JPH07503367A

JPH07503367A - ヒト　アポリポタンパク質ａｉｖから透導されたポリペプチド，その製造及びその利用

Info

Publication number: JPH07503367A
Application number: JP5512981A
Authority: JP
Inventors: デネフル，パトリス; ギネ，フランソワーズ; ラタ，マルテイヌ; ミユリ−ブルリエ，アヌ
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1992-01-27
Filing date: 1993-01-26
Publication date: 1995-04-13
Also published as: FR2686605A1; EP0624194A1; WO1993015198A1; FR2686605B1; CA2125877A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト　アポリポタンパク質ＡＩＶから誘導されたポリペプチド、その製造及びその利用本発明はヒト　アポリポタンパク質ＡＩＶ　（アポＡＩ）から誘導されたポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、その製造及びその利用に関する。

アポリポタンパク質ＡＩＶ（アポＡ　Ｉ　Ｖ）は３７６のアミノ酸から成り、分子質量が４６，０００ダルトンのタンパク質である。アポＡＩＶのペプチド及びヌクレオチド配列は、らせんの位置と共に配列番号・１及び２に示されている。

アポＡＩＶはリンノ゛り液中に分泌されるキロミクロンの生成分であるが、王に血漿中でリポタンパク賀と結合しない形態にあるという特徴を有する（Ｒ，Ｂ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３、Ｊ、Ｌｉｐｉｄ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、２４＋５２−５９）。

さらに血漿アポＡＴＶは多型性であるが、この多型性の性質はまだ未知である（Ｇ、Ｕｔｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２．Ｊ、Ｂｉ。

］、Ｃｈｅｍ、２５７：５０１−５０７）、アポＡＩＶの生理学的役割も比較的知られていないままである。それは試験管内でレンチンーコレステロールアンルトランスフエラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化でき（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　。

２６０　：　２２５８−２２６４）　、アポリポタンパク質ＡＩと同様にＨＤＬ粒子のウソ大動脈内皮細胞への結合を妨害できる（Ｓａｖｉｏｎｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２５７：４１７１−４１７８）ことが知られている。これらの２つの活性は、アポＡＩＶが逆コレステロール輸送の媒介物として関与している可能性が非常に高いことを示していると思われる。

本発明は、逆コレステロール輸送に影響する因子の研究のための標的分子としてアポリポタンパク質ＡＩＶを用いることを出願人が選択した結果である。さらに特定すると、本発明は高コしノステロール血症及びそれに伴う影響、例えばアテローム動脈硬化症を新規な療法により防除できるようにする新規生成物の製造のためのアポＡ、　Ｉ　Ｖの利用に基づく。

さらに具体的には、本発明は、アポＡＩＶから誘導され、かくしてこのタンパク質の性質を薬理学的に利用できるようにしたポリペプチドを提供する。従って本発明の主題はヒト　アポリポタンパク質ＡＩＶから誘導されたポリペプチドである。特にそれらは天然のタンパク質と比較して血漿安定性が向上しく脱離又は分解の生理学的機構に対する低い感受性）、結果として長い寿命を有するポリペプチドであることができる。

それらは又、細胞コレステロールの流出に関する刺激活性を有し、従って逆コレステロール輸送を促進し、アテロームプラークの形成という意味においてコレステロールが堆積した細胞から負荷を除去するポリペプチドである可能がある。それらは又、アポＡＩＶの唯−又は数種の性質を有するポリペプチドであることができる。特にそれらは、例えば細胞レセプターに結合することができるが細胞コレステロールの流出に関する刺激活性を有していないポリペプチドであることができる。さらにそれらはアポＡＩＶの活性を持たないポリペプチドであることもできる。

そのようなポリペプチドは実際に治療的価値を有することができる（抗体の生成、構造−機能研究など）。

本発明のポリペプチドはＨＤＬレセプターに結合できるのが好ましい。

ポリペプチドはＨＤＬレセプターに結合し、コレステロールの流出を刺激できるのがさらに好ましい。

本発明のポリペプチドは数種の型のものであることができる。それらはヒト　アポＡＩＶに対する突然変異体又は置換誘導体、欠失誘導体あるいは付加誘導体であることができる。本発明は数種の型の修飾を含むポリペプチド、例えば突然変異及び欠失誘導体、欠失及び付加誘導体なども含むと理解される。

さらに具体的には、本発明の主題は、ヒト　アポリポタンパク質ＡＩＶから誘導され、ヒト　アポリポタンパク質ＡＩＶ、配列番号：２に対して以下の修飾（ａ）官能基に影響を与える１点突然変異、及び／又は（’ｏ　）末端からの少なくとも１０のアミノ酸の欠失、及び／又は（Ｃ）らせん又は１対のらせんの欠失、及び／又は（ｄ）アポＡＩＶの生物学的活性と異なる、又はそれと相補的な生物学的活性、あるいはマーカー、ターゲツティング剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）又は安定剤の性質を有する追加の異種部分の少なくとも１つを含む非天然のポリペプチドである。

特定の実施態様の場合、本発明のポリペプチドは（ａ）及び（ｂ）に記載の少なくとも１つの修飾を含む。

他の特定の実施態様の場合、本発明のポリペプチドは（ａ）及び（Ｃ）に記載の少なくとも１つの修飾を含む。

別の特定の実施態様の場合、本発明のポリペプチドは（ｄ）に記載の修飾と組み合わされた（ａ）、（ｂ）又は（Ｃ）に記載の修飾を含む。

突然変異誘導体は一般に点突然変異（アミノ酸の脱離又はアミノ酸の修飾、又はあるアミノ酸の他による置換）、あるいは二重突然変異（１対のアミノ酸の修飾）を含む。選ばれる突然変異はそれぞれのらせんにお１プる突然変異残基の位置を考慮し、原則として問題のらせんの、従ってポリペプチドの構造を過剰に乱さずに官能基を修飾するように行われる。本発明の目的の場合、官能基はレセプターとの相互作用に関する、又はシグナルの伝達に関する（例えばコレステロール流出の刺激など）アポＡＩＶの活性に含まれると思われる残基を意味すると理解される。

好ましい残基は一般にポリペプチドとそのレセプターの相互作用に影響を有すると思われる荷電残基である。そのような残基を他の非極性残基、又は電荷の廃止又は付加により化学的に修飾された残基により置換することができる。グリコノル化残基及びジスルフィド架橋の形成に体重する残基（ンステイン）は他の好ましい残基を構成する。

本発明のポリペプチドは、配列番号、２に示すヒト　アポＡＩＶに対して以下の残基の１つに少なくとも１つの突然変異を有するのが好ましい・位置５．４４．１０６．１５３のアスパラギン酸；位置３７．１９４のグルタミン、位置３９のアスパラギン；位置７３．８４．１０３．１６９．１７８のリシン、位置７６．８１．８７．９９．１３１．１６４．１８７．２３０のグルタミン；位置２２のアラニン；位置１３９．１６１のプロリン；及び位置１５４のセリン。

アスパラギン酸はＳ、に、Ａ、Ｆ又はＧ残基により置換され、グルタミンはＴ、Ｋ又はＦ残基により置換され、アスパラギンはＡ又はＤ残基により置換され、リシンはＧ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｈ又はＦ残基により置換され、グルタミン酸はＳＳＲ，Ｆ、に、Ａ、Ｇ、Ｎ又はＱ残基により置換され、アラニンはＲ又はＥ残基により置換され、プロリンはＲ又はＧ残基により置換され、セリンはＲ又はＲ残基により置換されるのがさらに好ましい（文字は受容されているコードに従うアミノ酸に対応する）。

本発明のポリペプチドは欠失誘導体であることができる。この場合、欠失はタンパク質の１つの末端に存在することができる（Ｃ−末端又はＮ−末端）。これに関し、本発明のいくつかのポリペプチドはタンパク質の大きな部分の欠失により得たアポＡＩＶフラグメントであることができる。本発明のポリペプチドはヒト　アポＡＩＶに対する少なくとも１０アミノ酸の末端欠失を有するのが好ましい。欠失はアポＡＩＶの内部領域、特にらせん全体、又はらせんの対に存在することもできる。

不発明の他の型のポリペプチドは付加誘導体により示される。特に本発明はアポＡＩＶの全体又は一部、及びマーカー、ターゲツティング剤、安定剤又は他の活性要素などの追加の要素を含むポリペプチドに関する。

精製マーカーとして、例えばＨｏｃｈｕｌ　ｉ　ｅｔ　ａｌ、、（Ｂｉ。

／１ｅｃｈｎｏ１．　（１９８８）１３２１）により記載の配列ＭＲＧ　５（Ｈ）６の標識デカペプチドを挙げることができる。実施例に記載の通り、このデカペプチドをアポＡＩＶ又は上記で定義した誘導体のＮ−末端に融合し、それにより該ポリペプチドの生産の能力に影響を与えない非常に迅速な１段階精製を可能にする。

