CN101550185A

CN101550185A - 新的肿瘤相关基因或蛋白及其应用

Info

Publication number: CN101550185A
Application number: CNA2008101033897A
Authority: CN
Inventors: 韩文玲; 马大龙; 王彧; 李婷; 钟吉; 邱晓彦; 张颖妹; 宋泉声; 李荷楠
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2008-04-03
Filing date: 2008-04-03
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2028-04-03
Also published as: CN101550185B

Abstract

本发明涉及一种新的肿瘤相关基因或蛋白及其应用，特别是涉及CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段，所述CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段在治疗和/或抑制肿瘤或在肿瘤辅助诊断、预后判断中的应用、包含CMTM3的载体或组合物，以及检测CMTM3或其免疫性片段的试剂的应用。

Description

新的肿瘤相关基因或蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的肿瘤相关基因或蛋白及其应用，具体地涉及CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段及其应用。

背景技术

癌症对人类健康和生命的威胁很大，是全世界造成死亡的重要原因。对肿瘤的治疗和诊断，成为现代医学需要解决的重要课题。

趋化素样因子超家族(CKLFSF)是本发明人在国际上首次报道的一个新基因家族并申请了专利(中国专利申请号：02122266.5)。在人类，该家族由CKLF(Chemokine-likeFactor，趋化素样因子)和趋化素样因子相关蛋白1-8(CKLF-RP1-8)组成。该家族大部分成员存在不同剪切体，而且每个基因至少有一种剪切体的编码产物具有MARVEL结构域。因此，2005年12月，CKLF-RP1-8被重命名为CMTM1-8(CKLF-like MARVELtransmembrane domain containing 1-8)。

发明内容

本发明的一个目的是提供CMTM3蛋白或其衍生蛋白或它们的免疫性片段。

本发明的另一目的是提供编码CMTM3蛋白或其衍生蛋白或它们的免疫性片段的多核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段在制备用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种包含CMTM3或其免疫性片段的载体。

本发明的另一目的是提供一种用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物。

本发明的另一目的是提供检测CMTM3的基因和蛋白或其免疫性片段的试剂的应用。

发明的另一目的是CMTM3的基因和蛋白或其免疫性片段在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用。

一方面，本发明提供了如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片段：

(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；或

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段；

所述免疫性片段优选为SEQ ID NO：2的氨基酸残基1～24所示的序列或SEQ IDNO：15所示的序列、SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列、或SEQ ID NO：2的氨基酸残基156～182所示的序列或SEQ ID NO：16所示的序列。

另一方面，本发明提供了编码本发明所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列优选为SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列、更优选SEQ ID NO：1的核苷酸75～620所示的多核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了本发明所述的蛋白或其免疫性片段或本发明所述的多核苷酸序列在制备用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物中的应用；肿瘤优选为前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌或肝癌。

另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明所述的多核苷酸序列；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。

另一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物，该组合物含有本发明所述的蛋白或其免疫片段，或本发明所述的多核苷酸序列，或本发明所述的载体；以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。

另一方面，本发明提供了检测本发明所述的蛋白或其免疫性片段或本发明所述的多核苷酸序列的试剂在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用。

另一方面，本发明提供了本发明所述的蛋白或其免疫性片段或本发明所述的多核苷酸序列在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用。

附图说明

图1显示CMTM3在16种人正常组织中的表达谱：1.脑；2.心脏；3.肾脏；4.肝脏；5.肺：6.胰腺；7.胎盘；8.骨骼肌；9.结肠；10.白细胞；11.卵巢；12.前列腺；13.小肠；14.脾；15.睾丸；16.胸腺；

图2显示CMTM3的氨基酸序列，其中：方框内为亮氨酸拉链结构，下划线为LXXLL结构域；

图3A显示CMTM3多肽抗体纯度，其中50kD为抗体的重链，25kD为抗体的轻链；

图3B显示抗CMTM3多克隆抗体的鉴定结果；其中，1：野生型；2：空载体对照组(MOI＝120)；3：Ad-CMTM3(MOI＝15)；4：Ad-CMTM3(MOI＝30)；5：Ad-CMTM3(MOI＝60)；6：Ad-CMTM3(MOI＝120)腺病毒感染各组的病毒总数相同，其差距由空载体对照病毒补齐；

图4显示CMTM3在人正常睾丸和前列腺组织中高表达，并且主要定位于细胞核中；

图5A显示随着CMTM3量的增加，AR的转录活性下降；图5B显示通过普通PCR筛选最有效的Si-CMTM3，其中，1：非沉默；2：No.1；3：No.2；4：No.3；图5C显示通过实时定量PCR筛选最有效的Si-CMTM3，其中，1：非沉默；2：No.1；3：No.2；4：No.3；图5D显示随着Si-CMTM3量的增加，AR的转录活性升高；

图6A～图6D显示在LNCaP细胞中，CMTM3的超表达能抑制PSA的表达，且不影响AR的水平；其中图6A：借助腺病毒系统在LNCap细胞中超表达CMTM3；图6B和图6C分别显示实时定量PCR和Western blot结果；图6D：用ELISA检测上清中PSA浓度；

图7A显示PC-3细胞中克隆形成实验结果；图7B和图7C显示CNE-2细胞、T-47D细胞中克隆形成实验结果；

图8A显示Ad-CMTM3感染DU145细胞后引起的形态学变化，其中，1：野生型；2：空载体对照组；3：Ad-CMTM3；图8B显示Ad-CMTM3感染48小时诱导DU145细胞发生凋亡；图8C显示电转CMTM324小时后诱导CNE-2细胞发生凋亡，其中Bax为阳性对照；图8D显示电转CMTM324小时后，使CNE-2细胞PARP的总量下降，PARP切割片断出现，caspase-3酶原减少，其中：1：对照，2：CMTM3，3：Bax(阳性对照)；图8E显示电转CMTM324小时后，CNE-2caspase-3的活性增加；

