JPH1075781A - ヒトプロテアソームサブユニットｐ５８蛋白質及びそれに特異的な抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明はヒト２６Ｓプロテアソームの構成因
子であるサブユニットＰ５８及びその遺伝子の同定、さ
らにはサブユニットＰ５８に対する抗体、ポリヌクレオ
チドプローブ及びアンチセンスポリヌクレオチドを提供
することを目的とするものである。 【解決手段】 牛赤血球細胞の２６Ｓプロテアソーム制
御因子群から５８ｋＤの分子量を持つ構成因子（ポリペ
プチド）を単離し、該構成因子のフラグメントに対する
相補的ポリヌクレオチドをプローブとしてヒトｃＤＮＡ
ライブラリーからヒト２６Ｓプロテアソームの構成因子
であるサブユニットＰ５８のｃＤＮＡを同定し、該サブ
ユニットＰ５８のアミノ酸配列及びそれをコードする遺
伝子の塩基配列を明らかにする。また、前記サブユニッ
トＰ５８に対する抗体を提供する。さらに、前記サブユ
ニットＰ５８に対するポリヌクレオチドプローブ、アン
チセンスポリヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２６Ｓプロテアソ
ームに関するものであり、さらに詳しくは該プロテアソ
ームのサブユニットＰ５８のポリペプチド、および該ポ
リペプチドをコードする遺伝子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】プロテアソームは、別名、多機能性プロ
テアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネル
ギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。本
酵素は、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在してお
り、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓では、全
可溶性蛋白質の１％も占める。

【０００３】該酵素は同一分子内に複数の触媒活性部位
を持ち、トリプシン型酵素の基質である塩基性アミノ
酸、キモトリプシン型酵素の基質である中性アミノ酸、
そしてプロテアーゼとしては稀な酸性アミノ酸を含む合
成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する
活性がある。

【０００４】しかしながら、種々の既知の阻害剤の中で
特異的で有効に作用するものがないことから、該酵素
は、既知のプロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つ
と推定されている。

【０００５】また、該酵素は構造的には、１４種類（α
型７種類、β型７種類）の異なるサブユニットのダイマ
ーからなる総数２８個の多成分複合体である。

【０００６】また、沈降係数２０Ｓ、分子量は約７５万
と推定され、プロテアーゼとしては例外的に大きい。

【０００７】また、該酵素を電子顕微鏡で観察すると７
種類のサブユニットが環状構造を形成し、これがα(1-
7) β(1-7) β(1-7) α(1-7) の４層構造をとる特異的
な分子形状を有していることが認められた（臨床免疫、
25、1578-1589 、1993）。

【０００８】さらに、ヒトプロテアソームは、少なくと
も１４種類のサブユニットより、構成されていることが
わかり、このうちα型サブユニット群として、ＨＣ２、
ＨＣ３、ＨＣ８、ＨＣ９（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ． Ａｃｔａ．，１０８９，９５−１０２，１９
９１）、β型サブユニット群として、ＨＣ５（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．，１０８９，
９５−１０２，１９９１）、ＨＣ７−Ｉ、ＨＣ−１０Ｉ
Ｉ、ＨＮ３（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａ
ｃｔａ．，１２１９，３６１−３６８，１９９４）、ｈ
ＬＭＰ７（Ｎａｔｕｒｅ，３５３，３５７−３６０，１
９９１）、ｈＬＭＰ２（Ｎａｔｕｒｅ，３５３，６６７
−６６８，１９９１）、Ｘ、Ｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６
５，１２３１−１２３４，１９９４）等の１次構造が明
かになった。

【０００９】かかるプロテアソームは、非リソゾーム系
蛋白質分解経路における主要酵素であり、蛋白質の修飾
による機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩な生
理作用を有していると推定される。

【００１０】さらに、最近、プロテアソームが内在性抗
原のプロセシング酵素であると考えられており、注目さ
れている。これは、クラスＩ ＭＨＣ抗原の提示に欠陥
をもつＢ細胞変異株が分離され、それらがクラスＩＩ
ＭＨＣ領域約２００ｋｂに欠失のあることが判明したこ
とによる。この領域には、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２とよばれ
るペプチドを細胞質から小胞体へ移送させるトランスポ
ーター蛋白質の遺伝子がコードされており、その近傍に
は、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７とよばれるプロテアソームのサ
ブユニットをコードする遺伝子が存在することが判明
し、プロテアソームの内在性抗原のプロセシングにおけ
る重要性が高まっている（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２，８１，１９９２）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】プロテアソームは、こ
のような２０Ｓ型複合体として見いだされた。

【００１２】さらに、本発明者等は最近、多数の制御因
子群がこの２０Ｓプロテアソームに可逆的に結合し、分
子量約２００万、沈降係数２６Ｓの巨大な複合体を形成
していることを見いだし、２６Ｓプロテアソームと命名
した（特開平５−２９２９６４号公報、特開平６−０２
２７５９号公報）。

【００１３】しかしながら、ヒトプロテアソームを構成
するサブユニットのうち、この２６Ｓプロテアソーム制
御因子群の詳細は明かにされておらず、そのサブユニッ
トの詳細を明かにし、各種病態の診断、および治療法を
確立することが強く要請されている。

【００１４】そこで、本願発明者らは、このような状況
を踏まえ、上記２６Ｓプロテアソームについて、その構
成因子である個々のサブユニットの構造、機能等につい
て鋭意研究を重ねた結果、新規な多機能プロテアーゼ、
すなわち、ヒトのプロテアソームの構成因子であるサブ
ユニットＰ５８について解明し、本発明を完成するに至
った。

【００１５】すなわち、本発明はヒト２６Ｓプロテアソ
ームの構成因子のサブユニットＰ５８のポリペプチドの
アミノ酸配列を提供することを目的とするものである。

【００１６】また、本発明は上記ヒトプロテアソームの
構成因子のうちサブユニットＰ５８のポリペプチドをコ
ードする遺伝子の塩基配列を提供することを目的とする
ものである。

【００１７】さらに、本発明はサブユニットＰ５８に対
する抗体、ポリヌクレオチドプローブ及びアンチセンス
ポリヌクレオチドを提供することを目的とするものであ
る。

【００１８】さらに、本発明は、前記抗体やポリヌクレ
オチドを利用したヒトプロテアソームの酵素機能の解明
に使用可能な方法および、免疫疾患をはじめ各種病態の
診断に有用な方法を提供することを目的とするものであ
る。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記目
的を達成可能とするため、前記プロテアソームについ
て、その構成因子である個々のサブユニットの構造、機
能等について詳細に研究を重ねた結果、ヒトの２６Ｓプ
ロテアソームの構成因子であるサブユニットＰ５８につ
いて解明した。

【００２０】さらに、上記の知見に基づき、各種病態の
診断に有用な方法を提供することが可能となった。

【００２１】すなわち、本発明者らは、上記サブユニッ
トＰ５８を単離すること、上記サブユニットＰ５８のポ
リペプチドのアミノ酸配列を決定すること、さらに上記
サブユニットＰ５８のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの塩基配列及びアンチセンスポリヌクレオチ
ドの塩基配列を決定した。

【００２２】さらに本発明においては、上記ポリペプチ
ドＰ５８の相補的ポリヌクレオチドをプローブとして用
いることにより各種ヒト臓器での該サブユニットのｍＲ
ＮＡ発現量を定量可能とする。

【００２３】また、本発明においてはサブユニットＰ５
８の抗体を作製可能とし、上記抗体を用いた各種細胞に
おけるこれらのサブユニットを免疫測定により定量可能
とする。

【００２４】より詳しくは、本発明は、上記の目的を達
成するため、本発明者等の方法（特開平５−２９２９６
４号公報、特開平６−０２２７５９号公報）を用いて、
ヒト２６ＳプロテアソームサブユニットＰ５８を電気泳
動法で単離同定し、得られるポリペプチドのフラグメン
トのアミノ酸配列からサブユニットＰ５８のアミノ酸配
列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩
基配列を決定し、さらに上記の知見に基づき、サブユニ
ットＰ５８の全アミノ酸配列を決定するものである。

