CA2125877A1 - Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation - Google Patents

Abstract

2125877 9315198 PCTABS00163 La présente invention concerne des polypeptides dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine (apoAIV), les séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides, leur préparation et leur utilisation.

Description

W O 93/15198 ~ 7 PCT/FR93/00073 POLYPEPTIDES DERIVES DE L'APOLIPOPROTEINE AIV HUMAINE, LEUR PREPARATION ET

La présente invention concerne des polypeptides dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine (apoAI), les séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides, 5 leur préparation et leur utilisation.

L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 46 000 daltons. Les séquences peptidiqueset nuc1éotidiques de l'apoAIV, ainsi que la position des hélices sont représentées sur Ies séquences SEQ ID n 1 et 2. L'apoAIV est un composant majeur des lo chylomicrons sécrétés dans la Iymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associee avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B.
Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24: 52-59). Par ailleurs, l'apoAIV
plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257: 501-507). Le rôle 15 physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 198S, J. Biol. C}lem., 260: 2258-2264) et qu'elle peut, comme l`apolipoprotéine AI, interf~rer avec la fixadon des particules de HDL sur les cellules endo~éliales ao~tiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257: 41714178). Ces 20 deux activités æmblent indiquer que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol.

La présente invention resulte du choix de la demanderesse d'utiliser l'apolipoprotéine AIV comme molécule cible pour l'étude des facteurs influençant le ~ansport inverse du choles~érol. La présente invention repose plus précisément sur

2~ l'utilisation de l'apoAIV pour la préparation de produits nouveaux, permettant, par de nouvelles ~hérapies, de lutter contre les hypercholestérolémies et les effets qui y sont associés, tels que l'athérosclérose.
Plus précisément, la présente invention fournit des polypeptides dérivés de l'apoAIV, et permet ainsi d'exploiter pharrnacologiquement les propriétés de cette 30 p~otéine. La présente invention a donc pour objet des polypeptides dérivés del'apolipoprotéine AIV humaine. Il peut s'agir en particulier de polypeptides ayant une stabilité plasmatique accrue par rapport à la proteine native (sensibilité plus faible aux mécanismes physiologiques d'élimination QU de dégradation), et par conséquent .. . . . . ~ . . . . . . ... . ~ .

WO 93/15198 pcr/FR93/ooo73 2125~77 2 une durée de vie plus longue. Il peut également s'agir de polypeptides ayant uneactivité stimulatrice de l'efflux du cholestérol cellulaire, et donc favorisant le - transport inverse du cholestérol, conduisant à décharger les cellules ayant accumulé
du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Il peut5 également s'agir de polypeptides possédant seulement une ou plusieurs des propriétés de l'apoAIV. En particulier, il peut s'agir par exemple de polypeptides capables de lier les r~cepteurs cellulaires, mais ne possédant pas l'activité stimulatrice de l'efflux ;~ du cholestérol cellulaire. En outre, il peut également s'agir de polypeptides dépourvus des activités de l'apoAlV. De tels polypeptides peuvent en effet présenter 10 des utilités thérapeutiques (génération d'anticorps, études structure-fonction, etc).
. Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont capables de lier le récepteur HDL.
Encore plus préférentiellement, les polypeptides sont capables de lier le récepteur HDL et de stimuler un efflux de cholestérol.
ls Les polypeptides selon l`invention peuvent être de plusieurs types. Il peut s'agir, par rapport à l'apoAIV humaine, de dérivés de mutation ou de substitution, de dérivés de délédon ou de dérivés d'addition. Il est entendu que la présente invendon couvre également les polypepddes comportant plusieurs types de modifications, tels que par exemple des dérivés de mutation et de délétion, des dérivés de délétdon et 20 d'addition, etc.
Plus ptéférentiellement, l'invention a pour objet des polypeptides non-naturels dérives de l'apolipoprotéine ~IV humaine comprenant, par rapport à la séquence de l'apolipoprotéine AIV humaine SEQ ID n 2, au moins une des modifications suivantes:
25 (a) une mutation ponctuelle portant sur un résidu fonctionnel, et/ou, (b) une delétion d'une extrêmité terminale d`au moins 10 acides aminés, et/ou, (c) une délétion d'une hélice ou d'une paire d'hélices, et/ou, (d) une partie additionnelle hétérologue possédant une activité biologique différente ou complémentaire de celle de l'apoAIV, ou une propriété de marqueur, de cibleur30 ou de stabilisateur.
Dans un mode particulier, les polypeptides de l'invention comprennent au moins une modification selon (a) et (b).
Dans un autre mode particulier, les polypeptides de l`invention comprennent au moins une modification selon (a) et (c)~

Wo 93/15198 pcr/FRs3/ooo73 212~77 Dans un autre mode particulier, les polypeptides de l'invention comprennent une modification selon (a), (b) ou (c) associée à une modification selon (d).
Les dérives de mutation comprennent généralement une mutation ponctuelle ~suppression d'un acide aminé, ou modification d'un acide aminé, ou remplacementd'un acide amine par un autre), ou double ~modification d'une paire d'acides aminés).
Les mutations choisies tiennent compte de la position des résidus mutés dans leurs hélices respectives, et tendent a priori à modifier les groupements fonctionnels sans trop perturber la structure de l'hélice concernée, et donc du polypeptide. Au sens de la présente invention, on entend par résidu fonctionnel les r~sidus susceptibles d'être impliqués dans l'activité de l'apoAIV, soit au niveau de l'interaction avec le récepteur, soit au niveau de la transmission d'un signal (tel que par exemple lastimulation de l'efflux du cholestérol). Les résidus préférés sont généralement les résidus chargés, qui possèdent un effet potentiel dans l'interaction du polypeptide avec son récepteur. De tels résidus peuvent être ~emplacés par d'autres, apolaires, ou modifiés chimiquement par suppression ou ajout d'una charge. Les résidus glycosylés et les residus impliqués dans la formation de ponts disulfure (cystéine) constituent d'autres résidus préférés.
Préférentiellement, les polypeptides de l'invention possèdent par rapport à
l'apoAIV humaine telle que représent;ée sur la sequence SEQ ID n 2 au moins unemutation sur l'un des résidus suivants: acide aspartique en position 5, 44, 106,153;
glutamine en position 37, 194; asparagine en posit;on 39; Iysine en position 73,84, 103,169,17~; acide glutamique en position 76, B1, 87, 99, 131, 164, 187, 230;
alanine en position 22; proline en position 139, 161; et serine en position 154.Plus préférentiellement, l'acide aspartique peut être remplacé par un résidu S, K, A, F ou &; la glutamine par un residu T, K ou F; l'asparagine par un résidu A
ou D; la lysine par un residu G, E, T, D, A, Y, H ou F; l'acide glutamique par un résidu S, R, F, K, A, G, N, ou Q; l'alanine par un résidu R ou E; la proline par un residu R ou G; et la sérine par un résidu E ou R (les lettres correspondent à un acide aminé selon le code reconnu).
Les polypeptides de l'invention peuvent etre des dérivés de délétion. Dans ce cas, la ou les délétions peuvent porter sur une extrêmité de la protéine (C-terminale ou N-terminale). A cet égard, certains p~lypeptides de l'invention sont des fragments d'apoAIV, obtenus par délétion de parties importantes de la protéine.
Préférentiellement, les polypeptides de l'invention possèdent par rapport à l'apoAIV

W O 93/15198 PC~r/FR93/00073 212~877 4 humaine des délétions terminales d'au moins 10 acides aminés. La ou les délétions peuvent également porter sur des regions internes de l'apoAIV, et notamment sur des hélices entières ou sur des paires d'hélices.

Un autre type de polypeptides selon l'invention est représenté par des S dérivés d'addition. En particulier, l'invention concerne les polypepddes comprenant tout ou partie de l'apoAIV et un élément supplémentaire tel qu'un marqueur, un cibleur, un stabilisant ou un autre élément actif. Comme marqueur de purification, on peut citer à titre d'exemple le décapeptide t~g de séquenoe MRGS(H)6 décrit par Hochuli et al (Bio/technol. (1988) 1321). Comme illustré dans les exemples, ce lo décapeptide peut être fusionné en N-terminal de l'apoAIV ou d'un dérivé tel que défini ci-avant, permettant ainsi une purification très rapide en une etape, sans affecter les capacités de production dudit polypeptide.
A ti~e d`exemples spécifiques de polypeptides selon l'invention, on peut citer préférentiellement les polypeptides suivants:
1~ - polypepdde P(~N13,R93G): polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux (/~N13) et une glycine au lieu d`une arginine en position 93 (R93G).
- polypeptides P( N13): polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux, et sa version tag P(tag N13).
- polypeptide P(R93G): polypeptide possédant une glycine au lieu d'une arginine en position 93.
- polypeptides P(~C44~: polypeptide possédant une delétion des 44 acides aminés C-terminaux, et sa version tag.
- polypeptide P(/~C194): polypeptide possédan~ une déletion des 194 2s de~niers acides aminés.
- polypeptide P(~N182): polypeptide possédant une délétion des 182 premiers acides aminés.
- polypeptides P(~h1-2): polypeptide possédant une delétion des hélices 1 et 2 telles que représentées sur la SEQ ID n 2 (résidus D14 à V62)~ et sa version tag.
- polypeptides P(l\h7-8): polypeptide possédant une délétion des hélices 7 et 8 telles que présentées sur la SEQ ID n 2 (résidus P162 à A205), et sa version tag.