图9A显示DU145细胞的裸鼠体内成瘤生长曲线；图9B显示裸鼠体内肿瘤的重量。

具体实施方式

根据本发明的一个方面，本发明提供如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片段：

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段。

如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列为本发明的CMTM3蛋白序列，共182个氨基酸残基。prosite计算机软件分析，其具有3个跨膜区，分别位于氨基酸残基61-83，103-122，132-151。CMTM3没有典型的信号肽，富含亮氨酸，更为重要的是，它具有一个亮氨酸拉链结构和两个LXXLL基序，前者常出现在转录因子的结构中，后者提示它可能与核受体(如雄激素受体，雌激素受体等)相结合。

由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白的免疫性片段可以为CMTM3蛋白的任何具有免疫原性的片段，例如SEQ ID NO：2的氨基酸残基1～24所示的序列、SEQID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列或SEQ ID NO：2的氨基酸残基156～182所示的序列。根据本发明，可以对CMTM3蛋白或其免疫性片段进行取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，而获得与CMTM3蛋白或其免疫性片段具有相同功能的由所述蛋白或其免疫性片段衍生的序列，例如SEQ ID NO：15所示的序列或SEQ ID NO：16所示的序列。

所述取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而获得具有相同功能的衍生物的技术是本领域技术人员所已知的，例如可以是进行非极性氨基酸间或是极性氨基酸间(特别是不带电荷的极性氨基酸间或带相同电荷(带正电荷或负电荷)的极性氨基酸间)的取代。例如，本领域技术人员可利用下表显示的常见氨基酸序列的分类进行非极性氨基酸间或是极性氨基酸间的取代，例如Asp与Glu之间的互换。

氨基酸分类

非极性氨基酸	Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro共八种
非极性氨基酸	Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro共八种	极性不带电荷	Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr共七种
带正电荷	Arg、Lys、His	极性不带电荷	Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr共七种
带正电荷	Arg、Lys、His	带负电荷	Asp、Glu

CMTM3基因为编码本发明的SEQ ID NO：2的多核苷酸序列，其可以为SEQ IDNO：2所示氨基酸的编码序列；除了上述编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。其中优选的基因为SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，该序列全长1514个核苷酸，其包含编码CMTM3蛋白的序列(例如编码序列(CDS：核苷酸75～620)和5′非编码区(核苷酸1～74)及3′非编码区(核苷酸621～891)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含CMTM3蛋白的编码序列，例如SEQ ID NO：1所示的编码序列：核苷酸75～620。本领域普通技术人员已知，本发明CMTM3的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ IDNO：1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子，从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更长的半衰期)而转换密码子。

本发明的CMTM3的多核苷酸序列或其免疫性片段可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到核苷酸可以克隆进合适的载体中，然后利用在所述载体中的复制得到。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。

本发明的CMTM3的蛋白或其免疫性片段可以通过常规方法获得，例如通过用CMTM3的基因或其免疫性片段转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CMTM3的蛋白或其免疫性片段，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

根据本发明的另一方面，本发明提供CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段在制备用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物中的应用。在本发明的具体实施例中，证明了CMTM3在免疫系统和男性生殖系统高表达，这提示该基因可能与这两种系统有密切的关系；此外还证明了CMTM3的超表达对前列腺癌来源细胞、鼻咽癌来源细胞和乳腺癌来源细胞的生长具有明显抑制作用，同时还能够抑制DU145细胞在裸鼠体内的成瘤能力，所以CMTM3对于治疗和/或抑制肿瘤具有重要应用价值。而且，本发明还以确切的实验数据从机理上证明了CMTM3的超表达能够诱导多种类型的肿瘤细胞系发生明显的凋亡改变，包括鼻咽癌(CNE-2)、乳腺癌(T-47D)、前列腺癌(DU145)，这提示CMTM3蛋白可能能够通过诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗和/或抑制肿瘤的目的。同时，在本发明的具体实施例中还证明了CMTM3能够抑制AR的转录活性，而AR在前列腺癌的发生发展过程中有重要的作用；以及证明了CMTM3在肝细胞癌中表达明显下调，这些进一步证明了CMTM3在肿瘤的治疗和/或抑制中的重要作用。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种含有本发明的多核苷酸序列的载体。适当的载体通常为基因工程载体，其可以为染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、病毒(如痘苗病毒、腺病毒)以及病毒DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。插入到表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列如启动子可操作地连接，以指导mRNA的合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，还可以包括用于扩增表达的合适序列。必要时，为了提高编码本发明CMTM3的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中插入增强子序列。简单起见，可以将本发明的CMTM3的基因导入市售载体中，这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)、pMT-hIL-3(马大龙、狄春辉、庞健等(1991)高技术通讯11：26～29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个具体实施例中，将CMTM3多核苷酸序列克隆至载体pGEM-T Easy中；在本发明的另一具体实施例中，将CMTM3多核苷酸序列克隆至载体pcDNA3-Myc-His(B)中。

优选将本发明的CMTM3序列或其免疫性片段或含有CMTM3序列或其免疫性片段的载体通过转导、转化或转染的方法直接施用于患病个体的肿瘤部位，从而达到治疗和/或抑制肿瘤的目的。转导、转化或转染的方法包括本领域已知的病毒感染(尤其是腺病毒介导的转染法和痘苗病毒介导的转染法)、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。目前构建的腺病毒载体主要有3类，即腺病毒E3区缺失表达载体(非缺陷型载体)、腺病毒E1区缺失表达载体(缺陷型载体)和腺病毒沉默区表达载体。利用同源重组技术，腺病毒所携带的外源基因长度可达7.5kb，能感染处于不同周期的细胞，且不整合于宿主细胞基因组中，其安全性较高。痘苗病毒作为载体有如下特点：插入外源基因容量大，可以表达25～40kb的DNA，并能同时表达多种外源基因；病毒宿主范围广；病毒在胞浆中繁殖，不与宿主细胞的染色体整合，无致癌性；表达的产物可以糖基化，能保持外源基因产物的生物学和理化性质。

