JP3023467B2 - ヒトベイシジンｉ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトベイシジンＩ（ｂａ
ｓｉｇｉｎ Ｉ）遺伝子に関し、更に詳細には腫瘍マー
カー、免疫異常マーカーあるいは各種炎症性疾患マーカ
ーとして有用なヒト細胞膜上に発現する糖タンパク質、
ベイシジンＩのコアタンパクをコードするヒトベイシジ
ンＩ遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に癌化した細胞の細胞膜には正常な
細胞とは異なる糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質が
存在することが知られている。またガンを診断するに際
し、癌患者において特異的に産生されるタンパク抗原や
糖鎖抗原を測定する方法が行われている。その例として
は、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン、Ｃ
Ａ１９−９などの測定による消化器系癌の診断等が知ら
れている〔村松喬，日本臨床，４４，３３７−３４４
（１９８６）；神奈木玲児，臨床病理，３５，１２４７
−１２６４（１９８６）；医学のあゆみ，１０６巻，５
号，第５土曜特集，２３５〜２５０頁（１９７８
年）〕。しかしながら、従来の各種癌抗原測定を利用す
るガンの診断法は適用できる癌の種類が比較的限られて
いたり、健常人や肝炎等の他の疾患との交差反応がおこ
るなどの問題点があり、より広範な種類の癌に適用でき
る診断法又は特異性の高い診断法が望まれている。ま
た、種々の免疫異常応答に基づく疾病や各種炎症性疾患
においても適確な診断法が望まれている。そして、かか
る癌の診断に利用出きる腫瘍マーカー、免疫異常マーカ
ーあるいは各種炎症性疾患マーカーとなり得る新たな糖
タンパク質の開発が切望されている。

【０００３】そこで、本発明者は所謂未分化ガンの範疇
に属するマウスのテラトカルシノーマ〔ｔｅｒａｔｏｃ
ａｒｃｉｎｏｍａ，奇形癌腫〕に着目して研究をしてき
たところ、癌あるいは免疫異常の診断上有用な新規糖タ
ンパク質をマウステラトカルシノーマ及びマウス各種組
織細胞膜画分中に見出し、先に特許出願した〔特開平３
−４１０９９号公報〕。すなわち、マウステラトカルシ
ノーマの細胞膜画分中に含まれるロータス豆レクチン結
合糖タンパク質を免疫原としてウサギを免疫し、得られ
た抗体を用いてテラトカルシノーマ由来のｃＤＮＡライ
ブラリー（λgt１１ライブラリー）を検索し、該糖タン
パク質のコアタンパクをコードするｃＤＮＡクローンを
単離した〔特開平３−４１０９９号公報、Ｍｉｙａｕｃ
ｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，１０７，３１６〜３２３〕。

【０００４】当該糖タンパク質の分子量はＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動後のウエスタンブロットの
抗体染色により43,000〜66,000と決定されたが、ｃＤＮ
Ａの塩基配列より推定されるコアタンパク部分の分子量
は約28,000であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及
び細胞質ドメインよりなる。細胞外ドメインにはアスパ
ラギン結合型糖鎖の結合しうる部位が３個所存在する。
細胞外ドメインはシステイン残基がＳ−Ｓ結合すること
により免疫グロブリン様のループ構造を形成しうる。該
糖タンパク質と既知タンパク質とのホモロジーを比較検
索したところ、免疫グロブリンκ鎖（Ｖドメイン）及び
主要組織適合性クラスII抗原β鎖（Ｃ様ドメイン）と約
２０％のホモロジーが認められ、免疫グロブリンスーパ
ーファミリーの新規メンバーであることが判明した。

【０００５】他方、該糖タンパク質はマウス成体各臓器
及び９〜１５日胚など広範囲に発現分布していることも
明らかとなった。このような特性をもつ該糖タンパク質
をベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）と命名した。マウスの
生体各臓器に発現しているベイシジンはヒマ凝集素Ｉ
（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉ
ｎｉｎ−Ｉ，ＲＣＡ−Ｉ）及びコンカナバリンＡ（Ｃｏ
ｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ，Ｃｏｎ Ａ）の両レクチン
に結合しうることが明らかとなり、その分子量は臓器に
よって異なることも判明した〔Ｋａｎｅｋｕｒａ，Ｔ．
ｅｔ ａｌ．，（１９９１〕Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．
Ｆｕｎｃｔ．１６，２３−３０〕。更にヒト由来の細胞
においてもベイシジンの発現が認められた。

【０００６】ベイシジンは免疫グロブリンκ鎖と組織適
合性クラスII抗原β鎖の双方にホモロジーが認められる
ことや胚や成体の各組織に広く分布していることより、
生体各組織において重要な役割を担っている分子であろ
うと推測される。また、免疫グロブリンスーパーファミ
リーに属する多くの分子が種々の組織細胞で細胞接着に
関与していることから推測されるように、ベイシジンも
細胞接着など細胞間相互作用に何らかの形で関与してい
ると考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このような特性を示す
ベイシジンの発現異常は生体において癌や免疫異常ある
いは炎症性疾患などをひき起こす可能性が予想され、ベ
イシジン又はそのコアタンパクをコードする遺伝子をこ
れらの疾患の診断、治療に応用することが期待されてい
る。しかしながら、従来知られている遺伝子はマウス由
来のベイシジンに関するものであり、ヒトへの臨床応用
をすすめるためにもヒト由来のベイシジン遺伝子の単離
が望まれていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは、鋭意研究した結果、マウスベイシジン遺伝子
より得られたＤＮＡ断片をプローブとして用いてクロー
ニングすることにより、ヒトベイシジンＩ遺伝子が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、以下の（ａ）から
（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質を
コードする塩基配列を有するヒトベイシジンＩ遺伝子を
提供するものである。 （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、１番目
から２６９番目までの配列からなるタンパク質、 （ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、２番目
から２６９番目までの配列からなるタンパク質、 （ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、２３番
目から２６９番目までの配列からなるタンパク質。 また、本発明は当該ヒトベイシジンＩ遺伝子を発現する
ベクター、当該発現ベクターで形質転換された宿主細
胞、当該ヒトベイシジンＩ遺伝子によってコードされる
組換えタンパク質、当該組換えタンパク質の製造方法、
当該組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体又は
ポリクローナル抗体、及び当該ヒトベイシジンＩ遺伝子
検出用プローブを提供するものである。