【００２５】さらに、本発明は、サブユニットＰ５８の
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドの相補的ポリヌクレオチドを作製可能とし、これを
用いて各種ヒト臓器におけるプロテアソームｍＲＮＡの
発現量を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方
法に使用可能とするものである。

【００２６】さらに、本発明は、ヒトプロテアソームサ
ブユニットＰ５８に対する抗体を作成可能とし、これら
の抗体を用いて、各種細胞中のそれぞれのサブユニット
を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法に使
用可能とするものである。

【００２７】さらに、本発明は前記サブユニットＰ５８
をコードする塩基配列よりアンチセンスポリヌクレオチ
ドを提供可能とし、該アンチセンスポリヌクレオチドを
利用した疾患の治療方法を提供するものである。

【００２８】上記をさらに具体的に以下に述べる。

【００２９】本発明は、配列表の配列番号１に記載のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。

【００３０】また、本発明は、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列のうち、１又は２以上のアミノ酸を置
換、欠失又は付加した前記に記載のポリペプチドの変異
体であって、前記ポリペプチドを含むプロテアソームが
有する、２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼ活性をア
クチベートする活性を、実質的に有するポリペプチドに
関する。

【００３１】また、本発明は、前記ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに関する。

【００３２】また、本発明は、配列表の配列番号２に記
載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに関する。

【００３３】また、本発明は、前記記載のポリペプチド
のうち連続する少なくとも８のアミノ酸からなるポリペ
プチドに関する。

【００３４】また、本発明は、前記記載のポリヌクレオ
チドのうち連続する少なくとも１２の塩基からなるポリ
ヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチドに関
する。

【００３５】また、本発明は、前記記載のポリペプチド
に反応する抗体に関する。

【００３６】また、本発明は、プロテアソームサブユニ
ットＰ５８を、該サブユニットとその抗体との特異性を
利用して測定して疾患を診断するためのキットであっ
て、前記記載の抗体を含むことを特徴とする疾患診断用
キットに関する。

【００３７】また、本発明は、プロテアソームサブユニ
ットＰ５８のｍＲＮＡを測定して疾患を診断するための
キットであって、前記記載の少なくとも１２の塩基から
なるポリヌクレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオ
チドを含むことを特徴とする疾患診断用キットに関す
る。

【００３８】また、本発明は前記のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドによっ
て宿主細胞を形質転換した形質転換体に関し、好ましく
は、該宿主細胞が大腸菌である前記の形質転換体に関す
る。

【００３９】また、本発明は、前記のポリペプチドに対
するアンチセンスポリヌクレオチド又はそのフラグメン
トであって、プロテアソームサブユニットＰ５８の生合
成を抑制できることを特徴とするアンチセンスオリヌク
レオチド又はそのフラグメントに関する。

【００４０】なお、本明細書および図面において、塩基
やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ- Ｉ
ＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用の略号を
使用した。

【００４１】 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａｌａ （Ａ） アラニン Ａｒｇ （Ｒ） アルギニン Ａｓｎ （Ｎ） アスパラギン Ａｓｐ （Ｄ） アスパラギン酸 Ｃｙｓ （Ｃ） システイン Ｇｌｎ （Ｑ） グルタミン Ｇｌｕ （Ｅ） グルタミン酸 Ｇｌｙ （Ｇ） グリシン Ｈｉｓ （Ｈ） ヒスチジン Ｉｌｅ （Ｉ） イシロイシン Ｌｅｕ （Ｌ） ロイシン Ｌｙｓ （Ｋ） リジン Ｍｅｔ （Ｍ） メチオニン Ｐｈｅ （Ｆ） フェニルアラニン Ｐｒｏ （Ｐ） プロリン Ｓｅｒ （Ｓ） セリン Ｔｈｒ （Ｔ） スレオニン Ｔｒｐ （Ｗ） トリプトファン Ｔｙｒ （Ｙ） チロシン Ｖａｌ （Ｖ） バリン

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。

【００４２】（ヒト２６Ｓプロテアソームのサブユニッ
トＰ５８のポリペプチド）以下で説明する方法により塩
基配列が決定されたヒト２６Ｓプロテアソームのサブユ
ニットＰ５８のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドから決定されるサブユニットＰ５８のポリペプチド
のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸
配列である。前記ポリペプチドの計算上の分子量は、６
０８４９であり、等電点は、８．４５である。

【００４３】本発明に係るサブユニットＰ５８は、上記
のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していない
ポリペプチド、および上記アミノ酸配列のＮ末端にヒト
プロテアソームのサブユニットＰ５８のためのシグナル
ペプチドの一部もしくは全部が結合した中間体又は欠損
した中間体も含包する。

【００４４】また、自然の変異によりまたは人工の変異
により、ポリペプチドの主たる活性に変化を与えること
なく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を
変化させることが可能である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，１５．１−１５．１１３
ページ参照）。このとき、前記のＤＮＡがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列は、１又は２以上のアミノ酸
が置換、欠失又は付加された変異体となる場合がある。
本発明のヒトプロテアソームのサブユニットＰ５８のポ
リペプチドは、該変異体に相当する構造を有するポリペ
プチドも含包する。

【００４５】（ヒト２６Ｓプロテアソームの調製）本発
明に係るヒト２６Ｓプロテアソームは本発明者等の方法
（特開平５−２９２９６４号公報）に準じ、ヒト細胞、
組織細胞等の各種動物細胞から、バイオゲルーＡ、Ｑー
セファロス、ハイドロキシアパタイトを吸着体としたク
ロマトグラフィー、グリセロール密度勾配遠心法等の操
作で単一に精製することが可能である。

【００４６】さらに、２６Ｓプロテアソーム制御因子群
のみの精製は、以下の方法、すなわち、ヒト株化細胞、
組織細胞等をはじめ各種動物細胞から出発物質を調製
し、バイオゲル、ハイドロキシアパタイト、グリセロー
ルグラディエント等の方法により調製可能である。

【００４７】以下、その調製法を順に説明する。

【００４８】（１）ヒト細胞や組織等を緩衝液（２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ β−
メルカプトエタノール、２ｍＭ ＡＴＰ、 ２５０ｍＭ
Ｓｕｃｒｏｓｅ）を用いてホモジナイズし、さらに１
００００×ｇで３０分間遠心する。

【００４９】（２）上記遠心で得られた上澄をさらに７
００００×ｇで１時間遠心する。

【００５０】（３）得られた上澄をさらに７００００×
ｇで５時間遠心する。

【００５１】（４）得られた沈殿物を２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭβ−メルカプトエ
タノール、０．５ｍＭ ＡＴＰ、２０％グリセロールの
緩衝液（緩衝液Ａとする）に懸濁する。

【００５２】（５）得られた懸濁サンプルを緩衝液Ａで
平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ（バイオラッド社）１．
５ｍカラムにより２６Ｓプロテアソーム画分を集める。
２６Ｓ画分の分画にはプロテアーゼ活性としてキモトリ
プシン様活性、トリプシン様活性、Ｖ８プロテアーゼ様
活性、ユビキチン分解活性（特開平５−２９２９６４号
公報）を指標とすることが可能である。

【００５３】（６）上記画分を濃縮し、１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール、０．５ｍＭ ＡＴＰ、２０％グリセロールで平
衡化したハイドロキシアパタイトカラムにより、１０−
３００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のグラジエン
ト（１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ
ＡＴＰ、２０％グリセロール）により精製する。

【００５４】（７）得られた各分画を２６Ｓプロテアソ
ーム抗体（徳島大学酵素科学研究センターより入手可
能）を用いて、イムノブロティング法（Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ
ｄ．，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｐ４７１−５１
０，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８８）により同定し、反応画分を分
離回収した後濃縮する。

【００５５】（８）さらに１０−３０％のグリセロール
グラディエント（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、２ｍ
Ｍ ＡＴＰ）で２５０００回転で２２時間遠心による分
画後、２６Ｓ制御因子群を含む画分を（７）と同様にイ
ムノブロティング法により同定し、制御因子群を分離精
製することが可能である。

