FR2667601A1 - Polypeptides derives de l'interleukine-1 beta, procede de preparation et utilisation, notamment dans le cadre des pathologies osteoarticulaires. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux dérivés inhibiteurs de certains effets de l'interleukine-1 beta, un procédé microbiologigue pour leur préparation, et des compositions pharmaceutiques les comprenant, utilisables dans le cadre des pathologies ostéoarticulaires.

Description

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides dérivés de l'interleukine-1 béta humaine (IL1B). Plus particulièrement, elle concerne des polypeptides capables d'inhiber certaines activités de l'IL1ss humaine, et à ce titre, utilisables pharmacologiquement, comme antagonistes sélectifs de l'IL1ss. L'invention concerne également un procédé de préparation microbiologique de ces polypeptides, le matériel génétique impliqué dans ce procédé (séquences d'ADN, plasmides, cellules hôtes), ainsi que des compositions pharmaceutiques comprenant ces polypeptides comme principe actif.

L'interleukine-1 beta est une cytokine sécrétée notamment par les macrophages, qui joue un rôle déterminant dans le développement de la réponse immunitaire. Cette activité s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs membranaires présents à la surface des lymphocytes, et intervient au niveau de l'activation et de la différenciation lymphocytaire.

Mais, en raison de la diversité des cellules cibles de l'ILIB, cette molécule possède également d'autres activités. Ainsi, elle est capable d'induire la prolifération des fibroblastes, et d'induire ou de stimuler la production de médiateurs ou d'enzymes (PAF, prostaglandines, protéases, histamine ..) chez les cellules endothéliales, les chondrocytes, les fibroblastes et les basophiles.

Par ailleurs, sur les polynucléaires neutrophiles, elle facilite le processus d'activation, processus qui s'accompagne d'une libération de médiateurs lipidiques et de protéases. Elle est encore capable d'agir sur les centres thermorégulateurs, sur la moelle osseuse, sur le foie, pour stimuler la synthèse protéique ou la maturation des leucocytes. Toutes ces activités de l'IL1ss expliquent son rôle important dans le développement de la réponse inflammatoire et dans la régulation du métabolisme des cartilages. Plus précisément dans ce dernier cas, un effet de l'IL1ss a été observé aussi bien sur la synthèse des protéines du tissu conjonctif (anabolisme) que sur leur dégradation (catabolisme).

Ainsi, du fait de ses nombreuses propriétés, l'ILlB est devenue une cible pharmacologique privilégiée, et de nombreux travaux sont effectués dans le but d'utiliser cette molécule à des fins thérapeutiques.

Toutefois, les interférences entre les multiples activités de l'ILlB sont grandes. Ainsi, l'IL1B produite localement par un macrophage peut aussi bien interagir avec un lymphocyte T qu'avec un chondrocyte, et ainsi stimuler le système immunitaire ou la production de protéases neutres (protéoglycanase, collagénase ..) qui vont augmenter le catabolisme des cartilages. De même, les relations entre la réponse pro-inflammatoire et la réponse immunitaire ne peuvent être dissociées. De ce fait, l'utilisation de l'IL1B dans le but de stimuler le système immunitaire risque d'engendrer parallèlement une réaction inflammatoire.

Réciproquement, l'emploi d'un inhibiteur de l'IL1B pour réduire une réaction inflammatoire ou une lésion des cartilages risque d'avoir un effet associé immunodépressif.

Dans ces conditions, l'existence de multiples propriétés constitue également un inconvénient important, qui limite les conditions d'utilisation thérapeutique de l'ILlJ3.

Pour tenter de remédier à cet inconvénient, différents mutants de 1'IL1B ont été produits.

On connait en particulier le brevet EP 276 778, qui décrit des dérivés de l'IL1B portant des modifications sur les 4 premiers acides aminés N-terminaux, et dont l'activité est altérée.

Le brevet EP 237 967 décrit également une panoplie de molécules dérivées de l'IL1ss, présentant différents profils d'activité, et notamment des molécules présentant des mutations sur des résidus cystéine situés dans des feuillets ss de la molécule.