【００１０】本発明の遺伝子は、例えば後記配列表で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、該アミノ酸
配列に相補的な塩基配列、又はその両者を含有するもの
である。より具体的には、後記配列表で示される塩基配
列、該塩基配列に相補的な塩基配列、又はその両者を含
有するものである。

【００１１】本発明のヒトベイシジンＩ遺伝子は、例え
ば以下のようにして調製される。すなわち、まずヒトベ
イシジンＩ遺伝子を発現しているヒト細胞より全ＲＮＡ
を分離し、これよりｍＲＮＡを精製し、常法によりｃＤ
ＮＡを合成したのちこれを発現ベクターに組込んだライ
ブラリーを構築する。ついでマウスベイシジンｃＤＮＡ
をプローブとして用いてこのｃＤＮＡライブラリーより
プラークハイブリダイゼーション法によりヒトベイシジ
ンＩ遺伝子を有するクローンを選択し、本発明のヒトベ
イシジンＩ遺伝子を得る。次に上記本発明遺伝子の製法
につき、詳細に説明する。

【００１２】（１）ｃＤＮＡライブラリーの構築 全ＲＮＡの抽出に用いられる組織細胞としてはヒト正常
及び癌組織又は既にセルラインとして確立された細胞
株、例えば正常二倍体細胞ＷＩ−３８〔Ｈａｙｆｌｉｅ
ｋ，Ｌ．，（１９６５）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，
３７，６１４−６３６〕、胃癌細胞株ＫＡＴＯ−III
〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｍ．，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ
Ｋ．ａｎｄ Ｆｕｊｉｉ Ｇ．，（１９７８）Ｊｐｎ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，４８，６１−６８〕等が挙げら
れる。

【００１３】ＲＮＡの抽出は、グアニジン−イソチオシ
アネート混合液又は適当な界面活性剤、例えばＳＤＳ、
ＮＰ−４０、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸等
を用いて、或いはホモジナイザーを用いる方法や凍結融
解等の物理的方法によって、細胞を部分的又は完全に破
壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン等のミ
キサーもしくは注射筒を用い、ある程度せん断し、その
後、蛋白質と核酸分画とを分別する操作により行われ
る。この操作には、特にフェノール・クロロホルム抽出
もしくは超遠心を用いるＣｓＣｌ重層法〔Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５２９４（１９７９）〕等が一般に用いら
れる。

【００１４】また上記各方法においては、ＲＮａｓｅに
よるＲＮＡの分解を防ぐために、ＲＮａｓｅインヒビタ
ー、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカ
ーボネート、パナジウム複合体、ベントナイト、マカロ
イド等を添加しておくのがよい。

【００１５】上記抽出操作に従って得られるＲＮＡから
のｍＲＮＡの分離、精製は、抽出物を例えばオリゴｄＴ
−セルロース（Ｃｏｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｉｎｃ．）、ポリＵ−セファロース（ファルマ
シア社製）等の吸着カラムを用いる方法により又はバッ
チ法により実施できる。

【００１６】上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常
不安定であり、安定な相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の型に代
えられ、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由
来のベクターに接続される。インビトロでの、上記ｍＲ
ＮＡのｃＤＮＡへの変換、即ちｃＤＮＡの合成は、一般
に次のようにして行うことができる。

【００１７】即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとし
（このプライマーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベク
タープライマーに付加されたオリゴｄＴのいずれでもよ
い）、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧ
ＴＰ，ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素
を用いてｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成す
る。次のステップは、上記において遊離のオリゴｄＴを
用いたか、ベクタープライマーに付加されたオリゴｄＴ
を用いたかにより、各々以下の如く異なる。

【００１８】前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカ
リ処理等により分解して除去し、その後一本鎖ＤＮＡを
鋳型として逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて
二本鎖ＤＮＡを作製する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの
両端をエキソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適
当なリンカーＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩
基を複数付加し、これを適当なベクターへ組込む。これ
は使用するベクターに応じ公知の方法、例えばヤングら
の方法〔Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｄ
ＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，４９（１９８５）〕、ある
いはグブラーとホフマンの方法〔Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａ
ｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ，２５，２
６３（１９８３）〕などを使用して行われる。また、上
記ｃＤＮＡの合成には市販のｃＤＮＡ合成キットを用い
れば容易に行うことができる。

【００１９】ベクターは、特に制限はされないが、λgt
系のファージベクターやプラスミドベクター等を宿主に
応じて適当に選択し、あるいは組合せて使用できる。こ
こで用いられるベクターとしてはλgt１０、λgt１１等
を例示でき、λgt１０、λgt１１をベクターとして用い
る方法は前記ヤングらの方法に準じて行うことができ
る。

【００２０】λgt系のファージベクターに組込んだｃＤ
ＮＡ組換え体はインビトロパッケージング液と反応させ
ることによりｃＤＮＡ組換え体ファージとなり、λgt１
０又はλgt１１のｃＤＮＡライブラリーが構築される。
上記のλgt系ファージライブラリーの作製は市販のλgt
１０又はλgt１１ｃＤＮＡクローニングキットを用いれ
ば容易に行うことができる。

【００２１】また、後者の場合、鋳型としてｍＲＮＡを
残存させたまま、上記と同様のリンカーを付加した開環
状プラスミドと、リンカーＤＮＡ（しばしば動物細胞で
自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域
を含むＤＮＡ断片が用い得る) とを、アニーリングさせ
て閉環状とした後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮａｓｅとＤ
ＮＡポリメラーゼを共存させてｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に置
換し、完全なプラスミドＤＮＡを作製できる。

【００２２】上記の如くして得られるｃＤＮＡ組変え体
プラスミドを宿主微生物に導入し、該微生物を形質転換
する。宿主微生物としては、（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表的であるが、特にこれに限
定されず、その他に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）等も使用することができる。

