CN103025354A

CN103025354A - 自身免疫疾病和变应性疾病的治疗药

Info

Publication number: CN103025354A
Application number: CN201180037505XA
Authority: CN
Inventors: 木野孝一; 甲斐敏裕; 松本光广; 梶川益纪; 杉浦雅仁; 清水绘美
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2013-04-03
Also published as: US20150037886A1; US20130121914A1; JPWO2011152503A1; EP2578232A1; CA2801509A1; AU2011259924A1; US8858944B2; WO2011152503A1; EP2578232A4

Abstract

本发明提供了自身免疫疾病或变应性疾病的预防剂或治疗剂，其含有抗-Embigin抗体，特别是表现出细胞毒性或细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体，还提供了涉及Th17细胞的疾病的预防剂或治疗剂以及针对Th17细胞的细胞毒性剂。另外，提供了含有抗-Embigin抗体的用于检测Th17细胞的试剂、使用所述试剂的方便的检测Th17细胞的方法、使用抗-Embigin抗体以Th17细胞选择性的方式有效地递送药物等的方法、以及针对Th17细胞的药物递送系统。

Description

自身免疫疾病和变应性疾病的治疗药

技术领域

本发明涉及自身免疫疾病和变应性疾病的治疗剂。更具体地，其涉及与Th17细胞有关的上述疾病的治疗剂、表现出对Th17细胞和类似细胞的细胞毒性的药物。

背景技术

基于它们生产的细胞因子的差异等，已经将在获得性免疫中起重要作用的辅助性T细胞(在下文中称作“Th细胞”)分类为：参与细胞免疫的Th1细胞，和参与体液免疫的Th2细胞。

但是，近年来，作为不同于Th1细胞和Th2细胞的新的Th细胞亚型，已经将Th17细胞鉴别为特异性地生产IL-17的Th细胞(非专利文件1)。已经发现，Th17细胞参与宽范围的自身免疫疾病（诸如多发性硬化、银屑病、风湿病、炎性肠病）和变应性疾病（诸如接触性超敏反应、特应性皮炎等）以及例如多发性硬化，已经使用动物模型发现，Th17细胞是比常规地认为重要的Th1细胞更强的致病细胞(非专利文件1、非专利文件2、非专利文件3、非专利文件4)。

因而，尽管Th17细胞正在作为自身免疫疾病、变应性疾病等的新靶标而引起注意，但尚未开发出选择性地作用于Th17细胞的药物。

例如，已经尝试如下治疗自身免疫疾病：使用FTY-720 (芬戈莫德)等，非特异性地抑制淋巴细胞向病灶中的浸润。但是，已经报道，停药会造成立即的征状恶化(非专利文件5)，问题仍然存在。

不同于该方案，已经报道了如下实现的在不同自身免疫病模型中的治疗效力：使用具有ADCC活性的抗体(抗-淋巴毒素α抗体)，从体内消除Th17细胞和Th1细胞(专利文件1)。但是，由于Th1细胞和Th17细胞均参与生物学防御(非专利文件2、非专利文件3)，Th1细胞和Th17细胞的非特异性作用(FTY-720)或功能抑制会过度地降低生物学防御功能。因此，已经需要特异性地作用于Th17细胞的药物产品，所述Th17细胞显示出作为自身免疫疾病的致病细胞的强作用。

为了开发这样的药物产品，例如，在Th17细胞中特异性地表达的分子可以用作靶标。作为在Th17细胞中特异性地表达的分子，已经鉴别出RORγt（它是一种细胞核受体）等(非专利文件6)，但是尚未发现Th17细胞特异性的细胞表面分子(非专利文件7)。

已知Embigin是一种单次跨膜蛋白，其与CD147 (Basigin)和神经丝束蛋白（neuroplastin）形成一个家族。

已经报道，Embigin在胚胎癌细胞(非专利文件8)、小鼠胎儿期(早期内胚层) (非专利文件9)、大鼠前列腺、乳腺、心、肝、肺、脑(非专利文件10)、大鼠肌肉(非专利文件11)、小鼠造血细胞(非专利文件12)中表达。另外，已经报道，Embigin在大鼠肝纤维化模型中表现出增加的表达(专利文件2)。

此外，已经报道Embigin是随着抗-CD3抗体/抗-CD28抗体对CD4⁺细胞的刺激而变化的数千个基因之一(专利文件3)。但是，该报道是基于被诱导分化成Th1细胞或Th2细胞的细胞与Th0细胞的对比，没有提供关于Embigin如何在哪一细胞中变化的描述，也根本没有描述Th17细胞。

[现有技术文件]

[专利文件]

专利文件1: WO2008/063776

专利文件2: EP-A-1811041

专利文件3: WO2005/016962

[非专利文件]

非专利文件1: J. Exp. Med. (2005); 201:233-240

非专利文件2: Immunological Reviews (2008); 223:87-113

非专利文件3: J. Allergy Clin. Immunol. (2009); 123:1004-1011

非专利文件4: Clinical and Experimental Immunology (2009); 159:109-119

非专利文件5: Journal of Neuroimmunology 153 (2004); 108-121

非专利文件6: Cell (2006); 126:1121-1133

非专利文件7: Annual Review of Immunology (2008); 27:485-517

非专利文件8: Differentiation. (1990); 45:76-83

非专利文件9: Develop. Growth Differ. (1998); 40:277-286

非专利文件10: Developmental Genetics (1997); 21:268-278

非专利文件11: J. Biol. Chem. (2009); 284:8930-8939

非专利文件12: J. Immunology (2008); 180:1719-1728。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的课题是，提供自身免疫疾病和变应性疾病的治疗剂，诸如多发性硬化等的治疗剂和针对Th17细胞的细胞毒性剂，所述治疗剂靶向Th17细胞。另外，本发明的课题是，发现在Th17细胞中更选择性地表达的细胞表面分子，并提供用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统(DDS)、Th17细胞标志物和方便的检测Th17细胞的方法。

解决问题的方式

发明人已经进行了深入研究，并发现，Embigin在Th17细胞表面上高度表达，但是以极低的水平在其它血细胞（包括血液衍生的培养的细胞诸如Th1细胞、Th2细胞、Th0细胞、B细胞、白细胞等）中表达。此外，他们已经发现，由于与表现出细胞毒性的药物缀合的抗-Embigin抗体会选择性地减少或消除Th17细胞，且具有诱导细胞毒性的结构的抗-Embigin抗体会选择性地减少或消除Th17细胞并表现出对自身免疫病模型动物的预防或治疗效果，因而与表现出细胞毒性的药物缀合的抗-Embigin抗体和具有诱导细胞毒性的结构的抗-Embigin抗体可用于自身免疫疾病和变应性疾病、特别是多发性硬化，这导致本发明的完成。

另外，他们新近已经发现，由于与抗-Embigin抗体缀合的药物会有效地到达Th17细胞，因而所述抗-Embigin抗体可用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统中。

此外，发明人已经进行了Th17细胞的深入研究，并发现，由于与在其它血细胞中相比，Embigin在Th17细胞中高度地表达，因而通过检查血细胞中Embigin的表达，可以方便地测定Th17细胞。

因此，本发明涉及下述内容。

[1]一种用于预防和/或治疗自身免疫病或变应性疾病的药剂，所述药剂包含抗-Embigin抗体。

[2]根据[1]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

[3]根据[1]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

[4]根据[3]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体具有诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的结构。

[5]根据[3]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

[6]根据[1]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

[7]根据[6]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

[8]根据[1] - [7]中任一项所述的药剂，其中所述疾病与Th17细胞有关。

[9]根据[1] - [7]中任一项所述的药剂，其中所述疾病是：多发性硬化、银屑病、风湿病、炎性肠病、接触性超敏反应、类固醇抵抗型哮喘、慢性非传染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、肾小球肾炎或特应性皮炎。

[10]根据[1] - [7]中任一项所述的药剂，其中所述疾病是多发性硬化。

[11]一种针对Th17细胞的细胞毒性剂，所述细胞毒性剂包含抗-Embigin抗体。

[12]根据[11]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

[13]根据[11]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

[14]根据[13]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体具有诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的结构。

[15]根据[13]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

[16]根据[11]所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

[17]根据[16]所述的药剂，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

[18]一种用于药物递送系统(DDS)中的抗-Embigin抗体，所述药物递送系统用于将药物递送给Th17细胞。

[19]根据[18]所述的抗体，所述抗体与前述药物缀合。

[20]根据[18]或[19]所述的抗体，其中所述药物是细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素。

[21]一种用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统，所述药物递送系统使用抗-Embigin抗体。

[22]根据[21]所述的药物递送系统，其中所述抗-Embigin抗体与前述药物缀合。

[23]根据[21]或[22]所述的药物递送系统，其中所述药物是细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素。

[24]一种用于检测Th17细胞的试剂，所述试剂包含抗-Embigin抗体。

[25]根据[24]所述的试剂，其中所述抗-Embigin抗体被荧光物质或放射性同位素所标记。

[26]一种用于检测Th17细胞的试剂，所述试剂包含能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸。

[27]一种用于检测Th17细胞的试剂盒，所述试剂盒包含根据[24] - [26]中任一项所述的试剂。

[28]一种用于检测Th17细胞的方法，所述方法包括：测量Embigin的表达。

[29]根据[28]所述的方法，所述方法包括：测量Embigin在得自试验动物的细胞中的表达。

[30]根据[28]或[29]所述的方法，所述方法包括：使用根据[24] - [26]中任一项所述的试剂，测量Embigin的表达。

[31] Embigin或Embigin基因转录产物作为标志物分子在Th17细胞的检测中的用途。

[32]一种用于预防和/或治疗受试者的自身免疫病或变应性疾病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的抗-Embigin抗体。

[33]根据[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

[34]根据[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

[35]根据[34]所述的方法，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体具有诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的结构。

[36]根据[34]所述的方法，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

[37]根据[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

[38]根据[37]所述的方法，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

[39]根据[32] - [38]中任一项所述的方法，其中所述疾病与Th17细胞有关。

[40]根据[32] - [38]中任一项所述的方法，其中所述疾病是：多发性硬化、银屑病、风湿病、炎性肠病、接触性超敏反应、类固醇抵抗型哮喘、慢性非传染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、肾小球肾炎或特应性皮炎。

[41]根据[32] - [38]中任一项所述的方法，其中所述疾病是多发性硬化。

[42]一种用于在Th17细胞中诱导细胞损伤的方法，所述方法包括：使抗-Embigin抗体与所述Th17细胞接触。

[43]根据[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

[44]根据[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

[45]根据[44]所述的方法，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体具有诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的结构。

[46]根据[44]所述的方法，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

[47]根据[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

[48]根据[47]所述的方法，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

[49]根据[42] - [48]中任一项所述的方法，所述方法包括：通过给受试者施用有效量的抗-Embigin抗体，使抗-Embigin抗体与所述受试者中的Th17细胞接触。

发明效果

根据本发明，可以提供用于预防或治疗自身免疫疾病或变应性疾病的药剂以及针对Th17细胞的细胞毒性剂。

此外，本发明可以提供用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统、用于检测Th17细胞的试剂、和Th17细胞的检测方法，所述检测方法可以方便地检测Th17细胞。

附图说明

图1的图显示了通过流式细胞术评价的抗-Embigin抗体与表达小鼠Embigin的大鼠细胞和大鼠细胞的结合活性。相对于抗-Embigin抗体的同种型(大鼠IgG)是5 μg/mL浓度，并使用培养物上清液作为抗-Embigin抗体(抗-emb抗体)。

图2的图显示了通过流式细胞术评价的抗-Embigin抗体与表达小鼠Embigin的仓鼠细胞和仓鼠细胞的结合活性。同种型是5 μg/mL浓度，并使用培养物上清液作为抗-Embigin抗体(抗-emb抗体)。

图3的图显示了通过蛋白质印迹法评价的、从Th17细胞和Treg细胞制备的蛋白中含有的Embigin的量。

图4的图显示了通过qRT-PCR方法评价的、从Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th0细胞和Treg细胞制备的总RNA中含有的Embigin mRNA的量。

图5的图显示了通过流式细胞术评价的、在含有Th17的不同细胞的细胞膜上的Embigin的量。显示了当使用抗-Embigin抗体时的几何平均值与同种型(大鼠IgG)的几何平均值之比。当发现多个峰时，显示每个值。通过抗-小鼠B220抗体(B细胞标志物)、抗-小鼠CD11a抗体(白细胞标志物)或抗-小鼠CD3抗体(CD3阳性的细胞标志物)来鉴别各细胞。