7 ~

- polypeptides P( h9-10): polypeptide possedant une délétion des hélices 9 et 10 telles que présentées sur la SEQ ID n 2 (résidus P206 à A249), et sa version tag, - polypeptides P(~h11-12): polypeptide possédant une délétion des hélices s 11 et 12 telles que présentées sur la SEQ ID n 2 (residus P250 à E289), et sa version tag.
- polypeptide P( hll-12,L~7M): polypeptide possédant une délétion des hélices 11 et 12 telles que représentées sur la SEQ ID n 2 (~hll-12), et une methionine au lieu d'une leucine en position 87 (L87M).
- polypeptides P(ah13-14): polypeptide possédant une délétion des hélices 13 et 14 telles que présentées sur la SEQ ID n 2 (résidus P290 à N333), et sa version tag.
- polypeptides P(~h5-6): polypeptide possédant une délétion des hélices 5 et 6 telles que représentées sur la SEQ ID n 2 (résidus P118 à R161), et sa version tag.
- polypeptide P~ ): polypeptide possédant une phénylalanine au lieu d'un acide aspartique en position 44.
- polypeptide P(D44A): polypeptide possédant une alanine au lieu d'un acide aspartique en position 44.
- polypeptide P(DSS): polypeptide possédant une sérine au lieu d'un acide aspartique en position 5.
- polypeptide P(D5K): polypeptide possédant une lysine au lieu d'un acide aspartique en position 5.
- pclypeptide P(K178Y): polypeptide possédant une tyrosine au lieu d'un~
Iysine en position 178.
- polypeptide P(K178A): polypeptide possédant une alanine au lieu d'une Iysine en position 178.
- polypeptide P(E230K): polypeptide possédant une lysine au lieu d'un acide glutamique en position 230.
De tels polypeptides selon l'invention présentent un intérêt pharmaceutique important, notamment dans le traitement et/ou la prévention de l`athérosclérose.L'athérosclérose est une maladie qui se caractérise par la formation de plaques lipidiques ou fibr~lipidiques dans l'intima de l'aorte, des artères coronaires et de la carotide essentiellement. Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être ~umelées à des lesions, et sont créees par l'accumulation dans WO 93/15198 PCI~FR93/00073 212S$77 6 les artères de dépôts graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques provoquent alors un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux.
La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère 5 un caractère sténosant responsaUe des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou emboUe, qui surviennent chez les patients les plus atteints.
La formation d'une plaque d'athérome résulte donc de la conjugaison de différents facteurs, (i) un excès de cholestérol plasmatique, dont proviennent les dépôts artériels, et (ii) un défaut de régulation entre influx et efflux de cholestérol au o niveau des tissus périphériques, en faveur d'une accumulation intracellulsire.Compte tenu de leur propriétés, les polypeptides selon l`invention peuvent notamment permettre de ralentir la formation des plaques d'athérome, d'induire la régression des plaques d'athérome, et de diminuer le risque d'incidence d'accidents coronariens.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus de différentes façons, et notamment par voie chimique et/ou génétique.
Dans le cas de la préparation par voie chimique, les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus soit entièrement par synthèse chimique, soit par modifications chimique ou enZymatique de la protéine nadve. Dans ce dernier cas,20 diffétents agents chimiques ou enzymatiques peuvent être utilisés, permettant de modifier des résidus (dérivés de mutation), de marquer des`résidus (dérivés d'addition) ou de fragmenter la protéine (dérivés de délétion). Parmi les agentschimiques perme~tant de modifier ou marquer des acides aminés, on peut citer plus particulièrement le sulfo-NHS-acétate, qui permet l'acylatîon des amines primaires et 2s surtout des lysine; le tétranitrométhane qui introduit un groupement nitrate sur les tyrosines, ou encore le N-bromo-succinimide qui oxyde les résidus t~yptophane.
Parmi les agents chimiques et enzymatiques permettant de couper des liaisons peptidiques, on peut citer plus particulièrement le bromure de cyanogène, le iodosobenzoate, la trypsine, la chymotrypsine, la thermolysine ou encore la 30 proendopeptidase.
Comme indiqué plus haut, ces traitements peuvent être appliqués aussi bien sur le polypepdde produit d'une synthèse chimique que sur le polypeptide natif. De plus, ces traitements peuvent également être appliqués aux polypeptides obtenus par vois génétique, et de ce fait, comportant déjà certaines modifications.

WO 93/lSl98 pcr/FR93/ooo73 21~7~

Dans le cas de la préparation par voie génétique, les polypeptides de l'invention sont obtenus par modification au niveau des séquences nucleotidiquescodantes, et expression desdites séquences dans un hôte cellulaire.
A cet égard, la présente invention a également pour objet les séquences s nucléotidiques ccdant pour les polypeptides décrits plus haut. Il peut s'agir de séquences d'ADN, de séquences d'ARN, de séquences synthétiques, semi-synthétiques, hybrides, etc. Ces séquences peuvent être utilisées:
- pour la production des polypeptides de l'invention par expression dans un hôte cellulaire, o - comme composition pour des thérapies géniques, - pour la réalisatio~i de sondes rnarquées permettant l'identification de polypeptides apparentés ou la mise en évidence d'une expression des polypeptides de l'invention, - pour la préparation de nouveaux vecteurs de clonage ou d`expression lS comportant ces séquences, ou encore, - pour la préparation de nouvelles cellules eucaryotes ou proca~yotes recombinantes ou d'animaux transgeniques contenant ces séquences ou ces vecteurs.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent etre obtenues à partir d'une séquence codant pour l'apoAIV, par différentes techniques telles que notamment par découpage gé~étique, mutagénèse, ou tout autre traitement altérant la structure des acides nucléiques. Les techniques les plus connues de l'homme du métier sont mentionnées ci-après dans les techniques générales de clonage. Le détail de la synthèse des sequences nucléotidiques de l'invention est donné dans la partie B/
des exemples. La séquence de l'apoAIV humaine utilisée dans l'invention a été
obtenue à partir d'un clone génomique contenant le f~agment KpnI-HindIII de la séquence du gène humain de l'apoAIV, qui contient la fin de l'intron 2, la totalité de l'exon 3 ainsi que la séquence 3' non traduite. Ce clone ne contenait donc pas, en particulier, les deux premiers exons du gène de l'apoAIV humaine (Elshourbagy etcoll. J.B.C. (1987) 262:7973). La séquence complète a été obtenue par:
- syn~èse chimique de l'extrémité 5' de la séquence de l'apoAIV, de sorte que ce fragment synthétique contienne les codons correspondant à la partie de laprotéine mature codée par les deux premiers exons du gène humain, et également les premiers nucléotides de la région 5' de l'exon 3 s'étendant jusqu'au site BstEII; puis, WO 93/15198 PCI`/FR93/00073 212~8~7 -- la liaison de ce fragment synthétique à un fragment d'ADN contenant le restant de la séquence du gène de l'apolipoprotéine AIV située après le site BstEII, utilisé pour effectuer la jonction au nucléotide près.
Le détail de ces étapes est donné dans la partie A/ des exemples.
S La présente invendon a également pour objet un p~océdé de préparadon des polypeptides de l'invention décrits plus haut. Ce procédé consiste à réaliser les étapes suivantes:
- dans une première étape, on introduit dans une cellule une séquence nucléotidique telle que définie plus haut codant pour un polypeptide de l'invention, ~0 - dans une deuxième étape, on cultive la cellule ainsi obtenue dans des conditions d'expression de ladite sequence nucléotidique et, - dans une troisième étape, on récupère le polypeptide produit.
Plus particulièrement, lors de la première étape du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique peut être introduite dans la cellule par diffé~r~s techniques. Notamment, l'introduction peut être effectuée par ~ansf~mation, conjugaison, ou électroporation.
S'agiæant de la transfo~nation, différents protocoles ont été décrits dans rart antérieur. En particulier, elle peut être éalisée en traitant les cellules entières en presence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décnte par Ito et al. ~J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de ; diméthylsulfoxyde selon la technique de Dun~ns et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7).
La transformation peut encore être effectuée selon la technique décrite par Dagert at al. (Gene 6 (1979) 23-28) par traitement avec une solution de CaC12 puis choc thermique. Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet 2~ EP 361 99~.
S'agissa~t d'électroporation, la technique décrite par Karube et al. (FEBS
Letters 182 (198~) 90) peut avantageusement être utilisee.
Le choix de l'une ou de l'autre de ces méthodes est établi notamment en fonction de l'hôte choisi.
Parmi les hôtes euca~otes utilisables dans le procédé de l'invention, on peut citer les cellules animales, ~es levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Sac~bammyces, Kluvveromvces, ~hi~a - ~astoris, Schwanniomvces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellu1es COS, CHO, Cl27, etc. Parmi les champignons susceptibles d'être .:

~123&7~

utilisés dw la présente invention, on peut citer plus particulièrement Asper~illus ssp. ou Trichoderma ssp.
Parmi les hôtes procaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les bactéries suivantes ~.5~, BaCi1l~, OU Streptomvces.
s Dans un mode préféré de l'invention, le procédé est mis en oeuvre en utilisant comme cellule hôte une cellule procaryote.
Encore plus préférentiellement, le procédé de l'invention est mis en oeuvre en utilisant comme cellule hôte la bactérie ~,~QIi.
Généralement, la sequence nucléotidique utilisée est une séquence génomique, une séquence d'ADNc, une séquence séquence hybride, etc. Pour une meilleure mise en oeuvre de l'invention, on préfère cependant utiliser un ADNc (Cf exemple A/~. Par ailleurs, cette séquence nucléotidique comprend généralement une région de démar;rage de la transcription et de la traduction jointe à l'extrêmité S' terminale de la s~quence codante, de façon à diriger et à réguler la transcription et la 1~ traduc~ de ladite séquence. Le choix de ces régions peut varier en fonction de l'hôte utilis~. En particulier, chez les bactéries telles que E.~i. on peut utiliser le ~omotn~ de l'op~ron tryptophane (Ptrp), ou les promoteurs gauche et droit du bactériophage lambda (PL, PR) OU encore le promoteur du gène 10 du bactériophage17.
Par ailleurs, la séquence nucléotidique fait préférentiellement partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulierement, des vecteurs à replication autonome peuvent être préparés en utilisant des sequences à
réplication autonome chez l'hôte choisi. A titre d'exemple~ chez la levure, il peut s'agir d`origines de réplication dérivées de plasmides: p~Dl (EP 241 435) ou bien de séquences chromosomiques (ARS~ et chez la bactérie, il peut s'agir d`origines de réplication dérivées de plasmides (pBR322, pET3, etc). S`agissant des vecteurs intégradfs, ceux-ci peuvent être prepares par exemple en utilisar~t des sequences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, pennettant, par recombinaison homologue, I'intégration du vecteur. A cet égard, l`utilisation d'ADNr permet une intégration multiple de l'ADN exogène, et donc sa presence en plus grand nombre de copies par cellules.
Dans un mode préféré, la séquence nucléotidique comprend, en amont de la séquence codante, ou, le cas échéant, entre la région de démarrage de la transcription et de la traduction et la séquence codante, une séquence "leader" dirigeant le ~12~77 ~o po1ypeptide naiss.ant dans les voies de sécrétion de l'hote utilisé. Cette séquence Hleader" peut être la séquence "leader" de l'apoAIV, mais il peut également s'agir d'une séquence hétérologue (issue d'un gène codant pour une autre protéine) ou même artificielle. Le choix de l'une de ces séquences est notamment guidé par l'hôte s utilisé.
Les polypeptide~. de la présente invention peuvent ensuite être isolés du milieu de culture par toute technique connue de l'homme du métier. Plus particulièrement, la partie C/ des exemples décrit un procédé permettant de purifier dans les conditions natives, c'est-à-dire sans aucune étape de dénaturation, les10 polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne des compositions phannaceudques comportant un ou plusieurs polypeptides selon l'inventdon ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'invendon.
Préférentiellement, de telles compositions sont destinées au traitement ou à
Is la prévention des affections liées aux hypercholestérolémies.
Encore plus préférendellement, l'invendon a pour objet des compositions pharmaceutiques comportant un ou plusieurs polypeptides selon l'învention, ou une ou plusieurs séquences nucléoddiques selon l'invention, desdnées au ralentdssement de la formation de plaques d'athérome, et/ou à la r~&ession des plaques d'athérome 20 et/ou à la diminudon des risques d'accidents coronariens.
De plus, la présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides décrits ci-avant pour la réalisation de molécules de structure non-peptidique ou non exclusivement peptîdique possédant le même type d'acdvité. A cet égard, I'învendon concerne l'utilîsation d'un polypeptide de l'invention tel que décrit 25 cî-avant pour la préparation de molécules non-pepddiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement sur les niveaux plasmadques de cholestérol, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont împortants pour son activité, et reproduction de ces éléments par des structures non-peptidiques ou non exclusivement peptîdiques. L'invention a aussi pour objet des30 compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules aînsi préparées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples ; suivants, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

WO 93/1~198 2 1 2 ~ S 7 7 PCr/FR93/00073 Il L~:GENDE DES FlGURES
Figure 1: Structure et construction du plasmide pXL1697 Figure 2: Structure des plasmides pXL1872 et pXL1867.
Figure 3: Structure des plasmides pXL1696 et pXL2051 s TECHNlOUE~ENERALES DE CLONAGE
Les techniques classiques de purification de plasmides, de préparation des cellules compétentes pour la transformation par la méthode au CaC12, sont décrites dans le manuel de laboratoire: T. Maniatis et Coll., Molecular cloning, 1982, Cold Spring Harbor Laborato y. Les séquences d'ADN ont été déterminées par la méthode10 de Sanger (Smith AJ.H., 1980, Methods in Enzymol. 65: 499-559). Les protocoles de clonage dans M13 sont décrits (Messing et Coll. 1981, Nucleic Acid Res. 9:
309-321)~ Les endonucléases de restric~ion (New England Biolabs) ont été utilisées selon les conseils du fabricant~ Le tampon utilisé pour les ligatures a la composition ` suivante: Tds-HCl 50 mM, MgC12 10 mM, DTT 15 mM, ATP 1 mM, pH 7,5. Le 15 tampon de phosphorylation des oligonucléotides a la composition suivante:
Tris-HCl S mM, MgCl2 1 mM, DTT 0,6 mM, pH 7,5~ La mutagénèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléoffdes est effectuée selon la méthode développée par Taylor et aL (Nucleic Acids ~es~ ~ (1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham~
. .
20 A - ~~YNTHESE ET ~SEMBLAGE l)E LA_ SEOUENCE COI:)ANTE DE
L'APOLIPOPROTEINE AIV ET ~REPAR~TION DES VEC~TEURS.
A~ - Sv~èse et a~bla~e d~l~!2nte de~AIV.
La séquence nucléotidique du gène de l'apolipoprotéine AIV décrite dans la présente invention diffère des séquences de cDNA publiées précédemment (voir en particulier 2s la liste des séquences cDNA publiée par C-Y~ Yang, Z-W. Gu, I. Chong, W~ Xiong, M~ Rosseneue, H. Yang, B. Lee, A~M. Gotto et L. Chan, 1989, B~B~A., 1002:
231-237). Notamment, la sequence codant pour le peptide signal de la protéine est absente, et, en amont du premier codon de la protéine mature a été placé un codon de démarrage de la t~aduction ATG~ Celui-ci introduit donc une méthionine surnumé-30 raire en amont de la sequenoe de la protéine mature, et permet ainsi d'exprimer le- gène codant uniquement pour la partie mature de la protéine.

WO 93/15198 PCI`/FR93/00073 ~ 12r~ ~7 D'autre part, cette séquence nucléotidique de l'apolipoprotéine AIV a été
obtenue d'une manière originale par l'assemblage de quatre oligonucléotides qui ont été synthétisés par voie chimique et dont la taille est comprise entre 86 et 107 mer (SEQ ID n 3-6). De plus, on peut remarquer sur la séquence des oligonucléotides5 que des extrémités cohésives XbaI et EcoRl ont été définies afin de pe~nettre un assemblage en deux étapes de la séquence complète de l'apolipoprotéine AIV.
1. Synthèse des oligonucléotides Les quatre oligodéoxynucléotides qui ont servi à l'assemblage du gène de l'apolipoprotéine AIV, ont été synthétisés par la méthode des phosphoramidites (LJ.
10 Bride et M.H. Caruthers (1983) Tetrahedron Lett. ~4: 245) aù moyen du synthé-tiseur Bioresearch (Modèle 8600) selon les conseils des fabricants. Les oligonucléo-tides ont été purifiés sur gel d'acrylamide 15 ~o. Leur séquence est donnée sur les séquences SEQ ID n 3-6.
2. Première étape d'assemblage Les oligonucléotides ont été phosphorylés par traitement avec la T4 DNA
kinase. Les oligonucléoddes A et C ont été appariés respectivement avec les oligonucléotides B et D dans des conditions stoechiométriques. L'hybridation desoligonucléotides a été réalisée dans des tubes Eppendorf immergés dans un béchercontenant environ 100 ml d'eau portée à 80C que l'on laisse revenir à la température 20 du laboratoire.
Les fragments A-B et C-D ont été ligaturés en présence de T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mplO au préalable digérée par les enzymes XbaI et EcoRI.
La forrne réplicative du bacteriophage recombinant obtenu appelé pXL1695 2s (M13mplQABCD) a servi à transfecter des bactéries TGl rendues competentes par la méthode au CaC12.
Ce réplicon pXL1695 a été purifi~, soit sous sa forme d`ADN simple brin et sa séquence a été vérifiée, soit sous sa forme d`ADN double brin réplicative pour la suite des constructions.
30 3. Deuxième étape d'assemblage La forme réplicative de pXL1695 ~M13mplOABCD) et un plasmide appelé
pXL1694 portant un fragment KnpI-HindIII d`environ 3 kb contenant la totalité du :`` . .

troisième exon du gène de l`apoAIV (N.A. Elhourbagv, J Biol. C:hem.. 19&7, 262:
79/3-7981) ont été respectivement dicerés par XbaI el BslEII d'une pa~ et EcoRI et BstEII d'autre part. Dans le cas de pXL169~, un fragment de 167 paires de bases a été purifié sur gel d`acrylamide. La forme réplicative du vecteur ~I13mpl8amIV aété ~igérée par XbaI et EcoRI et un fragment d'environ 7 kb a été purifié sur gel d`agarose.
Les trois fragments on été rassemblés et ligaturés en présence de T4 DNA
ligase.
Après transfection de TG1, des clones contenant la forme réplicative appelée pXL1696 ont été obtenus. La séquence codante complète du fragment XbaI-EcoRI ainsi cloné dans pXL1696 a été vérifiée. Ce fra~gment a ensuite été
re-extrait de pXL1696 et ligaturé en présence d`un fra~ment EcoRI-HindIII, d'environ 3 kb provenant de pXL1694 et portant en particulier la fin de l`exon 3 du gène de l`apoAIV humaine, et en présence également du vecteur M13mpl9, coupé
par les enzymes XbaI et HindIII.
Le vecteur recombinant ainsi obtenu, pXL1697, porte la totalité de la séquence codante de l'apoAlV (1132 bp) ainsi qu'un fragment génomique d'environ 2 kb correspondant à l'intron 3 du gène de l'apoAIV (figure 1).
Une mutagénèse dirigée effectuée avec le ki~ de mutagénèse Amersham (~PN 1~23) à l'aide de l'oligodeoxynucléotide synthétique SqlOB7: SEQ ID n 7, apermis d'introduire sur pXL1697 un site BamHI immédiatement après le codon Stop (TGA) du gène de l'apoAIV. Le vecteur obtenu a été dénommé pXL1866.
A2 - Preparation des vectçur~ portant la sé~uence de l'a~oAIV.
1. Préparation du vecteur pXLl872.
Le vecteur pXL1866 décrit ci-dessus a été coupé par les enzymes XbaI et bamHI, et un fragment de 1,1; kb contenant la totalité de la séquence codante de. l'apoAIV a été purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mp18amIV pour donner le vecteur pXL1~72 (fi~gure 2).
2. Préparation du vecteur pXL1867.
Le vecteur pXL1866 a été coupé par NdeI et BamHI et un fragment de 1,2 kb a été purifié puis inceré dans pET3-a, lui même coupé par BamHI et NdeI. Le ; vecteur d'expression .~ ltant, pXL1867, contient donc la séquence codante de ~: , : ~UILLE ~E REU~PLA~EU~ENT

~12~ g7'-i l'apolipoproleine AI~' sans aucun fra~ment résiduel de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoproléine AI~T (figure 2).