【００２３】ＤＮＡの宿主微生物への導入及びこれによ
る形質転換の方法としては、一般に用いられている方
法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、Ｃａ
Ｃｌ₂処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にし
て、プラスミドを取り込ませる方法等を採用できる。上
記方法においては、通常知られているように形質転換の
効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂ やＲｂＣｌを更
に共存させることもできる。また、微生物細胞をスフェ
ロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転換させ
る方法も採用することができる。

【００２４】 （２）ヒトベイシジンＩ遺伝子クローンの選択 ヒトｃＤＮＡライブラリーからの、ヒトベイシジンのコ
アタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンのスクリー
ニングは、従来より知られている方法を組合わせること
により実施できる。例えば、（ｉ）発現ベクターに組込
んだｃＤＮＡの産生する蛋白質に対しヒトベイシジン蛋
白特異的抗体を使用し、ウエスタンブロッティングによ
り対応する組換え体ファージクローン又はバクテリアク
ローンを選択する方法、（ii）目的のＤＮＡ配列に選択
的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション法あるいはコロニーハイブリダイゼーション法
などによりスクリーニングが可能である。更にこれらを
組合わせて用いることも可能である。（ii）で用いるプ
ローブとしては、目的のＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はそれ
にコードされるアミノ酸配列に関する情報をもとに、化
学合成したＤＮＡプローブを用いるのが一般的である
が、天然から調製されたＤＮＡやＲＮＡも使用できる。
特にヒトベイシジンのコアタンパクをコードする遺伝子
はマウスのそれと相同性が高いと考えられるため、マウ
スの対応するｃＤＮＡ又はその一部を標識化して使用可
能である。

【００２５】上記において得られた本発明遺伝子は、常
法に従って各種プラスミドにクローニングすることがで
きる。例えばＥｃｏＲＩにて切断して精製した本発明遺
伝子を含む断片を、同様にＥｃｏＲＩにて切断したｐＵ
Ｃ１８〔Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，８３，１０３−１１９（１９８５）〕
などのクローニングベクターの切断部位へ挿入すればよ
い。これにより所望の組換えベクターを得ることができ
る。また、得られる組換えベクターの宿主への導入及び
これによる組換えベクターの増幅と個別化は、一般に用
いられている各種の方法、例えば主として対数増殖期に
ある細胞を集め、ＣａＣｌ₂ 処理により自然にＤＮＡを
取り込みやすい状態とし、これにベクターを取り込ませ
る方法等により行い得る。

【００２６】なお、上記において採用される各種の操
作、例えば一部ＤＮＡの化学合成、ＤＮＡ鎖の切断、削
除、付加ないし結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単
離、精製、複製、選択等はいずれも常法に従うことがで
きる。より具体的には、上記ＤＮＡの単離精製は、アガ
ロースゲル電気泳動等により行うことができる。

【００２７】また、上記で得られる本発明遺伝子の塩基
配列の決定は、適当な制限酵素でＤＮＡを消化した後、
ジデオキシ法〔Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４
６３（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ａ．
Ｍ．Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９
（１９８０）〕等により行い得る。更に上記塩基配列の
決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによ
っても容易に行い得る。

【００２８】かくして得られた本発明ヒトベイシジンＩ
遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列表に
示す。塩基の番号は５′末端を１とし、５′末端から
３′末端方向につけられている。アミノ酸残基の番号は
Ｎ末端からＣ末端方向へつけられており、最初にコード
されるアミノ酸を１としている。ヒトベイシジンＩ遺伝
子の配列は、翻訳領域、５′側及び３′側の非翻訳領域
を含めて全体で１６３２個の塩基からなる。翻訳領域は
８０７塩基の長さで、２６９個のアミノ酸の蛋白質部分
に相当する。

【００２９】得られた本発明遺伝子を利用すれば、従来
公知の一般的な遺伝子組換え技術〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９
８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ，８０，５９９０（１９８３）；ＥＰ特許公開第１
８７９９１号公報等参照〕により、ヒトベイシジンＩの
コアタンパク質を容易に且つ大量に製造、取得すること
ができる。また、このようにして得られるヒトベイシジ
ンＩのコアタンパク質を用い、ヒトベイシジンＩのコア
タンパク質に特異的な抗体を作製することができる。抗
体は通常のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の
製造法に従い製造されるが、ヒトベイシジンＩのコアタ
ンパク質に対するポリクローナル抗体からワインバーガ
ーらの方法〔Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｉｅｎｃｅ，２２８，７４０−７４２（１９８５）〕に
従いエピトープ特異的抗体を得ることも可能である。抗
体はヒトベイシジンＩの精製、測定、識別等に用いられ
る。

【００３０】また、上記の如くして得られるヒトベイシ
ジンＩのコアタンパク質には、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペ
プチド、及び上記アミノ酸配列のＮ末端にヒトベイシジ
ンＩ遺伝子のためのシグナルペプチドの部分もしくは全
部が結合、または欠損した中間体も包含される。かかる
変異は天然に、例えば翻訳後の修飾により得られ、ある
いは遺伝子工学的手法においては、天然から得た遺伝子
を例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス等の
方法により改変したり、ホスファイトトリエステル法等
の化学合成法により変異したＤＮＡを合成したり、或い
は両者を組合わせて、遺伝子を合成できる。これらの遺
伝子を利用し、これを微生物のベクターに組込み、形質
転換された微生物から産生させることにより、変異を有
するコンポーネントを得ることができる。又、これらの
蛋白質は、その機能を保ったまま、天然或いは人口の変
異により、その一部のアミノ酸の置換や配列の改変を行
うことができる。従って、本発明のヒトベイシジンＩ遺
伝子は、上記の各種変異を有する蛋白質をコードする遺
伝子も包含する。遺伝暗号の末端にはＴＡＧ、ＴＡＡ等
の終止コドンを付加することができる。遺伝暗号は上記
配列番号：１に例示されたコドンに限られず、アミノ酸
配列を変えることなく各アミノ酸に対し任意のコドンを
選択でき、例えば遺伝子組換えに利用する宿主のコドン
使用頻度等を考慮した常法に従えばよい〔Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，９，４３−７４（１９８１）〕。

