KR20030016217A - 전립선 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암, 특히 전립선 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 예시된 조성물은 하나 이상의 전립선-특이적 폴리펩타이드, 이의 면역원성 부분, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포, 및 상기 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에 특이적인 T 세포를 포함한다. 개시된 조성물은, 예를 들어, 질환, 특히 전립선 암의 진단, 예방 및/또는 치료에 유용하다.
Description
암은 전 세계에서 중요한 건강 문제이다. 비록 암은 전 세계에서 중요한 건강 문제이다. 비록 암을 검출하고 치료하는데 있어서 진전이 있어 왔지만, 어떠한 백신 또는 다른 광범위하게 성공적인 예방 또는 치료법도 현재 이용가능하지 않다. 현존하는 치료법은 일반적으로 화학요법 또는 수술과 방사능에 기초하는 것으로, 많은 환자에 있어서 부적합한 것으로 판명되고 있다.
전립선 암은 50세의 연령 이상의 남성에서 30%로 평가된 발암율을 갖는, 남성 암의 가장 흔한 형태이다. 압도적인 임상적 증거들이 사람 전립선 암이 골로전이되는 특성을 갖고 있음을 나타내며, 상기 질환은 필연적으로 안드로겐 의존성에서 안드로겐 내성 상태로 진행하여 환자의 사망률을 증가시키는 것으로 보인다. 이러한 일반화된 질환은 현재 미국내에서 남성 암 사망의 2번째 주요 원인이다.
상기 질환에 대한 치료법을 상당히 연구해 왔음에도 불구하고, 전립선 암은 여전히 치료하기 어렵다. 흔히, 치료는 외과적 수술 및/또는 방사능 요법에 기초하지만, 상기 방법들은 발병 사례의 유의한 백분율에서 비효과적이다. 두 개의 이전에 동정된 전립선 특이적인 단백질[전립선 특이적 항원(PSA) 및 전립선 산 포스파타제(PAP)]은 제한적인 치료학적 및 진단학적 잠능을 갖는다. 예를 들면, PSA 수준은 양성 전립선 과형성증(BPH)을 포함하는 비-전립선 암 사례의 백분율에서도 양성을 나타내며, 전립선 암의 존재와 항상 상관관계가 있는 것은 아니다. 추가로, PSA는 전립선 용적과 상관관계가 없으며, 전이의 수준에 대한 지표가 되지도 않는다.
이러한 및 다른 암에 대한 치료법에 대한 상당한 연구에도 불구하고, 전립선 암은 효과적으로 진단하고 치료하는 어렵다. 따라서, 당해 분야에서는 상기 암을 검출하고 치료하는 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시키며 추가로 다른 관련된 장점을 제공한다.
발명의 요약
한 가지 양태에서, 본 발명은,
(a) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330,332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열;
(b) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열에 대한 상보체;
(c) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열의 20개 이상의 연속하는 잔기로 이루어진 서열;
(d) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열;
(e) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788의 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는 서열;
(f) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788의 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열 및
(g) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열의 축퇴성 변이체로 이루어진 그룹으로 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 시험된 전립선 조직 샘플의 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 30% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 50% 이상으로 발현되며, 이는 다른 정상 조직에 비해 약 2배 이상, 바람직하게는 약 5배 이상, 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상 더 높은 수준이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791에서 인용된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.
특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명이 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 면역원성이며, 즉 이들은 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 면역 반응, 특히 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 야기할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기된 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 단편, 변이체 및/또는 유도체를 제공하며, 이때, 상기 단편, 변이체 및/또는 유도체는 바람직하게는 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 또는 789-791로 제시된 폴리펩타이드 서열, 또는 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열의 면역원성 활성에 대해 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 면역원성 활성 수준을 갖는다.
본 발명은 추가로, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 또는 형질감염시킨 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 관련된 양태에서, 약제학적 조성물, 예를 들면, 백신 조성물은 예방학적 또는 치료학적 적용을 위해서 제공된다. 상기 조성물은 일반적으로 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 면역자극제, 예를 들면, 애쥬번트와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명은 추가로, (a) 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편; 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 상기된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예시적인 항원 제시 세포는 수상돌기 세포, 대식세포, 단핵 세포, 섬유아세포 및 B 세포를 포함한다.
관련된 양태에서, (a) 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 추가로, 상기된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 뿐만 아니라 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전형적으로는 약제학적 조성물, 예를 들면, 생리학적으로 허용되는 다체 및/또는 면역자극제를 포함하는 백신 조성물의 형태로 제공한다. 상기 융합 단백질은 상기된 바와 같이, 다중 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 일부분/변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드(들)의 발현, 정제 및/또는 면역원성을 촉진 및/또는 증강시키기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드 절편을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 환자에서 면역 반응, 바람직하게는, 사람 환자에서 T 세포 반응을 자극시키는 방법을 제공한다. 상기 환자는 전립선 암으로 고통받고 있을 수 있으며, 이러한 경우, 상기 방법은 상기 질환에 대한 치료법을 제공하거나, 환자가 상기 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 생각되는 경우 예방학적으로 치료될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 인용된 바와 같은 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 환자는 전립 선 암으로 고통받고 있을 수 있으며, 이러한 경우, 상기 방법은 상기질환에 대한 치료법을 제공하거나, 환자가 상기 질환에 걸릴 위험이 있는 것으로 생각되는 경우 예방학적으로 치료될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 추가로, 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와, 샘플로부터의 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 제거를 허용하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
관련된 양태에서, 환자에게 상기 기술된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 투여함을 포함하는, 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법들이 제공된다.
다른 양태에서, T 세포를 (i) 상기 기술된 폴리펩타이드, (ii) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 중 하나 이상과, T 세포의 자극 및/또는 발현을 허용하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 증가시키는 방법이 추가로 제공된다. 상기된 바와 같이 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단이 또한 제공된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 환자에게 상기 기술된 바와같이 T 세포 집단의 효과적인 양을 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, (a) 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를, (i) 본원에서 기술된 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드,(ii) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 항온 처리하는 단계, 및 (b) 환자에게 상기 증식된 T 세포 유효량을 투여하여 환자에서 암의 발현을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 환자에게 투여하기에 앞서 클론화될 수 있지만, 필요한 것은 아니다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 상기 인용된 바와 같은 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플 중 상기 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하며, (c) 예정된 컷오프 값으로 상기 폴리펩타이드의 양을 비교한 후, 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정함을 포함하여, 환자에서 암, 바람직하게는 전립선 암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체적인 양태에서, 결합제는 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 제1 시점에서 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 상기 인용된 바와 같은 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플 중 상기 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하고, (c) 후속하는 시점에서 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 단계 (b)를 반복하며, (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키고, (b) 샘플 중 상기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 mRNA의 수준을 검출하며, (c) 예정된 컷오프 값을 사용하여 상기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리화하는 폴리뉴클레오타이드의 수준을 비교하여, 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 구체적인 양태에서, mRNA의 양은 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보체에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 통해 검출된다. 다른 구체적인 양태에서, mRNA의 양은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 하이브리드화 기술을 사용하여 검출된다.
관련 양태에서, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키고, (b) 샘플 중 상기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하고, (c) 후속하는 시점에서 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 단계 (b)를 반복하며, (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체 같은 항체, 뿐만 아니라 상기 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단 키트가 또한 제공된다.
본 발명은 상기 및 다른 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해 질 것이다. 본원에서 설명된 모든 참조 문헌은 각각을 개별적으로 도입한 바와 같이 이의 전체를 참조로 본원에 도입한다.
도면 및 서열 동정에 대한 간단한 설명
도 1은 대조군 섬유아세포와 비교하여, 대표적인 전립선-특이적 폴리펩타이드 P502S를 발현하는 섬유아세포를 사멸시키는 T 세포의 능력을 예시한다.
도 2A 및 2B는 대표적인 전립선-특이적 폴리펩타이드 P502S를 발현하는 세포를 인식하는 T 세포의 능력을 예시한다. 각각의 경우, γ-인터페론 스폿의 수는 반응자의 상이한 수를 나타낸다. 도 2A에서, 데이터는 대조군 E75 펩타이드로 펄스시킨 섬유아세포에 비교하여, P2S-12 펩타이드로 펄스시킨 섬유아세포에 대해 제시된다. 도 2B에서, 데이터는 HER-2/neu를 발현하는 섬유아세포에 비교하여, P502S를 발현하는 섬유아세포에 대해 제시된다.
도 3은 P502S로부터 유도된 P1S#10 펩타이드가 HLA-A2에 결합한다는 것을 보여주는 펩타이드 경쟁 결합 분석을 나타낸다. 펩타이드 P1S#10은 TNF 방출 생체분석에서 CTL 클론 D150M58에 대해 HLA-A2 제한된 fluM58 펩타이드의 제시를 억제한다. D150M58 CTL은 인플루엔자 매트릭스 펩타이드 fluM58에 결합하는 HLA-A2에 대해 특이적이다.
도 4는 EGFP-형질도입된 Jurkat A2Kb에 비교하여, P1S#10-펄스된 Jurkat A2Kb 표적 및 P501S-형질도입된 Jurkat A2Kb 표적을 특이적으로 용해시키는 P1S#10 면역화된 마우스로부터 생성된 T 세포주의 능력을 예시한다. 용해율(%)은 지시된 바와 같이, 일련의 이펙터 대 표적 비율로서 나타낸다.
도 5는 대표적인 전립선-특이적 폴리펩타이드 P501S를 발현하는 Jurkat A2Kb 세포를 인식하고 특이적으로 용해시키는 T 세포 클론의 능력을 예시하며, 이는 P1S#10 펩타이드가 P501S 폴리펩타이드의 천연적으로 가공된 에피토프일 수 있다는 것을 입증한다.
도 6A 및 6B는 대표적인 전립선-특이적 항원(P501S)에 대한 CD8+세포주(3A-1)의 특이성을 예시하는 그래프이다. 도 6A는51Cr 방출 분석의 결과를 나타낸다. 특이적인 용해율(%)은 지시된 바와 같이, 일련의 이펙터:표적 비율로서 나타낸다. 도 6B는 지시된 바와 같이 다양한 이펙터:표적 비율에서, P501S로 형질도입된 자가 B-LCL로 자극된 3A-1 세포에 의한 인터페론-감마의 생산을 나타낸다.
도 7은 바큘로바이러스에서 P501S의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 8은 P501S에 대한 에피토프 맵핑 연구의 결과를 예시한다.
도 9는 경막 도메인 및 추정된 세포내 및 세포외 도메인의 위치를 나타내는 P501S 단백질의 도식이다.
도 10은 염색체 22q11.2의 캣 아이 증후군(cat eye syndrome) 영역내 전립선 유전자 P775P, P704P, B305D, P712P 및 P774P의 위치를 나타내는 게놈 맵이다.
도 11은 P501S에 대한 래빗 폴리클로날 항혈청의 특이성을 결정하는 ELISA 분석법의 결과를 나타낸다.
서열 1은 F1-13에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 2는 F1-12에 대한결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 3은 F1-12에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 4는 F1-16에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 5는 H1-1에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 6은 H1-9에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 7은 H1-4에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 8은 J1-17에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 9는 J1-17에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 10은 L1-12에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 11은 L1-12에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 12는 N1-1862에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 13은 N1-1862에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 14는 J1-13에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 15는 J1-13에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 16은 J1-19에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 17은 J1-19에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 18은 J1-25에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 19는 J1-25에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 20은 J1-24에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 21은 J1-24에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 22는 K1-58에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 23은 K1-58에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 24는 K1-63에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 25는 K1-63에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 26은 L1-4에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 27은 L1-4에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 28은 L1-14에 대해 결정된 5' cDNA 서열이다.
서열 29는 L1-14에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 30은 J1-12에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 31은 J1-16에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 32는 J1-21에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 33은 K1-48에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 34는 K1-55에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 35는 L1-2에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 36은 L1-6에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 37은 N1-1858에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 38은 N1-1860에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 39는 N1-1861에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 40은 N1-1864에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 41은 P5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 42는 P8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 43은 P9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 44는 P18에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 45는 P20에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 46은 P29에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 47은 P30에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 48은 P34에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 49는 P36에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 50은 P38에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 51은 P39에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 52는 P42에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 53은 P47에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 54는 P49에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 55는 P50에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 56은 P53에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 57은 P55에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 58은 P60에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 59는 P64에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 60은 P65에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 61은 P73에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 62는 P75에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 63은 P76에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 64는 P79에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 65는 P84에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 66은 P68에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 67은 P80 (또한 P704P로서 인용됨)에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 68은 P82에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 69는 U1-3064에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 70은 U1-3065에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 71은 V1-3692에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 72는 1A-3905에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 73은 V1-3686에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 74는 R1-2330에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 75는 1B-3976에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 76은 V1-3679에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 77은 1G-4736에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 78은 1G-4738에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 79는 1G-4741에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 80은 1G-4744에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 81은 1G-4734에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 82는 1H-4774에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 83은 1H-4781에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 84는 1H-4785에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 85는 1H-4787에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 86은 1H-4796에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 87은 1I-4807에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 88은 1I-4810에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 89는 1I-4811에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 90은 1J-4876에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 91은 1K-4884에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 92는 1K-4896에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 93은 1G-4761에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 94는 1G-4762에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 95는 1H-4766에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 96은 1H-4770에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 97은 1H-4771에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 98은 1H-4772에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 99는 1D-4297에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 100은 1D-4309에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 101은 1D.1-4278에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 102는 1D-4288에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 103은 1D-4283에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 104는 1D-4304에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 105는 1D-4296에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 106은 1D-4280에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 107은 F1-12 (또한 P504S로서 인용됨)에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 108은 F1-12에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 109는 J1-17에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 110은 L1-12 (또한 P501S로서 인용됨)에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 111은 N1-1862 (또한 P503S로서 인용됨)에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 112는 J1-17에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 113은 L1-12 (또한 P501S로서 인용됨)에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 114는 N1-1862 (또한 P503S로서 인용됨)에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 115는 P89에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 116은 P90에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 117은 P92에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 118은 P95에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 119는 P98에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 120은 P102에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 121은 P110에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 122는 P111에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 123은 P114에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 124는 P115에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 125는 P116에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 126은 P124에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 127은 P126에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 128은 P130에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 129는 P133에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 130은 P138에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 131은 P143에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 132는 P151에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 133은 P156에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 134는 P157에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 135는 P166에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 136은 P176에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 137은 P178에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 138은 P179에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 139는 P185에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 140은 P192에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 141은 P201에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 142는 P204에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 143은 P208에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 144는 P211에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 145는 P213에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 146은 P219에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 147은 P237에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 148은 P239에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 149는 P248에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 150은 P251에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 151은 P255에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 152는 P256에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 153은 P259에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 154는 P260에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 155는 P263에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 156은 P264에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 157은 P266에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 158은 P270에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 159는 P272에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 160은 P278에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 161은 P105에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 162는 P107에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 163은 P137에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 164는 P194에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 165는 P195에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 166은 P196에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 167은 P220에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 168은 P234에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 169는 P235에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 170은 P243에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 171은 P703P-DE1에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 172는 P703P-DE1에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 173은 P703P-DE2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 174는 P703P-DE6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 175는 P703P-DE13에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 176은 P703P-DE13에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 177은 P703P-DE14에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 178은 P703P-DE14에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 179는 1G-4736에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 180은 1G-4738에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 181은 1G-4741에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 182는 1G-4744에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 183은 1H-4774에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 184는 1H-4781에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 185는 1H-4785에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 186은 1H-4787에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 187은 1H-4796에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 188은 1I-4807에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 189는 1I-4810에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 190은 1I-4811에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 191은 1J-4876에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 192는 1K-4884에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 193은 1K-4896에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 194는 1G-4761에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 195는 1G-4762에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 196은 1H-4766에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 197은 1H-4770에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 198은 1H-4771에 대해 결정된 3' cDNA 서열이다.
서열 199는 1H-4772에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 200은 1D-4309에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 201은 1D.1-4278에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 202는 1D-4288에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 203은 1D-4283에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 204는 1D-4304에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 205는 1D-4296에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 206은 1D-4280에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 207은 10-d8fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 208은 10-H10con에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 209는 11-C8rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 210은 7.g6fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 211은 7.g6rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 212는 8-b5fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 213은 8-b5rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 214는 8-b6fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 215는 8-b6rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 216은 8-d4fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 217은 8-d4rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 218은 8-g3fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 219는 8-g3rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 220은 8-h11rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 221은 g-f12fwd에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 222는 g-f3rev에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 223은 P509S에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 224는 P510S에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 225는 P703DE5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 226은 9-A11에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 227은 8-C6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 228은 8-H7에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 229는 JPTPN13에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 230은 JPTPN14에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 231은 JPTPN23에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 232는 JPTPN24에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 233은 JPTPN25에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 234는 JPTPN30에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 235는 JPTPN34에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 236은 PTPN35에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 237은 JPTPN36에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 238은 JPTPN38에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 239는 JPTPN39에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 240은 JPTPN40에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 241은 JPTPN41에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 242는 JPTPN42에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 243은 JPTPN45에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 244는 JPTPN46에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 245는 JPTPN51에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 246은 JPTPN56에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 247은 PTPN64에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 248은 JPTPN65에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 249는 JPTPN67에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 250은 JPTPN76에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 251은 JPTPN84에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 252는 JPTPN85에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 253은 JPTPN86에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 254는 JPTPN87에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 255는 JPTPN88에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 256은 JP1F1에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 257은 JP1F2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 258은 JP1C2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 259는 JP1B1에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 260은 JP1B2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 261은 JP1D3에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 262는 JP1A4에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 263은 JP1F5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 264는 JP1E6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 265는 JP1D6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 266은 JP1B5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 267은 JP1A6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 268은 JP1E8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 269는 JP1D7에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 270은 JP1D9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 271은 JP1C10에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 272는 JP1A9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 273은 JP1F12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 274는 JP1E12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 275는 JP1D11에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 276은 JP1C11에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 277은 JP1C12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 278은 JP1B12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 279는 JP1A12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 280은 JP8G2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 281은 JP8H1에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 282는 JP8H2에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 283은 JP8A3에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 284는 JP8A4에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 285는 JP8C3에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 286은 JP8G4에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 287은 JP8B6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 288은 JP8D6에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 289는 JP8F5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 290은 JP8A8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 291은 JP8C7에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 292는 JP8D7에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 293은 P8D8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 294는 JP8E7에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 295는 JP8F8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 296은 JP8G8에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 297은 JP8B10에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 298은 JP8C10에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 299는 JP8E9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 300은 JP8E10에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 301은 JP8F9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 302는 JP8H9에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 303은 JP8C12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 304는 JP8E11에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 305는 JP8E12에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 306은 펩타이드 PS2#12에 대한 아미노산 서열이다.
서열 307은 P711P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 308은 P712P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 309는 CLONE23에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 310은 P774P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 311은 P775P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 312는 P715P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 313은 P710P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 314는 P767P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 315는 P768P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 316 내지 325는 이전에 분리된 유전자들의 결정된 cDNA 서열들이다.
서열 326은 P703PDE5에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 327은 P703PDE5에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 328은 P703P6.26에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 329는 P703P6.26에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 330은 P703PX-23에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 331은 P703PX-23에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 332는 P509S에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 333은 P707P (또한 11-C9로서 인용됨)에 대해 결정된 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 334는 P714P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 335는 P705P (또한 9-F3으로서 인용됨)에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 336은 P705P에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 337은 펩타이드 P1S#10에 대한 아미노산 서열이다.
서열 338은 펩타이드 p5에 대한 아미노산 서열이다.
서열 339는 P509S에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 340은 P778P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 341은 P786P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 342는 P789P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 343은 호모 사피엔스 MM46 mRNA에 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 344는 호모 사피엔스 TNF-알파 자극된 ABC 단백질(ABC50) mRNA에 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 345는 호모 사피엔스 mRNA E-카드헤린에 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 346은 사람 핵-암호화된 미토콘드리아 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)에 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 347은 호모 사피엔스 천연 내성-관련된 대식세포 단백질 2 (NRAMP2)에 대해 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 348은 호모 사피엔스 포스포글루코뮤타제-관련된 단백질 (PGMRP)에 대해 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 349는 사람 mRNA 프로테오좀 서브유니트 p40에 대해 상동성을 나타내는 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 350은 P777P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 351은 P779P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 352는 P790P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 353은 P784P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 354는 P776P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 355는 P780P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 356은 P544S에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 357은 P745S에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 358은 P782P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 359는 P783P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 360은 미확인된 17984에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 361은 P787P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 362는 P788P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 363은 미확인된 17994에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 364는 P781P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 365는 P785P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 366 내지 375는 B305D의 스플라이스 변이체들에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 376은 서열 366에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 377은 서열 372에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 378은 서열 373에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 379는 서열 374에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 380은 서열 375에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 381은 B716P에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 382는 P711P에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 383은 P711P에 대해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 384는 P1000C의 cDNA 서열이다.
서열 385는 CGI-82의 cDNA 서열이다.
서열 386은 23320의 cDNA 서열이다.
서열 387은 CGI-69의 cDNA 서열이다.
서열 388은 L-이디톨-2-데하이드로게나제의 cDNA 서열이다.
서열 389는 23379의 cDNA 서열이다.
서열 390은 23381의 cDNA 서열이다.
서열 391은 KIAA0122의 cDNA 서열이다.
서열 392는 23399의 cDNA 서열이다.
서열 393은 이전에 동정된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 394는 HCLBP의 cDNA 서열이다.
서열 395는 트랜스글루타미나제의 cDNA 서열이다.
서열 396은 이전에 동정된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 397은 PAP의 cDNA 서열이다.
서열 398은 Ets 전사인자 PDEF의 cDNA 서열이다.
서열 399는 hTGR이 cDNA 서열이다.
서열 400은 KIAA0295의 cDNA 서열이다.
서열 401은 22545의 cDNA 서열이다.
서열 402는 22547의 cDNA 서열이다.
서열 403은 22548의 cDNA 서열이다.
서열 404는 22550의 cDNA 서열이다.
서열 405는 22551의 cDNA 서열이다.
서열 406은 22552의 cDNA 서열이다.
서열 407은 22553 (또한, P1020C로 공지됨)의 cDNA 서열이다.
서열 408은 22558의 cDNA 서열이다.
서열 409는 22562의 cDNA 서열이다.
서열 410은 22565의 cDNA 서열이다.
서열 411은 22567의 cDNA 서열이다.
서열 412는 22568의 cDNA 서열이다.
서열 413은 22570의 cDNA 서열이다.
서열 414는 22571의 cDNA 서열이다.
서열 415는 22572의 cDNA 서열이다.
서열 416은 22573의 cDNA 서열이다.
서열 417은 22573의 cDNA 서열이다.
서열 418은 22575의 cDNA 서열이다.
서열 419는 22580의 cDNA 서열이다.
서열 420은 22581의 cDNA 서열이다.
서열 421은 22582의 cDNA 서열이다.
서열 422는 22583의 cDNA 서열이다.
서열 423은 22584의 cDNA 서열이다.
서열 424는 22585의 cDNA 서열이다.
서열 425는 22586의 cDNA 서열이다.
서열 426은 22587의 cDNA 서열이다.
서열 427은 22588의 cDNA 서열이다.
서열 428은 22589의 cDNA 서열이다.
서열 429는 22590의 cDNA 서열이다.
서열 430은 22591의 cDNA 서열이다.
서열 431은 22592의 cDNA 서열이다.
서열 432는 22593의 cDNA 서열이다.
서열 433은 22594의 cDNA 서열이다.
서열 434는 22595의 cDNA 서열이다.
서열 435는 22596의 cDNA 서열이다.
서열 436은 22847의 cDNA 서열이다.
서열 437은 22848의 cDNA 서열이다.
서열 438은 22849의 cDNA 서열이다.
서열 439는 22851의 cDNA 서열이다.
서열 440은 22852의 cDNA 서열이다.
서열 441은 22853의 cDNA 서열이다.
서열 442는 22854의 cDNA 서열이다.
서열 443은 22855의 cDNA 서열이다.
서열 444는 22856의 cDNA 서열이다.
서열 445는 22857의 cDNA 서열이다.
서열 446은 23601의 cDNA 서열이다.
서열 447은 23602의 cDNA 서열이다.
서열 448은 23605의 cDNA 서열이다.
서열 449는 23606의 cDNA 서열이다.
서열 450은 23612의 cDNA 서열이다.
서열 451은 23614의 cDNA 서열이다.
서열 452는 23618의 cDNA 서열이다.
서열 453은 23622의 cDNA 서열이다.
서열 454는 폴레이트 하이드롤라제의 cDNA 서열이다.
서열 455는 LIM 단백질의 cDNA 서열이다.
서열 456은 공지된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 457은 공지된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 458은 이전에 동정된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 459는 23045의 cDNA 서열이다.
서열 460은 23032의 cDNA 서열이다.
서열 461은 클론 23054의 cDNA 서열이다.
서열 462-467은 공지된 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 468-471은 P710P의 cDNA 서열이다.
서열 472는 P1001C의 cDNA 서열이다.
서열 473은 P775P (27505로서 인용됨)의 제1 스플라이스 변이체에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 474는 P775P (19947로서 인용됨)의 제2 스플라이스 변이체에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 475는 P775P (19941로서 인용됨)의 제3 스플라이스 변이체에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 476은 P775P (19937로서 인용됨)의 제4 스플라이스 변이체에 대해결정된 cDNA 서열이다.
서열 477은 서열 474의 서열에 의해 암호화된 제1 아미노산 서열이다.
서열 478은 서열 474의 서열에 의해 암호화된 제2 아미노산 서열이다.
서열 479는 서열 475에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 480은 서열 473의 서열에 의해 암호화된 제1 아미노산 서열이다.
서열 481은 서열 473의 서열에 의해 암호화된 제2 아미노산 서열이다.
서열 482는 서열 473에 의해 암호화된 제3 추정된 아미노산 서열이다.
서열 483은 서열 473에 의해 암호화된 제4 추정된 아미노산 서열이다.
서열 484는 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 Ra12의 처음 30개 아미노산이다.
서열 485는 PCR 프라이머 AW025이다.
서열 486은 PCR 프라이머 AW003이다.
서열 487은 PCR 프라이머 AW027이다.
서열 488은 PCR 프라이머 AW026이다.
서열 489 내지 501 에피토프 맵핑 연구에서 사용된 펩타이드이다.
서열 502는 항-P503S 모노클로날 항체 20D4에 대한 영역을 결정하기 위한 상보성의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 503은 항-P503S 모노클로날 항체 JA1에 대한 영역을 결정하기 위한 상보성의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 504 및 505는 에피토프 맵핑 연구에서 사용된 펩타이드이다.
서열 506은 항-P703P 모노클로날 항체 8H2에 대한 영역을 결정하기 위한 상보성의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 507은 항-P703P 모노클로날 항체 7H8에 대한 영역을 결정하기 위한 상보성의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 508은 항-P703P 모노클로날 항체 2D4에 대한 영역을 결정하기 위한 상보성의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 509 내지 522는 에피토프 맵핑 연구에서 사용된 펩타이드이다.
서열 523은 P703P에 대한 항체를 생성시키는데 사용된 P703P의 성숙 형태이다.
서열 524는 P703P의 추정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 525는 서열 524에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 526은 P790P의 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 527은 P790P의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 528 및 529는 PCR 프라이머이다.
서열 530은 서열 366의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 531은 서열 530의 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열이다.
서열 532는 서열 531의 서열에 의해 암호화된 추정된 아미노산이다.
서열 533은 P775P의 추정된 ORF DNA 서열이다.
서열 534는 서열 533에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 535는 P510S의 제1 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 536은 P510S의 제2 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 537은 서열 535에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 538은 서열 536에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 539는 펩타이드 P501S-370이다.
서열 540은 펩타이드 P501S-376이다.
서열 541-551은 P501S의 에피토프이다.
서열 552는 P712P의 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 553 내지 568은 서열 552내에서 추정된 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 569는 P776P의 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 570은 콘티그 6으로서 인용되는 P776P의 스플라이스 변이체의 결정된cDNA 서열이다.
서열 571은 콘티그 7로서 인용되는 P776P 의 스플라이스 변이체의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 572는 콘티그 14로서 인용되는 P776P의 스플라이스 변이체의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 573은 서열 570의 제1 추정된 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 574는 서열 570의 제2 추정된 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 575는 서열 571의 추정된 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 576-586은 서열 569의 추정된 ORF의 아미노산 서열이다.
서열 587은 P767P 및 P777P의 서열의 DNA 컨센서스 서열이다.
서열 588 내지 590은 서열 587의 추정된 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 591은 P1020C의 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 592는 서열 P1020C의 서열에 의해 추정된 아미노산 서열이다.
서열 593은 50748로서 인용되는 P775P의 스플라이스 변이체이다.
서열 594는 50717로서 인용되는 P775P의 스플라이스 변이체이다.
서열 595는 45985로서 인용되는 P775P의 스플라이스 변이체이다.
서열 596은 38769로서 인용되는 P775P의 스플라이스 변이체이다.
서열 597은 37922로서 인용되는 P775P의 스플라이스 변이체이다.
서열 598은 49274로서 인용되는 P510S의 스플라이스 변이체이다.
서열 599는 39487로서 인용되는 P510S의 스플라이스 변이체이다.
서열 600은 5167.16으로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 601은 5167.1로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 602는 5163.46으로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 603은 5163.42로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 604는 5163.34로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 605는 5163.17로서 인용되는 P504S의 스플라이스 변이체이다.
서열 606은 10640으로서 인용되는 P501S의 스플라이스 변이체이다.
서열 607 내지 615은 PCR 프라이머의 서열이다.
서열 616은 P703P 및 PSA의 융합체의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 617은 P703P 및 PSA의 융합체의 아미노산 서열이다.
서열 618은 유전자 DD3의 cDNA 서열이다.
서열 619는 P714P의 증폭된 cDNA 서열이다.
서열 620-622은 P704P의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 623은 P553S-14로서 인용되는 P553S의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 624는 P553S-12로서 인용되는 P553S의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 625는 P553S-10으로서 인용되는 P553S의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 626은 P553S-6으로서 인용되는 P553S의 스플라이스 변이체의 cDNA 서열이다.
서열 627은 서열 626에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열 628은 서열 623에 의해 암호화되는 제1 아미노산 서열이다.
서열 629는 서열 623에 의해 암호화되는 제2 아미노산 서열이다.
서열 630은 전립선-특이적 트랜스글루타미나제 유전자 (또한, P558S로서 인용됨)의 제1 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 631은 전립선-특이적 트랜스글루타미나제 유전자의 제2 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 632는 서열 630의 서열에 의해 암화된 아미노산 서열이다.
서열 633은 서열 631의 서열에 의해 암화화된 아미노산 서열이다.
서열 634는 P788P의 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 635는 서열 634에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 636은 P788P의 다형성 변이체의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 637은 서열 636에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 638은 P703P로부터의 펩타이드 4의 아미노산 서열이다.
서열 639는 P703P로부터의 펩타이드 4를 암호화하는 cDNA 서열이다.
서열 640-655는 P703P의 에피토프를 암호화하는 cDNA 서열이다.
서열 656-671은 P703P의 에피토프의 아미노산 서열이다.
서열 672 및 673은 PCR 프라이머이다.
서열 674는 이. 콜라이(E. coli) 중에서 발현되는 P788P의 N-말단 부분을 암호화하는 cDNA 서열이다.
서열 675는 이. 콜라이 중에서 발현되는 P788P의 N-말단 부분의 아미노산 서열이다.
서열 676은 엠. 투베르큘로시스 항원 Ra12의 아미노산 서열이다.
서열 677 및 678은 PCR 프라이머이다.
서열 679는 Ra12-P510S-C 작제물의 cDNA 서열이다.
서열 680은 P510S-C 작제물의 cDNA 서열이다.
서열 681은 P510S-E3 작제물의 cDNA 서열이다.
서열 682는 Ra12-P510S-C 작제물의 아미노산 서열이다.
서열 683은 P510S-C 작제물의 아미노산 서열이다.
서열 684는 P510S-E3 작제물의 아미노산 서열이다.
서열 685 내지 690은 PCR 프라이머이다.
서열 691은 작제물 Ra12-P775P-ORF3의 cDNA 서열이다.
서열 692는 작제물 Ra12-P775P-ORF3의 아미노산 서열이다.
서열 693 및 694는 PCR 프라이머이다.
서열 695는 P703P His 태그 융합 단백질의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 696은 P703P His 태그 융합 단백질의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 697 및 698은 PCR 프라이머이다.
서열 699는 P705P His 태그 융합 단백질의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 700은 P705P His 태그 융합 단백질의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 701 및 702는 PCR 프라이머이다.
서열 703은 P711P His 태그 융합 단백질의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 704는 P711P His 태그 융합 단백질의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 705는 엠. 투베르큘로시스 항원 Ra12의 아미노산 서열이다.
서열 706 및 707은 PCR 프라이머이다.
서열 708은 작제물 Ra12-P501S-E2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 709는 작제물 Ra12-P501S-E2의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 710은 P501S의 에피토프에 대한 아미노산 서열이다.
서열 711은 서열 710을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 712는 P501S의 에피토프에 대한 아미노산 서열이다.
서열 713은 서열 712를 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 714는 에피토프 맵핑 연구에서 사용되는 펩타이드이다.
서열 715는 P501S의 에피토프에 대한 아미노산 서열이다.
서열 716은 서열 715를 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 717 내지 719는 P501S의 CD4 에피토프에 대한 아미노산 서열이다.
서열 720 내지 722는 서열 717 내지 719의 서열을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 723 내지 734는 P703P의 추정된 CTL 에피토프에 대한 아미노산 서열이다.
서열 735는 P789P에 대한 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 736은 서열 735에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열 737은 콘티그 6으로서 P776P의 스플라이스 변이체에 대해 결정된 전체 길이의 cDNA 서열이다.
서열 738 내지 739는 콘티그 7로서 인용되는 P776P의 스플라이스 변이체에 대해 결정된 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 740 내지 744은 서열 737에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열 745 내지 750은 콘티그 7로서 인용되는 P776P의 스플라이스 변이체에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열 751은 사람 경막 프로테아제 세린 2의 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 752는 서열 751에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.
서열 753은 사람 경막 프로테아제 세린 2의 제1 209개 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열이다.
서열 754는 사람 경막 프로테아제 세린 2의 제1 209개 아미노산이다.
서열 755는 P501S의 펩타이드 296-322의 아미노산 서열이다.
서열 756-759는 PCR 프라이머이다.
서열 760은 P501S-특이적 T 세포 클론 4E5에 대한 T 세포 수용체의 Vb 쇄에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 761은 P501S-특이적 T 세포 클론 4E5에 대한 T 세포 수용체의 Va 쇄에 대해 결정된 cDNA 서열이다.
서열 762는 서열 760에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 763은 서열 761에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 764는 종결 코돈을 포함하는 P768P에 대한 전체 길이 오픈 리딩 프레임이다.
서열 765는 종결 코돈을 포함하지 않는 P768P의 전체 길이 오픈 리딩 프레임이다.
서열 766은 서열 765에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 767-772는 P768P의 추정된 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 773은 P835P의 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 774는 이전에 동정된 클론 FLJ13581의 cDNA 서열이다.
서열 775는 종결 코돈을 포함하지 않는 P835P의 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열이다.
서열 776은 종결 코돈을 포함하지 않는 P835P의 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열이다.
서열 777은 P835P의 전체 길이 아미노산 서열이다.
서열 778 내지 785은 P835P의 세포내 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 786은 P1000C에 대한 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 787은 종결 코돈을 포함하는 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열이다.
서열 788은 종결 코돈을 포함하지 않는 P1000C의 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열이다.
서열 789는 P1000C의 전체 길이 아미노산 서열이다.
서열 790은 서열 789의 아미노산 1 내지 100번이다.
서열 791은 서열 789의 아미노산 100-492번이다.
서열 792는 α 프리프로-P501S 재조합 단백질의 아미노산 서열이다.
본 발명은 일반적으로 전립선 암 같은 암의 치료 및 진단에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로 전립선-특이적 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 백신 같은 약제학적 조성물, 및 전립선 암을 진단하고 치료하기 위한 다른 조성물에서 유용하다.
본 발명은 일반적으로 암, 특히 전립선 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 치료 및 진단에서의 용도에 관한 것이다. 하기 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명의 예시적인 조성물은 폴리펩타이드, 특히 면역원성 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 하에 및 다른 결합제, 항원 제시 세포(APC) 및 면역계 세포(예를 들면, T 세포)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시는 그밖에 특정하게 언급되지 않는 한, 당해 분야의 기술내의 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 상기 중 다수는 예시를 목적으로 하기에서 기술된다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어져 있다. 참조[예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R.Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)].
본원에서 인용되는 상기 및 하기의 모든 공보, 특히 및 특허원은 이의 전체를 본원에 참조로 도입한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 관사는 내용이 그밖에 명확하게 지시되지 않는 한, 복수 언급을 포함한다.
폴리펩타이드 조성물
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"는 아미노산 서열 같이, 이의 통상적인 의미에서 사용된다. 폴리펩타이드는 생성물의 특정한 길이에 제한되지 않으며, 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 단백질은 폴리펩타이드의 정의내에 포함되며, 상기 용어는 그밖에 특정되지 않는 한, 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 또한, 천연 발생적 및 비 천연 발생적인, 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 변형을 인용하거나 배제하지 않는다. 폴리펩타이드는 전체 단백질 또는 이의 서브 서열일 수 있다. 본 발명의 내용에서 관심의 대상인 특정 폴리펩타이드는 에피토프를 포함하는 아미노산 서열, 즉 실질적으로 폴리펩타이드의 면역원성 특성에 관여하며 면역 반응을 유발할 수 있는 항원 결정기이다.
본 발명의 특정 예시적인 폴리펩타이드는 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626,630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788 중 어느 하나에서 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 중간 정도의 엄격한 조건 또는 대안으로, 높은 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열에 의해 암호화되는 것들을 포함한다. 특정 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 전립선-특이적 단백질 또는 전립선-특이적 폴리펩타이드로서 종종 본원에서 인용되며, 이는 이의 동정이 전립선 조직 샘플 중 증가된 수분의 발현에 부분적으로 기초하기 때문이다. 따라서, "전립선-특이적 폴리펩타이드" 또는 "전립선-특이적 단백질"은 일반적으로 본 발명의 폴리펩타이드 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 인용하며, 이는 본원에서 제공된 대표적인 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이, 다른 정상 조직에서의 발현 수준에 비해, 적어도 2배, 및 바람직하게는 5배 이상의 수준으로, 시험된 전립선 샘플의 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 30% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 50% 이상으로, 전립선 조직 샘플의 실질적인 부분에서 발현된다. 본 발명의 전립선-특이적 서열은 종양 세포의 증가된 발현에 기초하여, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 진단 마커로서 뿐만 아니라 치료제로서 특정한 용도를 갖는다.
특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역원성이며, 즉 전립선 암에 걸린 환자로부터의 항혈청 및/또는 T 세포로 면역분석법(ELISA 또는 T 세포 자극 분석법)에서 검출가능하게 반응한다. 면역원성 활성에 대한 스크리닝은 수련자에게 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 스크리닝은 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 예시적인 예에서, 폴리펩타이드는 고체 지지체 고정될 수 있으며, 환자 혈청과 접촉되어 고정된 폴리펩타이드에 대한 혈청 내 항체의 결합을 가능하게 한다. 비 결합된 혈청은 제거되고 결합된 항체는 예를 들면,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 검출할 수 있다.
숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본원에 설명된 폴리펩타이드의 면역원성 부분은 또한 본 발명에 의해 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "면역원성 부분"은 상기 폴리펩타이드를 인식하는 B 세포 및/또는 T 세포 표면 항원 수용체와 면역학적으로 반응성(즉, 특이적으로 결합하는)인 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드의 단편이다. 면역원성 부분은 일반적으로 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd, ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 본원에서 인용된 참조 문헌에서 요약된 바와 같은, 공지된 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 기술은 항원-특이적 항체, 항혈청, 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해서 폴리펩타이드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항혈청 및 항체는 이들이 항원에 특이적으로 결합하는 경우(즉, 이들이 ELISA 및 다른 면역분석법에서 상기 단백질과 반응하지만, 관련이 없는 단백질과는 검출가능하게 반응하지 않는다), 이는 "항원-특이적"이다. 상기 항혈청 및 항체는 본원에서 기술된 바와 같고, 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 부분은 전체 길이 폴리펩타이드의 반응성에 비해 실질적으로 낮지 않는 수준으로 항혈청 및/또는 T 세포와 반응하는(예를 들면, ELISA 및/또는 T 세포 반응성 분석법에서) 부분이다. 바람직하게는, 면역원성 부분의 면역원성 활성의 수준은 전체 길이 폴리펩타이드에 대한 면역원성의 적어도 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상이다. 특정 예에서, 바람직한 면역원성 부분은 상응하는 전체 길이 폴리펩타이드보다 더 높은 면역원성 활성 수준을 갖는, 예를 들면, 약 100% 이상, 또는 150% 이상의 면역원성 활성을 갖는 것으로 확인될 것이다.
특정 다른 구체적인 양태에서, 예시적인 면역원성 부분은 N-말단 리더 서열 및/또는 경막 도메인이 결실된 펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 면역원성 부분은 성숙 단백질에 대해 작은 N- 및/또는 C-말단 결실(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)을 함유할 것이다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 T 세포와 면역학적으로 반응성인 폴리펩타이드 하나 이상, 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체, 특히 본원에 설명된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 또한 포함할 수 있다.
또 다른 본 발명의 구체적인 양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 설명된 폴리펩타이드 하나 이상과 면역학적으로 반응성인 T 세포 및/또는 항체를 유발할 수 있는 폴리펩타이드 하나 이상, 또는 본원에 설명된 폴리뉴클레오타이드 서열 중에 함유된 연속하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 하나 이상, 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체, 또는 중간 정도 내지 높은 엄격함의 조건하에서 상기 서열 중 하나 이상에 하이브리드화하는 핵산 서열 하나 이상을 포함하도록 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791에서 나타낸 것들, 또는 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681,711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788에서 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 것들 같이, 본원에서 나타낸 폴리펩타이드 조성물의 약 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 100개 또는 그 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술된 폴리펩타이드 조성물의 변이체를 제공한다. 폴리펩타이드 변이체는 일반적으로 본원에서 나타낸 폴리펩타이드 서열에 이의 길이를 따라서, 전형적으로 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 그 이상의 동일성을 나타낼 것이다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 볼 발명에 의해 제공되는 폴리펩타이드 단편 및 변이체는 본원에서 나타낸 전체 길이 폴리펩타이드와 반응하는 항체 및/또는 T 세포와 면역학적으로 반응성이다.
또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 폴리펩타이드 단편 및 변이체는 본원에서 구체적으로 나타낸 전체 길이 폴리펩타이드 서열에 의해 나타나는 면역원성 활성의 약 50%, 바람직하게는 약 70%, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 면역원성 활성 수준을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 폴리펩타이드 "변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 본원에서 구체적으로 설명된 폴리펩타이드와는 전형적으로 상이한 폴리펩타이드이다. 상기 변이체는 천연 발생적일 수 있거나 합성적으로 생성될 수 있으며, 예를 들면, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형시키고 당해 분야에 공지된 수 많은 기술 중 하나를 사용하여 본원에서 설명된 바와 같은 면역원성 활성을 평가함으로써 합성적으로 생성될 수 있다
예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예시적인 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 경막 도메인 같은 하나 이상의 부분에서 결실되어진 것들을 포함한다. 다른 예시적인 변이체는 성숙 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 작은 부분(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)이 제거된 변이체를 포함한다.
수 많은 예에서, 변이체는 보존적인 치환을 포함할 것이다. "보존적인 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖은 또 다른 아미노산으로 치환되어, 결과적으로 펩타이드 화학 분야의 숙련자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수화도 특성이 실질적으로 변화되지 않을 것으로 예견하는 것이다. 상기 기술된 바와 같이, 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 수행될 수 있으며, 바람직한 특성, 예를 들면, 면역원성 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시켜 등가물, 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 개선된 면역원성 변이체 또는 이의 부분을 제조하는 것이 바람직한 경우, 당해 분야의 숙련자는 전형적으로 표 1에 따라 DNA 서열을 암호화하는 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 것이다.