本発明のポリペプチドの具体例として以下のポリペプチドを好ましく挙げることができるーポリペプチドＰ（△Ｎ１３、Ｒ９３Ｇ）：１３のＮ−末端アミノ酸の欠失（Δ Ｎ１５）及び位置９３においてアルギニンの代わりにグリシンを有する（Ｒ９３Ｇ）ポリペプチド。

−ポリペプチドＰ（ΔＮ１５）：１３のＮ−末端アミノ酸の欠失を有するポリペプチド及びその標識形Ｐ（ｔａｇΔＮ１５）。

−ポリペプチドＰ　（Ｒ９３Ｇ）：位置９３においてアルギニンの代わりにグリシンを有するポリペプチド０ −ポリペプチドＰ（△Ｃ４４）：４４のＣ−末端アミノ酸の欠失を有するポリペプチド及びその標識形。

−ポリペプチドＰ（△Ｃ１９４）：最後の１９４のアミノ酸の欠失を有するポリペプチド。

一ポリペプチドＰ（ΔＮ１８２）：最初の１８２のアミノ酸の欠失を有するポリペプチド。

一ポリペプチドＰ（ムｈｌ−２）：配列番号、２に示すらぜん１及び２（残基Ｄ１４から■６２）の欠失を有するポリペプチド、及びその標識形。

一ポリペプチドＰ（△ｈ７−８）　配列番号、２に示すらせん７及び８（残基Ｐ１６２からＡ２０５）の欠失を有するポリペプチド、及びその標識形。

一ポリペプチドＰ（△ｈ９−１０）：配列番号・２に示すらせん９及び１０（残基Ｐ２Ｏ６からＡ２４９）の欠失を有するポリペプチド、及びその律識形。

一ポリペプチドＰ（△ｈｌｌ−１２）　・配列番号：２に示すらせん１１及び１２（残基Ｐ２５０からＥ２８９）の欠失を有するポリペプチド、及びその標識形。

一ポリペプチドＰ（△ｈｌｌ−１２．Ｌ８７Ｍ）　配列番号＝２に示すらせん１１及び１２の欠失（△ｈｌｌ−１２）、及び位置８７においてロイシンの代わりにメチオニン（Ｌ８７Ｍ）有するポリペプチド。

一ポリペプチドＰ（△ｈ１３−１４）：配列番号・２に示すらせん１３及び１４（残基Ｐ２９０からＮ３３３）の欠失を有するポリペプチド、及びその標識形。

一ポリペプチドＰ（△ｈ５−６）：配列番号＝２に示すらせん５及び６（残基Ｐ１１８からＲ１６１）の欠失を有するポリペプチド、及びその標識形。

−ポリペプチドＰ（Ｄ４４Ｆ）　・位置４４においてアスパラギン酸の代わりにフ二ニルアラニンを有するポリペプチド。

−ポリペプチドＰ　（Ｄ４４Ａ）：位置４４においてアスパラギン酸の代わりにアラニンを有するポリペプチド。

−ポリペプチドＰ（Ｄ５Ｓ）　位置５においてアスパラギン酸の代わりにセリンを有するポリペプチド。・ −ポリペプチドＰ　（Ｄ５Ｋ）：位置５においてアスパラギン酸の代わりにリシンを有するポリペプチド。

−ポリペプチドＰ（Ｋ１７８Ｙ）　・位置１７８においてリジンの代わりにチロシンを有するポリペプチド。

−ポリペプチドＰ　（Ｋ１７８Ａ）：位置１７８においてリジンの代わりにアラニンを有するポリペプチド。

−ポリペプチドＰ　（Ｅ２３ＯＫ）：位置２３０においてグルタミン酸の代わりにリジンを有するポリペプチド。

本発明のそのようなポリペプチドは特にアテローム動脈硬化症の処置及び／又は予防において製薬学的に非常に重要である。アテローム動脈硬化症は、主に大動脈、冠動脈及び頚動脈の内膜における脂質又は線維−脂質プラークの形成を特徴とする疾患である。過程の進行の程度に依存して多少石灰化したこれらのプラークは障害を伴い、主にコレステロールエステルカ・ら成る脂肪沈着物の動脈における堆積により作られる。

その後これらのプラークは動脈壁の肥厚を起こし、平滑筋の肥厚、泡沫細胞の出現及び線維組織の堆積を伴う。アテロームプラークは壁から非常に顕著に突き出、最も影響を受けた患者で起こるアテロームによる血管閉塞、血栓症又は塞栓症に責任のある狭窄性をそれに与える。

従ってアテロームプラークの形成は、（ｉ）動脈沈着物が生ずる過剰の血漿コレステロール、及び（ｉ　ｉ）細胞内堆積の傾向のある、末梢組織におけるコレステロールの流入と流出の調節の欠陥という異なる因子が連携して起こる。

その性質に鑑みて、本発明のポリペプチドは特にアテロームプラークの形成を遅くし、アテロームプラークの退行を誘導し、冠動脈の事故が起こるのを減少させることを可能にする。

本発明のポリペプチドは種々の方法で、特に化学的及び／又は遺伝的手段により得ることができる。

化学的手段による製造の場合、本発明のポリペプチドは完全に化学合成により、あるいは天然のタンパク質の化学的又は酵素的修飾により得ることができる。後者の場合、種々の化学的又は酵素的試薬を用いて残基を修飾しく突然変異誘導体）、残基を標識しく付加誘導体）、又はタンパク質をフラグメント化する（欠失誘導体）ことを可能にすることができる。アミノ酸の修飾又は標識を可能にする化学的試薬の中で、特に第１アミン、特にリジンのアンル化を可能にするスルホ −ＮＨ３−アセテート、チロシン上に硝酸基を導入するテトラニトロメタン、又はトリプトファン残基を酸化するＮ−ブロモコハク酸イミドを挙げることができる。ペプチド結合の切断を可能にする化学的及び酵素的試薬の中で、特にシアノゲンブロミド、ヨートンベンゾエート、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン又はプロエンドペプチダーゼを挙げることができる。

上記の通り、これらの処理は化学的合成から生産されたポリペプチドに、天然のポリペプチドと同様に十分に適用することができる。さらにこれらの処理は遺伝的手段によって得られ、その結果すでにいくつかの修飾を含んでいるポリペプチドにも適用することができる。

遺伝的手段による製造の場合、不発明のポリペプチドはコードヌクレオチド配列のレベルにおける修飾、及び細胞宿主における該配列の発現により得られる。

これに関し、本発明の主題は上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列でもある。これらはＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、合成配列、半一合成配列、混成配列（ｈｙｂｒｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）などであることができる。これらの配列は・ −細胞宿主における発現による本発明のポリペプチドの生産のために、−遺伝子療法のための組成物として、 −関連ポリペプチドの同定、又は本発明のポリペプチドの発現の検出を可能にする標識プローブの生産のために、−これらの配列を含む新規クローニング又は発現ベクターの製造のために、あるいは別の場合 −これらの配列又はこれらのベクターを含む新規な組み換え真核もしくは原核細胞、又は形質転換動物の製造のために用いることができる。

本発明のヌクレオチド配列はアポＡＩＶをコードする配列から種々の方法により、例えば特に遺伝子デカップリング（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｅｃｏｕｐ　］　ｉｎｇ）　、突然変異誘発又は核酸構造を変える他の処置により得ることができる。

当該技術分野における熟練者に最も知られている方法を一般的クローニング法において下記に言及する。本発明のヌクレオチド配列の合成に関する詳細な説明は実施例のパートＢ／に示す。本発明で用いるヒト　アポＡＩＶ配列は、ヒト　アポＡＩＶ遺伝子の配列のＫｐｎｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを含むゲノムクローンから得、それはイントロン２の末端、二千ソン３の全体、及び非翻訳３′ 配列も含ム。従ってこのクローンは特にヒト　アポＡＩＶ遺伝子の最初の２つノエキソンを含まない（Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂ。

Ｃ，（１９８７）２６２ニア９７３）。完全な配列は、−合成フラグメントがヒト遺伝子の最初の２つのエキソンによりコードされる成熟タンパク質の部分に対応するコドン、ならびにＢｓｔＥ１１部位まで延びるエキソン３の５′領域の最初のヌクレオチドも含むように、アポＡＩＶ配列の５′末端を化学合成し、続いて−あるヌクレオチドを正確に連結するのに用いられるＢｓｔＥＩＩ部位の後に位置するアポリポタンパク質ＡＩＶの配列の残りを含むＤＮＡフラグメントにこの合成フラグメントを連結することにより得た。

これらの段階の詳細な説明は実施例のパートＡ／に示す。

本発明の主題は上記の本発明のポリペプチドの製造法でもある。この方法は以下の段階を行うことから成るニー第１段階で、本発明のポリペプチドをコードする上記で定義したヌクレオチド配列を細胞中に導入し、 −第２段階で、それにより得られた細胞を該ヌクレオチド配列の発現のための条件下で培養し、一部３段階で生産されたポリペプチドを回収する。