图6的图显示了通过流式细胞术评价的、抗-人Embigin抗体与下述细胞的结合活性：表达与小鼠Embigin相对应的人基因(智人Embigin，在下文中称作“人Embigin”)的小鼠细胞和小鼠细胞。相对于抗-人Embigin抗体的同种型(大鼠IgG)是5 μg/mL浓度，并使用培养物上清液作为抗-Embigin抗体(抗-emb抗体)。

图7的图显示了通过流式细胞术评价的在人Th17细胞膜表面上的Embigin表达。同种型(大鼠IgG)是5 μg/mL浓度，并使用培养物上清液作为抗-Embigin抗体(抗-emb抗体)。

图8的图显示了经毒素修饰的抗-Embigin抗体在致病细胞中的细胞衰竭特异性的评价。

图9的图显示了抗-Embigin抗体在致病细胞中的细胞衰竭特异性的评价。

图10的图显示了通过蛋白质印迹法和使用商购可得的器官集合（organ panel）评价的、小鼠不同器官的小鼠Embigin表达量。以1/1000倍稀释度，使用商购可得的兔抗-小鼠Embigin抗体。

图11的图显示了抗-Embigin抗体(抗-Emb抗体)的施用对转移至小鼠脾的荧光标记的致病细胞的细胞数目的影响的评价。小鼠的CFSE标记的致病细胞是1.5 x 10⁷细胞，并使用30 μg或100 μg抗-Embigin抗体。使用流式细胞术检测荧光细胞的数目。在该图中，Δ显示了每个个体的测量值。

图12的图显示了抗-Embigin抗体在致病细胞中的细胞衰竭特异性的评价。

图13的图显示了，在用抗-Embigin抗体选择性地衰竭Th17细胞以后，将细胞转移进小鼠中得到的多发性硬化模型的临床评分的评价。转移的细胞是3 x 10⁶细胞，并使用1 μg/mL的抗-Embigin抗体。评价临床评分至细胞转移后第20天。

图14的图显示了，在病状发作之前，给小鼠施用抗-Embigin抗体对临床评分的影响的评价，所述小鼠通过用PLP免疫而诱导制成多发性硬化模型。PLP与弗氏完全佐剂相混合，并皮下地免疫1次。在免疫接种以后，在第7天和第14天(用箭头指示)施用抗-Embigin抗体(300 μg)2次。评价临床评分至PLP免疫接种以后第18天。

图15的图显示了，在病状发作之后，给小鼠施用抗-Embigin抗体对临床评分的影响的评价，所述小鼠通过用PLP免疫而诱导制成多发性硬化模型。PLP与弗氏完全佐剂相混合，并皮下地免疫1次。在PLP免疫接种以后第12天，基于临床评分，将表现出病状的小鼠分组，在分组当天和分组7天后(用箭头指示)，施用抗-Embigin抗体(100 μg) 2次。评价临床评分至PLP免疫接种以后第23天。

具体实施方式

下面详细地解释本发明。

1. 在本发明中的抗-Embigin抗体

已知Embigin是一种单次跨膜蛋白，其与CD147 (Basigin)和神经丝束蛋白（neuroplastin）形成一个家族。已知Embigin具有下述氨基酸序列：例如，人Embigin (NCBI数据库登录号：NP_940851, SEQ ID NO: 1)、大鼠Embigin (NCBI数据库登录号：NP_446171)或小鼠Embigin (NCBI数据库登录号：NP_034460, SEQ ID NO: 8)。

作为编码Embigin的基因(在下文中称作“Embigin基因”)的核酸序列，还已知：例如，人Embigin基因(NCBI数据库登录号：NM_198449, SEQ ID NO: 2)或小鼠Embigin基因(NCBI数据库登录号：NM_010330, SEQ ID NO: 9)。

在本说明书中的Embigin不仅包括这些已知序列所示的“蛋白”或“(多)肽”，而且包括：例如，它们的同系物(同系物和剪接突变体)、突变体、衍生物、成熟形式、氨基酸修饰形式等，只要它们的生物学功能与显示人Embigin的特定氨基酸序列的生物学功能等效。在这里，同系物的实例包括：与人蛋白相对应的其它生物学物种（诸如小鼠、大鼠等）的蛋白。从通过HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)鉴别出的基因的碱基序列，可以推论地鉴别出它们。另外，所述突变体包括：天然存在的等位基因突变体、非天然存在的突变体、以及具有通过删除、置换、添加或插入而人工地改变的氨基酸序列的突变体。上述突变体的实例包括与无突变的蛋白或(多)肽具有至少70%、优选地80%、更优选地95%、进一步更优选地97%的同源性的那些突变体。另外，所述氨基酸修饰形式包括：天然存在的氨基酸修饰形式和非天然存在的氨基酸修饰形式，可以具体地提及氨基酸的磷酸化形式。

在本发明中的抗-Embigin抗体可以是任意的，只要它会特异性地识别Embigin。“特异性地识别”是指特异性地结合Embigin。具体地，它可以是能够特异性地识别Embigin基因的表达产物(蛋白) (在本说明书中，在下文中也称作“Embigin”)的抗体，能够识别Embigin的细胞外区域(SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的第32个至第257个)的抗体是优选的。

要用于本发明中的上述抗体包括多克隆和单克隆抗体。根据重链的恒定结构域的类型，将抗体分成5大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在它们中，有些抗体被进一步分成亚类或同种型(例如，在IgG的情况下，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)。

所述抗体包括：人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段或由Fab表达文库生成的片段、小抗体(也包括抗体片段)、多特异性抗体等、以及经修饰的抗体，诸如与药物缀合的抗体等。此外，也包括上述抗体的具有抗原结合性质的部分、具有增强的细胞毒性诱导活性的抗体、双特异性抗体、与蛋白融合的抗体等。

作为要用于本发明中的抗-Embigin抗体，例如，可以使用商购可得的抗-Embigin抗体(Santa Cruz生产，eBioscience等生产)，或它可以是使用已知方式生产的多克隆或单克隆抗体。

作为要用于本发明中的抗-Embigin抗体，从哺乳动物衍生出的单克隆抗体和多克隆抗体是特别优选的。通过本领域普通技术人员已知的方法，可以生产单克隆抗体和多克隆抗体。

从哺乳动物衍生出的单克隆抗体和多克隆抗体的实例包括：在动物血液中生产的那些，由杂交瘤生产的那些，由通过基因工程方式用含有抗体基因的表达载体转化的宿主生产的那些，由最佳抗体（其通过噬菌体展示从含有1,000,000,000,000种分子的庞大克隆文库中筛选出）的基因在CHO细胞工厂中大量生产的那些，使用生产人抗体的转基因小鼠直接生产的人抗体，等等。

要用作敏化抗原的蛋白不受它的起源动物物种（诸如人、小鼠、大鼠等）的限制，所述敏化抗原用于得到本发明的抗-Embigin抗体，用于制备多克隆抗体。但是，优选地考虑与要用于细胞融合的母细胞的相容性来进行确定，通常，从哺乳动物衍生出的蛋白是优选的，从人类衍生出的蛋白是特别优选的。也可以是完整蛋白或蛋白的部分肽。例如，当Embigin是人Embigin时，可以使用表达人Embigin蛋白和人Embigin的细胞、人Embigin的部分肽等。蛋白的部分肽的实例包括蛋白的氨基(N)端片段和羧基(C)端片段。在本发明中的抗-Embigin抗体是指，与全长Embigin蛋白或其片段反应的抗体。

例如，可以如下得到多克隆抗体。也就是说，使用下述物质免疫小动物（诸如兔等）以得到血清：天然的Embigin蛋白，或由微生物（诸如大肠杆菌等）表达为含有GST的融合蛋白的重组Embigin蛋白，或其部分肽。其通过下述方法纯化，以得到多克隆抗体：例如，硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱法、与Embigin蛋白或合成肽偶联的亲和柱等。

根据例如使用杆状病毒的方法(例如，WO98/46777等)等，可以制备抗原。当所述抗原具有低免疫原性时，给它缀合具有免疫原性的大分子（诸如白蛋白等），并用于免疫接种。

作为单克隆抗体的生产方法，根据已知方法，用敏化抗原免疫动物。作为一般的方法，将敏化抗原腹腔内地或皮下地注射给哺乳动物。具体而言，用PBS (磷酸盐缓冲盐水)、盐水等稀释敏化抗原或在其中悬浮至足够的量，并根据需要在其中混合合适量的常规佐剂，例如，弗氏完全佐剂。乳化所述混合物，并每隔4 - 21天免疫哺乳动物数次。也可在以敏化抗原进行免疫接种时使用合适的载体。

以此方式，免疫哺乳动物，证实血清中所需抗体水平的增加，从所述哺乳动物得到免疫细胞，并进行细胞融合。免疫细胞的特别优选的实例包括脾细胞。作为要与前述免疫细胞融合的其它母细胞，使用哺乳动物骨髓瘤细胞。作为骨髓瘤细胞，优选地使用各种已知的细胞系，例如，P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. 等人, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. 等人, Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. 等人, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. 等人, Nature (1979) 277, 131-133)等。

基本上根据已知方法，例如，Kohler, Milstein等人的方法(Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)等，可以进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体地，例如，在有细胞融合促进剂存在下，在常规营养培养基中，进行前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血凝集病毒(HVJ)等，当需要时，还可以进一步加入助剂诸如二甲基亚砜等，用于提高融合效率。

可以任选地确定要使用的免疫细胞和骨髓瘤细胞的比例。例如，使用的免疫细胞优选地是骨髓瘤细胞的1-10倍。作为要用于前述细胞融合的培养基，例如，RPMI1640培养基和MEM培养基对于前述骨髓瘤细胞系的生长而言是优选的，也可以使用为这类细胞培养通常使用的培养基，且进一步，还可以组合地使用血清添加物诸如胎牛血清(FCS)等。

就细胞融合而言，在前述培养基中将给定量的前述免疫细胞和骨髓瘤细胞混合均匀，所述培养基中通常预先加入30-60% (w/v)浓度的、加热至约37℃的PEG溶液(例如，约1000-6000的平均分子量)，并混合所述混合物，以形成目标杂交瘤。然后，重复下述操作：接连地加入合适的培养基、离心混合物并除去上清液，以除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。

除了通过用抗原免疫除了人类以外的动物来得到上述杂交瘤以外，还可以通过在体外用下述物质敏化人淋巴细胞例如，通过EB病毒感染而永生化的人淋巴细胞，来制备生产人抗-Embigin抗体的细胞系：Embigin蛋白，表达Embigin蛋白的细胞或其裂解物。此外，为了稳定地维持抗体分泌能力，可以使敏化的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞（如上所述）或从人类衍生出的具有持久的分裂潜能的骨髓瘤细胞，例如，U266进行融合，以得到生产具有所需活性(Embigin结合活性)的人抗体的杂交瘤。

通过在常规选择培养基例如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养，确定如此得到的杂交瘤。在上述HAT培养基中的培养持续足以杀死除了目标杂交瘤以外的细胞(未融合的细胞)的时间(通常数天至数周)。然后，进行常规的有限稀释方法，并进行生产目标抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。

可以在常规培养基中传代培养如此制备的生产单克隆抗体的杂交瘤，且可以在液氮中长期保藏。为了从杂交瘤得到单克隆抗体，采用下述方法：包括根据常规方法培养杂交瘤以在其培养物上清液中得到抗体的方法，或包括将杂交瘤施用给与其相容的哺乳动物并得到在腹水流体等中的增殖的细胞的方法。前一种方法适用于得到非常纯的抗体，后一种方法适用于抗体的大规模生产。

人抗体是指作为人衍生的抗体基因的表达产物的抗体。人抗体可以如下得到：例如，将人抗体基因基因座引入转基因的动物中，以赋予生产人衍生的抗体的能力，并将抗原施用给该动物。作为这样的转基因的动物，可以提及小鼠，能够生产人抗体的小鼠的生产方法描述在例如WO02/43478中。