3. Préparation du vecteur pXL1696.
Le fragment XbaI-EcoRI de 570 pb contenant la partie 5` de la sçquence codante de l'apoAIV (résidus 1 à 189) a été excis~é du vecteur pXL1872, purifié sur gel d`agarose et religaturé dans M13mplO pour donner le vecteur pXL1696 (figure 3 ) . .. .

4. Préparation du vecteur pXL20~1.
Le fragment EcoRI-BamHI de S77 pb contenant la partie 3' die la séquence o co~ante de l'apoAIV (résid~s lS8 à 377) a été excIsé du vecteur p~1872, punfié
sur gel d'agarose et religaturé dans M13rnpl9 pour donner le vecteur pXL,2051 (figure 3).
B - GENERATION DES SEO~ENCES NUCLEOTIDIOUES CODANT POUR
~ S P.QLYPEPI'IDES DE L'I~T~EN~ E~ PRC~DUCT10~ ~ OE:S
-- T;~T ~T~r~T~C~
1~ r ~JL, ~ r ~r 1 lL,'L~.
Bl Mutants réalisés à partir du vectçul pXII 872 1. Génération des vecteurs pXL1775, pXL186~ et pXL2168,.et préparation des pol~peptides P(~N13,R93G), P('\N13) et P(tag~N13~.
A l`aide de l`oligodésoxynucléotide svnthétiqùe phosphonrlé SEQ ID n 8, une muta_enèse dirigée sur la forme simple brin du vecteur pXL1872 décrit ci-dessus a été réalis'e en u~ilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse A permis d'introduire un site NdeI ainsi qu'un codonATG d~ns la séquence codante de l'apoAIV a1LY positions respectives 40 et 43, provoquant une délétion des 13 premiers acides aminés N-terminaux. Par ailleurs, 25 lors de la vérification de séquence des dérivés obtenus, certains clones dont le clone pXL1799 portaient une mutation ponctuelle supplérnentaire en position 280 sur laséquence. Cette mutation (C->G) a pour effet de changer un codon arginine en glycine dans la protéine.
A partir du clone pXL1799 et d'un autre clone ne portant pas la mutation (C->G~ supplémentaire, un fragment NdeI-BamHI de 1097 pb a eté purifié et ~:EUILLE DE RE~JIPLACE~IENT

- ~125g~7 ligaturé avec le vecteur pET3-a (AMS Biotechnolo~)~ lui même coupé par les enzymes NdeI et BamHI.
Deux vecteurs recombinants ont aiSnsi été obtenus: Le vecteur pXL1775, qui permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des

5 13 acides aminés N-terminaux (l~N13) et une glycine au lieu d'une arginine en position 93 (R93G~; et le vecteur pXL1869, qui permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terrninaux ~'\N13).
A partir du vecteur pXL1869, le vecteur pXL2168 a été construit, dans lequel la séquence co~ant pour le polypeptide P(~N13) a été fusionnée en S` à une 10 séquence codant pour le décapeptide ta" MRGS(H)6~ Pour cela, les 2 oligodéoxynucléotides suivants OM été synthétisés, en utilisant unS synthhiseur d'ADN Biosearch 8600:
Oligo A: SEQ ID n 9 Oligo B: SEQ ID n 10 s oligodéoxynucléotides A et B ont été hybridés, et le prc~uit d'hybridation a été
ligaturé avec le v~cteur pXL1869, préalablement digéré par llen~me NdeI. Le vecteur ainsi obtenu, désigné pXL2168, code pour Ie polypeptide P(~N13) fusionnéen N-terminal au décapeptide MRGS(~I)6.
-2. Génération des vecteurs pXL1766 et pXL2182, et préparation du polypeptide 20 P(~C44) et de sa ~rersion tag.
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 11, une mutagénèse dirigée sur la forme simple brisn du plasmi~e pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Arnersham selon les recommandations dufabricant. Cette mutagénèse a pe~SiS d'introduire un site BamHI ainsi qu'un codon 25 . TGA dans la séquence codante ~e l'apoAIV aux positions respectives 1000 et 997, provoquant une délétion des 44 acides aminés C-terminaux.
A partir d'un ck.ne rnutant (pXL176~) dont la sequence a été vérifiée intétJra~ement, un fragment NdeI-BamHI de 1004 pb a été purifié et ligature avec le vecteur pET3-a, lui même coup~é par les enz,vmes NdeI et BamHI.
30Le vecteur recor r~inant pXL1766 ainsi obtenu perrnet d`exprimer à très haut niveau un polypeptide p/ ~sedant une déletion des 44 acides aminés C-terminaux (~C44).
En suivant le pr: ~ole décrit en B1~1), le vecteur pXL2182 a été construit à
partir du vecteur pXLI ` . Le vecteur pXL2182 ainsi obtenu permet d'exprimer à

FEUILLE DE RE'MPLAC'sts~9EN~

~1~3~77 haut niveau le polypeptide P(~C4~) fusionné en l~-tenninal au décapeptide MRGS(H)6.
3. Génération du vecleur pXLl / l4 et préparation du polypeptide P(~C194).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide s~,~thétique phosphorylé SEQ ID n 12, 5 une mutaaénèse dirigée sur la fonne simple bnn du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a permis d'introduire un site BamHI ainsi qu'un codon TGA dans la séquence codante de l'apoAIV aux positions respectives 553 et 550, provoquant une délétion de 194 acides arninés du coté C-terminal.
A partir d'un clone mutant (pXL1798) dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment NdeI-BamHI de 55; pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1774 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 194 derniers acides aminés C194).
- 4. Génération du vecteur pXL1817 et préparation du polypeptide P(AN182).
A l'aide de l`oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 13, une mutagénèse dirigée s~r la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a permis d'introduire un site NdeI ainsi qu'un codonATG dans la séquence codante de l'apoAIV aux positions respectives 544 et 547, provoquant une délétion de 182 acides aminés du coté N-terminal.
A par~ir d'un clone mutant (pXL176~) dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment NdeI-BasnHI de 579 pb a été purifié et ligatùré avec le 2~ vecteur pET3-a, lui meme coupé par les enzvmes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1817 ainsi obtenu permet d`exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 182 premiers acides aminés (~N182).

5. Génération des vecteurs pXL1981 et p~L2183, et préparation des polypeptides 30 P(~hl-2) et P(tagAh1-2).
A l'aide de l`oligodéso.~cynucléotide synthétique phospho~ylé SEQ ID n 14, une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réaiisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du - fabricant. (:ette mutagénèse a perrnis de déléter la partie de la séquence codante de ' FEUILLE DE RE9JIPLACE~E~I

~12~ ~ 7 7 l'apoAIV compnse entre les positions 40 et 186, provoquant une délétion de 49 acides aminés, du résidu D14 au résidu V62.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été véri~iée intégralement, un fragment NdeI-BamHI de 990 pb a été purifié et ligaturé avec le.vecteur pET3-a, lui S même coupé par les enzymes NdeI et BamHI
Le vecteur recombinant pXL1981 ainsi obtenu perrnet d`e~:primer à très haut niveau un polypeptide possédant une délhion des hélices 1 et 2 ( hl-2).
Erl suivant le protocole décrit en B1.1), le vecteur p~2183 a été construit à
partir du vecteur pXL1981. Le vecteur pXL2183 ainsi obtenu perrnet d'exprimer à
lo haut niveau le polypeptide P( hl-2) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.

6. Génération des vecteurs pXL1943 et p~2184, et préparation des polypeptides P( h7-8) et P(tag~h7-8). .
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 1~, une mutagénèse dirigée sur la forme simple brL~ du plasrnide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du ~abricant. Cette mutagénèse a permis de c~éIéter Ia parhe de Ia séquence codante de - l'apoAIV comprise entre les positions 484 et 61; provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P162 au résidu A205.
~0 A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vétifiee intégr~ement, un fragment NdeI-BamHI de 1005 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a,lui-même coupé par les enzymes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1943 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant ime délétion des hélices 7 et 8 ll~h7 8).
En suivant le protocole décrit en B1.1~, le vecteur pXL2184 a été construit à
partir du Yecteur pXL1943. Le vecteur pXL2184 ainsi obtenu permet d'exprimer à
haut niveau le polypeptide P(~h7-8) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.

7. Génération des vecteurs pXL1982 et pXL2215, et préparation des polypeptides P(/~h9-10) et P(tag h9-10).
A l'aide de l`oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 16, une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a permis de déléter la panie de la sé~uence codante de FEUILLE DE REMPLA~:E~EN`.