【００５６】以上説明した方法の他にも、各種クロマト
グラフィーを組み合わせることにより、サブユニットＰ
５８を含むプロテアソームの精製は可能である。例えば
牛赤血球細胞からは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９，３５３９−３５４７，１９９４に記載の方法に準じ
て、硫酸アンモニウムによる沈殿の後、セファクリルＳ
−３００Ｓ、ＤＥＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、ハイドロ
キシアパタイトカラム等による分離精製が可能である。

【００５７】なお、これら精製した２６Ｓ制御因子画分
は２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼの活性をアクチ
ベートする活性がある。この活性を見る方法は実施例１
の（１−７）に示した。

【００５８】精製したサブユニットＰ５８を含む２６Ｓ
プロテアソーム画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動法（ＳＤＳーＰＡＧＥ,Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ
Ｄａｖｉｄ ｌａｎｅ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６３６−６４
０，１９８８）や、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ等による２次元
電気泳動（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，４００７
−４０２１，１９７５）により分離した後、ゲルをクマ
シー染色すると、分子量２１−３２ｋＤの十数個の２０
Ｓプロテアソームによるバンドとともに、分子量３０−
１１０ｋＤの制御因子群が含まれたバンドが観察され
る。

【００５９】また精製しサブユニットＰ５８を含む制御
因子群はＳＤＳ−ＰＡＧＥや２次元電気泳動により、分
子量３０−１１０ｋＤの制御因子群のみのバンドとして
観察される。

【００６０】（サブユニットＰ５８の単離）上記ＳＤＳ
−ＰＡＧＥや２次元電気泳動によるバンドからサブユニ
ットＰ５８を単離するには、分子量約５８ｋＤのバンド
を選ぶことにより可能である。

【００６１】すなわち電気泳動法より分離同定されたサ
ブユニットＰ５８をポリビニリデンジフルオロダイド
（ＰＶＤＦ）等にトランスファーすることが可能であ
る。

【００６２】（プローブの作成）上記の処理後、リジル
エンドペプチダーゼなどによる各種酵素処理によりポリ
ペプチドフラグメントの混合物とし、得られたペプチド
フラグメントの混合物を高速液体クロマトグラフィーで
分離する。

【００６３】上記得られたポリペプチドフラグメントの
いくつかのフラグメントのアミノ酸配列を自動アミノ酸
シークエンサー等を用いて決定することが可能である。

【００６４】上記の解析によって得られたアミノ酸配列
の一部の情報をもとに、ポリヌクレオチドの検索に必要
なプローブは、得られたポリペプチドフラグメントのう
ち縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補的
ポリヌクレオチドとして合成して作成することにより可
能である。

【００６５】また、複数のアミノ酸配列が得られた場合
は、対応する相補的ポリヌクレオチドを組み合わせて、
ヒトのｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法（例えば、Ｍｉｃ
ｈａｅｌ Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，斎
藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１
９９１年）により、より長い断片のＤＮＡプローブを得
ることが可能である。

【００６６】以上のようにして、ヒトプロテソームのサ
ブユニットＰ５８をスクリーニングするためのＤＮＡプ
ローブが得られる。

【００６７】（相補鎖ＤＮＡライブラリーの作製および
スクリーニング）本発明においてポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをスクリーニングするためのｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、一般的な方法を使用可能で
あり例えば次のステップにより可能である。

【００６８】すなわち、（ｉ）ヒトプロテアソーム産生
細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチ
ド（ｃＤＮＡ）を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合
成し、（ｉｉｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミド
またはファージに組み込み、（ｉｖ）得られた組換えプ
ラスミドまたはファージにより適当な宿主細胞を形質転
換し、（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体
から、適当な方法、例えばコロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーションにより、目
的とするポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたは
ファージを単離し、（ｖｉ）そのプラスミドまたはファ
ージから目的とするポリヌクレオチドを切り出し、（ｖ
ｉｉ）該クローン化ポリヌクレオチドを適当なプラスミ
ドにサブクローニングする、というステップである。

【００６９】各ステップについてさらに詳しく説明す
る。

【００７０】ステップ（ｉ）：ヒトプロテアソームのサ
ブユニットＰ５８のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
は、種々の動物の組織、器官、産生細胞から、より具体
的には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、胸腺、肝癌細胞
株、腎臓癌細胞株などから得ることができる。

【００７１】また該酵素産生細胞から全ＲＮＡを調製す
る方法としては、グアニジウム／セシウムクロライド法
（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍｕ／Ｃｅｓｉｕｍｕ Ｃｈｌｏｒ
ｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９４−１９６，１９８２）やグアニジウ
ムチオシアネート法 （Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．
ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１６２，１５６−１５９，１９８７）等が
一般に用いられる。

【００７２】上記操作により得られる全ＲＮＡからのｍ
ＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴ−セルロース
（コラボレイティブ リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））やオリゴテックス−
ｄＴ３０（タカラ社）等を用いて吸着カラム法またはバ
ッチ法により実施できる。

【００７３】ステップ（ｉｉ）：このようにして得られ
たｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオ
カヤマ−バーグ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅ
ｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｏｌｏｇｙ，３，２８０，１９８３）やグブ
ラーとホフマンの方法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｖ．ａｎｄＨｏ
ｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６
９，１９８３）等に従いｃＤＮＡを合成する。

【００７４】ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡを
プラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラ
リーを調製する。

【００７５】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターと
しては、例えば、ＰＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５，
１９７７）、ＰＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，４，１２１，１
９７８），ＰＵＣ１２（Ｇｅｎｅ，１９，２５９，１９
８２）、ＰＵＣ１３（Ｇｅｎｅ，１９，２５９，１９８
２）、ＰＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８
５）、ＰＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８
５）、ＰＵＣ１１８（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，１５３，３，１９８７）、ＰＵＣ１１９
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５
３，３，１９８７）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９
４，１９８９）、などが挙げられるが、その他のもので
あっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いず
れも用いることができる。

【００７６】また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、例えば、λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．
Ｖ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．
Ｗ．，ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，１，４９，１９８５）、λｇｔ１１（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
０，１１９４，１９８３）又はλＺＡＰＩＩ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９
８９）などが使用可能であるが、その他のベクターであ
っても、適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。

【００７７】プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えば、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．）らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１．５３−１．７３，１９８９）などが
挙げられる。

【００７８】また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み
込む方法としては、例えば、Ｈｙｕｎｈ，Ｔ．Ｖ．等の
方法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，１，４９，１９８５）などが使用可能である。

【００７９】ステップ（ｉｖ）：上記の方法により得ら
れたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿
主たとえば、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａＣｏｌｉ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス セレビシア
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）等に導入して、これを形質転換できる。

【００８０】プラスミドベクターで宿主を形質転換する
方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１．７４−１．８４，
１９８９）記載のエレクトロポーレーション法あるいは
カルシウムクロライド法などが挙げられる。また、ファ
ージベクターを、例えば、増殖させた大腸菌にインビト
ロパッケージング法を用いて導入することができる。

【００８１】ステップ（ｖ）：上記方法によるｃＤＮＡ
から目的のヒトプロテアソームのサブユニットＰ５８の
ｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プ
ラークハイブリダイゼーション法 （Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１．８５
−１．１０４又は２．１１２−２．１２０，１９８９）
などが使用可能である。

【００８２】上記のハイブリダイゼーションにおけるプ
ローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、サブユ
ニットＰ５８とハイブリダイズするポリヌクレオチドで
あれば、何でもよい。例えば、サブユニットＰ５８のア
ミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチ
ド、あるいはプロテアソームのｐ５８をコードするｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びこれらの部分ＤＮＡ等がサブユ
ニットとハイブリダイズ可能であるかぎり使用可能であ
る。

【００８３】さらに、プロテアソームの他のコンポーネ
ントをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成Ｄ
ＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡも、サブユニットとハ
イブリダイズ可能であるかぎり使用可能である。

【００８４】以上のようにして、ヒトプロテアソームの
サブユニットＰ５８をコードするポリヌクレオチドが調
製可能となる。

【００８５】（塩基配列の決定）上記に従い得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサム−ギルバ
ート（Ｍａｘｉａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９−５
６０，１９８０）、ジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，９，３０９，１９８１）、蛍光色素を用
いたＴａｑ サイクルシークエンシング法等（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４−４９９，１９８９）
により可能である。