本发明还提供一种用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物，该组合物含有CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段，或包含CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫性片段的载体；和一种或多种药用赋形剂或药用载体。药用赋形剂或药用载体指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。所述组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于临床使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等辅剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。表皮给药包括在皮肤、黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的CMTM3序列或其免疫性片段或含有CMTM3多核苷酸序列或其免疫性片段的载体与适宜的非刺激性药用赋形剂或药用载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述药用赋形剂或药用载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。

当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明的CMTM3可以是本发明CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫片段的纯净形式、药用盐形式，或选择性与药用赋形剂组合。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和其严重程度；所用具体化合物的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；具体化合物的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。本发明的CMTM3的基因和蛋白可以以基因或蛋白的形式直接包含在组合物中以直接利用所述基因或蛋白治疗和/或抑制肿瘤，也可以以包含在表达载体中的形式包含在组合物中以利用瞬时表达产物或稳定表达产物治疗和/或抑制肿瘤。

本发明还提供检测CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫片段的试剂在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用。所述试剂可以为蛋白、核酸、碳水化合物等，优选为抗体、反义RNA或小干扰RNA(siRNA)。本发明的CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫片段可以作为肿瘤辅助诊断、预后判断的辅助指标。在本发明的具体实施例中，证明了本发明的CMTM3与前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等肿瘤密切相关，而且CMTM3在免疫系统和男性生殖系统高表达，在肝细胞癌中表达明显下调，故本发明的CMTM3可作为癌症的临床诊断和/或预后判断的辅助指标，可利用上述检测CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫片段的试剂对CMTM3的表达水平或存在情况进行检测，从而对肿瘤，尤其是前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌或肝癌，进行辅助诊断和/或预后判断。

因此，可以利用限制性片段长度多态性分析(RFLP)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交法(FISH)等方法或它们的组合，检测体内因本发明的CMTM3表达不足或过量所致的病理状态。同样，也可以使用本发明CMTM3蛋白的抗体，通过放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法或酶联免疫吸附法(ELISA)达到。所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体，所述的抗体优选为与SEQ ID NO：15所示的序列、SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列和SEQ ID NO：16所示的序列特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。所述多克隆抗体或单克隆抗体可以利用本领域已知的方法制备。所述“特异性结合”是指多克隆抗体或单克隆抗体特异性识别靶抗原并与靶抗原的不同抗原表位或抗原决定簇结合的特性。

另一方面，本发明提供了本发明所述的蛋白或其免疫性片段或本发明所述的多核苷酸序列在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用。在本发明的具体实施例中，证明了本发明的CMTM3与前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等肿瘤密切相关，而且CMTM3在免疫系统和男性生殖系统高表达，在肝细胞癌中表达明显下调，故本发明的CMTM3可作为癌症的临床诊断和/或预后判断的辅助指标。因此可利用CMTM3的基因或蛋白或它们的免疫片段对肿瘤，尤其是前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌或肝癌，进行辅助诊断和/或预后判断。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、CMTM3全长cDNA的克隆化

1、CMTM3全长cDNA的EST拼接：

利用CKLF2蛋白质序列(参见国际申请：PCT/CH00/00026)对蛋白质数据库(NCBI的blastp)和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现多组EST序列(AL542357、AL551269、AL514858、AL526558、BG744169、AL544210、AL550478、BG758446、BG748053、AL527977、BI199176、BG697860、BG323663、BG323505)，通过EST Assembly machine(网址为http://www.tigem.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的读码框架。

2、CMTM3的cDNA克隆化：

根据EST拼接得到的CMTM3全长cDNA序列设计特异的引物(上游引物：CGCGAGAAGAGGGGAGCCAG(SEQ ID NO.3)；下游引物：ATCTCGCAGTGCCCATAGCC(SEQ ID NO.4))，根据EST来源不同和Unigene分析结果，选择高表达CMTM3的胎盘单链cDNA文库(购自Clontech)，进行PCR扩增，(94℃，5分钟；94℃，20秒，58℃，20秒，72℃，30秒，35循环；72℃，7分钟)。纯化PCR产物，克隆至pGEM-TEasy载体中(Promega)，连接产物转化XL-1Blue菌，用蓝白斑筛选阳性克隆。测序质粒用Tip-20Mini-preparation试剂盒(Qiagen)进行纯化，3100测序仪进行DNA序列分析，证明EST拼接正确。

实施例2、真核表达质粒的构建

用EcoR I酶切释放出CMTM3片段，将之连接至经EcoR I酶切后并用CIP处理后的真核表达质粒pcDNA3-Myc-His(B)(简称pcDB，购自Invitrogen公司)中，构建了pcDB-CMTM3质粒。在此基础上，利用上游引物5′-cgcggatcctattgccgccaccatg-3′(SEQ IDNO.5)和下游引物5′-cgggatccgcgtcagagtccgagtcggaat-3′(SEQ ID NO.6)，引入BamHI酶切位点，去掉终止码后连接至pEGFP(Invitrogen)载体中，构建pEGFP-CMTM3真核表达质粒。

实施例3、CMTM3在mRNA水平上的表达谱分析

在BD公司购买了两组正常人多组织cDNA文库(Human MTC TM Panel I，catalogNo.636742；Human MTC TM Panel II，catalog No.636743；BD Biosciences Clontech，USA)该文库包含了多个体的cDNA文库。利用ABI Sequence Detection System(AppliedBiosystems，USA)进行实时定量PCR检测。所有的cDNA模板均稀释100倍，在20μl的实时定量PCR扩增体系中，加入8μl稀释的cDNA模板及相应的引物(见表1)，DNA在首先在95℃变性10分钟，然后按照95℃×15秒，60℃×1分钟的条件扩增35轮。其中CMTM3在骨骼肌中的表达水平作为基本单位，其余组织中的表达丰度与其相比得出CMTM3 mRNA水平的表达谱。