さらに特定すると、本発明の方法の第１段階でヌクレオチド配列は種々の方法により細胞に導入することができる。特に形質転換、接合（ｃｏｎ　ｊ　ｕｇａ　ｔ　ｉ　ｏｎ）又はエレクトロポレーションにより導入を行うことができる。

形質転換に関し、種々の案が先行技術において記載されている。特に形質転換は、Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３（１９８３）１６３ −１６８）により記載の方法に従い、酢酸リチウム及びポリエチレングリコールの存在下で、あるいはＤｕｒｒｅｎｓｅｔ　ａｌ、（Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、工８　（１９９０）７）の方法に従い、エチレングリコール及びジメチルスルホキシドの存在下で全細胞を処理することにより行うことができる。形質転換は、Ｄａｇｅｒｔｅｔ　ａｌ、（Ｇｅｎｅ　旦（１９７９）２３−２８）により記載の方法に従ってＣａＣ１，溶液を用いた処理、続いて熱ショックにより行うこともできる。別の案が欧州特許第３６１，９９１号明細書にも記載されている。

エレクトロポレーシヨンに関し、Ｋａｒｕｂｅ　ｅｔ　ａｌ、（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８２　（１９８５）９０）により記載の方法を用いるのが有利である。

これらの方法のある方法、又は他の方法の選択は、特に選ばれた宿主に従って確定される。

本発明の方法で有用な真核宿主の中で、動物細胞、酵母又は菌を挙げることができる。特に酵母に関し、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ。

ユ凹）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）　、ピＨＯ，Ｃｌ２７などの細胞を挙げることができる。本発明で用いることができる菌の中で、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉ　］　ｌｕｓ　ｓｓｐ、　）又はトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｓｐ、）を特に挙げることができる。

本発明に関して有用な原核宿主の中で、以下のバクテリアを挙げることができる　Ｅ　コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）。

本発明の好ましい実施態様の場合、宿主細胞として原核細胞を用いて方法を行う。

バクテリアＥ　コリを宿主細胞として用いて本発明の方法を行うのがさらに好ましい。

一般に用いられるヌクレオチド配列はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、混成配列などである。しかし本発明をさらに良く遂行するために、ｃＤＮＡを用いるのが好ましい（実施例Ａ／を参照）。さらにこのヌクレオチド配列は一般にコード配列の５゛末端に結合した転写及び翻訳開始領域を含み、該配列の転写及び翻訳を方向付け、調節することができる。これらの領域の選択は、用いられる宿主に従って変えることができる。特にＥ　コリなどのバクテリアの場合、トリプトファンオペロンのプロモーター（Ｐｔｒｐ）又はバクテリオファージラムダの左側及び右側プロモーター（ＰＬＳＰＪ　、あるいは別の場合バクテリオファージＴ７の遺伝子１０のプロモーターを用いることができる。

さらにヌクレオチド配列は、自律複製性又は組み込み性であるベクターの一部を形成しているのが好ましい。さらに特定すると、選ばれた宿主中で自律複製性である配列を用いて自律複製性ベクターを製造することができる。例えば酵母の場合、これらの配列はプラスミド、即ちｐＫＤＩ　（ＥＰ　２４１．４３５Ｌ又は別の場合染色体配列（ＡＲ３）から誘導された複製起点であることができ、バクテリアの場合これらはプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３など）から誘導された複製起点であることができる。組み込みベクター自身は、例えば相同的組み換えによるベクターの組み込みが可能な、宿主のゲノムのある領域と相同な配列を用いて製造することができる。これに関し、ｒＤＮＡを用いると外因性ＤＮＡの多重組み込みが可能になり、従って細胞当たりの高いコピー数でそれが存在できる。

好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列はコード配列の上流、又は適宜転写及び翻訳開始領域とコード配列の間に、用いられる宿主の分泌経路にナセント（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドを方向付けるリーダー配列を含む。このリーダー配列はアポＡＩＶのリーダー配列であることができるが、異種配列（別のタンパク質をコードする遺伝子に由来する）、又は人工の配列であることさえできる。これらの配列の１つの選択は、特に用いられる宿主により指示される。

本発明のポリペプチドは、続いて当該技術分野において既知のいずれの方法によっても培地から単離することができる。さらに具体的には、実施例のバー１−Ｃ／は自然の条件下で、すなわち変性段階を含まずに本発明のポリペプチドを精製することができる方法につき記載している。

本発明の他の主題は、１種又はそれ以上の本発明のポリペプチド、あるいは１種又はそれ以上の本発明のヌクレオチド配列を含む製薬学的組成物に関する。

そのような組成物は高コレステロール血症に伴う疾患の処置又は予防のためであるのが好ましい。

本発明の主題は、１種又はそれ以上の本発明のポリペプチド又は１種又はそれ以上の不発明のヌクレオチド配列を含み、アテロームプラークの形成を遅くする、及び／又はアテロームプラークの退行を誘導する、及び／又は冠動脈の事故の危険を減少させることを目的とする製薬学的組成物であることがさらに好ましい。

さらに本発明の主題は、その構造がペプチドの構造でないか、又は必ずしもペプチドの構造でなく、同種の活性を有する分子の製造のための、上記のポリペプチドの利用でもある。これに関し本発明は、その活性に重要な本発明の上記のポリペプチドの構造的要素を決定し、ペプチドの構造ではないか、又は必ずしもペプチドの構造ではない構造によりこれらの要素を再現することにより、ペプチドでないか、又は必ずしもペプチドでなく、血漿コレステロール量に関して薬理学的に活性である分子を製造するための、本発明の上記のポリペプチドの利用に関する。本発明の主題は、かくして製造された１種又はそれ以上の分子を含む製薬学的組成物でもある。

本発明のさらに完全な説明を以下の実施例を用いて示すが、それは例示であり、制限ではないと考えるべきである。

図の説明図１ニブラスミドｐＸＬ１６９７の構造及び構築。

図２−プラスミドｐＸＬ１８７２及びｐＸＬ１８６７ｃｏ構造。

図３＝プラスミドｐＸＬ１６９６及びｐＸＬ２０５１Ｊ構造。

一般的クローニング法プラスミド精製及びＣａＣ１，法による形質転換のための感応細胞の製造の標準的方法は実験室マニュアル：Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａ＋、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、１９８２．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。

ＤＮＡ配列はＳａｎｇｅｒ法により決定した（Ｓｍｉ　ｔｈ　Ａ、Ｊ、　Ｈ。

、１９８０．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５：４９９−５５９）。Ｍ１３１．−おけるクローニングの案は記載されている（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、１９８１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

９　：　３０９−３２１）、制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）は、製造者の勧告に従ワて使用した。連結に用いた緩衝液は以下の組成を有する：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　１０オリゴヌクレオチドのリン酸化緩衝液は以下の組成を有する・５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ、、０．６ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７，５゜試験管内のオリゴヌクレオチド一方向付け（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発はＡｍｅｒｓｈａｍにより販売されているキットを用い、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、により開発された方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、よ旦（１９８５）８７４９−８７６４）に従ってＡ１−アポＡＩＶコード配列の合成と組み立て本発明に記載のアポリポタンパク質ＡＩＶ遺伝子のヌクレオチド配列は、以前に公開されたｃＤＮＡ配列と異なる（特にＣ−Ｙ、　Ｙａｎｇ。

Ｚ−Ｗ、Ｇｕ、１．Ｃｈｏｎｇ、Ｗ、Ｘｉｏｎｇ、Ｍ、Ｒｏｓｓｅｎｅｕｅ、Ｈ，Ｙａｎｇ、Ｂ、Ｌｅｅ、Ａ、Ｍ、Ｇｏｔｔｏ　ａｎｄ　Ｌ。

Ｃｈａｎ、１９８９．Ｂ、Ｂ、Ａ、、１００２＋２３１−２３７により公開されたｃＤＮＡ配列の表を参照されたい）。特にタンパク質のシグナルペプチドをコードする配列が不在であり、ＡＴＧ翻訳開始コドンが成熟タンパク質の第１コドンの上流に置かれた。従って開始コドンは成熟タンパク質の配列の上流に余分のメチオニンを導入し、タンパク質の成熟部分のみをコードする遺伝子が発現されるようにする。

さらにアポリポタンパク質ＡＩＶのこのヌクレオチド配列は、化学的に合成され、サイズが８６−〜１０７ｍａｒの４つのオリゴヌクレオチド（配列番号　３〜６）を組み立てることにより新規な方法で得た。さらにオリゴヌクレオチド配列につき、Ｘｂａｌ及びＥｃｏｌｌ付看末端が限定され、完全なアポリポタンパク質ＡＩＶ配列の２段階の組み立てが可能であることに注目することができる。

１、オリゴヌクレオチドの合成アポリポタンパク質ＡＩＶ遺伝子の組み立てに用いられる４つのオリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ合成機（Ｍｏｄｅｌ　８６００）を用い、製造者の勧告に従ってホスホノげミデート法（Ｌ、Ｊ。

Ｂｒ１ｄｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｈｅｒｓ　（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２４：２４５）ｌ：より合成Ｌ？：。オリゴヌクレオチドは１５％アクリルアミドゲル上で精製した。その配列を配列番号、３〜６に示す。