Toutefois, aucun des mutants décrits dans ces documents ne présente de spécificité suffisante vis-à-vis d'une activité de l'IL1ss. De plus, il existe généralement une bonne corrélation entre les activités biologiques des analogues étudiés et leur affinité pour les récepteurs, ce qui indique que les différents fonctions biologiques de ces molécules ne sont pas dissociées.

Plus récemment enfin, ont été mis en évidence des antagonistes potentiels naturels de l'1L113. Il s'agit d'un récepteur soluble d'IL1 (Sims et al; Science vol 241, 1988) et d'un inhibiteur antagoniste des IL1 (Eisenberg et al; Nature, vol 343, 1990).

Toutefois, le premier n'est pas spécifique d'un type cellulaire donné, et, compte tenu du pléiotropisme de l'IL1ss, risque de présenter des effets secondaires importants (immunodéficience). Il en va de même avec le second qui se fixe aux récepteurs des lymphocytes T.

Dans ces conditions, il n'existe pas de molécules suffisamment sélectives, permettant de dissocier les différentes activités de l'IL1ss pour une meilleure utilisation pharmacologique.

La demanderesse a maintenant mis au point des analogues de l'IL1ss capables d'inhiber sélectivement l'activité sur le métabolisme des cartilages, sans interférer avec le système immunitaire.

Un objet de l'invention réside donc dans des polypeptides dérivés de 1'IL113 humaine, caractérisés en ce qu'ils possèdent la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'TLII3 humaine sur le métabolisme des cartilages.

Au sens de la présente invention, l'effet sur le métabolisme des cartilages comprend aussi bien l'effet sur le catabolisme que sur l'anabolisme, ainsi que déterminé dans les exemples. De même, selon l'invention, l'effet sélectif des dérivés de l'invention signifie qu'ils présentent, vis à vis des cellules de l'immunité, et des lymphocytes T plus particulièrement, une affinité inférieure à l'IL1ss mature.

Les polypeptides de l'invention dérivent de l'IL1ss par modifications de la structure primaire, selon une stratégie visant à dissocier les propriétés de la molécule. En particulier, les polypeptides selon la présente invention dérivent de l'1L16 par modifications structurales à l'intérieur ou proches de boucles.

L'IL1ss est en effet une protéine de classe structurale ss, constituée de 12 feuillets ss reliés entre eux par des boucles. Voir notamment la structure publiée par Priestle et al., EMBO J. Vol 7, 339 (1988), représentée sur la figure 1. Il a maintenant été trouvé que les boucles de la molécule sont des régions sensibles, susceptibles de jouer un rôle dans les interactions extramoléculaires. De ce fait, il est particulièrement avantageux de modifier la structure de 1'IL1B en se focalisant sur ces régions, ou sur des résidus proches. Encore plus particulièrement, les modifications structurales portent sur les boucles situées entre les feuillets 4-5, 5-6, 7-8, 10-11 et 11-12 représentées figure 1, ou sur des résidus proches de ces boucles.

Préférentiellement, la ou les modifications de la structure primaire sont des mutations, ponctuelles ou non, des additions ou des délétions d'un ou plusieurs acides aminés.

Les modifications de structure primaire opérées ont ainsi permis de dissocier les activités de 1'IL1B. La spécificité obtenue permet dès lors d'augmenter les potentialités thérapeutiques des molécules, puisqu'il devient possible d'inhiber sélectivement certains effets de l'IL1ss tout en conservant l'activité recherchée.

Parmi les polypeptides répondant aux caractéristiques de l'invention, on peut citer plus particulièrement les polypeptides:
- (63Ser;65Ser)-IL1ss, c'est à dire un dérivé de l'IL1ss dans lequel les résidus lysine aux positions 63 et 65 sont remplacés par des résidus serine,
- (126Ala; 128Ala)-IL1ss, c'est à dire un dérive de l'IL1ss dans lequel les résidus glutamine et acide glutamique respectivement aux positions 126 et 128 sont remplacés par des résidus alanine,
- o(50Gly-51Gly)-IL1ss, c'est à dire un dérivé de l'IL1ss dans lequel les résidus glycine 50 et 51 ont été délétés.