本发明中的单克隆抗体包括由这样的重链和/或轻链组成的单克隆抗体：所述重链和/或轻链各自具有构成所述抗体的重链和/或轻链的氨基酸序列，其中一个至几个氨基酸被删除、置换或添加。通过部分地改变编码氨基酸序列的碱基序列，可以向本发明抗体的氨基酸序列中引入氨基酸的这种部分改变(删除、置换、插入、添加)。根据常规方法(Proc. Natl. Acsd. Sci. USA., 1984 Vol.81, 5662-5666; Sambrook等人, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989)第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press)，使用已知的位点特异性的诱变，可以引入碱基序列的这种部分改变。

在本发明中，还可以使用基因重组抗体，其被人工地改变，以降低对人的异源抗原性等，例如，嵌合(型)抗体和人源化的抗体。这些改变的抗体可以使用已知方法来生产。

嵌合抗体是这样的免疫球蛋白分子：其特征在于，从不同的动物物种衍生出的2个或更多个部分的结合。通常，嵌合抗体的可变区源自非人哺乳动物的抗体(例如，小鼠单克隆抗体)，且其免疫球蛋白恒定区源自人免疫球蛋白分子。优选地，选择具有低免疫原性的可变区，并与也具有低免疫原性的人恒定区相组合。优选地，所述组合也具有低免疫原性。嵌合抗体包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是嵌合H链通过二硫键与嵌合L链结合而形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是通过至少1个二硫键结合的2个HL二聚体形成的四聚体(H2L2)。

在本技术领域中已经描述了嵌合抗体及其生产方法(Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne等人, Nature 312: 643-646 (1984); Liu等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 214-218 (1987); Better等人, Science 240: 1041-1043 (1988)；和Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。

人源化的抗体也称作重构的人抗体，其如下得到：将非人哺乳动物（例如，小鼠）的抗体的互补性决定区(CDR)移植进人抗体的互补性决定区中，用于这方面的一般的基因重组方法也是已知的(参见EP-A-EP125023和WO92/19759)。通过已知方法，可以生产人源化的抗体。例如，通过PCR方法，从制备成在末端上具有重叠区的几种寡核苷酸，合成设计为连接小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区(FR；框架区)的DNA序列。使得到的DNA与编码人抗体C区的DNA相连，然后整合进表达载体中，将所述表达载体引入宿主中以允许生产，由此得到人源化的抗体(参见EP-A-EP239400和WO92/19759)。作为人抗体的框架区（其通过CDR相连）选择这样的框架区：其中互补性决定区形成良好抗原结合位点。在必要的情况下，可以置换在抗体的可变区的框架区中的氨基酸，使得重构的人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点(Sato, K. 等人, Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。

对于嵌合抗体和人源化的抗体，使用了人抗体C区。作为人抗体C区，可以提及Cγ，且可以使用例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，为了提高抗体或其生产的稳定性，可以修饰人抗体C区。嵌合抗体由源自非人哺乳动物的抗体的可变区和人抗体衍生的C区组成，人源化的抗体由源自非人哺乳动物的抗体的互补性决定区和人抗体衍生的框架区和C区组成。由于在人体中的抗原性较低，它作为要用于本发明中的抗体是有益的。

要用于本发明中的抗体可以是抗体的片段或其修饰形式，只要它可以优选地用于本发明中。抗体片段的实例包括：Fab、F(ab’)2、Fv或单链抗体（scFv）（其中Fv的H链（VH）和L链（VL）用合适的接头相连，以形成Fv）、双体（其中含有VH和VL的多肽二聚体通过分子间VH-VL相互作用而装配）、微体（minibody）（它是一种二聚体，其中恒定区的一部分（CH3）与scFv的H链结合）、其它小抗体等。

所述小抗体没有特别限制，只要它含有全长抗体(完整抗体，例如，完整IgG等)的一部分缺失的抗体片段，且具有与抗原(Embigin蛋白)的结合潜力。所述抗体片段没有特别限制，只要它是全长抗体的一部分，且优选地含有重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。

所述单链抗体也称作“单链Fv”，也就是说，“scFv”抗体片段，且含有抗体的VH和VL结构域，且这些结构域存在于多肽单链中。所述“Fv”片段是最小的抗体片段，且含有完全的抗原识别位点和结合位点。通常，所述“Fv”片段是二聚体(VH-VL二聚体)，其中一个VH和VL通过非共价键强烈地相连。每个可变区的3个互补性决定区(CDR)相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上形成抗原结合位点。6个CDR形成一种抗体的抗原结合位点。甚至一个可变区(或仅含有3个对抗原特异性的CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点的亲和力。所述scFv多肽另外含有在VH和VL结构域之间的多肽接头，使得scFv可以形成抗体结合所需的结构(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg和Moore编. Springer-Verlag, New York, 第269-315页(1994))。

可以如下生产小抗体和单链抗体：例如，用酶(例如，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)处理抗体以生成抗体片段，或构建编码这些抗体片段的基因，并将所述基因引入表达载体中以允许在合适的宿主细胞中表达(参见，例如，Co, M. S. 等人, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. 和Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. 等人, Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. 等人, TIBTECH (1991) 9, 132-137)。

通过连接抗体的H链V区和L链V区，可以得到scFv。这些区域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽另外含有在VH和VL之间的多肽接头，因此scFv可以形成抗原结合所需的结构(关于scFv的综述，参见Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”第113卷(Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag, New York)第269-315页, 1994))。所述接头没有特别限制，只要它不会抑制与其两端连接的抗体可变区的表达。

在该scFv中，H链V区和L链V区通过接头（优选肽接头）相连(Huston, J. S. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。在scFv中的H链V区和L链V区可以源自上面描述为抗体的那些区域中的任一种。作为连接V区的肽接头，例如，使用由12-19个氨基酸残基组成的任选的单链肽。

如下得到编码scFv的DNA：使用编码前述抗体的H链或H链V区的DNA和编码其L链或L链V区的DNA作为模板，使用限定两端的引物对，通过PCR方法扩增编码那些序列的所需氨基酸序列的DNA部分，然后组合地扩增编码肽接头部分的DNA和限定使得所述接头部分的两端分别与H链和L链相连的引物对。制备出编码scFv的DNA以后，根据常规方法，可以得到含有所述DNA的表达载体和用所述表达载体转化的宿主，并可以根据常规方法使用所述宿主得到scFv。

双体是指通过基因融合构建的二价抗体片段(Holliger P等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP-A-404097, WO93/11161等)。所述双体是由2个多肽链构成的二聚体。通常，在多肽链中，VL和VH分别通过短接头（其具有例如约5个残基）连接在同一链中，所述接头因为太短而不能彼此结合。在同一多肽链上编码的VL和VH不能形成单链可变区片段（因为它们之间的接头太短），但是会形成二聚体，因此，所述双体具有2个抗原结合位点。

sc(Fv)2是由2个VH和2个VL组成的小抗体，所述VH和VL通过接头等连接成单链(Hudson等人, J Immunol. 方法1999; 231: 177-189)。可以如下制备sc(Fv)2：例如，通过接头来连接2个scFv。

在本发明中，作为连接抗体的可变区的接头，可以使用：可通过基因工程引入的肽接头，在合成的化合物接头中公开的接头(参见例如，Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996)等。当使用肽接头时，其长度没有特别限制，本领域普通技术人员可以根据目标适当地选择长度。所述长度通常是1 - 100个氨基酸，优选地3 - 50个氨基酸，进一步优选地5 - 30个氨基酸，特别优选地12 - 18个氨基酸(例如，15个氨基酸)。合成的化合物接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂。其实例包括：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(BS³)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸盐) (DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸盐) (DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸盐) (EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸盐) (磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等。这些交联剂是商购可得的。

可以如下生产这些抗体的片段：以与上面相同的方式，得到其基因，表达所述基因，并使宿主生产它们。在本申请的权利要求中的“抗体”也包括那些抗体片段。

经修饰的抗体的实例包括与各种分子缀合的抗体，所述分子是诸如聚乙二醇(PEG)、荧光物质、放射性同位素、药物等。在本申请的权利要求中的“抗体”也包括这些经修饰的抗体。通过将化学修饰应用于得到的抗体，可以得到这样的经修饰的抗体。在本领域中已经建立了所述方法及其用途。

具有增强的细胞毒性诱导活性的抗体的实例包括：岩藻糖-缺陷型抗体，在糖链处添加了平分型N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体，通过置换Fc区中的氨基酸而改变了对Fcγ受体的结合活性的抗体，等。通过本领域普通技术人员已知的方法，可以生产这些具有增强的细胞毒性诱导活性的抗体。

当将不同亚类中的抗体转化成人IgG1时，可以如下得到它：例如，从源自生产抗体的杂交瘤的cDNA中，仅分离出可变区的编码区，将所述编码区引入含有人IgG1的恒定区的载体中，例如，N5KG1-Val Lark载体(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 (美国专利6001358))。

双特异性抗体是识别两类抗原的抗体，其制备方法也是已知的(例如，Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374)。所述抗原之一是Embigin，另一种抗原是除了Embigin以外的异源抗原。异源抗原的实例包括、但不限于免疫效应细胞的其它细胞表面抗原，例如，CD3、CD28、CD16、CD64等。

与蛋白融合的抗体是，在所述抗体的N-端或C-端处与异源蛋白融合的抗体，其制备方法也是已知的(例如，Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。所述抗体仅需要是通过使异源蛋白与抗-Embigin抗体结合得到的嵌合分子。异源蛋白的实例包括、但不限于：Fc受体、细胞因子等。

从细胞内外、和宿主，可以分离如上所述生产和表达的抗体，并均匀地纯化。通过亲和色谱法，可以分离和纯化要用于本发明中的抗体。要用于亲和色谱法的柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。要用于蛋白A柱的载体的实例包括HyperD、POROS、琼脂糖F.F. 等。另外，可以使用通常用于蛋白的分离和纯化方法，且没有任何限制。

例如，可以如下分离和纯化在本发明中使用的抗体：适当地选择和组合除了上述亲和色谱法以外的色谱法、过滤、超滤、盐析、透析等。色谱法的实例包括离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤等。这些色谱法可以应用于HPLC (高效液相色谱法)。另外，也可以使用反相HPLC。

2. 本发明的预防剂或治疗剂和针对Th17细胞的细胞毒性剂

发明人已经发现，由于经毒素修饰的抗-Embigin抗体和与磁性珠子缀合的抗-Embigin抗体会选择性地衰竭Th17细胞，且进一步，作为大鼠IgG2b的抗-Embigin抗体不仅选择性地减少Th17细胞，而且显示出对自身免疫病模型动物的预防或治疗效果，所以使用抗-Embigin抗体（例如，与表现出细胞毒性的药物缀合的抗-Embigin抗体，具有诱导细胞毒性的结构的抗-Embigin抗体，等）作为与Th17细胞有关的自身免疫或变应性疾病的预防剂或治疗剂，特别是多发性硬化的预防剂或治疗剂。

因此，本发明提供了自身免疫病或变应性疾病的预防剂或治疗剂，其含有抗-Embigin抗体。

在本发明的自身免疫病或变应性疾病的预防剂或治疗剂中含有的抗-Embigin抗体没有特别限制，只要它是在“1. 在本发明中的抗-Embigin抗体”中描述的抗体。例如，可以优选地使用表现出细胞毒性的抗-Embigin抗体、具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体等。

“细胞毒性”的实例包括细胞杀死活性、细胞功能障碍活性和细胞生长抑制活性。在本发明中，需要存在这些活性中的至少一种。另外，所述抗-Embigin抗体本身可以具有细胞毒性(例如，ADCC·CDC-非依赖性的细胞凋亡诱导活性等)，并优选地，可以如下使用表现出细胞毒性的药物：使它们与抗体缀合，以赋予所述抗体细胞毒性。

表现出细胞毒性的药物的实例包括：细胞毒性物质（诸如细菌衍生的毒素等）、化学治疗剂和放射性同位素。其具体实例包括：放射性核素诸如碘(¹³¹碘：¹³¹I、¹²⁵碘：¹²⁵I)、钇(⁹⁰钇：⁹⁰Y)、铟(¹¹¹铟：¹¹¹In)、锝(^99m锝：^99mTc)等(J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS)，细菌衍生的毒素诸如铜绿假单孢菌毒素(假单胞菌外毒素)、白喉毒素和蓖麻蛋白，化学治疗剂诸如甲氨蝶呤、丝裂霉素、卡奇霉素、皂草素等(D.J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T.J. International Ltd, M.L. Grossbard., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc, John M Lambert, Current Opinion in Pharmacology (2005)第5卷, 第543-549页)等。不具有副作用且具有强细胞毒性的药物是优选的。