=~ ~

~12~7 l'apoAIV comprise entre les positions 616 et 74/, provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P206 au résidu A249.
A partir d`un clone mutant dont la séquence a élé vérifiée intégralement, un fragment NdeI-BamHI de 1005 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a,s lui-meme coupé par les enzy~es NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1982 ainsi obtenu perrnet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 9 et 10 (~h9-10).
En suivant le protocole décrit en B1 1), le vecteur pXL2215 a été construit à
partir du vecteur pXL1982. Le vecteur pXL2215 ainsi obtenu permet d'exprimer à
10 haut niveau le polypeptide P( h9-10) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.

8. Génération du vecteur pXL1986 et préparation du polypeptide P(~h11-12,L87M).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorvlé SEQ ID n 17, une mutagénèse dirigée sur la forme simple ~rin du plasmide pXL1872 décrit ci-15 dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersh m selon les recommandations dufabricant. ~ette mutagénèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de rapoAIV comprise entre les positions 748 et 867, provoquant une déIetion de 40 acides aminés, du résidu P250 au résidu E289. Par ailleurs, lors de la vérification de séquence des dérivés obtenus, certains clones portaient une mut~tion ponctuelle ~o supplémentaire sur la séquence. Cette mutation ~L->M) a pour e~et de changer le codon leucine 87 en methionine dans la protéine.
A partir de ce clone et d'un autre clone ne portant pas la mutation (L->M) supplémentaire, un fragment NdeI-BamHI de 1017 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes NdeI et BamHI.
2~ Deux vecteurs recombinants ont ainsi été obtenus, dont l~ vecteur pXL1986 qui permet dlexprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 11 et 12 ~hll-12) et une méthionine au lieu d`une leucine en position 8f(L87M~.
En suivant le protocole décrit en B1.1), le vecteur pXL2186 a été construit à
30 partir du vecteur obtenu ci-dessus, codant pour le polypeptide P(~h11-12). Levecteur pXL2186 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(~h11-12) fusionné en N-tenninal au décapeptide MRGS(H)~.

9. Génération des vecteurs pXL1987 et pXL2217, et préparation des polypeptides P(~hl3-14) et P(tag/~hl3-14~.

FEUILLE DE REMPLACE~IENT

5~ ' 8~7 l9 A l'aide de l`oligodésoxynucléolide svnthétique phosphorvlé SEQ ID n 1~, une mutagénèse dirigée sur la forme simp]e brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandalions du fabricant. Cette muta_énèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 86~ et 999, provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P290 au résidu N333.
. A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un ~raoment NdeI-BamHI de 1005 pb a été purifié et li~,,~ture avec le ~çcteur pET3-a, lui meme~coupé par les enzymes NdeI et BamHl.
lo Le vecteur recombinant pXL1987 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possedant une délétion des hélices 13 et 14 (~h13-14).
En suivant le protocole décrit en 131.1), le vecteur pxr ~17 a été constmil 2 partir du vecteur pXL198/. Le vecteur pXL2217 ainsi obtenu permet d'exprimer à
haut niveau le pol,vpeptide P( hl3-14) fusiormé en N-terminaI au décapeptide MRGS(H)6~

.
~2 . Mutants réalisés à par~ir du plasmide pXL1696 1. Génération des vecteurs pXL2071 et pXL2185, et préparation des polypeptides P(~h5-6) et P(tag~h5-6).
A l'aide de l'oligodésoxvnucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 19~
une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon le~ recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a permis de déléter la par~ie de la sequence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 352 et 483, provoquant une délétion de 44 2~ acides aminés, du résidu P118 au résidu R161.
A partir d`un clone mutant dont la séquence a été vérifiée inté_ralement. un fragment NdeI-EcoRI de 432 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment E:coRI-BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzvmes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2~71 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possedant une delétion des helices 5 et 6 (~hS-6).
En suivant le protocole décrit en B1.1), le vecteur pXL2185 a eté construit à
partir du-vecteur pXL20/1. Le vecteur pXL2185 ainsi obtenu perrnet d`exprimer à

FEUILLE DE RE~!APLACE~JIENT

~12S8~7 haul niveau le polypeptide P(~ 6) fusionné en ~-te~rninal au décapeptid~
MRGS(H)6.
2. Génération du vecteur pXL2063 et préparation du polypeplide P(D5S).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphor,vlé SEQ ID n 20, S une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2~ a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette rnutagénèse a permis d'introduire un codon AGC dan~s la sé~uence codante de l'apoAIV, prov~quant le remplacement de l'acide aspartique par une sérine en position 5.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment NdeI-EcoRI de ~64 pb a été purifié, puis li.~aturé avec le fraoment EcoRI-BamHI isolé du plasmide pXL20~1 et le vecteur pET3-a ou~ert par les enzymes NdeI et BamHI
Le vecteur recombinant pXL2073 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut 1~ niveau un polypeptide possédant une sérine en position ~.
3~ Génération du vecteur pXl:,2069 et préparation du polypeptide P(D~K~.
A l'aide de lloligodésoxynucléotide synthétique phosphor,vlé SEQ ID n 21, une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL16~6 (Cf exemple A2) a eté réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon ~A dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une lysine en position 5.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiee intégralement, un fra~ment NdeI-EcoRI de 564 pb a été purifie, puis li~ature a~ ec le fragment EcoRI-2~ BarnHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2069 ainsi obtenu permet d'e~;primer à très haut niveau un polypeptide possédant une lysine en position 5.
4. Génération du vecteur pXL2062 et préparation du polyF~eptide P(D44F).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé SEQ ID n 22, une mutagénèse di~igée sur !a forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabrican~. Cette mutagénèse a permis d'introduire un codon Tl`C dans la séquence .

i~EUILLE DE RENIPLACE~AENT

- ~12~77 codante de l'aooAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une phénylalanine en posilion 4~.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment NdèI-EcoRI de 564 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI-BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzvmes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2062 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut -- niveau un polypeptide possédant une phénylalanine en position 44. ----5. Génération du vecteur pXL2074 et préparation du polypeptide P(D44A).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorvlé SEQ ID n 23, une muta,énèse dirigée sur la fonne simple brin du plasmide pXL1696 ~Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Arnersham selon les recommandations du fab~icant. Cette mutagénèse a permis d'introduire un codon GCG dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l`acide aspartique par une alanine en position 44~
; A pardr d'un clone mutant dont la séquerice a été vérifiée intégralement, un fragment NdeI-EcoRI de ~64 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI-BamHI iso!é du plasmide pXL20~1 et le vecteur pET3-a ouvert par-les enzvmes ~ ~ ~ NdeI et BamHL
;~ ~ 20 Le vecteur recombinant pXL2074 ainsi obtenu perrnet d'exprinler à très haut niveau un polypeptide possédant une alanine en position 44.

333: Mutants réalisés à ~artir du plasmide pXL20~1 1. Génération du vecteur pXL2073 et préparation du polypeptide P(K178A).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide ~nthétique phosphorylé SEQ ID n 24, 2~ une mutagénèse dirigée sur la forrne simple brin du plasrnide pXL20~1 (Cf exemple A2j a éte real~sëe en utilisant le kit Arnersham selon les recommandations du fabricant. Cette mut~l~enèse a perrnis d'introduire un codon GCG dans la séquence codante de l'apoAIV, ~c~ovoquant le rernplacernent de la lysine par une alanine en position 178.
A partir d`~ 'one mutant dont la sequence a eté vérifiee intégralement, un fragmènt EcoRl- ~3am l-~ de ~72 pb a été purifié, puis li~ature avec le fra~ment l~deI-FEI.JILLE DE REMPLACE~i~ENT
: ~ .

~125~77 EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzvmes NdeIet BamHI.
Le vecteur recombinant pS~L20 /3 ainsi obten~ permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une alanine en position 178.
2. Génération du vecteur pXL2070 et préparation du polypeptide P(K178Y).
A l'aide de l`oligodésoxynucléotide s~nthétique phosphorylé SEQ ID n 25, une mutagénèse dirigée sur la forme simple bnn du plasmide p~20~1 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a permis d'introduire un codon TAT dans la séquence ~o codante de l'apoAIV, provoquant Ie remplacement de la Iysine par une tyrosine en position 178.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiee intégralement, un fragment EcoRl-BamHI de 572 pb a été purifié, puis ~ga~ avec le fraO~nent NdeI-EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymesl~ NdeI et B~mHI.
Le vecteur recombinant pXL2070 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une tyrosine en pos~tion 178.
3~ Génération du vecteur pXL2072 et preparation du polypeptide P~E230K~.
A l'aide de l`oligodésoxynucléotide syn*létique phosphorylé SEQ ID n 26, une snutagénèse dirigee sur la forrne simple br,in du plasmide pXL2051 (C~ exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse a pe~nis d'introduire un codon A~A dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquanl le remplacement de l'acide lutamique par une lysine en position 230.
2~ A partir d`un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement. un fragment EcoRI-BamHI de ~72 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment NdeI-EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes NdeIel BàmHI.
Le vecteur recombinant pXL2072 ainsi obtenu permet d`exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une lysine en position 230.
B4: Production des polvpeptides décrits dans les parties Bl-B3.

FEUILLE DE RE~lPLA~::E.~3~ENT

WO 93/15198 ~12 5 ~ 7 7 pcr/FR93/ooo73 NdeI-EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzy nes NdeI et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2070 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une tyrosine en position 178.
s 3. Génération du vecteur pXL2072 et préparation du polypeptide P(E230K).