예를 들면, 특정 아미노산은 예를 들면, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위 같은 구조를 가지고 상호작용하는 결합 능력의 평가할 만한 손실 없이 단백질 구조 중 다른 아미노산을 대체할 수 있다. 이는 단백질의 생물학적 기능성 활성을 규정하는 단백질의 상호작용 능력 및 특성이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 단백질 서열에서, 및 물론, 이의 기초가 되는 DNA 암호화 서열에서 수행될 수 있으며, 그럼에도 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 다양한 변화가 기술된 조성물의 펩타이드 서열, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열에서, 생물학적 유용성 또는 활성의 평가할 만한 손실 없이 수행될 수 있다는 것을 의도한다.
| 아미노산 | 코돈 | |||||||
| 알라닌 | Ala | A | GCA | GCC | GCG | GCU | ||
| 시스테인 | Cys | C | UGC | UGU | ||||
| 아스파르트산 | Asp | D | GAC | GAU | ||||
| 글루탐산 | Glu | E | GAA | GAG | ||||
| 페닐알라닌 | Phe | F | UUC | UUU | ||||
| 글리신 | Gly | G | GGA | GGC | GGG | GGU | ||
| 히스티딘 | His | H | CAC | CAU | ||||
| 이소루이신 | Ile | I | AUA | AUC | AUU | |||
| 라이신 | Lys | K | AAA | AAG | ||||
| 루이신 | Leu | L | UUA | UUG | CUA | CUC | CUG | CUU |
| 메티오닌 | Met | M | AUG | |||||
| 아스파라긴 | Asn | N | AAC | AAU | ||||
| 프롤린 | Pro | P | CCA | CCC | CCG | CCU | ||
| 글루타민 | Gln | Q | CAA | CAG | ||||
| 아르기닌 | Arg | R | AGA | AGG | CGA | CGC | CGG | CGU |
| 세린 | Ser | S | AGC | AGU | UCA | UCC | UCG | UCU |
| 트레오닌 | Thr | T | ACA | ACC | ACG | ACU | ||
| 발린 | Val | V | GUA | GUC | GUG | GUU | ||
| 트립토판 | Trp | W | UGG | |||||
| 티로신 | Tyr | Y | UAC | UAU |
상기 변화를 수행하는데 있어서, 아미노산의 수화도 지수가 고려될 수 있다. 단백질 상의 상호작용 생물학적 기능을 제공하는데 있어서 수화도 아미노산 지수의 중요성은 당해 분야에서 일반적으로 이해되고 있다[kyte and Doolittle, 1982, 본원에 참조로 도입됨]. 아미노산의 상대적인 수화도 특성이 수득되는 단백질의 2차구조에 기여하며, 이는 차례로, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 다른 분자와 상기 단백질의 상호작용을 규정하는 것으로 인정되고 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 변화 특성[Kyte and Doolittle, 1982]에 기초하여 수화도 지수가 배열되었다. 상기 값은 다음과 같다: 이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
특정 아미노산은 유사한 수화도 지수 또는 득점을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 수득할 수 있으며, 즉 여전히 생물학적 기능으로 등가의 단백질을 수득할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어져 있다. 상기 변화를 수행하는데 있어서, 수호도 지수가 ±2인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1내의 아미노산 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 내의 아미노산 치환이 보다 더 특히 바람직하다. 또한, 유사 아미노산의 치환이 수화도에 기초하여 효과적으로 수행될 수 있는 것으로 당해 분야에서 이해되고 있다. 문헌[미국 특허 제4,554,101호, 이의 전체가 본원에 참조로 구체적으로 도입됨]은, 이의 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 단백질의 가장 국부적인 평균 친수도는 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있음을 진술하고 있다.
문헌[미국 특허 제4,554,101호]에서 기술된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기들에 할당되어져 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ±1); 글루타메이트 (+3.0 ±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 이소루이신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어 여전히 생물학적으로 등가물을 수득할 수 있으며, 특히 면역학적으로 등가인 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 변화에서, 친수성 값이 ±2내인 아미노산 치환이 바람직하며, ±1내인 아미노산 치환이 특히 바람직하며, ±0.5내인 아미노산 치환이 보다 더 바람직하다.
상기 개략된 바와 같이, 따라서, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들면, 이의 소수성, 친수성, 변화, 크기 등에 기초한다. 전술한 다양한 특성들을 고려한 예시적인 치환은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있으며, 다음을 포함한다: 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 루이신 및 이소루이신.
또한, 임의의 폴리뉴클레오타이드가 추가로 변형되어 생체내에서 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형은 5' 및/또는 3' 말단에서의 플랭킹 서열의 부가, 골격내 포스포디에스터라제 대신 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 퀴에오신 및 위부토신 같은 비전형적인 염기의 포함 뿐만 아니라, 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 다른 변형된 형태를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 치환은 추가로, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성에서 유사성에 기초하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고, 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며, 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산은 루이신, 이소루이신 및 발린; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적인 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 그룹은 다음을 포함한다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. 변이체가 또한, 또는 선택적으로 비보존적인 변화를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 변이체 폴리펩타이드는 5개 아미노산 이하의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과 상이하다. 변이체는 또한 (또는 선택적으로), 예를 들면, 상기 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 수화도 특성에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단에서 신호(또는 리더) 서열을 포함할 수 있으며, 이는 단백질의 수송을 해독과 동시에 또는 해독후에 지시한다. 상기 폴리펩타이드는 또한, 상기 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정 각각을 위해서, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 증강시키기 위해서, 링커 또는 다른 서열에 접합될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합될 수 있다.
폴리펩타이드 서열을 비교하는 경우, 두 개의 서열은 두 개의 서열내 아미노산 서열이 하기 기술되는 바와 같이, 최대 일치를 위해서 배열되는 경우에 동일한 경우 "동일성"인 것으로 고려된다. 두 개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적인 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교 창 상에서 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "비교 창"은 약 20개 이상의 연속하는 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 연속하는 위치의 절편을 의미하며, 이때, 서열은 두 개의 서열을 최적으로 배열한 후, 연속하는 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적의 배열은 디폴트 변수를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(제조원: DNASRTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene suite에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로그램은 하기 참조문헌에 기술된 수 개의 배열 구조를 구체화한다[Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymologyvol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989)CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971)Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987)Mol. Biol. Evol.4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973)Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983)Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730].
대안으로, 비교를 위한 서열의 최적의 배열은 문헌[Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482]의 국부적 동일성 알고리듬에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]의 동일성 배열 알고리듬에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 연구 방법에 의해, 상기 알고리듬의 컴퓨터화된 수단(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, USA)에 의해 또는 정밀 조사에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성(%)를 결정하기에 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이며 이는 문헌[Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. 215: 403-410]에 각각 기술되어져 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대한 서열 동일성(%)을 측정하게 위해서, 본원에 기술된 변수들과 함께 사용할 수 있다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 제조원[National Center for Biotechnology Information]을 통해 공개적으로 이용가능하다. 아미노산 서열에 있어서, 득점 매트릭스를 사용하여 축적된 득점을 계산할 수 있다. 각각의 방향에서 워드 히트의 신장은 다음의 경우에 중지된다: 이의 최대 달성된 값으로부터 양 X에 의해 축적된 배열 득점이 감소하는 경우; 하나 이상의 네가티브-득점 잔기 배열의 축적으로 인해, 0 이하로 축적 득점이 가는 경우; 또는 서열 각각의 말단에 도달하는 경우. BLAST 알고리듬 변수, W, T 및 X가 배열의 민감성 및 속도를 결정한다.
한 가지 바람직한 접근법에서, "서열 동일성(%)"은 두 개의 서열의 최적 배열을 위해서 참조 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하는 경우, 폴리펩타이드 서열의 일부가 비교 창에서 20% 미만, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있는 경우, 약 20개 위치에서 비교의 창 상에서 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 측정된다. 상기 백분율은 동일한 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 야기되는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 수득하고, 매치된 위치의 수를 참조 서열내 전체 위치의 수(즉, 창의 크기)로 나누며 수득된 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성(%)을 수득함으로써 계산된다.
다른 예시적인 구체적인 양태에서, 폴리펩타이드는 본원에서 기술된 바와 같은 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 또는 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 하나 이상과 공지된 종양 단백질 같은 관련되지 않은 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 융합 상대는 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 상대), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하도록 보조될 수 있거나, 천연 재조합 단백질 이상의 높은 수율로 단백질을 발현하도록(발현 증강제) 보조할 수 있다. 특정 바람직한 융합 상대는 면역학적 및 발현 증강성 융합 상대이다. 다른 융합 상대는 폴리펩타이드의 용해성을 증가시키거나 폴리펩타이드가 목적하는 세포내 구획으로 표적화되게 하도록 선택될 수 있다. 여전히 추가의 융합 상대는 친화도 태그를 포함하며, 이는 폴리펩타이드의 정제를 촉진시킨다.
융합 폴리펩타이드는 일반적으로 화학적 접합을 포함하는, 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 발현 시스템에서 재조합 폴리펩타이드로서 발현되어, 비-융합된 폴리펩타이드에 비해 증가된 수준의 생산을 가능하게 한다. 간략하면, 상기 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열을 개별적으로 조합하고, 적합한 발현 벡터내로 결합시킨다. 하나의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을 펩타이드 링커의 존재 또는 부재하에 제2 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 결합시켜 서열의 판독 프레임이 협조적이도록 한다. 이는 단일 융합 폴리펩타이드로의 해독을 가능하게 하여 두 성분 폴리펩타이드 모두의 생물학적 활성을 보유하게 된다.
펩타이드 링커 서열을 사용하여 제1 및 제2 폴리펩타이드 성분을 일정한 거리를 두게 하여 각각의 폴리펩타이드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되는 것을 충분하게 한다. 상기 펩타이드 링커 서열을 다해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩타이드내로 도입시킨다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음 인자들에 기초하여 선택될 수 있다: (1) 유연한 증폭된 형태를 채택하는 이의 능력, (2)제1 및 제2 폴리펩타이드 상의 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택하는 이의 능력, 및 (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala 같은 다른 인접한 중성 아미노산이 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[Maratea et al.,Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; U.S. Patent No. 4,935,233 and U.S. Patent No. 4,751,180]에 기술되어져 있다. 링커 서열은 제1 및 제2 폴리펩타이드가 기능성 도메인을 분리시키고 공간적 방해를 예방할 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우, 불필요하다.
결합된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 인자에 작동적으로 결합된다. DNA의 발현에 관여하는 조절 인자는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 바로 앞에 위치한다. 유사하게, 해독을 종결하는데 필요한 종결 코돈 및 전사 종결 신호는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3' 바로 뒤에 위치한다.
융합 폴리펩타이드는 본원에 기술된 폴리펩타이드와 함께, 리콜 반응을 야기할 수 있는 면역원성 단백질 같은 비관련된 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 상기 단백질의 예는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질[참조: 예를 들면, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336: 86-91, 1997]을 포함한다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 면역학적 융합 상대는 마이코박테리움투베르쿨로시스-유도된 Ra12 단편 같은 마이코박테리움으로부터 유도된다. Ra12 조성물 및 이의 이종성 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열의 발현 및/또는 면역원성의 증가 용도는 문헌[미국 특허원 제60/158,585호]에 기술되어져 있으며, 이의 내용은 이의 전체가 본원에 참조로 도입된다. 간략하면, Ra12는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 서브 서열인 폴리뉴클레오타이드 영역이다. MTB32A는 엠. 투베르쿨로시스의 병원성 균주 및 비병원성 균주에서 유전자에 의해 암호화된 32kDa 분자량의 세린 프로테아제이다. 상기 MTB32A의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 문헌[예를 들면, 미국 특허원 제60/158,585호, 또한 참조: Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67: 3998-4007, 본원에 참조로 도입됨]에 기술되어져 있다. MTB32A 암호화 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현되며 정제 공정을 통해 용해성 폴리펩타이드로서 잔류한다. 또한, Ra12는 이를 융합시킨 이종성 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 한 가지 바람직한 Ra12 융합 폴리펩타이드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14kD C-말단 단편을 포함한다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 Ra12 폴리펩타이드의 일부분을 암호화하는 약 15개 보존적인 뉴클레오타이드 이상, 약 30개 뉴클레오타이드 이상, 약 60개 뉴클레오타이드 이상, 약 100개 뉴클레오타이드 이상, 약 200개 뉴클레오타이드 이상, 또는 약 300개 뉴클레오타이드 이상을 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함하여, 암호화된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 천연 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 비해, 실질적으로 소멸되지 않도록할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 약 70% 이상 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일성, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상 동일성을 나타낸다.
다른 바람직한 구체적인 양태에서, 면역학적 융합 상대는 그램-음성 세균 헤모필러스 인플루엔자 B[제WO 91/18926호]의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도된다. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 단백질의 대략 처음 1/3(예를 들면, 처음 N-말단 100 내지 110개 아미노산)을 포함하며, 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, N-말단 상에 포함된 지단백질 D 융합 상대의 처음 109개 잔기는 상기 폴리펩타이드와 부가적인 외인성 T-세포 에피토프를 제공하며 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킨다(따라서, 발현 증강제로서 기능성이다). 상기 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 대한 항원의 최적의 제시를 보장한다. 다른 융합 상대는 인플루엔자 바이러스로부터의 비-구조 단백질인 NS1(헤마글루티딘)을 포함한다. 전형적으로, N-말단 81개 아미노산이 사용되며, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편이 사용될 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 면역학적 융합 상대는 LYTA로 공지된 단백질, 또는 이의 일부분(바람직하게는 C-말단 부분)이다. LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유도되며, 이는 아미다제 LYTA로 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성한다[LytA 유전자에 의해 암호화됨, Gene 43: 265-292, 1986]. LYTA는 펩티도글리칸 골격에서 특정 결합을 특이적으로 부해시키는 오토라이신이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE 같은 특정 콜린 유사체에 대한 친화도에 관여한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발을 위해 사용되어져 왔다. 아미노 말단에서 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 기술되어져 있다[참조: Biotechnology 10: 795-798, 1992]. 바람직한 구체적인 양태내에서, LYTA의 반복 부분이 융합 폴리펩타이드 내로 도입될 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 출발하여 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188 내지 305를 도입시킨다.
또 다른 예시적인 구체적인 양태는 융합 폴리펩타이드, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 이때 융합 상대는 문헌[미국 특허원 제5,633,234호]에 기술된 바와 같은 엔도좀/리소좀 구획으로 폴리펩타이드를 지시할 수 있는 표적화 신호를 포함한다. 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드는 표적화 신호와 융합되는 경우, MHC II부류 분자와 보다 효과적으로 결합되어 상기 폴리펩타이드에 대한 CD4+T 세포의 특이성에 대한 생체내 증강된 자극을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 공지된 합성 및/또는 재조합 기술 중 하나를 사용하여 제조할 수 있으며, 재조합 기술이 추가로 하기에 기술된다. 폴리펩타이드, 일반적으로 약 150개 아미노산 미만의 이의 일부분 및 다른 변이체는 일반적으로 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 한 가지 예시적인 예에서, 상기 폴리펩타이드는 메리필드 고체-상 합성법 같은 시판중인 고체-상 기술 중 하나를 이용하여 합성되며, 이때 아미노산은 성장하는 아미노산 쇄에 연속적으로 부가된다. 문헌 참조[Merrifield, J.Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동화된 합성을 위한 장비는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈 디비젼(Foster City, CA) 같은 공급원에 의해 시판중이며, 제조업자의 사용설명서에 따라서 작동시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물(융합 폴리펩타이드 포함)은 분리된다. "분리된 폴리펩타이드"는 이의 최초 환경으로부터 제거되는 것이다. 예를 들면, 천연 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연 시스템에서 함께 조재하는 물질 일부 또는 모두로부터 분리되는 경우 분리된 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 또한 정제되며, 예를 들면, 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하게 정제된다.
폴리뉴클레오타이드 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 용어 "DNA" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환가능하게 특정 종의 전체 게놈 DNA로부터 분리된 DNA 분자를 의미하는데 필수적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 다른 암호화 서열로부터 실질적으로 떨어진 것, 및 DNA 분자가 염색체 단편 또는 다른 기능성 유전자 또는 폴리펩타이드 암호화 영역 같은 비관련된 암호화 DNA를 함유하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이는 최초 분리된 바와 같은 DNA 분자를 의미하며 사람의 손으로 절편에 이후 부가된 유전자 또는 암호화 영역을 배제하지 않는다.
당해 분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 게놈성 서열, 게놈외 및 플라스미드-암호화된 서열 및 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하고 발현하도록 채택될 수 있는 보다 작은 유전공학적으로 조작된 유전자 절편을 포함할 수 있다. 상기 절편은 천연 분리되거나, 사람 손으로 합성적으로 변형시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련자에 의해 또한 인식되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있으며, DNA(게놈성 또는 cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자를 포함할 수 있으며, 이는 인트론을 함유하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응하며, mRNA 분자를 포함할 수 있으며, 이는 인트론을 함유하지 않는다. 부가적인 암호화 또는 비암호화 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드내에 존재할 수 있지만, 필수적인 것은 아니며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나, 필수적이지는 않다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 본 발명의 폴리펩타이드/단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 변이체 또는 유도체, 바람직하게는 상기 서열의 면역원성 변이체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 한 가지 양태에 따라서, 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722,735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열 중 일부 또는 모두, 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보체, 및 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788 중 어느 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 특정한 바람직한 구체적인 양태에서, 본원에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 기술된 바와 같이, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화한다.
다른 관련된 구체적인 양태에서, 본 발명은 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788에서 본원에 설명된 서열과 실질적으로 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 본원에서 기술된 방법(예를 들면, 하기 기술되는 바와 같이, 표준 변수들을 사용하는 BLAST 분석법)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 값들이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치화 등을 고려함으로써, 두 개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해서 적합하게 조정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
전형적으로, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유하여, 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 본원에서 구체적으로 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 비교해 실질적으로 감소되지 않게 된다. 용어 "변이체"는 또한 이종성 기원의 상동성 유전자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
부가적인 구체적인 양태에서, 본 발명은 본원에서 설명된 서열 하나 이상에 대해 다양한 길이의 연속하는 길이의 서열 동일성, 또는 이에 대한 상보성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 제공한다. 예를 들면, 본원에 설명된 서열 하나 이상의 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이의 중간 길이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 제공된다. "중간 길이"는 본원의 내용에서, 200-500; 500-1,000을 통한 모든 정수를 포함하여, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153등의 인용된 값 사이의 임의의 길이를 의미한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 중간 정도 내지 엄격한 조건하에 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편, 또는 이의 상보적인 서열에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 하이브리드화 기술은 분자생물학 분야에 공지되어져 있다. 예시를 목적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화를 시험하는데 있어서 적합한 중간 정도의 엄격한 조건은 of 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중 예비세척; 50 내지 60℃에서, 5 X SSC로 밤새 하이브리드화; 65℃에서 20분 동안 0.1% SDS을 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각을 사용한 2회 세척을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 하이브리드화의 엄격함이 하이브리드화 용액 중 염의 함량을 조절하고/하거나 하이브리드화 수행 온도를 변화시킴으로써 용이하게 조절할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 또 다른 구체적인 양태에서, 적합한 높은 엄격한 하이브리드화 조건은 상기 기술된 것을 포함하지만, 단 하이브리드화 온도를 예를 들면 60 내지 65℃에서 65 내지 70℃로 승온시키는 것을 포함한다.
특정 바람직한 구체적인 양태에서, 상기된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 변이체, 단편 및 하이브리드화 서열은 본원에 구체적으로 나타낸 폴리펩타이드 서열과 면역학적으로 교차-반응하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 본원에 구체적으로 나타낸 폴리펩타이드 서열의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 보다더 바람직하게는 약 90% 이상의 면역원성 활성의 수준을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편은 이의 암호화 서열의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 부가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 절편과 배합되어, 이의 전체 길이가 상응하게 다양화될 수 있다. 딸서, 거의 모든 길이의 단편이 사용될 수 있으며, 전체 길이는 바람직하게는 각각의 제법 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 따라 제한된다는 것을 의도한다. 예를 들면, 전체 길이 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50염기쌍 길이 등의 예시적인 폴리뉴클레오타이드 절편(모든 중간 길이를 포함)이 본 발명의 수 많은 방법에서 유용하다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하는 경우, 두 서열은 두 개의 서열내 뉴클레오타이드 서열이 하기 기술되는 바와 같이, 최대 일치로 배열되는 경우 동일한 경우에 "동일성"인 것으로 고려된다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부 영역을 동정하고 비교하기 위한 비교 창 상에서 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "비교 창"은 약 20개 이상의 연속하는 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 연속하는 위치의 절편을 의미하며, 이때, 서열은 두 개의 서열을 최적으로 배열한 후, 연속하는 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적의 배열은 디폴트 변수를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(제조원: DNASRTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene suite에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로그램은 하기 참조문헌에 기술된 수 개의 배열 구조를 구체화한다[Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymologyvol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989)CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988)CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971)Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987)Mol. Biol. Evol.4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983)Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80: 726-730].
대안으로, 비교를 위한 서열의 최적의 배열은 문헌[Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482]의 국부적 동일성 알고리듬에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]의 동일성 배열 알고리듬에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 연구 방법에 의해, 상기 알고리듬의 컴퓨터화된 수단(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, USA)에 의해 또는 정밀 조사에 의해 수행될수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성(%)를 결정하기에 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이며 이는 문헌[Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. 215: 403-410]에 각각 기술되어져 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대한 서열 동일성(%)을 측정하게 위해서, 본원에 기술된 변수들과 함께 사용할 수 있다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 제조원[National Center for Biotechnology Information]을 통해 공개적으로 이용가능하다. 한 가지 예시적인 예에서, 축적된 득점은 뉴클레오타이드 서열에 있어서, 변수 M(일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 득점; 항상 > 0) 및 N(불일치하는 잔기에 대한 벌칙 득점; 항상 < 0)을 사용하여 계산할 수 있다. 각각의 방향에서 워드 히트의 신장은 다음의 경우에 중지된다: 이의 최대 달성된 값으로부터 양 X에 의해 축적된 배열 득점이 감소하는 경우; 하나 이상의 네가티브-득점 잔기 배열의 축적으로 인해, 0 이하로 축적 득점이 가는 경우; 또는 서열 각각의 말단에 도달하는 경우. BLAST 알고리듬 변수, W, T 및 X가 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTIN 프로그램(뉴클레오타이드 서열에 대한)은 11의 워드길이(W), 10의 예상치(E)를 디폴트로서 사용하고, BLOSUM62은 득점 매트릭스[참조: Henikoff and henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 배열, 50의 (B), 10의 예상치(E), M=5, N=4 및 둘 쇄 모두를 디폴트로 사용한다.
바람직하게는, "서열 동일성(%)"은 두 개의 서열의 최적 배열을 위해서 참조서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하는 경우, 폴리펩타이드 서열의 일부가 비교 창에서 20% 미만, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있는 경우, 약 20개 위치에서 비교의 창 상에서 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 측정된다. 상기 백분율은 동일한 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 야기되는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 수득하고, 매치된 위치의 수를 참조 서열내 전체 위치의 수(즉, 창의 크기)로 나누며 수득된 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성(%)을 수득함으로써 계산된다.
유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 수 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재함을 당해 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법이 상이하여 다양한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 구체적으로 포함된다. 추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립형질도 본 발명의 범위내에 포함된다. 대립형질은 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 변화된 내인성 유전자이다. 수득되는 mRNA 및 단백질은 변화된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 필수적이지는 않다. 대립형질은 표준 기술(예를 들면, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터 베이스 서열 비교)을 사용하여 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 부위-특이적 돌연변이유발같은 돌연변이유발 접근법을 본원에서 기술된 폴리펩타이드의 면역원성 변이체 및/또는 유도체의 제조에 사용한다. 이러한 방법에 의해, 폴리펩타이드 서열내 특정 변형이 이를 암호화하는 근본적인 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발을 통해 수행될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오타이드 변화를 폴리뉴클레오타이드 내로 도입시킴으로써, 전술한 고려 사항의 하나 이상을 도입하는 서열 변이체를 제조하고 시험하는 직접적인 접근법을 제공한다.
부위-특이적 돌연변이유발은 바람직한 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 인접하는 충분한 뉴클레오타이드 서열의 사용을 통해 돌연변이체의 생성을 가능하게 하여 횡단하는 결실 연결부의 부 측면에서 안정한 이합체를 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복잡성의 프라이머 서열을 제공한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드 자체의 특성을 개선, 감소, 변화 또는 그밖에 변형시키고/시키거나 암호화된 폴리펩타이드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 1차 서열을 변화시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구체적인 양태에서, 본 발명자들은 폴리펩타이드 백신의 면역원성 같은 암호화된 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 변화시키기 위한 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이유발을 의도한다. 부위-특이적 돌연변이유발의 기술은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 변이체 모두를 제조하는데 광범위하게 사용된다. 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발은 DNA 분자의 특정 부분을 변화시키는데 종종 사용된다. 상기 구체적인 양태에서, 전형적으로 약 14 내지 약 25개 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머가 사용되며, 변화되는 서열의 접합부 양 측면 모두에서 약 5개 내지 약 10개의 잔기를 갖는다.
당해 분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 부위 특이적인 돌연변이유발 기술은 일본쇄 및 이본쇄 형태 모두에서 존재하는 파아지 벡터를 종종 사용한다. 부위 지시된 돌연변이유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파아지 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지는 용이하게 시판중이며, 이의 용도는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다. 이본쇄 플라스미드가 또한 플라스미드로부터 파아지로 관심 대상 유전자를 전달하느 과정을 제거하는 부위 특이적 돌연변이유발에서 일상적으로 사용된다.
일반적으로, 부위 지시된 돌연변이유발은 우선 일본쇄 벡터 또는 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 이의 서열내에 포함하는 이본쇄 벡터의 두 쇄를 용융 분리시켜 수행한다. 목적하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 합성적으로 제조된다. 이러한 프라이머를 이후, 일본쇄 벡터와 어닐링시키고, 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레나우 단편 같은 DNA 중합 효소에 적용하여 돌연변이를 갖는 쇄의 합성을 완성한다. 따라서, 이종이합체가 형성되며, 이때 하나의 쇄는 최초 비-돌연변이된 서열을 암호화하고 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 갖는다. 이러한 이종 이합체 벡터를 사용하여 적합한 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
부위 지시된 돌연변이유발을 사용한 선택된 펩타이드-암호화 DNA 절편의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단을 제공하며, 펩타이드의 서열 변이체 및 이를 암호화하는 DNA 서열을 수득할 수 있는 다른 방법이 존재하는 경우 제한적인 것을 의미하지는 않는다. 예를 들면, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터는 하이드록실아민 같은 돌연변이유발제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이러한 방법 및 프로토콜에 관련된 특정 상세한 설명은 문헌[Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; and Maniatis et al., 1982]에서 확인되며, 이는 상기 목적으로 본원에 참조로 각각 도입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발 방법"은 이의 초기 농도에 비해 특정 핵산 분자의 농도 증가, 증폭 같은 검출가능한 신호의 농도 증가를 초래하는 주형-의조성 과정 및 벡터-매개된 증폭을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발 방법"은 프라이머 분자의 주형-의존성 증폭과 관련된 방법을 의미하는 것을 의도한다. 용어 주형 의존성 방법은 핵산의 신규 합성된 쇄의 서열이 상보적인 염기쌍의 공지된 규칙에 의해 지시되는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 의미한다[예를 들면, Watson, 1987]. 전형적으로, 벡터 매개된 방법은 핵산 단편의 DNA 또는 RNA 벡터로의 도입, 벡터의 클로날 증폭, 및 증폭된 핵산 단편의 회수와 관련된다. 상기 방법의 예는 문헌[미국 특허 제4,237,224호]에서 제공되며, 이는 이의 전체가 본원에 참조 문헌으로 구체적으로 도입된다.
본 발명의 폴리펩타이드 변이체의 생산을 위한 또 다른 접근법은 문헌[미국특허 제5,837,458호]에 기술된 바와 같이 귀납적 서열 재조합을 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 재조합 및 스크리닝 또는 선택의 반복적인 사이클을 수행하여, 예를 들면, 증폭된 면역원성 활성을 갖는 본 발명의 개별적인 폴리뉴클레오타이드 변이체를 "유도"한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 핵산 하이브리드화를 위한 프로브 또는 프라이머로서 유리하게 사용할 수 있다. 이와 같이, 본원에서 설명된 15개 뉴클레오타이드 길이의 연속하는 서열과 동일하거나 상보적인 서열을 갖는 15개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드의 서열 영역을 포함하는 핵산 절편은 특정 용도를 가질 것으로 이해된다. 보다 긴 연속적인 동일하거나 상보적인 서열, 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000(모든 중간 길이를 포함)개 내지 전체 길이 서열이 또한 특정 구체적인 양태에서 사용될 것이다.
관심 대상 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 상기 핵산 프로브의 능력은 이들을 제시된 샘플 중 상보적인 서열의 존재를 검출하는데 있어 유용하게 할 것이다. 그러나, 돌연변이체 종 프라이머, 또는 다른 유전자 작제물의 제조에 있어서 사용하기 위한 프라이머의 제조를 위한 서열 정보의 용도 같은 다른 용도가 제시된다.
본원에 설명된 폴리뉴클레오타이드 서열에 동일하거나 상보적인 10 내지 14, 15 내지 20, 30, 50 또는 100 내지 200개 뉴클레오타이드의 연속하는 뉴클레오타이드 증폭물로 이루어진 서열 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 특히 서던 및노던 블로팅에서 사용하기 위한 하이브리드화 프로브로서 의도된다. 이들은 유전자 생성물 또는 이의 단편이 다양한 세포 유형에서 및 또한 다양한 세균 세포에서 분석되는 것을 가능하게 한다. 단편의 전체 크기 뿐만 아니라 상보적인 증폭물의 크기는 특정 핵산 절편의 의도된 용도 또는 적용에 궁극적으로 의존적일 것이다. 보다 작은 단편은 일반적으로 하이브리드화 구체적인 양태에서 용도를 가지며, 이때, 연속하는 상보적인 영역의 길이는 약 15 내지 약 100개 뉴클레오타이드 정도로 다양할 수 있지만, 보다 큰 연속하는 상보적인 증폭물은 검출하고자 하는 상보적인 서열 길에 따라서 사용될 수 있다.
약 15 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 하이브리드화 프로브의 사용은 안정적이고 선택적인 이합체 분자의 형성을 가능하게 한다. 15개 염기 길이 이상의 증폭물에 대해 연속하는 상보적인 서열을 갖는 분자는 일반적으로 하이브리드의 안정성 및 선택성을 증가시키기 위해서 바람직하며, 이로써 수득된 특정한 하이브리드 분자의 품질 및 정도를 개선시킨다. 일반적으로 15 내지 25개 연속하는 뉴클레오타이드 또는 바람직한 경우 그 이상의 유전자 상보적인 증폭물을 갖는 핵산 분자를 디자인하는 것이 바람직하다.
하이브리드화 프로브는 본원에서 기술된 서열 중 하나의 임의 부분으로부터 선택할 수 있다. 필요한 것은 본원에 나타낸 서열 또는 단지 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드 길이 내지 전체 길이 서열로부터, 프로브 또는 프라이머로 사용하고자 하는 서열의 임의의 연속하는 부분들을 분석하는 것이다. 프로브 및 프라이머 서열의 선택은 다양한 인자들에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 전체 서열의 말단으로부터의 프라이머를 사용할 수 있다.
작은 폴리뉴클레오타이드 절편 또는 단편들은 예를 들면, 화학적 수단에 의해서 단편을 직접 합성하여 용이하게 제조할 수 있으며, 이는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 흔히 실시된다. 또한, 단편들은 문헌[미국 특허 제4,683,202호](이는 참조로 본원에 도입됨)의 PCRTM 기술 같은 핵산 재생성 기술을 적용하거나, 선택된 서열을 재조합 생산을 위한 재조합 벡터내로 도입함으로써, 또는 분자생물학 분야의 숙련자에게 일반적으로 공지된 다른 재조합 DNA 기술에 의해 수득할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 관심 대상의 전체 유전자 또는 유전자 단편의 상보적인 증폭물과 이합체 분자를 선택적으로 형성하는 이의 능력에 대해서 사용할 수 있다. 의도된 적용에 따라서, 전형적으로 표적 서열에 대한 프로브의 선택의 다양한 정도를 달성하기 위한 다양한 하이브리드화 조건을 사용하는 것이 바람직하다. 높은 선택성을 필요로 하는 적용의 경우, 전형적으로 하이브리드를 형성하기 위한 상대적으로 엄격한 조건을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 범위의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M의 것과 같은 염 조건에 의해 제공되는 바와 같이, 상대적으로 낮은 염 농도 및 높은 온도 조건을 선택할 것이다. 상기 선택적인 조건은 프로브 및 주형 또는 표적 쇄 사이의 불일치가 존재하는 경우, 거의 견디어 내지 못하며, 특히 관련된 서열을 분리하는데 적합할 것이다.
물론, 특정 적용에 있어서, 예를 들면, 기본이 되는 주형의 보다 덜 엄격한(감소된 엄격함) 하이브리드화 조건에 하이브리드화된 돌연변이 프라이머 쇄를 사용하는 돌연변이체를 제조하는 것이 전형적으로 이종이합체의 형성을 위해서 필요할 것이다. 상기 환경에서, 약 20℃ 내지 약 55℃의 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M의 것 같은 염 조건을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 교차-하이브리드화 종은 이로써 대조군 하이브리드화에 비해 포지티브한 하이브리드화 신호로서 용이하게 확인될 수 있다. 임의의 경우, 일반적으로 포름아미드의 증가량을 부가함으로써 보다 엄격함을 부여할 수 있는 것으로 평가되며, 포름아미드는 증가된 온도와 동일한 방식으로 하이브리드 이합체를 불안정화시킨다. 따라서, 하이브리드화 조건은 용이하게 조절될 수 있으며, 따라서, 일반적으로 목적하는 결과에 따른 선택 방법이 될 것이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질 합성의 효과적이고 표적화된 억제제로서 입증되어져 왔으며, 결과적으로 질환이 질환에 기여하는 단백질의 억제에 의해 치료될 수 있는 치료학적 방법을 제공한다. 단백질 합성을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능은 잘 확립되어져 있다. 예를 들면, 폴리갈락타우로나제 및 뮤스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 이들 각각의 mRNA 서열[미국 특허 제5,739,119호 및 미국 특허 제5,759,829호]에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다. 추가로, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약제 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 스트리아탈 GABAA 수용체 및 사람 EGF로입증되어져 왔다[Jaskulskiet al., Science. 1988 Jun 10;240(4858):1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989;1(4):225-32;Periset al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15;57(2):310-20; U.S. Patent 5,801,154; U.S. Patent 5,789,573; U.S. Patent 5,718,709 and U.S. Patent 5,610,288]. 안티센스 작제물은 또한 다양한 비정상적인 세포 증식, 예를 들면, 암의 치료에 사용될 수 있는 것으로 기술되어져 왔다[미국 특허 제5,747,470호, 미국 특허 제5,591,317호 및 미국 특허 제5,5783,683호].
따라서, 특정 구체적인 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 한 가지 구체적인 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 제3의 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트화된 변형된 골격을 포함하는 변형된 DNA이다. 제4 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 핵산 또는 이의 유도체를 포함한다. 각각의 경우, 바람직한 조성물은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 부분들에 상보적인 및 보다 바람직하게는 실질적으로 상보적인, 및 보다 더 바람직하게는 완전히 상보적인 서열 영역을 포함한다. 제시된 유전자 서열에 특이적인 선택된 안티센스 조성물의 선택은 선택된 표적 서열의 분석 및 2차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대적인 안정성에 기초한다. 안티센스 조성물은 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적인 결합을 감소시키거나 억제하게 되는 이합체, 헤어핀, 또는 다른 2차 구조를 형성하지 못하는 이의 능력에 따라 선택될 수 있다. mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 해독 개시 코돈 또는 그 인근이며, mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 서열이다. 이러한 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려는 예를 들면, OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 및/또는 BLASTIN 2.0.5 알고리듬 소프트웨어[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25(17): 3389-402]를 사용하여 수행할 수 있다.
MPG(27개 잔기)로 명명된 짧은 펩타이드 벡터를 사용하는 안티센스 전달 방법의 사용이 또한 포함된다. MPG 펩타이드는 HIV gp41의 융합 서열로부터 유도된 소수성 도메인 및 SV40 T-항원의 핵 국재화 서열로부터의 친수성 도메인을 함유한다[Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15; 25(14): 2730-6]. MPG 펩타이드의 몇몇 분자들은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 피복하여 상대적으로 높은 효능(90%)으로 1시간 이내에 배양된 포유동물 세포내로 전달될 수 있는 것으로 입증되어져 왔다. 추가로, MPG와의 상호작용은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제에 대한 안정성 및 세포막을 가로지르는 능력을 강력하게 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 따라서, 본원에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 조성물은 종양 세포에서 본 발명의 종양 폴리뉴클레오타이드 및 단백질의 발현을 억제하기 위한 리보자임 분자의 디자인 및 제조에서 유용하다. 리보자임은 부위-특이적 방식으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 특정 촉매 도메인을 갖는다[Kim and Cech, Proc Natl AcadSci U S A. 1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20]. 예를 들면, 수 많은 리보자임이 높은 특이성으로 포스포에스테르 수송 반응을 촉진하여, 올리고뉴클레오타이드 기질 중 수 개의 포스포에스테르 중 단지 하나를 종종 절단한다[Cechet al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374):173-6]. 이러한 특이성은 화학적 반응에 앞서 리보자임의 내부 지시 서열("IGS")에 특정 염기쌍 상호작용을 통해 기질이 결합하는 필요조건에 기여해 왔다.
천연 효소 RNA의 6개 염기 다양성이 현재 공지되어져 있다. 각각은 생리학적 조건하에서 트랜스적으로(및 따라서 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다) RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매할 수 있다. 일반적으로, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA에 결합함으로서 작용한다. 상기 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소적 부분에 매우 인접하여 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통해 야기된다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 상보적인 염기쌍을 통해서 표적 RNA를 인식하고 결합한 후, 일단 정확한 부위에 결합되면, 효소적으로 표적 RNA를 절단한다. 상기 표적 RNA의 전략적인 절단은 암호화된 단백질의 직접적인 합성 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산이 결합하고 이의 RNA 표적을 절단한 후, 상기 RNA로부터 분리되어 또 다른 표적을 찾게 되어 신규한 표적에 반복적으로 결합하여 절단할 수 있다.
리보자임의 효소적 특성은 안티센스 기술(이때, 핵산 분자는 이의 해독을 차단하기 위한 핵산 표적에 단순히 결합한다) 같은 수 많은 기술에 대해 유리하며, 이는 치료학적 치료에 영향을 미치는데 필요한 리보자임의 농도가 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도보다 더 낮기 때문이다. 이러한 잇점은 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영한다. 따라서, 단일 리보자임 분자는 표적 RNA 수 많은 분자를 절단할 수 있다. 또한, 리보자임은 매우 특이적인 억제제로서, 이의 억제 특이성은 표적 RNA에 결합하는 염기쌍 메커니즘에 의존할 뿐만 아니라 표적 RNA 절단의 메커니즘에도 의존한다. 절단 부위 인근에서의 단일 불일치 또는 염기 치환도 리보자임의 촉매적 활성을 완전히 제거할 수 있다. 안티센스 분자에서의 유사한 불일치은 이의 활성을 방해하지 않는다[Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 Aug 15; 89(16): 7305-9]. 따라서, 리보자임 활성의 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합 활성보다 더 크다.
효소적 핵산 분자는 햄머헤드, 헤어핀, 간염 바이러스, I 그룹 인트론 또는 RNase P RNA[RNA 지시 서열과 관련하여] 또는 뉴로스포라 VS RNA 모티프에서 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 예는 문헌[Rossietal.Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11;20(17):4559-65]에서 기술된다. 헤어핀 모티프의 예는 문헌[Hampeletal.(Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257), Hampel and Tritz,Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33;Hampeletal.,Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):299-304 and U.S. Patent 5,631,359]에서 기술된다. 간염 바이러스 모티프의 예는 문헌[Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1;31(47):11843-52]에서 기술되며, RNase P 모티프의 예는 문헌[Guerrier-Takadaetal., Cell. 1983Dec;35(3 Pt 2):849-57]에서 기술되며, 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프는 문헌[Collins (Saville and Collins, Cell. 1990 May 18;61(4):685-96; Saville and Collins, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 1;88(19):8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23;32(11):2795-9]에서 기술되며, I 그룹 인트론의 예는 문헌[미국 특허 제4,987,071호]에서 기술된다. 본 발명의 효소적 핵산 분자에서 가장 중요한 것은 표적 유전자 RNA 영역 중 하나에 대해 상보적인 특정 기질 결합 부위를 가지며, 상기 분자에 대해 RNA 절단 활성을 부여하는 기질 결합 부위 내 또는 주변에서 핵산 서열을 갖는다는 것이다. 따라서, 리보자임 작제물은 본원에서 언급된 특정 모티프에 제한되지 않는다.
리보자임은 문헌[Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569 and Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595, 각각은 본원에 참조로 구체적으로 도입된다]에 기술된 바와 같이 디자인될 수 있으며, 기술된 바와 같이 시험관내 및 생체내 시험용으로 합성될 수 있다. 상기 리보자임은 또한 수송을 위해서 최적화될 수 있다. 특정예가 제공되는 반면, 당해 분야의 숙련자는 필요한 경우 다른 종의 등가의 RNA 표적을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 암의 길이를 변화시키거나, 혈청 리보뉴클레아제에 의한 분해를 예방하는 변형[참조: 예를 들면, Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 92/07065; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/15187; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 91/03162; Eur. Pat. Appl. Publ. No.92110298.4; U.S. Patent 5,334,711; and Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/13688, 이는 효소적 RNA 분자의 당 잔기에 대해수행될 수 있는 다양한 화학적 변형을 기술한다], 세포에서 이의 효능을 증강시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 줄이고 화학적 필요 조건을 감소시키기 위한 간 II 염기의 제거로 화학적으로 합성된 리보자임에 의해 최적화될 수 있다.
문헌[Sullivanet al., Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595]은 효소적 RNA 분자를 전달하는 일반적인 방법을 기술하고 있다. 리보자임은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법으로 세포내로 투여될 수 있으며, 리포좀 캡슐화, 이온토포레시스 또는 다른 비히클(하이드로겔, 사이클로덱스트란, 생분해가능한 나노캡슐, 및 생부착성 미세구체)내로의 도입을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 지침에 있어서, 리보자임은 전술한 비히클의 존재 또는 부재하에서 생체외적으로 세포 또는 조직내로 직접적으로 전달될 수 있다. 대안으로, RNA/비히클 배합물을 직접적인 흡입에 의해, 직접적인 주사에 의해 또는 카테테르, 흡입 펌프 또는 스텐트를 사용하여 국부적으로 전달할 수 있다. 다른 전달 경로는 정맥내, 근육내, 피하내 또는 관절 주입, 에어로졸 흡입, 경구(정제, 또는 환제 형태), 국부적, 전신계로, 안내, 복막내 및/또는 척수강내 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 리보자임 전달 및 투여에 대한 보다 상세한 기술은 문헌[Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595 and Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569, 각각은 구체적으로 본원에 참조로 도입된다]에서 제공된다.