Par ailleurs, les dérivés selon la présente invention comprennent également tous les fragments des polypeptides décrits ci-dessus, c'est à dire les fragments des polypeptides dérivés de l'IL113 possèdant la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'IL113 humaine sur le métabolisme des cartilages. Ces fragments peuvent être obtenus de plusieurs façons, en particulier par clivage des polypeptides ou par expression directe de gènes tronqués.

La sélectivité des dérivés de l'invention a été étudiée sur différents paramètres, reflétant les fonctions immunitaire, inflammatoire et de régulation du métabolisme des cartilages.

Les différentes activités des polypeptides de l'invention sont présentées dans les exemples.

Un autre objet de l'invention réside dans les séquences d'ADN codant pour les polypetides ou les fragments de polypeptides ayant les caractéristiques définies ci-dessus. Préférentiellement, il s'agit de séquences d'ADN comprenant tout ou partie d'une séquence choisie parmi celles présentées à la figure 2a,b,c.

L'obtention et la purification de ces séquences sont décrites dans les exemples.

L'invention a également pour objet les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une ou plusieurs séquences d'ADN définies ci-dessus. Il peut en particulier s'agir de vecteurs intégratifs ou autoréplicatifs. Dans ces vecteurs, la ou les séquences d'ADN peuvent être placées sous le contrôle de séquences permettant leur expression, et éventuellement leur sécrétion. Le choix du type de vecteur et des signaux d'expression peut en particulier dépendre de l'hôte choisi. Plusieurs exemples de ces vecteurs sont donnés ultérieurement.

L'invention a aussi pour objet les cellules recombinées contenant un vecteur de clonage et/ou d'expression tel que défini ci-dessus. Notamment, il peut s'agir aussi bien de cellules végétales qu'animales, eucaryotes que procaryotes, dès lors que ces cellules sont capables d'exprimer une protéine hétérologue. Ces cellules peuvent être obtenues par conjugaison, transformation, électroporation, ou tout autre technique permettant d'introduire un fragment d'ADN dans une cellule.

L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de polypeptides ou de fragments de polypeptides ayant les caractéristiques définies ci-avant, procédé caractérisé en ce que l'on cultive une cellule telle que ci-dessus dans des conditions d'expression et on récupère les produits obtenus.

Enfin, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs polypeptides tels que définis plus haut ou des fragments de ces polypeptides, associés à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions trouvent application notamment dans le cadre des pathologies ostéoarticulaires (arthrose, ...).

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

DESCRIPTION DES FIGURES
- La figure 1 représente la structure tridimensionnelle de l'IL1ss, telle que décrite par Priestle et coll précitée,
- La figure 2 représente les séquences nucléotidiques
a) du gène synthétique complet de l'IL1ss,
b) du dérivé de l'IL113 (63Ser;65Ser)-IL1B,
c) du dérivé de l'IL1ss (126Ala; 128lla)-IL1ss,
d) du dérivé de l'IL1ss ô(50Gly-51Gly)-IL113.

- La figure 3 décrit la structure de vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant les séquences d'ADN de la figure 2 sous le contrôle de séquences permettant leur expression,
- Le tableau 1 rassemble les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'IL1ss sur la réaction immunitaire,
- Le tableau 2 rassemble les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'IL113 sur la réaction inflammatoire et sur l'hématopoièse,
- Les tableaux 3 et 4 réunissent les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'IL1B sur le métabolisme des cartilages.

I. PREPARATION DES DERIVES
A - Construction du gène de l'IL1B
Un gène codant pour l'IL113 entièrement synthétique a été construit, par assemblage de 14 oligonucléotides synthétisés chimiquement. La séquence du gène complet obtenu est donnée figure 2a. Cette séquence diffère de celles publiées aux positions 483 (TCC), 506 (T), 435 (CATATG), et 896 (AACGTT).