在抗体和药物之间的键可以是共价键和非共价键中的任一种(例如，离子键)。例如，可以如下得到抗-Embigin抗体和药物的复合物：使用抗体分子中的反应基团(例如，氨基、羧基、羟基等)或配位基团，并使特定药物与抗体接触，所述药物具有能够与所述反应基团反应形成键的官能团(在细菌衍生的毒素或化学治疗剂的情况下)，或具有能够与配位基团形成复合物的可离子化基团(在放射性核素的情况下)，其中如果必要的话，所述反应基团可以在被具有更高反应性的基团结合以后使用，或在转化成具有更高反应性的基团以后使用。或者，还可以使用生物素-抗生物素蛋白系统来形成复合物。在本领域中已经确立了这样的结合方法(Bioconjugate Chem. (2010)第21卷, 5-13, Accounts of chemical research (2008)第41卷, 第1期, 98-107)。目前，已经在临床上开发了与表现出细胞毒性的药物缀合的多种IgG(Current Opinion in Pharmacology (2005)第5卷, 第543-549页)。作为本发明的表现出细胞毒性的抗-Embigin抗体，可以提及例如这样的抗-Embigin抗体：它是与表现出细胞毒性的药物缀合的IgG。

作为在本说明书中的“具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体”，可以提及特异性地识别Embigin且具有前述诱导细胞毒性的结构的抗体。如在实施例14–17中所示，具有诱导细胞毒性的结构的抗-Embigin抗体会选择性地消除Th17细胞，并表现出对自身免疫病动物模型的预防或治疗效果。因此，当所述抗-Embigin抗体是具有诱导细胞毒性的结构的抗体时，即使所述抗体本身不具有细胞毒性且未与具有所述活性的药物缀合时，所述抗体也可以表现出作为自身免疫病或变应性疾病的预防剂或治疗剂或针对Th17细胞的细胞毒性剂的功能。

具有诱导细胞毒性的结构的抗体的具体实例包括下述的(a) - (c)。

(a)一种抗体，其具有在效应细胞存在下诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)的结构。

(b)一种抗体，其具有诱导补体依赖性的细胞毒性(CDC)的结构。

(c)一种抗体，其具有诱导抗体依赖性的细胞吞噬作用(ADCP)的结构。

上述(a)的具有在效应细胞存在下诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性的结构的抗体是广泛已知的。其实例包括属于诸如下述亚类的抗体：小鼠IgG2a和IgG3、人IgG1和IgG3、大鼠IgG2b等等。

作为这些亚类的药用抗体，利妥昔单抗(商品名Rituxan (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.))、曲妥单抗(商品名赫赛汀(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.))等是已知的(参见，例如，Nat. Rev. Immunol. 2010; 10: 301-316)。

上述(b)的具有诱导补体依赖性的细胞毒性的结构的抗体也是广泛已知的。其实例包括属于诸如下述亚类的抗体：小鼠IgM、IgG2a和IgG3、人IgM、IgG1和IgG3、大鼠IgG2b等等。

抗体的ADCC和CDC活性在很大程度上取决于IgG的亚类，且已经澄清，IgG1和IgG3在人类中具有强活性。因而，具有诱导细胞毒性的结构的人抗体的实例包括这样的抗体：所述抗体具有IgG1的恒定区、IgG3的恒定区或IgM的恒定区。具有诱导细胞毒性的结构的人抗体的优选实例包括IgG1或IgG3亚类的IgG抗体和IgM抗体。

可以如下检查抗体的细胞毒性诱导活性：例如，在ADCC活性的情况下，在有抗-Embigin抗体存在下温育靶细胞(Th17细胞和强制表达Embigin的细胞系)和表达Fc受体的效应细胞(NK细胞、单核细胞等)，在CDC活性的情况下，在有新鲜的人血清(包括补体)存在下温育靶细胞和抗体，并计数活细胞和/或死细胞。

此外，本发明的“具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体”也包括：具有诱导2类细胞毒性活性的结构的抗体，具有增强的细胞毒性诱导活性的抗体，结合Embigin和除了Embigin以外的抗原的双特异性抗体，与蛋白融合的抗-Embigin抗体，等。

具有增强的细胞毒性诱导活性的抗体的实例包括：Fc区糖链的岩藻糖缺失的抗体，在糖链处添加了平分型N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体，通过置换Fc区中的氨基酸而改变了对Fcγ受体的结合活性的抗体，等。这些操作可以使对效应细胞上的Fc受体的结合活性增强至100倍或更多。另外，当抗-Embigin抗体属于人IgG2或IgG4亚类时，通过前述基因重组方法，可以将恒定区改变成人IgG1或IgG3亚类。此外，可以如下赋予超过天然亚型IgG1和IgG3的CDC活性：制备同种型嵌合抗体，所述嵌合抗体将人IgG3序列的一部分掺入人IgG1中(综述参见Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872; Nat. Rev. Immunol. 2010 (如上所述))。

“与Th17细胞有关的疾病”是指：其中Th17细胞是致病细胞的疾病，其中Th17细胞被怀疑为致病细胞的疾病，其中Th17细胞会加速病状恶化的疾病，或其中Th17细胞具有加速病状恶化的可能性的疾病。

与Th17细胞有关的疾病的实例包括：自身免疫疾病诸如多发性硬化、银屑病、风湿病、炎性肠病等、变应性疾病诸如接触性超敏反应、类固醇抵抗型哮喘、肾小球肾炎、特应性皮炎等和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。在文献等中已经报道了Th17细胞在这些疾病中的参与(Annu. Rev. Physiol. (2010) 72: 495-516, J Am Soc Nephrol (2010) 21: 925-931)。具体地，已经使用动物模型澄清，Th17细胞是比常规地认为重要的Th1细胞更强的多发性硬化致病细胞(J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240)。

另外，由于体内的主要的IL-17生产细胞是Th17细胞，与IL-17有关的疾病也被包括在“与Th17细胞有关的疾病”中。已知，通过抑制IL-17生产或抑制IL-17的功能，可以改善诸如类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、慢性非传染性葡萄膜炎等疾病(J. Immunol. (2003) 171: 6173-6177, Inflamm Bowel Dis (2006): 2: 382-388, Sci Transl Med (2010) 2; 52ra72)。

由于Th1细胞和Th17细胞也参与身体的防御功能，非特异性的免疫抑制或Th1细胞和Th17细胞的功能抑制可能过度地降低身体的防御功能。因此，预期本发明的治疗剂（其选择性地作用于Th17细胞）会实现减少的副作用。另外，由于Th17细胞作为自身免疫疾病的致病细胞显示出比Th1细胞更强的作用（这取决于疾病），本发明的治疗剂通过选择性地作用于Th17细胞而表现出对与Th17细胞有关的自身免疫疾病等的优良的作用。

另外，发明人已经发现，与表现出细胞毒性的药物缀合的抗-Embigin抗体或具有诱导细胞毒性的结构的抗-Embigin抗体也可用作针对Th17细胞的细胞毒性剂，因为经皂草素修饰的抗-Embigin抗体和与磁性珠子缀合的抗-Embigin抗体会选择性地衰竭Th17细胞，并且大鼠IgG2b抗体（即是能够诱导ADCC和CDC活性的抗体的抗-Embigin抗体）也会选择性地衰竭Th17细胞。

因此，本发明提供了针对Th17细胞的细胞毒性剂，其含有抗-Embigin抗体。

本发明的“针对Th17细胞的细胞毒性剂”是会对Th17细胞造成细胞损伤的药物。因此，本发明的针对Th17细胞的细胞毒性剂的实例包括前述的表现出细胞毒性的抗-Embigin抗体和具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体。

本发明的针对Th17细胞的细胞毒性剂可以用于证实Th17细胞在某种病理学状况中的参与，例如，通过将所述药剂施用给各种动物疾病模型。

迄今为止，已经主要通过Th17细胞转移证实了Th17细胞作为自身免疫疾病的致病细胞的研究。但是，它们不是使用非常纯的Th17细胞进行转移的研究，而是允许混合除了Th17细胞以外的细胞的那些研究(J. Exp. Med. (2005) 233-240)。因此，使用本发明的针对Th17细胞的细胞毒性剂，可以更清楚地分析Th17在病理学中的参与，且本发明的药剂可用于研究多种疾病的治疗。例如，作为自身免疫病模型，可以提及实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)-发病模型，这是一种多发性硬化模型，且可以使用通过用肽(自身抗原)诸如PLP或MOG等免疫广泛使用的小鼠和大鼠而得到的EAE模型(Methods Mol Biol. 2009; 549: 157-73, Brain (2004); 127: 2201-2213)，尽管不限于此。

本发明的针对Th17细胞的细胞毒性剂可以另外用于预防或治疗前述的“与Th17细胞有关的疾病”。

根据在下述的“5. 本发明的Th17细胞的检测方法”中描述的方法，通过计数Th17细胞的数目，可以证实本发明的针对Th17细胞的细胞毒性剂的效果。

本发明的治疗剂和针对Th17细胞的细胞毒性剂可以含有任选的载体，例如，药学上可接受的载体，且可以以药物组合物的形式作为药物施用。

药学上可接受的载体的实例包括、但不限于：赋形剂诸如蔗糖、淀粉等，粘合剂诸如纤维素、甲基纤维素等，崩解剂诸如淀粉、羧甲基纤维素等，润滑剂诸如硬脂酸镁、微粉硅胶等，香料诸如柠檬酸、薄荷醇等，防腐剂诸如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠等，稳定剂诸如柠檬酸、柠檬酸钠等，悬浮液诸如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，分散剂诸如表面活性剂等，稀释剂诸如水、盐水等，蜂蜡等。

本发明的药剂可以口服地和肠胃外地施用，优选肠胃外施用。其具体实例包括注射剂型、经鼻施用剂型、经肺施用剂型、透皮施用形式等。注射剂型的实例包括静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等，它们可以全身地或局部地施用。

尽管本发明的药剂的剂量可以随下述因素而变化：给药目的、给药方法、给药途径、剂型、给药对象的状况(性别、年龄、体重、严重性等)，当通过注射施用给成年人时，通常可以确定在下述范围内的剂量：每1kg体重0.0001 mg - 100 mg，或每位患者每次注射1 - 1000 mg、优选地5 - 50 mg。但是，本发明的药剂和/或组合物不限于这些剂量。

另外，关于给药间隔，只要效果持续，就可以不施用下一次给药。例如，在治疗期间，给药可以是每2 - 8周1次，每几周1次，或每几个月1次，或每几年1次。

根据已知的制药方法配制本发明的药剂，并施用。例如，它可以以在水或其它药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液注射剂的形式使用。另外，可以如下配制它：适当地与例如药理学上可接受的载体或介质（具体地，无菌的水和盐水、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、媒介物、防腐剂等）相组合，并在普遍接受的药用用途所需的单位剂型中混合。在这些制品中的活性成分的量应当设定为在标定范围内的合适体积。

根据一般的制备用途，使用诸如注射用蒸馏水等媒介物，可以配制用于注射的无菌组合物。注射用水溶液的实例包括盐水、等张溶液，所述等张溶液包括葡萄糖和其它助剂，诸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，且它们可以与合适的溶解助剂(例如，醇，特别是乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)和非离子的表面活性剂(例如，聚山梨酯80TM、HCO-50)组合使用。

油状液体的实例包括芝麻油和大豆油，它们可以与苯甲酸苄酯和苯甲醇（作为溶解助剂）组合使用。另外，可以组合地使用缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、醋酸钠缓冲剂)、安抚剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苯甲醇、苯酚)和抗氧化剂。制备的注射溶液通常装入合适的安瓿中。

3. 本发明的用于药物递送系统的抗-Embigin抗体

本发明提供了用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统(DDS)和可用于所述DDS的抗-Embigin抗体。

发明人已经发现，由于与其它血细胞相比，Embigin在Th17细胞中高度地表达，且经毒素修饰的抗-Embigin抗体和与磁性珠子缀合的抗-Embigin抗体会衰竭Th17细胞，所以抗-Embigin抗体可用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统中。