【００３１】

【発明の効果】本発明ヒトベイシジンＩ遺伝子を用いれ
ば、ヒトベイシジンＩのコアタンパク質を容易に且つ大
量に製造することができる。これを用いてヒトベイシジ
ンＩに対する抗体作成と抗体精製が可能となり、更に精
製抗体をリガンドとするアフィニティークロマトグラフ
ィーで各組織細胞に発現しているヒトベイシジンＩを単
離精製できる。このようにして得られるヒトベイシジン
Ｉ遺伝子、ベイシジンＩ及び抗ベイシジンＩ抗体は癌、
免疫異常、各種炎症性疾患などの診断、治療法に応用で
きる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが本発明はこの実施例に何ら限定されるものではな
い。

【００３３】実施例１ （１）マウスベイシジンプローブの調製 一般にヒトとマウスの遺伝子は相同性が高いと期待され
ることからヒトベイシジンＩ遺伝子の検索にはマウスベ
イシジンのｃＤＮＡをプローブとして用いた。即ち、本
発明者らが先に出願したマウスのベイシジン遺伝子（特
開平３−４１０９９号公報）をプローブとして使用し
た。マウスベイシジン遺伝子は溶原菌ＢＮＮ１０３（λ
FR１）の名称で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されているもの（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３０）
を用いマウスベイシジンｃＤＮＡクローンｐＦＲ１を得
〔Ｍｉｙａｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１０７，３１６−３２３（１９９０）〕、
これを制限酵素ＰｓｔＩ及びＡｃｃＩ（日本ジーン社
製）で消化し、６９１塩基対のＤＮＡ断片を得た。得ら
れたＰｓｔＩ−ＡｃｃＩ断片にはマウスベイシジンｃＤ
ＮＡの翻訳領域の大部分が含まれている。これをマルチ
プライムＤＮＡラベル化法〔Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３
７，２６６−２６７（１９８４）〕を用いたマルチプラ
イムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社製）によ
り、α−［³²Ｐ］−ｄＣＴＰを使って標識化しプローブ
とした。該プローブの制限酵素地図を図１に示す。

【００３４】（２）胃癌細胞株ＫＡＴＯ−III のｃＤＮ
Ａライブラリー作製 胃癌細胞株ＫＡＴＯ−III （ヒト印環胃癌細胞）はミヤ
ウチ（Ｍｉｙａｕｃｈｉ）らの方法〔Ｍｉｙａｕｃｈ
ｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｎｎ，７３，５８１−５
８７（１９８２）〕に従って培養した。上記胃癌細胞株
ＫＡＴＯ−III は、国立衛生試験所細胞バンク（ＪＣＲ
Ｂ）に寄託番号ＪＣＲＢ０６１１の番号で保存されてい
る。胃癌細胞株ＫＡＴＯ−III を、ＲＰＭＩ−１６４０
培地に１０％の割合で牛胎仔血清を加えた培地で５％の
ＣＯ₂ ガス通気下３７℃にて継代培養した。得られた胃
癌細胞株ＫＡＴＯ−III １ｇからグアニジウムイソチオ
シアネート法〔“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）ｐ．１
９６〕に従って全ＲＮＡ３mgを抽出し、これをオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラム（Ｃｏｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，カラム容量１ml）を用
いてポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ２００μg を得た。以下アマシ
ャム社のｃＤＮＡ合成システムのプロトコールに従い、
２本鎖のｃＤＮＡを合成した。即ち、該当ポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡ５μg に逆転写酵素（アマシャム社製）を作用さ
せて第一ＤＮＡ鎖を合成した。次に大腸菌リポヌクレア
ーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（共にアマシャム社製）を作用させ、ＲＮＡを消化し
ながら第一ＤＮＡ鎖を鋳型として第二ＤＮＡ鎖を合成
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性
を利用して平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ）を合成した。

【００３５】上記により得られたｄｓ−ｃＤＮＡを更に
アマシャム社のｃＤＮＡ・クローニングシステムλgt１
１を使って発現ベクターλgt１１にクローニングした。
即ちｄｓ−ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩメチラーゼ（アマシャ
ム社製）を作用させ、ｄｓ−ｃＤＮＡの内部にある制限
酵素ＥｃｏＲＩの認識部位をメチル基により保護し、次
にＴ４ＤＮＡリガーゼ（アマシャム社製）により合成Ｅ
ｃｏＲＩリンカー（アマシャム社製）を両末端に接続
し、最後にこれに制限酵素ＥｃｏＲＩ（アマシャム社
製）を作用させて両端を付着末端とした。

【００３６】このｄｓ−ｃＤＮＡとλgt１１アーム（ア
マシャム社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（アマシャム社
製）により結合させ、組換えＤＮＡを作製した。これに
インビトロパッケージング液（アマシャム社製）を作用
させてｃＤＮＡライブラリーを作成した。

【００３７】（３）ヒトベイシジンをコードする組換え
体ファージクローンの分離 （１）で調製したプローブと（２）で作製したｃＤＮＡ
ライブラリーを用いて、ベントンとデービス〔Ｂｅｎｔ
ｏｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９６，３８３−３９４（１９７７）〕によって開
発されたプラーク・ハイブリダイゼーション法によりス
クリーニングを行った。（２）で作成したλgt１１ｃＤ
ＮＡライブラリーとＬＢ培地で一夜培養したＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｙ１０９０を３７℃にて２０分間インキュベート
し、組換え体ファージを宿主菌であるＹ１０９０に吸着
させた後、溶解したＬＢ上層軟寒天と混合してＬＢ寒天
平板上にまきひろげた〔“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（ｅｄｓ．），Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）〕。上層寒天固化後寒天
平板を４２℃で４〜８時間培養し、プラークを形成させ
た後、４℃にて１時間以上冷却した。