B - Elaboration de dérivés selon l'invention
Différents dérivés de l'IL113 selon l'invention ont été obtenus par mutagénèse dirigée, en utilisant le Kit Amersham (ref.

RPN 1523). A cet effet, plusieurs oligonucléotides ont été préparés, et notamment les oligonucléotides de séquence
Oligol (39 mer) 5' - GTG GCC TTG GGC CTC AGC GAA AGC AAT CTG TAC CTG TCC - 3'
Oligo2 (36 mer) 5' - ATC AGC ACC TCT GCA GCA GCA AAC ATG CCC GTC TTC - 3'
Oligo3 (36 mer) 5' - ATG TCC TTT GTA CAA GGA AGT AAT GAC AAA ATA CCT - 3'
En appliquant la technique mentionnée ci-avant, des séquences nucléotidiques dérivées du gène de l'IL113 ont été obtenues, dont les séquences entières sont présentées figue 2b, 2c et 2d. Ces séquences codent respectivement pour les polypeptides (63Ser;65Ser)-IL1B, (126Ala; 128Ala)-IL1ss et o(50Gly-51Gly)-IL1ss.

D'autres techniques de mutagénèse connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées pour la préparation de dérivés selon l'invention, et notamment la technique PCR.

C - Expression
L'IL113 et ses dérivés ont été produits par voie microbiologique chez E.coli. Il est clair que les enseignements donnés dans la présente demande permettent à l'homme du métier de reproduire l'invention dans un autre type cellulaire.

Les conditions de culture utilisées sont celles décrites par Jung et al. (Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (1988), 139, p 129).

Les vecteurs de clonage et d'expression utilisés dans l'invention ont été obtenus à partir du plasmide pXL1029 décrit par
Jung et al. Ces vecteurs contiennent les séquences d'ADN codant pour les dérivés de l'IL1ss sous le contrôle de la région thermosensible opérateur/promoteur du bactériophage lambda CIts-O/PR. D'autres signaux d'expression peuvent bien évidemment être utilisés, dérivant par exemple de gènes bactériens ou phagiques, ainsi que des signaux permettant la sécrétion des polypeptides produits. De plus, des vecteurs intégratifs peuvent être obtenus en insérant dans le vecteur des séquences d'ADN homologue, permettant d'augmenter la stabilité plasmidique.

Les vecteurs ainsi décrits ont été introduits dans la souche E. coli E103S.

Dans les conditions définies ci-dessus, les dérivés de l'invention on été produits à des taux élevés et sous forme soluble, c'est à dire facilement purifiable.

D - Purification
Les dérivés de l'invention ont été purifiés selon le protocole suivant
1) Lyse cellulaire : 14 g de culot cellulaire sont repris dans 54 ml de tampon Al (Tris 50 mM pH 7,5 EDTA 5 mM PMSF 1 mM, ss-mercaptoéthanol 5 mM) et lysés aux ultrasons. Après centrifugation, on obtient le surnageant S1.

2) Précipitation des acides nucléiques : 1,84 g de sulfate de streptomycine sont ajoutés, le mélange est agité 30 minutes à 40C avant d'être centrifugé à 18 000 rpm. On obtient le surnageant S2.

3) Précipitations au sulfate d'ammonium : Une première précipitation à 45% de saturation en sulfate d'ammonium est effectuée (30 minutes à 200C), et le surnageant S3 est récupéré après centifugation à 18 000 rpm. Une seconde précipitation à 65% de saturation en sulfate d'ammonium est réalisée dans des conditions identiques. Le culot C4 qui contient les dérivés de l'IL113 est dialysé contre le tampon A2 (Tris 50 mM pH 8 PMSF 0,1 mM EDTA 2 mM).