由于本发明的药物递送系统的抗-Embigin抗体会特异性地结合Embigin（它是Th17细胞的细胞膜表面抗原），通过使目标药物与所述抗体缀合而形成的复合物可以将所述药物递送给Th17细胞。

抗-Embigin抗体的实例包括在“1.在本发明中的抗-Embigin抗体”中详细描述的抗体。它也可以是商购可得的抗-Embigin抗体(例如，由Santa Cruz等销售的抗-Embigin抗体)。

所述药物没有特别限制，只要它可以与抗-Embigin抗体形成复合物。其实例包括：细胞毒性物质诸如细菌衍生的毒素等，化学治疗剂和放射性同位素。其具体实例包括在“2. 本发明的治疗剂和针对Th17细胞的细胞毒性剂”中详细描述的药物。优选的药物是这样的药物：其没有副作用，且表现出强细胞毒性诸如细胞杀死活性、细胞生长抑制活性等。在本领域中已经确立了药物和抗体的结合方法。

本发明的药物递送系统(DDS)是以施用抗-Embigin抗体和药物的复合物为特征的药物递送系统，且可以将目标药物递送给Th17细胞。

本发明的DDS可以在体外和在体内施用。

在“体外”的情况下，通过将抗-Embigin抗体和药物的复合物加入培养细胞或从哺乳动物收集的细胞的培养用培养基中，可以将药物递送给Th17细胞。

在“体内”的情况下，通过皮下给药、静脉内给药、经渗透泵给药、经尾静脉给药等方式，给单个哺乳动物施用抗-Embigin抗体和药物的复合物，可以将药物递送给体内的Th17细胞。所述哺乳动物的实例包括人、猴、小鼠、大鼠等。

4. 本发明的Th17细胞检测试剂和试剂盒

尽管已知Th17细胞与多种疾病有关，尚未报道Th17细胞-特异性的细胞表面分子。

发明人已经发现，Embigin或Embigin基因可用作Th17细胞标志物，因为Embigin在小鼠Th17细胞和人Th17细胞中高度地表达，且特别是在血细胞中，Th17细胞比其它血细胞更高地表达Embigin。

本发明的Th17细胞检测试剂含有抗-Embigin抗体或能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸。

抗-Embigin抗体的实例包括在“1. 本发明的抗-Embigin抗体”中详细描述的抗体。另外，所述抗-Embigin抗体可以是用荧光物质或放射性同位素标记的经修饰的抗体。作为标记，可以使用与下述核酸中的标记类似的标记。荧光物质的实例包括：荧光胺、异硫氰酸荧光素等，放射性同位素的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等。根据常规方法，可以用荧光物质或放射性同位素标记抗体。使用被荧光标记等标记的抗-Embigin抗体，通过FACS等可以容易地检测Th17细胞。

所述“能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸”可以是任意核酸，只要它可以特异性地检测Embigin的mRNA，且根据所述检测方法可以适当地选择和使用探针或引物。探针的实例包括这样的多核苷酸序列：所述序列包含Embigin mRNA的核酸序列的15个碱基或更多、优选地18个碱基或更多、更优选约20个碱基或更多、最优选地全长的连续核苷酸序列，或其互补序列。引物的实例包括包含一对DNA序列的多核苷酸序列，所述DNA序列由15个碱基或更多、优选地18个碱基或更多、更优选约20个碱基或更多且100个碱基或更少、优选地50个碱基或更少、更优选约40个碱基或更少组成，它们会提供具有下述长度的PCR扩增的序列：例如，100个碱基或更多、优选地200个碱基或更多，且，例如，1000个碱基或更少、优选地500个碱基或更少，且它们分别被包含在Embigin mRNA的核酸序列和其互补链序列内。

所述核酸探针或引物可以含有其它序列(不与检测对象多核苷酸互补的核苷酸序列)，只要不损害特异性检测即可。

另外，也可以用合适的标记来标记所述核酸探针和引物，所述标记是例如放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、荧光物质(例如，荧光胺、异硫氰酸荧光素等)、发光物质(例如，鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等)等。或者，可以另外在荧光物质附近缀合猝灭剂(猝灭物质)，后者会吸收由荧光物质(例如，FAM、VIC等)发射的荧光能。在这样的实施方案中，当荧光物质和猝灭剂在检测反应过程中分离时，检测到荧光。

所述核酸探针可以是DNA、RNA和嵌合核酸中的任一种，且是单链或双链。基于关于Embigin基因的核酸序列的已知信息(例如，SEQ ID NO: 2所示的人Embigin基因的核酸序列)，根据常规方法，并使用例如DNA/RNA自动合成仪，可以合成能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸探针。

本发明也提供了一种用于检测Th17细胞的试剂盒。本发明的用于Th17细胞检测的试剂盒含有：用于测量Embigin的表达的试剂。通过使用本发明的试剂盒测量Embigin的表达，可以方便地检测Th17细胞。

本发明的试剂盒含有抗-Embigin抗体或能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸，特别是前述的用于Th17细胞检测的试剂。

在用于Th17细胞检测的试剂中含有的抗-Embigin抗体或核酸，通常以下述形式被包含在本发明的试剂盒中：以合适的浓度溶解在水或合适的缓冲液(例如，TE缓冲液、PBS等)中的其水溶液的形式，或核酸阵列的形式，其中将核酸探针固定化在固相载体上。

本发明的试剂盒可以在它的构成中另外含有：根据Embigin的测量方法实施所述方法必需的其它组分。例如，当使用RNA印迹法或核酸阵列进行测量时，本发明的试剂盒可以另外含有印迹缓冲液、标记试剂、印迹膜等。当使用原位杂交进行测量时，本发明的试剂盒可以另外含有标记试剂、生色底物等。另外，当使用FACS进行测量时，所述试剂盒可以含有荧光标记的第二抗体、细胞固定剂等。

5. 本发明的Th17细胞检测方法

发明人已经发现，Embigin在小鼠Th17细胞和人Th17细胞中高度地表达，且特别是在血细胞中，Embigin在Th17细胞中比在其它血细胞中更高地表达，基于此，他们已经发现了使用Embigin的表达作为指标的Th17细胞检测方法。

本发明的Th17细胞检测方法包括：测量Embigin在细胞或组织中的表达的步骤，和基于表达水平和Th17细胞之间的正相关来检测Th17细胞的步骤。根据本发明，可以比以前更容易地检测Th17细胞。

“Embigin的表达”在本发明中是指，Embigin蛋白或Embigin基因的表达。

通过测量Embigin在细胞或组织中的表达，可以具体地执行本发明的方法。所述细胞仅需要是从试验动物得到的细胞或培养细胞，且得到的血细胞或从血细胞衍生出的培养细胞是优选的。所述组织仅需要是从试验动物得到的组织，且优选地是允许免疫染色的形式。

本发明的方法可以应用于，例如，从试验动物（诸如人、大鼠、小鼠等）得到的细胞、组织等。

使用前述的本发明的用于Th17细胞检测的试剂和根据其本身已知的方法，可以测量Embigin的表达。测量方法的实例包括：FACS、蛋白质印迹法、RT-PCR、RNA印迹法、原位杂交、核酸阵列、组织染色等。

然后，基于测量的Embigin的表达水平，可以检测Th17细胞。如在下述的实施例中所示，由于Embigin在Th17细胞中的表达水平较高，基于Embigin表达水平和Th17细胞之间的正相关，当Embigin的表达水平或浓度在测量对象的细胞或组织中较高时，可以判断所述细胞是Th17细胞。

迄今为止，尚未发现这样的Th17细胞的细胞表面分子：其能够实现使用单一分子来鉴别Th17细胞。但是，本发明的Th17细胞检测方法可以使用方便的方法诸如FACS等来检测Th17细胞。具体地，当将本发明的方法应用于血细胞或血液衍生的培养细胞时，可以容易地检测Th17细胞。因此，就研究涉及Th17细胞的自身免疫疾病和变应性疾病、检查试验动物中是否存在增加的Th17细胞等而言，本发明的方法是非常有用的。

实施例

在下面，通过参照实施例解释本发明，所述实施例不应解释为限制性的。

参照实施例1-1. 针对小鼠Embigin的抗体的制备(1)

将用于表达小鼠Embigin的逆转录病毒导入大鼠细胞中，以制备过表达小鼠Embigin的细胞。用过表达小鼠Embigin的细胞免疫大鼠(Wistar, 5-周龄, CLEA Japan, Inc.)。在免疫接种以后，得到淋巴细胞，并通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，以得到杂交瘤。

使用用于免疫接种的过表达小鼠Embigin的细胞作为阳性对照细胞，使用与阳性对照细胞相同、但是仅导入载体的宿主细胞作为阴性对照细胞，通过流式细胞术，筛选生产抗-小鼠Embigin抗体的杂交瘤。

如下通过流式细胞术来评价结合活性。

以1x10⁴ - 1x10⁶细胞，使用阳性对照细胞或阴性对照细胞，加入杂交瘤培养物上清液或5 μg/mL的合适的大鼠IgG，使所述混合物反应30 min。用FACS缓冲液洗涤细胞1次，加入荧光标记的抗-大鼠IgG抗体，使所述混合物反应30 min。反应以后，通过离心操作收集细胞，悬浮于PBS或FACS缓冲液中，并进行流式细胞术。使用的流式细胞计是流式细胞计FC500 (Beckman Coulter)。使用前向散射和侧向散射直方图，设定对活细胞群的门控，并进行分析。

得到仅与表达Embigin的阳性对照细胞强烈反应的杂交瘤(2G21、2G23、3E64、3E66)。图1显示了评价结果。

为了进一步证实反应特异性，使用过表达小鼠Embigin的细胞(宿主：仓鼠细胞)作为阳性对照细胞，并使用仅导入载体的仓鼠细胞作为阴性对照细胞，通过流式细胞术评价了2G21和3E64。使用流式细胞计FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)进行分析，证实了2G21和3E64仅与阳性对照细胞的强反应。图2显示了评价结果。

参照实施例1-2. 针对小鼠Embigin的抗体的制备(2)

使用96-孔板，通过有限稀释方法，进一步对在上述参照实施例1-1中制备的抗-Embigin抗体3E64进行单克隆。纯化该克隆的抗体，以得到抗-Embigin抗体(3E64D1)。

另外，证实该抗体克隆为大鼠IgG2b抗体。已知大鼠IgG2b具有诱导细胞毒性的结构。

参照实施例2. 小鼠各种辅助性T细胞的制备

(1)小鼠Th17细胞的制备

通过参考公开的参考文献(Nature Immunology (2007)第8卷903-905, Nature Immunology (2007)第8卷958-966, Nature Immunology (2007)第8卷1390-1397, Nature (2007)第448卷480-484, J. Biol. Chem. (2008)第283卷17003-17008)，制备小鼠Th17细胞。

从SJL小鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)或Rag2 KO/DO11.10 Tg小鼠(Taconic Farms, Inc.)分离出脾，并制备细胞悬浮液。用细胞过滤网(直径70 μm, Becton, Dickinson and Company)过滤细胞悬浮液，并离心(300×g, 4℃, 5 min)，除去上清液。用ACK溶液(TAKARA BIO INC.)溶血以后，用RPMI1640 (Nacalai Tesque)洗涤细胞，以制备脾细胞。当从SJL小鼠制备时，使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从洗涤过的细胞制备CD4⁺T细胞。

在抗-CD3ε/抗-CD28抗体固相板上培养CD4⁺T细胞。为了培养，使用含有10% 胎牛血清的IMDM培养基(Invitrogen)，所述培养基加入了20 ng/mL小鼠IL-6、3 ng/mL小鼠TGF-β1、20 ng/mL小鼠IL-23、10 μg/mL抗-小鼠IFN-γ抗体、10 μg/mL抗-小鼠IL-4抗体和10 μg/mL抗-小鼠IL-2抗体，通过传代培养适当地维持所述细胞，并诱导分化成Th17细胞。使用分化诱导了5-14天的Th17细胞进行试验。

(2)小鼠Treg细胞的制备

从小鼠脾制备CD4⁺T细胞，并在抗-CD3ε/抗-CD28抗体固相板上培养。为了培养，使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养基，所述培养基加入了20 ng/mL小鼠TGF-β1、100 IU/mL小鼠IL-2、100 nM视黄酸(全反式)和10 μg/mL抗-小鼠IL-6，通过传代培养适当地维持所述细胞，并诱导分化成Treg细胞。使用分化诱导了5-14天的Treg细胞进行试验。