【００３８】次にニトロセルロースフィルターを寒天平
板表面に置き、４℃で１５分間放置後、フィルターをは
がし、０．５Ｍ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液をしみ込ませた濾紙（ワットマン社製３ＭＭ）
上にプラークとの接触面を上にして置き１０分間放置し
てファージＤＮＡを変性させた。その後、フィルターを
１Ｍ−トリス塩酸（pH８．０）−１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液をしみ込ませた濾紙に１０分間置いて中和し、更
に２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋
０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）溶液をしみ込ませた濾紙上
に５分間置いた。フィルターを室温にて乾燥させた後、
減圧下８０℃にて２時間処理（ベーキング）してファー
ジＤＮＡをフィルター上に固定した。

【００３９】ベーキング終了後、フィルターを２×ＳＳ
Ｃに浸したのち、プレウオッシング溶液（前記Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐ．３２６）に移して４
２℃で１時間振盪して洗浄した。洗浄後フィルターをプ
レハイブリダイゼーション溶液〔５０％ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、５０mMリン酸ナトリウム（pH６．５）、２
００μg ／mlサケＤＮＡ、１０×デーンハート氏液（１
×デーンハート氏液：０．０２％ウシ血清アルブミン＋
０．０２％フィコール４００＋０．０２％ポリビニルピ
ロリドン）、０．１％ＳＤＳ（前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）〕中で４２℃にて一夜間振盪した。

【００４０】次にフィルターをα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識
プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（組成はプ
ローブ以外プレハイブリダイゼーション溶液と同じ）中
に移して４２℃にて２０時間振盪した。プローブはｐＦ
Ｒ１クローン中のｃＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＡｃ
ｃＩで切断した断片をマルチプライムＤＮＡラベングシ
ステム（アマシャム社製）を用いてα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ
にて標識したものを３×１０⁶ 〜１×１０⁷ ｃｐｍ／ml
の濃度で使用した。

【００４１】ハイブリダイゼーション終了後、フィルタ
ーを２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液に移して室温で１
０分間ずつ３回洗浄し、更に１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤ
Ｓ溶液中で５０℃にて３０分間ずつ３回洗浄した後室温
で乾燥した。フィルターを濾紙にはりつけてＸ線フィル
ムカセットに入れ、Ｘ線フィルム（コニカ社製ＸＡＲ−
５）を重ねて−７０℃で一夜感光させた。

【００４２】フィルム上に出現したシグナルに対応する
プラーク中の組換え体ファージをＳＭ緩衝液に懸濁し、
再度寒天平板上に単一プラークを形成させ、上記同一操
作を行って陽性クローンを分離し、更にＥ．ｃｏｌｉ
Ｙ１０９０に感染させて増殖させた。

【００４３】（４）ヒトベイシジンＩをコードする組換
え体ファージＤＮＡの分離 （３）で得られたベイシジンをコードする組換え体ファ
ージクローンλKB３をＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０を宿主
として増殖させたのち、〔“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）ｐ．
３７１−３７２〕記載の方法に従って、本発明組換え体
ファージＤＮＡ（λKB３ＤＮＡ）を調製した。

【００４４】 （５）プラスミドｐＫＢ３形質転換株の作成 λKB３ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（日本ジーン社製）
で消化し、約１６００塩基対のＤＮＡ断片を得た。

【００４５】一方、プラスミドベクターｐＵＣ１８を同
じくＥｃｏＲＩで消化したのち、両断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製）で結合させ、ベイシジンＩのポリ
ペプチド鎖をコードする組換え体プラスミドｐＫＢ３を
得た。

【００４６】得られた組換え体プラスミドｐＫＢ３を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３のコンピテント細胞に形質導入
した。

【００４７】（６）制限酵素地図の作製 （５）で得られたｐＫＢ３を〔“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）ｐ．１
０４−１０６〕に記載の方法に従って処理し、更に上記
文献ｐ．３７４−３８１の方法に従って、ベイシジンＩ
をコードするｐＫＢ３クローンの制限酵素地図を作製し
た（図２）。

【００４８】（７）一方向性欠失クローンの作製 図２に示すようにｐＫＢ３クローン上にはＭ１３又はｐ
ＵＣ系プラスミドベクターのマルチクローニング部位に
対応する制限酵素切断部位がＳｍａＩ以外存在しない。
従って、塩基配列決定に通常用いられる方法、即ち、ｃ
ＤＮＡクローンを断片化した後、Ｍ１３又はｐＵＣ系ベ
クターに組込んだサブクローンを作製し、これを鋳型と
して塩基配列を決定する方法では限定された領域の配列
しか決定できないことが判明した。

【００４９】そこで、ヘニコフの方法〔Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆ Ｓ．，（１９８４）Ｇｅｎｅ，２８，３５１−３５
９〕を改良した中山らのＳＵＤ法（Ｓｉｚｅ−ｆｒａｃ
ｔｉｏｎａｔｅｄ Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｄ
ｅｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）〔中山敬一、中内啓
光，（１９８８）実験医学，６，８１−８９〕により欠
失長の異なる多数の一方向性欠失クローンを作製し、こ
れを塩基配列決定の鋳型として用いた。以下、その方法
を具体的に述べる。

【００５０】ｐＫＢ３を３′−突出末端形成酵素のＰｓ
ｔＩで切断し、次に、５′−突出末端形成酵素のＢａｍ
ＨＩで切断した後、エキソヌクレーアゼIII （ＥｘｏII
I ）で５′−突出末端より３′→５′方向に消化した。
次に、ＥｘｏIII 処理で生成した一本鎖部分をマングビ
ーン（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで消化して平
滑末端とした。ＥｘｏIII の反応時間を変えることによ
り長さの異なる欠失プラスミドが生成するので、これを
低融点アガロースゲル電気泳動で分離したのち、求める
長さのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出した。これを溶解
した後、ＤＮＡポリメラーゼクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）
断片を作用させて末端を修復し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
閉環して、それぞれ異なる長さの欠失部分をもつプラス
ミドクローンを作製した（ここで用いた酵素類は宝酒造
社製）。

【００５１】（８）ヒトベイシジンＩｃＤＮＡクローン
の塩基配列決定 塩基配列の決定はサンガーらのジデオキシ法〔Ｓａｎｇ
ｅｒ Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｕｌｓ
ｏｎ Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕
に従って行った。