表1实时定量PCR所用的引物序列

	上游引物	SEQ IDNO.	下游引物	SEQ IDNO.
	上游引物	SEQ IDNO.	下游引物	SEQ IDNO.	CMTM3	5′-ACCGCGGCCCTCATCTACT-3′	7	5′-AGGCCTTCAGTCAGAGTCC-3′	8
AR	5′-ATGCTCTACTTCGCCCCTGAT-3′	9	5′-GGGTGATTTGGAGCCATCC-3′	10	CMTM3	5′-ACCGCGGCCCTCATCTACT-3′	7	5′-AGGCCTTCAGTCAGAGTCC-3′	8
AR	5′-ATGCTCTACTTCGCCCCTGAT-3′	9	5′-GGGTGATTTGGAGCCATCC-3′	10	PSA	5′-TGACCAAGTTCATGCTGTGT-3′	11	5′-GTCATTTCCAAGGTTCCAAG-3′	12
GAPDH	5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′	13	5′-GAAGATGGTGATGGGATT-3′	14	PSA	5′-TGACCAAGTTCATGCTGTGT-3′	11	5′-GTCATTTCCAAGGTTCCAAG-3′	12

结果(参见图1)：CMTM3呈现广谱表达，并且在免疫系统和雄性生殖系统高表达。

实施例4、CMTM3的特性分析：

Prosite计算机软件分析，CMTM3为3次跨膜蛋白：第1次：氨基酸残基61-83；第2次：氨基酸残基103-122；第3次：氨基酸残基132-151。

用CMTM3的全长cDNA序列在NCBI HGP数据库中进行检索，并分析其基因组成和染色体定位；结果发现，CMTM3由5个外显子组成：外显子1：氨基酸残基1-222；外显子2：氨基酸残基223-378；外显子3：氨基酸残基379-476；外显子4：氨基酸残基477-593；外显子5：氨基酸残基594-1508。

生物信息学分析发现(参见图2)：CMTM3没有典型的信号肽，富含亮氨酸，更为重要的是，它具有一个亮氨酸拉链结构和两个LXXLL基序，前者常出现在转录因子的结构中，后者提示它可能与核受体(如雄激素受体，雌激素受体等)相结合。

实施例5、CMTM3多肽抗体的制备及鉴定

1、CMTM3多肽的设计

利用DNAstar软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)进行多序列比对以及CMTM3的抗原性、亲疏水性、表面暴露性等预测。选取了CMTM3蛋白中亲水性、抗原性与表面暴露性都较好的三段氨基酸序列(分别命名为肽1、2、3，具体序列如下表2)，在蛋白质数据库中验证其特异性后进行多肽合成。多肽的合成以及鈅孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)的偶联由杭州中肽公司完成，要求多肽纯度大于75％。

表2设计并合成的多肽

	序列	氨基酸数目
	序列	氨基酸数目		肽1	MWPPDPDPDPDPEPAGGSRPGPAVC*(位于CMTM3的N-末端)	25	SEQ ID NO：15(相当于SEQ ID NO：2的氨基酸1～24再添加Cys)
肽2	MQLNDKWQGLC(位于CMTM3的中间)	11	相当于SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97	肽1	MWPPDPDPDPDPEPAGGSRPGPAVC*(位于CMTM3的N-末端)	25	SEQ ID NO：15(相当于SEQ ID NO：2的氨基酸1～24再添加Cys)
肽2	MQLNDKWQGLC(位于CMTM3的中间)	11	相当于SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97	肽3	KFLKQGDSADETTAHKTEEENSDSDSDC*(位于CMTM3的C-末端)	28	SEQ ID NO：16(相当于SEQ ID NO：2的氨基酸残基156～182再添加Cys)

*在C-末端的*为添加的丝氨酸以利于与KLH的偶联

2、CMTM3多肽抗体的制备

将与KLH偶联的肽1、2和3等质量混合后免疫家兔，初次免疫将300μg的肽1、2、3混合多肽用PBS稀释至1ml后与等体积的完全弗氏佐剂充分混合，于两足蹠部各0.25ml皮下注射，其余后背部皮下多点(6点)注射。之后每两周加强免疫一次，使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后，全部后背部皮下多点(8点)注射。第二次加强免疫后14天取兔耳缘静脉血样检测效价，至效价达1∶10⁶以上后，将家兔处死心脏取血，获取血清。

3、CMTM3多肽抗体效价ELISA测定

首先用包被液(0.05M NaHCO₃，pH9.6)将CMTM3裸肽稀释至1μg/ml，加入ELISA酶标板中，100μl/孔，37℃孵育4小时进行抗原包被。然后弃去孔中液体，PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次后加入封闭液(PBS-T+1％BSA)于37℃封闭2小时。再次用PBS-T洗涤3次后，加入不同稀释度(1∶10⁴，1∶10⁵，1∶5×10⁵，1∶10⁶)的免疫前后兔血清，100μl/孔，37℃孵育2小时。彻底洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶5000)，37℃孵育1小时后洗涤，加入TMB底物室温避光显色15分钟，加入2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪490nm波长下测定OD值，高于免疫前血清10倍的为阳性。

结果：ELISA法检测抗体效价，其值高达1∶10⁶。

4、CMTM3多肽抗体亲和纯化

首先将肽1、2和3裸肽各3mg的混合物与溴化氰(CNBr)活化的Sepharose 4B(购自Amersham Pharmacia biotech)偶联，制备多肽亲和层析柱。PBS冲洗并平衡柱料后，分别加入PBS稀释的相应的免疫后血清4℃旋转孵育过夜。PBS冲洗柱料后使用pH2.4、0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱。收集洗脱液，立即用1/20体积的1mol/L Tris-HCl(pH 9.0)中和至中性并透析至PBS中。BCA法定量，SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度。

结果：如图3A所示，50kD大小处为抗体的重链，25kD大小处为抗体的轻链。

5、CMTM3多肽抗体特异性的鉴定

重组CMTM3腺病毒Ad-CMTM3以及对照空载体病毒Ad-null乃委托本元正阳公司按照标准方法重组、包装、纯化获得。TCID₅₀亦由该公司按照标准方法测定。

在LNCaP细胞(ATCC号：CRL-1740，用FBS/RPMI 1640培养)中分别用不同的MOI(MOI＝15、30、60)值超表达Ad-CMTM3后24小时收全细胞裂解液，BCA定量后，取25μg总蛋白进行12.5％SDS-PAGE电泳，而后使用1×CAPS电转液，100V下电转120分钟，将凝胶中的蛋白转移至NC膜(购自Amersham Pharmacia biotech)上。电转移后的NC膜，用5％脱脂奶粉(0.1％TBST配制)室温封闭1小时，加入纯化后的抗CMTM3多抗(1μg/ml)，于4℃过夜反应；用0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤3次，每次10分钟；然后加入抗兔二抗，室温作用1小时；0.1％TBST彻底洗涤后，用LI-COR红外成像系统(Odyssey，Lincoln，NE)检测信号。