세포 내 리보자임(들)의 높은 농도를 축적시키는 또 다른 방법은 DNA 발현 벡터내로 리보자임-암호화 서열을 도입하는 것이다. 리보자임 서열의 전사는 진핵세포 RNA 폴리머라제 I(pol I), RNA 폴리머라제 II(pol II), 또는 RNA 폴리머라제III(pol III)에 대한 프라이머로부터 구동된다. Pol II 또는 pol III로부터의 전사체는 모든 세포에서 높은 수준으로 발현될 것이며, 제시된 세포 유형 중 제시된 pol II 프로모터의 수준은 인접하여 존재하는 유전자 조절 서열(인핸서, 사일런서 등)의 특성에 따를 것이다. 원핵세포 RNA 폴리머라제 프로모터가 또한 사용될 수 있으며, 단 원핵세포 RNA 폴리머라제 효소는 적합한 세포에서 발현된다. 상기 프로모터로부터 발현된 리보자임은 포유동물에서 기능하는 것으로 나타났다. 상기 전사 단위체는 포유동무내로 도입시키기 위한 다양한 벡터내로 도입될 수 있으며, 벡터는 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노-연관된 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터(예를 들면, 레트로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 벡터)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 본 발명의 구체적인 양태에서, 펩타이드 핵산(PNA) 조성물이 제공된다. PNA는 뉴클레오염기가 슈도펩타이드 골격에 부착되는 DNA 모사체이다[Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4) 431-37]. PNA는 전형적으로 RNA 또는 DNA를 사용하는 수 많은 방법에서 사용될 수 있다. 종종, PNA 서열은 상응하는 RNA 또는 DNA 서열 보다 기술에서 더 우수하게 수행되며 RNA 또는 DNA에 부여되지 않은 용도를 갖는다. 제조 방법, 특성, 사용 방법을 포함하는 PNA에 대한 정보는 문헌[Corey,Trends Biotechnol1997 Jun;15(6):224-9]에서 제공된다. 상기와 같이, 특정 구체적인 양태에서, ACE mRNA 서열의 하나 이상의 일부에 상보적인 PNA 서열을 제조할 수 있으며, 상기 PNA 조성물은 ACE-특이적 mRNA의 전사의 조절, 변화, 감소 또는 축소하는데 사용될 수 있으며, 이로써, 상기 PNA 조성물이 투여된 숙주 세포내 ACE 활성의 수준을 변화시킬 수 있다.
PNA는 DNA의 정상적인 포스포디에스테르 골격을 대체하는 2-아미노에틸-글리신 결합을 갖는다[Nielsenet al., Science1991 Dec 6;254(5037):1497-500;Hanveyet al., Science. 1992 Nov 27;258(5087):1481-5;Hyrup and Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Jan;4(1):5-23]. 이러한 화학은 세 가지 중요한 결과를 갖는다: 첫째, DNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드와는 반대로, PNA는 중성 분자이며; 둘째, PNA는 비키랄성으로, 이는 스테레오선택성 합성을 개발할 필요가 없으며; 셋째, 변형된 메리필드 방법을 포함한 다른 방법을 사용해 왔지만, PNA 합성은 고체상 펩타이드 합성에 대한 표준 Boc 또는 Fmoc 프로토콜을 사용한다.
PNA 단량체 또는 즉시 사용할 수 있는 올리고머가 제조원[PreSeptive BioSystems, Framingham, MA]으로부터 시판중이다. Boc 또는 Fmoc 프로토콜에 의한 PNA 합성은 수동 또는 자동 프로토콜을 사용하여 직접적으로 수행된다[Nortonet al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr;3(4):437-45]. 수동 프로토콜은 밀접하게 관련된 PNA의 패밀리의 동시적인 합성 또는 화학적으로 변형된 PNA의 생산에 사용된다.
펩타이드 합성에서와 마찬가지로, 특정 PNA 합성의 성공은 선택된 서열의 특성에 따른다. 예를 들면, 이론상, PNA는 핵산 염기의 임의의 배합물내로 도입될 수 있으며, 인접한 퓨린의 존재는 생성물 중 하나 이상의 잔기 결실을 초래할 수있다. 이러한 난점에 대한 예상으로, PNA를 인접한 퓨린과 함께 생산하는데 있어서, 비효과적으로 부가되는 잔기의 커플링을 반복해야만 한다는 것을 제시한다. 이는 후속적으로 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해 PNA를 정제해야 하며, 이는 펩타이드 합성 동안 관찰되는 것과 유사한 생성물의 수율 및 순도를 제공한다.
제시된 용도에 대한 PNA의 변형은 고체상 합성 동안 아미노산을 커플링시키거나 노출된 N-말단 아민에 카복실산 그룹을 함유하는 화합물을 부착함으로써 달성할 수 있다. 대안으로, PNA는 도입된 라이신 또는 시스테인에 커플링시킴으로써 합성후 변형될 수 있다. PNA가 변형될 수 있는 각경우는 보다 우수한 용해성 또는 특정 기능성 필요성에 대해서 최적화를 촉진시킨다. 일단 합성되면, PNA 및 이의 유도체의 확인은 질량 스펙트럼으로 확인할 수 있다. PNA의 변형을 사용한 수 개의 연구가 수행되었다[예를 들면, Nortonet al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr;3(4):437-45; Petersenet al., J Pept Sci. 1995 May-Jun;1(3):175-83; Orumet al., Biotechniques. 1995 Sep;19(3):472-80; Footeret al., Biochemistry. 1996 Aug 20;35(33):10673-9; Griffithet al., Nucleic Acids Res. 1995 Aug 11;23(15):3003-8; Pardridgeet al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jun 6;92(12):5592-6; Boffaet al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Mar 14;92(6):1901-5; Gambacorti-Passeriniet al., Blood. 1996 Aug 15;88(4):1411-7; Armitageet al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Nov 11;94(23):12320-5; Seegeret al.,Biotechniques. 1997 Sep;23(3):512-7]. 문헌[미국 특허 제5,700,922호]는 PNA-DNA-PNA 키메라 분자 및 진단. 유기체내 조절 단백질, 및 치료제에 민감한 조건의 치료에서 이의 용도를 기술한다.
PNA의 안티센스 결합성에 관한 특성을 규명하는 방법에 대해서는 문헌[Rose, Anal Chem. 1993 Dec 15;65(24):3545-9] 및 [Jensen et al. Biochemistry, 1997, Apr 22; 36(16): 5072-7]에 논의되어 있다. 로즈는 PNA의 상보성 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합을 측정하기 위하여 모세관 겔 전기영동을 이용하고, 상대적 결합 속도론과 화학량론을 측정하였다. 젠슨 등도 BIAcore™ 기법을 사용하여 이와 유사한 유형의 측정을 실시하였다.
공지되어 당업자에게 잘 알려져 있는 PNA의 다른 용도로는 DNA쇄 침입, 안티센스 억제, 돌연변이 분석, 전사 인핸서, 핵산 정제, 전사 활성 유전자의 분리, 전사 인자 결합의 차단, 게놈 절단, 바이오센서, 동일계내 하이브리드화 등에서의 용도를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 동정, 특성화 및 발현
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 다양한 공지 기법을 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작할 수 있다[일반적으로, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 등의 참고문헌 참조]. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 다음에 상세히 설명하는 바와 같이, 종양과 관련이 있는 발현(즉, 본 명세서에 제공되는 대표적인 분석법을 사용하여 측정했을 때 발현이 정상 조직에서 보다 종양에서 2배 이상 증가된 경우)에 cDNA 마이크로어레이를 선별함으로써 동정할 수 있다. 이때, 선별은 예를 들어 아피메트릭스 인코포레이티드(Affymetrix, Inc. Santa Clara, CA)의 마이크로어레이 기법을 제조자의 지시에 따라[그리고 문헌(Schena et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:10614-10619, 1996 및 Heller et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:2150-2155, 1997)에 대부분 기술된 바와 같이] 사용하여 실시할 수 있다. 또는, 본 명세서에 기술된 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 종양 세포로부터 제조한 cDNA로부터 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킬 수도 있다.
시료 중에 존재하는 당해의 표적 서열을 증폭시키는 데에는 다수의 주형 의존적 방법을 이용할 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중 하나는 본 발명에 전적으로 참고로 포함되는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,302호 및 제4,800,159호에 상세히 설명되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™)이다. 간략히 설명하면, PCR™에서는 우선 표적 서열의 대향하는 상보적 가닥 상에 존재하는 영역에 상보적인 2개의 프라이머 서열을 준비한다. 그 다음, 과량의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 DNA 폴리머라제(예, Taq 폴리머라제)와 함께 반응 혼합물에 첨가한다. 표적 서열이 시료에 존재하면, 프라이머는 표적에 결합하고 폴리머라제는 뉴클레오타이드 상에 첨가되어 표적 서열을 따라 프라이머가 증폭되도록 할 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승 및 감소시킴으로써 증폭된 프라이머는 표적으로부터 해리하여 반응 생성물을 형성하고, 과량의 프라이머를 표적과 반응 생성물에 결합하면 이 과정이 반복된다. 바람직하게는, 증폭된 mRNA의 양을 정량하기 위하여 역전사 및 PCR™ 증폭 절차를 수행할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
다른 다수의 주형 의존적 공정은 그 대부분이 PCR™ 증폭 기법의 변형으로서, 모두 널리 공지되어 있고, 당해 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들면, 이러한 일부 방법으로는 예를 들어 문헌[유럽 특허 출원번호 제320,308호 및 미국 특허 제4,883,750호]에 기술된 리가제 연쇄 반응(LCR이라고도 함), PCT 국제특허출원 공개번호 PCT/US87/00880에 기술된 큐베타 레플라카제(Qbeta Replicase); 가닥 치환 증폭(SDA) 및 수복 연쇄 반응(RCR)이 있다. 또 다른 증폭 방법으로는 영국 특허출원번호 2 202 328 및 PCT 국제특허출원 공개번호 PCT/US89/01025에 기술된 것이 있다. 다른 핵산 증폭 절차로는 전사에 근거한 증폭 시스템(TAS)(PCT 국제 특허출원 공개번호 WO88/10315), 핵산 서열에 근거한 증폭(NASBA) 및 3SR이 있다. 유럽 특허출원 공개번호 329,822에서는 일본쇄 RNA("ssRNA), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 순환적으로 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭법에 대하여 기술하고 있다. PCT 국제특허출원 공개번호 WO89/06700에서는 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 대한 프로모터/프라이머 서열의 하이브리드화 및 잇따른 그 서열의 다수의 RNA 복사체의 전사 에 기초한 핵산 서열 증폭법에 대하여 기술하고 있다. 다른 증폭 방법, 예컨대 "RACE"(Frohman, 1990) 및 "일방향 PCR"(Ohara, 1989) 역시 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 증폭부는 적합한 라이브러리(예, 종양 cDNA 라이브러리)로부터 공지의 기법에 따라 전체 길이의 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 기법에서는, 라이브러리(cDNA 또는 게놈 라이브러리) 선별에 증폭에 적합한 1종 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머가사용된다. 바람직하게는, 라이브러리에서 보다 큰 분자만을 포함하도록 크기 선별하는 것이 좋다. 무작위 프라이밍된 라이브러리는 또한 유전자의 5' 및 업스트림 영역을 동정하는데 바람직할 수 있다. 게놈 라이브러리는 인트론을 수득하고 5' 서열을 증폭시키는데 바람직하다.
하이브리드화 기법에서, 부분 서열은 공지의 기법을 사용하여 표지할 수 있다(예, 닉해독 또는32P를 이용한 말단 표지화). 그 다음, 박테리아 또는 박테리오파지 라이브러리의 선별에는 변성된 박테리아 콜로니(또는 파지 플라크를 함유하는 론)를 함유하는 필터를 표지된 프로브에 하이브리드하여 실시한다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 하이브리드한 콜로니 또는 플라크는 선별하여 증폭시키고, DNA는 추가 분석을 위하여 분리한다. cDNA 클론을 분석하면, 예를 들어 부분 서열 유래의 프라이머와 벡터 유래의 프라이머를 이용한 PCR로 추가 서열의 양을 측정할 수 있다. 제한 지도와 부분 서열을 만들면 1종 또는 그 이상의 중첩 클론을 동정할 수 있다. 그 다음, 일련의 결실 클론을 작제하는 것을 포함하는 표준 기법으로 전체 서열을 작제할 수 있다. 그 결과 얻어지는 중첩 서열을 조합하여 하나의 인접 서열을 얻을 수 있다. 적합한 단편을 공지의 기법에 따라 연결시키면 전체 길이의 cDNA 분자를 얻을 수 있다.
또는, 전술한 바와 같은 증폭 기법은 부분 cDNA 서열로부터 전체 길이의 암호 서열을 수득하는데 유용할 수 있다. 이러한 증폭 기법 중 하나는역PCR(Triglia et al., Nucl.Acids Res. 16:8186, 1988)로서, 유전자의 공지 영역내에서 단편을 생성하는 제한효소를 이용한다. 그 다음, 이 단편을 분자내 연결로 원형화하여 공지 영역 유래의 상이한 프라이머를 이용하는 PCR의 주형으로서 사용한다. 또 다른 방법으로서, 링커 서열에 대한 프라이머와 공지 영역에 특이적인 프라이머를 이용한 증폭으로 부분 서열에 인접한 서열을 회수할 수 있다. 증폭된 서열은 동일한 링커 프라이머와 공지 영역에 특이적인 제2의 프라이머를 이용한 2차 증폭과정에 사용한다. 공지 서열에서 유래하는 반대 방향으로 증폭을 개시시키는 2개의 프라이머를 이용하는 변형된 방법이 WO96/38591에 기술되어 있다. 또한, "cDNA 말단의 급속 증폭법" 또는 RACE라고 하는 또 다른 기법도 공지되어 있다. 이 기법은 폴리A 영역 또는 벡터 서열에 하이브리드하고 공지 서열의 5' 및 3' 서열을 동정하는 내부 프라이머 및 외부 프라이머의 사용을 포함한다. 또 다른 기법으로, 포획(capture) PCR(Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) 및 워킹(walking) PCR(Parker et al., Nucl.Acids Res. 19:3055-60, 1991)이 있다. 증폭을 이용하는 다른 방법도 전체 길이의 cDNA 서열을 수득하는데 사용할 수 있다.
일부 경우에는, 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스, 예를 들어 GenBank에서 입수용이한 데이터베이스에서 제공되는 서열을 분석하여 전체 길이의 cDNA 서열을 수득할 수도 있다. 중첩 EST는 일반적으로 공지의 프로그램(예컨대, NCBI BLAST 조사)을 사용하여 조사할 수 있고, 이러한 EST를 사용하여 인접한 전체 길이의 서열을 생성할 수 있다. 또한, 전체 길이의 DNA 서열은 게놈 단편을 분석하여수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 또는 그 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편은 적합한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 직접 발현시키기 위하여 재조합 DNA 분자에 사용할 수 있다. 유전자 코드의 고유의 축퇴성으로 인하여, 거의 동일하거나 기능적으로 등가성인 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열을 생성할 수 있으며, 이 서열을 사용하여 소정의 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현시킬 수 있다.
당업자라면 이해할 수 있듯이, 일부 경우에는 비천연발생의 코돈을 소유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 생성이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정 원핵 또는 진핵 숙주에 바람직한 코돈을 선택하여 단백질 발현율을 증가시키거나, 천연 발생의 서열에서 생성되는 전사체의 반감기보다 연장된 반감기와 같은 바람직한 특성을 가진 재조합 RNA 전사체를 작제할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 생성물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현 등을 비롯한 다양한 이유로 폴리펩타이드 암호 서열을 변화시키기 위하여 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 무작위 단편화에 의한 DNA 셔플링 및 유전자 단편과 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 재조립을 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 조작할 수 있다. 또한, 부위 지시성 돌연변이유발법을 사용하여 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 글리코실화 패턴을 변경시키거나, 코돈 선호성을 변화시키거나, 접목 변형체를 생성하거나, 또는 돌연변이를 도입시키는 등의 변화를 줄 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 천연 핵산 서열, 변형된 핵산 서열 또는 재조합 핵산 서열을 이종 서열에 연결시켜 융합 단백질을 암호화하도록 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 활성의 억제제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해서는 시판용 항체에 의해 인식될 수 있는 키메라 단백질을 암호화하는 것이 유용할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 폴리펩타이드 암호 서열과 이종 단백질 서열 사이에 위치된 절단 부위를 포함하도록 조작되어, 상기 폴리펩타이드는 이종 부로부터 절단되어 정제할 수 있다.
목적 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 당해 기술 분야에 공지된 화학적 방법[Caruthers, M.H. et al.(1980) Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215-223, Horn, T. et al.(1980) Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 225-232 참조]에 따라 완전하게 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 또는, 단백질 자체를 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 그 일부를 합성하는 화학적 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 예를 들어, 다양한 고상 기법[Roberge, J.Y. et al.(1995) Science 269:202-204]을 사용하여 펩타이드를 합성할 수 있으며, 자동화된 합성법은 ABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용하여 수행할 수 있다.
새로 합성된 펩타이드는 정제용 고성능 액체 크로마토그래피(예컨대, Creighton, T.(1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) 또는 당해 기술분야에서 이용가능한 다른 유사한 기법으로 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩타이드의 조성물은 아미노산 분석 또는 서열분석(예컨대, 에드만 분해법)으로 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 일부분의 아미노산 서열은 직접 합성법 중에 변경시키고(또는) 다른 단백질 또는 이의 임의의 일부분 유래의 서열과 화학적 방법으로 결합시켜 폴리펩타이드 변형체를 만들 수 있다.
목적 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 기능적 등가물을 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자를 포함하는 벡터에 삽입할 수 있다. 당해의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 적당한 전사 및 해독 조절 인자를 포함하는 발현 벡터를 작제하는 데에는 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 있다. 이러한 기법은 예를 들어 문헌[Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 및 Ausubel,F.M. et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.]에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고 발현시키는 데에는 다양한 발현 벡터/숙주계를 이용할 수 있다. 그 예로는, 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질전환된 식물세포계 또는 박테리아 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물세포계; 또는 동물세포계를 포함하며, 여기에 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터에 존재하는 "조절 인자" 또는 "조절 서열"은 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사와 해독을 수행하는 벡터의 비해독 영역, 즉 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 해독 영역을 포함한다. 이러한 인자들은 강도와 특이성이 다양하며, 사용된 벡터계와 숙주에 따라 구성형 프로모터 및 유도형 프로모터를 비롯한 다양한 적합한 전사 및 해독 인자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아계에 클로닝하는 경우에는, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, CA) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도형 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포계에서는, 포유동물 유전자 유래의 프로모터 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 복수의 복사체를 포함하는 세포주의 생성이 필요한 경우에는 SV40 또는 EBV를 기본으로 한 벡터를 적당한 선택성 마커와 함께 사용하는 것이 유리하다.
박테리아계의 경우, 발현 벡터로는 발현되는 폴리펩타이드에 바람직한 용도에 따라 다수의 발현 벡터 중 임의의 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 유도용과 같이 다량이 필요한 경우에는 쉽게 정제되는 융합 단백질의 고농도 발현을 유도하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터로는 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 당해의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 벡터내에 아미노 말단의 Met 서열 및 뒤이은 하이브리드 단백질을 생성하기 위한 베타-갈락토시다제의 7잔기와 정확한 프레임에 맞게 연결시킬 수 있는 BLUESCRIPT(Stratagene); pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster(1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.) 역시 이종 폴리펩타이드를 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고 글루타치온-아가로스 비드에 대한 흡착으로 용균 세포로부터 용이하게 정제한 뒤 유리 글루타치온의 첨가를 통해 용출시킬 수 있다. 이러한 발현계에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인하여 필요할 때 GST 잔기로부터 당해의 클로닝된 폴리펩타이드를 해리시킬 수 있다.
효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우에는, 구성형 또는 유도형 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH를 함유하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다[Ausubel et al.(상기문헌설명 참조) 및 Grant et al.(1987) Methods Enzymol. 153:516-544].
식물 발현 벡터를 사용하는 경우에는, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현에 다수의 프로모터 중 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S 프로모터 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 벡터를 단독으로 또는 TMV 유래의 오메가 리더 서열과 함께 사용할 수 있다[Takamatsu, N.(1987) EMBO J. 6:307-311]. 또는, RUBISCO 또는 열충격 프로모터의 작은 서브유닛과 같은 식물 프로모터를 사용할 수도 있다[Coruzzi, G. et al.(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al.(1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al.(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105]. 이러한 작제물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원균 매개의 형질감염을 통해 식물 세포로 도입시킬 수 있다. 이러한 기법에 대해서는 일반적으로 유용한 다수의 문헌에 기술되어 있다[예컨대, Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yeatbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill. New York, N.Y.; pp.191-196].
곤충계 역시 당해의 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 발현계의 하나로서 오토그라파 캘리포니카 핵 다면성 바이러스(AcNPV)를, 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 라바(Trichoplusia larvae)에서 이종 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용할 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역에 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 배치시킬 수 있다. 폴리펩타이드 암호 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화하고 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성하는 것이다. 그 다음, 이 재조합 바이러스를 사용하여, 예컨대 당해의 폴리펩타이드를 발현할 수 S.프루지페르다 세포 또는 트리코플루시아 라바를 감염시킬 수 있다[Engelhard, E.K. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227].
포유동물 숙주 세포의 경우에는 다수의 바이러스계 발현계가 일반적으로 이용가능하다. 예를 들어, 발현 벡터로서 아데노바이러스가 사용되는 경우에는, 후기 프로모터와 3분배 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체에 당해의 폴리펩타이드를 암호하는 서열을 연결시킬 수 있다. 즉, 상기 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역내로 삽입시킴으로써 감염된 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생균 바이러스를 얻을 수 있다[Logan, J. and Shenk, T.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659]. 또한, 루스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서의 발현율을 증가시킬 수 있다.
또한, 특정 개시 시그널을 사용하여 당해의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 해독을 보다 효과적으로 향상시킬 수 있다. 이러한 시그널로는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 그 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터에 삽입되어 있는 경우에는 어떤 추가 전사 또는 해독 조절 시그널도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 암호 서열 또는 그 일부분 만이 삽입되어 있는 경우에는 ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 해독 조절 시그널이 제공되어야만 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체가 확실하게 해독할 수 있도록 정확한 리딩 프레임으로 배치되어야 한다. 외인성 해독 인자 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현 효율은 사용되는 특정 세포계에 적당한 인핸서, 예컨대 문헌[Scharf,D. et al.(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162]에 기재된 바와 같은 인핸서를 첨가함으로써 향상시킬 수 있다.
또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 발현된 단백질을 바람직한 방식으로 프로세싱하는 특성에 따라 선택할 수 있다. 이와 같은 폴리펩타이드의 변형으로는, 아세틸화, 카복실화, 글리코실화, 포스포릴화, 지질화 및 아실화를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 단백질의 "프리프로" 형태를 절단하는 해독후 프로세싱은 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 용이하게 하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 해독후 활성에 특이적인 세포 기구류와 특징적인 기작을 가진 CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38과 같은 여러 숙주 세포를 선택하여 이종 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 확고히 할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 동안 고수율로 생성하기 위해서는 안정한 발현이 일반적으로 선호된다. 예를 들어, 당해의 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 기원의 복제 및/또는 내인성 발현 인자와 동일 벡터 또는 별도의 벡터 상에 존재하는 선택성 마커 유전자를 포함할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터를 도입시킨 후, 세포는 집적용 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 후, 선택성 배지로 이동시킬 수 있다. 선택성 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것으로서, 그 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포를 성장 및 회수할 수 있도록 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 종류에 적합한 조직 배양 기법에 따라 증식시킬 수 있다.
선택 시스템은 임의의 수로 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 그 예로는 tk.sup.-세포 또는 aprt.sup.-세포에서 각각 이용될 수 있는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, M. et al.(1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy, I. et al.(1990) Cell 22:817-23) 유전자를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 선택 기준으로서 항대사산물, 항생제 또는 제초제 내성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler, M. et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코사이드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin, F. et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 각각 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(Murry, 상기 문헌 설명 참조)이 있다. 또 다른 선택성 유전자로는, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하도록 하는 hisD가 설명되어 있다[Hartman, S.C. and R.C. Mulligan(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51]. 형질전환체를 동정하고 특정 벡터계에 의한 일시적이거나 또는 안정한 단백질 발현 양을 정량하는데에도 널리 사용되는 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 그 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 그 기질 루시페린과 같은 마커와 함께 가시성 마커의 이용은 인기를 얻고 있다[Rhodes, C.A. et al.(1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131].
마커 유전자 발현의 존재 유무가 당해의 유전자가 존재함을 암시하는 것이더라도 유전자의 존재 및 발현은 확인되어야할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 마커 유전자 서열에 삽입되어 있는 경우, 서열을 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재를 통해 확인할 수 있다. 또는, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드 암호 서열과 직렬로 배치될 수 있다. 유도 또는 선택에 대한 응답반응으로 이 마커 유전자가 발현된다는 것은 일반적으로 직렬 유전자도 발현된다는 것을 나타낸다.
또는, 목적 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하여 발현하는 숙주세포는 당업자에게 공지된 다양한 절차를 통해 확인할 수 있다. 이러한 절차로는 핵산 또는 단백질을 검출 및/또는 정량하기 위하여, 예컨대 막, 용액 또는 칩을 기본으로 하는 기술을 포함하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생물검정법 또는 면역분석법을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
생성물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 중 어느 하나를 사용하여 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 생성물을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 그 예로는 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)이 있다. 일부 용도에는 소정의 폴리펩타이드 상에 있는 2개의 비간섭성 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2부위 모노클로날계 면역분석법이 바람직하기도 하지만, 경쟁적 결합 분석법 역시 이용될 수 있다. 이와 같은 분석법과 기타 다른 분석법은 특히 문헌[Hampton, R. et al. 1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul. Minn. 및 Maddox, D.E. et al.(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216]에 기술되어 있다.
다양한 표지와 접합 기법은 당업자에게 공지되어 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리드화 또는 PCR 프로브 생산 방법으로는 올리고표지화, 닉 해독, 말단 표지화 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭을 포함한다. 또는, 서열이나 이것의 임의의 일부분을 mRNA 프로브를 생성하기 위한 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수용이하며, 적당한 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7. T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드를 첨가하여 시험관내에서 DNA 프로브를 합성하는데 이용할 수 있다. 이러한 절차는 다양한 시판용 키트를 사용하여 수행할 수 있다. 사용할 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성핵종, 효소, 형광제, 화학발광제제 또는 발색원성 제제 뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
당해의 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물로부터 단백질을 발현 및 회수하는데 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 포함될 수 있다. 당업자에게는 자명하듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 시그널 서열을 포함하도록 디자인할 수 있다. 다른 재조합 작제물은 당해의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 가용성 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 결합시키는데 사용할 수 있다. 이와 같은 정제 용이성 도메인으로는, 고정된 금속 상에서의 정제를 용이하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트성 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상에서의 정제를 허용하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 증폭/친화성 정제계(Immunex Corp., Seattle, Wash.)에서 이용되는 도메인을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 정제 도메인과 암호화된 폴리펩타이드 사이에 XA 인자 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 절단성 링커 서열의 병입은 정제를 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 한가지 발현 벡터는 당해의 폴리펩타이드와 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞에 6개의 히스티딘 잔기를 암호화하는 핵산을 함유하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 상기 히스티딘 잔기는 문헌[Porath, J. et al., 1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281]에 기재된 바와 같이 IMIAC(고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)에서의 정제를 용이하게 하는 한편, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 목적 폴리펩타이드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유하는 벡터에 대해서는 문헌[Kroll, D.J. et al., 1993; DNA Cell Biol. 12:441-453]에 설명되어 있다.
재조합 생산 방법외에도, 본 발명의 폴리펩타이드와 이의 단편은 고상 기법[Merrifield J. 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154]을 이용한 직접적인 펩타이드 합성법으로 제조할 수 있다. 단백질 합성은 수동 기법이나 자동화로 실시할 수 있다. 자동화 합성법은 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer)를 사용하여 실시할 수 있다. 또는, 다양한 단편을 화학적으로 각각 합성한 뒤 화학적 방법으로 결합시켜 전체 길이의 분자를 얻을 수도 있다.
항체 조성물, 이의 단편 및 다른 결합제
또 다른 관점으로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 종양 폴리펩타이드 또는 그 일부분에 대하여 면역학적 결합성을 나타내는 항체 및 이것의 항원 결합 단편과 같은 결합제를 제공한다. 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 본 발명의 폴리펩타이드와 검출가능한 농도(예컨대 ELISA 분석법에서)로 반응하지만 유사한 조건하에서 비관련 폴리펩타이드와는 검출가능할 정도로 반응하지 않는다면, 본 발명의 폴리펩타이드와 "특이적 결합", "면역학적 결합" 및/또는 "면역학적 반응성인"이라고한다.
이러한 문장에 사용된 면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자와 이 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 일어나는 유형의 비공유 상호작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있는데, 여기에서 Kd가 작을수록 친화성은 크다는 것을 의미한다. 선택된 폴리펩타이드의 면역학적 결합성은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 정량할 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 단계를 포함하되, 그 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성 및 양 방향으로 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존적이다. 따라서, "진행 속도 상수"(Kon) 및 "중지 속도 상수"(Koff)는 결합 및 해리의 실제 속도와 농도를 계산하여 측정할 수 있다. Koff/Kon비는 친화성과 관련되지 않은 모든 파라미터들의 소거를 가능케하여 해리 상수 Kd와 동일한 값이 된다. 일반적으로 문헌[Davies et al.(1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473]을 참조하라.
항체의 "항원 결합 부위" 또는 "결합부"는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역내에 있는 3개의 고도 상이성 스트레치는 "초가변 영역"이라 하며, "프레임워크 영역" 또는 "FR"이라는 보다 보존적인 인접 스트레치 사이에 중재해 있다. 따라서, "FR"이라는 용어는 면역글로불린내에서 초가변 영역 사이에 인접해 있는 천연의 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서 경쇄의 3개의 초가변 영역과 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에 서로 상대적으로 배치되어 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이어서, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역을 "상보성 결합 영역" 또는 "CDR"이라 부른다.
결합제는 또한 본 명세서에 제시된 대표적인 분석법을 사용하여 암, 일 예로 전립선 암이 있는 환자와 없는 환자를 구별할 수 있다. 예를 들어, 종양 단백질에 결합하는 항체 또는 다른 결합제는 바람직하게는 질병이 있는 환자의 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 환자의 약 30% 이상에게서 암의 존재를 나타내는 시그널을 생성하는 것이 좋다. 대안적으로, 또는 또한 항체는 암이 없는 개체의 약 90% 이상에게서 질병의 부재를 나타내는 음성 시그널을 생성하는 것이 좋다. 결합제가 이러한 조건을 충족시키는지 측정하기 위하여, 암이 있고 없는 환자들의 생물 시료(예, 혈액, 혈청, 타액, 요 및/또는 종양 생검)를 가지고 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 분석할 수 있다. 바람직하게는 질병이 있고 없는 시료를 통계적으로 유의적인 수치로 분석할 수 있는 것이 좋다. 각각의 결합제가 상기 기준을 충족시켜야 하지만, 감수성을 향상시키기 위하여 결합제를 조합하여 사용할 수도 있음을 당업자라면 충분히 이해할 수 있을 것이다.
상기 기준을 충족시키는 모든 제제는 결합제일 수 있다. 예를 들어, 결합제는 펩타이드 성분의 유무에 관계없이 리보솜이거나 RNA 분자이거나 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.항체는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 통해 제조할 수 있다[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로 항체는 세포 배양 기법, 예컨대 본 명세서에 기술된 모노클로날 항체의 생성, 또는 적합한 박테리아 또는 포유동물 세포 숙주로 항체 유전자를 형질감염시켜 재조합 항체를 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 한가지 기법으로서, 폴리펩타이드를 함유하는 면역원을 다양한 포유동물(예, 마우스, 랫트, 래빗, 양 또는 염소) 중 임의 동물에게 1차 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드인 경우에는 그 폴리펩타이드가 소혈청 알부민이나 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 결합되어 있다면 우수한 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역원을 동물 숙주에 주사하는 방법은 1회 또는 2회 이상의 추가 면역화를 포함하는 소정 계획에 따르는 것이 바람직하고, 주기적으로 동물의 혈액을 채혈한다. 이 항혈청으로부터 예를 들어 적합한 고상 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 상기 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체를 정제할 수 있다.
당해의 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976]에 기술된 기법 및 이의 개선안을 사용하여 제조할 수 있다. 간략히 설명하면, 이 방법은 바람직한 특이성(즉, 당해 폴리펩타이드와의 반응성)이 있는 항체를 생성할 수 있는 무한증식성 세포주를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들어 전술한 바와 같이 면역화한 동물에게서 얻은 비장 세포로부터 제조할 수 있다. 이 비장 세포를그 다음 예컨대 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 세포와의 융합을 통해 무한증식화한다. 융합 기법에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포와 골수종 세포를 비이온 세정제와 수 분 동안 혼합한 뒤 골수종 세포는 성장시키지 않고 하이브리드 세포의 성장만을 지지하는 선택 배지에 저밀도로 평판배양한다. 바람직한 선택 기법은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택을 이용하는 것이다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후 하이브리드 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선발하고 그 배양 상청액을 상기 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대하여 시험한다. 반응성과 특이성이 높은 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 증식성 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 적합한 척추 동물 숙주, 예컨대 마우스의 복강내로 상기 하이브리도마 세포주를 주사하는 방법과 같은 다양한 기법으로 수율을 향상시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 그 다음 복수액이나 혈액으로부터 수거할 수 있다. 오염물은 통상의 기법, 예컨대 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출 등으로 항체로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예컨대 친화성 크로마토그래피 단계인 정제 과정에 사용할 수 있다.
항체 분자의 면역학적 결합성을 나타낼 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 치료적으로 유용한 다수의 분자가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 단백분해 효소인 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 여러 단편을 생성하는데, 그 중 2개("F(ab)" 단편)는 각각 고유의 항원 결합 부위를 포함하는 공유성 이종이량체를포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 양쪽에 항원 결합 부위를 포함하는 "F(ab')2" 단편을 비롯하여 여러 단편을 생성할 수 있다. "Fv" 단편은 IgM의 우선적인 단백분해 절단으로 생성되고, 때로 드물지만 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자에 의해 생성될 수도 있다. 그러나, Fv 단편은 당해 기술 분야에 공지된 재조합 기법에 의해 유도되는 것이 보다 일반적이다. Fv 단편은 천연의 항체 분자의 항원 인식성과 결합성의 대부분을 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 비공유성 VH::VL이종이량체를 포함한다[Inbar et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al.(1976) Biochem 15:2705-2710; 및 Ehrlich et al.(1980) Biochem 19:4091-4096].
일본쇄 Fv("sFv") 폴리펩타이드는 펩타이드 암호성 링커에 의해 결합된 VH및 VL암호 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 발현되는 공유 결합된 VH::VL이종이량체이다[Huston et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85(16): 5879-5883]. 항체 V 영역으로부터 유래하는, 천연적으로는 응집되어 있지만 화학적으로는 분리된 경쇄 및 중쇄의 폴리펩타이드를 항원 결합 부위의 구조와 거의 유사한 3차원 구조로 중첩할 수 있는 sFv 분자로 전환시킬 수 있는 화학적 구조를 식별하는 방법으로는 다수의 방법이 개시되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호(Huston et al.) 및 미국 특허 제4,946,778호(Ladner et al.)를 참조하라.
전술한 분자는 각각 CDRS에 대한 지지체를 제공하고 CDR의 서로에 대한 공간적 관계를 한정하는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에 각각 배치된 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "CDR 세트"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 의미한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서부터 시작할 때 이 영역들을 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"이라 한다. 따라서, 항원 결합 부위는 각각 중쇄 및 경쇄 V 영역 유래의 CDR 세트를 포함하여 6개의 CDR을 포함한다. 하나의 CDR(예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드를 본 명세서에서는 "분자 인식 단위"라고 한다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 충분한 접촉을 형성하고 있고, 가장 넓은 항원 접촉은 중쇄 CDR3에서 이루어져 있음을 입증하고 있다. 따라서, 분자 인식 단위는 주로 항원 결합 부위의 특이성에 중요한 역할을 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "FR 세트"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세포에 있는 CDR들을 골격화하는 4개의 인접 아미노산 서열을 의미한다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원에 접촉할 수 있으나, FR은 주로 V 영역을 항원 결합 부위로 중첩시키는데 중요한 역할을 하며, 특히 FR 잔기는 CDRS에 직접 인접해있다. FR내에서, 일부 아미노 잔기와 일부 구조적 특징은 매우 고도의 보존성을 나타낸다. 이러한 점에서, 모든 V 영역의 서열은 약 90개 아미노산 잔기의 내부 이황화물 루프를 포함한다. V 영역이 결합 부위로 중첩할 때, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 돌출형 루프 모티프로서 나타난다. 일반적으로, CDR 루프의 중첩 형태를 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이 특정 "규범적" 구조로 만드는데 영향을 미치는 FR의 보존적 구조 영역이 있는 것으로 이해되고 있다. 또한, 항체 중쇄와경쇄의 상호작용을 안정화시키는 비공유 상호도메인 접촉에 참여하고 있는 몇몇 FR 잔기가 알려져 있다.
비인간 면역글로불린 유래의 항원 결합 부위를 포함하는 다수의 "인체화된" 항체 분자로는, 설치류의 V 영역을 보유하고 이들의 관련 CDR이 인간의 불변 도메인에 융합되어 있는 키메라 항체[Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al.(1989) Proc.Nat.Acad.Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al(1987) J.Immunol. 138:4534-4538; 및 Brown et al.(1987) Cancer Res. 47:3577-3583], 설치류 CDR이 적당한 인간 항체 불변 도메인과 융합하기 전에 인간 지지성 FR에 이식되어 있는 키메라 항체[Riechmann et al.(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al.(1988) Science 239:1534-1536; 및 Jones et al.(1986) Nature 321:522-525] 및 설치류 CDR이 재조합적으로 부착된 설치류 FR에 의해 지지되는 키메라 항체(유럽 특허 공개 번호 519596, 1992.12.23 공개) 등이 개시되어 있다. 이와 같은 "인체화된" 분자는 인간 수용체에 투여시 그 분자들의 치료적 적용의 효과와 지속기간을 제한하는 설치류 항인간 항체 분자에 대한 바람직하지 않은 면역학적 반응을 최소화하도록 디자인한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "부착된 FR" 및 "재조합적으로 부착된 FR"이란, 예컨대 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역 유래의 FR 잔기가 천연의 FR 폴리펩타이드 중첩 구조를 거의 대부분 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 이종 개체 분자를 제공하기 위하여 인간의 FR 잔기로 선택적으로 치환시킨 것을 의미한다. 부착 기법은 항원 결합 부위의 리간드 결합 특성이 항원 결합 표면내에 있는 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 배치에 의해 주로 결정된다는 이해에 기초한 것이다[Davies et al.(1990) Ann.Rev.Biochem. 59:439-473]. 따라서, 항원 결합 특이성은 CDR 구조와 서로간의 상호작용, 그리고 V 영역 도메인 나머지와의 상호작용이 주의깊게 유지되는 인체화된 항체에서만 보존될 수 있다. 부착 기법을 사용하여, 면역계와 쉽게 만나는 외부(예, 용매 접촉성) FR 잔기를 인간 잔기와 선택적으로 치환시켜 약하게 면역원성이거나 또는 실질상 비면역원성인 부착 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 얻을 수 있다.
부착 과정은 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed.,(U.S.Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987]에서 카벳(Kabat) 등에 의해 축적된 인간 항체 가변 도메인에 대한 유용한 서열 데이터, 카벳 데이터베이스의 갱신물 및 다른 입수용이한 미국 및 외국 데이터베이스(핵산 및 단백질 데이터베이스 모두)를 이용한다. V 영역 아미노산의 용매 접촉성은 인간 및 마우스의 항체 단편에 대한 공지의 3차원 구조로부터 추론할 수 있다. 마우스의 항원 결합 부위를 부착하는 데에는 일반적인 2단계를 이용한다. 먼저, 당해의 항체 분자의 가변 도메인의 FR들을 전술한 데이터베이스들에서 얻어진 인??나 가변 도메인의 상응하는 FR 서열들과 비교한다. 그 다음, 가장 상동성인 인간 V 영역을 상응하는 마우스 아미노산과 잔기끼리 비교한다. 인간의 대응물과 상이한 마우스의 FR내 잔기를 당해 기술 분야에 공지된 재조합 기법으로 인간 유전자 부에 존재하는 잔기로 치환시킨다. 잔기 치환은 최소한 부분적으로 노출된(용매 접촉성) 유전자 부만을 가지고 실시하고, V 영역 도메인의 3차 구조에유의적인 효과를 나타낼 수 있는 아미노산 잔기, 예컨대 프롤린, 글리신 및 하전을 띤 아미노산으로 치환시킨다.
이와 같은 방식으로 결과적으로 얻어지는 "부착된" 마우스의 항원 결합 부위는 마우스의 CDR 잔기, CDR에 실질적으로 인접한 잔기, 매립되거나 거의 매립된 것으로 확인되는 잔기(용매 비접촉성), 중쇄 도메인과 경쇄 도메인 사이의 비공유(예, 정전기적 및 소수성 접촉) 접촉에 참여하는 것으로 생각되는 잔기 및 CDR 루프의 "규범적" 3차 구조에 영향을 미치는 것으로 사료되는 FR의 보존적 구조 영역의 잔기를 보유하도록 디자인한다. 이와 같은 디자인 기준에 따라 마우스의 항원 결합 부위의 중쇄 및 경쇄의 CDR을, 마우스의 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 인간 항체의 발현을 위해 포유동물 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있는 인간을 나타내는 FR에 결합시킨 재조합 뉴클레오타이드 서열을 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 모노클로날 항체는 1종 또는 그 이상의 치료제에 결합시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제로는 방사성핵종, 분화 유도제, 약물, 독소 및 이의 유도체를 포함한다. 바람직한 방사성핵종으로는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi 가 있다. 바람직한 약물로는 메토트렉세이트, 및 피리미딘과 퓨린 유사체가 있다. 바람직한 분화 유도체로는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 있다. 바람직한 독소로는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 쉬겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질이 있다.
치료제는 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접(예, 링커 그룹을 통해)적으로 결합시킬 수 있다(예, 공유 결합). 물질과 항체사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 소유할 때 가능하다. 예를 들면 아미노 또는 설프하이드릴 그룹과 같은 친핵성 그룹은 한쪽에 무수물 또는 산 할라이드와 같은 카보닐-함유 그룹 또는 다른 쪽에 양호한 이탈 그룹(예, 할라이드)을 함유한 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
다른 방도로서, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통해 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합능의 방해를 피하기 위해 물질로부터 항체를 이격시키는 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 또한 물질 또는 항체에 치환체의 화학 반응성을 증대시키는 작용을 하여 결합 효율을 증가시킬 수 있다. 화학 반응성의 증대는 또한 물질 또는 가능하지 않을 수 있는 물질상의 작용기의 사용을 촉진할 수 있다.
호모- 및 헤테로-작용성의 여러 이작용성 또는 다작용성 시약(일리노이 록포드 소재 Pierce Chemical Co.의 카달로그에 기술된 것)이 링커 그룹으로서 사용될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 예를 들면, 결합은 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 방법에 관하여는 많는 참고 문헌이 있으며 예로는 로드웰(Rodwell) 등의 미국 특허 제4,671,958호이다.
치료제가 본 발명의 면역결합체의 항체 부분으로 유리될 때 보다 강력한 경우, 세포내로의 내화 동안에 또는 내화시 절단될 수 있는 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 다른 절단가능한 링커 그룹이 공개되었다. 이들 링커 그룹으로부터 물질의 세포내 방출에 대한 기전은 이황화 결합의 환원에 의한 절단(Spitler의 미국 특허 제4,489,710호), 광분해성 결합의 방사선조사에 의한 분해(Senter 등의 미국 특허 제4,625,014호), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해에 의한 절단(Kohn 등의 미국 특허 제4,638,045호), 혈청 보충-매개된 가수분해에 의한 절단(Rodwell 등의 미국 특허 제4,671,958호) 및 산-촉매된 가수분해에 의한 절단(Blattler 등의 미국 특허 제4,569,789호)을 포함한다.
하나 이상의 물질을 항체에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 양태로서, 물질의 다수 분자가 한 개의 항체 분자에 결합된다. 다른 양태로서, 물질의 하나 이상의 유형이 한 개의 항체에 결합될 수 있다. 특정한 양태와 상관없이, 하나 이상의 물질을 갖는 면역결합체는 여러 방식으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 물질은 항체 분자에 직접 결합되거나 결합을 위한 다수의 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 다른 방도로서, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적인 공유 결합을 포함하거나 링커 그룹을 통해 공유 결합을 포함하여 여러 방법으로 물질을 포함할 수 있다. 적합한 담체로는 알부민(참조: Kato 등의 미국 특허 제4,507,234호)과 같은 단백질, 펩타이드 및 아미노덱스트란(참조: Shih 등의 미국 특허 제4,699,784호)와 같은 다당류를 포함한다. 담체는 또한 비공유 결합 또는 예를 들어, 리포좀 소포내에서의 캡슐화(참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호)에 의해 물질을 함유할 수 있다. 방사선핵종 물질에 대해 특이적인 담체는 방사선할로겐화 소 분자 및 킬레이트화 화합물을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사선할로겐화 소 분자 및 이들의 합성법이 기술되어 있다. 방사선핵종 킬레이트는 질소 및 황 원자를 금속 또는 금속 옥사이드와의 결합을 위한 공여 원자로서 함유하는 것을 포함한 킬레이트 화합물로부터 형성할 수 있다. 예를 들면, Davison 등의 미국 특허 제4,673,562호에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이들의 합성법이 기술되어 있다.