【００５２】決定した塩基配列及び推定されるアミノ酸
配列は、配列表に示す通りである。塩基配列の番号は
５′末端を１とし、５′末端から３′末端方向につけら
れている。アミノ酸配列の番号はＮ末端からＣ末端方向
へつけられており、最初にコードされるアミノ酸を１と
している。

【００５３】以上の結果より得られたヒトベイシジンＩ
遺伝子の配列は、５′側の非翻訳領域、翻訳領域及び
３′側の非翻訳領域を含めて全体で１６３２個の塩基か
らなる。翻訳領域は８０７塩基の長さで、２６９個のア
ミノ酸のタンパク質部分をコードすることが判明した。
このアミノ酸残基数はマウスベイシジンの残基数（２７
３残基）に類似している。２６９個のアミノ酸残基より
なるポリペプチドは分子量約30,000に相当するが、後述
のシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸残基数は２４
７個であり分子量約27,000に相当する。

【００５４】推定アミノ酸配列において２０６番目のロ
イシン（Ｌｅｕ）より２２９番目のチロシン（Ｔｙｒ）
までは疎水性アミノ酸残基が多く、ベイシジンＩが細胞
膜由来の糖タンパク質と考えられることより、この領域
はベイシジンＩの細胞膜貫通ドメインであると推定され
る。又１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）より２２番目のア
ラニン（Ａｌａ）の領域も疎水性アミノ酸残基が多く本
領域は合成された本ペプチドが細胞膜に移行するときに
必要なシグナルペプチドであることが推定される。

【００５５】 （９）既知遺伝子及び既知タンパク質との相同性の比較 既知遺伝子の核酸配列との比較は、ＥＭＢＬ−ＧＤＢ及
びＬＡＳＬ−ＧＤＢ（ＧｅｎＢａｎｋ）のデータベース
を用いて、また既知タンパク質のアミノ酸配列との比較
は、ＮＢＰＦ−ＰＤＢ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのデー
タベースを用いて行った。これらのデータベースの利用
はソフトウエア開発株式会社のＧＥＮＥＴＹＸプログラ
ムを用いて行った。

【００５６】まず、マウスベイシジン遺伝子との相同性
を比較した結果、核酸配列は６１％、アミノ酸配列は５
８％の相同性が認められた（図３及び図４）。マウスベ
イシジンの配列と異なるアミノ酸のうち８０％は近縁の
アミノ酸への置換であった。膜貫通ドメインは最初の１
残基を除き、全残基がマウスベイシジンと同一であり、
更に細胞質ドメインの一部に至る合計２９残基の長さに
わたって完全に一致していた。マウスベイシジンとの比
較において、細胞質ドメインでは７０％、細胞外ドメイ
ンでは５１％の相同性が認められた。細胞外ドメインに
はマウスベイシジンと同じくアスパラギン結合型糖鎖の
結合しうる部位が３個所存在する。

【００５７】タンパク質データベースを検索した結果、
マウスベイシジン及びヒトベイシジンＩは鶏の血液−脳
関門を構成する内皮細胞に発現している糖タンパク質Ｈ
Ｔ７抗原〔Ｓｅｕｌｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｔｔｓｐ
ｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｒｉｓａｕ，Ｗ．，（１９９０）ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，９，２１５１−２１５８〕のコアタンパク
質と約４５％の相同性が認められた（図３及び図４）。
マウスベイシジンとヒトベイシジンＩの膜貫通ドメイン
より細胞質ドメインに至る２９残基のアミノ酸配列は、
ＨＴ７抗原においても完全に同一であった。ＨＴ７抗原
の細胞質ドメインはヒトベイシジンＩの細胞質ドメイン
と６８％の相同性があるが、細胞外ドメイン間の相同性
は３４％であった。

【００５８】また、マウスベイシジン及びヒトベイシジ
ンはマウス初期胚やテラトカルシノーマなどに特異的に
発現し、細胞接着に関与する糖タンパク質と考えられて
いるエンビジン（ｅｍｂｉｇｉｎ）（ＧＰ−７０）〔Ｏ
ｚａｗａ，Ｍ．，Ｈｕａｎｇ，Ｒ．−Ｐ．，Ｆｕｒｕｋ
ａｗａ，Ｔ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，（１９８
８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，３０５９−３
０６２；Ｈｕａｕｇ，Ｒ．−Ｐ．，Ｏｚａｗａ，Ｍ．，
Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，
Ｔ．，（１９９０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，
４５，７６−８３〕とも約２８％の相同性が認められた
（図３）。ｅｍｂｉｇｉｎの膜貫通ドメインとヒトベイ
シジンＩの同ドメインは約５２％の相同性が、また、細
胞外ドメイン間では約２７％の相同性が認められたが、
細胞質ドメイン間の相同性は認められなかった（図３及
び図４）。

【００５９】一方、ヒトベイシジンＩもマウスベイシジ
ンと同様、ＭＨＣクラスII抗原β鎖と約２１％の相同性
が、また、免疫グロブリンκ鎖Ｖドメインとも約２５％
の相同性が認められた（図５）。

【００６０】従って、ヒトベイシジンＩも免疫グロブリ
ンスーパーファミリーに属し、ＨＴ７抗原やエンビジン
とサブグループを形成すると考えられる。

【００６１】実施例２ （１）全ＲＮＡ及びポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製 実施例１−（１）に示したグアニジウムイソチオシアネ
ート法に従って胃癌細胞株ＫＡＴＯ−III より全ＲＮＡ
を抽出し、また市販のオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
（Ｃｏｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ
ｃ．）を用いてポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製した（前記Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐ．１９６−１９
８参照）。