２、組み立ての第１段階オリゴヌクレオチドを７４　ＤＮＡキナーゼで処理することによりリン酸化した。オリゴヌクレオチドＡ及びＣをそれぞれオリゴヌクレオチドＢ及びＤと、化学量論的条件下で対合させた。８０’Ｃとし、実験室温度に戻した約１００ｍ１の水を含むビーカーに浸したＥｐｐｅｎｄｏｒｆｔでオリゴヌクレオチドハイブリッド形成を行った。

フラグメントＡ−Ｂ及びＣ−Ｄを、酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲｌであらかじめ消化した複製形態のファージＭ１３ｍｐ１０を用いてＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で連結した。

得られたｐＸＬ１６９５と称する複製形態の組み換えバクテリオファー’）（Ｍ１３ｍｐ１０ＡＢＣＤ）を用イ、Ｃａ　ＣＩ　を法ｊ’ニー、ｋ　リ感応性ＪニーされたＴＧＩバクテリアをトランスフェクトした。

このレプリコンｐＸＬ１６９５をζその１本饋ＤＮＡ形態で精製してその配列を確認するか、あるいは構築の次の段階のためにその複製性２本鎖ＤＮＡ形態で精製した。

３、組み立ての第２段階複製形態のｐＸＬ１６９５　（Ｍ１３ｍｐｌＯＡＢＣＤ）　、及びアポＡＩＶ遺伝子の第３エキソン全体を含む約３−ｋｂのＫｎ　ｐ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩフラグメントを有し、ｐＸＬ１６９４と称するプラスミド（ＮＡ、Ｅｌｈｏｕｒｂａｇｙ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１９８７゜２６２　：　７９７３−７９８１）をそれぞれ一方でＸｂａＩとＢｓｔＥｉｌｌ及び他方でＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩで消化した。ｐＸＬ１６９５の場合、１６７−塩基対のフラグメントを゛アクリルアミドゲル上で精製した。復製形態のベクターＭ１３ｍｐ１８ａｍｌＶをＸｂａｌとＥｃ。

Ｒ１で消化し、約７−ｋｂのフラグメントをアガロースゲル上で精製した。

３つのフラグメントを一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結した。

ＴＧＩのトランスフェクションの後、ｐＸＬ１６９６と称する複製形態を含むクロ・−ンを得た。カクシてｐＸＬ１６９６甲にクローニングされたＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントの完全コード配列を確認した。

続いてこのフラグメントをｐＸＬ１６９６から再抽出し、ｐＸＬ１６９４に由来し、特にヒト　アポＡＩＶ遺伝子のエキソン３の末端を有する約３−ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈ４ｎｄ２１１フラグメントの存在下、及び又酵素Ｘｂａ　ＩとＨｉｎｃＪＩ　Ｉ　Ｉで切断したベクターＭ１３ｍｐ１９の存在下で連結した。

かくして得られた組み換えベクター、ｐＸＬ１６９７は、アポＡＩＶコード配列の全体（１１３２ｂｐ）ならびにアポＡＩＶ遺伝子のイントロン３に対応する約２−ｋｂのゲノムフラグメントを有する（図１）。

合成オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ１０８７、すなわち５’　−ＧＣＣＣＣＴｒＴＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＡ −３’を用い、Ａｍｅｒｓｈａｍ突然変Ｊ！誘発キット（ＲＰＮ１５２３）を用いて行った特定部位の突然変異誘発により、ＢａｍＨ１部位をアポＡＩＶ遺伝子の停止（ＴＧＡ）コドンの直後でｐＸＬ１６９７に導入することができた。得られたベクターをｐＸＬ１８６６と称した。

Ａ２−アポＡＩＶ配列を有するベクターの製造１　ベクターｐＸＬ１８７２の製造上記のベクターｐＸＬ１８６６を酵素Ｘｂａｌ及びｂａｍＨＩで切断し、アポＡＩＶコード配列の全体を含む１．１５−ｋｂのフラグメントをアガロースゲル上で精製し、Ｍ１３ｍｐ１８ａｍＩＶにおいて連結してベクターｐＸＬ１８７２を得る（図２）。

２、ベクターｐＸＬ１８６７の製造ベクターｐＸＬ１８６６をＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断し、１．２−ｋｂのフラグメントを精製し、続いてそれ自身ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断したｐＥ７３−ａ中に挿入した。従って得られた発現ベクター、ｐＸＬ１８６７はアポリポタンパク質ＡＩＶのゲノム配列に由来するイントロン３の残りのフラグメントを含まないアポリポタンパク賀ＡＩＶコード配列を含む（図２）。

３、ベクターｐＸＬ１６９６の製造・アポＡＩＶコード配列の５′部分（残基１〜１８９）を含む５７ｏ−ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲｒフラグメントをベクターｐＸ１，１８７２から切り出し、アガロースゲル上で精製し、Ｍ１３ｍｐ１０において連結し、ベクターｐＸＬ１６９６を得る（図３）。

４、　べ’ｙ９−ｐＸＬ２０５１の製造アポＡＩＶコード配列の３′部分（残基１８８〜３７７）を含む５７７−ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをベクターｐＸＬ１８７２から切り出し、アガロースゲル上で精製し、Ｍ１３ｍｐ１９において連結し、ベクターｐＸＬ２ｃ１５１を得る（図３）。

Ｂ一本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の生成及びこれらのポリペプチドの生産Ｂｌ：ベクター、ＸＬ１’８７２から生産された突然変異体１、　ベク９−ｐＸＬ１７７５、ｐＸＬ１８６９及びｐＸＬ２１６８の生成、ならびにポリペプチドＰ（Δ＼Ｎ１３．Ｒ９３Ｇ）　、Ｐ　（ΔＮ１５）及びＰ（ｔａｇ△Ｎ１５）の製造。

以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチド５’−ＧＡＣＣＡＧＧ？ＧＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＴ八ＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴへ−３’を用い、Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１末鎖の形態のベクターｐＸＬＩ８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりＮｄｅ１部位及びＡＴＧコドンをアポＡＩＶコード配列にそれぞれ位ｆ１４０及び４３において導入することができ、最初の１３のＮ−末端アミノ酸の欠失を引き起こした。さらに得られた誘導体の配列を確認すると、クローンｐＸＬ１’７９９を含むいくつかのクローンが配列の位置２８．０において追加の点突然変異を有した。この突然変異（Ｃ−＋Ｇ）はタンパク質におけるアルギニンコドンをグリシンに変える効果を有する。

クローンｐＸＬ１７９９及び追加の（Ｃ−＋Ｇ）突然変異を有していない他のクローンから、１０９７−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ７ラグメントを精製し、それ自身酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨｒで切断したベクターｐＥＴ３−ａ　（ＡＭＳ　Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と連結した。

それにより２つの組み換えベクター、１３のＮ−末端アミノ酸の欠失（△Ｎ１５）及び位！９３におけるアルギニンの代わりにグリシンを有するポリペプチドを非常に多量に発現することを可能にするベクターｐＸＬ１７７５；及び１３のＮ −末端アミノ酸の欠失（△Ｎ１５）を有するポリペプチドを非常に多量に発現することを可能にするベクターｐＸＬ１８６９が得られた。

ベクターｐＸＬ１８６９からベクターｐＸＬ２１６８が構築され、この場合、ポリペプチドＰ（ΔＮ１５）をコードする配列が標識デカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｓをコードする配列の５′末端に融合された。この目的のために、以下の２つのオリゴデオキシヌクレオチドをＢｉｏｓｅａｒｃｈ８６００ＤＮＡ合成機を用いて合成したオリゴＡ：　５’−ＴｕＴＧＣＧＴＧｃＡＴＣＧＣＡＣＣｘＴＣＡＣｃｘＴＣｘＣｃｘ−３’オリゴＢ：　ｓ′−ｒｈＴａｃｒａｈｒＧＧＴａｈＴａＧＴａｃｃｃｈｒｃＣＡｃａＣＡτ−３′オリゴデオキソヌクレオチドＡ及びＢをハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成産物を、あらかじめ酵素Ｎｄｅｌで消化したベクターｐＸＬ１８６９と連結した。それにより得られ、ｐＸＬ２１６８と称するベクターはＮ−末端でデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｓに融合されたポリペプチドＰ（ΔＮ１５）をコードする。

２　ベクターｐＸＬ１７６６及びｐＸＬ２１８２の生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｃ４４）及びその標識形の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位（または直接反応型）の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりＢａｍＨＩ部位及びＡＴＧコドンをアポＡＩＶコード配列にそれぞれ位置１０００及び９９７において導入することができ、４４のＣ−末端アミノ酸の欠失を引き起こした。

完全に配列を確認した突然変異クローン（ｐＸＬ１７６５）から、１００４−ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥ７３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１７６６は、４４のＣ−末端アミノ酸の欠失（△Ｃ４４）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２１８２をベクターｐＸＬ１７６６から構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２１８２はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｓにＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（△Ｃ４４）の非常に多量の発現を可能にする。