A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé suivant:
5'-AAGAAGAACGCC ~ GAGCTCAAGGCCAG-3', une mutagénèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL2051 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagénèse lo a permis d'introduire un codon AAA dans la s~quence codante de l'apoAlV, provoquant le remplacement de l'acide glutamique par une Iysine en position 230.A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment EcoRI-BamHI de 572 pb a été purifié, puis ligaturé avec k: fragment NdeI-EcoRl isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes NdeI15 et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2072 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypepdde possédant une lysine en position 230.
B4; Production~olvpeptid~écrits ~n~ les ~arties B1-~3.
1. Production: On utilise par exemple la souche BL21 DE3 (pLysS) contenant un 20 plasmide d'expression d'un polypeptide de l'invention tel que décrit dans les parties B1-B3.
Une preculture de nuit en milieu LB contenant de l'ampicilline (100,ug/ml) et du chloramphénicol (50 ~g/ml~, LB~Cm, à 37C, sert à inoculer au 1l100ème la culture de production ~même milieu~. La culture est agitée à 37C jusqu'à une densité
2s optique (mesurée fi 610 nm) de 0,5. On ajoute alors de l'IPTG à la concentration finale de 1 mM et les cellules induites pour l'expression de l'ARN polymérase de 17 sont incubées pendant 90 ou 180 min. L'analyse des extraits bactériens par gel d'électrophorèse coloré au bleu de coomassie permet de révèler une accumulation dans les extraits des cultures de 90 min du polypeptide de l'invention. Par ailleurs, ce 30 polypeptide peut être stabilisé par ajout de rifampicine durant la phase de production.
Les seuls ARNm pouvant alors être néosynthhisés sont ceux qui ne dépendent pas de WO 93/15198 PCl'/FR93/00073 l'ARN polymérase d'E.col;. On peut ajouter par exemple 20 min après l'ajout de l'In`G de la rifampicine à des concentrations qui peuvent être comprises entre 50 et 200 ~g/ml. Les cellules qui ne produisent alors plus que le seul ARNm du polypeptide désiré à l'exception de tous les autres sont incubées entre 90 et 180 min à
s 3PC.
Dans ce cas, le polypeptide recombinant produit peut représenter de 20 à
30 ~o des protéines totales produites par la bactérie. De plus le polypeptide est ainsi accumulé sans dégradation dans la bactérie sous forme soluble.
La production a été extrapolée en fermenteur, par culture haute densité de lo E.coli en mode Fed-Batch. Cette production a été réalisée dans un ferrnenteur de 2 litres (Setric) en 2 phases: une phase de ~oissance du microorganisme jusqu'à une DO600 de 30 à 40 (durée: 5 heures environ). Cette phase est réalisée dans le milieu de fermentation défini par Jung et al. (Ann.Inst.Pasteur/Microbiol. ~ (1988) 129-146); puis une phase d'induction de la production, par addition d'lPTG et derifampicine, et augmentation du débit d'alimentation en substrats carboné et azoté
(durée: 1 heure 30 minutes environ).

2. Lyse des cellules et récupération du polypeptide recombinant.
Après la culture de production, les cellules sont collectées puis Iysées, par exemple par sonication. A l'échelle du laboratoire, il a été utilisé un sonicateur Branson (mod~le B30, Proscience, France) après avoir concentré 30 fois les cellules dans le tampon PBS (KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,25 g/l~.
Le cassage des cellules est effectué à 4C en mode continu (2 impulsions de 5 ~unutes~. On peut également prétraiter la suspension cellulaire concentrée en 2~ presence de Triton X-100 à la ~empérature ambiante avant la sonication.
C/ PURIF~CATION DES PQLYPEPTID~S DE: L'INVENTION.
C1. Les polypeptides P(R93G), P(/~C44) et P(~N13) ont été purifiés selon le protocole suivant, qui se d~roule en conditions natives et ne requiert aucune étape d'affinité pour les lipides.
La culture cellulaire est centrifugée à 6.000 tr/min pendant 30 minutes et le culot est repris à raison de 3 ml par gramme de cellules humides dans le tampon A
(Na2HPO4 81 mM, NaH2PO4 19 mM; EDTAt 2 mM; PMSF, 1 mM; pH 7,5;
~mercaptoéthanol 10 mM). La suspension est ~itée par 8 cycles de 3 minutes :
~::

WO 93/15198 PCr/FR93/00073 21~

d'ultrasons (modele BRANSON règlé à 250W) à 4C. Les extraits sont centrifugés pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4C. Le surnageant Sl est conservé et le culot est lavé dans le même volume de tampon A e$ recentrifugé dans les mêmes conditions.
Le surnageant comspondant S1' est ajouté au surnageant Sl.
Après un dosage des protéines de la fraction (Sl + Sl') est ajoutée une solution aqueuse de sulfate de streptomycine à 10 ~o à raison de 10 ml de solution par ~amme de protéine. Après 15 minutes d'incubation à 4C sous agitation douce, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4C. Le surnageant (S2) est récupéré. A cette fraction S2 est ajouté du sulfate d'ammonium (concentration finale: 25 % de saturationl. Après 1~ minutes d'incubation à 4C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4C. Au surnageant S25 est ajouté du sulfate d`ammonium (concentration finale: 50 % de saturation).Après 15 minutes d'incubation à 4C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 min à 15.000 tr/min à 4C. Le culot (C50) est récupéré et repris dans le tampon B (Tris-HCI, 10 mM; EDTA, 2 mM; pH8.8) et dialysé contre 21 de tampon B que l'on change ~ fois durant 48 heures.
Le dialysat est injecté sur une colonne échangeuse d`ions de type QFF
(Pharmacia) et élué avec un gradient de NaCl. La détermination des fractions conte-nant les polypeptides de l'invention est effectuée selon un test en Elisa décrit ci-après.
Les fractions intéressantes sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale : 80 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 4C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à
15.000 tr/min à 4C. Le culot (C80) est récupéré et repris dans le tampon B et dialysé
c~ntre 21 de tampon B.
Le dialysat est injec$é sur une colonne échangeuse d'ions de type Mono Q
(Pharmacia~ et élué avec un gradient de NaCl. Les fractions intéressantes, identifiees par le test Elisa ci-après décrit et gel SI)S 15 ~o, sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale: 80 % de satu~ation). Après 15 minutes d'incubation à 4C sous agitation, la suspension est centrifugée et reprise dans le tampon D (sulfate d`ammonium, 1,7 M; Na2HPO4 8,1 mM, NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4~ et dialysée contre 21 de tampon D.
Le dialysat est injecté sur une colonne de chromatog;raphie d'interactions hyd~ophobes Phényl-sépharose (Pharmacia) et élué avec le tampon E ~Na2HP04 8,1 mM; NaH2PO4 1,9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4). L~s fractions intéressantes sont 35 identifiées par test Elisa et gel de polyacrylamide SDS.

Wo 93/15198 PCl /FR93/00073 ~12~877 26 Brièvement, le test ELISA mis au point consiste à adsorber sur une plaque avec un sérum polyclonal de lapin dirigé contre l'apoAIV hu naine (dilué au 1/lOOOème), saturer cette plaque à la gélatine, incuber l'échantillon à tester et enfin, faire réagir un mélange équimolaire de deux anticorps monoclonaux dirigés contres l'apoAlV (~03 et M05, SERLlA, Institut Pasteur de Lille), suivi d'une` révélation immunoenzymatique à l'aide d'un sémm polyclonal anti-souris couplé à la peroxydase.
Ce test est facilement étalonné avec une gamme de dilutions de l'apoAIV plasmatique.
Ces fractions sont rassemblées et dialysees contre le tarnpon F (sulfate d'ammonium, 40 % de saturation; Na2HPO4 8,1 mM; NaH2PO4 1,~ mM; EDTA, lO 2 mM; pH7.4) et conservées à 4C.
C2. Pour les polypeptides P(~hl-2)1 P(~h5-6), P(~h13-14) et P(~\N182), la fraction S2 est directement injectée sur coloMe de type QFF (sans précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium) équilibrée en tampon B. Le polypeptide est exclu (P(~N182)) ou élué avec un palier à 250 mM NaCl en tampon B (P(~ 2)). Le 15 polypeptide est ensuite concentré par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale 50 ~o de la saturation pour P(~h1-2), 10 ~o pour P(/~N182)). La purification de P(~h1-2) est terminée par une centrifugation (30 min., 4C, 10 000 g).
Le culot est récupéré, repris en tampon PBS, désalé sur colonne de gel-filtration PD10 (I?hamlacia) et s~ché à - 20C. Le polypeptide P(~N182) précipité au sulfate 20 d'ammonium est injecté sur une colonne de chromatographie d'interactions hydr~phobes phényl-sépharose (Pharmacia) et élué avec le tampon B. Le polypepddeest identifié par gel de polyacrylamide SDS, et les fractions interessantes sontrassemblées et dialysées contre le tampon B et conservées à 4C.
C3. Les polypeptides P(tag~N13), P(tag~C44), P(tagl~ 21, P(tagQh7-8), 25 P(tagl~h9-10), P(tag~h11-12), P(tag~h13-14) et P(tag~h5-6~ ont été purifiés selon le protocole suivant, qui ne comprend qu'une seule étape.
La culture cellulaire est centrifugée à 6.000 tr/min pendant 30 minutes et le culot est repris à raison de 3 ml par gramme de cellules humides dans le tampon A
(Na2HP04 81 mM, NaH2P04 19 mM; EDTA, 2 mM; PMSF, 1 mM; pH 7,5;
30 ~mercaptoéthanol 10 mM). La suspension est traitée par 3 cycles de 5 minutes d'ul-trasons (modèle BRANSON règlé à 250W) à 4C. Les extraits sont centrifugés pen-dant lh à 11.000 g à 4C. Les acides nucléiques présents dans le surnageant ont eté
precipités par addition de 10% (w/v) de sulfate de streptomycine (10 ml/g protein), incubation 30 min. à 4C, puis recentrifugé dans les mêmes conditions que 35 précédemment.