4) Chromatographie sur FFQ ("Fast Flow QEAE" Pharmacia)
Les 24 ml de C4 sont déposés sur un échangeur d'anion FFQ équilibré avec le tampon A3 (Tris 50 mM pH 8). La majorité des protéines de E. coli se fixent sur la matrice, contrairement aux dérivés de 1' invention.

5) Précipitation au sulfate d'ammonium 75%.

6) Chromatographie d'exclusion de gel : Le précipité est déposé sur une colonne de Séphacryl S100 (Pharmacia) équilibrée avec le tampon A4 (Acétate de sodium 50 mM pH 5).

7) Chromatographie sur mono S : L'éluat S100 est déposé sur échangeur de cation mono S equilibré avec le tampon A4. Les dérivés de l'IL113 sont élués par un gradient de NaCl.

De cette manière les résultats suivants ont été obtenus
Polypeptide Expression (*) Pureté
(63Ser;65Ser)-IL1B 5 > 95%
(126Ala; 128Ala)-IL1B 9 99
o(50Gly-51Gly)-IL1ss 5 96%
(*) % des protéines solubles
II. CARACTERISATION BIOLOGIQUE DES DERIVES
A - Activité sur le système immunitaire
L'étude des paramètres suivants permet d'évaluer l'effet relatif des dérivés de 1'IL1B selon l'invention sur le système immunitaire.

a/ Activité LAF : Cette activité de référence reflète l'activité spécifique de l'IL113 et des dérivés de l'invention. Ce test reproduit in vitro l'effet immunostimulant de l'IL1ss par activation des lymphocytes T. Le protocole utilisé est le suivant:
Les thymocytes utilisés ont été obtenus à partir de thymus de souris (C3H/Ouj). Les cellules sont mises en culture, à raison de 1,5.106 thymocytes/ml, en présence de PHA (1 pg/ml) pendant 20 minutes.Des dilutions appropriées d'IL113 ou des dérivés de l'invention sont ensuite ajoutées, et la culture est maintenue 72 h à 370C sous 7,5% de CO2. La prolifération des thymocytes est mesurée pendant les 5 dernières heures de chaque culture en ajoutant dans le milieu du MTT (diméthyl-thiazo diphényl tétrazolium), qui est transformé en sel insoluble au contact des cellules. Le sel insoluble résiduel est ensuite dissous en présence d'HCl 0,04N dans le propanol, et la concentration est mesurée par lecture de la DO à 560/690 nm selon la technique de Mosmann (J.Immunol. Methods, 65, 55 (1983)). Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

b/ Mesure des paramètres de fixation sur des lymphomes B humains : les cellules Raji.

Les cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, à 370C, dans une atmosphère contenant 5 de CO2. Les tests de fixation sont réalisés au moyen d'IL113 marquée à l'iode 125I. Pour cela, 100 ul de suspension lymphocytaire sont incubés pendant 3 h à 230C en présence de 50 pM d'IL1ss marquée et d'azidure de sodium 0,2%, qui inhibe le processus d'internalisation. A la fin de l'incubation, les cellules sont séparées du surnageant par centrifugation sur mélange silicone/paraffine et la radioactivité présente dans la fraction cellulaire est comptée.

L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de 1' IL1B et l'affinité correspondante (KD).

Les propriétés de fixation des dérivés de l'invention sont ensuite déterminées par compétition avec l'IL113 mature. Pour cela, différentes concentrations d'IL113 froide ou des dérivés selon l'invention sont préincubées pendant 15 minutes en présence d'IL113 marquée. Les expériences de liaison sont ensuite conduites selon le protocole décrit ci-dessus. Les résultats obtenus permettent de déterminer la valeur des CI50 (concentration inhibant 50% de la liaison de l'IL113 mature) des dérivés, et de déduire ainsi leur KI selon l'équation
KI = CI50/(1+L/KD) avec L = Concentration en IL1ss marquée.

KD = constante de dissociation de l'IL113.

Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

c/ Mesure des paramètres de fixation sur des thymocytes murins : les cellules EL4-6.1. Les protocoles utilisés sont identiques à ceux décrits en b/.