【００８６】決定されたヒトプロテアソームのサブユニ
ットＰ５８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの塩基配列は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列
である。また、前記ポリヌクレオチドがコードするポリ
ペプチドのアミノ酸配列は配列表の破裂番号１に記載の
アミノ酸配列である。

【００８７】本発明に係る上記ポリヌクレオチドは、前
記配列の５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列か
らなるポリヌクレオチドを含む。

【００８８】本発明のポリヌクレオチドはまた、ヒトプ
ロテアソームのサブユニットＰ５８のシグナルペプチド
の部分または全部をコードする５’フランキングポリヌ
クレオチドを含むＤＮＡも含む。

【００８９】さらに、既述のように自然の変異により、
または人工的変異により、主たる活性に変化を与えるこ
となく、ポリヌクレオチドの構造およびそれから演繹さ
れるポリペプチドの構造の一部を変異せしめることが可
能である。従って、本発明に係るポリヌクレオチドは、
前述のすべてのポリペプチドの異性体に相当する構造を
有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有するこ
とも可能である。

【００９０】さらに、遺伝暗号の縮重に従い、ポリヌク
レオチドから生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を
変えることなくそのポリヌクレオチドの塩基配列の少な
くとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換することがで
きる。従って、本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって、変換された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列より、演繹されるアミノ酸配列は配
列表の配列番号１のアミノ酸配列と一致する。

【００９１】本発明のプロテアソームサブユニットＰ５
８のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むポリヌク
レオチドは、上記の方法の他に、ヒト、ラット、マウス
などのゲノムＤＮＡのライブラリーからのクローニング
によっても得ることができる。

【００９２】これら、サブユニットＰ５８をコードする
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、目的により、そのまま
あるいは制限酵素で切断して使用することが可能であ
る。

【００９３】本発明により得られたサブユニットＰ５８
のｃＤＮＡの構造は図２に示されるように、１９７８残
基からなり、オープンリーディングフレームは１６０５
残基であり、５３４アミノ酸をコードする。 （疾患の診断に有用な方法）上記のポリヌクレオチド又
はその一部であるポリヌクレオチドをプローブとして用
いることは、プロテアソームが関する免疫疾患等各種疾
患の診断等にも有効な手段を与える。プローブとして
は、１２塩基以上の長さのポリヌクレオチドが一般に用
いられている。そのＧＣ含有率は３０−７０％であるこ
とが好ましく、また長さは１６塩基以上であることがさ
らに好ましい。本発明のポリヌクレオチドも配列表の配
列番号２の塩基配列のうちの前記条件を満たす一部がプ
ローブとして使用可能である。

【００９４】さらにヒトプロテアソームサブユニットＰ
５８の遺伝的多型性を調べることにより、各種疾患との
関連も明らかにでき、ポリヌクレオチド診断に有効に使
用可能となる。

【００９５】また、本発明で得られたヒトプロテアソー
ムサブユニットＰ５８の相補鎖ポリヌクレオチドをプロ
ーブとして用いることにより、各種ヒト臓器のｍＲＮＡ
発現量を例えばノザンブロット解析やＲＴ−ＰＣＲ解析
（例えば、ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，ｅｄ．，斎藤隆 監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、
ＨＢＪ出版局、１９９１年）を行うことにより定量的に
測定可能となり、上記各種疾患の診断手段を与えるもの
である。

【００９６】さらに本発明において得られたサブユニッ
トＰ５８に対するポリクロナールまたはモノクロナール
抗体を作成することが可能である（例えば、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｅｄ．，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８８に記載の方法に準じて可能である）。前記抗体
を得るためには、抗原として少なくとも８以上のアミノ
酸からなるポリペプチドを免疫することが好ましい。さ
らには、実施例２で示したように１５アミノ酸以上であ
ればより好ましい。

【００９７】得られた抗体を用いた免疫的測定法によ
り、各種細胞中の該サブユニットの変化を定量的に測定
する手段が与えられる。

【００９８】ヒトプロテアソームの遺伝子はヒト肝癌細
胞、ヒト腎癌細胞（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５１，６６
７７−６６８５，１９９１）、ヒト白血病細胞などの悪
性腫瘍細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８，１３９−１４３，１９９０）にお
いて正常細胞に比較して異常に高く発現し、さらに、こ
れらの腫瘍細胞の核にプロテアソームが、異常蓄積する
ことが知られており、従って本発明に係るプロテアソー
ムのサブユニットＰ５８をヒトの癌化のメカニズムの解
明や癌の診断および治療に有効に使用可能となる。

【００９９】さらに、アルツハイマー病患者の脳内には
ユビキチンが異常蓄積し、少なくともこの疾患の原因の
一つに細胞内における蛋白質分解系の異常のあることが
示唆されており、さらにこの疾患の発現にかかわる遺伝
子の機能ドメインにはプロテアーゼ阻害剤がコードされ
ていることが知られており（Ｎａｔｕｒｅ，３３１，５
３０−５３２，１９８８）、非リソソーム系の蛋白分解
に関与すると考えられるプロテアソームがアルツハイマ
ー病に本質的に関係していることが示唆されている。

【０１００】従って、本発明に係るヒトプロテアソーム
のサブユニットＰ５８は、その機能および阻害メカニズ
ムの解明、および各種疾患と本酵素との関係や異常の生
じるメカニズムの解明、および治療に有効に使用可能と
なる。

【０１０１】（アンチセンスポリヌクレオチド）本発明
のサブユニットＰ５８をコードするポリヌクレオチドの
塩基配列より、該サブユニットＰ５８に対するアンチセ
ンスポリヌクレオチドが提供される。アンチセンスポリ
ヌクレオチドはサブユニットＰ５８の生合成を抑制可能
であればその長さは限定されず、例えば、配列表の配列
番号２の全長に対するアンチセンスポリヌクレオチド
（全長）のフラグメントであってもよい。アンチセンス
ポリヌクレオチドとしては、一般に１５塩基以上のもの
が適当とされている。本発明のアンチセンスポリヌクレ
オチドは化学的合成等の公知の方法で作製可能である。
また、公知の方法（例えば、癌と化学療法、２０巻、１
８９９−１９０７頁、１９９３年を参照）により得られ
る誘導体も含まれる。

【０１０２】前記のように癌やアルツハイマー病でプロ
テアソームの異常蓄積が見られていることから、その発
現を抑制する本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
が、該疾患の治療に有効に使用可能である。

【０１０３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【０１０４】（実施例１）ヒトプロテアソームのサブユ
ニットＰ５８の遺伝子配列の決定 Ｐ５８サブユニットを含む２６Ｓプロテアソームの制御
因子群の調製 （１）プローブの調製 （１−１）出発物質の調製 牛赤血球細胞の２６Ｓプロテアソーム制御因子群は以下
に記載の方法に準じて精製可能である。以下説明する。

【０１０５】牛血液をヘパリン存在下で収集し、２００
０×ｇで１時間遠心し赤血球細胞を集めた後、得られた
沈殿を４倍体積のリン酸緩衝液に懸濁し、再沈殿するこ
とにより洗浄した。この操作を４回繰り返した。

【０１０６】なお、以下のステップは特に述べない限り
４℃で行った。

【０１０７】赤血球細胞に３倍体積の溶解バッファー
（バッファーＨ：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
６、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
βーメルカプトエタノール）を加えて１０分間攪拌して
溶解した。これを１３，０００×ｇで６０分間遠心し、
上清を除去して、保存した。

【０１０８】沈殿は再度バッファーＨに懸濁し、遠心し
た後上清を最初の上清に加えた。

【０１０９】この上清画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ βーメル
カプトエタノール、１０％グリセロールからなる緩衝液
に対して透析処理を行った。

【０１１０】（１−２）ＤＥ５２による調製 上記の透析画分５ｍｌに対し、バッファーＨで平衡化し
たＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ社）１ｍｌを添加した。

【０１１１】該レジンに結合している蛋白を、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含むバッファーＨ中で該レジンを１０分間
緩やかに攪拌することにより溶出した（レジン：０．５
ＭＮａＣｌ／バッファーＨ＝１：１（ｖ／ｖ））。さら
に０．５Ｍ ＮａＣｌを含む少量のバッファーＨで溶出
し、ヘモグロビンを含まない赤血球細胞からの抽出画分
を得た。