:

WO 93/15198 2 1 2 ~ g 7 7 PCI /FR93/00073 Les protéines recombinantes présentes dans le surnageant ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur ion métallique chélaté. La purification a étéeffectuée sur résine agarosei-acide nitrilotriacétique-nickel (NTA-Ni) selon lesrecommandadons du fabricant, avec les modifications suivantes: La solution 5 protéique est désalée sur une oolanne Tris-Acryl GF-05 équilibrée avec un tampon phosphate 100 mM pH 8. Les fractions protéiques récoltées s~nt réunies, diluées dans le même tampon phosphate jusqu'à une concentration finale de 4 mg/ml, et supplémentées de Hecameg (poudre?, concentration finale 25 mM. Le mélange a ensuite été chargé sur une colonne Ni-NTA équilibrée avec le même tampon

10 phosphate contenant 25 mM de Hecameg. Aucune protéine fixée n'a été éluée parlavage de la colonne avec le même tampon. Les protéines faiblement liées ont étééluées par un tampon phosphate/citrate pH 6, et les p~otéines recombinantes, par un tampon phosphate/citrate pH 5. Les fractions protéiques obtenues à pH 5 ont été
neutralisées par addidon de soude lM (30 IlVml) et supplémentées de 2 inhibiteurs de protéases: EDTA 0,lM et PMSF 0,2M. Les fractions ont ensuite été analysées par éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) contenant 15~o d'acrylamide/bis-acrylamide, selon Laemmli (Nature ;~ (1970) 680), puis regroupées selon la pureté et la quantité. Les fractions regroupées ont été incubées en présence de L(-)-histidine poudre (concentration finale 50 mM), pendant lh à 4C, 20 afin de détruire la liaison Ni-poly-His-protéine. Le nickel et l'histidine libérés ont ensuite été éliminés par desalage sur colonne Tris-Acryl GF-05 équilibrée avec un tampon phosphate pH 7,4 contenant 2mM EDTA.
Les protéines recombinantes ainsi purifiées ont été analysées par éléctrophorèse SDS-PAGE et immlLnoblotting~. L'immunobloning a été réalisé avec 25 un mélange d'anticorps monoclonaux anti-ApoAIV conjugués à la peroxydase, et d`anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la peroxydase. L'activité peroxydase liée a été révélée par incubation avec ~e solution de 4-Chlor~l-Naphtol comme substrat.
Les différents chromatogrammes ont été suivis par détection UV à 280 nm.
30 La concentration en protéine a été déterminée selon la technique de Bradford (Anal.Biochem. ~ (1976) 248).

Wo 93/15198 PCr/FR93/00073 21'~5~77 28 ,D/ CARACTERISATION BIOLOGIOU~ DES POL~EErrII2ES DE
,L'INVENTION.
L'activité biologique des polypeptides de l'invention a été évaluée principalement sur la base de 2 paramètres: leur affinité pour le récepteur HDL et S leur effet sur l'emux du cholest~rol. Ces 2 paramètres rendent comptent du potentiel pharmacologique hypocholestérolémiant des polypeptides de l'invention. Le protocole de détermination de ces paramètres est donné ci-après ainsi que les ~esultats obtenus.
1. Prot,ocoles de mesure.
0 a) Affinité pour le récepteur HDI, Les polypeptides purifiés sont utilisés dans un premier temps pour econstituer des pr~téoliposomes avec du DMPC, dont la s~cture apparaît identique, au vu du comportement en chron~atographie d'exclusion, à celle des oliposomes reconstitués avec de l'apoAIV native. Ces protéoliposomes 15 reconstitués sont ensuite testés pour leur capacité de se fixer à des adipocytes murins (lignée Obl77) selon un protocole déjà décrit.
b) Efflux du cholestérol L`efflux du cholestérol à partir de cellules adipocytaires murines (lignée Obl77) provoqué par les protéoliposomes DMPC-polypeptides de l'invention est 20 déterminé apr~s 5 heures d'incubation.
2. Résultats Polypeptide Kd(~o) Bmax(~o) Efflux à 5h (%)*
ApoAIV 100** 100** 28 P(R93G) 115 97 27,5 P(~h1-2) 105 94 23,5 P(~C44) nd nd 32 P(/\N13) 96 94 24 (*) Exprimé en % du cholestérol initial des cellules chargées, l`efflux de base obtenu en présence de DPMC seul après 5 heures est de 11%.
30 (**) Réalisé sur trois expériences indépendantes.

.5.~

21 ~ ~ ~, 7 i LISTE DE SEQlJENCES
~]) IN~ORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
~B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C~ VILLE: ANTONY
(E) PAYS: ERANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLYPEPTIDES, LEUR PREPAR~TION ET
LEUR UTILISATION.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6 ) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR IBM PC compa*ble (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release ~1.0, Version ~ 5 (OEB) (v) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE:
NUMERO DE DEPOT: PCT/FR93/00073 ~2) ~NFORMATION E~OUR LA SEO ID NO: 1:
(i) CARACIERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 1134 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique ~C) NOMBRE ~E BR~NS double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) l~YPE l~E MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETlQUE NON
(iii) ~TI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Sequence nucleotidique de l`apolipoproteine AIV
~ix) CARACTERISTIQUE ADDmONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1134 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 40..120 FEUILLE DE RE~ PLA~Er'~

WO 93/15198 PCI`/FR93/00073 ~..' 21 2587'~ 30 "

(ix) CARACTERISI IQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 121..186 (ix) CARACI ERISllQUE ADDlTlONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 187.285 (ix) CARACTERISIIQUE ADDlTlONEELE:
(A) NOM/CLE: Boucle ~B) EMPLACEMENT: 286..351 10 (ix) CARACTERISI IQUE A`DDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) Eh~PLACEMENT: 352..417 (ix) CARACTERISTIQUE AD~ITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 418.. 483 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 484..549 (ix) CARACll~lSllQUE ADDlTlONELLE:
(A) NOM/CLE Boucle (B) EMPLAOEMENT: 550..61~
(ix) CARACTERlSIlQUE ADDITIONFl 1 F.
(A) NOM/CLE: Boude (B) EMPLACEMENT: 616..681 25 (ix) CARACTERISrlOUE ADDlTIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle - (B) EMPLACEMENT: 682.. 747 (ix) CARACTERISllQUE ADDITIONELLE:
(A~ NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 748.. 801 (ix) CARACTERISIIQUEADr)l'rlONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 802..B66 ~ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: E~oucle (B) EMPLACEMENT: 867..~33 (ix) CARACTERISIlQUE ADDlTlONEl l F~
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 934..999 wo 93/lslg8 2 ~ 2 5 ~ ~ ~ PCr~FR93/00073 (LX) CARACI'ERlSrIQUE ADDlTlONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle (B) EMPLACEMENT: 1000..1131 (xi) DESCRIPIlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp Asp Tyr Phe 10. Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp Lys Leu Gly Glu Val Asn - Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu Lys Leu Lys GAG GAG ATT GGG }~AG GAG CTG GAG GAG CTG AGG GCC CGG CTG CTG CCC 288 Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Leu Pro :

His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp S;lu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly Leu Thr Phe WO 93/15198 PCI`/FR93/00073 ~12~)87 ~ 32 Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ser GCC GAG GAG CTG. CGG CAG AGG CTG GCG CCC TTG GCC GAG GAC GTG CGT 768 Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn Ser Phe Phe AGC ACC TTC AAG GAG AAA G~G AGC CAG GAC AAG ACT CTC TCC CTC CCT 1056 Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser (2) 1NFORMATIONPOI~l~ ~QIP NQ~
(i~ CARACrERISIlQUES DE LA SEQI)ENCE:
4j (A) LONGUEUR: 377 ~cides amin,s (13) ~YPE: a~de amin, (D~ CONFIGURATION: lin,aire (ii) l'YPE DE MOLECULE: prot,ine ~0 (xi) DESCRIPI`ION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp Asp Tyr Phe ~5 Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His Leu Gln Lys ~ 25 30 Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp Lys Leu Gly W 0 93/151~8 21 ~ ~ 8 7 7 PCT/FR93/00073 Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Val Lys 180 185 190 :~
Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Tyr Ala 195 . 200 205 Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln Gln Met Glu 2gO 295 300 Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln 355 360 365 :
Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser wo 93/lslg8 ~ 1 ~ 5 ~ 7 I PCr/FR93/00073 ~2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 3:
(i) CARACTERIST. IQUES DE LA SEQUENCE:
S (A) LONGUEUR: 84 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,i~ue (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: lin,aire (u) mE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
~S
(vi) ORIGINE:
: ~ (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE A

20 ~xi) DESCRIlrrlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
: CTAGACATAT GGAGGTCAGT GCTGACCAGG TGGCCACAGT GATGTGGGAC TACTTCAGCC 60 ~2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 94 paires de bases :: 30 (B) TYPE: acide nucl,ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CON~IGURATION: lin,aire (ii) TYPE DE MOEECULE: ADNc (iii~ HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: o1igonucleotide B

(xi) DESCRI~ION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
4~

50 (2) INFORMATlON POUR LA SEO ID NO: 5:
(i) CARACIERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 86 paires de bases (B) TYPE: acide nucl,ique 2125~

~2) INFORMATIOI~ POUR L.~ SEO IT~ !~O 5:
(ij CARACTERlSTIQUES DE L.~ SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 86 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii~ TYPE DE MOLECULE: A~Nc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON :
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIl:~E C
(xi) DESCRIPllON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5- :
CCACGGCCTC CTTGGCATTG T~GCTCAGCT GGCTGAAGTA GTCCCACATC ACTGTGGCCA 6 INFORMATTON POUR LA SEO ID NO: 6-(i) CARACTERISTIQUES DE T_A SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 92 paires de b~es (B) TYPE: acide nucleique ~C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE NON
~iii) ANTl-SENS: NON
- ~vi) QRIGINE:
2~ (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE D
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
AATTCGGTCA CCTGCGTAAG TGTTCACTTC TCCAAGTTTG TCCTGGA~GA GGGCATTGAG 60 . TTGCTGGGTG AGTTCAGATT TCTGGAGATG TT 92 30 (2) I.~FQRMATTO~ POUR L~ SEO II~ Q: ?:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LON&UEI~R: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique ~C) ~;lOMBRE DE BRINS: simple FEUILLE DE RE911PLA~:E~