T 세포 조성물
본 발명은 다른 관점으로서 본원에 기술된 종양 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체에 특이적인 T 세포를 제공한다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 제조할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 시판되는 세포 분리 시스템(예, 캘리포니아 어어빈 소재 Nexell Therapeutics, Inc.의 제품 Islex System)(참조: 미국 특허 제5,240,856호 및 제5,215,926호; WO89/06280; WO91/16116 및 WO92/07243)을 사용하여 환자의 골수, 말초혈액 또는 골수 또는 말초혈액의 분획으로부터 분리할 수 있다. 다른 방도로서, T 세포는 관련된 또는 무관한 사람, 비-사람 포유동물, 세포주 또는 배양물로부터 유도할 수 있다.
T 세포는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포(APC)로 자극시킬 수 있다. 이러한 자극은 해당 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포의 발생을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안에 실시한다. 바람직하게는, 본 발명의 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 미세구체와 같은 전달 비히클내에 존재하여 특이적 T 세포의 발생을 촉진한다.
T 세포는 특정적으로 증식하거나, 사이토킨을 분비하거나, 폴리펩타이드로 피복된 표적세포를 살해하거나 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현하는 경우 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 특징적으로 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 여러 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 검정 또는 증식 검정에서, 음성 대조군에 비하여 용해 및/또는 증식에서 2배 이상 증가된 자극 지수는 T 세포 특이성을 가리킨다. 이러한 검정은 예를 들면 문헌[Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다. 다른 방도로서, T 세포의 증식의 검출은 여러 공지 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가된 비율을 측정함으로써(예, T 세포 배양물을 삼중수 티미딘으로 펄스 표지시키고 DNA에 혼입된 삼중수 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 종양 폴리펩타이드(100ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 200ng/ml 내지 25㎍/ml)와의 3-7 일간 접촉은 전형적으로 T 세포가 2배 이상 증가한다. 상기된 바와 같은 2 내지 3일간의 접촉은 사이토킨 방출(예, TNF 또는 IFN-γ)의 수준에서 2배 증가는 T 세포 활성화를 지시하는 표준 사이토킨 검정(참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998))을 사용하여 측정했을 때 T 세포의 활성화를 제공해야 한다. 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드-발현 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+또는 CD8+T 세포일 수 있다. 종양 폴리펩타이드-특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 양태로서, T 세포는 환자, 관련된 공여자 또는 무관한 공여자로부터 유도되며 자극 및 증식 후 환자에 투여된다.
치료 목적상, 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식할 수 있는 CD4+또는 CD8+T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 숫적으로 증식시킬 수 있다. 이러한 T 세포의 시험관내 증식은 여러 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 인터루킨-2와 같은 T 세포 성장 인자 및/또는 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포의 첨가와 함께 또는 첨가하지 않고서 종양 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 면역원성 부분에 상응하는 짧은 펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 다른 방도로서, 종양 폴리펩타이드의 존재하에서 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 숫적으로 증식시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며 제한 희석을 포함한다.
약제학적 조성물
추가의 양태로서, 본 발명은 세포 또는 동물에 단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 치료 요법과 병용하여 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체중의 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포 및/또는 항체 조성물중 하나 이상의 제형에 관한 것이다.
본원에 기술된 조성물은 필요한 경우 다른 제제, 예를 들면 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 여러 약제학적으로 허용되는 제제와 병합하여 투여할 수 있다는 것은 이해될 것이다. 사실, 추가되는 제제가 표적 세포 또는 숙주 조식과의 접촉에 유의적으로 유해하게 작용하지 않는 한 그에 대한 실질적인 제한은 없다. 따라서, 조성물은 특정 사례에서 필요로 하는 여러 다른 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제되거나 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 마찬가지로, 이러한 조성물은 또한 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 관점으로서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체 및/또는 T-세포 조성물중 하나 이상을 생리학적으로 허용되는 담체와 배합하여 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 바람직한 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및 치료 백신에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 포함한다. 백신 제제는 일반적으로 예를 들면 문헌[M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 한 가지 이상의 면역자극제와 배합하여 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 포함한다.
본원에 기술된 약제학적 조성물중 어떠한 것도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 이러한 염은 예를 들면 유기 염기(예, 일차, 이차 및 삼차 아민과 염기성아미노산의 염) 및 무기 염기(예, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 포함한 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명의 대표적인 면역원성 조성물(예, 백신 조성물)은 폴리펩타이드가 원위치에서 발생하도록 상기된 폴리펩타이드중 하나 이상을 암호화하는 DNA를 포함한다. 위에서 주지된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 알려진 여러 전달 시스템으로 투여할 수 있다. 사실, 많은 유전자 전달 기술이 본 분야에 잘 알려져 있으며 예로는 문헌[Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998] 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있는 방법을 들 수 있다. 적절한 폴리뉴클레오타이드 발현 시스템은 물론 환자의 체내에서 발현하는데 필요한 DNA 조절 서열(예, 적합한 프로모터 및 종결 시그널)을 함유한다. 다른 방도로서, 세균 전달 시스템은 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 세포 표면에서 발현하거나 그러한 에피토프를 분비하는 세균(예, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 포함할 수 있다.
따라서, 특정한 양태로서, 본원에 기술된 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 많은 공지된 바이러스-기본 시스템을 사용하여 적합한 포유동물 숙주 세포내로 도입한다. 한 가지 대표적인 양태로서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위해 편리하고 효과적인 기반을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 뉴클레오타이드 서열은 본 분야에 공지된 기술을 이용하여 벡터내로 삽입하고 레트로바이러스 입자에 내재시킬 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스를 분리하고 대상자에게 전달할 수 있다. 많은 예시적인 레트로바이러스 시스템이 공개되었다(예, 미국 특허 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al., (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
또한, 많은 예시적인 아데노바이러스-기본 시스템이 또한 공개되었다. 숙주 게놈내로 통합되는 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 염색체외에 존재하며 이에 따라 삽입에 의한 돌연변이 유발과 관련된 위험은 최소화한다(Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al.(1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616-629; 및 Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).
여러 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 또한 폴리뉴클레오타이드 전달위해 개발되었다. AAV 벡터는 본 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 용이하게 작제할 수 있다(예, 미국 특허 제5,173,414호 및 5,139,941호; 국제특허공개 WO92/01070 및 WO93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875).
유전자 전달에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 유용한 추가의 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스 및 조류 수두바이러스와 같은 수두 바이러스 계열로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들면, 새로운 분자를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체가 다음과 같이 작제될 수 있다. 우선, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 이것이 백시니아 프로모터 및 플랭킹 백시니아 DNA 서열(티미딘 키나제(TK)를 암호화하는 서열)에 인접하도록 적합한 벡터내로 삽입한다. 그런 후, 이 벡터를 사용하여 세포를 감염시키면 세포는 동시에 백시니아로 감염된다. 동종 재조합을 이용하여 백시니아 프로모터와 함께 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 바이러스 게놈내로 삽입시킬 수 있다. 생성된 TK.sup.(-) 재조합체는 세포를 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 배양하고 이에 대해 내성인 바이러스 플라그를 픽업함으로써 선별할 수 있다.
백시니아-기본 감염/형질감염 시스템은 유기체의 숙주 세포에서 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 유도성, 일시성 발현 또는 동시발현을 제공하는데 편리하게 사용할 수 있다. 이 특정 시스템에서, 세포는 우선 시험관내에서 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염된다. 이 폴리머라제는 단지 T7 프로모터를 갖는 주형만을 전사한다는 점에서 특이성을 나타낸다. 감염 후, 세포는 T7 프로모터에 의해 작동되는 해당 폴리뉴클레오타이드로 감염된다. 백시니아 바이러스 재조합체로부터 세포질내에 발현된 폴리머라제는 감염된 DNA를 RNA로 전사하고 이후 RNA는 숙주 해독 기작에 의해 폴리펩타이드로 해독된다. 이 방법은 다량의 RNA 및 이의 해독 산물의 고 수준의 일시적, 세포질내 생성을 제공한다(참조: Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Sci. USA (1986) 83:8122-8126).
다른 방도로서, 계두 및 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스바이러스가 또한 해당 암호화 서열을 전달하기 위해 사용할 수 있다. 포유동물 병원체로부터 면역원을 발현하는 재조합 아비폭스바이러스는 비조류 종에 투여될 때 보호 면역성을 제공하는 것으로 알려져 있다. 아비폭스 벡터의 사용은 특히 사람 및 기타 포유동물 종에서 바람직한데 그 이유는 아비폭스 속의 일원들이 민감성 조류 종에서만이 풍부하게 복제할 수 있고 이에 따라 포유동물 세포에는 감염되지 않기 때문이다. 재조합 아비폭스 바이러스를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있고 백시니아 바이러스의 제조와 관련하여 상기된 바와 같이 유전자 재조합을 사용한다(예, WO91/12882; WO89/03429; 및 WO92/03545).
많은 알파바이러스 벡터가 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물의 전달에 사용할 수 있으며 예로는 미국 특허 제5,843,723호; 제6,015,686호; 제6,008,035호 및 제6,015,694호에 기술된 벡터를 들 수 있다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE)을 기초로 한 특정 벡터를 또한 사용할 수 있으며 이의 대표적인 예는 미국 특허 제5,505,947호 및 제5,643,576호에서 찾아 볼 수 있다.
게다가, 문헌[Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 및Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103)에 기술된 아데노바이러스 키메라 벡터와 같은 분자 결합 벡터가 또한 본 발명하의 유전자 전달을 위해 사용할 수 있다.
이들 및 기타 공지된 바이러스-기본 전달 시스템에 관한 추가의 예시적인 정보를 예를 들면 문헌[Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; WO89/01973; 미국 특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]에서 찾아 볼 수 있다.
특정한 양태로서, 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포의 게놈내로 통합될 수 있다. 이 통합은 동종 재조합(유전자 치환)을 통해 특정 위치 및 방향으로 존재하거나 랜덤한 비특정 위치(유전자 증대)로 통합될 수 있다. 또 다른 양태로서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA의 별도 에피좀 단편으로서 세포내에 안정하게 유지될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 "에피좀"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 숙주 세포 주기와 동시에 유지 및 복제를 허용하기에 충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물이 세포에 전달되고 세포에서 폴리뉴클레오타이드가 유지되는방식은 사용된 발현 작제물의 유형에 의존한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 및 Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 기술된 바와 같이 "나출형" DNA로서 투여되고/전달된다. 나출형 DNA의 유입은 세포내로 효율적으로 이송되는 DNA를 생체분해성 비드에 코팅함으로써 증가시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 조성물은 입자 충돌 방식을 통해 전달될 수 있으며, 이 가운데 많은 것들이 공개되어 있다. 한 가지 예로서, 가수-가동된 입자 가속은 Powderject Pharmaceuticals PLC (영국 옥스퍼드 소재) 및 Powderject Vaccines Inc. (위스콘신 매디슨 소재)에 의해 제조된 것과 같은 장치로 달성할 수 있으며, 이 가운데 일부는 미국 특허 제5,846,796호; 제6,010,478호; 제5,865,807호 및 유럽특허 제0500799호에 기술되어 있다. 이 방식은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 입자와 같은 미세 입자의 무수 산제를 손바닥 크기의 장치로 발생된 헬륨 가스 제트내에서 고속으로 가속시키고 입자를 해당 표적 조직내로 추진시키는 주사침-비함유 전달 방식을 제공한다.
관련된 양태로서, 본 발명의 조성물의 가스-작동된 주사침-비함유 주사에 유용할 수 있는 다른 장치 및 방법으로서 Bioject, Inc.(오레곤 포트랜드 소재)에 의해 제공된 것이 포함되며, 이 가운데 일부는 미국 특허 제4,790,824, 제5,064,413호, 제5,312,335호, 제5,383,851호, 제5,399,163호, 제5,520,639호 및 제5,993,412호에 기술되어 있다.
다른 양태에 따라, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체, T-세포 및/또는 APC 조성물이외에 한 가지 이상의 면역자극제를 함유한다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포-매개된) 강화하거나 증가시키는 물질을 가리킨다. 면역자극제의 한 가지 바람직한 유형은 부형제를 포함한다. 많은 부형제는 수산화알루미늄 또는 광유와 같이 신속한 신진대사로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질 및 지질 A, 보르타델라 페르투시스 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 유도된 단백질과 같은 면역반응의 자극제를 함유한다. 특정 애쥬번트가 시판되고 있으며 예로는 프로인트 불완전 애쥬번트 및 완전 애쥬번트(미시간 디트로이트 소재 Difco Laboratories); 머크 애쥬번트 65(뉴저지 라웨이 소재 Merck and Company, Inc.); AS-2(펜실바니아 필라델피아 소재 SmithKline Beecham); 수산화알루미늄 겔(칼륨명반) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생체분해성 미세구체; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A를 들 수 있다. GM-CSF, 인터루킨-2, -7, -12 및 기타 유사한 성장 인자와 같은 사이토킨이 또한 애쥬번트로서 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 양태로서, 보조 조성물은 바람직하게는 Th1 유형의 면역 반응을 우세하게 유도하는 것이다. 고 수준의 Th1-유형 사이토킨(예, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포 매개된 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 대조적으로, 고 수준의 Th2-유형 사이토킨(예, IL-4, IL-5, IL-6및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후, 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함한 면역 반응을 지지할 것이다. 반응이 우세하게 Th1-유형인 바람직한 양태로서, Th1-유형 사이토킨의 수준은 Th2-유형 사이토킨의 수준보다 더 많은 정도로 증가한다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨의 부류는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]을 참고할 수 있다.
Th1-유형 반응을 우세하게 유도하기에 특히 바람직한 애쥬번트로는, 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염과의 혼합물이 포함된다. MPL 애쥬번트가 코릭사 코포레이션(워싱턴 시애틀 소재)(참조예: 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호)에서 구입가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(여기서, CpG 디뉴클레오타이드는 비메틸화되어 있다)가 또한 Th1 반응을 우세하게 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 잘 알려져 있으며 예를 들면 WO96/02555, WO99/33488 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기술되어 있다. 면역자극성 DNA 서열은 또한 예를 들면 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에 기술되어 있다. 다른 바람직한 애쥬번트는 사포닌(예, Quil A) 또는 이의 유도체(QS21 및 QS7를 포함)(매사츄세츠 프라밍햄 소재 Aquila Biopharmaceuticals Inc.); 에스신; 디지토닌; 또는 집소필라 또는 체노포듐 퀴노아 사포닌을 포함한다. 다른 바람직한 제제는 본 발명의 애주번트 혼합물에 하나 이상의 사포닌을 포함하며, 예를 들면 QS21, QS7, Quil A, β-에스신 또는 디지토닌으로 이루어진 그룹중에서 두 가지 이상의 혼합물을 포함한다.
다른 방도로서, 사포닌 제제는 키토산 또는 다른 다중양이온성 중합체, 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코스아민-계통 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질-계통 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자로 이루어진 백신 비히클과 혼합될 수 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재하에 제형되어 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미세 구조를 형성할 수 있다. 또한, 사포닌은 비입자성 용액 또는 현탁액에서 또는 파우시라멜라 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립 구조에서 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 혼합하여 제형될 수 있다. 사포닌은 또한 CarbopolR과 같은 부형제와 제형하여 점성을 증가시키거나 락토즈와 같은 분말 부형제와 혼합하여 무수 산제 형태로 제형할 수 있다.
한 가지 바람직한 양태로서, 애쥬번트 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 혼합물(예, WO94/00153에 기술된 QS21과 3D-MPLR애쥬번트의 혼합물 또는 WO96/33739에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 급랭된 보다 덜 반응원성인 조성물)을 포함한다. 다른 바람직한 제제는 유중수 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 유중수 에멀젼에 QS21, 3D-MPLR애쥬번트 및 토코페롤을 사용한 특히 바람직한 다른 애쥬번트 제제가 WO95/17210호에 기술되어 있다.
다른 증가된 애쥬번트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드와 사포닌 유도체의 혼합물을 포함하며, 특히 CpG와 QS21의 혼합물이 WO00/09159에 기술되어 있다. 바람직하게는, 제제는 추가로 유중수 에멀젼과 토코페롤을 함유한다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 추가의 예시적인 애쥬번트로는 몬타나이드 ISA 720(프랑스 소재 Seppic), SAF(미합중국 캘리포니아 소재 Chiron), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), SBSA 애쥬번트 시리즈(예, 벨기에 릭센사르트 소재 SmithKline Beecham 제품 SBAS-2 똔느 SBAS-4), 데톡스(MT, 해밀톤 소재 Corixa 제품 EnhanzynR), RC-529(MT, 해밀톤 소재 Corixa) 및 미국 특허원 제08/853,826호 및 09/074,720호에 기술된 것과 같은 기타 아미노알킬 글루코스아미니드 4-포스페이트(AGP)이 포함된다. 상기 특허원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 원용된다. 또한, WO 99/52549A1에 기술된 것과 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 애쥬번트가 포함된다.
다른 바람직한 애쥬번트는 다음 화학식의 애쥬번트 분자를 포함한다:
HO(CH2CH2O)n-A-R (I)
상기식에서, n은 1 내지 50이고, A는 결합 또는 -C(O)-이며, R은 C1-50알킬 또는 페닐 C1-50알킬이다.
본 발명의 한 가지 양태는 화학식(I)의 폴리옥시에틸렌 에테르(여기서, n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고, R은 C1-50, 바람직하게는 C4-20알킬, 가장 바람직하게는 C12알킬이며, A는 결합이다)를 포함하는 백신제제로 구성된다. 폴리옥시에틸 에테르의 농도는 0.1 내지 20%의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%의 범위이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 그룹중에서 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 머크 인덱스(12판: 엔트리 7717)에 기술되어 있다. 이들 애쥬번트 분자는 WO99/52549에 기술되어 있다. 화학식(I)의 폴리옥시에틸렌 에테르는 필요한 경우 다른 애쥬번트와 배합할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 애쥬번트 배합물은 바람직하게는 영국특허원 9820956.2에 기술된 바와 같이 CpG와 혼합한 것이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 항원 제시 세포(APC), 예를 들면 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵세포 및 효율적인 APC가 되도록 공학적으로 조작될 수 있는 기타 세포를 통해 숙주에 전달될 수 있다. 이러한 세포는 반드시 필요한 것은 아니지만 항원을 제공하는 능력을 증가시키거나, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키거나, 항종양 효과 자체를 갖도록 하고/하거나 면역학적으로 수용체와 양립가능하도록 (즉, 정합된 HLA 일배체형) 유전학적으로 변형시킬 수 있다. 일반적으로, APC는 종야 및 종양주변 조직을 포함한 여러 생물학적 체액 및 기관으로부터 분리할 수 있으며 자가, 동종이인자형, 유전적동계 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 특정한 바람직한 양태는 항원-제시 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조를 사용한다. 수지상 세포는 고도의 강력한 APC(Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998)이며 예방 또는 치료 항종양 면역성을 유발하기에 생리학적 애쥬번트로서 효과적인 것으로 제시되어 왔다(Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). 일반적으로, 수지상 세포는 이의 전형적인 모양(원위치에서 방사상이고 뚜렷한 세포질 과정이 시험관내에서 시각적으로 나타남), 이들의 감는 능력, 고도의 효율을 갖는 과정 및 존재하는 항원 및 천연 T 세포 반응을 활성화하는 능력을 기준으로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포도 물론 공학적으로 조작하여 수지상 세포에서 생체내 또는 생체외로 특히 볼 수 없는 특정 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현시킬 수 있으며 이러한 변형된 수지상 세포는 본 발명에 속한다. 수지상 세포의 대안으로서, 분비된 소포 항원-부하된 수지상 세포(엑소좀이라고 한다)이 백신내에 사용될 수 있다(Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).
수지상 세포 및 선조 세포는 말초 혈액, 골수, 종양-침윤 세포, 종양주변 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대 혈액 또는 기타 다른 적합한 조직 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 말초 혈액으로부터 수거된 단핵세포의 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 혼합물을 첨가함으로써 생체외로 분화시킬 수 있다. 다른 방도로서, 혈액 세포, 제대 혈액 또는 골수로부터 수확된 CD34 양성 세포는 배양 배지에 CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 다른 화합물(들)의 혼합물을 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 편리하게는 두 가지의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법을 허용하는 미성숙 세포와 성숙 세포로 분류한다. 그러나, 이러한 명명은 모든 가능한 분화의 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어는 아니된다. 미성숙 수지상 세포는 Fcγ 수용체와 만노즈 수용체의 고도의 발현과 상호 관련이 있는 항원 흡수 및 프로세싱에 대해 고도의 능력을 갖는 APC로서 특징지워 진다. 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커들의 보다 낮은 발현 및 I 부류 및 II 부류 MHC, 흡착 분자(예, CD54 및 CD11) 및 보조자극 분자(예, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화에 책임을 지는 세포 표면 분자의 고도의 발현에 의해 특징지워 진다.
APC는 일반적으로 세포 표면에서 암호화된 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 부분이 발현되도록 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염될 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 발생할 수 있고 그러한 형질감염된 세포를 포함한 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 치료 목적에 사용할 수 있다. 다른 방도로서, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 환자에 투여하여 생체내에서 일어나는 형질감염을 제공할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 WO97/24447에 기술된 바와 같은 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있거나 문헌[Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 총 방식에 의해 실시할 수 있다. 수지상 세포의 항원 로딩은 수지상 세포 또는 선조 세포를 종양폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터내) 또는 RNA와 배양하거나 항원-발현 재조합 세균 또는 바이러스(예, 백시니아, 계두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 배양함으로써 달성할 수 있다. 로딩이전에, 폴리펩타이드는 T 세포 헬퍼(예, 담체 분자)를 제공하는 면역학적 파트너에 공유결합시킬 수 있다. 다른 방도로서, 수지상 세포는 폴리펩타이드와 별도로 또는 이의 존재하에서 비결합된 면역학적 파트너로 펄스시킬 수 있다.
본 발명의 조성물에 당업자에게 알려진 어떠한 적합한 담체도 사용할 수 있는 한편, 담체의 종류는 전형적으로 투여 방식에 따라 다양하다. 본 발명의 조성물은 예를 들면 국소, 경구, 비내, 점막내, 정맥내, 두개골내, 복강내, 피하 및 근육내 투여를 포함한 어떠한 적절한 투여 방식으로도 제형할 수 있다.
약제학적 조성물에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고 또한 생체분해성일 수 있다. 특정 양태로서, 제제는 바람직하게는 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 그러나, 다른 양태로서, 투여시 보다 신속한 방출이 필요할 수 있다. 이러한 조성물의 제형은 공지 기술을 이용한 당업자의 수준에 속한다. 이러한 관점에서 유용한 대표적인 담체로는 폴리(락타이드-코-글리코라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 미세입자가 포함된다. 다른 대표적인 지연 방출 담체로는 비액체 친수성 코어(예, 가교된 다당류 또는 올리고당류) 및 임의로 인지질과 같은 양쪽성 화합물을 포함한 외층을 포함한 거대분자 바이오벡터가 포함된다(참조: 미국 특허 제5,151,254호 및 국제특허공개 WO94/20078, WO94/23701 및 WO96/06638). 지방성 제제에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상되는 기간 및 치료 또는 예방하고자 하는 증세의 성질에 의존한다.
다른 대표적인 양태로서, 생체분해성 미세구체(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 본 발명의 조성물을 위한 담체로서 사용된다. 적합한 생체분해성 미세구체는 예를 들면 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,76호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 기술되어 있다. WO99/40934 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 것과 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템이 또한 많은 적용에 유용할 것이다. 다른 예시적인 담체/전달 시스템은, 숙주에서 I 부류-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 것과 같은 입자-단백질 복합체를 포함한 담체를 사용한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 한 가지 이상의 완충제(예, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물(예, 글루코즈, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산(예, 글리신), 산화방지제, 살균제, 킬레이트화제(예, EDTA 또는 글루타티온), 애쥬번트(예, 수산화알루미늄), 제제를 수혜자의 혈액과 함께 등장성, 저장성 또는 약 저장성으로 만드는 용질, 현탁화제, 농조화제 및/또는 보존제를 포함한다. 다른 방도로서, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 밀폐된 앰풀 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 수회 용량 용기에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 전형적으로 사용시까지제제의 무균성 및 안정성을 보존하는 방식으로 밀폐된다. 일반적으로, 제제는 오일 또는 수성 비히클에 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 다른 방도로서, 약제학적 조성물은 사용하기 직전에 무균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다.
경구, 비경구, 정맥내, 비후내 및 근육내 투여 및 제형을 포함한 여러 치료 섭생에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위해 적합한 용량 및 치료 섭생의 개발은 본 분야에 잘 알려져 있으며 이의 일부는 일반적인 예시의 목적상 아래에 간단히 서술되어 있다.
특정 용도로서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 경구 투여를 통해 동물에 전달될 수 있다. 이러한 경우로서, 이들 조성물은 불활성 희석제 도는 동화가능한 식용 담체와 제형되거나 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 정제로 타정되거나 식품에 직접 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 부형제와 함께 혼합되고 섭취가능한 정제, 협부 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서제, 현탁제, 시럽, 웨이퍼제 등의 형태로 사용할 수 있다(참조: Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27; 386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998; 15(3):243-84; 미국 특허 제5,641,515호, 제5,580,579호 및 제5,792,451호). 정제, 트로키제, 환제, 캡슐 등은 또한 여러 추가의 성분을 함유할 수 있으며, 예를 들면 결합제(예, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴), 부형제(예, 인산이칼슘), 붕해제(예, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등), 활탁제(예, 마그네슘 스테아레이트) 및 감미제(예, 수크로즈,락토즈 또는 사카린)가 첨가되거나 박하, 노루발풀 오일 또는 체리향과 같은 풍미제가 첨가될 수 있다. 용량 단위형이 캡슐일 경우, 이는 상기 유형의 물질이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 여러 다른 물질은 피복제로서 존재하거나 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 셀락, 당 또는 둘 다로 피복될 수 있다. 물론, 용량 단위형을 제조하는데 사용되는 어떠한 물질도 약제학적으로 순수해야하며 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지방성 제제 및 제형내로 혼입될 수 있다.
전형적으로, 이들 제제는 비록 활성 성분의 퍼센트가 다양할 수 있으나 적어도 약 0.1%의 상기 화합물을 함유하며, 편리하게는 전체 제제를 기준으로 하여 약 1 또는 2중량% 또는 용량% 내지 약 60 또는 70중량% 또는 용량% 이상일 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 성분의 양은 화합물의 주어진 단위 용량에서 적합한 용량을 제공하는 정도이다. 용해성, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 요소뿐만 아니라 다른 약물학적 요인이 약제 제조사에 의해 고려될 것이며 이러한 경우로서 여러 용량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 구강세정액, 치약, 협막 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구투여 제제의 형태로 하나 이상의 보형제와 혼합될 수 있다. 다른 방도로서, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유한 것과 같은 경구 용액에 혼합되거나 치약에 분산되거나 물, 결합제, 연마재, 풍미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 치료학적으로 유효한 양으로 첨가할 수 있다. 다른 방도로서, 조성물은 혀아래에 설정되거나 입안에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태를 취할 수 있다.
특정 상황에서 본원에 기술된 약제학적 조성물은 비경구, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이 가운데 일부는 예를 들면 미국 특허 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호에 기술되어 있다. 특정 양태로서, 유리 염기 또는 약물학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조할 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로 미생물의 성장을 억제하는 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 대표적인 약제학적 형태는 멸균된 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다(참조: 미국 특허 제5,466,468호). 모든 경우에 있어서, 멸균 형태이어야 하고 주사가 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 그들의 혼합물 및/또는 식물성유를 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면 렉시틴과 같은 피복물의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 억제는 여러 항균 및 항진균 물질, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
한 가지 양태로서, 수용액의 비경구 투여시, 용액은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며 액체 희석제가 우선 충분한 염수 또는 글루코즈로 등장성으로 되어야 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 현재 공개 내용에 비추어 당업자에게 알려진 것이다. 예를 들면, 1회 용량이 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있으며 1000ml의 피하용해에 첨가되거나 제안된 흡입 부위에 주사할 수 있다(참조예: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580). 용량에서의 약간의 변화는 치료 받는 대상자의 상태에 따라 반드시 발생한다. 게다가, 사람에게 투여하는 경우, 제제는 물론 바람직하게는 FDA Office of Biologics의 표준 규정에 따라 무균성, 발열원성 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 대표적인 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹과 형성되는) 산 부가 염 및 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형시 용액은 용량 제제와 일치하는 방식으로 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다.
담체는 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복제, 희석제, 항균 및 항진균 물질, 등장성 및 흡수 지연 제제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위해 그러한 매질 및 물질의 사용은 본 분야에 잘 알려져 있다. 통상적인 매질 또는 물질이 활성 성분과 혼화되지 않는 경우를 제외하고 이들을 치료 조성물에 사용하는 것은 가능하다. 보조적인 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여했을 때 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 유발하지 않는 분자 자체 및 조성물을 가리킨다.
특정한 양태로서, 약제학적 조성물은 비내 분무, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 유전자, 핵산 및 펩타이드 조성물을 비내 에어로졸 분무를 통해 폐로 직접 전달하는 방법이 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호에 기술되어 있다. 유사하게, 비내 미세입자 수지(Takenage et al., J. Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 제5,725,871호)을 이용한 약물의 전달은 약학 분야에 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태로 대표적인 경점막 약물 전달이 미국 특허 제5,780,045호에 기술되어 있다.
특정한 양태로서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포 등이 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체내로 도입하는데 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화된 형태로 제형될 수 있다. 다른 방도로서, 본 발명의 조성물은 담체 비히클의 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다.
강력한 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀-유사 제제의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다(참조예: Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug; 35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61; 미국 특허 제5,567,434호, 제5,552,157호, 제5,565,213호, 제5,738,868호 및 제5,795,587호). 각 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.
리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물 및 PC 12 세포를 포함한 다른 절차에 의해 정상적으로 감염되기 어려운 많은 세포 유형에 성공적으로 사용되어 왔다(Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25; 265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr; 9(3):221-9). 또한, 리포좀은 바이러스-기본 전달 시스템에서 전형적으로 나타나는 DNA 길이 제약을 받지 않는다. 리포좀은 유전자, 여러 약물, 방사능 치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 작동물질 등을 여러 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀의 사용은 전신 투여 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 무관한 듯하다.
특정한 양태로서, 리포좀은 수성 매질중에 분산되어 자발적으로 멀티라멜라동심성 이중층 소포(또한 멀티라멜라 소포라고 한다)를 형성하는 인지질로부터 형성된다.
다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제제를 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생적인 방식으로 화합물을 포획할 수 있다(참조예: Quintanar-Querrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec; 24(12):1113-28). 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(약 0.1 μm의 크기)를 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 고안할 수있다. 이러한 입자는 예를 들면 문헌[Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1-3):31-40; 및 미국 특허 제5,145,684호]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
암 치료 방법
본 발명의 추가의 관점으로서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 암의 치료, 특히 전립선 암의 면역요법을 위해 사용할 수 있다. 이러한 방법내에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 환자, 전형적으로 온혈 동물, 바람직하게는 사람에게 투여한다. 환자는 암을 앓고 있거나 앓고 있지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물은 암의 발전을 억제하거나 암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 원발성 종양의 외과적 수술 이전 또는 이후 및/또는 방사선치료 또는 통상적인 화학요법 약물의 투여와 같은 치료 이전 또는 이후에 투여할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 약제학적 조성물의 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 피내, 항문, 질내, 경피 및 경구 경로에 의한 투여를 포함하여 어떠한 적합한 방법에 의한 것일 수 있다.
특정 양태내에서, 면역요법은 치료가 면역반응-변형 물질(예, 본원에 제공된 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)의 투여로 종양에 대해 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존하는 능동 면역요법일 수 있다.
다른 양태로서, 면역요법은 치료가 항종양 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하고 온전한 숙주 면역계에 반드시 의존하지 않는 정립된 종양-면역 반응성(예, 이펙터 세포 또는 항체)으로 물질의 전달을 포함하는 수동 면역요법일 수 있다. 이펙터 세포의 예로는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 상기된 T 세포, T 림프구(예, CD8+세포독성 T 림프구 및 CD4+T-헬퍼 종양 침윤 림프구), 킬러 세포(예, 천연 킬러 세포 및 림포카인-활성화된 킬러 세포), B 세포 및 항원-제시 세포(예, 수지상 세포 및 대식 세포)를 포함한다. 본원에 언급된 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체는 입양 면역요법을 위해 다른 벡터 또는 이펙터 세포내로 클로닝, 발현 및 전달될 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드는 또한 수동 면역요법을 위한 항체 또는 항인자형 항체(상기된 바 있고 미국 특허 제4,918,164호에 기술되어 있음)를 발생하는데 사용할 수 있다.
이펙터 세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험관내 성장에 의해입양 면역요법에 충분한 양으로 수득할 수 있다. 단일 항원-특이적 이펙터 세포를 생체내 항원 인식이 보유된 수십 억 개로 증식하기 위한 배양 조건은 본 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 시험관내 배양 조건은 전형적으로 흔히 사이토킨(예, IL-2) 및 비분열 피더 세포의 존재하에 항원으로의 간헐적인 자극을 사용한다. 상기된 바와 같이, 본원에 제공된 면역반응성 폴리펩타이드는 면역요법을 위해 충분한 수의 세포를 발생하기 위해 항원-특이적 T 세포 배양물을 신속히 증식시키는데 사용할 수 있다. 특히, 수지세포, 대식세포, 단핵세포, 섬유아세포 및/또는 B 세포와 같은 항원-제시 세포는 면역반응성 폴리펩타이드로 펄스시키거나 본 분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들면, 항원-제시 세포는 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템에서 발현을 증가시키기에 적절한 프로모터를갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기위한 배양된 작용 세포는 성장해서 넓게 분포할 수 있고 생체내에서 장기간 살아 있어야 한다. 연구에 따르면, 배양된 이펙터 세포가 IL-2로 보충된 항원에 의한 반복된 자극에 의해 생체내에서 자라도록 유도되고 실질적인 수만큼 장기간 살아 있을 수 있는 것으로 나타났다(참조예: Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997).
다른 방도로서, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 발현하는 벡터는 환자로부터 채취된 항원 제시 세포내로 도입되어 동일한 환자에게로 재이식을 위해 생체외에서 클론적으로 증식시킬 수 있다. 감염된 세포는 본 분야에 알려진 수단을 사용하여, 바람직하게는 무균 형태로서 정맥내, 강내, 복강내 도는 종양내 투여에 의해 환자내로 재도입할 수 있다.
본원에 기술된 치료 조성물의 투여 경로 및 횟수뿐만 아니라 용량은 개인에 따라 변할 수 있으며 표준 기술을 사용하여 용이하게 설정할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예, 흡입에 의해) 또는 경구적으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10회 용량이 52주 기간에 투여될 수 있다. 바람직하게는 6회 용량이 한달의 기간에 투여되며 이후 추가 접종이 주기적으로 이루어질 수 있다. 다른 프로토콜이 개개 환자에 대해 적절할 수 있다. 적합한 용량은 상기된 바와 같이 투여되었을 때 항-종양 면역 반응을 촉진할 수 있는 화합물의 양이며 기본(즉, 비처리된) 수준보다 10 내지 50% 이상이다. 이러한 반응은 환자에서 항-종양 항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 종양 세포를 살해할 수 있는 세포 용해 이펙터 세포의 백신-의존 발생에 의해 모니터링할 수 있다. 이러한 백신은 또한 비백신화된 환자와 비교하여 백신화된 환자에서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 좀더 장기간의 질병-해방 생존)를 유도하는 면역 반응을 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한 약제학적 조성물 및 백신의 경우, 용량에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 약 25㎍ 내지 5mg이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 변할 수 있지만 전형적으로 약 0.1mL 내지 약 4mL의 범위이다.
일반적으로, 적절한 용량 및 치료 섭생은 치료 및/또는 예방 수혜를 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 이러한 반응은 비처리된 환자와 비교하여 처리된 환자에서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 좀더 장기간의 질병-해방 생존)를 설정함으로써 모니터링할 수 있다. 종양 단백질에 대한 사전의 면역 반응의 증가는 일반적으로 향상된 임상 결과와 상호 관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 처치 전후에 환자로부터 얻은 시료를 사용하여 실시할 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
암 검정 및 진단 조성물, 방법 및 키트
일반적으로, 암은 하나 이상의 전립선 종양 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 환자로부터 얻은 생물학적 시료(예, 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검)에 존재하는 가를 기초로 하여 환자에서 검정할 수 있다. 다시 말해서, 이러한 단백질은 전립선 암과 같은 암의 유무를 가리키는 마커로 사용할 수 있다. 또한, 이러한 단백질들은 다른 암의 검정에 유용할 수 있다. 본원에 제공된 결합제는 일반적으로 생물학적 시료에서 그 물질과 결합하는 항원의 수준을 검정할 수 있게 한다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 탐침을 사용하여 암의 유무를 지시하는 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있다. 일반적으로, 전립선 종양 서열은 정상적인 조직에서 보다 종양 조직에서 적어도 3배 높은 수준으로 존재해야 한다.
시료에서 폴리펩타이드 마커를 검정하기 위해 결합제를 사용하는 것에 대해 당업자에게 알려진 여러 검정 포맷이 있다(참조예: Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 일반적으로 환자에게 암의 유무는 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키고, (b) 시료중에 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 수준을 검출하고, (c) 폴리펩타이드의 수준을 예정된 컷오프 값과 비교함으로써 결정할 수 있다.
바람직한 양태로서, 검정은 고체 지지체상에 고정된 결합제를 사용하여 시료의 나머지로부터의 폴리펩타이드와 결합하고 제거하는 것을 포함한다. 이어서, 결합된 폴리펩타이드를 리포터 그룹을 함유하고 특이적으로 결합제/폴리펩타이드 복합체와 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 검출 시약은 예를 들면 폴리펩타이드 또는 항체와 특이적으로 결합하는 결합제 또는 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴과 같은 결합제와 특이적으로 결합하는 다른 물질을 포함할 수 있다. 다른 방도로서, 폴리펩타이드가 리포터 그룹으로 표지되고 시료와 결합제의 배양 후 고정된 결합제와 결합하도록 허용되는 경쟁 검정을 이용할 수 있다. 시료의 성분이 결합제에 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 정도가 고정된 결합제와 시료의 반응성을 지시한다. 이러한 검정내에서 사용하기에 적합한 폴리펩타이드는 상기한 바와 같이 결합제가 결합하는 전체 길이 전립선 종양 단백질 및 이의 폴리펩타이드 일부분을 포함한다.
고체 지지체는 당업자에게 알려진 것으로 종양 단백질이 결합될 수 있는 어떠한 물질도 가능할 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 미세역가 평판내의 시험 웰이거나 니트로셀룰로즈 또는 다른 적합한 막일 수 있다. 다른 방도로서, 지지체는 비드 또는 디스크(예, 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질)일 수 있다. 지지체는 또한 마그네틱 입자 또는 섬유 광 센서(예, 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 것)일 수 있다. 결합제는 당업자에게 알려진 여러 기술을 사용하여 고체 지지체에 고정시킬 수 있으며, 이는 특허 및 과학 문헌에 널리 기술되어 있다. 본 발명에 따라, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유 결합과 공유 결합(물질과 작용기상의 작용기사이의 직접적인 결합이거나 가교제에 의한 결합힐 수 있다)을 가리킨다. 미세역가 평판내의 웰 또는 막에 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충액에서 결합제를 고체 지지체와 충분한 시간 동안 접촉시켜 달성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가 평판의 웰(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)을 약 10ng 내지 약 10㎍, 바람직하게는 약 100ng 내지 약 1㎍ 범위의 결합제의 양과 접촉시키는 것은 적절한 양의 결합제를 고정하기에 충분하다.
고체 지지체에 결합제의 공유 결합은 일반적으로 우선 지지체를 이작용성 시약과 반응시켜 달성할 수 있다. 이작용성 시약은 지지체 및 결합제상의 하이드록실 또는 아미노 그룹과 같은 작용기 둘 다와 반응한다. 예를 들면, 결합제는 벤조퀴논을 사용하여 또는 지지체상의 알데하이드 그룹을 아민 및 결합 파트너 상의 활성화 수소와 축합시켜 적절한 중합체 피막을 갖는 지지체에 공유 결합시킬 수 있다(참조예: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).
특정한 양태로서, 검정은 이-항체 샌드위치 검정이다. 이 검정은 고체 지지체(흔히 미세역가 평판의 웰)상에 고정된 항체를 시료와 접촉시키고 이에 따라 시료내 폴리펩타이드가 고정된 항체와 결합하도록 함으로써 실시할 수 있다. 이어서, 비결합된 시료를 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고 리포터 그룹을 함유한 검출 시약(바람직하게는 폴리펩타이드상에 상이한 부위에 결합할 수 있는 제2 항체)을 첨가한다. 그런 다음, 고체 지지체에 결합한 채로 남아 있는 검출 시약의 양을 특정 리포터 그룹에 대해 적절한 방법을 사용하여 결정한다.
보다 자세하게는, 일단 항체가 상기된 바와 같이 지지체상에 고정되면, 지지체상의 남은 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단된다. 적합한 차단제는 당업자에게 알려져 있으며 예로는 소 혈청 알부민 또는 트윈 20(미주리주 세인트 루이스 소재 Sigma Chemical Co.)을 들 수 있다. 이어서, 고정된 항체를 시료와 배양하고 폴리펩타이드가 항체와 결합하도록 한다. 시료는 배양하기 전에 인산염-완충 염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간은 전립선 암 환자로부터 얻은 시료내에 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 기간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 비결합된 폴리펩타이드사이에 평형에 도달된 것의 약 95% 이상이 결합 수준에 도달하기에 충분한 시간이다. 당업자는 기간에 걸쳐서 발생하는 결합 수준을 검정함으로써 평형에 도달하는데 필요한 시간을 용이하게 결정할 수 있음을 인정할 것이다. 실온에서 약 30분의 배양 시간이면 일반적으로 충분하다.
이어서, 고체 지지체를 적절한 완충액(예, 0.1% 트윈 20을 함유한 PBS)으로 세척하여 비결합된 시료를 제거할 수 있다. 그런 다음 리포터 그룹을 함유한 제2 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹은 상기된 그룹을 포함한다.
이어서, 검출 시약을 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체와 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 배양한다. 적절한 시간의 양은 일반적으로 기간 내내 발생하는 결합의 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 그런 다음, 비결합된 검출 시약을 제거하고 결합된 검출 시약을 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹을 검출하기 위해 사용된 방법은 리포터 그룹의 성질에 의해 좌우된다. 방사성 그룹의 경우, 신틸레이션 계수 또는 자가방사기록 방법이 일반적으로 적절하다. 분광 방법을 사용하여 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 바이오틴은 다른 리포터 그룹(흔히 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 일반적으로 효소 리포 그룹은 기질을 첨가한 후(일반적으로 특정 기간 동안) 반응 산물을 분광 분석 또는 다른 분석함으로써 검출할 수 있다.
