTN−55(b)ポリペ
プチド画分に含まれるポリペプチドを、実施例1第2項
記載の方法に準じて精製した。即ち、S−セファロース
ファーストフローカラムクロマトグラフィー及びトヨ
パールHW−55カラムを用いるゲルー過により精製し
、高度精製品を得た。 このTN−55(b)ポリペプチド画分から単離精製し
たポリペプチドのアミノ酸配列を、N末端から順次エド
マン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのN
末端から40番目までのアミノ酸配列は、次のとおりで
あった。 SerSerProPheSerPheLeuSerA
snValLysTyrAsnPheMetArgIl
elleLysTyrGluPhelleLeuAsn
AspAlaLeuAsnGlnSerI le I
leArgAlaAspAspGlnTyrL、eu即
ち、N末端から第36番目のアミノ酸はAspと同定さ
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、TN
55Aspポリペプチドであると結論された。尚、
このTN−55Aspポリペプチドの等電点は、等電点
電気泳動法により5.4±0.2と求められた。 実施例3 T N −55(141)ポリペプチドの製造前記第3
表の式[I11]に示したアミノ酸配列を有するポリペ
プチド(但し、第3表中のX !、tAsnであり、Y
はTyrである)、即ちTN−55ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中、N末端から14残基のへブチド及びC末端
から4残基のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応
するポリペプチド[TN −55(141)ポリペプチ
ドという]を以下の方法により分離精製した。 (1)形質発現プラスミドの構築 ヨーロッパ公開特許第0188920号に記載の方法で
得たヒト インターロイキン1前駆体ポリペプチドをコ
ードするクローン化cDNAが組み込まれた組み換え体
プラスミドpHL4から、制限酵素PstIによる消化
にて、cDNA領域を切り出した。このcDNAがコー
ドするヒトインターロイキン1前駆体ポリペプチドのア
ミノ酸配列及びその塩基配列を第8表に示す、このクロ
ーン化cDNAから、制限酵素EcoRIとm96 I
による消化にて、第8表に示した塩基配列の第398〜
769番目までに相当するDNA断片を単離した。 このDNA断片に、下記の式[C]及び[D]で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを7
4DNAリガーゼを用いて結合させた。 式[C]及び[D]の化学合成オリゴヌクレオチドアダ
プターの塩基配列は、次の通りである。 ここで得られたDNA断片を、I L 1 (141)
l!lr片という。 形質発現ベクターpEP302を、古谷らの方法(Fu
rutani、Y、ら、 Nuclelc Ac1ds
Res、、 13巻、5869頁、 1985年)
に従って作製し、これを制限酵素mIとBamHIにて
消化し、大腸菌トリプトファンプロモーター領域部分及
びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりNA断片を単
離した。この断片に下記式[Elで示される化学合成オ
リゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガーゼを用
いて結合させた。 更に、この得られたDNA断片を、上記のIL 1 (
141)断片と、T4DNAリガーゼを用いて結合させ
ることにより、TN−55(141)ポリペプチド生産
用の形質発現プラスミドを構築した(図1参照)、この
形質発現プラスミドをpHTN 55 (141)と名
付けた。 (2) TN 55 (141)ポリペプチドの製造
第1項で作製した形質発現プラスミドをpHTN 55
(141)を用いて実施例1に記載した方法に準じて
、形質転換体を作製し、その培養菌体よりT N −5
5(141)ポリペプチドを分離精製した。 得られたT N −55(141)ポリペプチド精製品
について、そのN末端部分のアミノ酸配列をエドマン分
解法により分析した結果、そのN末端から第40番目ま
でのアミノ酸配列は、次のとおりであり、前記第3表の
式[11[]に示したアミノ酸配列と一致した(但し、
第3表中のXはAsnである)。 MatArgIleIleLysTyrG1uPheI
leLauAsnAspA1aLeuAsnG1nSe
rlleIleArgA1aAsnAspGlnTyr
LeuThrA1aAlaA1aLeuH35AsnL
euAspG1uA1aVa ILysPheまた、カ
ルボキシペプチダーゼ酵素分解及びアミノ酸分析の結果
では、ロイシンが検出された。 このT N −55(141)ポリペプチドの精製過程
中、実施例2に示したと同様により酸性側の等電点を有
する脱アミド体の存在を1ii認した。その脱アミド体
ポリペプチドのアミノ酸配列分析の結果から、N末端か
ら第22番目のアミノ酸がAspに変化していることを
確認した。 T N −55(141)ポリペプチドの等電点は5.