【０１１２】（１−３）硫安沈殿 上記得られた画分に３８％飽和になるように３０分間を
かけてゆっくりと攪拌しながら硫安（硫酸アンモニウ
ム）を添加した。

【０１１３】さらに３０分間攪拌して沈殿した蛋白を遠
心により集めた。

【０１１４】この沈殿をダンス（ＤＯＵＮＣＥ）ホモジ
ナイザーを用いて大量のバッファー中に再懸濁し、さら
に遠心し沈殿蛋白を得た。

【０１１５】沈殿は少量のバッファーＨに溶解し、１０
０ｍＭになるようにＮａＣｌを添加し、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ／バッファーＨに対して１６時間透析した。

【０１１６】透析後、不溶物を３０，０００×ｇ、３０
分間遠心して除き、上清画分を得た。

【０１１７】（１−４）セファクリルＳ−３００ セファクリルＳ−３００（ファルマシア社、１００×５
ｃｍ）カラムをバッファーＨで平衡化後、（１−３）で
得た画分をアプライし、１００ｍＭ ＮａＣｌを含むバ
ッファーＨで溶出し、１１ｍｌずつフラクションを集め
た。

【０１１８】フラクションのうち２０Ｓプロテアーゼ活
性促進の高い画分を集めた。活性画分の測定は（１−
７）に記載した。

【０１１９】（１−５）ＤＥＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ （１−４）の活性画分をバッファーＨで平衡化したＤＥ
ＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ、１０×２．５ｃｍ）にアプライし１００ｍＭ−３０
０ｍＭ ＮａＣｌ／バッファーＨによるリニアグラジエ
ントで溶出し、１１ｍｌずつフラクションを集めた。

【０１２０】得られたフラクションのうち、活性画分の
高い画分を集め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に
対して透析を行った。

【０１２１】（１−６）ハイドロキシアパタイト （１−５）で得られた画分をバッファーＨで平衡化した
ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ社、７ｘ２５ｃ
ｍ）にアプライし、リン酸緩衝液（２０−２００ｍｌ）
のリニアグラジエントにより８ｍｌずつ各フラクション
を溶出し集めた。

【０１２２】上記各フラクションの活性画分を集め、バ
ッファーＨで透析し、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでア
ミコンＰＭ１０メンブランで濃縮した。

【０１２３】（１−７）活性画分の測定方法 ２６Ｓプロテアソーム制御因子群の活性の測定は、２０
Ｓプロテアソームと制御因子群を混合して２０Ｓプロテ
アソームのペプチダーゼ活性を測定する方法により可能
である。反応は、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、６０μＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中、０．３μｇ ２０
Ｓプロテアソームと精製各段階の制御因子群を添加して
最終容積５０μｌで行った。

【０１２４】この反応液を、３７℃で４５分間プレイン
キュベートし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０μＭ
２０Ｓプロテアソーム、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ ( キモトリプシン様活性を測定す
るための合成基質）からなる溶液に添加し１０分間イン
キュベートして、蛍光を測定した。

【０１２５】制御因子群にアクチベート活性があれば、
２０Ｓプロテアソームによる合成基質の分解活性が上昇
することから、活性画分を同定可能となる。

【０１２６】（２）Ｐ５８サブユニットのアミノ酸配列
の決定 （２−１）Ｐ５８サブユニットの単離 （１）の処理で得られた２６Ｓプロテアソーム制御因子
群蛋白を逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｓｈｏｄｅ
ｘ ＲＳ Ｐａｋ Ｄ４−６１３ カラム ６×１５０
ｍｍ）を使用し以下の条件で分離した。

【０１２７】分離条件： 流速 ０．７５ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ５０℃ 溶媒Ａ ０．０６％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） 溶媒Ｂ ０．０５％ＴＦＡ／７０％アセトニトリル／３
０％水 ６４％Ａ，３６％Ｂによりカラムを平衡化し、３６−７
０％のＢ溶媒を用いたグラジエントで溶出した。

【０１２８】２１４ｎｍの波長で検出し、ピーク画分を
スピードバックコンセントレータ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社) で乾燥した。

【０１２９】（２−２）電気泳動による分離 上記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバファーに
溶解し、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａ
ｒｌｏｗ Ｄａｖｉｄ ｌａｎｅ 著、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６３
６−６４０，１９８８）により分離した。

【０１３０】電気泳動が終わったゲルは、イモビロン−
ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）にセミドライエレ
クトロブロティング装置ザルトブロットＩＩ−Ｓ（ザル
トリウス社製）を用いてトランスファーした。

【０１３１】蛋白質をブロットした膜フィルターは、蒸
留水で洗浄した後、クマシーブルー染色液（０．２％ク
マシーブリリアントブルーＲ２５０を含む４０％メタノ
ール、１０％酢酸溶液）で染色後、脱色液（６０％メタ
ノール溶液）に浸し、振とうしてバックグラウンドを脱
色した。

【０１３２】このメンブラン上の５８ｋＤの位置のスポ
ットを切出し、ｉｎ ｓｉｔｕでＬ−１−ｔｏｓｙｌａ
ｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙ
ｌｋｅｔｏｎｅ処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏ
ｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ社）、又はＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ
（ベーリンガーマンハイム社）により酵素処理した。生
成したペプチドはＨＰＬＣ（パーキンエルマー社製）に
よって分離精製した（流速５０μｌ／ｍｉｎ、０．１％
ＴＦＡを溶媒とし０−７０％のアセトニトリルによるグ
ラジエント、ＲＰ３００カラム（２．１×１００ｍ
ｍ）。

【０１３３】得られたポリペプチドフラグメントのいく
つかをペプチドシークエンサー（パーキンエルマー社製
プロテインシークエンサー４９７型分析装置）により解
析を行った。

【０１３４】以上のアミノ酸解析により次の７種類のプ
プチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０８７８−２０８８４，
１９９４）。

【０１３５】 フラグメント１；ＡＫＰＰＰＧＧＧＥＱＥＰＰＰＰＰＡ
ＰＱＤＶＥＭＫ フラグメント２；ＥＬＤＴＶＴＬＥＤＩＫＥＨＶＫ フラグメント３；ＤＦＬＬＰＦＬＥＥＰＭＤＴＥＡＤＬ
ＱＦＲ フラグメント４；ＶＹＥＦＬＤＫＬＤＶＶ フラグメント５；ＨＤＸＤＧＱＡＴＬＬＮＬＬＬＲ フラグメント６；ＳＶＦＰＥＱＡＮＮＮＥＷＡＲ フラグメント７；ＬＱＬＤＳＰＥＤＡＥＦＩＶＡＫ ただし、Ｘは決定できなかったアミノ酸を示す。

【０１３６】（３）プライマーの合成 得られた上記のペプチドフラグメントの配列から縮重度
の低い配列として、フラグメント１からＱＤＶＥＭＫＥ
Ｅ、フラグメント７からＦＡＫＥＭＡＥＤの配列を選択
した。

【０１３７】次に、これら選択したポリペプチドに対応
する相補的オリゴヌクレオチドとして、フォワードプラ
イマーとして５’−ＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＡ
ＡＡＧＡＧＧＡＧ−３’を選び，リバースプライマーと
して５’−ＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧ
ＣＡＡＡ−３’をＤＮＡ合成機３８０Ｂ（アプライドバ
イオシステムズ社製）で合成した。

【０１３８】得られたオリゴヌクレオチドをオリゴヌク
レオチドカートリッジ（アプライドバイオシステムズ社
製）を使用して精製した。

【０１３９】（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 （４−１）ｃＤＮＡの調製 ヒト肝細胞癌ＨＥＰＧ２（ＡＴＣＣから入手可能）か
ら、（３−２）記載のグアニジウムチオシアネイト法
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５
９，１９８７）によって全ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡ
からオリゴ（ｄＴ）ラテックス（タカラ社；Ｏｌｉｇｏ
ｔｅｘ−ｄＴ３０）を用いて（３−２）記載の方法と同
様にＨＥＰＧ２細胞からｍＲＮＡ１０μｇを得た。