L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de l'IL1ss, l'affinité correspondante de l'IL113 et le KI des dérivés de l'invention. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

d/ Mesure de la résistance aux infections à Listeria chez la souris. Il est connu que l'IL113, de par ses propriétés immunostimulantes, protège la souris contre des doses mortelles de
Listeria. Une étude comparative de l'effet des dérivés de l'IL1ss selon l'invention sur cette résistance a été réalisée : Au temps 0, on administre par voie intraveineuse à chaque souris OF1 testée
- 0,2 ml d'une suspension (en soluté physiologique) préparée à partir d'un stock congelé de germes,
- 0,2 ml d'un dérivé de l'invention, ou du véhicule seul (souris témoin).

Au temps 10 jours, le temps moyen de survie (Tms) est déterminé, et les résultats sont exprimés sous forme d'indice de protection
I = Tms (traitée)/Tms (témoin) . 100
L'effet protecteur des dérivés de l'IL113 selon l'invention est présenté dans le tableau 1.

Les résultats obtenus sur le système immunitaire montrent que les dérivés de l'invention n'ont pas l'effet immunostimulant de l'IL113. Mais ils montrent aussi et surtout qu'ils n'ont pas d'effet immunosuppresseur, en dépit de leur effet antagoniste sur le métabolisme des cartilages, ainsi que présenté au point C.

B - Activités pro-inflammatoire et hématopoiétique
(tableau 2)
L'effet comparatif de l'IL113 et des dérivés de l'invention sur ces activités a été déterminé par:
e/ Mesure de l'hypozincémie chez la souris. L'IL113 produite lors d'un état inflammatoire (ou une activité de type IL113), entraîne une diminution du taux sérique de zinc. Une interprétation de ce phénomène est que l'IL113 stimule la synthèse d"'acute phase proteins" par les enzymes hépatiques qui, pour ce faire, mobilisent le zinc sérique. L'effet des dérivés de l'invention sur le taux de zinc sérique a été déterminé par spectrométrie d'émission avec source à plasma d'argon, 4 heures après injection intrapéritonéale de doses d'IL113 ou de dérivés de l'invention variant entre 0,2 et 20 ng par souris.

f/ Mesure de l'induction de CSF ("Colony Stimulating
Factor") chez la souris. Il est connu que l'IL113 stimule la production de CSF (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), en particulier par les cellules immunocompétentes. Il est possible de mesurer cette activité en détectant la prolifération de cellules de la moelle osseuse induite par un sérum de souris traitée par l'IL113 ou les dérivés de l'invention. Plus précisément, des sérums de souris OF1 ont été obtenus à différents temps après injection intraveineuse de dérivés de l'invention, par prélêvement, coagulation 45 min à température ambiante et centrifugation. La prolifération est mesurée sur cellules de moelle fémorale de souris cultivées pendant 3 jours en présence des sérums obtenus ci-dessus, après ajout de MTT selon la technique de Mosmann (J. Immunol.Methods, 65, 55 (1983)). Le
M-CSF activant la multiplication et l'activité métabolique des cellules médullaires, l'intensité de la coloration rend compte de l'aptitude du dérivé de 1'IL1B à stimuler in vivo la production de
M-CSF.

g/ Mesure de la diminution de consommation de nourriture chez la souris, qui reflète les potentialités anorexigènes de l'IL113, médiées par les prostaglandines. L'IL113 ou les dérivés de l'invention sont administrés par voie intrapéritonéale à des doses variant entre 2 et 200 ng par souris. La consommation est mesurée entre les temps 1 heure et 1 heure 30 minutes par pesée de la nourriture restante. La diminution de consommation engendrée par les différentes formes d'IL113 est déterminée par comparaison avec des souris témoins.

L'ensemble de ces résultats indique clairement une diminution des propriétés pro-inflammatoires des dérivés de l'invention par rapport à l'IL113 mature.