结果：如图3B所示，本发明制备并纯化的CMTM3多克隆抗体能够很特异地识别外源CMTM3的蛋白的表达。

实施例6、CMTM3在人睾丸和前列腺组织中存在核定位形式

免疫组织化学检测CMTM3在人正常睾丸和前列腺组织中的表达情况

人睾丸及前列腺组织(购自陕西超英公司)取材后4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。切片经过脱蜡，梯度酒精水化，3％H₂O₂室温避光孵育10min去除内源性过氧化物酶，在柠檬酸钠缓冲液中煮沸进行抗原修复，正常羊血清工作液室温封闭10min，然后滴加CMTM3多肽抗体(10μg/ml，PBS稀释)，4℃过夜反应(12-16h)。同样浓度的正常兔IgG作为阴性对照。PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔二抗室温反应30分钟，PBS洗涤三次，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。

结果：如图4所示，CMTM3在这两种组织中不仅有高水平的表达，而且有明显的核定位形式。

实施例7、PC-3细胞中荧光素酶活性检测

1、PC-3细胞的瞬时转染

转染前一天以1-2×10⁵/ml的密度接种于100mm细胞培养皿中，18-24小时以后，用trypsin+EDTA消化PC-3细胞，再用无血清无抗生素的RPMI 1640洗细胞2遍，调细胞密度为6-10×10⁶/ml，300μl/样品。加入相应的环状质粒(下述)或siRNA(下述)与细胞混匀，质粒和siRNA在对照组和实验组以的空载体或非沉默siRNA(下述)补齐。采用2mm电转杯，140v，20ms。电击后，室温静置5-10分钟，铺至培养板中进行后续实验。

2、荧光素酶活性检测

在PC-3细胞(ATCC号：CRL-1435)中，利用电穿孔的方法导入外源基因，包括内参质粒pRL(Promega)、报告质粒MMTV-Luc(Promega)以及pSG5-AR(Ivan V等，Molecular characterization of the commonly used human androgen receptor expressionvector，pSG5-AR，The prostate，58：319-324(2004))和pcDB-CMTM3质粒，转染后的细胞置于含5％活性碳吸附的胎牛血清的RPMI 1640中培养，24小时后，加入10nM的DHT(Sigma)或等量的无水乙醇，36小时后收获细胞，然后用Dual-luciferase reporter 1000assay system(Promega)检测荧光素酶活性。

结果：如图5A所示，在DHT存在的条件下，AR的转录活性随着超表达CMTM3的增加而下降。

3、Si-CMTM3的合成及筛选

三对双链Si-CMTM3、阴性对照非沉默siRNA乃委托上海吉凯公司合成并PAGE纯化。所有siRNA(如表3所示)均无RNA酶污染。双链siRNA的处理按照该公司的说明进行，所有的siRNA均用吉凯公司提供的1x Universal Buffer(20mM KCl，pH＝7.56mMHEPES和0.2mM MgCl)以20μM终浓度保存。

表3、siRNA序列

SiRNA	靶向序列	SEQ ID NO.
SiRNA	靶向序列	SEQ ID NO.	SiCMTM3-1(No.1)	5’-AGCAGAGCCUUGUCUGUAU-3’	17
SiCMTM3-2(No.2)	5’-CAAUGACCCUUCCAAGAAU-3’	18	SiCMTM3-1(No.1)	5’-AGCAGAGCCUUGUCUGUAU-3’	17
SiCMTM3-2(No.2)	5’-CAAUGACCCUUCCAAGAAU-3’	18	SiCMTM3-3(No.3)	5’-GCCCUCAUCUACUUUGCUA-3’	19
非沉默siRNA	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’	20	SiCMTM3-3(No.3)	5’-GCCCUCAUCUACUUUGCUA-3’	19

将上述合成的三对Si-CMTM3以及阴性对照非沉默siRNA电转至PC-3细胞内，转染方法如上所述。电转后的细胞用含10％的RPMI 1640重悬，铺到6孔板中。在36小时后，用TRIZOL^TM一步法提取细胞总RNA，并用ThermoSCRIPT^TM逆转录酶得到cDNA第一条链，然后用普通PCR和实时定量PCR检测SiCMTM3对内源性CMTM3的抑制效果。

表4、筛选CMTM3-siRNA所用引物的序列

	上游引物	下游引物
	上游引物	下游引物	CMTM3	5′-accgcggccctcatctactt-3′SEQ ID NO.21	5′-aggccttcagtcagagtcc-3′SEQ ID NO.22
GAPDH	5′-tgaaggtcggagtcaacggatttggt-3′SEQ ID NO.23	5′-catgtgggccatgaggtccaccac-3′SEQ ID NO.24	CMTM3	5′-accgcggccctcatctactt-3′SEQ ID NO.21	5′-aggccttcagtcagagtcc-3′SEQ ID NO.22

表5、筛选CMTM3-siRNA所用PCR反应条件

	预变性	变性	退火	延伸	轮数	延伸
	预变性	变性	退火	延伸	轮数	延伸	GAPDH	94℃5min	94℃30s	58℃30s	72℃30s	20	72℃7min
CMTM3	94℃5min	94℃30s	56℃30s	72℃30s	32	72℃7min	GAPDH	94℃5min	94℃30s	58℃30s	72℃30s	20	72℃7min