전립선 암과 같은 암의 유무를 결정하기 위해 고체 지지체에 결합한 채로 남아 있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그널을 일반적으로 예정된 컷오프 값에 상응하는 시그널과 비교한다. 한 가지 바람직한 양태로서, 암의 검출을 위한 컷오프 값은 고정된 항체를 암이 없는 환자의 시료와 배양할 때 얻은 평균 시그널이다. 일반적으로, 예정된 컷오프 값에서 3 이상의 표준편차를 보이는 시그널을 발생하는 시료는 암에 양성인 것으로 고려된다. 다른 바람직한 양태로서, 컷오프 값은 문헌[Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]의 방법에 따라 ReceiverOperator Curve를 사용하여 결정한다. 간단히 설명하면, 이 양태에서, 컷오프 값은 진단 시험 결과를 위해 각각의 가능한 컷오프 값에 상응하는 진정 양성 비율(즉, 민감성)과 거짓 양성 비율(100%-특이성)을 플로팅하여 결정할 수 있다. 상단 좌측 코너에 가장 근접한 플롯에서의 컷오프 값(즉, 가장 큰 면적을 갖는 값)이 가장 정확한 컷오프 값이며 이 방법에 의해 결정된 컷오프 값보다 높은 시그널을 발생하는 시료는 양성으로 고려할 수 있다. 다른 방도로서, 컷오프 값을 플롯을 따라 좌측으로 이동시켜 거짓 양성 비율을 최소화하거나 우측으로 이동시켜 거짓 음성 비율을 최소화할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 결정된 컷오프 값보다 높은 시그널을 발생하는 시료는 암이 양성으로 고려될 수 있다.
관련된 양태로서, 검정은 결합제가 니트로셀룰로즈와 같은 막상에 고정되는 유동 또는 스트립 시험 포맷으로 실시한다. 유동 시험에서 시료내 폴리펩타이드는 시료가 막을 지나가면서 고정된 결합제와 결합한다. 이때 제2 표지된 결합제를 함유한 용액이 막을 통해 유동하면서 그 제2 표지된 결합제가 결합제-폴리펩타이드 복합체에 결합한다. 이어서, 결합된 제2 결합제의 검출을 상기한 바와 같이 실시할 수 있다. 스트립 시험 포맷에서, 결합제가 결합되어 있는 막의 한쪽 말단을 시료가 함유된 용액에 침지시킨다. 시료는 제2 결합제를 함유한 영역을 통해 막을 따라 고정된 결합제의 영역으로 이동한다. 고정된 항체의 영역에서 제2 결합제의 농도는 암의 존재를 가리킨다. 전형적으로, 그 부위에서 제2 결합제의 농도는 시각적으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴을 발생한다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 지시한다. 일반적으로, 막에 고정된 결합제의 양은 생물학적 시료가 상기된 포맷에서 쌍-항체 샌드위치 검정에서 양성 시그널을 발생하기에 충분한 폴리펩타이드의 수준을 함유할 때 시각적으로 식별가능한 패턴을 발생하는 것으로 선택한다. 이러한 검정에서 사용하기에 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 막에 고정된 항체의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍, 더욱 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng의 범위이다. 이러한 시험은 전형적으로 아주 소량의 생물학적 시료로 실시할 수 있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합제와 사용하기에 적합한 많은 다른 검정 프로토콜이 있다. 상기 설명은 단지 예시하는 것에 불과하다. 예를 들면, 상기 프로토콜을 용이하게 변형시켜 종양 펩타이드를 사용하여 이러한 폴리펩타이드와 생물학적 시료에서 결합하는 항체를 검출할 수 있음은 자명하다. 이러한 종양 단백질 특이적 항체의 검출은 암의 존재와 상호 연관이 있을 수 있다.
암은 또한, 또는 달리, 생물학적 샘플 중의 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재를 기초로 하여 검출할 수 있다. 특정 방법에 있어서, 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 함유하는 생물학적 샘플은 종양 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 당해 폴리펩타이드 중 적어도 면역원성 부분을 발현시키는 APC와 함께 배양한 다음, T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플로는 분리된 T 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, T 세포는 통상의 기법(예를 들어, 말초 혈액 림프구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리)에 의해 환자로부터 분리할 수 있다. T 세포는 폴리펩타이드(예, 5 내지 25㎍/ml)와 37℃에서 2 내지 9일(전형적으로는 4일) 동안 시험관내에서 배양할 수 있다. 대조군으로서 작용하는 종양 폴리펩타이드의 부재하에 T 세포 샘플의 또 다른 분획을 배양하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+T 세포의 경우, 활성화를 바람직하게는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출할 수 있다. CD8+T 세포의 경우, 활성화를 바람직하게는 세포용해 활성을 평가함으로써 검출할 수 있다. 무질병 환자에서 보다 세포용해 활성이 20% 이상의 수준이고 및/또는 증식 수준이 2배 이상인 경우에는 환자에서 암의 존재를 나타낸다.
전술한 바와 같이, 암은 또한, 또는 달리, 생물학적 샘플 중에 존재하는 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준에 기초하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 근거한 검정법에서 사용하여 생물학적 샘플로부터 유래되는 종양 cDNA의 일부를 증폭시킬 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 1종 이상은 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적이다(즉, 하이브리드화한다). 다음, 증폭된 cDNA를 분리하고, 겔 전기영동과 같이 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 검출한다. 유사하게는, 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 생물학적 샘플 중의 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 하이브리드화 분석에 사용할 수 있다.
검정법 조건하에서 하이브리드화시키기 위하여, 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 프로브는 길이가 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드인 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 부분과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하여야 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 전술한 바와 같이 중간 정도의 엄격한 조건하에서 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화한다. 본원에 기술된 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 길이는 바람직하게는 10 내지 40개 뉴클레오타이드이다. 바람직한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본원에 개시된 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자의 10개 이상의 인접하는 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15개 이상의 인접하는 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR에 근거한 검정법 및 하이브리드화 검정법 둘 다에 관한 기술은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다[참조예: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
한가지 바람직한 검정법은 역전사와 함께 PCR을 실시하는 RT-PCR을 이용한다. 전형적으로는, RNA는 생검 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 추출하고, 역전사시켜 cDNA 분자를 제조한다. 1종 이상의 특이적 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 cDNA 분자를 제조하고, 겔 전기영동 등의 방법으로 분리하고 육안관찰한다. 시험 환자와 암에 걸리지 않은 개체로부터 취한 생물학적 샘플을 사용하여 증폭을 수행한다. 증폭 반응은 2등급 범위내의 cDNA의 여러 희석물에 대하여 실시할 수 있다. 비암성 샘플의 동일 희석물과 비교하여 시험 환자 샘플의 여러 희석물에서의 2배 또는 그 이상의 발현 증가는 전형적으로 양성으로 간주된다.
또 다른 양태에 있어서, 본원에 기술된 조성물은 암 진행의 마커로서 사용될 수 있다. 당해 양태에 있어서, 암 진단에 대하여 상기한 검정법을 경시적으로 수행하고, 반응성 폴리펩타이드(들) 또는 폴리뉴클레오타이드(들)의 수준 변화를 평가할 수 있다. 예를 들어, 검정법은 6개월 내지 1년 동안 24 내지 72시간마다 수행하고, 이후에는 필요에 따라 수행할 수 있다. 일반적으로는, 암은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 검출 수준이 경시적으로 증가하는 환자들의 경우에는 진행성이다. 대조적으로, 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 경시적으로 일정하게 유지되거나 감소할 경우에 암은 진행성이 아니다.
특정의 생체내 진단 검정법은 종양 상에서 직접 수행할 수 있다. 이와 같은 특정한 검정법은 종양 세포를 결합제와 접촉시킴을 포함한다. 다음, 결합된 결합제를 리포터 그룹을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있다. 이러한 결합제는 또한 조직학적 용도에서 사용할 수 있다. 달리, 폴리뉴클레오타이드 프로브를 이러한 용도에서 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 감수성을 증가시키기 위해, 다수의 종양 단백질 마커를 제공된 샘플내에서 검정할 수 있다. 본원에서 제공된 여러 단백질에 특이적인 결합제들을 단일 검정법에서 조합시킬 수 있음은 명백할 것이다. 또한, 복수의 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용할 수도 있다. 종양 단백질 마커의 선택은 통상의실험에 기초하여 최적의 감수성을 생성시키는 조합을 결정할 수 있다. 또한, 또는 달리, 본원에서 제공된 종양 단백질에 대한 검정법은 다른 공지의 종양 항원들에 대한 검정법과 조합할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단 방법 중 임의의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로는 진단 검정법을 수행하는데 필요한 2종 이상의 성분을 포함한다. 성분은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장치일 수 있다. 예를 들어, 키트내의 특정한 용기는 종양 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편은 전술한 바와 같이 지지체에 부착시켜 제공할 수 있다. 또 다른 하나 이상의 용기는 검정법에 사용되는 시약 또는 완충제와 같은 성분을 함유할 수 있다. 이러한 키트는 또한, 또는 달리, 항체 결합의 직접 또는 간접적인 검출에 적합한 리포터 그룹을 함유하는 전술한 바와 같은 검출 시약을 포함할 수 있다.
달리, 키트는 생물학적 샘플 중의 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 디자인할 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로는 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 전술한 바와 같은 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, PCR 또는 하이브리드화 검정법에 사용할 수 있다. 이러한 키트 중에 존재할 수 있는 또 다른 성분은 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 용이하게 하는 제2 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단 시약 또는 용기를 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공하는 것이지, 본 발명을 한정하기 위해 제공하는 것은 아니다.
실시예 1
전립선-특이적 폴리펩타이드의 분리 및 특성화
본 실시예는 전립선 종양 cDNA 라이브러리로부터의 특정 전립선-특이적 폴리펩타이드의 분리에 대해 기술한다.
제조업자의 프로토콜에 따라 cDNA 합성을 위한 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(Suoperscript Plasmid System for eDNA Synthesis) 및 플라스미드 클로닝 키트(Plasmid Cloning kit, 제조원: BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897)를 사용하여 전립선 종양 폴리 A+RNA로부터 사람 전립선 종양 cDNA 발현 라이브러리를 작제한다. 구체적으로는, 전립선 종양 조직을 폴리트론(제조원: Kinematica, Switzerland)으로 균질화하고, 전체 RNA를 제조업자의 지시에 따라 트리졸 시약(제조원: BRL Life Technologies)을 사용하여 추출한다. 다음, 폴리 A+RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 Qiagen 올리고텍스 스핀 칼럼 mRNA 정제 키트(제조원: Qiagen, Santa Clarita, CA 91355)를 사용하여 정제한다. 제1 쇄 cDNA를 NotI/Oligo-dT18 프라이머를 사용하여 합성한다. 이본쇄 cDNA를 합성하여, EcoRI/BAXI 어댑터(제조원: Invitrogen, San Diego, CA)와 연결시킨 다음, NotI으로 분해한다. 크로마 스핀-1000 칼럼(제조원: Clontech, Palo Alto, CA)으로 크기별 분획화한 후, cDNA를 pCDNA3.1(Invitrogen)의 EcoRI/NotI 부위에 연결시키고, 전기천공에 의해 ElectroMax 이.콜라이 DH10B 세포(BRL Life Technologies)로 형질전환시킨다.
동일한 절차를 사용하여, 정상인의 췌장 cDNA 발현 라이브러리를 6개 조직 표본(Clontech)의 풀로부터 제조한다. 독립적인 콜로니의 수, 삽입체를 보유한 클론의 백분율, 평균 삽입체 크기를 측정하고, 서열을 분석하여, cDNA 라이브러리를 특성화한다. 전립선 종양 라이브러리는 1.64 x 107개의 독립된 콜로니를 함유하고, 클론의 70%는 삽입체를 보유하며, 평균 삽입체의 크기는 1745개 염기쌍이다. 정상 췌장 cDNA 라이브러리는 3.3 x 106개의 독립된 콜로니를 함유하고, 클론의 69%는 삽입체를 보유하며, 평균 삽입체의 크기는 1120개 염기쌍이다. 양 라이브리러의 경우, 서열 분석 결과로 대부분의 클론은 전체 길이 cDNA 서열을 보유하며, mRNA로부터 합성되고, 최소의 rRNA 및 미토콘드리아 DNA 오염되었음이 밝혀졌다.
문헌[참조: Hara et al., Blood, 84:189-199, 1994]에 의해 기술된 바를 약간 변형시켜 상기 전립선 종양 및 정상 췌장 cDNA 라이브러리를 사용하여 cDNA 라이브러리 공제(subtraction)를 수행한다. 구체적으로는, 전립선 종양-특이적 공제된 cDNA 라이브러리를 다음과 같이 생성시킨다. 정상 췌장 cDNA 라이브러리(70㎍)를 EcoRI, NotI 및 SfuI로 분해하고, DNA 폴리머라제 클레노우 단편과 충전 반응시킨다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 후, DNA를 H2O 100㎕에 용해시키고,가열 변성시킨 다음, 포토프로브 비오틴(제조원: Vector Laboratories, Burlingame, CA) 100㎕(100㎍)와 혼합한다. 제조업자의 권고에 따라, 생성된 혼합물을 빙상에서 270W 태양등으로 20분 동안 조사한다. 추가의 포토프로브 비오틴(50㎕)을 첨가하고, 비오티닐화 반응을 반복한다. 부탄올로 5회 추출한 후, DNA를 에탄올로 침전시키고, H2O 23㎕에 용해시켜, 드라이버 DNA를 형성시킨다.
트레이서 DNA를 형성시키기 위해, 전립선 종양 cDNA 라이브러리 10㎍을 BamHI 및 XhoI으로 분해하고, 페놀 클로로포름으로 추출한 다음, 크로마 스핀-400 칼럼(Clontech)에 통과시킨다. 에탄올 침전 후, 트레이서 DNA를 H2O 5㎕에 용해시킨다. 트레이서 DNA를 드라이버 DNA 15㎕ 및 2x하이브리드화 완충액(1.5M NaCl/10mM EDTA/50mM HEPES pH 7.5/0.2% 나트륨 도데실 설페이트) 20㎕와 혼합하고, 광유를 덮어씌운 다음, 가열하여 완전히 변성시킨다. 샘플을 즉시 68℃ 수조로 옮기고, 20시간 동안 배양한다(장기간 하이브리드화[LH]). 다음, 반응 혼합물을 스트렙타비딘으로 처리한 후, 페놀/클로로포름으로 추출한다. 이 과정을 3회 더 반복한다. 공제된 DNA를 침전시키고, H2O 12㎕에 용해시킨 다음, 드라이버 DNA 8㎕ 및 2x하이브리드화 완충액 20㎕와 혼합한 후, 68℃에서 2시간 동안 하이브리드화시킨다(단기간 하이브리드화[SH]). 비오티닐화된 이본쇄 DNA를 제거한 후, 공제된 cDNA를 클로람페니콜 내성 pBCSK+(제조원: Stratagene, La Jolla, CA 92037)의 BamHI/XhoI 부위에 연결시키고, 전기천공으로 ElectroMAx 이. 콜라이 DH10B 세포를 형질전환시켜, 전립선 종양 특이적 공제된 cDNA 라이브러리("전립선 공제 1"로 칭함)를 생성시킨다.
공제된 cDNA 라이브러리를 분석하기 위해, 공제된 전립선 종양 특이적 라이브러리로부터 무작위로 선정하고, 삽입체 크기별로 그룹화한 100개의 독립적인 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조한다. 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 자동 서열분석기 모델 373A(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automated Sequencer Model 373A, Foster City, CA)로 DNA 서열을 분석하여, 대표적인 cDNA 클론을 추가로 특성화한다. 이하 F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9 및 H1-4로 칭하는 6개의 cDNA 클론은 공제된 전립선-특이적 cDNA 라이브러리에 풍부한 것으로 나타났다. F1-12에 대해 결정된 3' 및 5' cDNA 서열은 각각 서열 2 및 3에 제시하고, F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 및 H1-4에 대해 결정된 3' cDNA는 각각 서열 1 및 4 내지 7에 제시한다.
EMBL 및 GenBank 데이터베이스(릴리스 96)를 사용하여, 유전자 은행에 공지된 서열과 분리된 클론에 대한 cDNA 서열을 비교한다. 전립선 종양 cDNA 클론 중의 4개, 즉 F1-13, F1-16, H1-1 및 H1-4는 이전에 동정된 다음의 단백질을 암호화하는 것으로 결정된다: 전립선 특이적 항원(PSA), 사람 선상 칼리크레인, 사람 종양 발현 증강된 유전자 및 미토콘드리아 사이토크롬 C 옥사다제 서브유니트 II. H1-9는 이전에 동정된 사람 자가 복제 서열과 동일한 것으로 밝혀졌다. F1-12에 대한 cDNA 서열과는 어떠한 유의한 상동성도 발견되지 않았다.
후속적인 연구로 F1-12에 대한 전체 길이 cDNA이 분리된다. 당해 서열은 서열 107에 제시되어 있으며, 이의 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 108에 제시되어 있다. P504S의 cDNA 스플라이스 변이체는 서열 600 내지 605에 제시되어 있다.
보다 덜 풍부한 전립선 종양 특이적 유전자를 클로닝하기 위해, 상기한 전립선 종양 cDNA 라이브러리를 정상 췌장 cDNA 라이브러리 및 이전에 공제된 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리에서 가장 풍부한 3개 유전자: 사람 선상 칼리크레인, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 미토콘드리아 사이토크롬 C 옥시다제 서브유니트 II로 공제함으로써 cDNA 라이브러리 공제를 수행한다. 구체적으로는, pCDNA3.1 중의 사람 선상 칼리크레인, PSA 및 미토콘드리아 사이토크롬 C 옥시다제 서브유니트 II cDNA 각각 1㎍을 드라이버 DNA에 첨가하고, 상기한 바와 같이 공제를 수행하여, 이하, "스파이크로 공제된 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리"로 칭하는 제2의 공제된 cDNA 라이브러리를 제공한다.
스파이크로 공제된 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리로부터 22개 cDNA 클론을 분리한다. J1-17, L1-12, N1-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 및 L1-14로서 명명된 클론에 대해 결정된 3' 및 5' cDNA 서열은 각각 서열 8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27 및 28-29에 제시한다. J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-1861 및 N1-1864로 명명된 클론에 대해 결정된 3' cDNA 서열은 각각 서열 30-40에 제시한다. 이들 서열을 상기한 바와 같이 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, 가장 풍부한 5개 DNA 종 중 3개(J1-17, L1-12 및 N1-1862; 각각 서열 8-9, 10-11 및 12-13)와는 전혀 유의한 상동성이 없는 것으로 나타났다. 가장 풍부한 나머지 2개 종 중 하나(J1-12; 서열 30)는 이전에 동정된 사람 폐 표면활성제-연관된 단백질과 동일한 것으로 밝혀졌고, 다른 하나(K1-48; 서열 33)는 2-아릴프로피오닐-CoA 에피머라제에 대한 알. 노르베기쿠스(R. Norvegicus) mRNA와 약간의 상동성이 있는 것으로 결정된다. 스파이크로 공제된 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리로부터 분리된 보다 덜 풍부한 17개 cDNA 클론 중에서, 4개(J1-16, K1-55, L1-6 및 N1-1864; 각각 서열 31, 34, 36 및 40)는 이전에 동정된 서열과 동일한 것으로 밝혀졌고, 2개(J1-21 및 N1-1860; 각각 서열 32 및 38)는 비사람 서열과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 2개(L1-2 및 N1-1861; 각각 서열 35 및 39)는 공지된 사람 서열과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 폴리펩타이드 J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L1-4 및 L1-14(각각, 서열 14-15, 16-17, 20-21, 18-19, 22-23, 24-25, 26-27 및 28-29)에 대해 유의한 상동성이 없는 것으로 밝혀졌다.
후속적인 연구로 J1-17, L1-12 및 N1-1862(각각, 서열 109-111)에 대한 전체 길이 cDNA 서열이 분리된다. 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 112-114에 제시되어 있다. L1-12는 또한 P501S로 명명된다. P501S의 cDNA 스플라이스 변이체는 서열 606에 제시되어 있다.
추가의 실험에서, 3개의 정상 전립선 폴리 A+RNA로부터 제조된 정상 전립선 cDNA로 전립선 종양 cDNA 라이브러리를 공제("전립선 공제 2"로 칭함)함으로써 4개의 추가 클론을 동정한다. 이하 U1-3064, U1-3065, V1-3692 및 1A-3905로 칭하는클론에 대해 결정된 cDNA 서열을 각각 서열 69-72에 제시한다. 결정된 서열을 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, U1-3065와 유의한 상동성이 없는 것으로 나타났다.
정상 췌장 cDNA 라이브러리로, 이어서 PSA, J1-17, 폐 표면활성제-연관된 단백질, 미토콘드리아 DNA, 사이토크롬 C 옥시다제 서브유니트 II, N1-1862, 자가 복제 서열, L1-12 및 종양 발현 증강된 유전자로 스파이킹하여 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리를 공제하여 스파이크에 의한 제2 공제("전립선 공제 스파이크 2"로 칭함)를 수행한다. 이하, V1-3686, R1-2330, 1B-3976 및 V1-3679로 칭하는 4개의 추가 클론을 분리한다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열을 각각 서열 73-76에 제시한다. 이들 서열을 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, V1-3686 및 R1-2330과 유의한 상동성이 없는 것으로 드러났다.
상기한 3개의 전립선 공제(전립선 공제 2, 스파이크로 공제된 전립선 종양 특이적 cDNA 라이브러리 및 전립선 공제 스파이크 2)를 추가로 분석한 결과, 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4810, 1I-4811, 1J-4876, 1K-4884 및 1K-4896로 칭하는 16개의 추가 클론이 동정된다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 77-92에 제시되어 있다. 상기한 바와 같은 이들 클론의 서열을 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, 1G-4741, 1G-4734, 1I-4807, 1J-4876 및 1K-4896(각각, 서열 79, 81, 87, 90 및 92)과 유의한 상동성이 없는 것으로 나타났다. 분리된 클론을 추가로 분석하여, 각각 서열 179-188 및 191-193에 제시되어 있는 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4807, 1J-4876, 1K-4884 및 1K-4896의 증폭된 cDNA 서열을 결정하고, 각각 서열 189 및 190에 제시되어 있는 1I-4810 및 1I-4811에 대한 추가의 부분적인 cDNA 서열을 결정한다.
전립선 공제 스파이크 2에 대한 추가 연구 결과, 추가의 3개 클론을 분리한다. 상기한 바와 같이 이들 서열을 결정하고, 가장 최근의 GenBank와 비교한다. 3개의 모든 클론은 시스테인-풍부한 단백질, KIAA0242 및 KIAA0280(각각, 서열 317, 319 및 320)인 공지된 유전자와 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 클론을 Synteni 마이크로어레이(제조원: Synteni, Palo Alto, CA)에 의해 추가로 분석한 결과, 모든 3개 클론은 대부분의 전립선 종양 및 전립선 BPH에서 뿐만 아니라, 시험된 정상 전립선 조직에서 과발현되고, 기타 모든 정상 조직에서는 저수준으로 발현된다.
정상 췌장 cDNA로 정상 전립선 cDNA 라이브러리를 공제함으로써 추가의 공제를 수행한다("전립선 공제 3"으로 칭함). 이로부터 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 및 1H-4772(서열 93-98)로 명명한 추가의 6개 클론이 동정된다. 이들 서열을 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, 1G-4761 및 1H-4771(각각, 서열 93 및 97)과 유의한 상동성이 없는 것으로 드러났다. 분리된 클론을 추가로 분석한 결과, 각각 서열 194-196 및 199에 제시되어 있는 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766 및 1H-4722에 대한 증폭된 cDNA 서열 및 각각 서열 197 및 198에 제시되어 있는 1H-4770 및 1H-4771에 대한 추가의 부분적인 cDNA 서열이 결정된다.
정상 췌장 cDNA 라이브러리로 3명의 전립선 암 환자로부터의 폴리 A+RNA로부터 제조된 전립선 종양 cDNA 라이브러리를 공제(전립선 공제 4)하여, 1D-4297, 1D-4309, 1D.1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 및 1D-4280(서열 99-107)으로 명명된 8개의 클론을 동정한다. 이들 서열을 상기한 바와 같이 유전자 은행에 공개된 것과 비교한다. 1D-4283 및 1D-4304(각각, 서열 103 및 104)에 대해 유의한 상동성이 발견되지 않았다. 분리된 클론을 추가로 분석하여, 각각 서열 200-206에 제시되어 있는 1D-4309, 1D.1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 및 1D-4280에 대한 증폭된 cDNA 서열을 결정한다.
상기한 전립선 공제 1 및 전립선 공제 2에서 분리된 cDNA 클론을 콜로니 PCR로 증폭시키고, 마이크로어레이 기술(Synteni, Palo Alto, CA)을 사용하여 전립선 종양, 정상 전립선 및 여러 다른 정상 조직에서의 그들의 mRNA 발현 수준을 결정한다. 간단히 설명하면, PCR 증폭 산물을 어레이 포맷에 따라 슬라이드 상에 점적하며, 여기서, 각 산물은 어레이에서 특유의 위치를 점유한다. mRNA를 피검 조직 샘플로부터 추출하여 역전사시킨 다음, 형광-표지된 cDNA 어레이를 생성시킨다. 마이크로어레이를 표지된 cDNA 프로브로 처리하고, 슬라이드를 스캐닝한 다음, 형광 강도를 측정한다. 이러한 형광 강도는 하이브리드화 양과 상호관련이 있다. 2개의 클론(P5009S 및 P510S로 칭함)은 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되고, 기타 모든 정상 피검 조직(간, 췌장, 피부, 골수, 뇌, 유방, 부신, 방광, 고환, 타액선, 대장, 신장, 난소, 폐, 척수, 골격근 및 결장)에서는 저수준으로 발현된다.P509S 및 P510S에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 223 및 224에 제시한다. 이들 서열을 상기한 바와 같이 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, 이전에 동정된 EST와 약간 상동성을 나타낸다.
추가로 연구한 결과, P509S의 전체 길이 cDNA 서열을 분리한다. 당해 서열은 서열 332에 제시되어 있고, 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 339에 제시되어 있다. P510S에 대한 2개의 변이체 전체 길이 cDNA 서열은 서열 535 및 536에 제시되어 있고, 상응하는 추정 아미노산 서열은 각각 서열 537 및 538에 제시되어 있다. P510S의 추가의 스플라이스 변이체는 서열 598 및 599에 제시되어 있다.
실시예 2
전립선-특이적 폴리펩타이드의 조직 특이성의 결정
유전자 특이적 프라이머를 사용하고 RP-PCR을 이용하여, 대표적인 전립선-특이적 폴리펩타이드 F1-16, H1-1, J1-17(또한, P502S로 칭함), L1-12(또한, P501S로 칭함), F1-12(또한, P504S로 칭함) 및 N1-1862(또한, P503S로 칭함)에 대한 mRNA 발현 수준을 여러 정상 및 종양 조직에서 조사한다.
간단히 설명하면, 상기한 바와 같이 트리졸 시약을 사용하여 여러 정상 및 종양 조직으로부터 전체 RNA를 추출한다. 전체 RNA 1 내지 2㎍을 SuperScript II 역전사효소(BRL Life Technologies)와 함께 42℃에서 1시간 동안 사용하여, 제1 쇄 합성을 수행한다. 다음, 유전자-특이적 프라이머을 사용하여 PCR을 수행함으로써 cDNA를 증폭시킨다. RT-PCR의 반정량 특성을 보장하기 위해, β-액틴을 각 피검조직에 대한 대조군으로 사용한다. 먼저, 제1 쇄 cDNA의 일련의 희석액을 제조하고, β-액틴 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 검정을 수행한다. 다음, β-액틴 주형의 선형 범위 증폭을 가능하게 하고, 초기 복제수에서의 차이를 반영하기에 충분할 만큼 감응성을 나타낸 희석액을 선택한다. 이들 조건을 사용하여, β-액틴 수준을 각 조직으로부터의 각 역전사 반응에 대해 결정한다. DNase로 처리하고 역전사효소를 첨가하지 않고 제조된 제1 쇄 cDNA를 사용할 경우에 음성 PCR 결과를 확실히 함으로써 DNA 오염을 최소화한다.
mRNA 발현 수준을 4개의 상이한 유형의 종양 조직(2명 환자로부터의 전립선 종양, 3명 환자로부터의 유방 종양, 결장 종양, 폐 종양) 및 전립선, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 골격근, 피부, 위, 고환, 골수 및 뇌를 포함한 16개의 상이한 정상 조직에서 조사한다. F1-16은 전립선 종양 조직, 결장 종양 및 정상 전립선에서 고수준으로 발현되고, 정상 간, 피부 및 고환에서 저수준으로 발현되나, 다른 피검 조직에서의 발현은 검출할 수 없는 것으로 밝혀졌다. H1-1은 전립선 종양, 폐 종양, 유방 종양, 정상 전립선, 정상 결장 및 정상 뇌에서 고수준으로 발현되고, 정상 폐, 췌장, 골격근, 피부, 소장, 골수에서는 훨씬 더 낮은 수준으로 발현되나, 다른 피검 조직에서는 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다. J1-17(P502S) 및 L1-12(P501S)는 특이하게 전립선에서 과발현되는 한편, 양 유전자는 전립선 종양 및 정상 전립선에서 고수준으로 발현되나, 다른 모든 피검 조직에서는 검출할 수 없는 수준으로 낮게 발현되는 것으로 보인다. N1-1862(P503S)는 전립선 종양의 60%에서 과발현되고, 정상 결장 및 신장에서는 검출가능한 정도로 발현되는 것으로밝혀졌다. 따라서, RT-PCR 결과는 F1-16, H1-1, J1-17(P502S), N1-1862(P503S) 및 L1-12(P501S)가 전립선 특이적이거나 전립선에서 상당히 증가된 수준으로 발현됨을 제시한다.
추가의 RT-PCR 연구 결과, F1-12(P504S)는 전립선 종양의 60%에서 과발현되고, 정상 신장에서는 검출가능한 정도로 발현되나, 다른 모든 피검 조직에서는 검출되지 않는 것으로 나타났다. 유사하게는, R1-2330은 전립선 종양의 40%에서 과발현되고, 정상 신장 및 간에서는 검출가능한 정도로 발현되나, 다른 모든 피검 조직에서는 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다. U1-3064는 전립선 종양의 60%에서 과발현되고, 또한 유방 및 결장 종양에서도 발현되는 것으로 밝혀졌으나, 정상 조직에서는 검출되지 않았다.
R1-2330, U1-3064 및 1D-4279의 RT-PCR 특성화은 이들 3개의 항원이 전립선 및/또는 전립선 종양에서 과발현됨을 제시한다.
4개의 전립선 종양, 2개의 정상 전립선 샘플, 2개의 BPH 전립선 및 정상 결장, 신장, 간, 폐, 췌장, 골격근, 뇌, 위, 고환, 소장 및 골수의 노던 분석 결과, L1-12(P501S)가 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되는 한편, 다른 피검 정상 조직에서 검출되지 않는 것으로 나타났다. J1-17(P502S)는 2개의 전립선 종양에서 검출되었고, 다른 피검 조직에서는 검출되지 않았다. N1-1862(P503S)는 3개의 전립선 종양에서 과발현되고, 정상 전립선, 결장 및 신장에서 발현되나, 다른 피검 조직에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다. F1-12(P504S)는 2개의 전립선 종양에서 고도로 발현되지만, 다른 모든 피검 조직에서는 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다.
상기한 마이크로어레이 기술을 사용하여, 전립선 종양, 유방 종양 및 다음의 정상 조직에서 본원에 기술된 대표적인 항원의 발현 수준을 결정한다: 전립선, 간, 췌장, 피부, 골수, 뇌, 유방, 부신, 방광, 고환, 타액선, 대장, 신장, 난소, 폐, 척수, 골격근 및 결장. L1-12(P501S)는 정상 전립선 및 전립선 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌고, 약간의 발현이 정상 골격근에서 검출되었다. J1-12 및 F1-12(P504S)는 둘 다 전립선 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌고, 기타 다른 피검 조직에서는 발현이 낮거나 검출되지 않았다. N1-1862(P503S)는 전립선 종양 및 정상 전립선에서 고수준으로 발현되고, 정상 대장 및 결장에서는 저수준으로 발현되나, 모든 다른 피검 조직에서는 발현이 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다. R1-2330은 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되고, 다른 모든 피검 조직에서는 저수준으로 발현되었다. 1D-4279는 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되고, 정상 척수에서는 저수준으로 발현되었으나, 다른 모든 피검 조직에서는 검출되지 않은 것으로 밝혀졌다.
P501S(서열 110)이 유방 종양에서 발현되는 정도를 특정적으로 결정하는 추가의 마이크로어레이 검정에서 유방 종양에서 뿐만 아니라, 전이성 유방 종양(2/31)에서 중간 정도의 과발현이 나타났고, 정상 조직에서는 무시할 정도 내지 저수준으로 발현되었다. 이러한 데이터는 P501S가 여러 유방 종양에서 뿐만 아니라, 전립선 종양에서 과발현될 수 있음을 시사한다.
여러 종양 및 정상 조직에서 문헌[참조: Vasmatzis et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95:300-304, 1998]에 기술된 32개 ETS(발현된 서열 태그)의 발현 수준을 상기한 바와 같이 마이크로어레이 기술로 검사한다. 이들 클론 중 2개(P1000C 및 P1001C로 칭함)는 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되고, 모든 다른 피검 조직(정상 대동맥, 갑상선, 휴지 및 활성화 PBMC, 상피 세포, 골수, 수신, 태아 조직, 피부, 타액선, 대장, 골수, 간, 폐, 수지상 세포, 위, 림프절, 뇌, 심장, 소장, 골격근, 결장 및 신장)에서 낮거나 검출할 수 없는 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. P1000C 및 P1001C에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 384 및 472에 제시한다. P1001C의 서열은 이전에 분리된 JM27 단백질에 대한 사람 mRNA에 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. P1000C의 서열에 대한 유의한 상동성이 발견되지 않았다. 서열 384의 서열과 공개된 데이터베이스 중의 서열과의 후속적인 비교로 492개 아미노산 서열을 암호화하는 P1000C의 전체 길이 cDNA 서열(서열 786)을 동정한다. PSORT II 프로그램을 사용한 아미노산 서열의 분석으로 아미노산 84 내지 100번으로부터의 추정 경막 도메인을 동정한다. 종결 코돈을 포함한 P1000C의 오픈 리딩 프레임의 cDNA 서열은 서열 787에 제시되어 있고, 종결 코돈이 존재하지 않는 오픈 리딩 프레임은 서열 788에 제시되어 있다. P1000C의 전체 길이 아미노산 서열은 서열 789에 제시되어 있다. 서열 790 및 791은 각각 P1000C의 아미노산 1 내지 100번 및 100 내지 492번을 나타낸다.
F1-12에 대한 전체 길이 cDNA 서열(P504S로 칭함; 서열 108)에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 면역조직화학 분석에 의해 조사한다. 표준 기술에 의해 전체 길이 P504S 단백질에 대한 래빗-항-P504S 폴리클로날 항체를 생성시킨다. 또한, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술에 의해 폴리클로날 항체를 분리하고 특성화한다. 면역조직화학 분석 결과, P504S 폴리펩타이드는 시험된 전립선 암종(n=5)의 100%에서 발현되는 것으로 나타났다.
래빗-항-P504S 폴리클로날 항체는 양성 전립선 세포를 동일한 세포질 과립 염색으로가 아니라 광선 핵 염색으로 라벨링하는 것으로 보인다. 정상 조직의 분석으로 암호화된 폴리펩타이드가 몇몇 사람 조직에서는 발현하나, 모든 사람 조직에서 발현되는 것은 아닌 것으로 밝혀졌다. 래빗-항-P504S 폴리클로날 항체로의 양성 세포질 염색이 정상 사람 신장, 간, 뇌, 결장 및 폐-연관된 대식세포에서 발견된 반면, 심장 및 골수는 음성이었다.
이러한 데이터는 P504S 폴리펩타이드가 전립선 암 조직에 존재하고, 양성 전립선 증식 조직과 전립선 암 조직 사이에서 정성 및 정량적 염색 차이가 있음을 나타내며, 이는 상기 폴리펩타이드가 전립선 종양에서 선택적으로 검출될 수 있고, 이에 따라 전립선 암의 진단에 유용할 수 있음을 암시한다.
실시예 3
PCR-기초 공제에 의한 전립선-특이적 폴리펩타이드의 분리 및 특성화
10개의 다른 정상 조직 cDNA(뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 태반, 골격근, 비장 및 갑상선)로 공제된 다음 1회의 PCR 증폭에 적용된 정상 전립선으로부터의 cDNA를 함유하는 cDNA 공제 라이브러리를 구입(구입원: Clontech)한다. 당해 라이브러리를 제조업자의 프로토콜에 따라 2회 PCR 증폭에 적용시킨다. 생성된 cDNA단편을 벡터 pT7 블루 T-벡터(제조원: Novagen, Madison, WI)내로 서브클로닝시키고, XL-1 블루 MRF' 이. 콜라이(Stratagene)로 형질전환시킨다. 독립적인 클론으로부터 DNA를 분리하고, 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 자동 서열분석기 모델 373A를 사용하여 서열분석한다.
59개의 양성 클론을 서열분석한다. 상기한 바와 같이 이들 클론의 DNA 서열을 유전자 은행에 공개된 서열과 비교한 결과, 이들 클론 중 이하 P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P39, P42, P49, P50, P53, P55, P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 및 P84로 칭하는 25개에 대해 유의한 상동성이 없는 것으로 드러났다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 41-45, 47-52 및 54-65에 제시되어 있다. P29, P47, P68, P80 및 P82(각각, 서열 46, 53 및 66-68)은 이전에 동정된 DNA 서열과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자가 알고 있는 한, 이들 서열 중 어느 것도 전립선에 존재하는 것으로 본 발명 이전에 제시된 바가 없다.
서열 67을 표준 전체 길이 클로닝 방법에서 프로브로 사용하는 추가의 연구로 P80의 스플라이스 변이체(또한 P704P로도 공지됨)로 보이는 3개의 cDNA 서열이 동정된다. 이들 서열은 서열 620 내지 622에 제시되어 있다.
상기한 PCR-기초 방법을 사용한 추가의 연구로, 180개 이상의 추가 클론이 분리되고, 이 중에서 23개 클론이 공지된 서열과 유의한 상동성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 115-123, 127, 131, 137, 145, 147-151, 153, 156-158 및 160이 제시되어 있다. 23개 클론(서열 124-126,128-130, 132-136, 138-144, 146, 152, 154, 155 및 159)이 이전에 동정된 EST와 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 추가의 10개 클론(서열 161-170)이 공지된 유전자와 약간의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. P20 서열을 함유하는 보다 큰 cDNA 클론은 P703P로 명명된 유전자의 스플라이스 변이체를 나타낸다. DE1, DE13 및 DE14로서 명명된 변이체에 대해 결정된 DNA 서열은 각각 서열 171, 175 및 177에 제시되어 있고, 상응하는 추정 아미노산 서열은 각각 서열 172, 176 및 178에 제시되 어 있다. P703의 증폭되고 스플라이싱된 형태에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 225에 제시되어 있다. DE2 및 DE6으로 명명된 스플라이스 변이체에 대한 DNA 서열은 각각 서열 173 및 174에 제시되어 있다.
종양 조직(전립선(n=5), 유방(n=2), 결장 및 폐), 정상 조직(전립선(n=5), 결장, 신장, 간, 폐(n=2), 난소(n=2), 골격근, 피부, 위, 소장 및 뇌) 및 활성화 및 비활성화 PBMC에서의 대표적인 클론의 mRNA 발현 수준을 상기한 바와 같이 RT-PCR에 의해 결정한다. 발현은 달리 언급되지 않는 한, 각 조직 유형의 1개 샘플에서 검사하였다.
P9는 비슷한 발현을 보인 정상 결장을 제외하고는 모든 피검 정상 조직에 비하여 정상 전립선 및 전립선 종양에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. P703P 유전자의 일부인 P20은 12개의 모든 피검 정상 조직에 비하여 정상 전립선 및 전립선 종양에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 유방 종양(n=2), 결장 종양 및 폐 종양에서 P20의 발현은 폐(2개 중 1개)를 제외한 모든 정상 조직에 비하여 그다지 높지 않은 정도로 증가한 것으로 나타났다. P18의 증가된 발현이 폐 및 위를 제외한 다른 정상 조직에 비하여 정상 전립선, 전립선 종양 및 유방 종양에서 발견되었다. P5의 발현이 약간 증가한 것이 대부분의 다른 정상 조직에 비하여 정상 전립선에서 관찰되었다. 그러나, 약간 증가된 발현이 정상 폐 및 PBMC에서 나타났다. 또한, P5의 증가된 발현이 전립선 종양(5개 중 2개), 유방 종양 및 한 개의 폐 종양 샘플에서 관찰되었다. P30의 경우, 유사한 발현 수준이 12개의 다른 피검 정상 조직 중 6개에 비하여 정상 전립선 및 전립선 종양에서 관찰되었다. 증가된 발현이 유방 종양, 1개의 폐 종양 샘플 및 1개의 결장 종양 샘플에서 및 또한 정상 PBMC에서 관찰되었다. P29는 대부분의 정상 조직에 비하여 전립선 종양(5개 중 5개) 및 정상 전립선(5개 중 5개)에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, P29의 상당한 발현이 정상 결장 및 정상 폐(2개 중 2개)에서 관찰되었다. P80은 모든 다른 피검 정상 조직에 비하여 전립선 종양(5개 중 5개) 및 정상 전립선(5개 중 5개)에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으며, 또한 증가된 발현이 결장 종양에서 관찰되었다.
추가의 연구로, 이하 10-d8, 10-h10, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11, 9-f12 및 9-f3로 칭하는 12개의 추가 결장이 분리된다. 10-d8, 10-h10, 11-c8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, 9-f12 및 9-f3에 대해 결정된 DNA 서열은 각각 서열 207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 및 222에 제시되어 있다. 7-g6, 8-b5, 8-b6 및 8-g3에 대해 결정된 정방향 및 역방향 DNA 서열은 각각 서열 210과 211, 212와 213, 214와 215 및 218과 219에 제시되어 있다. 이들 서열을 유전자 은행에 공개된 것과 비교한 결과, 9-f3의 서열과는 유의한 상동성이 없는 것으로 나타났다.클론 10-d8, 11-c8 및 8-h11은 이전에 분리된 EST와 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀진 한편, 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 및 9-f12는 이전에 동정된 유전자와 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 7-G6 및 8-G3의 추가 특성화로 각각 공지 유전자 PAP 및 PSA와 동일한 것으로 나타났다.
이들 클론에 대한 mRNA 발현 수준을 상기한 마이크로어레이 기술을 사용하여 결정한다. 클론 7-G6, 8-G3, 8-B5, 8-B6, 8-D4, 8-D9, 9-F3, 9-F12, 9-H3, 10-A2, 10-A4, 11-C9 및 11-F2는 전립선 종양 및 정상 전립선에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으며, 다른 조직에서의 발현은 낮거나 검출되지 않았다. 8-F11의 증가된 발현이 전립선 종양 및 정상 전립선, 방광, 골격근 및 결장에서 관찰되었다. 10-H10의 증가된 발현이 전립선 종양 및 정상 전립선, 방광, 폐, 결장, 뇌 및 대장에서 관찰되었다. 9-B1의 증가된 발현이 전립선 종양, 유방 종양 및 정상 전립선, 타액선, 대장 및 피부에서 관찰된 한편, 11-C8의 증가된 발현이 전립선 종양 및 정상 전립선 및 대장에서 관찰되었다.
상기한 PCR-기초 정상 전립선 공제로부터 유도된 추가의 cDNA 단편이 마이크로어레이 기술 및 RT-PCR에 의해 전립선 특이적인 것으로 밝혀졌다. 당해 클론(9-A11로 칭함)의 결정된 cDNA 서열은 서열 226에 제시되어 있다. 당해 서열을 공개된 데이터베이스에 있는 서열과 비교한 결과, 공지된 유전자 HOXB13과 99% 상동성이 있는 것으로 나타났다.
추가의 연구로 클론 8-C6 및 8-H7이 분리된다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 227 및 228에 제시되어 있다. 이들 서열은 이전에 분리된EST와 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
PCR 및 하이브리드화-기초 방법을 사용하여, 클론 P20(또한 P703P로 칭함)에 대한 보다 긴 cDNA 서열을 수득하고, 상기 유전자의 5' 말단에 점진적으로 증폭되는 3개의 추가 cDNA 단편을 수득한다. P703PDE5, P703P6.26 및 P703PX-23(각각, 서열 326, 328 및 330, 상응하는 추정 아미노산 서열이 각각 서열 327, 329 및 331에 제시되어 있음)으로 명명된 이들 단편은 추가의 5' 서열을 함유한다. P703P의 일부를 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리(#141-26)을 스크리닝함으로써 P703PDE5를 회수한다. P703P6.26을 3개의 전립선 종양 cDNA의 혼합물로부터 회수하고, P703PX-23을 cDNA 라이브러리(#438-48)로부터 회수한다. 일괄적으로, 추가의 서열은 추정 시그널 서열의 일부와 함께 모든 추정의 성숙 세린 프로테아제를 포함한다. P703P에 대한 전체 길이 cDNA 서열은 서열 524에 제시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 서열 525에 제시되어 있다.