３、ベクターｐＸＬ１７７４の生成及びポリペプチドＰ（△Ｃ１９４）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：Ａｒｎｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりＢａｍ８１部位及びＡＴＧコドンをアポＡＩＶコード配列にそれぞれ位置５５３及び５５０において導入することができ、Ｃ−末端側で１９４のアミノ酸の欠失を引き起こした。

完全に配列を確認した突然変異クローン（ｐＸＬ１７９８）から、５５５−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１７７４は、最後の１９４のアミノ酸の欠失（ΔＣ１９４）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

４、ベクターｐＸＬ１８１７の生成及びポリペプチドＰ（ΔＮ１８２）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：５’−ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりＮｄｅＩ部位及びＡＴＧコドンをアポＡＩＶコード配列にそれぞれ位置５４４及び５４７において導入することができ、Ｎ−末端側で１８２のアミノ酸の欠失を引き起こした。

完全に配列を確認した突然変異クローン（ｐＸＬ１７６５）から、５７９−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥ７３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１８１７は、最初の１８２のアミノ酸の欠失（ΔＮ１８２）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

５　ベクターｐＸＬ１９８１及びｐＸＬ２１８３の生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｈｌ−２）及びＰ（ｔａｇ△ｈｌ−２）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：５’−ＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＧＡＧ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本輪の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡｒＶコード配列の位置４０〜１８６の部分を欠失させ、Ｄ１４残基からＶ６２残基までの４９のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、９９０−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それき身酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１９８１は、らせん１及び２の欠失（△ｈｌ−２）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２１８３をベクターｐＸＬ１９８１から構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２１８３はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｓにＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（△ｈｌ−２）の非常に多量の発現を可能にする。

６　ベクターｐＸＬ１９４３及びｐＸＬ２１８４の生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｈ７−８）及びＰ（ｔａｇ△ｈ７−８）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い５’−ＣＡＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＴＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列の位置４８４〜６１５の部分を欠失させ、Ｐ１６２残基からＡ２０５残基までの４４のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、１００５−ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１９４３は、らせん７及び８の欠失（△ｈ７−８）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２１８４をベクターｐＸＬ１９４３から構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２１８４はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）　６にＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（△ｈ７−８）の非常に多量の発現を可能にする。

７、ベクターｐＸＬ１９８２及びｐＸＬ２２１５の生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｈ９−１０）及びＰ（ｔａｇ△ｈ９−１０）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：５　’　−ＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形管のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列の位置６１６〜７４７の部分を欠失させ、Ｐ２Ｏ６残基からＡ２４９残基までの４４のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、１００５−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥ７３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ１９８２は、らせん９及び１０の欠失（△ｈ９−１０）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２２１５をベクターｐＸＬ１９８２から構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２２１５はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｅにＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（△ｈ９−１０）の非常に多量の発現を可能にする。

８、ベクターｐＸＬ１９８６の生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｈ１１−１２．Ｌ８７Ｍ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレ不チドを用い５　’　−ＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＣ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列の位置７４８〜８６７の部分を欠失させ、Ｒ２５０残基からＲ２８９残基までの４０のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。さらに得られた誘導体の配列を確認すると、いくつかのクローンが配列において追加の点突然変異を有した。この突然変異（Ｌ→Ｍ）はタンパク質においでロイノンコドン８７をメチオニ：ノに変える効果を有する。

このクローン及び追加の突然変異（Ｌ−４Ｍ）を有していない他のクローンから、１０１．７−　ｂ　ｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメントを精製し、それ自身酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより、らせん１１及び１２の欠失（△ｈｌｌ−１２）を有し、位置８７においてロイシンの代わりにメチオニンを有する（Ｌ８７Ｍ）ポリペプチドの非常に多量の発現を可能にするベクターｐＸＬ１９８６を含む２つの組み換えベクターが得られた。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２１８６を、ポリペプチドＰ（△ｈｌｌ−１２）をコードする上記で得られたベクターから構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２１８６はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｅにＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（△ｈｌｌ−１２）の非常に多量の発現を可能にする。

９、ベクターｐＸＬ１９８７及びｐＸＬ２２１７の生成、ならびにポリペプチドＰ（△］）１３−１４）及びＰ（ｔａｇ△ｈ１３−１４）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い５’−ＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１８７２につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列の位置８６８〜９９９の部分を欠失させ、Ｒ２９０残基からＮ３３３残基までの４４のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、１００５−ｂｐのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、それ自身酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＴて切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ　１９８７は、らせん１３及び１４の欠失（△ｈ１３−１４）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１１）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２２１７をベクターｐＸＬ１９８７から構築した。それにより得られるベクターｐ　Ｘ　Ｉ−２２１７はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）６にＮ−末端で融合（−たポリペプチドＰ（△ｈ１３−１４）の非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ２　プラスミドｐＸＬ１６９６から生産される突然変異体１　ベク９−ｐＸＬ２０７１及びｐＸＬ２１８５（Ｄ生成、ならびにポリペプチドＰ（△ｂ５−６）及びＰ（ｔ、ａｇ△ｈ５−６）の製造以下のり二ノ酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い５’　−ＣＡＧ（ＪＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、−り記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１．６９６（実施例Ａ２を参明）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列の位置３５２〜・１８３の部分を欠失させ、Ｒ１１８残基からＲ１６１残基まての４４のアミノ酸の欠失を引き起こすことができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、４３２−ｂｐのＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ２０５１から単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨｌで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７１は、らゼん５及び６の欠失（△ｈ５−６）を有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ１　］）に記載の案に従い、ベクターｐＸＬ２１８５をベクターｐＸ　Ｌ、　２０７１から構築した。それにより得られるベクターｐＸＬ２１８５はデカペプチドＭＲＧＳ　（Ｈ）ｓにＮ−末端で融合したポリペプチドＰ（Δｈ５−６）の非常に多量の発現を可能にする。

２、ベクターｐＸＬ２０６３の生成及びポリペプチドＰ（Ｄ５Ｓ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデカキノヌクレオチドを用い５　′−ＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴΔＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１６９６（実施例Ａ２を参照）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＡ　Ｇ　Ｃ＝トンをよ入し、位置５においてアスパラ５ン酸をセリン残基で置換することができた。

完全に配列を確認した突体変異クローンから、５６４−ｂｐのＮｄｅＴ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ２０５１から単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍ１−ＴＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７３は、位置５においてセリンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

３　ベクターｐ　Ｘ　Ｌ　２０６９の生成及びポリペプチドＰ（Ｄ５Ｋ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデカキノヌクレオチドを用い５　′−ＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡ　−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１６９６　（実施例Ａ２を参照）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＡＡＡコドンを導入し、位置５においてアスパラギン酸をリシン残基で置換することができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、５６４−ｂｐ（７）Ｎｄｅｌ−ＥｃｏＲＴフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ２０５１から単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０６９は、位置５においてリジンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

４、ベクターｐＸＬ２０６２の生成及びポリペプチドＰ（Ｄ４４Ｆ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い・５’−ＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣｋＧＴ：匹−＾ＡＣＴｒＧＧＡＧＡＡ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１６９６　（、実施例Ａ２を参Ｒ）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡ■■コード配列にＴＴＣコドンを導入し、位置４４においてアスパラギン酸をフェニルアラニン残基で置換することができた。

完全に配列を確認した突体変異クローンから、５６４−ｂｐのＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐ　Ｘ　Ｉ−２０５１から単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び酵素ＮｄｅＴ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０６２は、位置４４においてフェニルアラニンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

５、ベクターｐＸＬ２０７４の生成及びポリペプチドＰ（Ｄ４４Ａ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い・Ｓ　’　−ＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＺ譚ＡＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡ　−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ１６９６　（実施例Ａ２を参照）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＧＣＧコドンを導入し、位置４４においてアスパラギン酸をアラニン残基で置換することができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、５６４−ｂｐのＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ２０５１から単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７４は、位置４４においてアラニンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ３−プラスミドｐＸＬ２０５１から生産される突然変異体１、ベクターｐＸＬ２０７３の生成及びポリペプチドＰ（Ｋ１７８Ａ）の製造Ｓ’−ＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＧＡＣＧＣＣＴＴＡＣＧ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ２０５１　（実施例Ａ２を参照）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＧＣＧコドンを導入し、位置１７８においてリシンをアラニン残基で置換することができた。

完全に配列を確認した突然変異クローンから、５７２−ｂｐのＥｃ。

ＲＴ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ１６９６から単離したＮｃｌｅ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７３は、位置１７８においてアラニンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

２、　ベク９−ｐＸＬ２０７０の生成及びポリペプチドＰ　（Ｋ１７８Ｙ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデカキノヌクレオチドヲ用い：５’−ＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＡＣＧ−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ２０５１　（実施例Ａ２を参％）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＴＡＴコドンを導入し、位置１７８においてリジンをチロノン残基で置換することができた。

Ｒ１−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ１６９６から単離したＮｄｅ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７０は、位置１７８においてチロノンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