C - Activité sur le métabolisme des cartilages
Les dérivés de l'invention ont été testés comparativement à l'IL113, afin de déterminer leur activité sur l'anabolisme et sur le catabolisme du cartilage, et ceci, en mesurant leur capacité à
h/ Inhiber la synthèse des protéoglycans (anabolisme). Il a été montré en effet que la capacité des chondrocytes à synthétiser une matrice cartilagineuse soit fortement diminuée en présence d'IL113. Cet effet apparaît d'ailleurs comme primordial dans la pathologie arthrosique. La mesure de cette activité a été effectuée sur culture primaire de chondrocytes, par incorporation de soufre 35S. Les cellules sont cultivées pendant 24 h, puis les échantillons à tester sont ajoutés, et la culture est maintenue 8 à 10 jours à 370C.L'incorporation de soufre 35S (SO4) est réalisée durant 16 à 24 h, et la quantité de soufre incorporé dans l'amas cellulaire est dosée. Les résultats sont exprimés sous la forme du pourcentage d'incorporation de 35S par rapport au témoin, puis en pourcentage d'inhibition de la synthèse des protéoglycans (voir tableau 3).

i/ Dégrader les protéoglycans (catabolisme des cartilages). Il a en effet été mis en évidence que l'IL113 était capable d'induire, via la production de protéases (protéoglycanases, métalloprotéases ..), la dégradation de la matrice cartilagineuse.

La mesure de cette activité a également été effectuée sur culture primaire de chondrocytes, par incorporation de soufre 35S. Les cellules sont cultivées pendant 6 à 8 jours (délai permettant la formation de nodules de cartilage), puis l'incorporation de soufre 35S (SO4) est réalisée durant 16 à 24 h. Après lavage, les échantillons à tester sont ajoutés, et la culture est maintenue 6 à 8 jours à 370C. La quantité de soufre résiduel dans l'amas cellulaire est ensuite dosée. Les résultats sont exprimés sous la forme du pourcentage de 35S incorporé résiduel par rapport au témoin, puis en pourcentage de dégradation du cartilage par rapport au témoin (tableau 3).

Pour la mesure des activités h/ et i/, le modèle cellulaire utilisé est une culture primaire de chondrocytes de rat, préparée et cultivée dans les conditions suivantes: Des embryons de rat (Sprague Dawley) sont prélevés au 13ème jour de gestation, sur lesquels on prélève ensuite de manière stérile des bourgeons de pattes des membres inférieurs et supérieurs. Après dissociation enzymatique de ces bourgeons (trypsine), le lysat cellulaire obtenu est homogénéisé, puis filtré sur tamis pour éliminer tout tissu résiduel. Les cellules sont alors comptées, centrifugées, et le culot est repris avec le milieu de culture. Les cellules ainsi obtenues constituent la solution d'innoculation. Pour chaque expérience, les cellules (25.106/ml) sont innoculées en boite de culture et maintenues entre 2 et 4 h à 370C pour permettre leur fixation.Selon le test, les protocoles décrits ci-dessus sont réalisés.

j/ Induire la sécrétion de protéases neutres par les chondrocytes de lapin. Cette activité se rapproche de celle décrite en i/, puisque ce sont ces protéases neutres qui sont principalement responsables de la dégradation du cartilage. Cette activité est déterminée indirectement, par mesure de la dégradation de l'azocoll (substrat synthétique) induite par différentes cultures de chondrocytes cultivées en présence d'IL113 ou des dérivés.

Concrètement, les chondrocytes d'une première sous-culture sont pré-cultivés pendant 24 h avant toute stimulation. Des dilutions de dérivés d'IL1B selon l'invention sont ajoutées au milieu pendant 30 h, à 370C, sous 5% de CO2. Après traitement trypsique, l'azocoll (10 mg/ml) est introduit à pH 7,4 et à 370C, et laissé en contact pendant 5 h sous agitation. On lit alors la densité optique à 550 nm, qui est proportionnelle à la quantité d'azocoll dégradée, et donc de protéases sécrétées. Plus spécifiquement, ce dosage rend compte des protéoglycanases et collagénases produites. Les résultats sont présentés dans le tableau 4).

k/ Se fixer sur les chondrocytes de lapin. Ce paramètre démontre que l'effet inhibiteur des dérivés de l'invention sur le métabolisme des cartilages n'est pas dû à une disparition corrélée de leur affinité pour les récepteurs des chondrocytes.