컴퓨터 알고리듬을 사용하여, P703P의 다음 영역이 잠재적인 HLA A2-결합 CTL 에피토프를 나타내는 것으로 예상된다: 서열 525의 아미노산 164-172번(서열 723); 서열 525의 아미노산 160-168번(서열 724); 서열 525의 아미노산 239-247번(서열 725); 서열 525의 아미노산 118-126번(서열 726); 서열 525의 아미노산 112-120번(서열 727); 서열 525의 아미노산 155-164번(서열 728); 서열 525의 아미노산 117-126번(서열 729); 서열 525의 아미노산 164-173번(서열 730); 서열 525의 아미노산 154-163번(서열 731); 서열 525의 아미노산 163-172번(서열 732); 서열 525의 아미노산 58-66번(서열 733); 및 서열 525의 아미노산 59-67번(서열 734).
P703P는 이전에 동정된 프로테아제, 예를 들어, 트롬빈에 어느 정도 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 트롬빈 수용체는 고도로 전이성인 유방 암종 세포 및 유방 암종 생검 샘플에서 우선적으로 발현되는 것으로 나타났다. 트롬빈 수용체 안티센스 cDNA의 도입은 배양물에서 전이성 유방 암종 세포의 침입을 억제하는 것으로 나타났다. 트롬빈 수용체에 대한 항체는 트롬빈 수용체 활성화 및 트롬빈-유도된 혈소판 활성을 억제한다. 또한, 수용체의 연결된 리간드 영역과 유사한 펩타이드는 트롬빈에 의한 혈소판 응고를 억제한다. P703P는 암 세포 또는 간질 세포 상에서의 프로테아제-활성화 수용체를 통한 전립선 암에서 역할을 할 수 있다. P703P의 잠재적인 트립신-유사 프로테아제 활성은 암 세포 막 상에서 프로테아제-활성화 수용체를 활성화시켜 종양 발생을 촉진시키거나 인접한 세포(예를 들어, 간질 세포) 상에서 프로테아제-활성화 수용체를 활성화시켜 종양 혈관형성, 침입 및 및 전이를 촉진시킬 수 있는 성장 인자 및/또는 프로테아제(예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제)를 분비할 수 있다. 이와 같이 P703P는 프로테아제-활성화 수용체의 활성화를 통해 종양 진행 및/또는 전이를 촉진시킬 수 있다. 따라서, P703P-수용체 상호작용을 차단하는 폴리펩타이드 및 항체는 전립선 암의 치료에서 유용하게 사용할 수 있다.
P703P 발현이 종양 단계의 지시제인 글리슨(Gleason) 등급의 증가된 중증도로 증가되었는지의 여부를 결정하기 위해, 정량적 PCR 분석을 5 내지 8 초과의 글리슨 점수의 범위를 갖는 전립선 종양 샘플 상에서 수행한다. P703P 발편의 평균 수준은 증가하는 글리슨 점수를 가지면서 증가하고, 이는 P703P 발현이 증가된 질환 중증도와 상호관련될 수 있음을 지시한다.
정상 조직의 풀에 대해 공제된 전립선 종양 풀의 PCR-기초 공제(JP: PCR 공제로 칭함) 라이브러리를 사용한 추가의 연구로, 13개의 추가 클론이 분리되고, 이들 중 7개는 공지된 GenBank 서열과 어떠한 유의한 상동성도 공유하지 않았다. 이들 7개 클론(P711P, P712P, 신규한 23, P774P, P775P, P710P 및 P768P)에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 307-311, 313 및 315에 제시되어 있다. 나머지 6개 클론(서열 316 및 321-325)은 공지의 유전자와 약간의 상동성을 공유하는 것으로 나타났다. 마이크로어레이 분석에 의해 13개 모든 클론은 정상 비-전립선 조직에 비해 전립선 종양, BPH 및 정상 전립선을 포함하는 전립선 조직에서 3배 이상 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 클론 P711P, P712P, 신규한 23 및 P768P는 검사된 대부분의 전립선 종양 및 BPH 조직(n=29) 및 대부분의 정상 전립선 조직(n=4)에서 과발현되었으나, 모든 정상 조직에서는 백그라운드 내지 저수준으로 발현되었다. 클론 P774P, P775P 및 P710P는 소수의 전립선 종양 및 BPH 샘플에서 비교적 낮은 발현을 나타내고, 정상 전립선에서는 음성 내지 낮은 발현을 나타낸다.
추가의 연구로 P712P(서열 552)에 대해 증폭된 cDNA 서열이 동정된다. 서열 552의 서열내에 존재하는 16개의 추정된 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 553-568에 제시되어 있다.
서열 307의 부분 서열을 사용하여 전립선 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 P711P에 대한 전체 길이 cDNA를 수득한다. 구체적으로는, 지향적으로 클로닝된 전립선 cDNA 라이브러리를 표준 기술을 사용하여 제조한다. 당해 라이브러리의 백만개 콜로니를 LB/Amp 플레이트 상에 플레이팅한다. 나일론 막 필터를 사용하여, 콜로니를 채취하고, 이들 필터에 의해 채취된 cDNA를 변성시킨 다음, UV 광으로 필터에 가교결합시킨다. 서열 307의 P711P cDNA 단편을 방사능 표지시키고, 이를 사용하여 상기 필터에 하이브리드화시킨다. 양성 클론을 선별하고, cDNA를 제조한 다음, 자동 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 서열분석기를 사용하여 서열분석한다. P711P의 결정된 전체 길이 서열은 서열 382에 제시되어 있고, 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 383에 제시되어 있다.
PCR 및 하이브리드화-기초 방법을 사용하여, 상기한 2개 클론, 이하 각각 P707P 및 P714P로 칭하는 11-C9 및 9-F3(각각, 서열 333 및 334)에 대한 추가의 cDNA 서열 정보를 유도한다. 가장 최근의 GenBank 서열과 비교한 결과, P707P는 공지의 유전자 HoxB13의 스플라이스 변이체인 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, P714P와는 유의한 상동성이 없는 것으로 밝혀졌다. 서열 334의 서열을 표준 전체 길이 클로닝 방법에서 프로브로서 사용한 추가의 연구로, P714P에 대한 증폭된 cDNA 서열이 수득된다. 당해 서열은 서열 619에 제시되어 있다. 이러한 서열은 사람 리보좀 L23A 단백질을 암호화하는 유전자와 어느 정도 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
클론 8-B3, P89, P98, P130 및 P201(1998년 2월 9일자로 출원된 미국 특허원 제09/020,956호에 개시되어 있음)이 공지의 유전자 NKX 3.1의 스플라이스 변이체로 결정된 P705P로 명명된 하나의 연속 서열(서열 335, 이의 상응하는 추정 아미노산은 서열 336에 제시되어 있다)내에 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다.
P775P에 대한 추가의 연구로 모두 P775P 유전자의 스플라이스 변이체인 4개의 추가의 서열(서열 473-476)이 분리된다. 서열 474의 서열은 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 ORF에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 477 및 478에 제시되어 있다. 서열 475의 cDNA 서열은 서열 479의 아미노산 서열을 암호화하는 ORF를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 서열 473의 cDNA 서열은 4개의 ORF를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 ORF에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 480-483에 제시되어 있다. P775P의 추가의 스플라이스 변이체는 서열 593-597에 제시되어 있다.
후속적인 연구로 5개의 전립선 유전자 P704P, P712P, P774P, P775P 및 B305D를 함유하는 캣 아이 신드롬 영역으로 공지되어 있는 염색체 22q11.2 상의 게놈 영역이 동정된다. 이들 5개의 유전자 각각의 게놈 영역내에서의 상대적 위치는 도 10에 도시되어 있다. 따라서, 이들 영역은 악성 종양과 관련될 수 있고, 다른 잠재적 종양 유전자가 이들 영역내에 함유될 수 있다. 또한, 이들 연구로 서열 534의 아미노산 서열을 암호화하는 P775P에 대한 잠재적 오픈 리딩 프레임(서열 533에 제시되어 있음)이 동정된다.
서열 325의 클론(P558S)의 GenBank 및 GeneSeq DNA 데이터베이스내의 서열과의 비교로 P558S가 2개의 형태를 갖는 것으로 공지되어 있는 전립선-특이적 트랜스글루타미나제 유전자와 동일한 것으로 나타났다. 2개의 형태에 대한 전체 길이 서열은 서열 630 및 631에 제시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 서열 632 및 633에 각각 제시되어 있다. 서열 631의 cDNA 서열은 15쌍의 염기 삽입체를 가지며, 상응하는 아미노산 서열(서열 633) 중의 5개의 아미노산 삽입체를 생성시킨다. 이러한 삽입체는 서열 630의 서열에는 존재하지 않는다.
P768P(서열 315)에 대한 추가의 연구로 추정의 전체 길이 오픈 리딩 프레임(ORF)이 동정된다. 종결 코돈을 갖는 ORF의 cDNA 서열은 서열 764에 제시되어 있다. 종결 코돈을 가지지 않는 ORF의 cDNA 서열은 서열 765에 제시되어 있으며, 상응하는 아미노산 서열은 서열 766에 제시되어 있다. 이러한 서열은 랫트 칼슘 수송체 단백질과 86%의 동일성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 이는 P768P가 사람 칼슘 수송체 단백질을 나타냄을 지시한다. P768P내에서의 경막 영역의 위치는 PSORT II 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 예상한다. 6개의 경막 도메인은 아미노산 위치 118-134번, 172-188번, 211-227번, 230-246번, 282-298번 및 348-364번에서 예상된다. 서열 767-772의 아미노산 서열은 각각 P768P의 아미노산 1-134번, 135-188번, 189-227번, 228-246번, 247-298번 및 299-511번을 나타낸다.
실시예 4
폴리펩타이드의 합성
HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화와 함께 FMOC 화학반응을 사용하여 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 430A 펩타이드 합성기에서 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. Gly-Cys-Gly 서열을 펩타이드의 아미노 말단에 연결하여, 결합 방법, 고정화된 표면에의 결합 또는 펩타이드의 라벨링을 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터 펩타이드의 절단은 다음의분해 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다: 트리플루오로아세트산:에탄디티올:티오아니솔:물:페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 분해한 후, 펩타이드를 냉 메틸-t-부틸-에테르 중에서 침전시킬 수 있다. 다음, 펩타이드 펠렛을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 함유된 물에 용해시키고, 동결건조시킨 후, C18 역상 HPLC로 정제할 수 있다. 물(0.1% TFA 함유) 중의 0%-60% 아세토니트릴(0.1% TFA 함유)의 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시킬 수 있다. 순수한 분획을 동결건조시킨 후, 전기분무 또는 다른 유형의 질량 스펙트럼을 사용하여 아미노산 분석에 의해 펩타이드를 특성화시킬 수 있다.
실시예 5
PCR-기초 공제에 의한 전립선-특이적 폴리펩타이드의 추가 분리 및 특성화
상기한 바와 같이 전립선 원시 종양 mRNA로부터 형성된 cDNA 라이브러리를 정상 전립선으로부터의 cDNA로 공제한다. 보다 큰 단편을 형성시키기 위해, 변형된 PCR-기초 프로토콜(Clontech)을 사용하여 공제를 수행한다. 이러한 프로토콜내에서, 테스터 및 드라이버 이본쇄 cDNA를 개별적으로 6개의 뉴클레오타이드 제한 부위(MluI, MscI, PvuII, SalI 및 StuI)를 인식하는 5개의 제한 효소로 분해한다. 이러한 분해 결과로, Clontech 프로토콜에 따르는 RsaI으로의 분해로부터 생성되는 300bp의 평균 DNA 크기보다 오히려 600bp의 평균 cDNA 크기가 형성되었다. 이러한 변형은 공제 효율에 영향을 미치지 않았다. 다음, 상이한 어댑터로 2가지 테스터 집단을 형성하였고, 드라이버 라이브러리는 어댑터없이 존재한다.
다음, 과량의 드라이버 cDNA를 사용하여 테스터 및 드라이버 라이브러리를 하이브리드화시킨다. 제1 하이브리드화 단계에서, 드라이버를 별도로 2가지 테스터 cDNA 집단 각각과 하이브리드화시킨다. 그 결과로, (a) 미하이브리드화된 테스터 cDNA, (b) 다른 테스터 cDNA에 하이브리드화된 테스터 cDNA, (c) 드라이버 cDNAdp 하이브리드화된 테스터 cDNA 및 (d) 미하이브리드화된 드라이버 cDNA가 수득되었다. 다음, 별개의 2가지 하이브리드화 반응물을 합하고, 추가의 변성된 드라이버 cDNA의 존재하에 재하이브리드화시킨다. 이러한 2차 하이브리드화 후, 집단 (a) 내지 (d)에 더하여, 하나의 어댑터를 갖는 테스터 cDNA를 제2 어댑터를 갖는 테스터 cDNA에 하이브리드화시킨 제5 집단 (e)를 형성시킨다. 따라서, 2차 하이브리드화 단계의 결과로서 어댑터-특이적 프라이머로 PCR 증폭시키기 위한 주형으로서 사용될 수 있는 차별적으로 발현된 서열이 증가되었다.
다음, 말단을 충전시키고, 어댑터-특이적 프라이머를 사용하여, PCR 증폭을 수행한다. 드라이버 cDNA에 하이브리드화하지 않은 테스터 cDNA를 함유하는 집단 (e)만이 지수적으로 증폭되었다. 이어서, 2차 PCR 증폭 단계를 수행하여, 백그라운드를 감소시키고, 차별적으로 발현된 서열을 추가로 증가시킨다.
이러한 PCR-기초 공제 기술은 전립선 종양 조직에서 과발현되는 희귀 전사물이 회수가능할 수 있도록 차별적으로 발현된 cDNA를 표준화시킨다. 이러한 전사물은 전통적인 공제 방법으로 회수하기 어렵다.
전립선 종양에서 과발현되는 것으로 공지된 유전자 이외에 77개의 클론을 추가로 동정한다. 이들 부분적인 cDNA의 서열은 서열 29 내지 305에 제시되어 있다.대부분의 이들 클론은 데이터베이스 서열과 유의한 상동성이 없다. 예외적인 것은 JPTPN23(서열 231; 피그 발로신-함유 단백질과 유사), JPTPN30(서열 234; 프로테아좀 서브유니트에 대한 랫트 mRNA와 유사), JPTPN45(서열 243; 랫트 노르베기쿠스 세포질 NADP-의존성 이소시트레이트 데하이드로게나제와 유사), JPTPN46(서열 244; 사람 아클론 H8 4 d4 DNA 서열과 유사), JP1D6(서열 265; 지. 갈루스(G. gallus) 다이네인 경쇄-A와 유사), JP8D6(서열 288; 사람 BAC 클론 RG016J04와 유사), JP8F5(서열 289; 사람 아클론 H8 3 b5 DNA 서열과 유사) 및 JP8E9(서열 사람 Alu 서열과 유사)이다.
정상 전립선 풀로 공제된 전립선 종양 그룹으로 이루어진 PCR-기초 공제 라이브러리(PT-PN PCR 공제로 칭함)를 사용한 추가의 연구로 추가로 3개의 클론이 수득되었다. 이들 클론의 cDNA 서열을 가장 최근의 GenBank 서열과 비교한 결과, P715P 및 P767P(각각, 서열 312 및 314)로 명명된 2개의 클론과의 유의한 상동성이 없는 것으로 드러났다. 나머지 클론은 공지의 유전자 KIAA0056(서열 318)과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 여러 조직에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 마이크로어레이 분석을 사용한 결과, 모든 3개 클론은 전립선 종양 및 BPH 조직에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로는, 클론 P715P는 3 이상의 계수만큼 대부분의 전립선 종양 및 BPH 조직에서 과발현되었고, 증가된 발현이 대부분의 정상 전립선 샘플 및 태아 조직에서 관찰되었으나, 기타 모든 정상 조직에서는 음성 내지 낮은 발현으로 나타났다. 클론 P767P는 수개의 전립선 종양 및 BPH 조직에서 과발현되는 한편, 정상 전립선 샘플의 50%에서 약간의 발현 수준이 관찰되었고, 기타 모든 피검 정상 조직에서는 발현이 백그라운드 내지 저수준으로 발현되었다.
PT-PN PCR 공제 라이브러리 및 정상 조직 cDNA 그룹으로 공제된 전립선 종양으로부터의 cDNA를 함유하는 DNA 공제 라이브러리를 상기한 바와 같이 마이크로어레이에 의해 추가로 분석하여 추가로 27개 클론(서열 340-365 및 381)을 분리한다. 이들 클론은 전립선 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 서열 341, 342, 345, 347, 348, 349, 351, 355-359, 361, 362 및 364의 클론은 정상 전립선에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 여러 정상 조직에서 모든 26개 클론의 발현은 낮거나 검출되지 않는 정도인 것으로 밝혀진 한편, 예외적으로 P554S(서열 356)는 소장에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 26개 클론 중 11개(서열 340-349 및 362)는 이전에 동정된 서열과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 서열 350, 351, 353-361 및 353-365의 클론과는 어떠한 유의한 상동성이 발견되지 않았다.
서열 362와 GenBank 및 GeneSeq DNA 데이터베이스 중의 서열과의 비교로 이러한 클론(P787P로 칭함)이 GeneSeq 단백질 수탁번호 제Y00931호 중에서 발견되는 단백질을 암호화하는 GeneSeq 수탁번호 제X27262호와 동일한 것으로 나타났다. P788P의 전체 길이 cDNA 서열은 서열 634에 제시되어 있고, 상응하는 추정된 아미노산은 서열 635에 제시되어 있다. 후속적으로, 서열 634의 서열에서는 발견되지 않는 다형을 함유하는 P788P에 대한 전체 cDNA 서열을 3개의 개체로부터의 수개의 RNA 주형으로부터 제조된 cDNA로부터의 PCR 증폭에 의해 다수회 클로닝시킨다. P788P의 상기 다형의 결정된 cDNA 서열은 서열 636에 제시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 서열 637에 제시되어 있다. 서열 637의 서열은 6개의 아미노산 잔기에 의해 서열 635의 서열과는 상이하다. P788P 단백질은 C-말단 영역에서 7개의 잠재적인 경막 영역을 가지고, 세포외 N-말단 영역을 갖는 플라스마 막 단백질인 것으로 예상된다.
서열 352(P790P로 칭함)에 대한 추가의 연구로 서열 526의 전체 길이 cDNA 서열이 분리된다. 상응하는 추정 아미노산은 서열 527에 제시되어 있다. 2회의 정량적 PCR 실험으로부터 데이터는 P790P이 11개/15개 시험된 전립선 종양 샘플에서 과발현되고, 척수에서 저수준으로 발현되고, 시험된 모든 다른 정상 샘플에서는 발현이 발견되지 않는다. 추가의 PCR 실험으로부터의 데이터 및 마이크로어레이 실험으로 정상 전립선 및 전립선 종양에서는 과발현되고, 시험된 다른 조직에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않는 것으로 나타났다. P790P는 후속적으로 이전에 동정된 G-단백질 커플링된 전립선 조직 수용체에 유의한 상동한 나타내는 것으로 밝혀졌다.
서열 354(P776P로 칭함)의 클론에 대한 추가의 서열로 서열 569에 제시되어 있는 증폭된 cDNA 서열이 분리된다. P776P의 3개의 추가의 스플라이스 변이체의 결정된 cDNA 서열은 서열 570-572에 제시되어 있다. 서열 570내에 함유되어 있는 2개의 추정된 오픈 리딩 프레임(ORF)에 의해 암호화된 아미노산 서열, 서열 571내에 함유되어 있는 하나의 추정된 ORF 및 서열 572내에 함유되어 있는 11개의 추정된 ORF는 각각 서열 573-586에 제시되어 있다. 추가의 연구로 서열 570의 클론에 대한 전체 길이 서열(서열 737에 제시되어 있음)이 분리된다. 서열 571의 클론에대한 전체 길이 클로닝 노력으로 위치 1293에서의 다형 삽입/결실을 제외하고는 동일한 단일 클론을 나타내는 2개의 서열(서열 738 및 739)이 분리된다. 구체적으로는, 서열 739의 클론(클론 F1로 칭함)은 위치 1293에서 단일 염기쌍 결실을 갖는다. 서열 737내에 위치하는 5개의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 740-744에 제시되어 있으며, 서열 738 및 739의 클론에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 745-750에 제시되어 있다.
클론 P767P에 대한 cDNA 서열(서열 314) 및 P777P에 대한 cDNA 서열(서열 350)과 GenBank 사람 EST 데이터베이스 중의 서열과의 비교로 2개의 클론이 다수의 EST 서열과 공통적으로 부합되는 것으로 나타나고, 이는 P767P 및 P777P가 동일한 유전자일 수 있음을 암시한다. P767P, P777P 및 다수의 EST 클론의 DNA 서열 정렬로부터 유래된 DNA 컨센서스 서열은 서열 587에 제시되어 있다. 서열 587내에 위치한 3개의 추정 ORF에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 588-590에 제시되어 있다.
서열 342의 클론(P789P)은 이전에 동정된 유전자와 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. P789P에 대한 전체 길이 cDNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열 735 및 736에 제시되어 있다.
실시예 6
마우스의 펩타이드 프라이밍 및 CTL 주의 증식
6.1. 본 실시예는 P502S 유전자를 발현하는 세포에 대해 특이적인 CTL 세포주의 제조를 예시한다.
사람 HLA A2Kb에 대한 형질전환 유전자를 발현하는 마우스(제공자: Dr L. Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)를 다음과 같은 변형으로 문헌[참조: Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11993-11997]에 기술된 바와 같이 P502S 유전자(또한, J1-17로 칭함, 서열 8)로부터 유도된 P2S#12 펩타이드(VLGWVAEL; 서열 306)로 면역화시킨다. 마우스를 P2S#12 100㎍ 및 불완전 프로인트 중에 유화된 I-Ab결합 펩타이드 120㎍으로 면역화시킨다. 3주 후 이들 마우스를 희생시키고 나이론 메쉬를 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 다음, 세포를 10% FCS, 2mM 글루타민(Gibco BRL), 나트륨 피루베이트(Gibco BRL), 비필수 아미노산(Gibco BRL), 2 x 10-5M 2-머캅토에탄올, 50U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 완전 배지(RPMI-1640; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 중에 6 x 106개 세포/ml로 재현탁시키고, 조사된(3000rad) P2S#12-펄스된(5mg/ml P2S#12 및 10mg/ml β2-마이크로글루불린) LPS 아세포(7㎍/ml 덱스트란 설페이트 및 25㎍/ml LPS의 존재하에 3일 동안 배양된 A2 형질전환 비장 세포)의 존재하에 배양한다. 6일 후 세포(5 x 105개/ml)를 2.5 x 106개/ml 펩타이드 펄스되고 조사된(20,000rad EL4A2Kb 세포[참조: Sherman et al., Science 258:815-818, 1992] 및 3 x 106개/ml A2 형질전환 비장 공급자 세포로 재자극시킨다. 세포를 20U/ml IL-2의 존재하에 배양한다. 세포주를 클로닝하기 위한 준비로서 세포를 상기한 바와 같이 계속해서매주 재자극시킨다.
30U/ml IL-2의 존재하에 자극제로서의 펩타이드 펄스된 EL4 A2Kb 종양 세포(1 x 104개 세포/웰) 및 성장된 공급자로서의 A2 형질전환 비장 세포(5 x 105개 세포/웰)로 제한 희석 분석을 실시함으로써 P2S#12 주를 클로닝한다. 14일째, 세포를 상기한 바와 같이 재자극시킨다. 21일째, 성장한 클론을 분리하고, 배양물에 정치시킨다. 이들 클론 중 수개는 대조 섬유아세포에 대해서보다 P502S가 형질도입된 사람 섬유아세포(HLA A2Kb 발현)에 대해 상당히 높은 반응성(용해)을 증명한다. 일례가 도 1에 도시되어 있다.
이러한 데이터는 P2S#12가 사람 HLA A2Kb 분자에 대해 발현되는 P502S 단백질의 천연적으로 프로세싱된 에피토프를 나타냄을 가리킨다.
6.2. 본 실시예는 P501S 유전자를 발현하는 세포에 대해 특이적인 마우스 CTL 주 및 CTL 클론의 제조를 예시한다.
상기한 바와 유사하게 일련의 실험을 실시한다. P501S 유전자(또한, L1-12로 칭함, 서열 110)로부터 유도되는 P1S#10 펩타이드(서열 337)로 마우스를 면역화시킨다. 공개된 HLA-A2 결합 모티프[참조: Parker, KC et al., J. Immunol., 152:163, 1994]로 정의된 잠재적인 HLA-A2 결합 서열을 위해 P501S에 대한 추정 폴리펩타이드 서열을 분석하여 P1S#10 펩타이드를 유도한다. P1S#10 펩타이드를 실시예 4에 기술된 바와 같이 합성하고, T 세포 기초 경쟁 검정법을 이용하여, HLA-A2 결합에 대해 실험적으로 시험한다. 추정된 A2 결합 펩타이드를 HLA-A2 결합 인플루엔자 매트릭스 펩타이드 fluM58에 대해 특이적인 HLA-A2 제한된 CTL 클론(D150M58)에 HLA-A2 특이적 펩타이드 제시를 경쟁하는 능력에 대해 시험한다. D150M58 CTL은 펩타이드 fluM58의 자가-제시에 반응하여 TNF를 분비한다. 경쟁 검정에서 CTL에 HLA-A2를 결합시키기 위해 100 내지 200㎍/ml의 시험 펩타이드를 D150M58 CTL의 배양물에 첨가한다. 30분 후, 시험 펩타이드 또는 대조 펩타이드와 배양한 CTL을 표준 TNF 생검정에서 fluM58 펩타이드에 대한 항원 용량 반응에 대해 시험한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 펩타이드 P1S#10은 fluM58의 HLA-A2 제한된 제시를 경쟁하며, 이는 펩타이드 P1S#10이 HLA-A2와 결합함을 증명한다.
사람 HLA A2Kb에 대한 형질전환 유전자를 발현하는 마우스를 다음의 변형으로 문헌[참조: Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11993-11997, 1995]에 기술된 바와 같이 면역화한다. 불완전 프로인트 애쥬번트 중에 유화된 P1S#10 62.5㎍ 및 B형 간염 바이러스 단백질로부터 유도된 I-Ab결합 펩타이드 120㎍으로 마우스를 면역화시킨다. 3주 후 이들 마우스를 희생시키고, 나일론 메쉬를 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 이어서, 세포를 상기한 완전 배지 중에 6 x 106개 세포/ml로 재현탁시키고, 조사된(3000rad) P1S#10-펄스된(2㎍/ml P1S#10 및 10mg/ml β2-마이크로글로불린) LPS 아세포(7㎍/ml 덱스트란 설페이트 및 25㎍/ml LPS의 존재하에 3일간 배양한 A2 형질전환 비장 세포)의 존재하에 배양한다. 6일 후 세포(5 x 105개 세포/ml)를 상기한 2.5 x 106개/ml 펩타이드-펄스되고조사된(20,000rad) EL4A2Kb 세포 및 3 x 106개/ml A2 형질전환 비장 공급자 세포로 재자극시킨다. 세포를 20U/ml IL-2의 존재하에 배양한다. 클로닝을 위한 준비로 세포를 매주 재자극시킨다. 3회의 시험관낸 자극 후, 도 4에 도시된 바와 같이 P1S#10-펄스된 Jurkat A2Kb 표적 및 P501S-형질도입된 Jurkat 표적을 인식한 1개의 주가 생성되었다.
30U/ml IL-2의 존재하에 성장된 공급자로서의 A2 형질전환 비장 세포(5 x 105개 세포/웰) 및 자극제로서의 펩타이드 펄스된 EL4A2Kb 종양 세포(1 x 104개 세포/웰)로 제한 희석 분석을 실시하여 P1S#10-특이적 CTL 주를 클로닝한다. 14일째, 세포를 상기한 바와 같이 재자극시킨다. 21일째, 생존한 콜로니를 분리하고, 배양물에 그대로 유지시킨다. 도 5에 도시된 같이, 이들 클론 중 5개는 P501S-형질도입된 Jurkat A2Kb 표적에 대한 특이적 세포용해 반응성을 입증한다. 이러한 데이터는 P1S#10이 사람 HLA-A2.1 분자에 대해 발현되는 P501S 단백질의 천연적으로 프로세싱된 에피토프를 나타냄을 가리킨다.
실시예 7
전립선 항원으로의 나출형 DNA 면역화를 이용한 생체내 CTL의 프라이밍
상기한 바와 같은 전립선-특이적 항원 L1-12는 또한 P501S로 칭한다. HLA A2Kb Tg 마우스(제공자: Dr L. Sherman, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)에 벡터 VR1012내에서 100㎍ P501S를 근육내 또는 경피로 면역화시킨다.마우스는 2주 간격으로 3회 면역화시킨다. 최종 면역화 후 2주 경과하여 면역 비장 세포를 Jurkat A2Kb-P501S 형질도입된 자극제 세포와 배양한다. CTL 주를 매주 자극시킨다. 시험관내 자극의 2주 후 P501S 형질도입된 표적에 대한 CTL 활성을 평가한다. 8마리 마우스 중 2마리는 강력한 항-P501S CTL 반응을 나타냈다. 이들 결과는 P501S가 하나 이상의 천연적으로 프로세싱된 A2-제한된 CTL 에피토프를 함유함을 증명한다.
실시예 8
전립선-특이적 폴리펩타이드를 인식하는 사람 세포의 능력
본 실시예는 전립선 종양 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포가 사람 종양을 인식하는 능력을 예시한다.
문헌[참조: Van Tsai et al., Critical Reviews in Immunology 18:65-75, 1998]의 프로토콜에 따라 수지상 세포를 사용하여, P502S(또한, J1-17로 칭함)로부터 유도된 P2S-12 펩타이드(서열 306)에 사람 CD8+T 세포를 시험관내에서 프라이밍시킨다. γ-인터페론 ELISPOT 검정[참조: Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997]에서 자가 섬유아세포 또는 P502S 유전자를 발현하도록 형질도입된 섬유아세포에 의해 제공된 P2S-12 펩타이드를 인식할 수 있는 능력에 대해 생성된 CD8+T 세포 미세배양물을 시험한다. 간단히 설명하면, 3㎍/ml 사람 β2-마이크로글로불린 및 1㎍/ml P2S-12 펩타이드 또는 대조 E75 펩타이드의 존재하에 104개 섬유아세포에 대해 중복하여 T 세포의 적정 수를 검정한다. 또한, 동시에 P502 유전자가 형질도입된 자가 섬유아세포 또는 대조군으로서 HER-2/neu가 형질도입된 섬유아세포에 대해 T 세포를 검정한다. 검정하기 전에, 섬유아세포를 10ng/ml γ-인터페론으로 48시간 동안 처리하여 I부류 MHC 발현을 상향조절한다. 미세배양물 중 하나(#5)는 γ-인터페론 ELISPOT 검정에서 펩타이드 펄스된 섬유아세포뿐만 아니라, 형질도입된 섬유아세포의 강력한 인식을 입증한다. 도 2A는 P2S-12 펩타이드(검정 막대)로 펄스된 섬유아세포상에 T 세포 수가 증가하면서 γ-인터페론 점의 수가 상당히 증가하였으나 대조 E75 펩타이드(흰색 막대)로는 그렇지 않았음을 증명한다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 당해 미세배양물은 또한 P502S 유전자를 발현하도록 형질도입된 섬유아세포상에 T 세포 수가 증가하면서 γ-인터페론 스폿의 수가 증가하였으나, HER-2/neu 유전자로는 그러하지 않았음을 증명한다. 이들 결과는 P2S-12 펩타이드가 P502S 단백질의 천연적으로 프로세싱된 에피토프라고 하는 확증을 추가로 제공한다. 또한, 이는 사람 T 세포 레퍼토리에서 이러한 에피토프를 인식할 수 있는 고친화성 T 세포가 존재함을 입증한다. 또한, 이들 세포는 P502S 유전자를 발현하는 사람 종양을 인식할 수 있어야 한다.
실시예 9
사람 혈액에서 전립선 항원-특이적 CTL 반응의 유발
본 실시예는 정상인의 혈액에서 전립선-특이적 항원이 CTL 반응을 유발하는 능력을 예시한다.
정상 공여자의 PBMC로부터 유도된 단핵세포 배양물을 10% 사람 혈청, 50ng/ml GMCSF 및 30ng/ml IL-4가 함유된 RPMI 배지 중에서 5일 동안 성장시킴으로써 자가 수지상 세포(DC)를 분화시킨다. 배양 후, DC를 5의 M.O.I.로 재조합 P501S-발현 백시니아 바이러스로 밤새 감염시키고, 2㎍/ml CD40 리간드를 첨가하여 8시간 동안 성숙시킨다. 바이러스를 UV 조사하여 불활성화시키고, 자기 비드를 사용한 양성 선별에 의해 CD8+세포를 분리한 다음, 배양물의 프라이밍을 24-웰 플레이트에서 개시한다. P501S 및 CD80을 발현시키기 위해 레트로바이러스에 의해 형질도입된 자가 섬유아세포로 5회 자극 사이클 후, 자가 P501S-형질도입된 섬유아세포로 자극되었을 때 특이적으로 인터페론-감마를 생성하는 CD8+ 주가 동정되었다. P501S로 형질도입된 자가 B-LCL에 추가의 자극 주기를 적용하여 세포주 3A-1의 P501S-특이적 활성을 유지할 수 있다. 주 3A-1은 세포독성 검정(51Cr 방출) 및 인터페론-감마 생성(인터페론-감마 Elispot; 상기 문헌 및 Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997 참조)으로 측정했을 때 P501S를 발현하도록 형질도입된 자가 B-LCL을 특이적으로 인식하지만, EGFP-형질도입된 자가 B-LCL은 인식하지 못하는 것으로 나타났다. 이들 검정의 결과는 도 6A 및 6B에 도시되어 있다.
실시예 10
전립선-특이적 항원 P703P내에 함유된 천연적으로 프로세싱된 CTL 에피토프의 동정
P703P 항원(또한, P20으로 칭함)으로부터 9-량체 펩타이드 p5(서열 338)를 유도한다. p5 펩타이드는 사람 HLA-A2 공여자에게서 면역원성이고 천연적으로 프로세싱된 에피토프이다. p5 펩타이드로 펄스된 단핵세포로 시험관내에서 반복적으로 자극시켜 항원 특이적 CD8+ T 세포를 프라이밍할 수 있다. 이들 CTL은 상기한 ELISPOT(상기한 바와 같음) 및 크롬 방출 검정에서 p5-펄스된 표적 세포를 특이적으로 인식한다. 추가로, p5로의 HLA-A2 형질전환 마우스의 면역화로 P703P를 발현시키는 각종 HLA-A2Kb 또는 HLA-A2 형질도입된 표적 세포를 인식하는 CTL 주가 생성된다.
p5가 천연적으로 프로세싱된 에피토프임을 입증하는 초기 연구는 HLA-A2Kb 형질전환 마우스를 사용하여 수행한다. HLA-A2 형질전환 마우스를 프로인트 불완전 애쥬번트 중의 B형 간염 바이러스 코어 펩타이드(Th 펩타이드) 140㎍과 함께 p5 펩타이드 100㎍을 피하로 면역화시킨다. 접종 후 3주 경과하여, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 펩타이드-펄스된 LPS 아세포로 시험관내에서 자극시킨다. CTL 활성은 초기 시험관내 자극 후 5일 경과하여 크롬 방출 검정에 의해 평가한다. 대조 항원 P703P 및 HLA-A2Kb를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된 세포를 표적으로서 사용한다. p5-펄스된 표적뿐만 아니라 P703P-발현 표적을 모두 특이적으로 인식한 CTL 주가 동정되었다.
사람 시험관내 프라이밍 실험은 p5 펩타이드가 사람에게서 면역원성임을 증명한다. 정상인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단핵세포 배양물을 10% 사람 혈청,50ng/ml 사람 GM-CSF 및 30ng/ml 사람 IL-4가 함유된 RPMI 배지에서 5일 동안 배양함으로써 수지상 세포(DC)를 분화시킨다. 배양 후, DC를 1㎍/ml p5 펩타이드로 펄스시키고, CD8+ T 세포 풍부한 PBMC와 함께 배양한다. CTL 주를 p5-펄스된 단핵세포로 주단위로 재자극시킨다. CTL의 배양 개시 후 5 내지 6주 경과하여 p5-펄스된 표적 세포의 CTL 인식이 입증되었다. 또한, CTL은 형질도입된 사람 세포를 인식하여 P703P를 발현시키는 것으로 나타나며, 이는 p5가 천연적으로 프로세싱된 에피토프임을 입증한다.
HLA II부류와 관련하여 세포의 표면 상에서 CD4 T 세포에 의해 인식될 수 있는 전립선 종양-특이적 항원 P703P로부터 유래된 추가의 펩타이드 에피토프(펩타이드 4로 칭함)을 동정하는 연구를 하기와 같이 수행한다. 펩타이드 4에 대한 아미노산 서열은 서열 638에 제시되어 있고, 상응하는 cDNA 서열은 서열 639에 제시되어 있다.
10개의 아미노산이 중첩되고 P703P의 카복시-말단 단편으로부터 유래된 20개의 15-량체 펩타이드를 표준 절차를 이용하여 생성시킨다. 수지상 세포(DC)를 표준 프로토콜에 의해 GM-CSF 및 IL-4를 이용하여 정상 여성 공여자의 PBMC로부터 유도한다. CD4 T 세포는 MACS 비드 및 네가티브 선택을 이용하여 DC와 동일한 공여자로부터 생성시킨다. DC를 각각의 펩타이드의 최종 농도가 0.25㎍/ml인 15-량체 펩타이드의 풀로 밤새 펄스시킨다. 펄스된 DC를 세척하고, 96-웰 V형 바닥 플레이트에 1 x 104개 세포/ㅞㄹ로 플레이팅시키고, 정제된 CD4 T 세포를 1 x 105개/웨레로 첨가한다. 배양물을 60ng/ml IL-6 및 10ng/ml IL-2로 보충하고, 37℃에서 배양한다. 배양물을 항원 제시 세포로서 상기한 바와 같이 생성되고 펄스된 DC를 사용하여 매주 단위로 상기한 바와 같이 재자극시키고, 5ng/ml IL-7 및 10u/ml IL-2로 보충한다. 4회의 시험관내 자극 사이클 후, 96개 주(각각의 주는 하나의 웰에 해당함)를 대조군으로서 사용된 맘마글로빈으로부터 유래된 펩타이드의 무관한 풀로 자극된 풀에 반응한 특이적 증식 및 사이토킨 생성에 대해 시험한다.
특정한 주(1-F9로 칭함)를 P703P 펩타이드의 풀 #1에 반응한 특이적 증식(3H 증식 검정법에 의해 측정) 및 사이토킨 생성(인터페론-감마 ELISA 검정법에 의해 측정)을 입증하는 풀 #1로부터 동정한다. 당해 주를 추가로 펩타이드 풀의 특이적 인식, 풀 중의 각각의 펩타이드의 특이적 인식에 대해, 및 관련된 제한 대립유전자를 동정하는 HLA 부정합 분석으로 시험한다. 주 1-F9는 펩타이드 풀 #1, 및 또한 펩타이드 4(서열 638)에 반응하여 특이적으로 증식하고 인터페론-감마를 생성시킨다. 펩타이드 4는 서열 327의 아미노산 126-140번에 상응한다. 펩타이드 적정 실험을 수행하여, 특이적 펩타이드에 대한 주 1-F9의 감수성을 평가한다. 당해 주는 0.25ng/ml만큼 낮은 농도에서 펩타이드에 특이적으로 반응하는 것으로 밝혀졌고, 이는 T 세포가 매우 민감하고, 따라서 에피토프에 대해 고도의 친화성을 가질 것임을 지시한다.
P703P 반응의 HLA 제한을 결정하기 위해, 사용된 공여자와 부분적으로 정합되어 T 세포를 생성시키는 항원 제시 세포(APC)의 패널을 생성시킨다. APC를 펩타이드로 펄스시키고, 주 1-F9와 함께 증식 및 사이토킨 검정법에서 사용한다. HLA-DRB0701 및 HLA-DQB02 대립유전자에서 공여자와 정합되는 APC는 T 세포에 대한 펩타이드를 제공할 수 있으며, 이는 P703P-특이적 반응이 이들 대립유전자 중의 하나에 제한됨을 지시한다.
항체 차단 검정법을 이용하여, 제한 대립유전자가 HLA-DRB0701 또는 HLA-DQB02인지를 결정한다. 항-HLA-DR 차단 항체 L243 또는 무관한 아이소타입 정합된 IgG2a를 T 세포 및 250ng/ml에서 펩타이드 RMPTVLQCVNVSVVS(서열 638)로 펄스된 APC 배양물에 첨가한다. 표준 인터페론-감마 및 증식 검정법을 수행한다. 대조 항체가 펩타이드-펄스된 APC를 인식하는 T 세포의 능력에 영향을 미치지 않음에도 불구하고, 양쪽 검정법에서 항-HLA-DR 항체는 펩타이드-펄스된 APC를 특이적으로 인식하는 T 세포의 능력을 완전히 차단한다.
펩타이드 에피토프 RMPTVLQCVNVSVVS(서열 638)가 천연적으로 프로세싱되었는지를 결정하기 위해, 재조합 P703P 단백질로 펄스된 APC를 인식하는 주 1-F9의 능력을 조사한다. 이들 실험을 위해, 다수의 재조합 P703P 공급원을 사용한다; 이. 콜라이-유래된 P703P, 피키아(Pichia)-유래된 P703P 및 바큘로바이러스-유래된 P703P. 사용된 무관한 단백질 대조군은 이. 콜라이-유래된 L3E 폐-특이적 항원 및 바큘로바이러스-유도된 맘마글로빈이다. 인터페론-감마 ELISA 검정법에 있어서, 주 1-F9는 P703P의 양 이. 콜라이 형태뿐반 아니라, 피키아-유래된 재조합 P703P를 효율적으로 인식할 수 있는 반면, 바큘로바이러스-유도된 P703P는 보다 덜 효율적으로 인식한다. 후속적인 웨스턴 블롯 분석으로 이. 콜라이 및 피키아 P703P 단백질 제제는 온전한 반면, 바큘로바이러스 P703P 제제는 약 75% 분해되는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, P703P로부터의 펩타이드 RMPTVLQCVNVSVVS(서열 638)는 P703P로부터 유래된 천연적으로 프로세싱된 펩타이드 에피토프이고, HLA-DRB-0701과 관련하여 T 세포를 제시한다.
추가의 연구에 있어서, 10개의 아미노산이 중첩되고 P703P의 N-말단 단편으로부터 유래된 24개의 15-량체 펩타이드(서열 525의 아미노산 27-152에 상응함)를 표준 절차에 의해 생성시키고, CD4 세포에 의해 인식되는 이들의 능력을 실질적으로 상기한 바와 같이 결정한다. DC를 각각의 펩타이드의 최종 농도가 10㎍/ml인 15-량체 펩타이드의 풀로 밤새 펄스시킨다. 다수의 각각의 CD4 T 세포주(65/480)가 P793P 펩타이드 풀에 반응하여 상당히 증식하고 사이토킨 방출(IFN-감마)시키나, 대조군 펩타이드 풀에 대해서는 반응하지 않음이 입증되었다. 특이적 활성을 나타낸 CD4 T 세포주를 P703P 펩타이드의 적합한 풀 상에서 재자극시키고, 각각의 풀의 각각의 펩타이드 상에서 재검정할 뿐만 아니라, 당해 펩타이드는 IFN-감마 방출 검정법 및 증식 검정법에서 펩타이드의 풀의 적정을 한다.