【００６２】（２）ノーザンブロッティング （１）で調製した全ＲＮＡ２０μg 又はポリ（Ａ）⁺ Ｒ
ＮＡ１０μg を前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｐ．２００−２０１）の方法に従って、グリオキサ
ール存在下、５０℃にて１時間加温して変性させた後、
１０mMリン酸ナトリウム溶液を含む１％アガロースゲル
にて９０Ｖで３〜４時間電気泳動を行った。次に分離し
たＲＮＡを２０×ＳＳＣ中でニトロセルロースフィルタ
ー（シュライアーアンドシェル社製）へ１５時間かけて
転写させた。ＲＮＡ転写後のニトロセルロースフィルタ
ーを室温で乾燥後８０℃で２時間ベーキングして固定
し、その後２０mMトリス塩酸バッファー（pH８．０）
中、１００℃にて５分間加熱してグリオキサールを除去
した。このフィルターを実施例１−（３）に記したプレ
ハイブリダイゼーション溶液中で４２℃にて３時間振盪
した後、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを含むハイブ
リダイゼーション溶液（組成はプローブ以外プレハイブ
リダイゼーション溶液と同じ）中に移して４２℃にて２
０時間振盪した。プローブはｐＫＢ３ｃＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断した断片をマルチプライムＤＮＡラ
ベリングシステム（アマシャム社製）を用いてα−³²Ｐ
−ｄＣＴＰにて標識したものを０．５〜１×１０⁷ cpm
／mlの濃度で使用した。ハイブリダイゼーション終了
後、フィルターを２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液に移
して室温で１０分間ずつ３回洗浄し、更に０．１×ＳＳ
Ｃ−０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃にて３０分間ずつ３
回洗浄した後室温で乾燥した。フィルターを濾紙にはり
つけてＸ線フィルムカセットに入れ、Ｘ線フィルム（コ
ニカ社製）を重ねて−７０℃で２日間感光させた。

【００６３】得られたノーザンブロッティングの結果を
図６に示す。

【００６４】なお、ＲＮＡの分子量マーカーとして２８
Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡを用いた。その結果、約
２０００塩基長の単一のｍＲＮＡが検出された。

【００６５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1632 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 細胞の種類：胃印環細胞癌 セルライン：KATO-III 直接の起源 ライブラリー名：λgt11 KATO-III cDNA library クローン名：λKB3 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：30..95 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：96..836 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：poly A signal 存在位置：1559..1564 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：poly A site 存在位置：1587..1632 特徴を決定した方法：S 配列 GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATC ATG GCG GCT GCG CTG TTC GTG CTG 53 Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu 1 5 CTG GGA TTC GCG CTG CTG GGC ACC CAC GGA GCC TCC GGG GCT GCC GGC 101 Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly 10 15 20 ACA GTC TTC ACT ACC GTA GAA GAC CTT GGC TCC AAG ATA CTC CTC ACC 149 Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr 25 30 35 40 TGC TCC TTG AAT GAC AGC GCC ACA GAG GTC ACA GGG CAC CGC TGG CTG 197 Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu 45 50 55 AAG GGG GGC GTG GTG CTG AAG GAG GAC GCG CTG CCC GGC CAG AAA ACG 245 Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr 60 65 70 GAG TTC AAG GTG GAC TCC GAC GAC CAG TGG GGA GAG TAC TCC TGC GTC 293 Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val 75 80 85 TTC CTC CCC GAG CCC ATG GGC ACG GCC AAC ATC CAG CTC CAC GGG CCT 341 Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro 90 95 100 CCC AGA GTG AAG GCC GTG AAG TCG TCA GAA CAC ATC AAC GAG GGG GAG 389 Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu 105 110 115 120 ACG GCC ATG CTG GTC TGC AAG TCA GAG TCC GTG CCA CCT GTC ACT GAC 437 Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp 125 130 135 TGG GCC TGG TAC AAG ATC ACT GAC TCT GAG GAC AAG GCC CTC ATG AAC 485 Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn 140 145 150 GGC TCC GAG AGC AGG TTC TTC GTG AGT TCC TCG CAG GGC CGG TCA GAG 533 Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu 155 160 165 CTA CAC ATT GAG AAC CTG AAC ATG GAG GCC GAC CCC GGC CAG TAC CGG 581 Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg 170 175 180 TGC AAC GGC ACC AGC TCC AAG GGC TCC GAC CAG GCC ATC ATC ACG CTC 629 Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu 185 190 195 200 CGC GTG CGC AGC CAC CTG GCC GCC CTC TGG CCC TTC CTG GGC ATC GTG 677 Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val 205 210 215 GCT GAG GTG CTG GTG CTG GTC ACC ATC ATC TTC ATC TAC GAG AAG CGC 725 Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg 220 225 230 CGG AAG CCC GAG GAC GTC CTG GAT GAT GAC GAC GCC GGC TCT GCA CCC 773 Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro 235 240 245 CTG AAG AGC AGC GGG CAG CAC CAG AAT GAC AAA GGC AAG AAC GTC CGC 821 Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg 250 255 260 CAG AGG AAC TCT TCC TGAGGCAGGT GGCCCGAGGA CGCTCCCTGC TCCGCGTCTG 876 Gln Arg Asn Ser Ser 265 269 CGCCGCCGCC GGAGTCCACT CCCAGTGCTT GCAAGATTCC AAGTTCTCAC CTCTTAAAGA 936 AAACCCACCC CGTAGATTCC CATCATACAC TTCCTTCTTT TTTAAAAAAG TTGGGTTTTC 996 TCCATTCAGG ATTCTGTTCC TTAGGATTTT TTCTTCTGAA GTGTTTCACG AGAGCCCGGG 1056 AGCTGCTGCC CTGCGGCCCC GTCTGTGGCT TTCAGCCTCT GGGTCTGAGT CATGGCCGGG 1116 TGGGCGGCAC AGCCTTCTCC ACTGGCCGGA GTCAGTGCCA GGTCCTTGCC CTTTGTGGAA 1176 AGTCACAGGT CACACGAGGG GCCCCGTGTC CTGCCTGTCT GAAGCCAATG CTGTCTGGTT 1236 GCGCCATTTT TGTGCTTTTA TGTTTAATTT TATGAGGGCC ACGGGTCTGT GTTCGACTCA 1296 GCCTCAGGGA CGACTCTGAC CTCTTGGCCA CAGAGGACTC ACTTGCCCAC ACCGAGGGCG 1356 ACCCCGTCAC AGCCTCAAGT CACTCCCAAG CCCCCTCCTT GTCTGTGCAT CCGGGGGCAG 1416 CTCTGGAGGG GGTTTGCTGG GGAACTGGCG CCATCGCCGG GACTCCAGAA CCGCAGAAGC 1476 CTCCCCAGCT CACCCCTGGA GGACGGCCGG CTCTCTATAG CACCAGGGCT CACGTGGGAA 1536 CCCCCCTCCC ACCCACCGCC ACAATAAAGA TCGCCCCCAC CTCCAGGGTC AAAAAAAAAA 1596 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1632