【０１４０】上記の方法によって得られたポリ（Ａ）＋
ＲＮＡから、ファルマシア社製ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃ
ＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを得た。

【０１４１】より詳しくは、オリゴｄＴプライマーを上
記ｍＲＮＡのポリＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素
（Ｍｕｒｉｎｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）により、１本鎖ＤＮＡを合成し、Ｅ. ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼ１により、２本鎖ｃＤＮＡとし
て合成した。

【０１４２】得られた上記ｃＤＮＡの両端にＮｏｔＩ／
ＥｃｏＲ Ｉアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡラ
イゲース処理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行
ない、両端にＥｃｏＲ Ｉ制限酵素切断部位をもつｃＤ
ＮＡを得た。

【０１４３】（４−２）インビトロパッケージング反応 得られた両端にＥｃｏＲ Ｉ制限酵素切断部位をもつｃ
ＤＮＡをクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ処理λ
ＺＡＰＩＩを含むλＺＡＰＩＩクローニングキット）の
ＥｃｏＲＩ部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。

【０１４４】ライゲーション反応溶液１ｍｌを用いて、
ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ Ｇｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇ
ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社）によりパ
ッケージングを行った。

【０１４５】パッケージングした組換えバクテリオファ
ージを含むパッケージング溶液と大腸菌ＳＵＲＥ２を３
７℃で１５分間培養した。

【０１４６】これを２−３ｍｌのトップアガー（４８
℃）に加えＮＺＹアガープレートへプレーティングし
て、３７℃で１夜培養した。

【０１４７】１５０ｍｍ ＮＺＹプレートにて約５０，
０００個のプラークを培養した。１０枚のプレートにま
いて培養した、約５ｘ１０⁵ 個のプラークをスクリーニ
ング用に用いた。

【０１４８】（５）クローンの単離 （５−１）スクリーン用フィルタの調製 ＮＺＹプレートを４℃で２時間冷却し、このプレート上
にナイロンフィルタ（アマシャム社、ハイボンドＮ＋）
をのせ、２分間放置した。

【０１４９】これをはがしてフィルターペーパ上で乾燥
し、紫外線照射により固定してスクリーニング用フィル
ターを調製した。

【０１５０】これを用いて以下のハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【０１５１】（５−２）ハイブリダイゼーションのため
のプローブは（１）で得られたＤＮＡプローブを、ラン
ダムプライムラベリング法（タカラ社；ランダムプライ
マＤＮＡラベリングキットＶｅｒ．２）で³²Ｐ−ｄＣＴ
Ｐ（アマシャム社）標識したものを使用した。

【０１５２】プレハイブリダイゼーション溶液として、
５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））、５０％フォルムア
ミド、１×ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．２％ウシ血清アルブ
ミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）０．２％ポリビニルピロ
リドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ４００）溶液、０．１％
ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用
いた。

【０１５３】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベー
トしてハイブリダイゼーションを行った。

【０１５４】以上の操作により４個のポジティブクロー
ンが得られた。

【０１５５】（６）ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ
（きりだし）による大腸菌組換え体の作成 （５−２）で得られたアガープレート中のポジティブＺ
ＡＰファージクローンのプラークの中心を竹くしでつ
き、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロフォル
ム混合液中に溶出し、ボルテックスをした後、一夜放置
した。

【０１５６】大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ２００μｌと
ポジティブファージクローン２００μｌ（＞１ｘ１０⁵
ファージパーティクル）、ヘルパーファージ Ｒ４０８
１μｌ（＞１ｘ１０⁶ ｐｆｕ／ｍｌ）を５０ｍｌチュ
ーブにて混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰとヘルパー
ファージを感染させた。

【０１５７】５ｍｌの２×ＹＴ培地（１０ｇ ＮａＣ
ｌ、１０ｇ Ｂａｃｔｏ ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、
１６ｇ Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ／１ｌ）を加え、
３７℃で３時間振とうしながら培養し、大腸菌よりファ
ージミドを分泌させた。

【０１５８】７０℃で２０分間熱処理した後、４０００
×ｇで５分間遠心し、菌体を死滅させた。

【０１５９】上清のファージミドを別の試験管に移し
た。

【０１６０】この上清にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
（−）粒子が含まれており、この上清２００μｌあるい
は１００倍に希釈した溶液２０μｌとＳＵＲＥ２（ＳＴ
ＲＡＧＥＮＥ社）２００μｌ（ＯＤ６００＝１．０）を
混合し３７℃で１５分間混合し感染させた。

【０１６１】１−１００μｌの培養液をＬＢ／Ａｍｐプ
レートにプレーティングした後、３７℃で一晩培養し
た。

【０１６２】表れたコロニーはインサートＤＮＡを含む
２本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）をもった大
腸菌（ＳＵＥＲＥ２）形質転換体である。

【０１６３】４個のポジティブクローンの大腸菌からプ
ラスミドをＱＩＡｐｒｅｐＰｌａｓｍｉｄキット（Ｑｕ
ｉａｇｅｎ社) を用いて調製し、制限酵素ＮｏｔＩで切
断して、そのうち最も長いインサート（約２ｋｂ）をも
つクローンについて以下のＤＮＡ塩基配列の決定を行っ
た。

【０１６４】なおこのヒトプロテアソームサブユニット
Ｐ５８の大腸菌ＳＵＲＥ２形質転換体についてはｈｕ−
Ｐ５８／ＳＵＲＥと命名して、工業技術院生命工学工業
技術研究所に平成８年８月２７日に寄託した（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５８１０）。

【０１６５】（７）塩基配列の決定 上記で得られた約２ｋｂのクローンの塩基配列を、パー
キンエルマー社製ＤＮＡシークエンサー３７３Ａを用
い、Ｔａｑサイクルシークエンシング法により決定し
た。

【０１６６】得られたサブユニットＰ５８のｃＤＮＡの
制限酵素切断部位を図１に、また塩基配列の解析結果を
図２に示す。

【０１６７】決定した塩基数は１９７８残基で、オープ
ンリーディングフレームは１６０５残基であり、５３４
個のアミノ酸がコードされている。

【０１６８】計算上の分子量は６０８４９であり、等電
点は、８．４５である。

【０１６９】図２の下線部は、（２−２）記載の牛赤血
球より精製したＰ５８から決定されたペプチドシークエ
ンスと相同性のある部分を示すものである。

【０１７０】（実施例２）ヒトプロテアソームサブユニ
ットＰ５８に反応するポリクローナル抗体の作製 （１）サブユニットＰ５８の他のＡＴＰａｓｅサブユニ
ットとホモロジーのない部分であるｃ末端側１５アミノ
酸（ＭＱＫＤＳＥＫＮＭＳＩＫＫＬＷＫ）を選択し、こ
のペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドを
Ｆ−Ｍｏｃ法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａ
ｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，
１９８９，Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｓｈｅｐｐａｒ
ｄ，Ｒ．Ｃ．著）により、パーキンエルマー社製ペプチ
ド合成機４３３Ａを用いて合成した。

【０１７１】合成したポリペプチドの脱保護および精製
は、抗ペプチド抗体実験プロトコール、大海忍 他著、
秀潤社、２５−４６ページに記載の方法で行った。

【０１７２】なお脱保護基後のペプチドの精製はＣ１８
ＯＤＳカラム（島津社Ｓｙｎ ＰｒｏＰｅｐカラム、
４．６×１５０ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、０−８０％アセ
トニトリルグラジエント）を用いた。

【０１７３】（２）上記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコ
ンジュゲイションキット（ピアス社）を用いて結合さ
せ、ペプチド−ＫＬＨ複合体を上記のキット中のカラム
により調製した。

【０１７４】（３）初回に、上記複合体約１５０μｇを
フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ、キャペル社）
とともにエマルジョンにし、ラビット（ジャパニーズホ
ワイト）の背中に免疫した。その後２週間おきに３回、
完全アジュバンドの代わりに不完全アジュバント（ＦＩ
Ａ）を用いて同様に免疫した。