(3)小鼠Th1细胞的制备

从小鼠脾制备CD4⁺T细胞，并在抗-CD3ε/抗-CD28抗体固相板上培养。为了培养，使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养基，所述培养基加入了20 ng/mL小鼠IL-12和10 μg/mL抗-小鼠IL-4，通过传代培养适当地维持所述细胞，并诱导分化成Th1细胞。使用分化诱导了5-14天的Th1细胞进行试验。

(4)小鼠Th2细胞的制备

从小鼠脾制备CD4⁺T细胞，并在抗-CD3抗体/抗-CD28抗体固相板上培养。为了培养，使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养基，所述培养基加入了20 ng/mL小鼠IL-4、5 μg/mL抗-小鼠IFN-γ和5 μg/mL抗-小鼠IL-12，通过传代培养适当地维持所述细胞，并诱导分化成Th2细胞。使用分化诱导了5-14天的Th2细胞进行试验。

(5)小鼠Th0细胞的制备

关于小鼠Th0细胞，从小鼠脾制备CD4⁺T细胞，并在抗-CD3ε/抗-CD28抗体固相板上培养。为了培养，使用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养基，所述培养基加入了10 μg/mL抗-小鼠IL-4、10 μg/mL抗-小鼠IFN-γ和10 μg/mL抗-小鼠IL-12，通过传代培养适当地维持所述细胞，以制备Th0细胞，其用于试验。

参照实施例3. 针对人Embigin的抗体的制备

将表达人Embigin的逆转录病毒导入小鼠细胞中，以制备过表达人Embigin的细胞。用过表达人Embigin的细胞免疫小鼠(Balb/c, 5-周龄, CLEA Japan, Inc.)。在免疫接种以后，得到淋巴细胞，并通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，以得到杂交瘤。

使用用于免疫接种的过表达人Embigin的细胞作为阳性对照细胞，使用与阳性对照细胞相同、但是仅导入载体的宿主细胞作为阴性对照细胞，通过流式细胞术，筛选生产抗-人Embigin抗体的杂交瘤。使用流式细胞计FC500 (Beckman Coulter)，得到表现出杂交瘤阳性反应的杂交瘤(6G1E6和7C4E10)，它们仅与表达Embigin的阳性对照细胞强烈地反应。图6显示了评价结果。

参照实施例4. 人Th17细胞的制备

根据公开的参考文献PNAS (2007); 104: 17034-17039，制备了人Th17细胞。

在含有脂多糖、抗-CD3抗体、抗-IFN-γ抗体、抗-IL-4抗体和抗-IL-12抗体的培养基中，培养从人外周血制备的记忆CD4⁺T细胞和单核细胞3天，进一步在含有抗-CD2抗体/抗-CD3抗体/抗-CD28抗体固相珠子(Cell Activation/Expansion Kit human, Miltenyi Biotec K.K.)、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-23、抗-IFN-γ抗体、抗-IL-4抗体和抗-IL-12抗体的培养基中培养3 - 20天，以造成分化成Th17细胞。

实施例1. 通过蛋白质印迹法评价在Th17细胞中的表达特异性

为了证实在Th17细胞中的表达特异性，通过蛋白质印迹法对比了Treg细胞（它是辅助性T细胞之一）和Th17细胞的Embigin表达水平。

将Th17细胞和Treg细胞（通过从Rag2 KO/DO11.10 Tg小鼠或SJL小鼠脾细胞分化而制备）溶解于含有80 mM NaCl、50 mM Tris-HCl (pH 8)、2 mM CaCl₂、1% Triton X-100和蛋白水解酶抑制剂(Complete^TM, Boehringer Ingelheim)的溶解缓冲液中，并离心(12000 rpm, 4℃, 30 min)。使用上清液作为蛋白溶液。将所述蛋白溶液与样品缓冲液(用于SDS-PAGE，2倍浓缩，含有2-巯基乙醇) (Nacalai Tesque)混合，并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳等量的蛋白。电泳以后，使用Trans-Blot SD半干电泳转移池(BIO-RAD)，将它转移至Immobilon-P (Millipore)。使用转移的膜，进行蛋白质印迹法。为了检测，使用兔抗-Embigin多克隆抗体(IMGENEX)和HRP标记的山羊抗-兔Ig抗体(BIOSOURCE)。通过LAS-3000 (Fujifilm)，使用ECL Plus蛋白质印迹法检测系统(GE Healthcare Japan)，进行检测。

结果显示在图3中。发现Embigin在Treg细胞中几乎不表达，但是在Th17细胞中高度表达。

实施例2. 通过qRT-PCR方法评价在辅助性T细胞中的表达特异性

从Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th0细胞和Treg细胞（通过从Rag2 KO/DO11.10Tg小鼠脾细胞分化而制备），并使用TRIzol (Invitrogen)，制备总RNA。通过TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems)和Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，评价总RNA中的Embigin mRNA的量。通过ABI7900 (Applied Biosystems)进行测量，并同时评价持家基因36B4的表达。在基于36B4表达量的修正以后，以Treg细胞的表达水平作为1，进行计算。

使用Embigin引物(SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4)和36B4引物(SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6)，进行检测。

结果显示在图4中。在小鼠辅助性T细胞中，发现Embigin可用作Th17细胞的标志物，因为它在Th17细胞中特别高地表达。

实施例3. 通过流式细胞术评价细胞膜表面蛋白的Th17细胞特异性

为了评价细胞膜表面蛋白在Th17细胞中的表达特异性，通过流式细胞术，用不同细胞中的表达水平进行了对比。

从SJL小鼠脾细胞分化出Th17细胞、Treg细胞、Th1细胞和Th2细胞，制备，并进行试验。另外，还对没有经过分化诱导的脾细胞和从小鼠外周血制备的红血细胞进行了试验。

使用生产抗-小鼠Embigin抗体的克隆2G23、3E64的培养物上清液，并使用荧光标记的山羊抗-大鼠IgM和IgG抗体(Beckman Coulter, Inc.)作为第二抗体，将Embigin染色。作为抗-小鼠Embigin抗体的阴性对照，以与在参照实施例1中相同的方式用大鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)将细胞染色。关于小鼠脾细胞，为了鉴别B细胞、白细胞和CD3阳性细胞，用荧光标记的抗-小鼠B220抗体(B细胞标志物)、荧光标记的抗-小鼠CD11a抗体(白细胞标志物)或荧光标记的抗-小鼠CD3抗体(CD3阳性的细胞标志物)将它们染色。通过流式细胞术，评价这些样品。使用的流式细胞计是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。使用前向散射和侧向散射直方图，设定对活细胞群的门控，并进行分析。在分析每种B细胞、白细胞、CD3阳性细胞时，进一步设定在B220、CD11a和CD3阳性的级分中的每个门控，并进行分析。通过抗-小鼠Embigin抗体的几何平均值与同种型(大鼠IgG)的几何平均值之比，对比各个样品。

结果显示在图5中。尽管Embigin在B细胞、白细胞、CD3阳性细胞、红血细胞和Treg细胞中的表达水平非常低，与这些细胞相比，Embigin在Th17细胞的细胞膜表面上高度地表达。因而，已经发现，通过检查Embigin的表达，可以检测Th17细胞。

实施例4. 在人Th17细胞中的Embigin表达研究

通过流式细胞术，评价了Embigin在人Th17细胞膜表面上的表达。

在含有12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯、离子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培养基中，处理从外周血分化出的人Th17细胞4小时，并用生产抗-人Embigin抗体的克隆6G1E6、7C4E10的培养物上清液和作为第二抗体的PE标记的山羊抗-小鼠Ig抗体(Beckman Coulter, Inc.)染色。作为抗-人Embigin抗体的阴性对照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)对细胞染色。此外，用APC标记的抗-CD4抗体对细胞染色。使用BD Cytofix/Cytoperm固定/透化溶液试剂盒(Becton, Dickinson and Company)，对这些样品进行透化，并用FITC标记的抗-人IL-17抗体染色。通过流式细胞术，评价这些样品。使用的流式细胞计是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。使用前向散射和侧向散射直方图，设定对活细胞群的门控，并将CD4⁺IL17⁺ 细胞作为Th17细胞进行分析。

结果显示在图7中。已经发现，Embigin在人Th17细胞中表达。

实施例5. 使用经毒素修饰的抗-Embigin抗体造成的小鼠Th17细胞的选择性衰竭(细胞死亡)

使用致病细胞，评价了使用抗-Embigin抗体是否可能造成Th17细胞选择性衰竭(细胞死亡)。

通过参考J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240，制备了致病细胞。

换而言之，与弗氏完全佐剂一起，用PLP肽(SEQ ID NO: 7)免疫SJL小鼠(5-周龄, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)，并在10天后收集淋巴结细胞。在有PLP和IL-23存在下培养5天以后，进一步在有IL-23和IL-2存在下培养所述细胞3 - 5天，以得到致病细胞。

使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从制备的致病细胞制备CD4⁺T细胞。

通过在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠Embigin抗体(2G21、3E64)、抗-IgG、Rat、Goat-Poly、皂草素<Rat-ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培养基中培养36小时，进行细胞除去操作。作为对照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗体，以相同方式处理所述细胞。在含有12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯、离子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培养基中处理反应以后的细胞4小时，并用Per-CP标记的抗-小鼠CD4抗体(COSMO BIO CO., LTD.)、PE标记的抗-小鼠IFNγ抗体(BD Biosciences)和Alexa488标记的抗-小鼠IL17抗体(BD Pharmingen)染色。通过流式细胞术，评价这些样品。使用的流式细胞计是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。将CD4⁺IL17⁺细胞归类为Th17细胞，将CD4⁺IFNγ⁺IL17^-细胞归类为Th1细胞，将CD4⁺IFNγ^-IL17^-细胞归类为其它细胞，并基于对照组中的每种细胞群的测量值（作为100%），评价存活细胞比率。

结果显示在图8中。由于Th17细胞的存活细胞比率显著低于Th1细胞和其它细胞的比率，已经发现，用皂草素（它是一类毒素）修饰的抗-Embigin抗体会选择性地衰竭Th17细胞。

实施例6. 抗-小鼠IgG-缀合的磁性珠子对Th17细胞的选择性衰竭

使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从以与在实施例5相同的方式制备的致病细胞制备CD4⁺T细胞。

将致病细胞和抗-小鼠Embigin抗体(2G23或3E66)在4℃混合30 min，并离心(1000 rpm, 3 min)，以回收细胞。将抗-大鼠IgG抗体修饰的磁性珠子(Dynal)加入回收的细胞中，将它们在4℃混合30 min。除去通过磁性与磁性珠子结合的细胞，重复该操作2次，并回收未与磁性珠子结合的细胞。作为对照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗体。作为对照，使用没有经过细胞除去操作的细胞。

在含有12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯、离子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培养基中处理这些细胞4小时，并用Per-CP标记的抗-小鼠CD4抗体(COSMO BIO CO., LTD.)、PE标记的抗-小鼠IFNγ抗体(BD Biosciences)和Alexa488标记的抗-小鼠IL17抗体(BD Pharmingen)染色。通过流式细胞术，评价这些样品。使用的流式细胞计是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。将CD4⁺IL17⁺ 细胞归类为Th17细胞，将CD4⁺IFNγ⁺IL17^- 细胞归类为Th1细胞，将CD4⁺IFNγ^-IL17^- 细胞归类为其它细胞，并基于对照组中的每种细胞群的测量值（作为100%），评价存活细胞比率。

结果显示在图9中。由于Th17细胞的存活细胞比率显著低于Th1细胞和其它细胞的比率，发现可以选择性地衰竭Th17细胞。

实施例7 . 在小鼠组织(组织集合)中的Embigin的表达

使用每种小鼠组织蛋白印迹诸如INSTA-Blot Mouse Tissue (IMGENEX)等，并与抗-小鼠Embigin抗体(IMGENEX)和HRP标记的山羊抗-兔Ig抗体(BIOSOURCE)反应，以进行蛋白质印迹法。使用ECL Plus蛋白质印迹法检测系统(GE Healthcare Japan)和LAS-3000 (Fujifilm)，进行检测。