Les chondrocytes sont cultivés dans le même milieu et aux mêmes conditions que les lymphocytes des expériences b/ et c/.

Lorsque la confluence est atteinte (tapis monocouche), les cellules sont incubées à 200C en présence d'une solution de 125I-IL1ss 100pM.

Au bout de 4 h, les cellules en monocouche sont rincées, solubilisées au moyen de SDS (sodium dodécyl sulfate) et la radioactivité fixée est comptée.

Les propriétés de fixation des dérivés de l'invention sont ensuite déterminées par compétition avec l'IL113 mature, selon le protocole décrit dans l'expérience b/.

L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de l'IL113, l'affinité correspondante de l'IL113 et le KI des dérivés de l'invention. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

1/ Moduler chez la souris l'anabolisme du tissu cartilagineux au niveau de la rotule, après injection intra-articulaire d'IL113. Cette expérience permet d'apprécier in vivo l'activité des dérivés de l'IL1B de l'invention (tableau 3).

L'IL113 ou les dérivés selon l'invention sont injectés au temps t=0 dans l'articulation fémorotibiale. A t=24 h, une injection intraveineuse de 35SO4Na2 est pratiquée (10 pCi par souris). Au temps t=48 h, Les souris sont sacrifiées et les rotules prélevées.

Les cartilages sont ensuite digérés (NaOH N) et la radioactivité incorporée est comptée. Les résultats sont traités pour faire apparaître les variations de radioactivité dues aux différents dérivés de l'IL113.

L'ensemble des résultats présentés fait apparaître une dissociation nette des activités des dérivés de l'invention, en ce sens qu'ils sont capables d'inhiber sélectivement les effets de l'IL113 sur le métabolisme des cartilages, sans affecter la réponse immunitaire. Cette dissociation permet une meilleure utilisation thérapeutique des propriétés des l'IL113.

Claims (16)

1. REVENDICATIONS

   1. Polypeptides dérivés de l'IL113 humaine, caractérisés en ce qu'ils possèdent la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'IL1ss humaine sur le métabolisme des cartilages.
2. 2. Polypeptides selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils dérivent de l'IL113 par modifications de la structure primaire à l'intérieur ou proches de boucles.
3. 3. Polypeptides selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'il s'agit des boucles situées entre les feuillets 4-5, 5-6, 7-8, 10-11 et 11-12, telles que représentées sur la figure 1.
4. 4. Polypeptides selon la revendication 2 caractérisés en ce que la ou les modifications structurales sont des mutations, ponctuelles ou non, des additions ou des délétions d'un ou plusieurs acides aminés.
5. 5. Polypeptide (63Ser;65Ser)-IL1B.
6. 6. Polypeptide (126Ala; 128Ala)-IL1ss.
7. 7. Polypeptide (50Gly-51Gly)-IL1ss.
8. 8. Fragment d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé en ce qu'il possède la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'IL1ss humaine sur le métabolisme des cartilages.
9. 9. Séquence d'ADN codant pour un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8.
10. 10. Séquence d'ADN selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi celles présentées aux figures 2b, 2c et 2d.
11. 11. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN selon l'une des revendications 9 et 10.
12. 12. Vecteur de clonage et/ou d'expression selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est intégratif ou autoréplicatif.
13. 13. Cellule recombinée contenant un vecteur selon l'une des revendications 11 et 12.
14. 14. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 ou d'un fragment de polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinée selon la revendication 13 dans des conditions d'expression, et on récupère le produit obtenu.
15. 15. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 8.
16. 16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15 destinée au traitement des pathologies ostéoarticulaires.