16개의 면역원성 펩타이드를 시험된 펩타이드 항원의 전체 세트로부터 T 세포에 의해 인식한다. 이들 펩타이드의 아미노산 서열은 서열 656-671에 제시되어 있고, 상응하느 cDNA는 서열 640-655에 각가 제시되어 있다. 특정한 경우에, T 세포주의 펩타이드 반응성은 단일 펩타이드에 맵핑시킬 수 있으나, 몇몇은 각각의 풀에서 하나 이상의 펩타이드에 맵핑시킬 수 있다. 펩타이드에 대해 적당한 친화성을 갖는 각각의 펩타이드 풀로부터 전형적인 인식 패턴을 나타내는 상기 CD4 T 세포주를 추가의 분석을 위해 선택한다(I-1A, -6A; II-4C, -5E; III-6E, IV-4B, -3F,-9B, -10F, V-5B, -4D 및 -10F). 이들 CD4 T 세포주를 적합한 각각의 펩타이드 상에서 재자극시키고, 이. 콜라이내에서 제조된 재조합 P703P 단백질의 절단된 형태(서열 525의 아미노산 96-254번), 바큘로바이러스 발현 시스템에서 제조된 전체 길이 P703P, 및 인플루엔자 바이러스 NS1 및 P703P 사이의 융합물로 펄스된 자가 DC 상에서 재검정한다. 시험된 T 세포주 중에서, 주 I-1A는 P703P(이. 콜라이)의 절단된 형태를 특이적으로 인식하나, P703P의 다른 재조합 형태는 인식하지 않는다. 이러한 주는 또한 사용된 펩타이드를 인식하여, T 세포를 유도한다. 주 2-4C는 P703P(이. 콜라이)의 절단된 형태를 인식하고, 바큘로바이러스에서 제조된 P703P의 전체 길이 형태뿐만 아니라, 펩타이드를 인식한다. 시험된 나머지 T세포주는 단지 (II-5E, II-6F, IV-4B, IV-3F, IV-9B, IV-10F, V-5B 및 V-4D) 펩타이드-특이적이거나 임의의 시험된 항원(V-10F)에 비반응성이다. 이들 결과는 T 세포주 I-1A에 의해 인식되는 펩타이드 서열 RPLLANDLMLIKLDE(서열 671; 서열 525의 아미노산 110-124에 상응함), 및 T 세포주 II-4C에 의해 인식되는 펩타이드 서열 SVSESDTIRSISIAS(서열 668; 서열 525의 125-139번에 상응함) 및 ISIASQCPTAGNSCL(서열 667; 서열 525의 아미노산 135-149번에 상응함)이 P703P 단백질의 천연적으로 프로세싱된 에피토프일 수 있음을 입증한다.
실시예 11
전립선에서 유방 종양-유도된 항원의 발현
차등 디스플레이에 의해 유방 종양으로부터 항원 B305D를 분리하는 것이1996년 8월 20일에 출원된 미국 특허원 제08/700,014호에 기술되어 있다. 이러한 항원의 상이한 수개 스플라이스 형태가 분리되었다. 이들 스플라이스 형태에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 366-375에 제시되어 있고, 서열 292, 298 및 301-303의 서열에 상응하는 추정 아미노산 서열은 각각 서열 299-306에 각각 제시되어 있다. 추가의 연구에 있어서, 오픈 리딩 프레임에서 프레임쉬프트를 유도하는 위치 884에 위치하는 추가의 구아닌 잔기(서열 530)를 함유하는 것으로 밝혀진 서열 366의 cDNA 서열의 스플라이스 변이체가 분리된다. 이러한 ORF의 결정된 DNA 서열은 서열 531에 제시되어 있다. 이러한 프레임쉬프트는 B305D의 다른 이소형태와 공통적이나 N-말단 영역에서는 상이한 C-말단 영역을 함유하는 293개 아미노산의 단백질 서열(서열 532에 제시되어 있음)을 생성시킨다.
각종 종양 및 정상 조직에서의 B305D의 발현 수준을 실시간 PCR 및 노던 분석으로 조사한다. 이러한 결과는 B305D가 유방 종양, 전립선 종양, 정상 전립선 종양 및 정상 고환에서 고도로 발현되는 한편, 기타 모든 피검 조직(결장 종양, 폐 종양, 난소 종양 및 정상 골수, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 피부, 소장, 위)에서는 낮게 또는 검출할 수 없을 정도로 발현됨을 지시한다. 전립선 종양의 패널 상에서 실시간 PCR을 이용하여, 전립선 종양에서의 B305D의 발현이 증가하는 글리슨 등급을 가지면서 증가하는 것으로 밝혀졌고, 이는 B305D의 발현이 전립선 암 진행에 따라 증가함을 입증한다.
실시예 12
전체 유전자 프라이밍 및 전립선-특이적 항원 P501S를 사용한 자극 기술을 이용한 시험관내에서의 사람 CTL의 생성
P501S-백시니아 감염된 DC를 사용한 시험관내 전체 유전자 프라이밍[참조예: Yee et al., The Journal of Immunology, 157(9):4079-86, 1996]을 이용하여, 상기한 바와 같이 인터페론-γ ELISPOT 분석으로 결정했을 때 P501S(또한, L1-12로도 공지되어 있음)로 형질도입된 자가 섬유아세포를 특이적으로 인식하는 사람 CTL 주를 유도한다. P501S로 형질도입된 HLA-부정합 B-LCL 주의 패널을 사용할 경우 이들 CTL 주가 제한된 HLAB I부류 대립유전자에 제한될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로는, 정상인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단핵세포 배양물을 10% 사람 혈청, 50ng/ml 사람 GM-CSF 및 30ng/ml 사람 IL-4가 함유된 RPMI 배지에서 5일 동안 성장시킴으로써 수지상 세포(DC)를 분화시켰다. 배양 후, DC를 재조합 P501S 백시니아 바이러스로 5의 감염 다중도(M.O.I)로 밤새 감염시키고, 3㎍/ml CD40 리간드를 첨가하여 밤새 성숙시킨다. 바이러스를 UV 조사하여 불활성화시킨다. 자기 비드 시스템을 사용하여 CD8+ T 세포를 분리하고, 표준 배양 기술을 사용하여 배양물의 프라이밍를 개시한다. 레트로바이러스에 의해 P501S 및 CD80으로 형질도입된 자가 원시 섬유아세포를 사용하여 배양물을 매 7 내지 10일마다 재자극시킨다. 4회 자극 사이클 후, P501S 및 CD80-형질도입된 자가 섬유아세포로 자극시킬 경우에 인터페론-γ를 특이적으로 생성하는 CD8+ T 세포주가 동정되었다. P501S로 형질도입된 HLA-부정합 B-LCL 주의 패널을 생성시켜, 반응의 제한 대립유전자를 제한한다. ELISPOT 검정에서 인터페론-γ를 측정함으로써, P501S 특이적 반응이 HLA B 대립유전자에 의해 제한되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 P501S에 대한 CD8+ CTL 반응이 유도될 수 있을 입증한다.
인식된 에피토프(들)을 동정하기 위해, P501S를 암호화하는 cDNA를 각종 제한 분해물에 의해 분획화시키고, 레트로바이러스 발현 발현 벡터 pBIB-KS로 서브클로닝시킨다. 레트로바이러스 상등액을 헬퍼 팩키징 주 Phoenix-Ampho의 형질감염에 의해 생성시킨다. 다음, 상등액을 사용하여, CTL 스크리닝을 위해 Jurkat/A2Kb 세포를 형질도입시킨다. CTL을 P501S 단편의 "라이브러리"로 형질도입된 상기 A2Kb 표적에 대한 IFN-감마 ELISPOT 검정법으로 스크리닝시킨다. 초기 양성 단편 P501S/H3 및 P501S/F2를 서열분석하여, 서열 113의 아미노산 106-553번 및 아미노산 136-547번을 각각 암호화함을 밝혀내었다. H3을 절단하여, 서열 113의 아미노산 잔기 106-351을 암호화하며, 이는 CTL을 자극시킬 수 없으며, 따라서 아미노산 잔기 351-547번에 대한 에피토프를 국재화시킨다. 아미노산 1-472번을 암호화하는 추가의 단편(단편 A) 및 아미노산 잔기 1-351번을 암호화하는 단편(단편 B)을 또한 작제한다. 단편 B는 CTL을 자극시키지 않으나, 단편 A는 CTL을 자극시켜, 아미노산 잔기 351-472번에 대한 에피토프를 국재화시킨다. 상기 영역을 제시하는 20-량체 및 18-량체 펩타이드의 중첩을 Jurkat/A2Kb 세포 대 CTL을 IFN-감마 검정으로 펄스시킴으로써 시험한다. 단지 펩타이드 P501S-369(20) 및 P501S-369(18)만이 CTL을 자극시킨다. 상기 영역을 제시하는 9-량체 및 10-량체 펩타이드를 합성하고, 유사하게 시험한다. 펩타이드P501S-370(서열 539)은 강력한 반응을 제공하는최소 9-량체이다. 펩타이드 P501S-376(서열 540)은 또한 약한 반응을 제공하고, 이는 당해 펩타이드가 교차-반응성 에피토프를 나타낼 수 있음을 암시한다.
후속적인 연구에 있어서, P501S로 형질도입된 원시 사람 B 세포의 MHC I부류-제한된, P501S-특이적, 자가 CD8 T 세포를 프라이밍하는 능력을 조사한다. 원시 B 세포는 CD40 리간드 및 IL-4에서 배양함으로써 동형접합 HLA-A2 공여자의 PBMC로부터 유도하고, 벡터 pBIB에서 재조합 P501S로 고빈도로 형질도입하고, 블라스토시딘-S로 선택한다. 시험관내 프라이밍을 위해, 정제된 CD8+ T 세포를 자가 CD40 리간드 + IL-4 유도된, P501S-형질도입된 B 세포와 함께 96-웰 미세배양 포맷으로 배양한다. 이들 CTL 미세배양물을 P501S-형질도입된 B 세포로 재자극시킨 다음, 특이성에 대해 검정한다. 이들 초기 스크리닝 후, 백그라운드를 초과하는 유의한 시그널을 갖는 미세배양물을 자가 EBV-형질전환된 B 세포(BLCL) 상에서 클로닝시킨 다음, 또한 P501S로 형질도입시킨다. 검출을 위해 IFN-감마 ELISPOT을 사용하여, 수개의 상기 CD8 T 세포 클론이 BLCL/P501S에 대한 반응성에 의해 입증된 바와 같이 P501S에 특이적이나, 대조 항원으로 형질도입된 BLCL에 대해서는 아닌 것으로 밝혀내었다. 추가로 항-P501S CD8 T 세포 특이성이 HLA-A2-제한적이라는 것이 입증되었다. 먼저, 항-HLA-A,B,C 모노클로날 항체(W6.32), 항-HLA-B,C 모노클로날 항체(B1.23.2) 및 대조 모노클로날 항체를 사용한 항체 차단 실험은 단지 항-HLA-A,B,C 항체만이 P501S-발현 자가 BLCL의 인식을 차단하는 것으로 밝혀내었다. 두번째로, 항-P501S CTL은 또한 P501S로 형질도입된 HLA-A2 부정합된 이종 BLCL를 인식하나, 상응하는 EGFP 형질도입된 대조 BLCL을 인식하지 않는다.
P501S의 천연적으로 프로세싱된 CD8, I부류-제한된 펩타이드 에피토프는 다음과 같이 동정한다. 수지상 세포(DC)를 Percol 구배, 이어서 차등 부착에 의해 분리하고, 1% 사람 혈정, 50ng/ml GM-CSF 및 30ng/ml IL-4를 함유하는 RPMI 배지의 존재하에 5일 동안 배양한다. 배양 후, DC를 P501S-발현 아데노바이러스로 10의 MOI에서 24시간 동안 감염시키고, 2ug/ml CD40 리간드의 첨가에 의해 추가 24시간 동안 성숙시킨다. CD8 세포를 자기 비드를 사용한 PBMC로부터의 CD4+, CD14+ 및 CD16+ 집단의 공제에 의해 농축시킨다. 10% 사람 혈청, 5ng/ml IL-12 및 10ng/ml IL-6을 함유하는 RPMI를 포함하는 96-웰 V-바닥 플레이트에 웰당 10,000개 P501S-발현 DC 및 100,000개 CD8+ T 세포를 함유하는 프라이밍 배양물을 배치한다. 배양물을 P501S 및 CD80을 발현시키도록 레트로바이러스로 형질도입된 자가 섬유아세포를 사용하여 매 7일마다 자극시키고, IFN-감마로 48 내지 72시간 동안 처리하여, MHC I부류 발현을 상향조절한다. 10u/ml IL-2를 자극시 및 자극 후 2일 및 5일째에 첨가한다. 4회 첨가 사이클 후, 1개의 P501S-특이적 CD8+ T 세포주(2A2로 칭함)는 γ-INF Elispot 검정법에서 IFN-감마-처리된 P501S/CD80 발현 자가 섬유아세포에 반응하나, IFN-감마-처리된 P703/CD80 발현 자가 섬유아세포에는 반응하지 않는 IFN-감마를 생성하는 것으로 동정되었다. 12개의 클론이 형질도입된 섬유아세포에서 강한 P501S 특이성을 나타내는 것으로 동정되었다.
형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting) 분석을 각각 PercP, FITC 및 PE에 접합된 CD3-, CD4- 및 CD8-특이적 항체를 사용하여 P501S-특이적 클론 상에서 수행한다. 프라이밍 배양물 중의 CD8 풍부한 T 세포의사용과 양립하여, P501S-특이적 클론은 CD3+, CD8+ 및 CD4-인 것으로 결정되었다.
P501S 특이적 CTL에 의해 인식된 관련된 P501S 에피토프를 동정하기 위해, P501S의 아미노산 서열의 대부분을 포함하는 18-20-량체 또는 30-량체 펩타이드의 풀을 자가 B-LCL 상에 로딩시키고, 4E5 및 4E7로 불리는 2개의 P501S-특이적 CTL 클론을 자극시키는 능력에 대해 γ-IFN Elispot으로 시험한다. P501S의 아미노산 411-486번(서열 113)을 포함하는 5개의 18-20-량체 펩타이드로 이루어진 하나의 풀을 양쪽 P501S-특이적 클론에 의해 인식되는 것으로 밝혀졌다. 상기 클론에 의해 인식되는 특이적 18-20-량체 펩타이드를 동정하기 위해, 양성 풀을 포함하는 18-20-량체 펩타이드 각각을 2개의 P501S-특이적 CTL 클론, 4E5 및 4E7을 자극시키는 능력에 대해 γ-IFN Elispot으로 각각 시험한다. 2개의 4E5 및 4E7은 P501S의 아미노산 453-472번을 포함하는 하나의 20-량체 펩타이드(서열 710; 서열 711에 제시되어 있는 cDNA)를 특이적으로 인식한다. CD8+ T 세포에 의해 인식되는 최소 에피토프는 거의 항상 9 또는 10-량체 펩타이드 서열이기 때문에, 서열 710의 전체 서열을 포함하는 10-량체 펩타이드를 1개 아미노산이 상이하도록 합성한다. 이들 10-량체 펩타이드 각각을 2개의 P501S-특이적 클론(1D5 및 1E12로 칭함)을 자극시키는 능력에 대해 시험한다. 하나의 10-량체 펩타이드(서열 712; 서열 713에 제시되어 있는 cDNA 서열)는 P501S-특이적 클론을 특이적으로 자극시키는 것으로 동정되었다. 당해 에피토프는 P501S의 아미노산 463-472번을 포함한다. 이들 서열은 천연적으로 프로세싱되고 CTL 반응이 정상 PBMC에서 동정될 수 있는 P501S로부터의 최소 10-량체 에피토프를 제한한다. 이와 같이, 당해 에피토프는 백신 잔기, 및전립선 암에 대한 치료 및/또는 진단 시약으로서 사용하기 위한 후보이다.
서열 712의 P501S-유도된 서열에 대한 I부류 제한 인자를 동정하기 위해, HLA 차단 및 부정합 분석을 수행한다. γ-IFN Elispot 검정에서, P501S-형질도입된 자가 섬유아세포에 대한 클론 4A7 및 4E5의 특이적 반응을 25ug/ml W6/32(팬-I부류 차단 항체) 및 B1.23.2(HLA-B/C 차단 항체)와 함께 예비배양함으로써 차단한다. 이들 결과는 서열 712-특이적 반응이 HLA-B 또는 HLA-C 대립유전자에 제한됨을 입증한다.
HLA 부정합 분석의 경우, HLAB51 대립유전자를 공유하는 자가 B-LCL(HLA-A1,A2,B8,B51, Cw1, Cw7) 및 이종 B-LCL(HLA0A2,A3,B18,B51,Cw5,Cw14)를 서열 712의 펩타이드 20ug/ml로 1시간 동안 펄스시키고, 세척하고, 클론 4A7 및 4E5를 자극시키는 능력에 대해 γ-IFN Elispot 검정으로 시험한다. B1.23.2(HLA-B/C 차단 항체)를 사용한 항체 차단 검정을 또한 수행한다. 서열 712-특이적 반응을 자가(DC326) 이종(D107) B-LCL 둘 다를 사용하여 검출하고, 또한 반응을 B1.23.2 HLA-B/C 차단 항체 25ug/ml로 예비배양함으로써 차단한다. 이들 결과는 함께 서열 712의 펩타이드에 대한 P501S-특이적 반응이 HLA-B51 I형 대립유전자에 제한됨을 입증한다. D3326으로부터의 HLA-B51 대립유전자의 분자 클로닝 및 서열 분석으로 D326의 HLA-B51 서브타입이 HLA-B51011임이 밝혀졌다.
서열 172의 10-량체 P501S-유도된 에피토프를 기재로 하여, 서열 714 및 715의 서열을 갖는 2개의 9-량체를 합성하고, 주 2A2으로부터 유도된 2개의 P501S-특이적 CTL 클론을 자극시키는 능력에 대해 Elispot 검정으로 시험한다. 서열 712의10-량체 펩타이드뿐만 아니라, 서열 715의 9-량체 펩타이드는 P501S-특이적 CTL을 자극시켜, IFN-감마를 생성할 수 있으나, 서열 714의 9-량체는 그러하지 않다. 이들 결과는 서열 715의 펩타이드가 P501S-특이적 CTL에 의해 인식되는 P501S-유도된 에피토프임을 입증한다. 서열 715의 에피토프를 암호화하는 DNA 서열은 서열 716에 제시되어 있다.
서열 712 및 715의 P501S-유도된 펩타이드 특이적 반응에 대한 I부류 제한 대립유전자를 동정하기 위해, HLA B 및 C 대립유전자 각각을 시험관내 프라이밍 실험에서 사용된 공여자로부터 클로닝시킨다. 서열 분석으로 관련된 대립유전자가 HLA-B8, HLA-B51, HLA-Cw01 및 HLA-Cw07임이 밝혀졌다. 이들 대립유전자 각각을 발현 벡터내로 서브클로닝시키고, P501S 유전자와 함께 VA-13 세포내로 형질감염시킨다. 다음, 형질감염된 VA-13 세포를 ELISPOT 검정으로 P501S-특이적 CTL을 특이적으로 자극시키는 능력에 대해 시험한다. P501S 및 HLA-B51로 형질감염된 VA-13 세포는 P501S-특이적 CTL을 자극시켜, 감마-IFN을 분비할 수 있다. HLA-B51 단독으로 또는 P501S + 다른 HLA-대립유전자로 형질감염된 VA-13 세포는 P501S-특이적 CTL을 자극시킬 수 없다. 이들 결과는 P501S-특이적 반응에 대한 제한 대립유전자가 HLAB51 대립유전자임을 입증한다. 서열 분석으로 관련된 제한 대립유전자의 서브타입이 HLA-B51011임이 밝혀졌다.
P501S-특이적 CTL이 P501S를 발현시키는 전립선 종양 세포를 인식할 수 있는지를 결정하기 위해, P501S-양성주 LnCAP 및 CRL2422(둘 다 P501S mRNA 및 단백질의 "중간" 양을 발현시킴), 및 PC-3(P501S mRNA 및 단백질의 적은 양을 발현시킴),이와 함께 P501S-음성 세포주 DU-145를 사용된 공여자로부터 클로닝된 HLA-B51011 대립유전자로 레트로바이러스에 의해 형질도입시켜, P501S-특이적 CTL을 생성시킨다. HLA-B51011- 또는 EGFP-형질도입되고 선택된 종양 세포를 (자극 기능 및 P501S를 각각 상향조절하기 위해) 감마-인터페론 및 안드로겐으로 처리하여, P501S-특이적 CTL 클론 4E5 및 4E7과 함께 감마-인터페론 Elispot 검정에서 사용한다. 미처리된 세포를 대조군으로서 사용한다.
4E5 및 4E7은 둘 다 HLA-B51011 대립유전자로 형질도입된 LnCAP 및 CRL2422 세포를 효율적으로 및 특이적으로 인식하나, EGFP로 형질도입된 동일한 세포주는 그러하지 않다. 또한, 상기 CTL 클론은 둘 다 HLA-B51011로 형질도입된 PC-3을 특이적으로 인식하나, P501S-음성 종양 세포주 DU-145는 그러하지 않다. 감마-인터페론 또는 안드로겐으로의 처리는 종양 세포를 인식하는 CTL의 능력을 증강시키지 않는다. 이들 결과는 시험관내 전체 유전자 프라이밍에 의해 생성된 P501S-특이적 CTL이 P501S를 발현시키는 전립선 종양 세포주를 특이적으로 및 효율적으로 인식함을 입증한다.
P501S의 천역적으로 프로세싱된 CD4 에피토프는 다음과 같이 동정한다.
P501S에 특이적인 CD4 세포를 하기와 같이 제조한다. P501S 유전자의 아미노 말단 부분(서열 113의 아미노산 1 내지 325번)의 약 50%를 포함하는 일련의 16개의 중첩된 펩타이드를 합성한다. 프라이밍을 위해, 펩타이드를 4개 펩타이드의 풀에 하하고, TNF-알파를 사용하여 수지상 세포(DC) 상에 4㎍/ml로 24시간 동안 펄스시킨다. 다음, DC를 세척하고, 96웰 U형 바닥 플레이트에서 음성적으로 선택된CD4+ T 세포와 혼합한다. 배양물을 펩타이드 풀로 로딩시킨 신선한 DC 상에서 매주 자극시킨다. 총 4회의 자극 사이클 후에, 세포를 추가의 1주 동안 정치시키고, γ-IFN ELISA 및 증식 검정법을 이용하여 펩타이드 풀로 펄스된 PC에 대한 특이성에 대해 시험한다. 이들 검정법을 위해, 4ug/ml의 관련된 펩타이드 풀 또는 ㎍/ml의 무관한 펩타이드로 로딩시킨 부착 단핵세포를 APC로서 사용한다. 다음, 특이적 사이토킨 분비 또는 증식이 입증된 T 세포주를 풀내에 존재하는 각각의 펩타이드의 인식에 대해 시험한다. T 세포주를 이들 세포로부터 각각의 펩타이드를 인식하는 풀 A 및 B로부터 동정할 수 있다.
풀 A로부터, 주 AD9 및 AE10은 펩타이드 1(서열 719)을 특이적으로 인식하고, 주 AF5는 펩타이드 39(서열 718)를 인식한다. 풀 B로부터, 펩타이드 58(서열 7171)을 인식하는 주 BC6을 동정할 수 있다. 이들 주 각각을 특이적 펩타이드 상에서 자극시키고, 적정 검정법에서 펩타이드뿐만 아니라, P501S 또는 무관한 항원을 발현시키는 아데노바이러스로의 HEK 293 세포의 감엽에 의해 생성된 세포 용해물의 특이적 인식에 대해 시험한다. 이들 검정법을 위해, PC-부착 단핵세포를 10, 1 또는 0.1㎍/ml 개별적 P501S펩타이드로 펄스시키고, DC를 아데노바이르서에 의해 감염된 세포 용해물의 1:5 희석액으로 밤새 희석시킨다. 주 AD9, AE10 및 AF5는 관련된 P501S-유도된 펩타이드의 유의한 인식을 0.1mg/ml에서도 유지시킨다. 또한, 주 AD9는 아데노바이러스-P501S 감염된 세포로부터의 용해물에 대해 유의한(8.1배 자극 지수) 특이적 활성을 나타낸다. 이들 결과는 고친화성 CD4 T세포주가 P501S-유도된 에피토프에 대해 생성될 수 있고, 이들 T 세포의 하나 이상의서브세트가 서열 719의 P501S 유도된 서열에 특이적이고 사람 세포에 의해 천연적으로 프로세싱된 에피토프에 대해 특이적임을 입증한다. 서열 717-719의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열은 서열 720-722에 각각 제시되어 있다.
AD9의 P501S-특이적 활성을 추가로 특성화하기 위해, 상기 세포주를 항-CD3을 사용하여 클로닝시킨다. 1A1, 1A9 및 1F5로 불리는 3개의 클론이 P501S-1 펩타이드(서열 719)에 대해 특이적인 것으로 동정되었다. P501S-특이적 반응에 대한 HLA 제한 대립유전자를 결정하기 위해, 상기 클론의 각각을 증식을 이용하는 II형 항체 차단 및 HLA 부정합 검정법 및 감마-인터페론 검정법으로 시험한다. 항체 차단 검정법 및 감마-인터페론 생성을 측정함을 사용하는 ELISA 검정법에서, 펩타이드 펄스된 APC를 인식하는 모든 3개 클론의 능력은 팬-II부류 차단 항체 또는 HLA-DR 차단 항체와의 공배양에 의해 특이적으로 차단되나, HLA-DQ 또는 무관한 항체와의 공배양에 의해서는 차단되지 않는다. 동일한 세포를 사용하여 동시에 수행된 증식 검정법이 이들 결과를 확증한다. 이들 데이터는 상기 클론의 P501S-특이적 반응이 HLA-DR 대립유전자에 의해 제한됨을 지시한다. 추가의 연구는 P501S-특이적 반응에 대한 제한 대립유전자가 HLA-DRB1501임을 입증한다.
실시예 13
마이크로어레이 분석에 의한 전립선-특이적 항원의 동정
본 실시예는 전립선 종양 cDNA 라이브러리로부터 특정한 전립선-특이적 폴리펩타이드를 분리하는 방법을 기술할 것이다.
상기한 바와 같이 사람의 전립선 종양 cDNA 발현 라이브러리를 마이크로어레이 분석으로 스크리닝하여, 비전립선 정상 조직(고환은 포함하지 않음)과 비교시 전립선 종양 및/또는 정상 전립선 조직에서 3배 이상 과발현되는 클론을 확인한다. 372개의 클론이 확인되었고, 319개가 성공적으로 서열분석되었다. 표 I은 서열 385 내지 400으로 나타낸 이들 클론들을 요약한 것이다. 이들중에서 서열 386, 389, 390 및 392는 신규한 유전자이고, 서열 393 및 396은 이전에 동정된 서열이다. 표 I에 나타낸 바와 같이 다른 서열(서열 385, 387, 388, 391, 394, 395 및 397 내지 400)은 공지된 서열이다.
| 공지된 유전자 | 이전에 동정된 유전자 | 신규한 유전자 |
| T 세포 감마 쇄 | P504S | 23379(서열 389) |
| 칼리크레인 | P1000C | 23399(서열 392) |
| 벡터 | P501S | 23320(서열 386) |
| CGI-82 단백질 mRNA(23319; 서열 385) | P503S | 23381(서열 390) |
| PSA | P510S | |
| Ald. 6 Dehyd, | P784P | |
| L-이디톨-2-데하이드로게나제(23376; 서열 388) | P502S | |
| Ets 전사 인자 PDEF(22672; 서열 398) | P706P | |
| hTGR(22678; 서열 399) | 19142.2, bangur.seq(22621; 서열 396) | |
| KIAA1295(22685; 서열 400) | 5566.1 Wang(23404; 서열 393) | |
| 전립선산 포스파타제(22655; 서열 397) | P712P | |
| 트랜스글루타미나제(22611; 서열 395) | P778P | |
| HDLBP(23508; 서열 394) | ||
| CGI-69 단백질(23367; 서열 387) | ||
| KIAA0122(23383; 서열 391) | ||
| TEEG |
GCI-82는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 4.06배 과발현된것으로 나타났다. 이는 전립선 종양의 43%와 정상 전립선의 25%에서 과발현되었고 시험한 다른 정상 조직에서는 검출되지 않았다. L-이디톨-2-데하이드로게나제는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 4.94배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 90%와 정상 전립선의 100%에서 과발현되었고 시험한 다른 정상 조직에서는 검출되지 않았다. Ets 전사 인자 PDEF는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 5.55배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 47%와 정상 전립선의 25%에서 과발현되었고 시험한 다른 정상 조직에서는 검출되지 않았다. hTGR1은 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 9.11배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 63%에서 과발현되었고 정상 전립선을 포함한 시험한 다른 정상 조직에서는 발현 수준이 너무 낮아 검출할 수 없었다. KIAA0295는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 5.59배 과발현되었다. 이는 전립선 종양에서 47% 과발현되었고 정상 전립선 조직을 포함한 시험한 정상 조직에서는 검출할 수 없을만큼 낮았다. 전립선 산 포스파타제는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 9.14배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 67%와 정상 전립선의 50%에서 과발현되었고 시험한 다른 정상 조직에서는 검출되지 않았다. 트랜스글루타미나제는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 14.84배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 30%와 정상 전립선의 50%에서 과발현되었고 시험한 다른 정상 조직에서는 검출되지 않았다. 고밀도 지단백 결합 단백질(HDLBP)는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 28.06배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 97%와 정상 전립선의 75%에서 과발현되었고 시험한 다른 모든 정상 조직에서는 검출할 수없었다. GCI-69는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 3.56배 과발현되었다. 이는 양이 적은 유전자로 전립선 종양의 90% 이상과 정상 전립선의 75%에서 과발현되었다. 다른 정상 조직에서는 이 유전자의 발현이 매우 낮았다. KIAA0112는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 4.24배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 57%에서 과발현되었고 정상 전립선 조직을 포함한 시험한 다른 정상 조직에서는 검출할 수 없었다. 19142.2 뱅규어(bangur)는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 23.25배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 97%와 정상 전립선의 100%에서 과발현되었다. 시험한 다른 정상 조직에서는 검출할 수 없었다. 5566.1 왕(Wang)은 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 3.31배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 97%와 정상 전립선의 75%에서 과발현되었고, 또한 골수, 췌장 및 활성화된 PBMC에서 과발현되었다. 신규한 클론 23379(P553S로도 지칭함)는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 4.86배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 97%와 정상 전립선의 75%에서 검출할 수 있었고, 시험한 다른 정상 조직에서는 검출할 수 없었다. 신규한 클론 23399는 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 4.09배 과발현되었다. 이는 전립선 종양의 27%에서 과발현되었고, 정상 전립선 조직을 포함한 모든 정상 조직에서는 검출할 수 없었다. 신규한 클론 23320은 시험한 다른 정상 조직과 비교시 전립선 조직에서 3.15배 과발현되었다. 이는 모든 전립선 종양과 정상 전립선 조직의 50%에서 검출할 수 있었다. 이는 정상 결장 및 기도에서도 발현되었다. 다른 정상 조직은 이 유전자를 높은 수준으로 발현하지 않았다.
표준 기술을 사용하여 PRR3S상에서 실시한 후속적인 전체 길이 클로닝 연구로 이 클론이 P501S의 불완전 스플라이싱 형태임이 밝혀졌다. P553S의 4개의 스플라이스 변형체에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 623 내지 626으로 제공된다. 서열 626에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열 627로 제공된다. 서열 623의 cDNA 서열은 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 2개의 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열 628 및 629로 제공된다.
실시예 14
전자 공제에 의한 전립선-특이적 항원의 확인
본 실시예는 전자 공제 기술을 사용하여 전립선 특이적 항원을 확인하는 방법을 기술할 것이다.
GenBank 사람 EST 데이타베이스에 있는 잠재적인 전립선 특이적 유전자를 전자 공제에 의해 확인한다[참조 문헌: Vasmatizis et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:300-304, 1998]. 다양한 전립선 라이브러리로부터 유도된 EST 클론(43,482)의 서열은 GenBank 공개 사람 EST 데이타베이스로부터 입수한다. 각각의 전립선 EST 서열은 사람 EST 데이타베이스과 비교한 BLASTN(National Center for Biotechnology information) 조사에서 의문 서열로서 사용한다. 동일한 것으로 간주된 모든 일치 서열(일치 서열의 길이>100염기쌍, 동일한 일치서열의 밀도> 70%)을 한 집단중에 함께 모아둔다(정렬한다). 200개 이상의 EST를 포함한 집단은 반복 요소를 나타내거나 리보좀 단백질에 대해 높이 발현된 유전자일 수 있기 때문에 배제시킨다. 2개 이상의 집단이 공통의 EST를 공유하는 경우, 이들을 함께 모아 "슈퍼클러스터"을 만드는데, 그 결과 4,345개의 전립선 슈퍼클러스터가 형성되었다.
GenBank 공개 정보에 있는 479 사람 cDNA 라이브러리에 대한 기록을 내려받아 이들 cDNA 라이브러리 기록에 대한 데이타베이스를 만든다. 이들 479 cDNA 라이브러리는 3그룹으로 나눈다: 플러스(발현되는 것이 바람직한 정상 전립선 및 전립성 종양 라이브러리, 및 유방세포주 라이브러리), 마이너스(발현되는 것이 바람직하지 못한 다른 정상 성인 세포로부터의 라이브러리) 및 기타(발현되는 것이 부적절하다고 여겨지는 태아 조직, 유아 조직, 여성에서만 발견되는 조직, 비전립선 종양 및 전립선 세포주 이외의 세포주). 이들 라이브러리 그룹은 표 II에 요약하였다.
| 라이브러리 | 라이브러리의 수 | EST의 수 |
| 플러스 | 25 | 43,482 |
| 정상 | 11 | 18,875 |
| 종양 | 11 | 21,769 |
| 세포주 | 3 | 2,838 |
| 마이너스 | 166 | |
| 기타 | 287 |
각각의 슈퍼클러스터은 슈퍼클러스터내에서 EST의 측면에서 분석한다. 각각의 EST 클론의 조직원을 인지하여 슈퍼클러스터를 4그룹으로 분류하는데 사용한다: 유형 1 - 플러스 그룹 라이브러리에서만 발견되는 클론; 마이너스 또는 기타 그룹 라이브러리에서는 발현이 검출되지 않음; 유형 2 - 플러스 및 기타 그룹 라이브버리로부터만 유도된 EST 클론; 마이너스 그룹에서는 발현이 검출되지 않음; 유형 3 - 플러스, 마이너스 및 기타 그룹 라이브러리로부터 유도된 EST 클론이지만 플러스 그룹으로부터 유도된 EST의 수가 다른 마이너스 및 기타 그룹의 수보다 높다; 및 유형 4 - 플러스, 마이너스 및 기타 그룹 라이브버리로부터 유도된 EST 클론이지만 플러스 그룹으로부터 유도된 EST의 수가 마이너스 그룹으로부터 유도된 수보다 높다. 이러한 분석으로 4,345개의 유방 슈퍼클러스터가 확인되었다(표 III 참조). 이들 슈퍼클러스터로부터의 3,172개 EST 클론은 리서치 제네틱스 인코포레이트(Research Genetics, Inc.)로부터 주문하였고 96웰 플레이트중 냉동 글리세롤 저장액으로서 배달되었다.
| 유형 | 슈퍼클러스터의 수 | 주문된 EST의 수 |
| 1 | 688 | 677 |
| 2 | 2899 | 2484 |
| 3 | 85 | 11 |
| 4 | 673 | 0 |
| 총 | 4345 | 3172 |
EST 클론 삽입체는 신테니(Synteni) 마이크로어레이 분석용의 아미노 연결된 PCR 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 특정 클론으로부터 하나 이상의 PCR 산물이 수득되는 경우, PCR 산물을 발현 분석에 사용하지 않는다. 전체적으로, 전자 공제 방법으로부터의 2,528개의 클론을 마이크로어레이 분석에 의해 분석하여, 정상 조직 mRNA에 비해 종양에서 수준이 높은 전자 공제 유방 클론을 확인하였다.이러한 스크리닝은 제조자 설명서(및 실질적으로는 참조 문헌: Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10624-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997)에 따라 신테니 마이크로어레이를 사용하여 수행한다. 이러한 분석에서는, 정상 및 종양 전립선 cDNA뿐만 아니라 다양한 다른 정상 조직으로부터 생성된 형광 프로브로 프로빙된 칩상에 클론이 배열된다. 슬라이드를 스캐닝하여 형광도를 측정한다.
발현비가 3(즉, 전립선 종양 및 정상 전립선 mRNA 수준이 다른 정상 조직 mRNA 수준부다 3배 이상이다)을 초과하는 클론을 전립선 종양 특이적 서열로 확인한다(표 IV). 이러한 클론들의 서열은 서열 401 내지 453으로 나타내었고, 신규한 특정 서열은 서열 407, 413, 416 내지 419, 422, 426, 427 및 450이다.
| 서열 | 서열 지정 | 내용 |
| 401 | 22545 | 이전에 동정된 P1000C |
| 402 | 22547 | 이전에 동정된 P704P |
| 403 | 22548 | 공지 |
| 404 | 22550 | 공지 |
| 405 | 22551 | PSA |
| 406 | 22552 | 전립선 분비 단백질 94 |
| 407 | 22553 | 신규 |
| 408 | 22558 | 이전에 동정된 P509S |
| 409 | 22562 | 선상 칼리크레인 |
| 410 | 22565 | 이전에 동정된 P100C |
| 411 | 22567 | PAP |
| 412 | 22568 | B1006C(유방 종양 항원) |
| 413 | 22570 | 신규 |
| 414 | 22571 | PSA |
| 415 | 22572 | 이전에 동정된 P706P |
| 416 | 22573 | 신규 |
| 417 | 22574 | 신규 |
| 418 | 22575 | 신규 |
| 419 | 22580 | 신규 |
| 420 | 22581 | PAP |
| 421 | 22582 | 전립선 분비 단백질 94 |
| 422 | 22583 | 신규 |
| 423 | 22584 | 전립선 분비 단백질 94 |
| 424 | 22585 | 전립선 분비 단백질 94 |
| 425 | 22586 | 공지 |
| 426 | 22587 | 신규 |
| 427 | 22588 | 신규 |
| 428 | 22589 | PAP |
| 429 | 22590 | 공지 |
| 430 | 22591 | PSA |
| 431 | 22592 | 공지 |
| 432 | 22593 | 이전에 동정된 P777P |
| 433 | 22594 | T 세포 수용체 감마 쇄 |
| 434 | 22595 | 이전에 동정된 P705P |
| 435 | 22596 | 이전에 동정된 P707P |
| 436 | 22847 | PAP |
| 437 | 22848 | 공지 |
| 438 | 22849 | 전립선 분비 단백질 57 |
| 439 | 22851 | PAP |
| 서열 | 서열 지정 | 내용 |
| 440 | 22852 | PAP |
| 441 | 22853 | PAP |
| 442 | 22854 | 이전에 동정된 P509S |
| 443 | 22855 | 이전에 동정된 P705P |
| 444 | 22856 | 이전에 동정된 P774P |
| 445 | 22857 | PSA |
| 446 | 23601 | 이전에 동정된 P777P |
| 447 | 23602 | PSA |
| 448 | 23605 | PSA |
| 449 | 23606 | PSA |
| 450 | 23612 | 신규 |
| 451 | 23614 | PSA |
| 452 | 23618 | 이전에 동정된 P1000C |
| 453 | 23622 | 이전에 동정된 P705P |
서열 407의 클론(P1020C로도 지칭함)에 대한 추가 연구로 서열 591의 증폭된 cDNA 서열을 분리하였다. 이러한 증폭된 cDNA 서열은 서열 592의 예상 아미노산 서열을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 밝혀졌다. P1020C cDNA 및 아미노산 서열은 사람 내인성 레트로바이러스 HERV-K pol 유전자 및 단백질과 다소 유사한 것으로 밝혀졌다.
실시예 15
마이크로어레이 분석에 의한 전립선-특이적 항원의 추가 분석
본 실시예는 전립선 종양 cDNA 라이브러리로부터 추가의 전립선 특이적 폴리펩타이드를 분리하는 방법을 기술할 것이다.
상기한 바와 같이 사람의 전립선 종양 cDNA 발현 라이브러리를 마이크로어레이 분석으로 스크리닝하여, 비전립선 정상 조직(고환은 포함하지 않음)과 비교시전립선 종양 및/또는 정상 전립선 조직에서 3배 이상 과발현되는 클론을 확인한다. 142개의 클론이 확인되고 서열분석되었다. 이들 클론중 확실한 것은 서열 454 내지 467이다. 이들 서열중에서 서열 459 및 460이 신규한 유전자이다. 다른 서열(서열 454 내지 458 및 461 내지 467)은 공지된 서열이다. BLAST 프로그램을 사용하여 서열 461의 결정된 cDNA 서열을 GenBank 데이타베이스의 서열과 비교시 이전에 동정된 막통과 프로테아제 세린 2(TMPRSS2)와 상동성이 있는 것으로 나타났다. 이 클론에 대한 전체 길이 cDNA 서열은 서열 751로 제공되고 이의 상응하는 아미노산 서열은 서열 752로 제공된다. TMPRSS2의 처음 209개 아미노산을 암호화하는 cDNA 서열은 서열 753으로 제공되고 처음 209 아미노산은 서열 754로 제공된다.
서열 462(P835P로도 지칭함)은 이전에 동정된 클론 FLJ13518(승인번호 AK023643)에 상응하고 관련 오픈 리딩 프레임(ORF)이 없는 것으로 밝혀졌다. 이 클론을 사용하여 제네세크(Geneseq) DNA 데이타베이스를 조사하였더니니, 7개의 막통과 도메인이 존재하는 것으로 확인된 G-단백질과 커플링된 수용체 단백질(DNA Geneseq 승인번호 A09351; 아미노산 DNA Geneseq 승인번호 Y92365)로서 이전에 동정된 클론과 일치하였다. 이들 도메인 사이에 있는 단편의 서열은 서열 778 내지 785로 제공되는데, 서열 778, 780, 782 및 784는 세포외 도메인이고 서열 779, 781, 783 및 785는 세포내 도메인이다. 서열 778 내지 785는 각각 P835P의 아미노산 1 내지 28, 53 내지 61, 83 내지 103, 12 내지 143, 162 내지 201, 226 내지 238, 263 내지 272 및 297 내지 381이다. P835P의 경우 전체 길이 cDNA 서열은 서열 773으로 제공된다. P835P의 경우 종결 코돈을 포함한 오픈 리딩 프레임의 cDNA서열은 서열 775로 제공되고 종결 코돈이 없는 오픈 리딩 프레임은 서열 776으로 제공되며, 상응하는 아미노산 서열은 서열 777로 제공된다.
실시예 16
전립선-특이적 항원 P710P의 추가적인 특성화
본 실시예는 P710P의 전체 길이 클로닝을 기술할 것이다.
상기한 바와 같은 전립선 cDNA 라이브러리는 상기한 P710P 단편을 사용하여 스크리닝한다. 100만개의 콜로니를 LB/암피실린 플레이트상에 플레이팅한다. 나일론 막 필터를 사용하여 이들 콜로니를 들어낸 후, 이 필터에 의해 들려진 cDNA를 변성시킨 다음, UV 광에 의해 필터에 가교결합시킨다. P710P 단편을 방사능표시키고 필터와 함께 하이브리드화한다. 양성 cDNA 클론을 선택하고 이들의 cDNA를 회수한 다음, 자동 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 시퀀서(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Sequencer)에 의해 서열분석한다. 4개의 서열을 수득하였고 서열 468 내지 471로 나타내었다. 이들 서열은 P710P 유전자의 상이한 스플라이싱 변형체인 것 같다. 이어서, GenBank에서의 서열과 P710P의 cDNA 서열을 비교한 결과, DD3 유전자와 상동성이 있는 것으로 나타났다(GenBank 승인번호 AF103907 및 AF103908). DD3의 cDNA 서열은 서열 618로 제공된다.