３　ベクターｐＸＬ２０７２の生成及びポリペプチドｐ　（Ｅ２３ＯＫ）の製造以下のリン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチドを用い：５　’　−ＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＭＩＩ；ＣＣＡＧ　−３’Ａｍｅｒｓｈａｍキットを用いて製造者の勧告に従い、上記の１本鎖の形態のプラスミドｐＸＬ２０５１（実施例Ａ２を参照）につき特定部位の突然変異誘発を行った。この突然変異誘発によりアポＡＩＶコード配列にＡＡＡコドンを導入し、位置２３０においてグルタミン酸をリシン残基で置換することができた。

Ｒ１−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、続いてプラスミドｐＸＬ１６９６から単離したＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント及び酵素Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩで切断したベクターｐＥＴ３−ａと連結した。

それにより得られる組み換えベクターｐＸＬ２０７２は、位置２３０においてリジンを有するポリペプチドの非常に多量の発現を可能にする。

Ｂ４　パートＢ１〜Ｂ３に記載のポリペプチドの生産１　生産　パートＢ１〜Ｂ３に記載の本発明のポリペプチドの発現のためのプラスミドを含む株ＢＬ２１　ＤＥ３　（ｐＬｙｓＳ）を例として用いる。

アンビンリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（５０ｕ　ｇ／ｍ　ｌ　）を含むＬＢ培地、ＬＢＡｐＣｍ中の３７°Ｃにお（プる終夜培養物を用い、生産培地（同培地）に１／１．００の希釈比で接種する。培養物を３７℃において０．５の光学濃度（６１０μｍで測定）に撹拌する。続いてＩＴＧを１ｍＭの最終濃度で加え、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼの発現に関して誘導された細胞を９０又は１８０分間インキュベートする。クーマン−ブルーで染色した電気泳動ゲルを用いたバクテリア抽出物の分析により、９０分培養の抽出物において本発明のポリペプチドの堆積を視覚化することができる。生産期（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｈａｓｅ）の間にリファムピシンを加えることによりこのポリペプチドを安定化することができる。続いて新合成（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓ　１ｚｅｄ）されることができるｍＲＮＡのみがＥ、コリ　ＲＮＡポリメラーゼに依存しないｍＲＮＡである。例えばＩＰＴＧの添加の２０分後にリファムビノンを５０〜２００μｇ／ｍＩの濃度て加えることができる。

続いて放置され、他のｍＲＮＡが排除されるまで所望のポリペプチドのｍＲＮＡのみを生産する細胞を３７℃で９０〜１８０分間インキュベートする。

この場合、生産される組み換えポリペプチドは、バクテリアによって生産される総タンパク質の２０〜３０％となることができる。さらにされによりポリペプチドはバクテリア中で分解せずに可溶性の状繋で堆積する。

生産を、流加様式におけるＥ　コリの高濃度培養により発酵槽操作に外挿（ｅｚｔｒａｐｏｌａｔｅ）した。生産は２−リットルの発酵（Ｓｅｔｒｉｃ）中で２相において行った。１相は０Ｄ６００が３０から４０までの微生物の発育相である（時間：約５時間）。この相はＪｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（Ａｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、１３９　（１９８８）１２９−１４６）により限定された発酵培地中で行われる。その後Ｉ　ＰＴＧ及びリファムピンンの添加、ならびに炭素及び窒素基質の供給速度の増加により、生産の誘導の相が続く（時間　約１時間３０分）。

２、細胞溶解及び組み換えポリペプチドの回収生産培養の後、細胞を集め、続いて例えば音波処理により溶解する。

実験室規模では、ＰＢＳ緩衝液（０，２ｇ／Ｉ　ＫＣＩ、０．２ｇ／ｌＫＨ２ＳＯ４，８ｇ／］　ＮａＣｌ、１．２５ｇ／］　Ｎａ２Ｐ０４）中で細胞を３０倍に遠心した後、Ｂｒａｎｓｏｎソニケータ−（モデルＢ３０．Ｐｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた。細胞破裂は、４°Ｃにおいて連続様式で行う（２５分パルス）。音波処理の前に、濃厚細胞懸濁液を室温におけるＴｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１００の存在下で予備処理することもできる。

Ｃ／本発明のポリペプチドの精製Ｃ１ポリペプチドＰ　（Ｒ９３Ｇ）　、Ｐ　（△Ｃ４４）及びＰ（ΔＮ１５）を以下の案に従って精製し、それは自黙の条件下で進行し、脂質に対する親和性の段階を必要としない。

細胞培養物を６．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心し、ペレットを、緩衝液Ａ　（８１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１９ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ，，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール）中に湿潤細胞１ｇ当たり３ｍｌに基づいて取り上げる。懸濁液を４℃において８３分サイクルの超音渡（２５０Ｗに設定しこＢＲＡＮＳＯＮモデル）で処理する。抽出物を４℃において１５．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心する。上澄み液Ｓ１を保存し、ペレットを同体積の緩衝液Ａで洗浄し、同条件下で再遠心する。対応する上澄み液Ｓｌ’を上澄み液Ｓ１に加える。

両分（３１＋３１’）のタンパク質のアッセイの後、ストレプトマイノンサルフェートの１０％水溶液をタンパク質１ｇ当たり１０ｍ１の溶液に基づいて加える。穏やかに撹拌しながら４℃で１５分間インキユベートシた後、懸濁液を４°Ｃにおいて１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心する。上澄み液（Ｓ２）を回収する。この画分Ｓ２に硫酸アンモニウム（最終濃度　２５％飽和）を加える。撹拌しながら４℃で１５分間インキュベートした後、懸濁液を４°Ｃにおいて１５．０００ｒｐｍで３０分間遠心する。この上澄み液Ｓ２５に硫酸アンモニウム（最終濃度、５０％飽和）を加える。撹拌しながら４°Ｃで１５分間インキュベートした後、懸濁液を４°Ｃにおいて１５．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心する。ペレット（Ｒ５０）を回収し、緩衝液Ｂ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，８）に取り上げ、２１の緩衝液Ｂに対して透析し、緩衝液Ｂを４８時間かけて５回変える。

透析物をＱＦＦ型（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）イオン交換カラム上に注入し、ＮａＣ］勾配を用いて溶離する。本発明のポリペプチドを含む画分の決定は、下肥のＥｌｉｓａ試験に従って行う。問題の両分を集め、硫酸アンモニウム（最終濃度　８０％飽和）中の沈澱により濃縮する。撹拌しながら４°Ｃて１５分間インキュベートした後、懸濁液を４８Ｃにおいて１５．０００ｒｐｍで３０分間遠心する。ペレット（Ｐ　８０）を回収し、緩衝液Ｂに取り上げ、２１の緩衝液Ｂに対して透析する。

透析物をＭｏｎｏ　Ｑ型（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）イオン交換カラム上に注入し、ＮａＣ１勾配を用いて溶離する。下記のＥｌｉｓａ試験及び１５％ＳＤＳゲルにより同定された問題の画分を集め、硫酸アンモニウム（最終濃度　８０％飽和）における沈澱により濃縮する。撹拌しながら４℃で１５分間インキュベートした後、懸濁液を遠心し、緩衝液Ｄ（１７Ｍ　硫酸アンモニウム、８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１，９ｍＭＮａＨ，ＰＯ４，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）中に取り上げ、２１の緩衝液りに対して透析する。

透析物をフェニル−セファロース（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上に注入し、緩衝液Ｅ　（８，１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ○４．１．９ｍＭ　ＮａＨ，ＰＯ４，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）を用いて溶離する。問題の画分をＥｌｉｓａ試験及び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより同定する。

簡単に記載すると、開発されたＥＬＩＳＡ試験は、平板上にヒト　アポＡＩＶに対するウサギポリクローナル血ｆｆ１（１／１０００に希釈）を吸着させ、この平板にゼラチンを飽和させ、試験試料をインキュベートし、最後ニアポＡＴＶ（ＭＯ３及びＭＯＳ、５ＥＲＬＩＡ、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｄｅ　Ｌｉ１ｌｅ）に対する２つのモノクローナル抗体の当モル混合物を反応させ、続いてパーオキソダーゼ−カップリング抗−マウスポリクローナル血清を用いて免疫酵素学的に視覚化することによる。この試験は血漿アポＡＩＶの１系列の希釈を用いて容易にキャリプレートされる。

これらの画分を集め、緩衝液Ｆ（硫酸アンモニウム、４０％飽和、８．１ｍＭ　Ｎａ２８Ｐ０４．１．９ｍＭ　Ｎａ８２ＰＯｔ、２ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐ８７．４）に対して透析し、４℃で保存する。