结果：图5B和图5C所示，No.3是最有效的一条，于是选用其做后续的功能试验。

利用上述的荧光素酶系统，敲减内源性的CMTM3，结果提示(图5D)，AR的转录活性随着SiCMTM3的增加而升高。

实施例8、LNCaP细胞中雄激素受体的转录活性及其稳定性的测定

将细胞置于含5％活性碳/葡聚糖处理的胎牛血清(Charcoal/Dextran treated FBS)的无酚红RMPI1640中，按照3×10⁵/孔的密度接种于6孔板中，每组细胞设三个平行复孔，36h以后，用MOI＝30的空载体或Ad-CMTM3感染细胞(Ad-CMTM3的MOI＝15组中，不足的腺病毒由空载体补齐)，感染后24h，用含终浓度为10nmol的DHT/无水乙醇及5％活性碳/葡聚糖处理的胎牛血清的无酚红RMPI1640培养基替代旧培养基，DHT/无水乙醇刺激24h后，收细胞培养上清，全细胞裂解液及RNA。

细胞培养上清用AXSYM公司的试剂盒测定上清中总PSA的浓度。

全细胞裂解液BCA定量后量取25μg总蛋白进行12.5％SDS-PAGE电泳，而后使用1×CAPS电转液，100V下电转90分钟，将凝胶中的蛋白转移至NC膜上。电转移后的NC膜，用5％脱脂奶粉(0.1％TBST配制)室温封闭1小时，加入商品化的抗AR单抗(1∶500稀释)或抗PSA单抗(1∶200稀释)，于4℃过夜反应；用0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤3次，每次10分钟；然后加入羊抗鼠二抗(1∶10000稀释)，室温作用1小时；0.1％TBST洗涤3次，每次10分钟；上机检测。

收RNA后制备cDNA文库，用设计的AR/PSA特异引物进行实时定量PCR扩增。

结果：LNCap细胞中，AR在有其配体存在的条件下，与PSA启动子上ARE结合，从而启动PSA的转录。所以PSA的表达水平可以反映AR的转录活性。借助于腺病毒系统在LNCap细胞中超表达CMTM3(图6A)，然后分别从mRNA和蛋白质水平检测其对AR和PSA的影响。如图6B和6C所示，实时定量PCR和Western blot的结果提示超表达CMTM3后，PSA的表达下降而AR未受明显影响。为了进一步验证，收集了细胞培养上清，用ELISA检测PSA的浓度。如图6D所示，随着Ad-CMTM3的增多，上清中的PSA的浓度下降。上述实验证明，在LNCaP细胞中，CMTM3的超表达能抑制PSA(前列腺癌的一个重要诊断指标)的表达，且不影响AR的水平。

实施例9、CMTM3抑制前列腺癌来源细胞系、鼻咽癌来源细胞系、乳腺癌来源细胞系的生长

克隆形成实验

分别将转染后的细胞以1000个细胞/孔的密度铺6孔板，设3个复孔，48小时后，加入800μg/ml的G418进行筛选。筛选过程持续14天，每3天更换一次新鲜培养基。2周以后，细胞克隆形成，用4％PFA/PBS室温固定10分钟，0.2％结晶紫染色。大于20个细胞作为1个克隆。

结果：在前列腺癌来源细胞系细胞(PC-3)、鼻咽癌来源细胞(CNE-2)以及乳腺癌来源细胞(T-47D)中的克隆形成实验(图7A、图7B和图7C)表明，与转染了空载体的对照组细胞相比，超表达CMTM3组的克隆形成数量明显减少，且克隆个数小。

实施例10、流式细胞仪检测细胞凋亡

收获感染或转染后的细胞，制备成单细胞悬液，预冷的PBS洗2次后，换结合缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，140mM NaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，2.5mM CaCl₂)洗细胞一次，加入FITC-Annexin V至终浓度0.5μg/ml，4℃孵育30分钟，加入碘化丙啶至终浓度1μg/ml，上流式细胞仪，以488nm氩激发光检测细胞程序性死亡。

结果：与野生型和对照组相比，Ad-CMTM3可以引起DU145发生明显的表型变化，具体表现为细胞数目明显减少，细胞变圆，从培养皿上脱落(如图8A所示)，用流式细胞仪检测CMTM3对DU145细胞凋亡的影响。如图8B所示，与对照组以及野生型细胞相比，Ad-CMTM3导致DU145细胞PI-AnnexinV单阳性及双阳性细胞比例明显增多，并且随着时间推移，CMTM3组细胞程序性死亡越来越明显。在CNE-2(如图8C所示)及T-47D细胞中亦可得到相似的结果。

实施例11、凋亡相关蛋白的检测

收获电转24小时后的CNE-2细胞，预冷的PBS洗两遍后，加入RIPA裂解液(购自北京宝赛生物技术有限公司)，BCA定量(定量试剂盒购自Promega公司)后量取30μg总蛋白进行12.5％SDS-PAGE电泳，而后使用电转液(购自Eppendorf公司)100V下电转90分钟，将凝胶中的蛋白转移至NC膜上。电转移后的NC膜，用5％脱脂奶粉(0.1％TBST配制)室温封闭1小时，加入抗PARP多抗(购自于Cell Signal公司)(1∶100稀释)或抗caspase-3酶原单抗(购自Cell Signal公司)(1∶1000稀释)，于4℃过夜反应；用0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤3次，每次10分钟；然后加入羊抗鼠二抗(1∶10000稀释)，室温作用1小时；0.1％TBST洗涤3次，每次10分钟；上机检测。

结果，如图8D所示，电转CMTM324小时后，使CNE-2细胞PARP的总量下降，PARP切割片断出现，半胱天冬酶-3(caspase-3)酶原减少。

实施例12、Caspase-3活性检测

收获电转24小时后的CNE-2细胞，预冷的PBS洗两遍后，加入RIPA裂解液，BCA定量后量取5μg总蛋白，加入Ac-DEVD-AMC底物及反应缓冲液[25mM HEPES，pH7.5，1mM EDTA，100mM NaCl，0.1％CHAPS和10mM二硫苏糖醇(DTT)]，37℃孵育。用FLUO Star仪(BMG Labtechnologies，Germany)的380nm荧光激发，收集发射波长为460nm的荧光信号，其荧光信号的强弱即代表Caspase-3的活性。