实施例8. Embigin在人Th17细胞以外的细胞中的表达研究

通过下述方法，可对比Embigin在不同人细胞中的表达水平。

通过Dynabeads Regulatory CD4⁺CD25⁺ T细胞试剂盒(Invitrogen)，从人外周血分离出CD4⁺CD25⁺T细胞，并使用Dynabeads Human Treg Expander (Invitrogen)放大培养，以制备人Treg细胞，对其进行试验。用生产抗-人Embigin抗体的克隆6G1E6、7C4E10的培养物上清液和作为第二抗体的PE标记的山羊抗-小鼠Ig抗体(Beckman Coulter, Inc.)对人Treg细胞染色。作为抗-人Embigin抗体的阴性对照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)对细胞染色。通过流式细胞计FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)，分析这些样品。

另外，用生产抗-人Embigin抗体的克隆6G1E6、7C4E10的培养物上清液和作为第二抗体的PE标记的山羊抗-小鼠Ig抗体(Beckman Coulter, Inc.)，对人外周血中的细胞染色。作为抗-人Embigin抗体的阴性对照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)对细胞染色。通过流式细胞计FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)，分析这些样品。当细分析外周血中的不同细胞时，用APC标记的抗-CD4抗体对细胞染色以鉴别CD4阳性细胞，或用APC标记的抗-DX5抗体对细胞染色以鉴别NK细胞，或用APC标记的抗-CD11c抗体对细胞染色以鉴别树突细胞，或用APC标记的抗-CD8抗体对细胞染色以鉴别CD8阳性细胞，或用APC标记的抗-CD11b抗体对细胞染色以鉴别巨噬细胞，或用APC标记的抗-B220抗体对细胞染色以鉴别B细胞，各自之后进行流式细胞术分析。

实施例9. 证实Th17细胞在体内的衰竭

通过在J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240中描述的方法，可以证实Th17细胞在体内的选择性衰竭。

用5-或6- (N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)-荧光素3',6'-二乙酸盐(CFSE, DOJINDO LABORATORIES)，标记通过与在实施例5类似的方法制备的致病细胞。

经由尾静脉，将CFSE标记的细胞转移进小鼠中，并施用经毒素修饰的抗-小鼠Embigin抗体。作为对照，使用大鼠IgG替代经毒素修饰的抗-小鼠Embigin抗体，以相同方式处理细胞。在4小时至4天以后，从外周血、脾、中枢神经、淋巴组织等回收细胞。在含有12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯、离子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培养基中处理得到的细胞4小时，并用Per-CP标记的抗-小鼠CD4抗体(COSMO BIO CO., LTD.)、PE标记的抗-小鼠IFNγ抗体(BD Biosciences)或PE标记的抗-小鼠IL17抗体(BD Pharmingen)染色。通过流式细胞术，评价这些样品。设定对活细胞群和CFSF阳性细胞的门控，将CD4⁺IL17⁺细胞归类为Th17细胞，将CD4⁺IFNγ⁺IL17^-细胞归类为Th1细胞，将CD4⁺IFNγ^-IL17^-细胞归类为其它细胞，并基于对照组中的每种细胞群的测量值（作为100%），评价存活细胞比率。

实施例10. Th17细胞衰竭的发作抑制作用的离体证实

通过下述方法，可以证实Th17细胞的选择性衰竭在自身免疫病模型中的发作抑制作用。

以与实施例5相同的方式，使用CD4⁺T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从致病细胞制备CD4⁺T细胞。通过在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠Embigin抗体(2G21、3E64)、抗-IgG、Rat、Goat-Poly、皂草素<Rat-ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培养基中培养36小时，进行细胞除去操作。作为对照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗体。或者，通过使用在实施例6中的磁性珠子，也可能特异性地消除Th17。

通过尾静脉，以3 x 10⁶细胞/只，将经过细胞除去操作以后的细胞施用给对照组的小鼠。随着时间观察四肢和尾巴的麻痹以及体重，并评价EAE (实验性自身免疫性脑脊髓炎)征状。

实施例11. 通过抗体施用来衰竭Th17细胞的发作抑制作用的证实

在自身免疫病模型中，通过下述方法，可以证实Th17细胞的选择性衰竭对疾病发作的抑制作用。

以与实施例5相同的方式，使用CD4⁺T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从致病细胞制备CD4⁺T细胞。以3 x 10⁶细胞/只，从尾静脉给小鼠施用细胞。

在细胞转移的同时，或在发作等以后，将具有细胞衰竭能力的抗-Embigin抗体(例如，皂草素化的抗体、具有ADCC活性的抗体等)施用给小鼠，随着时间观察四肢和尾巴的麻痹以及体重，并以此为基础评价对EAE发作的作用。

或者，将诸如PLP或MOG等肽施用给广泛地使用的小鼠或大鼠以制备EAE模型（根据在Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73., Brain (2004); 127:2201-2213中描述的方法），并在肽施用的同时，在EAE等发作之前，施用具有细胞衰竭能力的抗-Embigin抗体(例如，皂草素化的抗体、具有ADCC活性的抗体等)，并评价对EAE发作的作用。

实施例12. Th17细胞衰竭对复发的抑制作用的证实

由于许多自身免疫疾病表现出重复的征状恶化阶段和缓解阶段，复发的抑制对于治疗而言是重要的。

使用例如EAE模型，可以证实这一点。

在EAE发作以后，或在EAE征状消退以后，将抗-Embigin抗体施用给在Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73., Brain (2004); 127:2201-2213等中描述的EAE模型，并评价对复发的效力。

实施例13. 小鼠组织中的Embigin表达研究

为了研究Embigin在小鼠的每种组织中的表达，使用INSTA-Blot Mouse Tissue (IMGENEX)作为各小鼠组织蛋白印迹，使其与抗-小鼠Embigin抗体(IMGENEX)和HRP标记的山羊抗-兔Ig抗体(BIOSOURCE)反应，以进行蛋白质印迹法。使用ECL Plus蛋白质印迹法检测系统(GE Healthcare Japan)和LAS-3000 (Fujifilm)，进行检测。

结果显示在图10中。尽管证实了Embigin在肌肉和脾中的表达，其表达水平非常低，没有组织强烈地表达Embigin。因此，预期含有抗-Embigin抗体的治疗剂会表现出对身体的每个组织更少的副作用。

实施例14. Th17细胞衰竭的体内证实

根据在J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240中描述的方法，在体内证实了Th17细胞的选择性衰竭。

与弗氏完全佐剂一起，用PLP部分肽(PLP_139-151, SEQ ID NO: 7)免疫5-周龄雌性SJL/J小鼠，并在10天后制备淋巴结细胞。在有PLP和IL-23存在下培养5天以后，进一步在有IL-23和IL-2存在下培养所述细胞3 - 5天，以得到致病细胞。使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从所述致病细胞制备CD4⁺T细胞。该细胞群含有30 - 50%的Th17细胞。通过用于流式细胞术的CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒(Invitrogen)，用二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记该致病细胞。将抗-小鼠Embigin抗体(3E64D1)施用给小鼠，并以1.5 x 10⁷细胞，将CFSE标记的细胞从尾静脉施用给小鼠。作为对照，使用大鼠IgG2b。1天后，从脾得到细胞。通过流式细胞术，评价得到的细胞。计算CFSE阳性细胞的数目，将对照组中的CFSE阳性细胞数目（作为100%）的减少，评价为细胞衰竭率。

结果显示在图11中。经证实，抗-Embigin抗体的施用会以剂量依赖性的方式减少转移的CFSE阳性细胞的数目。该结果已经证实，抗-Embigin抗体可以通过所述抗体的ADCC和CDC活性来减少Th17细胞的数目。已经发现，给个体施用抗-Embigin抗体可以在体内减少Th17细胞的数目。

实施例15. Th17细胞衰竭的发作抑制作用的离体证实

在自身免疫病模型中，通过下述方法证实了Th17细胞的选择性衰竭的发作抑制作用。

与弗氏完全佐剂一起，用PLP部分肽(PLP_139-151)免疫5-周龄雌性SJL/J小鼠，并在10天后制备淋巴结细胞。在有PLP和IL-23存在下培养5天以后，进一步在有IL-23和IL-2存在下培养所述细胞3 - 5天，以得到致病细胞。使用CD4⁺ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec K.K.)，从所述致病细胞制备CD4⁺T细胞。通过在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠Embigin抗体(3E64D1) 1 μg/mL、抗-IgG、Rat、Goat-Poly、皂草素<Rat-ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培养基中培养36小时，进行细胞除去操作。作为对照，使用大鼠IgG2b替代抗-小鼠Embigin抗体。在含有12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯、离子霉素、BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培养基中处理反应以后的一部分细胞4小时，并用Per-CP标记的抗-小鼠CD4抗体(COSMO BIO CO., LTD.)、PE标记的抗-小鼠IFNγ抗体(BD Biosciences)和Alexa488标记的抗-小鼠IL17抗体(BD Pharmingen)对细胞染色。通过流式细胞术，评价这些样品。使用的流式细胞计是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。将CD4⁺IL17⁺细胞归类为Th17细胞，将CD4⁺IFNγ⁺IL17^-细胞归类为Th1细胞，并基于对照组中的每种细胞群的测量值（作为100%），评价存活细胞比率。可以证实Th17细胞选择性的细胞衰竭。结果显示在图12中。

以3 x 10⁶细胞/只，将在细胞除去操作以后的细胞或对照组的细胞从尾静脉转移至小鼠，并随着时间观察四肢和尾巴的麻痹以及体重，并以此为基础评价实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的征状。根据下述标准，以评分来显示征状的严重性水平。

0：没有征状

0.5：尾巴轻度麻痹

1：尾巴麻痹

2：后爪轻度麻痹

3：后爪中等至严重麻痹，或前肢轻度麻痹

4：后爪完全麻痹，或前肢中等至严重麻痹

5：四肢麻痹或处于生死攸关期

6：死亡

结果显示在图13中。通过使用抗-Embigin抗体对Th17细胞的选择性衰竭，完全抑制了EAE征状。

实施例16. 通过抗体施用实现的Th17细胞衰竭的发作抑制作用的证实

使用活动的EAE发作模型（它是一种自身免疫病模型），证实了抗-Embigin抗体的EAE发作抑制作用。

(1)活动的EAE发作模型的制备

使用EAE小鼠，它是一种多发性硬化动物模型。通过SD. Miller等人的方法(Curr. Protoc. Immunol. 2010; 88:15.1.1-15.1.20.)引起EAE。也就是说，将与弗氏完全佐剂混合的PLP部分肽(PLP_139-151) (150 μg)皮下地注射给9-周龄雌性SJL/J小鼠(购自CHARLES RIVER)的下背部。随时间观察四肢和尾巴的麻痹以及体重，并评价EAE征状。EAE征状的评分遵循实施例15。

(2)抗体施用和用于预防疾病发作的评价

将抗-Embigin抗体(3E64D1)悬浮于PBS溶液中，并以0.3 μg/小鼠，静脉内地施用给在上述(1)中制备的小鼠。将大鼠IgG2b静脉内地施用给对照组。在肽致敏以后第7天和第14天进行施用，每天1次。随时间观察四肢和尾巴的麻痹以及体重，并评价EAE征状。

结果显示在图14中。抗-Embigin抗体的施用完全抑制了EAE病状的发作。所述结果已经证实，抗-Embigin抗体可以抑制多发性硬化(MS)的发作。

实施例17. Th17细胞衰竭对复发的抑制作用的证实

使用EAE模型证实了这一点。在EAE发作以后，将抗-Embigin抗体施用给在Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73., Brain (2004); 127:2201-2213等中描述的EAE模型，并评价对复发的效力。使用临床评分和体重作为指标，将在肽致敏以后第12天表现出发作的动物分组。在肽免疫接种第12天分组以后马上，和在第19天，静脉内地施用抗-Embigin抗体(3E64D1)，每天1次。此后，评价对EAE征状的作用。EAE征状的评分遵循在实施例15中所示的标准。

结果显示在图15中。经证实，抗-Embigin抗体的施用会快速地降低临床评分。在对照组中没有观察到在第23天的恶化。该结果已经证实，抗-Embigin抗体会促进多发性硬化(MS)缓解的诱导并抑制恶化，且因此，它可以用作多发性硬化的缓解诱导剂或恶化抑制剂。