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒトベイシジンＩ遺伝子のスクリーニ
ングに使用したマウスベイシジンｃＤＮＡプローブを示
す。図１中、最上段に示したスケールはマウスベイシジ
ンｃＤＮＡの１番目の塩基を基準にしたヌクレオチドの
長さ（キロベース）である。その下段に、マウスベイシ
ジンｃＤＮＡを示している。該線上左側の斜線部はコー
ディング領域を示す。該線の下部にマウスベイシジンｃ
ＤＮＡクローンｐＦＲ１を示し、そのなかで太い黒線部
分で示したＰｓｔＩ−ＡｃｃＩ断片をプローブとして用
いた。

【図２】ヒトベイシジンＩのコアタンパク質をコードす
るｃＤＮＡの制限酵素地図及び塩基配列決定方法を示
す。図２中、最上段に示したスケールは、ヒトベイシジ
ンＩｃＤＮＡの１番目の塩基を基準にしたヌクレオチド
の長さ（キロベース）である。その下段はヒトベイシジ
ンＩをコードするｃＤＮＡクローンｐＫＢ３を示してい
る。該線上左側の斜線部はコーディング領域を示す。矢
印は各ＤＮＡ断片について決定した塩基配列の方向と長
さを示す。

【図３】ヒトベイシジンＩ（Ｈ Ｂａｓｉｇｉｎ）とマ
ウスベイシジン（Ｍ Ｂａｓｉｇｉｎ）、ＨＴ７抗原及
びエンビジン（ｅｍｂｉｇｉｎ）のアミノ酸配列上の相
同性を示す。線で囲んだアミノ酸残基がヒトベイシジン
Ｉと同一である。

【図４】ヒトベイシジンＩ（Ｈ Ｂａｓｉｇｉｎ）とマ
ウスベイシジン（Ｍ Ｂａｓｉｇｉｎ）、ＨＴ７抗原及
びエンビジン（ｅｍｂｉｇｉｎ）のアミノ酸配列上の相
同性を示す（図３のつづき）。

【図５】ヒトベイシジン（Ｈ Ｂａｓｉｇｉｎ）と主要
組織適合性（ＭＨＣ）クラスII抗原β鎖（ＣｌａｓｓII
β）及び免疫グロブリンκ鎖（Ｉｇκ）Ｖドメインとの
間のアミノ酸配列上の相同性を示す。 ＊：免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの
タンパク質に保存されているアミノ酸残基 ◎：多くのＭＨＣクラスＩ、クラスIIα鎖及びクラスII
β鎖に保存されているアミノ酸残基 ○：多くのＭＨＣクラスＩ及びクラスIIβ鎖に保存され
ているアミノ酸残基 ●：多くのクラスIIβ鎖に保存されているアミノ酸残基 ▽：多くのＶ領域様ドメインに保存されているアミノ酸
残基 △：ヒトベイシジンＩ、マウスベイシジン、ＨＴ７抗原
及びエンビジンに共通に保存されているアミノ酸残基 □：ヒトベイシジンＩ、マウスベイシジン及びＨＴ７抗
原に保存されているアミノ酸残基 ◇：ヒトベイシジンＩ及びマウスベイシジンに保存され
ているアミノ酸残基 ◆：ヒトベイシジンＩ、マウスベイシジン、ＨＴ７抗原
及びエンビジンの間で近縁のアミノ酸への置換がみられ
るアミノ酸残基

【図６】実施例２におけるヒトベイシジンＩのコアタン
パク質をコードするｍＲＮＡのノーザンブロッティング
の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 33/574 33/574 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ Ｔ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 村松 喬 鹿児島県鹿児島市桜ケ丘３丁目26−９ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/53 G01N 33/574 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのア
   ミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を
   有するヒトベイシジンＩ遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、１番目
   から２６９番目までの配列からなるタンパク質、 （ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、２番目
   から２６９番目までの配列からなるタンパク質、 （ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列中、２３番
   目から２６９番目までの配列からなるタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかのポ
   リヌクレオチド配列を有する請求項１記載のヒトベイシ
   ジンＩ遺伝子： （ａ）配列番号：１で示される塩基配列中、３０番目か
   ら８３６番目までの配列からなるポリヌクレオチド、 （ｂ）配列番号：１で示される塩基配列中、３３番目か
   ら８３６番目までの配列からなるポリヌクレオチド、 （ｃ）配列番号：１で示される塩基配列中、９６番目か
   ら８３６番目までの配列からなるポリヌクレオチド、 （ｄ）配列番号：１で示される塩基配列中、１番目から
   １６３２番目までの配列からなるポリヌクレオチド、 （ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれかの相補鎖。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のヒトベイシジンＩ
   遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつ腫瘍、免疫異常又は炎症性疾患のマーカーとし
   ての機能を有するヒトベイシジンＩをコードするヒトベ
   イシジンＩ遺伝子。
4. 【請求項４】 ヒト遺伝子である請求項１〜３のいずれ
   か１項記載のヒトベイシジンＩ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項記載のヒト
   ベイシジンＩ遺伝子を発現する発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターで形質転換
   された宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項記載のヒト
   ベイシジンＩ遺伝子によってコードされる組換えタンパ
   ク質。
8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項記載のヒト
   ベイシジンＩ遺伝子を微生物のベクターに組み込み、形
   質転換された微生物から産生させることを特徴とする請
   求項７記載の組換えタンパク質の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項７記載の組換えタンパク質に対す
   るモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれか１項記載のヒ
    トベイシジンＩ遺伝子又はこれと結合する塩基配列から
    なるヒトベイシジンＩ遺伝子検出用プローブ。