【０１７５】初回免疫後７、８、９週目にＥＬＩＳＡ法
により抗体価を測定し、後抗体価の上昇を確認後全採血
を行なった。

【０１７６】（４）ウサギ血液は、室温で３時間静置
後、セパラピッドチューブ（積水化学）にアプライし、
３０００回転で３０分間の遠心によりサブユニットＰ５
８に対する抗血清を得た。

【０１７７】（実施例３）ヒトプロテアソームのサブユ
ニットＰ５８の発現解析 （１）ヒト腎臓から精製したヒト２０Ｓ（図３Ａレーン
１）および２６Ｓプロテアソーム（特開平５−２９２９
６４号公報、特開平６−０２２７５９号公報）（図３Ａ
レーン２）をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ Ｄａｖｉｄ ｌａｎｅ著、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，６３６−６４０，１９８８）で分離し、これを
クマシー染色した。

【０１７８】その結果、２０Ｓプロテアソームは、分子
量２０ｋＤ−３０ｋＤのバンドとして観察され、２６Ｓ
プロテアソームは２０Ｓプロテアソームと３０−１１０
ｋＤの制御因子が結合した複合体であることがわかる。

【０１７９】また図３Ｂは２６Ｓヒトプロテアソーム制
御因子群のみを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後クマシー染
色（図３Ｂレーン３）したものとＰ５８の抗体を用いて
イムノブロットした結果を示したものである（図３Ｂレ
ーン４）。

【０１８０】イムノブロットの結果から、分子量約６０
ｋＤの位置に、ｐ５８抗体と反応する蛋白質が存在する
のが確認された。

【０１８１】従って、Ｐ５８サブユニットから作成され
る抗体を用いれば、ヒトの組織でもＰ５８の発現を解析
することが可能である。

【０１８２】（実施例４）プロテアソームサブユニット
Ｐ５８の相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いて、
各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析
を行った（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１５，２５７，１
９９４）。

【０１８３】プローブとしては、実施例１（６）で得ら
れた組み換え体を使用し、プラスミドＤＮＡを大腸菌Ｓ
ＵＲＥ２より、ＱＩＡｗｅｌｌ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ
社）にて調製した。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ
（タカラ社）で処理後、２％アゲロースゲル電気泳動で
分離して、２．０ｋｂのサブユニットＰ５８のプローブ
をＱＩＡ ｑｕｉｃｋＧＥＩ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で調製した。

【０１８４】これをマルチプライムＤＮＡ標識システム
（アマシャム社）で³²Ｐ標識してプローブとして用い
た。

【０１８５】フィルターは、各種ヒト臓器（心臓、脳、
胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）より抽出したｍ
ＲＮＡ（２μｇ）がブロットされたポジチィブチャージ
ドナイロンフィルター（Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉ Ｔｉ
ｓｓｕｅ ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、クローンテック
社）を用いた。

【０１８６】プレハイブリダイゼーション溶液として、
５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））、５０％フォルムア
ミド、１×ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．２％ウシ血清アルブ
ミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）、０．２％ポリビニルピ
ロリドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ４００）溶液、０．１
％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを
用いた。

【０１８７】フィルターは４２℃、３時間、プレハイブ
リダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識
プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％
ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベー
トしてハイブリダイゼーションを行った。

【０１８８】フィルターは２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
で４２℃、１５分間で４回洗浄し、さらに１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで３０分間１回洗浄した。

【０１８９】オートラジグラフィーは、Ｋｏｄａｌ Ｘ
ＡＲ−５フィルムを用いて、−７０℃で行った。

【０１９０】オートラジオグラフィーの結果を図４に示
す。各スポットの発色強度を表１に示す。発色強度の強
い順に、＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋と４段階で示し
た。

【０１９１】

【表１】

【０１９２】プロテアソームサブユニットＰ５８は、約
１．８ｋｂのｍＲＮＡと反応し、その発現量について
は、心臓、骨格筋で高く、腎臓、肺では低い発現である
ことが明確に定量可能であった。このことより、本発明
のプローブを用いて、ｍＲＮＡ発現量を測定することが
可能である。

【０１９３】

【発明の効果】ヒトプロテアソームを構成する個々のサ
ブユニット特にサブユニットＰ５８のポリペプチド又は
該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを利用す
ることで、プロテアソームが関与する癌やアルツハイマ
ー病免疫疾患等の各種疾患の診断及び治療が可能とな
る。

【０１９４】また、前記ポリペプチドに対する抗体の免
疫反応を利用した方法によっても前記疾患の診断及び治
療が可能となる。

【０１９５】さらに前記ポリペプチドに対するポリヌク
レオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドを利用する
方法によっても前記各種疾患の診断および治療が可能と
なる。