Ｃ２，ポリペプチドＰ（△ｈｌ−２）　、Ｐ　（△ｈ５−６）　、Ｐ　（△ｈ１３−１４）及びＰ（ΔＮ１８２）の場合、緩衝液Ｂで平衡化したＱＦＦ型カラム上に直接（硫酸アンモニウムを用いた分別沈澱を行わずに）画分Ｓ２を注入する。ポリペプチドは排除されるか（Ｐ（ΔＮ１８２））、又は緩衝液Ｂ中の２５０ｍＭ　ＮａＣ＋のプラトーを用いて溶離される（Ｐ（Δｈｌ−２））。続いてポリペプチドを硫酸アンモニウム（最終１度　Ｐ（△ｈｌ−２）の場合５０％飽和、ｐ（ΔＮ１８２）の場合１０％）中の沈澱により濃縮する。Ｐ（△ｈｌ−２）の精製は、遠心（３０分間、４℃、１０．０００　ｇ）により終了する。ペレットを回収し、ＰＢＳＩｉ衝液中に取り上げ、ＰＤＩＯ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル濾過カラム上で脱塩し、−２０℃で乾燥する。硫酸アンモニウムを用いて沈澱したポリペプチドＰ（ΔＮ１８２）は、フェニル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上に注入し、緩衝液Ｂで溶離する。ポリペプチドを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより同定し、問題の両分を集め、緩衝液Ｂに対して透析し、４°Ｃで保存する。

Ｃ３ポリペプチドＰ（ｔａｇ△Ｎ１５）　、Ｐ　（ｔａｇ△Ｃ４４）、Ｐ（ｔａｇ△ｈｌ−２）　、Ｐ　（ｔａｇ△ｈ７−８）、Ｐ　（ｔａｇ△ｈ９１０）、Ｐ（ｔａｇ△ｈｌｌ−１２）、Ｐ　（ｔａｇ△ｈ１３−１４）、及びＰ（ｔａｇ△ ｈ５−６）は１段階のみから成る以下の案に従って精亨νしｌこ。

細胞培養物を６．０００ｒｐｍで３０分間遠心し、緩衝液Δ（８］ｍＭ　ＮａｚＨＰ○４．１９　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦＳｐＨ７，５，１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール）中に１ｇの湿潤細胞当たり３ｍｌに基づいてベレットを取り上げる。懸濁液を４℃で３５分サイクルの超音波（２５０Ｗに設定したＢＲＡＮＳＯＮモデル）により処理する。抽出物を４℃において１１．００Ｏｒｐｍで１時間遠心する。１０％（Ｗ／Ｖ）のストレプトマイシンサルフェート（１０ｍｌ／ｇタンパク質）を加え、４°Ｃで３０分間インキュベートすることにより上澄み液中に存在する核酸を沈澱させ、続いてそれを前と同一の条件下で再遠心した。

上澄み液中に存在する組み換えタンパク質は、キレート形成金属イオンに関するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製は製造者の勧告に従い、以下の修正をしてアガロース−ニトリロトリ酢酸−ニッケル（ＮＴＡ−Ｎｉ）樹脂上で行った：タンパク質溶液は、１００ｍＭ　リン酸塩緩衝液、ｐＨ８を用いて平衡化したＴｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ　ＧＦ−０５カラム上で脱塩する。収穫したタンパク質画分を集め、同リン酸塩緩衝液中で４ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、Ｈｅｃａｍｅｇ（粉末）を最終濃度２５ｍＭに補足した。続いて混合物を、２５ｍＭのＨｅｃａｍｅｇを含む同一のリン酸塩緩衝液で平衡化したＮ１−ＮＴＡカラム上に装填した。同緩衝液でカラムを洗浄することにより、結合タンパク質は溶離しなかった。リン酸塩／クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６を用いた場合に弱く結合したタンパク質が溶離し、リン酸塩／クエン酸塩緩衝液、ｐＨ５を用いた場合に組み換えタンパク質が溶離した。ｐＨ５において得たタンパク質画分を、ＩＭの水酸化ナトリウム（３０μｍ７ｍ１）を加えることにより中和し、２つのプロテアーゼ阻害剤：０．１Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．２Ｍ　ＰＭＳＦを補足した。

続いて画分を、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）６８０）に従って１５％のアクリルアミド／ビス−アクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲル上の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、純度及び品質に従って集めた。集めた画分をＬ　（−）−ヒスチジン粉末（最終濃度　５０ｍＭ）の存在下で４°Ｃで１時間インキュベートし、Ｎｉ−ポリーＨ１ｓ−タンパク質結合を破壊した。その後遊離したニッケル及びヒスチジンを、２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＤＨ７，４のリン酸塩緩衝液で平衡化したＴｒｉｓ−Ａｃｒｙｌ　ＧＦ −０５カラム上で脱塩することにより除去した。

かくして精製した組み換えタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びイムノブロッティングにより分析した。イムノブロッティングはノ（−オキシダーゼー共役抗−アポＡ　Ｉ　Ｖモノクローナル抗体及びパーオキシダーゼー共役ヒツジ抗 −マウス抗体の混合物を用いて行った。結合したパーオキシダーゼ活性は、基質としての４−クロロ−１−ナフトールの溶液と共にインキュベートすることにより視覚化した。

種々のクロマトグラムを２８０ｎｍにおけるＵＶ検出により監視した。

タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Δｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ本発明のポリペプチドの生物学的活性は、生にそれらのＨＤＬレセプターに対する親和力及びそれらのコレステロール流出への効果の２つのパラメーターに基づいて評価した。これらの２つの／ぐラメ−ターは本発明のポリペプチドの高コレステロール血症薬理学的効力を反映している。

これらのパラメーターの測定のための案を、得られた結果と共に下記に示す。

１、測定案ａ）　ＨＤＬレセプターに対する親和力最初に、精製されたポリペプチドを用いてＤＭＰＣとプロテオリポソームを再構築し、その構造は排除クロマトグラフィーにおける挙動から見て天然のアポＡＩＶを用いて再構築したプロテオリポソームと同一と思われる。続いてこれらの再構築プロテオリポソームを、すでに記載の案に従ってネズミ脂肪細胞（Ｏｂ１７７系）に結合するその能力に関して調べる。

ｂ）　コレステロール流出本発明のＤＭＰＣ−ポリペプチドを含むプロテオリポソームにより誘導される不ズミ脂肪細胞（Ｏｂ１７７系）からのコレステロールの流出を５時間のインキュベーションの後に測定する。

２、結果アポＡＩＶ　１００＊＊　１００＊＊　２８Ｐ（Ｒ９３Ｇ）　１１５　９７　２７．５Ｐ（△ｈｌ−２）　１０５　９４　２５．５Ｐ（△Ｃ４４）　測定せず　測定せず　３２Ｐ（ΔＮ１５）　９６　９４　２４（＊）負荷された細胞における初期のコレステロールの％として表す＋ＤＰＭＣのみの存在下で５時間後に得たベースラインの流出は１１％である。

（＊＊）３回の独立した実験で行う。

配列表配列番号　１配列の長さ　１１３４配列の型：核酸鎖の数、２本鎖トポロジー　ｉ鎮状配列の種類、他の核酸　ｃＤＮＡハイポセティカル・ＮＯアンチセンス・ＮＯ配列の特徴特徴を表す記号　ＣＤＳ存在位置・１．．１１３４特徴を表す記号：Ｌｏｏｐ存在位置　４０．．１２０特徴を表す記号　Ｌｏｏｐ存在位ｉｉ：　１２１．．１８６特徴を表す記号　Ｌｏｏｐ存在位置　１８７．．２８５特徴を表す記号　Ｌｏｏｐ入ＩＣＧＡ（ｕ　ＣＴＣＡＣＴ　ｃｃ’ｒ　ＣＡＣＣＡＣＣｍ　にＣＣＡＣＡ　ＧＴＧ　八’ＩＮＩ；　ＴＣＩ；Ｇ　ＣＡＣＴＡＣＴｆ’ＣS１５Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｈａ　Ａｊｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　Ａｈａ　ＴｈｒＶａｌ　）４ｅｔ　？ｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈ５ＡにＣＣＡＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＡＣ入ＡＴ　ＧＣＣλ入ｃ　ＣＡＧ　Ｇｅｅ　ｃ’ｒａ　ｃ入入　ＣＡＴ　ｃｒｃ　ＣＡＧ　い、１　９６Ｓｅｒ　（，１ｎ　Ｉｚｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　にｍｕ　ＡＩＪＩ　ＶＪＬＩ　Ｇｌｕ　Ｒｌｓ　１＜ｕ　Ｇｌｏ　kｙｓＴｃ′Ｔｃｐｉ　ＣＴＣ＾ＣＣＣＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣｋ）σＧｅＣＣＴＣＴＴ ’ＣＣＡＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　１４４ＳｅｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＧユｎＧＬｎＬｅｕ＾ｓｎ入１畠ＬｅｕＰｈｅＧｉｎ入８ｐＬｙｓＬ＠。ＧｌｙＣＡＡ　ｇ　Ｍｅ　ＡＣＴ　ＴλＣＧＣ＾　ＧＣＴ（、へＣＣテＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＭＧ　ＣＴＣＧＴＧ　ＣＣＣＰｒ７　１９２ＧＩＬＩ　Ｖｌｌｌ　入ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＸＡｕ　にｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐ■■ ５０　ＳＳ　５ＱＧＣＣＡＣＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＴ　ＣＡＡ　ＣＧＣＣ’！’Ｇ　（、ＣＣＡＡＧ　ＧＡＣＴＣＧ　ＧｋＧ　ＡＡＸ　ＣＴＧ　ＡＡＣ２４０人１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ａｇｐ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ６５　７０　７５　６ｇＣＡＧ　ＧＡＧ　Ａ’ｌ”ｆ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＣＧＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣQａａＧ１ｕ　Ｇｌｕ　１１ｓ＋　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｓｕ　Ｃ１ｕ　にｌｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇにｌａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