4±0.2であり、その脱アミド体ポリペプチドの等電
点は5.2±0.2と求められた。 参考例1 形質発現プラスミドpHlPH383aの構築ヒト イ
ンターロイキン1前駆体ポリペプチドをコードするクロ
ーン化CDNA(第8表参照)が組み込まれた組み換え
体プラスミドpHL4から、制限酵素PstIによる消
化にて、cDNA領域を切り出した。このクローン化c
DNAから、制限酵素EcoRIとBstNIにて消化
し、第8表に示した塩基配列の第398〜808番目ま
でに相当するDNA断片を単離した。 このDNA断片に、下記の式[F]及び[Glで示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT
4DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
DNA断片を、SD−IL1断片という、但し、式[F
]の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、下
記式[a]〜〔8]で示される5種類のDNA断片を、
順次結合させて作製したDNAアダプターである(以下
、化学合成りNA[F]と記す)。 5’−AACTAGTACGCAAGTTCAC[a]
3’−TTGATCATGCGTTCAAGTGCAT
T5’−GTAAAAGGAGGTTTAAA
[b]3’−TTCCT
CCAAATTTAATAC5’−TTATGTCAT
CACCTTTTAG
[c13’−AGTAGTGGAAAATCGAAG
G3’−CTAGTAGTTTATGCTTAA式[G
lの化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。 別途に、形質発現ベクターpEP302を、制限酵素旦
り立IとBamHIにて消化し、大腸菌トリプトファン
プロモーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含
む大きなりNA断片(以下、ベクター断片という)を単
離した。このベクター断片と上記の5D−ILL断片を
、T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、
ヒト インターロイキン1ポリペプチド生産用の形質発
現プラスミドを構築した(第2図参照)。 この形質発現プラスミドをpHlPH383aと名付け
た。 参考例2 多 プラスミド HIP312ECの 築プラスミ
ドpBR322を、制限酵素AvalとPvunにて消
化し、得られた大きなりNA断片(約3.7 k b
p >を単離した。このDNA断片の両端を、DNAポ
リメラーゼI(クレノーフラグメント)及びdGTP、
dATP、dCTP、dTTPを用いて平滑末端とした
のちT4DNAリガーゼにて結合させ、pBR322の
複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させたプラス
ミドベクター(pBRS6という)を作製した。 このプラスミドベクターpBR36を、制限酵素F、c
oRIにて消化し、直鎖状DNAとしたのち、その両端
をDNAポリメラーゼエ(クレノーフラグメント)及び
dGTP、dATP、dCTP、dTTPを用いて平滑
末端とした。このDNA断片の両端に、下記式[H]で
示されるオリゴヌクレオチド リンカ−をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。 化学合成リンカ−の塩基配列は、次の通りである。 5′−CCTCGAGG−3°
[H]次いで、得られたDNA断片を制限酵素Pst工
とXhoIにより消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子
を含む大きなりNA断片を単離した。このDNA断片を
、pBR86−断片という。 別途、参考例1に記載した組み換え体プラスミドpHl
PH383aを、制限酵素Pst I とXhoIに
より消化し、ヒト インターロイキン1ポリペプチドを
コードする領域を含むDNA断片を単離した。このDN
A断片を、上記のpBR86−断片と結合させることに
より、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するヒト イン
ターロイキン1ポリペプチド生産用形質発現プラスミド
を構築した(第3図参照)。 この形質発現プラスミドをpHI P312ECと名付
けた。 (以下余白) 第8表 ヒトインターロイキン1(α型)前駆体ポリペプチドを
゛コードするcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列 ATGGCCAAAGTTCCAGACATGTTTG
AAGAC(30)CTGAAGAACTGTTACA
GTGAAAATGAAGA’A (60)GACAG
TTCCTCCATTGATCATCTGTCTCTG
(90)AATCAGAAATCCTTCTATCA
TGTAAGCTAT (120)GGCCCACTC
CATGAAGGCTGCATGGATCAA (15
0)TCTGTGTCTCTGAGTATCTCTGA
AACCTCT (180)AAAACATCCAAG
CTTACCTTCAAGGAGAGC(210)Ls
uLysLysArgArgLeuSe rLeuse
rGlnCTGAAGAAGAGACGGTTGAG
TTTAAGCCAA (270)ThrValIle
LeuArglleSsrLysThrGlnACCG
TGATTCTAAGAATCTCAAAAAC:TC
AA(570)LeuTyrValThrAlaGln
AspGluAspGlnTTGTATGTGACTG
CCCAAGATGAAGACCAA(600)Pro
VallauLeuLygGluMetProGluI
leCCAGTGCTGCTGAAGGAGATGCC
TGAGATA(630)ProLysThrlleT
hrGlySerGluThrAgnCCCAAAAC