【０１９６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Gln Glu Gly Ser Ala Arg Arg Arg Gly Ala Asp Lys Ala Lys 1 5 10 15 Pro Pro Pro Gly Gly Gly Glu Gln Glu Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro 20 25 30 Gln Asp Val Glu Met Lys Glu Glu Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Ala Asp Gly Lys Thr Ala Ala Ala Ala Ala Glu His Ser Gln 50 55 60 Arg Glu Leu Asp Thr Val Thr Leu Glu Asp Ile Lys Glu His Val Lys 65 70 75 80 Gln Leu Glu Lys Ala Val Ser Gly Lys Glu Pro Arg Phe Val Leu Arg 85 90 95 Ala Leu Arg Met Leu Pro Ser Thr Ser Arg Arg Leu Asn His Tyr Val 100 105 110 Leu Tyr Lys Ala Val Gln Gly Phe Phe Thr Ser Asn Asn Ala Thr Arg 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Pro Phe Leu Glu Glu Pro Met Asp Thr Glu Ala Asp 130 135 140 Leu Gln Phe Arg Pro Arg Thr Gly Lys Ala Ala Ser Thr Pro Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Val Glu Ala Tyr Leu Gln Leu Leu Val Val Ile Phe Met Met 165 170 175 Asn Ser Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Gln Lys Ile Ser Asp Asp Leu Met 180 185 190 Gln Lys Ile Ser Thr Gln Asn Arg Arg Ala Leu Asp Leu Val Ala Ala 195 200 205 Lys Cys Tyr Tyr Tyr His Ala Arg Val Tyr Glu Phe Leu Asp Lys Leu 210 215 220 Asp Val Val Arg Ser Phe Leu His Ala Arg Leu Arg Thr Ala Thr Leu 225 230 235 240 Arg His Asp Ala Asp Gly Gln Ala Thr Leu Leu Asn Leu Leu Leu Arg 245 250 255 Asn Tyr Leu His Tyr Ser Leu Tyr Asp Gln Ala Glu Lys Leu Val Ser 260 265 270 Lys Ser Val Phe Pro Glu Gln Ala Asn Asn Asn Glu Trp Ala Arg Tyr 275 280 285 Leu Tyr Tyr Thr Gly Arg Ile Lys Ala Ile Gln Leu Glu Tyr Ser Glu 290 295 300 Ala Arg Arg Thr Met Thr Asn Ala Leu Arg Lys Ala Pro Gln His Thr 305 310 315 320 Ala Val Gly Phe Lys Gln Thr Val His Lys Leu Leu Ile Val Val Glu 325 330 335 Leu Leu Leu Gly Glu Ile Pro Asp Arg Leu Gln Phe Arg Gln Pro Ser 340 345 350 Leu Lys Arg Ser Leu Met Pro Tyr Phe Leu Leu Thr Gln Ala Val Arg 355 360 365 Thr Gly Asn Leu Ala Lys Phe Asn Gln Val Leu Asp Gln Phe Gly Glu 370 375 380 Lys Phe Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Thr Leu Ile Ile Arg Leu Arg His 385 390 395 400 Asn Val Ile Lys Thr Gly Val Arg Met Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Arg 405 410 415 Ile Ser Leu Ala Asp Ile Ala Gln Lys Leu Gln Leu Asp Ser Pro Glu 420 425 430 Asp Ala Glu Phe Ile Val Ala Lys Ala Ile Arg Asp Gly Val Ile Glu 435 440 445 Ala Ser Ile Asn His Glu Lys Gly Tyr Val Gln Ser Lys Glu Met Ile 450 455 460 Asp Ile Tyr Ser Thr Arg Glu Pro Gln Leu Ala Phe His Gln Arg Ile 465 470 475 480 Ser Phe Cys Leu Asp Ile His Asn Met Ser Val Lys Ala Met Arg Phe 485 490 495 Pro Pro Lys Ser Tyr Asn Lys Asp Leu Glu Ser Ala Glu Glu Arg Arg 500 505 510 Glu Arg Glu Gln Gln Asp Leu Glu Phe Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp 515 520 525 Asp Asp Asp Ser Phe Pro 530 配列番号：２ 配列の長さ：１６０５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG AAG CAG GAG GGC TCG GCG CGG CGC CGC GGC GCG GAC AAG GCG AAA 48 CCG CCG CCC GGC GGA GGA GAA CAA GAA CCC CCA CCG CCG CCG GCC CCC 96 CAG GAT GTG GAG ATG AAA GAG GAG GCA GCG ACG GGT GGC GGG TCA ACG 144 GGG GAG GCA GAC GGC AAG ACG GCG GCG GCA GCG GCT GAG CAC TCC CAG 192 CGA GAG CTG GAC ACA GTC ACC TTG GAG GAC ATC AAG GAG CAC GTG AAA 240 CAG CTA GAG AAA GCG GTT TCA GGC AAG GAG CCG AGA TTC GTG CTG CGG 288 GCC CTG CGG ATG CTG CCT TCC ACA TCA CGC CGC CTC AAC CAC TAT GTT 336 CTG TAT AAG GCT GTG CAG GGC TTC TTC ACT TCA AAT AAT GCC ACT CGA 384 GAC TTT TTG CTC CCC TTC CTG GAA GAG CCC ATG GAC ACA GAG GCT GAT 432 TTA CAG TTC CGT CCC CGC ACG GGA AAA GCT GCG TCG ACA CCC CTC CTG 480 CCT GAA GTG GAA GCC TAT CTC CAA CTC CTC GTG GTC ATC TTC ATG ATG 528 AAC AGC AAG CGC TAC AAA GAG GCA CAG AAG ATC TCT GAT GAT CTG ATG 576 CAG AAG ATC AGT ACT CAG AAC CGC CGG GCC CTA GAC CTT GTA GCC GCA 624 AAG TGT TAC TAT TAT CAC GCC CGG GTC TAT GAG TTC CTG GAC AAG CTG 672 GAT GTG GTG CGC AGC TTC TTG CAT GCT CGG CTC CGG ACA GCT ACG CTT 720 CGG CAT GAC GCA GAC GGG CAG GCC ACC CTG TTG AAC CTC CTG CTG CGG 768 AAT TAC CTA CAC TAC AGC TTG TAC GAC CAG GCT GAG AAG CTG GTG TCC 816 AAG TCT GTG TTC CCA GAG CAG GCC AAC AAC AAT GAG TGG GCC AGG TAC 864 CTC TAC TAC ACA GGG CGA ATC AAA GCC ATC CAG CTG GAG TAC TCA GAG 912 GCC CGG AGA ACG ATG ACC AAC GCC CTT CGC AAG GCC CCT CAG CAC ACA 960 GCT GTC GGC TTC AAA CAG ACG GTG CAC AAG CTT CTC ATC GTG GTG GAG 1008 CTG TTG CTG GGG GAG ATC CCT GAC CGG CTG CAG TTC CGC CAG CCC TCC 1056 CTC AAG CGC TCA CTC ATG CCC TAT TTC CTT CTG ACT CAA GCT GTC AGG 1104 ACA GGA AAC CTA GCC AAG TTC AAC CAG GTC CTG GAT CAG TTT GGG GAG 1152 AAG TTT CAA GCA GAT GGG ACC TAC ACC CTA ATT ATC CGG CTG CGG CAC 1200 AAC GTG ATT AAG ACA GGT GTA CGC ATG ATC AGC CTC TCC TAT TCC CGA 1248 ATC TCC TTG GCT GAC ATC GCC CAG AAG CTG CAG TTG GAT AGC CCC GAA 1296 GAT GCA GAG TTC ATT GTT GCC AAG GCC ATC CGG GAT GGT GTC ATT GAG 1344 GCC AGC ATC AAC CAC GAG AAG GGC TAT GTC CAA TCC AAG GAG ATG ATT 1392 GAC ATC TAT TCC ACC CGA GAG CCC CAG CTA GCC TTC CAC CAG CGC ATC 1440 TCC TTC TGC CTA GAT ATC CAC AAC ATG TCT GTC AAG GCC ATG AGG TTT 1488 CCT CCC AAA TCG TAC AAC AAG GAC TTG GAG TCT GCA GAG GAA CGG CGT 1536 GAG CGA GAA CAG CAG GAC TTG GAG TTT GCC AAG GAG ATG GCA GAA GAT 1584 GAT GAT GAC AGC TTC CCT TGA

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ５８のｃＤＮＡの制限酵素切断部位を示す図
である。

【図２】実施例１で得られたヒトプロテアソームのサブ
ユニットＰ５８の決定された塩基配列と塩基配列から決
定したアミノ酸配列（Ｐ５８の１次構造）を示す図であ
る。

【図３】［Ａ］は、ヒト２０Ｓプロテアソーム（レーン
１）と２６Ｓプロテアソーム（レーン２）を電気泳動後
クマシー染色したものであり、［Ｂ］は、ヒト２６Ｓ制
御因子群を電気泳動後クマシー染色したもの（レーン
３）と、これをＰ５８の抗体を用いてイムノブロットし
たもの（レーン４）の電気泳動パターンの形態を示す図
である。

【図４】ヒトプロテアソームサブユニットＰ５８の相補
鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器で
のｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図
である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年１１月２７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】［Ａ］は、ヒト２０Ｓプロテアソーム（レーン
１）と２６Ｓプロテアソーム（レーン２）を電気泳動後
クマシー染色したものであり、［Ｂ］は、ヒト２６Ｓ制
御因子群を電気泳動後クマシー染色したもの（レーン
３）と、これをＰ５８の抗体を用いてイムノブロットし
たもの（レーン４）の電気泳動パターンの形態を示す電
気泳動写真である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】ヒトプロテアソームサブユニットＰ５８の相補
鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器で
のｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す電
気泳動写真である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列からなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列のうち、１又は２以上のアミノ酸を置換、欠失又は付
   加した請求項１に記載のポリペプチドの変異体であっ
   て、請求項１に記載のポリペプチドを含むプロテアソー
   ムが有する、２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼ活性
   をアクチベートする活性、を実質的に有するポリペプチ
   ド。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のポリペプチドを
   コードするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列か
   らなるポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 請求項１又は２に記載のポリペプチドの
   うち連続する少なくとも８のアミノ酸からなるポリペプ
   チド。
6. 【請求項６】 請求項３又は４に記載のポリヌクレオチ
   ドのうち連続する少なくとも１２の塩基からなるポリヌ
   クレオチド又はそれに相補的なポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項１、２又は５に記載のポリペプチ
   ドに反応する抗体。
8. 【請求項８】 プロテアソームサブユニットＰ５８を該
   サブユニットとその抗体との特異性を利用して測定する
   ことを含む疾患を診断するためのキットであって、該抗
   体が請求項７に記載の抗体であることを特徴とする疾患
   診断用キット。
9. 【請求項９】 プロテアソームサブユニットＰ５８のｍ
   ＲＮＡを測定することを含む疾患を診断するためのキッ
   トであって、該キットが請求項６に記載のポリヌクレオ
   チド又はそれに相補的なポリヌクレオチドを含むことを
   特徴とする疾患診断用キット。
10. 【請求項１０】 請求項３又は４に記載のポリヌクレオ
    チドを含む組換えプラスミドによって宿主細胞を形質転
    換することにより得られる形質転換体。
11. 【請求項１１】 宿主細胞が大腸菌である請求項１０に
    記載の形質転換体。
12. 【請求項１２】 請求項１又は２に記載のポリペプチド
    に対するアンチセンスポリヌクレオチド又はそのフラグ
    メントであって、プロテアソームサブユニットＰ５８の
    生合成を抑制できることを特徴とするアンチセンスオリ
    ヌクレオチド又はそのフラグメント。