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ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＡＣＡＧ　ＣへＧＣλ に　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣλＧＣ八ＧＧへＧＣＡＧ　１１０４Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｘ　Ｇ３Ｊｓ　ＧＬ＋ｉ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇ１１ｌｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇ−Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＧPｎ配列番号　２配列の長さ　３７７配列の型　アミノ酸トポロジー　直鎮状配列の種類　タンパク質配列Ｇｉｕ　Ｖａｌ　八ｓｎ　Ｔｈｒ　ＴｙＴ　ｋｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　ｈａ　Ｐｈ５）ｄａテｂｘ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ＭＬｓ　Ｇｉｎ　ＭＧ　１ａｕ　Ａｉａ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ｋｕ　ＬｙｓＴｈｒＧｉｎＡユａＧｌｕＧｉｎＬｅｕ人ｒｇＭｙＧｉｎＩＩ＜ｕＴｈｒＰｒｏ丁ｙｒλｌａＧユｎ＾ｘ９Ｇｌｕ　１４ｕ　ＬＹＩＩ　ＧユＹ　ｋｒｑ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ＰＴＯＴｙｒ　入ユ１　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｅｌｌｌｏ　１８５　１９０工ｌ＠）ｘｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ＶａｌＧｌｕ　Ｇｌｕ　テｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｅｒ　！ｘｕ　Ｊｄａ　Ｐｒｏ　ＴｙＴに１Ｇｌｓ　Ａｓｐでｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉ、ｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｙｎ　）Ｉｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕτｈｒ　ｐｈｓＧｉｎ　−ｔ　ＬＹＩＩ　ＬＹＳ−ｆｉＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＩＪｌｕ　Ｌｙｓ　Ｊｄａ　Ｊｃｇ工１＠　−ｒ　ｌｌａ　８訂２ス５２３０２３５２４０人ユａＧｉｕＧｌｕＬａｕ入ｒｇＧ１ｎＡｒｇＬ４ｕ＾ユａＰｒｏＬａｕ入１ａＧユＵλｓｐＶ龜ユＡｒｇＧｌｎ　Ｌｓｕ　入ｒｑ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＨＬｓ　入１ａ　Ｇｕｙ　Ａｇｐ　Ｖａｌ　に１ｕ　Ｇｌｙ　）Ｉｉ■ 配列番号：３配列の長さ　８４配列の型・核酸鋳の数　１本鎖トポロジー・直鎖状配列の種類　他の核酸　ｃＤＮＡハイボセティカル　Ｎ。

配列配列番号　４配列の長さ　９４配列の型　核酸鎖の数　１本鎖１−ポロジー　［鎖状配列の種類　他の核酸　ｃ　ＤＮＡハイポセティカル　Ｎ。

配列配列番号　５配列の長さ　８６配列の型　核酸鎖の数　１本鎖トポロジー　直鎖状配列の種類・他の核酸　ｃＤＮＡハイポセティカル二Ｎ。

配列ｃｃｈｃｃｃｃｃｒｃ　ＣｒＴＣｃＯＴアＣテＴＣＣでＣ入ＣＣ丁　ｃｃｅｒｃ入入ＧＴへ人　Ｇ？ＣＣＣＡｅ入工ＣＡＣ？α丁ＧＧＣＣ＾@６゜ｃｃＴＣＧＴＣ入ＧＣｘｃｒｃｘｃｃｒｃｃ　ｘ〒八へｃ丁　１１６配列番号：６配列の長さ：９２配列の型・核酸鏑の数　１本鎖トポロジー　ｗｉｎ状配列の種類　他の核酸　ｃＤＮＡハイポでティｎル　Ｎ。

配列ｍχ；’Ｎ：　ＡＣＴＴＣＡＣ；Ａ？〒賀＝１Ｑ〜りｄ℃ＴＴ　９２ｐＸＬ１６９７　ｆ＞２　ｋｂｌＦｉｑｕｒＩ！３補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年７月２２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトアポリボタンパク質ＡＩＶ配列番号：２に対して以下の修飾（ａ）官能基に影響する点突然変異、及び／又は（ｂ）末端からの少なくとも１０アミノ酸の欠失、及び／又は（ｃ）らせん又は１対のらせんの欠失、及び／又は（ｄ）アポＡＩＶの生物学的活性と異なる、又は相補的な生物学的活性、あるいはマーカー、ターゲッティング剤又は安定剤となることができる性質を有する追加の異種部分の少なくとも１つを含むことを特徴とする、ヒトアポリボタンパク質ＡＩＶから誘導されたポリペプチド。
２．（ａ）及び（ｂ）に記載の少なくとも１つの修飾を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載のポリペプチド。
３．（ａ）及び（ｃ）に記載の少なくとも１つの修飾を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載のポリペプチド。
４．（ｄ）に記載の修飾と組み合わされた（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の修飾を含むことを特徴とする請求の範囲１に記載のポリペプチド。
５．官能基が荷電残基、グリコシル化部位である残基、及びジスルフィド架橋に含まれる残基から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
６．官能基が以下の残基：位置５、４４、１０６、１５３におけるアスパラギン酸：位置３７、１９４におけるグルタミン：位置３９におけるアスパラギン：位置７３、８４、１０３、１６９、１７８におけるリシン；位置７６、８１、８７、９９、１３１、１６４、１８７、２３０におけるグルタミン酸；位置２２におけるアラニン；位置１３９、１６１におけるプロリン：及び位置１５４におけるセリンから選ばれることを特徴とする請求の範囲５に記載のポリペプチド。
７．実施例に記載の以下のポリペプチド：Ｐ（ΔＮ１３，Ｒ９３Ｇ）、Ｐ（ΔＮ１３）、Ｐ（ｔａｇΔＮ１３）、Ｐ（Ｒ９３Ｇ）、Ｐ（ΔＣ４４）、Ｐ（ｔａｇ ΔＣ４４）、Ｐ（ΔＣ１９４）、Ｐ（ΔＮ１８２）、Ｐ（Δｈ１−２）、Ｐ（ｔａｇΔｈ１−２）、Ｐ（Δｈ７−８）、Ｐ（ｔａｇΔｈ７−８）、Ｐ（Δｈ９− １０）、Ｐ（ｔａｇΔｈ９−１０）、Ｐ（Δｈ１１−１２）、Ｐ（ｔａｇΔｈ１１−１２）、Ｐ（Δｈ１１−１２．Ｌ８７Ｍ）、Ｐ（Δｈ１３−１４）、Ｐ（ｔａｇΔ１３−１４）、Ｐ（Δｈ５−６）、Ｐ（ｔａｇΔｈ５−６）、Ｐ（Ｄ４４Ｆ）、Ｐ（Ｄ４４Ａ）、Ｐ（Ｄ５Ｓ）、Ｐ（Ｄ５Ｋ）、Ｐ（Ｋ１７８Ｙ）、Ｐ（Ｋ１７８Ａ）及びＰ（Ｅ２３０Ｋ）から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
８．請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
９．それがｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ又はＲＮＡ配列、あるいは合成又は半一合成配列であることを特徴とする請求の範囲８に記載のヌクレオチド配列。
１０．それがｃＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲９に記載のヌクレオチド配列。
１１．請求の範囲８〜１０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
１２．請求の範囲１１に記載のベクターを含む組み換え細胞。
１３．請求の範囲１２に記載の組み換え細胞を培養し、生産されるポリペプチドを回収することを特徴とする請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドの製造法。
１４．請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドの活性な重要な構造的要素を決定し、ペプチドの構造ではないか、又は必ずしもペプチドの構造ではない構造によりこれらの要素を再現することにより、ペプチドでないか、又は必ずしもペプチドでなく、血漿コレステロール量に関して薬理学的に活性な分子を製造するための請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドの利用。
１５．請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載の１種又はそれ以上のポリペプチド、あるいは請求の範囲８〜１０のいずれか１つに記載の１種又はそれ以上のヌクレオチド配列、あるいは請求の範囲１４に従って製造された１種又はそれ以上の分子を含む製薬学的組成物。
１６．高コレステロール血症に伴う疾患の処置又は予防を目的とする請求の範囲１５に記載の組成物。
１７．アテロームプラークの形成を遅くする、及び／又はアテロームプラークの退行を誘導する、及び／又は冠動脈の事故を減少させることを目的とする請求の範囲１６に記載の組成物。