CATCACAGGTAGTGAGACCAAC(66
0)LeuLeuPhePheTrpGluThrH1
sG1yThrCTCCTCTTCTTCTGGGA八
ACTCACGGCACT(690)LysAsnTy
rPheThrSerValAlaHlsPr。 AAGAACTATTTCACATCAGTTGCCC
ATCCA(720)AsnLeuPhelleAla
ThrLysGlnAspTyrAACTTGTTTA
TTGCCACAAAGCAAGACTAC(750)
TrpValCysLeuAlaGlyGlyProP
roSerTGGGTGTGCTTGGCAGGGGG
GCCACCCTCT(780)11eThrAspP
heGln11eLsuGluAsnG1nATCAC
TGACTTTCAGATACTGGAAAACCAG
(810)Ali*** CGTAG 零本本は、翻訳終止コドンを意味する。 (以下余白)
第1図は、形質発現プラスミドp HTN 55(14
1)の構築工程を示す0図中の合成りNAアダプター[
C]、[D]及び[E]は、実施例3に記載した化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターである。 第2図は、形質発現プラスミドp HI P H383
aの構築工程を示す1図中の合成りNAアダプター[F
]と[G]は、参考例1に記載した化学合成オリゴヌク
レオチドアダプターである。 第3図は、形質発現プラスミドpHI P312ECの
構築工程を示す0図中の合成りNAリンカ−[H]は、
参考例2に記載した化学合成オリゴヌクレオチド リン
カ−である。 特許出願人 大日本製薬株式会社
1)の構築工程を示す0図中の合成りNAアダプター[
C]、[D]及び[E]は、実施例3に記載した化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターである。 第2図は、形質発現プラスミドp HI P H383
aの構築工程を示す1図中の合成りNAアダプター[F
]と[G]は、参考例1に記載した化学合成オリゴヌク
レオチドアダプターである。 第3図は、形質発現プラスミドpHI P312ECの
構築工程を示す0図中の合成りNAリンカ−[H]は、
参考例2に記載した化学合成オリゴヌクレオチド リン
カ−である。 特許出願人 大日本製薬株式会社
Claims (6)
- (1)下記式[ I ]で示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド又はそのN末端側の1 〜14個のアミノ酸及び/又はC末端側の 1〜4個のアミノ酸が欠失したポリペプチ ド。 【遺伝子配列があります】 式[ I ] 式中WはSer又はAlaを意味し、XはAsn又はA
spを意味し、YはAsp以外のアミノ酸を意味する。 - (2)下記式[III]で示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 式[III] 式中XはAsn又はAspを意味し、YはAsp以外の
アミノ酸を意味する。 - (3)特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の式[
I ]又は[III]で示されるアミノ酸 配列中、YがTyrであるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド。 - (4)下記式[II]で示されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド又はそのN末端側の1 〜3個のアミノ酸及び/又はC末端側の1 〜3個のアミノ酸欠失したポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 式[II] 式中Zは、Asp以外のアミノ酸を意味する。 - (5)特許請求の範囲第1項〜4項のいずれかに記載の
ポリペプチドをコードするDNA。 - (6)特許請求の範囲第5項記載のDNAを組み込んだ
細胞を培養することを特徴とする 特許請求の範囲第1項〜4項記載のポリペ プチドの製造法。
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KR1019890001221A KR960016705B1 (ko) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | 신규폴리펩티드 및 그것을 코우드하는 dna |
AT89301007T ATE108207T1 (de) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Polypeptide und dafür kodierende dna. |
ES89301007T ES2059717T3 (es) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Nuevos polipeptidos y adn codante para estos. |
EP89301007A EP0327360B1 (en) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Novel polypeptides and DNA encoding said polypeptides |
DE68916559T DE68916559T2 (de) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Polypeptide und dafür kodierende DNA. |
US07/681,077 US5290917A (en) | 1988-02-03 | 1991-04-05 | Modified polypeptides of IL-1α |
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