工业实用性

根据本发明，可以提供自身免疫疾病（诸如多发性硬化等）和变应性疾病的治疗剂以及针对Th17细胞的细胞毒性剂。此外，本发明也可以提供可用于药物递送系统中的抗-Embigin抗体，所述药物递送系统可以将药物等选择性地且有效地递送给Th17细胞，以及Th17细胞标志物、用于Th17细胞检测的试剂和方便的Th17细胞检测方法。

本申请是基于在日本提交的专利申请号2010-127316 (提交日：2010年6月2日)，其内容全部并入本文中。

序列表

<110> Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

<120> 自身免疫疾病和变应性疾病的治疗药

<130> 091723

<150> JP 2010-127316

<151> 2010-06-02

<160> 9

<170> PatentIn 3.4版

<210> 1

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Ala Leu Pro Gly Leu Leu Glu Ala Arg Ala Arg Thr Pro Arg

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Gln Cys Leu Leu Ala Ala Ala Arg Pro Ser Ser Ala

20 25 30

Asp Gly Ser Ala Pro Asp Ser Pro Phe Thr Ser Pro Pro Leu Arg Glu

35 40 45

Glu Ile Met Ala Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ser His Asn Ile Ser Leu

50 55 60

Thr Glu His Ser Ser Met Pro Val Glu Lys Asn Ile Thr Leu Glu Arg

65 70 75 80

Pro Ser Asn Val Asn Leu Thr Cys Gln Phe Thr Thr Ser Gly Asp Leu

85 90 95

Asn Ala Val Asn Val Thr Trp Lys Lys Asp Gly Glu Gln Leu Glu Asn

100 105 110

Asn Tyr Leu Val Ser Ala Thr Gly Ser Thr Leu Tyr Thr Gln Tyr Arg

115 120 125

Phe Thr Ile Ile Asn Ser Lys Gln Met Gly Ser Tyr Ser Cys Phe Phe

130 135 140

Arg Glu Glu Lys Glu Gln Arg Gly Thr Phe Asn Phe Lys Val Pro Glu

145 150 155 160

Leu His Gly Lys Asn Lys Pro Leu Ile Ser Tyr Val Gly Asp Ser Thr

165 170 175

Val Leu Thr Cys Lys Cys Gln Asn Cys Phe Pro Leu Asn Trp Thr Trp

180 185 190

Tyr Ser Ser Asn Gly Ser Val Lys Val Pro Val Gly Val Gln Met Asn

195 200 205

Lys Tyr Val Ile Asn Gly Thr Tyr Ala Asn Glu Thr Lys Leu Lys Ile

210 215 220

Thr Gln Leu Leu Glu Glu Asp Gly Glu Ser Tyr Trp Cys Arg Ala Leu

225 230 235 240

Phe Gln Leu Gly Glu Ser Glu Glu His Ile Glu Leu Val Val Leu Ser

245 250 255

Tyr Leu Val Pro Leu Lys Pro Phe Leu Val Ile Val Ala Glu Val Ile

260 265 270

Leu Leu Val Ala Thr Ile Leu Leu Cys Glu Lys Tyr Thr Gln Lys Lys

275 280 285

Lys Lys His Ser Asp Glu Gly Lys Glu Phe Glu Gln Ile Glu Gln Leu

290 295 300

Lys Ser Asp Asp Ser Asn Gly Ile Glu Asn Asn Val Pro Arg His Arg

305 310 315 320

Lys Asn Glu Ser Leu Gly Gln

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgcgcgccc tccccggcct gctggaggcc agggcgcgta cgccccggct gctcctcctc 60

cagtgccttc tcgctgccgc gcgcccaagc tcggcggacg gcagtgcccc agattcgcct 120

tttacaagtc cacctctcag agaagaaata atggcaaata acttttcctt ggagagtcat 180

aacatatcac tgactgaaca ttctagtatg ccagtagaaa aaaatatcac tttagaaagg 240

ccttctaatg taaatctcac atgccagttc acaacatctg gggatttgaa tgcagtaaat 300

gtgacttgga aaaaagatgg tgaacaactt gagaataatt atcttgtcag tgcaacagga 360

agcaccttgt atacccaata caggttcacc atcattaata gcaaacaaat gggaagttat 420

tcttgtttct ttcgagagga aaaggaacaa aggggaacat ttaatttcaa agtccctgaa 480

cttcatggga aaaacaagcc attgatctct tacgtagggg attctactgt cttgacatgt 540

aaatgtcaaa attgttttcc tttaaattgg acctggtaca gtagtaatgg gagtgtaaag 600

gttcctgttg gtgttcaaat gaataaatat gtgatcaatg gaacatatgc taacgaaaca 660

aagctgaaga taacacaact tttggaggaa gatggggaat cttactggtg ccgtgcacta 720

ttccaattag gcgagagtga agaacacatt gagcttgtgg tgctgagcta tttggtgccc 780

ctcaaaccat ttcttgtaat agtggctgag gtgattcttt tagtggccac cattctgctt 840

tgtgaaaagt acacacaaaa gaaaaagaag cactcagatg aggggaaaga atttgagcag 900

attgaacagc tgaaatcaga tgatagcaat ggtatagaaa ataatgtccc caggcataga 960

aaaaatgagt ctctgggcca gtga 984

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> embigin引物

<400> 3

gtacatgggt aatgaaaccg caca 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> embigin引物

<400> 4

gcacaaccag ctcattctgc tc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 36B4引物

<400> 5

gaggaatcag atgaggatat ggga 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 36B4引物

<400> 6

aagcaggctg acttggttgc 20

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PLP肽

<400> 7

His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

Met Arg Ser His Thr Gly Leu Arg Ala Leu Val Ala Pro Gly Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ala Ala Thr Arg Pro Asp Pro Ala Glu

20 25 30

Gly Asp Pro Thr Asp Pro Thr Phe Thr Ser Leu Pro Val Arg Glu Glu

35 40 45

Met Met Ala Lys Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys Ser Cys Asn Ile Ser

50 55 60

Val Thr Glu Lys Ser Asn Val Ser Val Glu Glu Asn Val Ile Leu Glu

65 70 75 80

Lys Pro Ser His Val Glu Leu Lys Cys Val Tyr Thr Ala Thr Lys Asp

85 90 95

Leu Asn Leu Met Asn Val Thr Trp Lys Lys Asp Asp Glu Pro Leu Glu

100 105 110

Thr Thr Gly Asp Phe Asn Thr Thr Lys Met Gly Asn Thr Leu Thr Ser

115 120 125

Gln Tyr Arg Phe Ile Val Phe Asn Ser Lys Gln Leu Gly Lys Tyr Ser

130 135 140

Cys Val Phe Gly Glu Lys Glu Leu Arg Gly Thr Phe Asn Ile His Val

145 150 155 160

Pro Lys Ala His Gly Lys Lys Lys Ser Leu Ile Ala Tyr Val Gly Asp

165 170 175

Ser Thr Val Leu Lys Cys Val Cys Gln Asp Cys Leu Pro Leu Asn Trp

180 185 190

Thr Trp Tyr Met Gly Asn Glu Thr Ala Gln Val Pro Ile Asp Ala His

195 200 205

Ser Asn Glu Lys Tyr Ile Ile Asn Gly Ser His Ala Asn Glu Thr Arg

210 215 220

Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Glu Glu Asp Gly Gly Ser Tyr Trp Cys

225 230 235 240

Arg Ala Thr Phe Gln Leu Gly Glu Ser Glu Glu Gln Asn Glu Leu Val

245 250 255

Val Leu Ser Phe Leu Val Pro Leu Lys Pro Phe Leu Ala Ile Leu Ala

260 265 270

Glu Val Ile Leu Leu Val Ala Ile Ile Leu Leu Cys Glu Val Tyr Thr

275 280 285

His Lys Lys Lys Asn Asp Pro Asp Ala Gly Lys Glu Phe Glu Gln Ile

290 295 300

Glu Gln Leu Lys Ser Asp Asp Ser Asn Gly Ile Glu Asn Asn Val Pro

305 310 315 320

Arg Tyr Arg Lys Thr Asp Ser Ala Asp Gln

325 330

<210> 9

<211> 993

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 9

atgcgctcgc acactggcct gagggcgctt gtggcgcctg gttacccgct cctccttcta 60

tgtcttctgg cggcgacgcg ccctgatccg gctgagggcg atcccacaga tccaactttt 120

acaagtctac ctgttcgaga agaaatgatg gcgaaatact caaacctttc cttaaagagc 180

tgtaatatct cagtgacgga aaagtccaat gtatcagtag aagagaacgt aattttggaa 240

aagccttctc atgtggaact caaatgcgtg tacacagcaa ctaaggattt gaacttgatg 300

aatgtgactt ggaagaaaga tgatgagccc cttgagacta cgggtgactt caatacaact 360

aaaatgggca acaccttaac cagtcagtac aggttcatcg tttttaatag caaacaattg 420

ggaaaatatt cttgtgtctt tggagaaaag gaactaagag ggacctttaa catccacgta 480

cccaaagctc atgggaaaaa aaagtcgttg atcgcttacg tgggggattc tactgtgctg 540

aagtgtgtat gtcaagattg tcttccttta aattggactt ggtacatggg taatgaaacc 600

gcacaggttc ccattgacgc tcactcgaat gaaaagtata tcatcaatgg ttcccatgcc 660

aatgaaacaa ggctcaagat taagcatctt ttggaggaag atggaggatc ctactggtgt 720

cgtgccacct tccagttagg ggagagtgag gagcagaatg agctggttgt gctgagcttc 780

ctggtgcccc tcaagccatt tctggccata cttgccgaag tcatcctctt ggtggccatc 840

attctgcttt gtgaagtgta cacacacaag aaaaagaatg acccagatgc tgggaaagaa 900

tttgaacaaa ttgaacagct gaaatcagat gatagcaatg gcatagaaaa caatgtcccc 960

cggtacagaa aaactgactc tgcagatcag tga 993

Claims

1. 一种用于预防和/或治疗自身免疫病或变应性疾病的药剂，所述药剂包含抗-Embigin抗体。

2. 根据权利要求1所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

3. 根据权利要求1所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

4. 根据权利要求3所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

5. 根据权利要求1所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

6. 根据权利要求5所述的药剂，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

7. 根据权利要求1-6中任一项所述的药剂，其中所述疾病与Th17细胞有关。

8. 根据权利要求1-6中任一项所述的药剂，其中所述疾病是：多发性硬化、银屑病、风湿病、炎性肠病、接触性超敏反应、类固醇抵抗型哮喘、慢性非传染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、肾小球肾炎或特应性皮炎。

9. 根据权利要求1-6中任一项所述的药剂，其中所述疾病是多发性硬化。

10. 一种针对Th17细胞的细胞毒性剂，所述细胞毒性剂包含抗-Embigin抗体。

11. 根据权利要求10所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性或细胞毒性诱导活性。

12. 根据权利要求10所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性诱导活性。

13. 根据权利要求12所述的药剂，其中所述具有细胞毒性诱导活性的抗-Embigin抗体的亚类是IgG1、IgG3或IgM。

14. 根据权利要求10所述的药剂，其中所述抗-Embigin抗体具有细胞毒性。

15. 根据权利要求14所述的药剂，其中所述具有细胞毒性的抗-Embigin抗体与细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素缀合。

16. 一种用于将药物递送给Th17细胞的药物递送系统，所述药物递送系统使用抗-Embigin抗体。

17. 根据权利要求16所述的药物递送系统，其中所述抗-Embigin抗体与前述药物缀合。

18. 根据权利要求16或17所述的药物递送系统，其中所述药物是细胞毒性物质、化学治疗剂或放射性同位素。

19. 一种用于检测Th17细胞的试剂，所述试剂包含抗-Embigin抗体。

20. 根据权利要求19所述的试剂，其中所述抗-Embigin抗体被荧光物质或放射性同位素所标记。

21. 一种用于检测Th17细胞的试剂，所述试剂包含能够特异性地检测Embigin基因转录产物的核酸。

22. 一种用于检测Th17细胞的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求19-21中任一项所述的试剂。

23. 一种用于检测Th17细胞的方法，所述方法包括：测量Embigin的表达。

24. 根据权利要求23所述的方法，所述方法包括：测量Embigin在得自试验动物的细胞中的表达。

25. 根据权利要求24或25所述的方法，所述方法包括：使用根据权利要求19-21中任一项所述的试剂，测量Embigin的表达。

26. Embigin或Embigin基因转录产物作为标志物分子在检测Th17细胞中的用途。