结果，如图8E所示，电转CMTM324小时后，CNE-2caspase-3的活性增加。

实施例13、裸鼠体内成瘤实验

选用SPF(specific pathogen free，无特定病原体)级BALB/C裸鼠，6-8周龄，雄性，6只。用MOI＝30感染DU145细胞，48小时后收获细胞，无血清培养基洗细胞三遍后，调整浓度重悬于无血清培养基，按2×10⁶细胞/点于裸鼠皮下注射。其中3只裸鼠两侧前肢腋下注射Mock组细胞(无CMTM3的对照空载体组细胞)，另外3只注射Ad-CMTM3组细胞。每3天观察成瘤情况并用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，并按照a×b×b的公式计算肿瘤的体积，于33天后取瘤体并称重。

结果：如图9A所示，mock对照组在注射后第12天即有肉眼可见的肿瘤，随着时间的延长，肿瘤持续生长；而Ad-CMTM3组裸鼠体内一直无肉眼可见的肿瘤。在注射肿瘤细胞33天后，处死裸鼠，剥离肿瘤称重，如图9B所示，mock组的肿瘤平均重量为0.16g，而Ad-CMTM3未见肿瘤的形成。该实验证明，CMTM3能明显抑制DU145细胞在裸鼠体内的成瘤性。

实施例14、CMTM3在肝细胞癌中表达明显下调

人正常肝脏及肝细胞肝癌组织芯片(购自陕西超英公司)经过脱蜡，梯度酒精水化，3％H₂O₂室温避光孵育10min去除内源性过氧化物酶，在柠檬酸钠缓冲液中煮沸进行抗原修复，正常羊血清工作液室温封闭10min，然后滴加CMTM3多肽抗体(10μg/ml，PBS稀释)，4℃过夜反应(12-16h)。同样浓度的正常兔IgG作为阴性对照。PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔二抗室温反应30分钟，PBS洗涤三次，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。

为了进一步明确CMTM3的作用，订购了组织芯片(购自陕西超英公司)，发现CMTM3在正常肝脏和肝硬化中的表达水平明显高于在肝细胞癌中的表达水平(结果见表6)，这种表达差异提示CMTM3可能在肝癌的发生发展起着重要的作用，并且有可能用于肝癌及其他肿瘤的辅助诊断和治疗。

表6、CMTM3在正常肝脏、肝硬化、肝细胞癌中的表达水平

肝	全部案例	-	±～++++
肝	全部案例	-	±～++++	正常肝	132	9.09％	90.91％
肝硬化	14	0％	100％	正常肝	132	9.09％	90.91％
肝硬化	14	0％	100％	肝细胞癌	204	53.90％	46.10％

序列表

<110>北京大学

<120>新的肿瘤相关基因或蛋白及其应用

<130>GBI07CN0475-C

<160>24

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1514

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(75)..(623)

<400>1

ccgggtttcc gcttccctcc gggcgcgaga agaggggagc caggccgagc cccggcccta 60

ccgacgccgc cgcc atg tgg ccc cca gac ccc gac ccc gac ccg gac ccc 110

Met Trp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro

1 5 10

gag cct gcc ggc ggc tcc cgt ccc ggc ccc gcg gtc ccc ggg ctc cgc 158

Glu Pro Ala Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg

15 20 25

gcc ctg ctg ccg gcg cgg gct ttc ctc tgc tct ctc aaa ggc cgc ctc 206

Ala Leu Leu Pro Ala Arg Ala Phe Leu Cys Ser Leu Lys Gly Arg Leu

30 35 40

ctg ctg gcc gag tcg ggt ctc tca ttc atc act ttt atc tgc tat gtg 254

Leu Leu Ala Glu Ser Gly Leu Ser Phe Ile Thr Phe Ile Cys Tyr Val

45 50 55 60

gcg tcc tca gca tct gcc ttc ctc aca gcg cct ctg ctg gag ttc ctg 302

Ala Ser Ser Ala Ser Ala Phe Leu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Phe Leu