(D) CONFlGUR4.TlON: linéaire (ii) IYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDEsqlO87 (xi) DESC~I~ION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GCCCCTTTGG AGAGCTGAGG ATCCCCTGGT GCAC~GGCCC CA ~2 t2! INFOR1~AIION POUR LA SEO rD I~O: 8:
(i) CAR~CTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CO~FIGURATION: linéaire :
(ii~ TYPEDEMOLECULE ADNc (vi~ ORIGINE:
(A) ORGANISME OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

~2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 9:
~il CARACTER~STIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 31 pures de bases (B) I~YPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéa~re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME OLIGONUCLEOTIDE A
(xi) DESCRIPTION DE LA SEC~UENCE: SEQ ID NO: 9 - (2) INFORMATIO~ POUR LA SEO 11:) ~O: 10 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paites de bases (B) IYPE acide nucléique - (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DF. ~OLECULE: ADNc FEUILLE DE RE~IIPL~CEES~NT

-(~i) ORIGINE:
(A) ORGAI';IS~SE: OLIGONUCLEOTIDE B
(xi) DESCRIPIION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
TATGGTGATG GTGATGGTGC GGATCCACGC A~ 32 (2) INFORM.~TTON POUR I A SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 46 paires de bases ~B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) mE DE MOLECULE: ADNc (~i) ORIGINE:
~A) ORGANISME: OLIGONUCLEO'I-IDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
1~ CTGAGG~.~CA AGGTCAACTG AGGATCCAGC ACCTTCAAG~ AGAAAG 4 G
~2) INFORMATIOI~ POUR LA SEO ID NQ: 12:
(i) CARACTERISTI~UES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple CONF~GURATION: lineaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONIJCLEOTIDE
2~ (xi) DESCRIPIION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CTC~GG~AC GCCTTACGTG A~GATCCGAC GA~TTCCAAA GTC 4' (~) INFORMATIO~l POUR LA SEO ID NQ 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A~ LONGUEUR: 39 paires de bases (B) ~PE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) lYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
3~ (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE

FEUILLE DE REMPLA~ ENT

212~8~7 (xi) DESCRIPTION DE L.~ SEQl lENCE: SEQ ID NO: 13:
GAGCTC~GG GACGCCAT.~ GCCC~AC~Cm GAC~mTC 3 (~INFORMATION POUR LA SEOID NO:]4 (i) CARAClERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 30 paires de bases ~:
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) l~YPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPllON DE L~ SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

~) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1~:
(i) CARACl~RISTIQUES DE LA SEQUE~CE
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUR:ATION: lineaife (ii~ l YPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPrION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CAGGCCTCGC ~GAGGCCCTA TGCTCAGGAC 30 25 (2~ INFORMATION POUR LA SEO ID NO~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMB~E DE BRINS: simple (D) CONFlGURATION: lineaire (ii) lYPE DE MOLECULE: ADNc (vi~ ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGON11CLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE L~ SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
35 CGCCGCAGCr TGG~TCCCTT G~CCGAGGAC . 3 FEUILLE DE RE~IIPL~C~ NT

212~'~77 ,9 (21 I~FORMATIOI~ POUR LA SEO ID NO: l7: ;:
~it CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: :
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) ~YPE: acide nucleique -(C) NOMBRE DE BE~NS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (u) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi~ ORlGINE:
(A) ORGANISME OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

(2)1NFORMATION POUR LA SEO 1D NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:30 paires de bases 1~ (B)l'YPE acidenucleique :::
:: ~: (C) NOMBRE DE BRlNS: simple.
(D)~ONFIGURATiON: lineaire u~ TYPE DE MOLECULE: ADNc . (vi) ORIGINE:
. (A~ ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
CGACGCCGGG TGGAGTCCTT CTTCAGCACC . ~ 30 ) TNFORMATiON POUR LA SEO IP NO: l2~ -(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
2~ (A~ LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTI(:)N DE LA SEQVENCE: SEQ ID NO: l~:

~2) INFORMAT101`1 POUR LA SEO ID NQ: 20:
3~ (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

. .
EUILLE DE REUlPLACE~ NT

- ~

: 2 1 2 ~j 8, 7 ~o (A) LOINGUEUR: 2~ paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE: DE BRINS: sirr,ple (D) CONFIGURATION: lir~,éaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) O~GINE
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
GAGGTCAGTG CTAGCCAGGT GGCCACA . 27 10 (2! INFORMATION POUR I~A SEO ID NO: 21:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
tA) LONGUEUR: 27 paues de bases tB) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple 1~ (D) CONFIGURATION: l~,s2,ire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
20 GAGGTCAGTG CTAAACAGG$ GGCCACA . 2i ~2) INFORMATTON POUR LA SEO ID NO: 22:
(i) CARACTERlSTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 27 pa~res de ba,ses (8) TYPE: acid,e nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: sim,ple (D) CONFIGURATION: liné~ire ~ii) I YPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORG~NISME: OLIGONUCLEOTIDE
30 . (XJ,) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
GCCCTCTTCC AGTTCAAACT TGGAGAA 27`
(O INFORMATION PQUR I~A SEO IP NO: 23:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
tA) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique C) NOl~BRE DE BRINS:.simple ~:ElJILLE DE REeJlPLA~ g'~

(D) CON~lGURATION: l~eaire (ii) T'r PE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
S (xi) DESCRIPIlON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:

(2~ INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) ~YPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUR~TION: lineaire (ii) IYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:

~2) I~FORMATION PQUR EA SEO ID N!~;
(i) CARAClERlSTIQVES DE LA SEQUENCE:
2~ (A) LONGVEUR: 27 paires de bases (B) l YPE: acidè nucleique (C) NOMBRE DE B}~INS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc 2~ (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:

~2) Il`lFORMAT~ON PQUR LA SEQ TD NQ~ 26:
(i) C:ARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de b~ses (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simplc (D) CONFIGURATION: lin~airc 3~ (ii) l~PE DE MOLECULE: Ar~Nt:

FEUILLE DE RENIPLACE~ NT

21258~7 `

(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE
(xi) I:~ESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:

, FEl lILLE DE REMPLA~ r

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide dérivé de l'apolipoprotéine AIV humaine caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport à la séquence de l'apolipoprotéine AIV humaine SEQ ID
n° 2, au moins une des modifications suivantes:
(a) une mutation ponctuelle portant sur un résidu fonctionnel, et/ou, (b) une délétion d'une extrêmité terminale d`au moins 10 acides aminés, et/ou, (c) une délétion d'une hélice ou d'une paire d'hélices, et/ou, (d) une partie additionnelle hétérologue possédant une activité biologique différente ou complémentaire de celle de l'apoAIV, ou une propriété de marqueur, de cibleurou de stabilisateur.

2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une modification selon (a) et (b).

3. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une modification selon (a) et (c).

4. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu`il comprend une modification selon (a), (b) ou (c) associée à une modification selon (d).

5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le résidu fonctionnel est choisi parmi les résidus chargés, les résidus sites de glycosylation et les résidus impliqués dans des ponts disulfure.

6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que le résidu fonctionnel est choisi parmi les résidus suivants: acide aspartique en position 5, 44, 106, 153; glutamine en position 37, 194; asparagine en position 39; lysine en position 73, 84, 103, 169, 178; acide glutamique en position 76, 81, 87, 99, 131, 164,187, 230 ; alanine en position 22; proline en position 139,161; et serine enposition 154.

7. Polypeptide selon l`une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides suivants décrits dans les exemples: P(.DELTA.N13,R93G), P(.DELTA.N13), P(tag.DELTA.N13), P(R93G), P(.DELTA.C44), P(tag.DELTA.C44), P(.DELTA.C194), P(.DELTA.N182), P(.DELTA.h1-2), P(tag.DELTA.h1-2), P(.DELTA.h7-8), P(tag.DELTA.h7-8), P(.DELTA.h9-10), P(tag.DELTA.h9-10), P(.DELTA.h11-12), P(tag.DELTA.h11-12), P(.DELTA.h11-12,L87M), P(.DELTA.h13-14), P(tag.DELTA.h13-14), P(.DELTA.h5-6), P(tag.DELTA.h5-6), P(D44F), P(D44A), P(D5S), P(D5K), P(K178Y), P(K178A), et P(E230K).

8. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

9. Séquence nucléotidique selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADNc, d'ADNg, d'ARN ou d'une séquence synthétique ou semi-synthétique.

10. Séquence nucléotidique selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADNc.

11. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 à 10.

12. Cellule recombinante contenant un vecteur selon la revendication 11.

13. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon la revendication 12 et on récupère le polypeptide produit;

14. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation de molécules non peptidiques ou non exclusivement peptidiques actives pharmacologiquement sur les niveaux plasmatiques de cholestérol, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité, et reproduction de ces éléments par des structures non-peptidiques ou non exclusivement peptidiques.

15. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou une ou plusieurs séquences nuclécotidiques selon l'une des revendications 8 à 10, ou une ou plusieurs molécules préparées selon la revendication 14.

16. Composition selon la revendication 15 destinée au traitement ou à la prévention des affections liées aux hypercholestérolémies.

17. Composition selon la revendication 16 destinée au ralentissement de la formation de plaques d'athérome, et/ou à la régression des plaques d'athérome et/ou à
la diminution des risques d`accidents coronariens.