65 70 75

ctg gcc ttg tac ttc ctc ttt gct gat gcc atg cag ctg aat gac aag 350

Leu Ala Leu Tyr Phe Leu Phe Ala Asp Ala Met Gln Leu Asn Asp Lys

80 85 90

tgg cag ggc ttg tgc tgg ccc atg atg gac ttc ctg cgc tgt gtc acc 398

Trp Gln Gly Leu Cys Trp Pro Met Met Asp Phe Leu Arg Cys Val Thr

95 100 105

gcg gcc ctc atc tac ttt gct atc tcc atc acg gcc atc gcc aag tac 446

Ala Ala Leu Ile Tyr Phe Ala Ile Ser Ile Thr Ala Ile Ala Lys Tyr

110 115 120

tcg gat ggg gct tcc aaa gcc gct ggg gtg ttt ggc ttc ttt gct acc 494

Ser Asp Gly Ala Ser Lys Ala Ala Gly Val Phe Gly Phe Phe Ala Thr

125 130 135 140

atc gtg ttt gca act gat ttc tac ctg atc ttt aac gac gtg gcc aaa 542

Ile Val Phe Ala Thr Asp Phe Tyr Leu Ile Phe Asn Asp Val Ala Lys

145 150 155

ttc ctc aaa caa ggg gac tct gca gat gag acc aca gcc cac aag aca 590

Phe Leu Lys Gln Gly Asp Ser Ala Asp Glu Thr Thr Ala His Lys Thr

160 165 170

gaa gaa gag aat tcc gac tcg gac tct gac tga aggcctggcg ggtgccttgg 643

Glu Glu Glu Asn Ser Asp Ser Asp Ser Asp

175 180

caacctgagc cacacaggcc tccacccctg cgcctcacag gggtcgctgg cgttggagcg 703

gaggcctgga cttctgagtt gcagaggggg ctgcggacac agcaggcccc ctacagcctc 763

aggttctgcc tgagcccagc ctaccaggct tgcccctcag ctcagcactg ttgaccacgc 823

tgcgtatgag ggcatcttgg gtatcccact ccttctcccc atttctgtcc cacagccttc 883

agccctttaa cgtctctgcc aaaaaccagc acaaggagac aaagcagagc cttgtctgta 943

tctgggcagc aggtgttcca tgctgctagg tggcgggggt cgggggtctt ctgtttcact 1003

aacaggaaca aagacagaaa ccatgacagg gctgccccgc caggccccgg tgggtttgtc 1063

tgcacttggt gctcctgccc acaccagcca ctttggtgac aatgaccctt ccaagaatct 1123

ttggttcaag gagcaccagt tccctcttca ttcttgaagc agggagaaat tgacctttgc 1183

cttgtcgccc aggaagtggg gctcggcacc cataactaac acctcccacc cttggaaacc 1243

atgtcttctg ggggtgagat gaccattctg ggtctaagac tgtttcaaag aagagctcat 1303

agactgactg gtccagaaga cagagggtac aacagtggca tcacagtgac agtgtcatgg 1363

ggagctgggc gggcccagcc aaaccctcct tcttcctaga gcccagccag caggcaggag 1423

ttcctggacc ctcaggacag gaaacttcag acttagggca ggctatgggc actgcgagat 1483

gagaccgctt tgtgtcacct acgatatacg a 1514

<210>2

<211>182

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Trp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Glu Pro Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Arg Pro Gly Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg Ala Leu Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Ala Phe Leu Cys Ser Leu Lys Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu

35 40 45

Ser Gly Leu Ser Phe Ile Thr Phe Ile Cys Tyr Val Ala Ser Ser Ala

50 55 60

Ser Ala Phe Leu Thr Ala Pro Leu Leu Glu Phe Leu Leu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Phe Leu Phe Ala Asp Ala Met Gln Leu Asn Asp Lys Trp Gln Gly Leu

85 90 95

Cys Trp Pro Met Met Asp Phe Leu Arg Cys Val Thr Ala Ala Leu Ile

100 105 110

Tyr Phe Ala Ile SerIle Thr Ala Ile Ala Lys Tyr Ser Asp Gly Ala

115 120 125

Ser Lys Ala Ala Gly Val Phe Gly Phe Phe Ala ThrIle Val Phe Ala

130 135 140

Thr Asp Phe Tyr Leu Ile Phe Asn Asp Val Ala Lys Phe Leu Lys Gln

145 150 155 160

Gly Asp Ser Ala Asp Glu Thr Thr Ala His Lys Thr Glu Glu Glu Asn

165 170 175

Ser Asp Ser Asp Ser Asp

180

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cgcgagaaga ggggagccag 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

atctcgcagt gcccatagcc 20

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cgcggatcct attgccgcca ccatg 25

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgggatccgc gtcagagtcc gagtcggaat 30

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

accgcggccc tcatctact 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

aggccttcag tcagagtcc 19

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

atgctctact tcgcccctga t 21

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

gggtgatttg gagccatcc 19

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

tgaccaagtt catgctgtgt 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

gtcatttcca aggttccaag 20

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gaagatggtg atgggatt 18

<210>15

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽1

<400>15

Met Trp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asp Pro Glu Pro Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Arg Pro Gly Pro Ala Val Cys

20 25

<210>16

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽3

<400>16

Lys Phe Leu Lys Gln Gly Asp Ser Ala Asp Glu Thr Thr Ala His Lys

1 5 10 15

Thr Glu Glu Glu Asn Ser Asp Ser Asp Ser Asp Cys

20 25

<210>17

<211>19

<212>RNA

<213>智人

<400>17

agcagagccu ugucuguau 19

<210>18

<211>19

<212>RNA

<213>智人

<400>18

caaugacccu uccaagaau 19

<210>19

<211>19

<212>RNA

<213>智人

<400>19

gcccucaucu acuuugcua 19

<210>20

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>非沉默RNA

<400>20

uucuccgaac gugucacgu 19

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

accgcggccc tcatctactt 20

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

aggcct tcag tcagagtcc 19

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

catgtgggcc atgaggtcca ccac 24

Claims

1、如下(a)或(b)所示的蛋白或其免疫性片段：

所述免疫性片段优选为SEQ ID NO：2的氨基酸残基1～24所示的序列或SEQ IDNO：15所示的序列、SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列、或SEQ ID NO：2的氨基酸残基156～182所示的序列或SEQ IDNO：16所示的序列。

2、编码权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列优选为SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO：1的核苷酸75～620所示的多核苷酸序列。

3、权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列在制备用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物中的应用。

4、如权利要求3所述的应用，其中所述的肿瘤为前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌或肝癌。

5、如权利要求3所述的应用，其中所述的蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白；所述免疫性片段为SEQ ID NO：2的氨基酸残基1～24所示的序列或SEQID NO：15所示的序列，SEQ ID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列，或SEQ ID NO：2的氨基酸残基156～182所示的序列或SEQ ID NO：16所示的序列；所述的多核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列或SEQ ID NO：1的核苷酸75～620所示的多核苷酸序列。

6、如权利要求4或5所述的应用，其中所述的多核苷酸序列包含于载体中；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。

7、一种载体，其包含如权利要求2所述的多核苷酸序列；所述的载体优选为质粒或病毒；所述的病毒优选为腺病毒。

8、一种用于治疗和/或抑制肿瘤的组合物，该组合物含有权利要求1所述的蛋白或其免疫片段，或权利要求2所述的多核苷酸序列，或权利要求7所述的载体；以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。

9、检测权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列的试剂在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用；优选所述的试剂为抗体、反义RNA或小干扰RNA；所述的抗体优选为与SEQ ID NO：15所示的序列、SEQID NO：2的氨基酸残基87～97所示的序列和SEQ ID NO：16所示的序列特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体；所述的小干扰RNA的靶向序列优选为SEQ ID NO.19所示。

10、权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列在制备用于肿瘤辅助诊断、预后判断的组合物中的应用；优选所述的肿瘤为前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌或肝癌。