실시예 17
전립선-특이적 항원의 단백질 발현
본 실시예는 이. 콜라이, 바큘로바이러스, 포유류 세포 및 효모 세포에서 전립선 특이적 항원의 발현 및 정제를 기술할 것이다.
a) 이. 콜라이에서의 P501S의 발현
P501S의 전체 길이형의 발현은 pET17b에서 결핵균(M. tuberculosis) 항원 Ra12(서열 484)의 첫번째 30개 아미노산의 리더 서열(서열 113의 아미노산 36 내지 553) 하부스트림이 없는 첫번째 클로닝 P501S로 시도하였다. 상세하게는, 프라이머 AW025(서열 485) 및 AW003(서열 486)을 사용하여 P501S DNA로 PCR을 실시한다. AW025는 HindIII 부위를 포함하는 센스 클로닝 프라이머이다. AW003은 EcoRI 부위를 포함하는 안티센스 클로닝 프라이머이다. DNA 증폭은 10X Pfu 완충액 5㎕, 20mM dNTP 1㎕, 10μM 농도인 PCR 프라이머 각각 1㎕, 물 40㎕, Pfu DNA 폴리머라제 1㎕(Stratagene, La Jolla, CA) 및 100ng/㎕ 의 DNA 1㎕을 사용하여 수행한다. 95℃에서 30초 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 3분 동안 10사이클을 반복한다. 95℃에서 30초, 65℃에서 1분 및 72℃에서 3분 동안 20사이클을 실시하고 마지막에 72℃에서 10분 동안 실시한다. PCR 산물은 HindIII 및 EcoRI을 사용하여 Ra12m/pET17b에 클로닝한다. 생성된 융합 작제물(Ra12-P501S-F)의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.
융합 작제물로 BL21(DE3)pLysE, pLysS 및 CodonPlus 이. 콜라이(Stratagene)를 형질전환시키고 가나마이신이 있는 LB 브로쓰에서 밤새 성장시킨다. 생성된 배양액을 IPTG로 유도시킨다. 단백질은 PVDF 막으로 이전시키고 5% 비유지방 우유(PBDS-Tween 완충액중에 존재)로 차단시키고 3번 세척한 다음, 마우스 항-HisTag 항원(Clontech)과 함께 1시간 동안 배양한다. 막을 3번 세척하고 HRP-단백질 A(Zymed)로 30분 동안 프로빙한다. 최종적으로 막을 3회 세척하고 ECL(Amersham)로 전개시킨다. 웨스턴 블롯으로는 발현이 검출되지 않았다. 유사하게 CE6 파지(Invitrogen)에 의해 BL21CodonPlus에서 Ra12-P501S-F 융합체를 발현시키는 경우, 웨스턴 블롯에 의해 발현이 검출되지 않았다.
P501S의 N-말단 단편(서열 113의 아미노산 36 내지 325)은 하기와 같이 pET17b중 결핵균 항원 Ra12의 첫번째 30개 아미노산의 하부스트림에 클로닝한다. 프라이머 AW025(서열 485) 및 AW027(서열 487)을 사용하여 P501S DNA로 PCR을 실시한다. AW027은 EcoRI 부위 및 종결 코돈을 포함하는 안티센스 클로닝 프라이머이다. DNA 증폭은 상기한 바와 본질적으로 동일하게 수행한다. 생성된 PCR 산물은 HindIII 및 EcoRI 부위에서 pET17의 Ra12에 클로닝한다. 융합 작제물(Ra12-P501S-N)의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.
본질적으로는 상기한 바와 같이, BL21(DE3)pLysE, pLysS 및 CodonPlus에 Ra12-P501S-N 융합 작제물을 발현시킨다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 분자량이 36kDa으로 예상되는 단백질 밴드가 관찰되었다. 다소 분자량이 높은 밴드도 관찰되었는데, 이는 재조합 단백질의 응집에 기인하는 것 같다. CE6 파지에 의해 BL21CodonPlus에 Ra12-P501S-F 융합체를 발현시키는 경우, 웨스턴 블롯에 의해 발현이 검출되지 않았다.
결핵균 항원 Ra12(서열 484)의 첫번째 30개 아미노산의 하부스트림에 위치한 P501S의 C-말단부(서열 113의 아미노산 257 내지 553)를 포함하는 융합 작제물은다음과 같이 제조한다. 프라이머 AW026(서열 488) 및 AW003(서열 486)을 사용하여 P501S DNA로 PCR을 실시한다. AW026은 HindIII 부위를 포함하는 센스 클로닝 프라이머이다. DNA 증폭은 본질적으로 상기한 바와 같이 수행한다. 수득한 PCR 산물은 HindIII 및 EcoRI 부위에서 pET17b의 Ra12에 클로닝된다. 생성된 융합 작제물(Ra12-P501S-C)의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.
본질적으로는 상기한 바와 같이, BL21(DE3)pLysE, pLysS 및 CodonPlus에 Ra12-P501S-C 융합 작제물을 발현시킨다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 소량의 단백질이 검출되었고 다소 분자량이 높은 응집체 또한 관찰되었다. CE6 파지에 의해 BL21CodonPlus에 Ra12-P501S-S 융합체를 발현시키는 경우, 웨스턴 블롯에 의해 또한 발현이 검출되었다.
결핵균 항원 Ra12(서열 705)의 하부스트림에 위치한 P501S 단편(서열 113의 아미노산 36 내지 298)을 포함하는 융합 작제물은 다음과 같이 제조한다. 프라이머 AW042(서열 706) 및 AW053(서열 707)을 사용하여 P501S DNA로 PCR을 실시한다. AW042은 EcoRI 부위를 포함하는 센스 클로닝 프라이머이다. AW053은 종결 부위 및 XhoI 부위를 갖는 안티센스 프라이머이다. DNA 증폭은 본질적으로 상기한 바와 같이 수행한다. 수득한 PCR 산물은 EcoRI 및 XhoI 부위에서 pETb의 Ra12에 클로닝된다. 생성된 융합 작제물(Ra12-P501S-E2)은 LB 배지에서 실온에서 2시간 동안 B834(DE3)pLys S 이. 콜라이 숙주 세포중에서 발현시킨다. 발현된 단백질은, 함유체를 세척함으로써 정제하고 Ni-NTA 칼럼에서 전개시킨다. 정제된 단백질은 20mM Tris-HCl(pH 8), 100mM NaCl, 10mM β-Me 및 5% 글리세롤을 포함한 완충액에 용해된 상태로 유지시킨다. 발현된 융합 단백질에 대한 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 서열 708 및 709로 각각 제공된다.
b) 바큘로바이러스에서의 P501S의 발현
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템(BRL Life Technologies, Inc.)을 사용하여 곤충 세포에서 P501S를 발현시킨다. 전체 길이 P501S(서열 113)을 PCR로 증폭시키고 공여체 플라스미드 pFastBacI의 XbaI 부위에 클로닝한다. 재조합 바스미드 및 바큘로바이러스는 제조자 설명서에 따라 제조한다. 재조합 바큘로바이러스를 Sf9 세포에서 증폭시키고 고역가 저장액을 사용하여 하이 파이브(Hi Five) 세포(Invitrogen)를 감염시켜 재조합 단백질을 제조한다. 재조합 단백질의 N-말단 서열분석 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 전체 길이 단백질의 동질성을 확인한다(도 7). 상세하게는, 6웰 플레이트중의 60만개의 하이 파이브 세포를 비관련 대조 바이러스 BV/ECD_PD(레인 2), 상이한 양의 P501S에 대한 재조합 바큘로바이러스 또는 MOI(레인 4 내지 8)로 감염시키거나 감염시키지 않는다(레인 3). 환원 조건하에 세포 용해물을 SDS-PAGE상에서 전개시키고, 항-P501S 모노클로날 항체 P501S-10E3-G4D3(하기하는 바와 같이 제조)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석한다. 레인 1은 비오티닐화된 단백질 분자량 마커(BioLabs)이다.
곤충 세포중 재조합 P501S의 위치는 하기와 같이 조사한다. P501S을 과발현하는 곤충 세포를 핵, 마이토콘드리아, 막 및 세포질로 단편화한다. 각 분획의 동량의 단백질을, P501S에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석한다. 분획 구성으로 인해 핵과 마이토콘드리아 분획 모두는 원형질 막 성분을 다소 포함한다. 그러나 막 분획은 기본적으로 마이토콘드리아 및 핵을 포함하지 않는다. P501S는 막 성분을 포함한 모든 분획에 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 P501S이 재조합 단백질을 발현하는 곤충 세포의 원형질 막과 연관될 수 있음을 제시한다.
c) 포유류 세포에서의 P501S의 발현
전체 길이 P501S(553개 아미노산: 서열 113)은, pCEP44(Invitrogen), pVR1012(Vical, San Diego, DA) 및 레트로바이러스 벡터 pBMN의 변형된 형태(pBIB로 지칭함)를 포함하여 다양한 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. 푸진(Fugene) 형질감염 시약(Boehringer Mannheim)을 사용하여 P501S/pCEP4 및 P501S/pVR1012를 HEK293 섬유아세포에 형질감염시킨다. 요약하면, 푸진 시약 2㎕를 혈청 비함유 배지 100㎕에 희석시키고 실온에서 5 내지 10분 동안 배양한다. 이 혼합물을 P501S 플라스미드 DNA 1㎍에 가하고 잠깐 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양한다. 푸진/DNA 혼합물을 세포에 가하고 24 내지 48시간 동안 배양한다. 형질감염된 HEK293 섬유아세포중 재조합 P501S의 발현은 P501S에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출된다.
P501S/pCEP4는 진포터(Geneporter) 형질감염 시약(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)을 사용하여 CHO-K 세포(ATCC, Rockvill, MD)를 형질감염시킨다. 요약하면, 진포터 15㎕를 혈청 비함유 배지 500㎕에 희석시키고 실온에서 10분 동안 배양한다. 진포터/배지 혼합물은, 혈청 비함유 배지 500㎕에 희석시킨 플라스미드 DNA 2㎍에 가하고 잠깐 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양한다. CHO-K 세포를 PBS로 세정하여 혈청 단백질을 제거하고, 진포터/DNA 혼합물을 가하여 5시간 동안 배양한다. 그런 다음, 형질감염된 세포를 동일 용적의 2x 배지에 넣고 24 내지 48시간 동안 배양한다.
P501S로 일시적으로 형질감염된 CHO-K 세포의 FACS 분석으로 P501S의 표면 발현이 입증되었다. P501S 펩타이드에 대해 생성된 래빗 폴리클로날 항체를 사용하여 하기하는 바와 같이 발현을 검출한다. 파스스캔(FaCScan; Becton Dickinson)을 사용하여 유량 세포 분석을 수행하고 세포 퀘스트(Cell Quest) 프로그램을 사용하여 데이타를 분석한다.
d) 에스. 세레비지애에서의 P501S의 발현
P501S는 효모에서 효모 α프리프로 신호 서열을 사용하여 막에 직접 발현시킨다. 발현된 P501S 단백질의 본래 위치를 보존하기 위해서 P501S의 천연 신호 서열 및 첫번째 루멘 도메인은 삭제한다.
상세하게는, His Tag 꼬리가 있는 서열 113의 아미노산 55 내지 553과 연결된 에스. 세레비지애의 α프리프로 신호 서열을 CUP1 프로모터와 함께 플라스미드 pRIT15068에 클로닝하고, 에스. 세레비지애 균주 Y1790을 형질감염시킨다. Y1790 균주는 Leu+ 및 His-이다. 히스티딘이 보충된 최조 배지에서 500μM 또는 250μM의 CuSO4을 30℃에서 가하여 단백질 발현을 유도시킨다. 유도한지 24시간 후 세포를 수집한다. 프로테아제 억제제가 보충되고 130mM NaCl이 있는 50mM 시트레이트 포스페이트 완충액(pH 4.0)중에서 OD600 5.0의 농도로 세포를 성장시켜 추출물을 제조한다. 유리 비드를 사용하여 세포를 파쇄시키고 15,000g에서 20분 동안 원심분리한다. 재조합 단백질은 100% 관련 펠렛으로 밝혀졌다.
재조합 단백질(분자량 63kDa)의 발현은 하기하는 바와 같이 항-P501S 모노클로날 항체 10E-D4-G3를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 입증된다. 발현된 단백질의 아미노산 서열은 서열 792로 제공된다.
에스. 세레비지애(균주 Y1790-CUP1 유도성 프로모터)에서 α프리프로-P501S-His Tag 재조합 단백질을 생산하기 위한 발효 공정은 다음과 같이 평가한다. 형질감염된 에스. 세레비지애 Y1790의 2.5x108개 세포/㎖를 포함한 마스터 씨드(Master Seed) 100㎕를 FSC004AA 고형 배지상에 스프레딩한다. FSC004AA 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코스 10g/ℓ; Na2MoO4·2H2O 0.0002g/ℓ; 폴산 0.000064g/ℓ; KH2PO41g/ℓ; MnSO4·H2O 0.0004g/ℓ; 이노시톨 0.064g/ℓ; MgSO4·7H2O 0.5g/ℓ; H3BO30.0005g/ℓ; 피리독신 0.008g/ℓ; CaCℓ2·2H2O 0.1g/ℓ; KI 0.0001g/ℓ; 티아민 0.008g/ℓ; NaCℓ 0.1g/ℓ; CoCℓ2·6H2O 0.00009g/ℓ; 니아신 0.000032g/ℓ; FeCℓ3·6H2O 0.0002g/ℓ; 리보플라빈 0.000016g/ℓ; 판토테네이트 Ca 0.008g/ℓ;CuSO4·5H2O 0.00004g/ℓ; 바이오틴 0.000064g/ℓ; 파라-아미노벤조산 0.000016g/ℓ; ZnSO4·7H2O 0.0004g/ℓ; (NH4)2SO45g/ℓ; 한천 18g/ℓ; 히스티딘 0.1g/ℓ.
2개의 플레이트를 30℃에서 26시간 동안 배양한다. 이러한 고형 전배양물을 액체 배지 FSC007AA 5㎖에 수집하고 이 현탁액 0.5㎖(또는 9.3x107세포)를 사용하여 2개의 액체 전 배양물을 접종한다.
FSC007AA 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코스 10g/ℓ; Na2MoO4·2H2O 0.0002g/ℓ; 폴산 0.000064g/ℓ; KH2PO41g/ℓ; MnSO4·H2O 0.0004g/ℓ; 이노시톨 0.064g/ℓ; MgSO4·7H2O 0.5g/ℓ; H3BO30.0005g/ℓ; 피리독신 0.008g/ℓ; CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ; KI 0.0001g/ℓ; 티아민 0.008g/ℓ; NaCl 0.1g/ℓ; CoCl2·6H2O 0.00009g/ℓ; 니아신 0.000032g/ℓ; FeCl3·6H2O 0.0002g/ℓ; 리보플라빈 0.000016g/ℓ; 판토테네이트 Ca 0.008g/ℓ; CuSO4·5H2O 0.00004g/ℓ; 바이오틴 0.000064g/ℓ; 파라-아미노벤조산 0.000016g/ℓ; ZnSO4·7H2O 0.0004g/ℓ; (NH4)2SO45g/ℓ; 히스티딘 0.1 g/ℓ.
이러한 전 배양물은 1.8 OD를 수득하기 위해 배지 FSC007AA 400㎖를 포함한 2ℓ들이 플라스크에서 20시간 동안 성장시킨다. 이러한 전 배양물의 특징은 다음과 같다: pH 2.8; 글루코스 2.3g/ℓ; 에탄올 3.4 g/ℓ.
균주 Y1790에 대한 액체 전 배양물의 최적의 시간은 예비 실험으로 결정한다. 최적의 접종 크기 및 시간을 결정하기 위해, 400㎖의 배지를 포함하고 다양한 용적(0.25, 0.5, 1 또는 2㎖)의 마스터 씨드로 접종한 액체 전 배양물을 모니터한다. 글루코스, 에탄올, pH, OD 및 세포수(유량 세포 분석에 의해 측정)는 배양 16 내지 23시간 사이에 수득된다. 글루코스 소비량 및 최대 생물량은 0.5 접종물로 접종한지 20시간 후에 수득된다. 이러한 조건은 전 배양물을 발효시키기 위해 선택된 것이다.
전체적으로, FSC002AA 배지 5ℓ를 포함하는 20ℓ들이 발효기를 전 배양물 800㎖로 접종시킨다. 접종하기 전에, 조사시킨 소포제 3㎖를 가한다. FSC002AA 배지의 조성은 다음과 같다: (NH4)2SO46.4g/ℓ; Na2MoO4·2H2O 2.05㎎/ℓ; 폴산 0.54㎎/ℓ; KH2PO48.25g/ℓ; MnSO4·H2O 4.1㎎/ℓ; 이노시톨 540㎎/ℓ; MgSO4·7H2O 4.69g/ℓ; H3BO35.17m/ℓ; 피리독신 68㎎/ℓ; CaCl2·2H2O 0.92g/ℓ; KI 1.03㎎/ℓ; 티아민 68㎎/ℓ; NaCl 0.06g/ℓ; CoCl2·6H2O 0.92㎎/ℓ; 니아신 0.27㎎/ℓ; HCl 1㎖/ℓ; FeCl3·6H2O 9.92㎎/ℓ; 리보플라빈 0.13㎎/ℓ; CuSO4·5H2O 0.41㎎/ℓ; 글루코스 0.14g/ℓ; 판토테네이트 Ca 68㎎/ℓ; ZnSO4·7H2O 4.1㎎/ℓ; 바이오틴 0.54㎎/ℓ; 파라-아미노벤조산 0.13㎎/ℓ; 히스티딘 0.3 g/ℓ.
FFB004AA 배지를 계속 공급하여 탄소원(글루코스)을 보충시킨다. FFB004AA 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코스 350g/ℓ; Na2MoO4·2H2O 5.15㎎/ℓ; 폴산 1.36㎎/ℓ; KH2PO420.6g/ℓ; MnSO4·H2O 10.3㎎/ℓ; 이노시톨 1350㎎/ℓ;MgSO4·7H2O11.7g/ℓ; H3BO312.9m/ℓ; 피리독신 170㎎/ℓ; CaCl2·2H2O 2.35g/ℓ; KI 2.6㎎/ℓ; 티아민 170g/ℓ; NaCl 0.15g/ℓ; CoCl2·6H2O 2.3㎎/ℓ; 니아신 0.67㎎/ℓ; HCl 2.5㎖/ℓ; FeCl3·6H2O 24.8㎎/ℓ; 리보플라빈 0.33㎎/ℓ; CuSO4·5H2O 1.03㎎/ℓ; 바이오틴 1.36㎎/ℓ; 판토테네이트 Ca 170㎎/ℓ; ZnSO4·7H2O 10.3㎎/ℓ; 파라-아미노벤조산 0.33㎎/ℓ; 히스티딘 5.35 g/ℓ.
발효에 의한 에탄올 생성을 최소화하기 위해 잔류하는 글루코스 농도를 매우 낮게(□50㎎/ℓ) 유지시킨다. 이는 한정된 글루코스 공급률을 이용하여 미생물의 성장을 제한함으로써 달성된다. 표준 생물량 함량(OD 80-90)은 발효기에서 44시간 동안 성장한 후에 도달하게 된다.
그런 다음, P501S 항원을 생성하기 위해 500μCuSO4를 가하여 CUP1 프로모터를 유도시킨다. CuSO4를 첨가한 후에 에탄올이 축적되면(6g/ℓ이하), 에탄올을 소비하기 위해 글루코스 공급률을 감소시킨다. 미생물에 유용한 구리는, 분광광도 구리 분석(DETC법)을 사용하여 브로써 상층액중 Cu 이온 농도를 조사하여 모니터한다. 그런 다음, 상층액에서 구리의 농도를 150 내지 250μM로 유지하기 위해 유도 상태에 걸쳐 CuSO4를 발효기에 보충한다. 유도 말기에 생물량은 OD 100에 도달한다. 유도한지 8시간 후 세포를 수집한다.
세포 균질물을 제조하고 표준 프로토콜을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석한다. 분자량이 62kDa인 것으로 예상되는 주요 단백질 밴드는 항-P501S모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출한다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 주요 62kDa 밴드가 유도 30분부터 점차적으로 생성되어 3시간 후에 최대에 도달한다는 것을 나타낸다. 유도한지 3시간 내지 12시간 사이에는 더 이상의 항원이 생성되지 않는 것 같다.
세포로부터 모든 항원을 추출하는데 필요한 프렌치 프레스(French Press)를 통과수를 평가한다. 1, 3 및 5회 통과를 시험하고 전체 세포 용해물, 세포 용해물의 상층액 및 펠렛을 웨스턴 블럿으로 분석한다. 프렌치 프레스를 3회 통과시키면 항원을 완전하게 추출할 수 있다. 항원은 불용성 분획에 존재한다.
e) 바큘로바이러스에서의 P703P의 발현
몇개의 플랭킹 제한 부위가 있는 전체 길이 P703P-DE5(서열 326)는 플라스미드 pCDNA703을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI and Hind III로 분해시켜 수득한다. 수득한 제한 단편(약 800염기쌍)은, 동일한 제한 효소로 분해한 플라스미드 pFastBacI와 접합시킨다. 삽입체의 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다. 재조합 이전 플라스미드 pFBP703은, 재조합 바스미드 DNA 및 Bac-T0o-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템(BRL Life Technologies)을 사용하는 바큘로바이러스를 제조하는데 사용한다. 하이 파이브 세포를 상기한 바와 같이 재조합 바이러스 BVP703로 감염시켜 재조합 P703P 단백질을 수득한다.
e) 이. 콜라이에서의 P788P의 발현
6x His Tag과 융합되어 있는 P788P의 절단된 N-말단부(서열 777의 1 내지 644잔기; P788P-N으로 지칭함)는 다음과 같이 이. 콜라이에서 발현시킨다. P788P cDNA는 프라이머 AW080 and AW081(서열 672 및 673)을 사용하여 증폭시킨다. AW080은 NdeI 부위가 있는 센스 클로닝 프라이머이다. AW081은 XhoI 부위가 있는 안티센스 클로닝 프라이머이다. PCR로 증폭시킨 P778P뿐만 아니라 벡터 pCRX1을 NdeI 및 XhoI으로 분해한다. 벡터 및 삽입체를 접합시키고 NovaBlue 세포로 형질전환시킨다. 삽입체에 대해 콜로니를 무작위적으로 스크리닝한 다음 서열분석한다. P788P-N 클론 #6이 설계한 작제물과 동일한 것으로 확인되었다. 작제물 P788P-N #6/pCRX1을 이. 콜라이 BL21 CodonPlus-RIL 컴피턴트 세포로 형질전환시킨다. 유도 후, 대부분의 세포가 잘 자라 3시간 후에 OD600이 2.0 이상이 된다. 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE는 약 75kDa에서 과발현된 밴드를 보여준다. 6x HisTag 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 밴드가 P788P-N임을 확인하였다. P788P-N에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 674로 제공되고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 675로 제공된다.
f) 이. 콜라이에서의 P501S의 발현
P501S 단백질은 9개의 잠재적 막 통과 도메인을 가지며 원형질막에 위치하는 것으로 예상된다. P501S의 예상 세번째 세포외 도메인뿐만 아니라 이 단백질의 C-말단 단백질을 다음과 같이 이. 콜라이에서 발현시킨다.
Ra12-P501S-C라 지칭하는 발현 벡터는 N-말단에 6 HisTag, 그 다음에 결핵균항원 Ra12(서열 676) 및 P501S의 C-말단부(서열 538의 아미노산 1176 내지 1261)가 오도록 설계한다. 프라이머 AW056 and AW057 (각각 서열 677 및 678)을 사용하여 PCR에 의해 P501S-C 단편을 증폭시키는데 전체 길이 P501S를 사용한다. AW056는 EcoRI 부위가 있는 센스 클로닝 프라이머이다. AW057은 종결 부위 및 XhoI 부위가 있는 안티센스 클로닝 프라이머이다. 증폭된 P501S 단편 및 Ra12/pCRX1를 EcoRI 및 XhoI으로 분해한 다음 정제한다. 삽입체 및 벡터를 함께 접합시키고 NovaBlue에 형질전환시킨다. 삽입체에 대해 콜로니를 무작위적으로 스크리닝하고 서열분석한다. 단백질 발현의 경우, 발현 작제물로 이. 콜라이 BL21(DE3) CodonPlus-RIL 컴피턴트 세포를 형질전환시킨다. 미니-유도 스크리닝을 실시하여 발현 조건을 최적화시킨다. 유도후, 세포는 잘 성장하여 3시간 후 600nm에서 OD가 2.0 이상에 도달한다. 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE는 약 30kDa에서 고도로 과발현된 밴드를 보여준다. 이것이 예상한 분자량보다 높았지만 웨스턴 블롯 분석에서 양성이었기 때문에 이 밴드는 His tag을 포함한 단백질이다. 최적화된 배양 조건은 다음과 같다. 밤/낮 배양물(LB+가나마이신+클로람페니콜)은 1리터의 2x YT(가나마이신 및 클로람페니콜 포함)당 배양물 25㎖의 비로 2x YT에 희석시킨다. OD600이 0.6이 될때까지 37℃에서 성장시킨다. T0 샘플로서 분취량을 취한다. 1mM IPTG를 가하고 30℃에서 3시간 동안 성장시킨다. T3 샘플을 취하고 세포를 회전시켜 가라앉히고 -80℃에서 저장한다. Ra12-P510S-C에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 679 및 682로 제공된다.
5개의 부가된 시작 코돈 및 글리신(GGA) 코돈, P501S C 말단 단편, 그 다음에 프레임으로서 6x 히스티딘 tag 및 pET28b 벡터로부터의 종결 코돈이 오도록 발현 작제물 P510S-C를 설계한다. 클로닝 방법은, PCR 프라이머로 서열 685 및 686을 각각 사용하고 pET28b중 NcoI/XhoI 절단체를 사용하는 것을 제외하고는 Ra12-P510S-C에서 사용한 것과 유사하다. 서열 685의 프라이머는 5' NcoI 부위를 만들고 시작 코돈을 부가한다. 서열 686의 안티센스 프라이머는 P510S C 말단 단편상에 XhoI 부위를 만든다. 클론은 서열분석으로 확인한다. 단백질 발현의 경우, 발현 작제물로 이. 콜라이 BL21(DE3) CodonPlus-RIL 컴피턴트 세포를 형질전환시킨다. 유도 30시간 후, OD600이 2.0 이상이 된다. 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE는 약 11kD에서 과발현된 단백질 밴드를 보여준다. N-말단 단백질 서열분석에서처럼, 웨스턴 블롯 분석으로 밴드가 P510S-C임을 확인하였다. 최적화된 배양 조건은 다음과 같다. 밤/낮 배양물(LB+가나마이신+클로람페니콜)은 1리터의 2x YT(가나마이신 및 클로람페니콜 포함)당 배양물 25㎖의 비로 2x YT에 희석시킨다. OD600이 0.5이 될때까지 37℃에서 성장시킨다. T0 샘플로서 분취량을 취한다. 1mM IPTG를 가하고 30℃에서 3시간 동안 성장시킨다. T3 샘플을 취하고 세포를 회전시켜 가라앉히고 -80℃에서 저장한다. P501S-C 작제물에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 680 및 683으로 제공된다.
P501S의 예상되는 세번째 세포외 도메인(P510S-E3; 서열 538의 328 내지 676잔기)은 다음과 같이 이. 콜라이에서 발현시킨다. P510S 단편은 서열 687 및 688의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 서열 687의 프라이머는 pPDM에 접합시키기 위한 NdeI 부위를 가진 센스 프라이머이다. 서열 688의 프라이머는 pPDM에접합시키기 위해 부가된 XhoI 부위가 있는 안티센스 프라이머이다. 수득한 단편은 NdeI 및 XhoI 부위에서 pPDM에 접합시킨다. 서열분석으로 클론을 확인한다. 단백질 발현의 경우, 발현 작제물은 이. 콜라이 BL21(DE3) CodonPlus-RIL 컴피턴트 세포에 형질전환시킨다. 유도한지 3시간 후, OD600이 2.0 이상이 된다. 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE는 약 39kDa에서 과발현된 단백질 밴드를 보여주고 N-말단 서열분석으로 N-말단이 P501S-E3의 것임을 확인하였다. 최적화된 배양 조건은 다음과 같다. 밤/낮 배양물(LB+가나마이신+클로람페니콜)은 1리터의 2x YT(가나마이신 및 클로람페니콜 포함)당 배양물 25㎖의 비로 2x YT에 희석시킨다. OD600이 0.6이 될 때까지 37℃에서 성장시킨다. T0 샘플로서 분취량을 취한다. 1mM IPTG를 가하고 30℃에서 3시간 동안 성장시킨다. T3 샘플을 취하고 세포를 회전시켜 가라앉히고, 정제할 때까지 -80℃에서 저장한다. P501S-E3 작제물에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 681 및 684으로 제공된다.
g) 이. 콜라이에서의 P775S의 발현
항원 P775P은 다중 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 서열 483의 단백질을 암호화하는 세번째 ORF가 최고의 이모티프 수치를 갖는다. 결핵균 항원 Ra12(서열 676)과 N-말단 6x HisTag이 있는 P775P-ORF3를 포함하는 발현 융합 작제물은 다음과 같이 제조한다. P775P-ORF3는 서열 689의 센스 PCR 프라이머 및 서열 690의 안티센스 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. P775P의 PCR 증폭된 단편 및 Ra12/pCRX1를 제한 효소 EcoRI 및 XhoI으로 분해한다. 벡터 및 삽입체를 접합시킨다음, NovaBlue 세포를 형질감염시킨다. 삽입체에 대한 콜로니를 무작위적으로 스크리닝하고 서열분석한다. 원하는 서열이 있는 클론을 이. 콜라이 BL21(DE3) CodonPlus-RIL 컴피턴트 세포에 형질감염시킨다. 유도한지 2시간 후, 세포 밀도는 OD600에서 약 1.8로 최고치가 된다. 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE는 약 31kDa에서 과발현된 밴드를 보여준다. 6x HisTag 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 밴드가 Ra12-P775P-ORF3임이 확인되었다. 융합 작제물에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 각각 서열 691 및 692로 제공된다.
h) 이. 콜라이에서의 P703P His Tag 융합 단백질의 발현
P703P의 암호화 영역에 대한 cDNA는 서열 693 및 694의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 제조한다. PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 분해하고 겔 정제한 다음, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해되고 프레임으로서 His Tag을 지닌 변형된 pET28 벡터에 클로닝한다. DNA 서열분석에 의해 정확한 작제물을 확인한 다음, 이. 콜라이 BL21(DE3) pLys S 발현 숙주 세포에 형질전환시킨다. 발현된 재조합 P703P에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 서열 695 및 696으로 각각 제공된다.
i) 이. 콜라이에서의 P705P His tag 융합 단백질의 발현
P705P의 암호화 영역에 대한 cDNA는 서열 697 및 698의 프라이머를 사용하여 PCR로 제조한다. PCR 산물을 EcoRI 제한 효소로 분해하고 겔 정제한 다음, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해되고 프레임으로서 His Tag을 지닌 변형된 pET28 벡터에클로닝한다. DNA 서열분석에 의해 정확한 작제물을 확인한 다음, 이. 콜라이 BL21(DE3) pLys S 및 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포에 형질전환시킨다. 발현된 재조합 P705P에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 서열 699 및 700으로 각각 제공된다.
j) 이. 콜라이에서의 P711P His Tag 융합 단백질의 발현
P711P의 암호화 영역에 대한 cDNA는 서열 701 및 702의 프라이머를 사용하여 PCR로 제조한다. PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 분해하고 겔 정제한 다음, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해되고 프레임으로서 His Tag을 지닌 변형된 pET28 벡터에 클로닝한다. DNA 서열분석에 의해 정확한 작제물을 확인한 다음, 이. 콜라이 BL21(DE3) pLys S 및 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포에 형질전환시킨다. 발현된 재조합 P705P에 대해 결정된 cDNA 및 아미노산 서열은 서열 703 및 704로 각각 제공된다.
실시예 18
전립선-특이적 폴리펩타이드에 대한 항원의 제조 및 특성화
a) P703P, P504S 및 P509S에 대한 폴리클로날 항체의 제조 및 특성화
P703P, P504S 및 P509S에 대한 폴리클로날 항체는 다음과 같이 제조한다.
이. 콜라이 재조합 발현 시스템에서 발현된 각각의 전립선 종양 항원은, 진탕 항온기내 적절한 항생제가 있는 LB 브로쓰중 37℃에서 밤새 성장시킨다. 다음날 아침, 밤새 배양한 배양물 10㎖를 격막이 있는 2ℓ들이 엘렌메이어 플라스크내 적절한 항생제가 부가된 2x YT 500㎖에 가한다. 배양물의 광학 밀도(560㎚)가 0.4 내지 0.6에 도달하면 IPTG(1mM)로 세포를 유도한다. IPTG로 유도한지 4시간 후, 원심분리하여 세포를 수집한다. 세포를 인산염 완충된 염수로 세척한 다음, 다시 원심분리한다. 상층액은 버리고 세포를 나중을 위해 냉동시키거나 바로 처리한다. 용해물 완충액 20㎖를 세포 펠렛에 가하고 볼텍싱한다. 이. 콜라이 세포를 개방하기 위해, 이 혼합물을 16,000psi의 압력에서 프렌치 프레스에 적용시킨다. 세포를 다시 원심분리하고, 상층액 및 펠렛은 재조합 단백질 분별용 SDS-PAGE로 확인한다. 세포 펠렛에 단백질이 집중된 경우, 펠렛을 10mM Tris pH 8.0, 1% CHAPS에 재현탁시키고 함유체를 세척하고 다시 원심분리한다. 이 과정은 2회 이상 반복한다. 세척된 함유체 펠렛은 10mM Tris pH 8.0과 10mM 이미다졸을 포함한 6M 구아니딘 HCl 또는 8M 우레아에 용해시킨다. 용해된 단백질을 니켈-킬레이트 수지 5㎖(Qiagen)에 가하고, 연속적으로 교반시키면서 실온에서 45 내지 1시간 동안 배양한다. 배양 후, 수지 및 단백질 혼합물을 1회용 칼럼에 붓고 유출물을 수집한다. 그런 다음, 칼럼을 10 내지 20칼럼 용적의 가용화 완충액으로 세척한다. 8M 우레아, 10mM Tris pH 8.0 및 300mM 이미다졸을 사용하여 칼럼으로부터 항원을 용출시킨 다음, 3㎖의 분획을 수집한다. SDS-PAGE 겔을 전개시켜 추가 정제를 위해 수집할 분획을 확인한다.
최종 정제 단계로서, HiPrepQ (Biorad)와 같은 강한 음이온 교환 수지를 적절한 완충액으로 평형화시키고, 상기와 같이 수집한 분획을 칼럼에 넣는다.염 구배를 증가시켜 칼럼으로부터 각각의 항원을 용출시킨다. 칼럼을 전개하고 다른 SDS-PAGE 겔을 전개시켜 칼럼으로부터의 수집할 분획을 확인하고 수집한다. 수집한 분획은 10mM Tris pH 8.0에 대해 투석시킨다. 0.22마이크론 필터를 통해 여과시킨 후 단백질을 바이알에 넣고, 면역반응에 필요할 때까지 항원을 냉동시킨다.
각각의 전립선 항원 400㎍을 무라밀디펩타이드(MDP) 100㎍와 합한다. 프로인트 불완전 면역보강제(IFA) 동일 용적과 혼합한 100㎍을 사용하여 4주마다 래빗에 추가접종시킨다. 각각의 추가접종 7일 후, 채혈한다. 혈액을 4℃에서 12 내지 4시간 동안 배양한 다음 원심분리하여 혈청을 생성한다.
재조합 단백질 50㎕(일반적으로 1㎍)을 4℃에서 20시간 동안 항원처리하여 96웰 플레이트를 항원으로 피복시킨다. BSA 차단 완충액 250㎕를 웰에 가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBS/0.01% Tween으로 6회 세척한다. 래빗 혈청을 PBS에 희석시킨다. 희석된 혈청 50㎕를 각 웰에 가하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, 1:10000 희석비로 염소 항-래빗 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 50㎕를 가하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 플레이트를 상기한 바와 같이 다시 세척하고 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 100㎕를 각 웰에 가한다. 암실 실온에서 15분 동안 배양한 후, 1N H2SO4100㎕를 가하여 발색 반응을 정지시키고 450㎚에서 바로 판독한다. 모든 폴리클로날 항체는 적절한 항원에 대해 면역반응을 나타내었다.
b) P501S에 대한 항체의 제조 및 특성화
전립선 특이적 항원 P501S의 카복시 말단에 대해 지시된 마우스 모노클로날 항체를 다음과 같이 제조한다.
P501S의 절단된 단편(서열 113의 아미노산 355 내지 526)을 생성하고 pET28b 벡터(Novagen)에 클로닝하고, 히스티딘 tag이 있는 티오레독신 융합 단백질로서 이. 콜라이에서 발현시킨다. trx-P501S 융합 단백질은 니켈 크로마토그래피로 정제하고 트롬빈으로 분해하여 trx 단편을 제거한 다음, 산 침전 과정과 연속되는 역상 HPLC에 의해 추가 정제한다.
절단된 P501S 단백질로 마우스에 면역반응을 일으킨다. 잠재적으로 항-P501S 폴리클로날 항체를 포함하는 마우스로부터 채혈한 혈청은, 정제된 P501S 및 trx-P501S 단백질이 있는 ELISA 검정을 사용하여 P501S 특이적 반응에 대해 시험한다. 그런 다음, P501S와 특이적으로 반응하는 것으로 나타난 혈청은 웨스턴 분석에 의해 P501S 반응을 스크리닝한다. P501S 특이적 항체 성분을 포함한 마우스를 죽이고, 표준 기술에 의해 비장 세포로 하이브리도마를 생성하는 항-P501S 항체를 생성한다. 하이브리도마 상층액은 먼저 ELISA에 의해 P501S 특이적 반응을 시험한 다음, P501S 형질유도된 세포와의 반응을 FACS 분석으로 시험한다. 이러한 결과를 바탕으로, 10E3으로 지칭되는 모노클로날 하이브리도마를 추가의 서브클로닝용으로 선택한다. 다수의 서브클론이 생성되면, ELISA를 사용하여 P501S에 대한 특이적 반응성을 시험하고 IgG 유형을 결정한다. 분석의 결과는 하기 표 V에 나타내었다. 시험한 16개의 서브클론중에서 모노클로날 항체 10E3-G4-D3을 추가 연구용으로 선택하였다.
| 하이브리도마 클론 | 이소타입 | 상층액중 대략적인 Ig(㎍/㎖) |
| 4D11 | IgG1 | 14.6 |
| 1G1 | IgG1 | 0.6 |
| 4F6 | IgG1 | 72 |
| 4H5 | IgG1 | 13.8 |
| 4H5-E12 | IgG1 | 10.7 |
| 4H5-EH2 | IgG1 | 9.2 |
| 4H5-H2-A10 | IgG1 | 10 |
| 4H5-H2-A3 | IgG1 | 12.8 |
| 4H5-H2-A10-G6 | IgG1 | 13.6 |
| 4H5-H2-B11 | IgG1 | 12.3 |
| 10E3 | IgG2a | 3.4 |
| 10E3-D4 | IgG2a | 3.8 |
| 10E3-D4-G3 | IgG2a | 9.5 |
| 10E3-D4-G6 | IgG2a | 10.4 |
| 10E3-E7 | IgG2a | 6.5 |
| 8H12 | IgG2a | 0.6 |
P501S에 대한 10E3-G4-D3의 특이성은 FACS 분석으로 조사한다. 상세하게는, 세포를 고정시키고(2% 포름알데히드, 10분) 삼투시키고(0.1% 사포닌, 10분), 0.5 내지 1㎍/㎖에서 10E3-G4-D3으로 염색시킨 다음, 2차 FITC 접합된 염소 항-마우스 Ig 항체(Pharmingen, San Diego, CA)와 함께 배양한다. 그런 다음, 세포는 엑스칼리버 형광 활성화 세포 분류기(Excalibur fluorescence activated cell sorter)를 사용하여 FITC 형광성을 분석한다. 형질유도된 세포의 FACS 분석의 경우, B-LCL은 레트로바이러스에 의해 P501S로 형질유도된다. 감염된 세포 분석의 경우, B-LCL은 P501S를 발현하는 우두 바이러스 벡터로 감염시킨다. 이러한 검정에서 특이성을 입증하기 위해, 상이한 항원(P710P)로 형질유도된 B-LCL 및 감염되지 않은 B-LCL벡터를 사용한다. 10E3-G4-D3은 P501S-형질유도된 B-LCL와 또한 P501S-감염된 B-LCL와는 결합하지만 감염되지 않은 세포 및 P703P-형질유도된 세포와는 결합하지 않는 것으로 나타났다.
10E3-G4-D3에 의해 인지되는 에피토프가 세포 표면상 또는 세포내 구획에서 나타나는지를 결정하기 위해, B-LCL을 대조 항원으로 P501S 또는 HLA-B8'로 형질전환시키고, 상기한 바와 같이 고정시키고 삼투시키거나 10E3-G4-D3로 염색시키고, 상기한 바와 같이 분석한다. 10E3-G4-D3에 의한 P501S의 특이적 인지에는 삼투가 필요한 것으로 나타났고, 이는 이 항체에 의해 인지되는 에피토피가 세포내에 있음을 제시한다.
각각 P501S를 고, 중, 저 수준으로 발현하는 것으로 공지된 3가지 전립선 종양 세포주인 Lncap, PC-3 및 DU-145와 10E3-G4-D3와의 반응성은 세포를 삼투시키고 상기한 바와 같이 처리하여 조사한다. 차례대로 DU-145보다는 PC-3, 이보다 Lncap가 있을때 10E3-G4-D3의 반응성이 보다 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 실시간 PCR과 일치하고, 항체가 이러한 종양 세포주내에서 P501S를 특이적으로 인지하고 전립선 종양 세포주내에서 인지되는 에피토프가 또한 세포내에 있음을 입증한 것이다.
P501S에 대한 10E3-G4-D3의 특이성은 또한 웨스턴 블롯으로 입증된다. 전립선 종양 세포주 Lncap, DU-145 및 PC-3 , P501S-일시 형질감염 HEK293 세포, 및 형질감염되지 않은 HEK293 세포의 용해물을 생성한다. 이러한 용해물들을 10E3-G4-D3로 웨스턴 블롯 분석하면, Lncap, PC-3 및 P501S-형질감염 HEK 세포에서는 46kDa의 면역반응성 밴드가 나타나지만, DU-145 세포 또는 형질감염되지 않은 HEK293 세포에서는 나타나지 않는다. 반정량 PCR 분석으로 P501S mRNA가 Lncap에서 발현되고 PC-3에서는 다소 적으나 검출가능한 수준으로 발현되고 DU-145에서는 전혀 발현되지 않는 것으로 나타났기 때문에, P501S mRNA 발현은 이러한 결과와 일치한다. 세균에서 발현시키고 정제한 재조합 P501S(P501SStr2로 지칭함)는 10E3-G4-D3(24 kDa)에 의해 인지되는데, 이는 발현 벡터 VR1012 또는 pCEP4를 사용하여 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되는 전체 길이 P501S이다. P501S의 예상 분자량이 60.5kDa이더라도, 형질감염된 P501S 및 본래의 P501S 모두는 이의 소수성으로 인해 약간 낮은 이동력으로 전개된다.
면역조직화학적 분석은 전립선 종양 및 정상 조직부(전립선, 부신, 유방, 경부, 결장, 십이지장, 담낭, 회장, 신장, 난소, 췌장, 이하선, 골격근, 비장 및 고환) 패널상에서 실시한다. 조직 샘플을 포르말린 용액중에서 24시간 동안 고정시키고 파라핀에 침지시킨 다음, 10마이크론 조각으로 얇게 저민다. 조직부를 삼투시키고 10E3-G4-D3 항체와 함께 1시간 동안 배양한다. DAB 발색원과 함께 배양한 HRP-표지된 항-마우스를 사용하여 P501S 면역반응성을 가시화한다. P501S는 정상 전립선 및 전립선 종양 조직 모두에서 높게 발현되지만 시험한 다른 어떤 조직에서도 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다.
10E3-G4-D3에 의해 인지되는 에피토프를 확인하기 위해, 에피토프 맵화를 실시한다. 10E3-G4-D3를 생성하는데 사용되는 P501S 단편을 포괄하는, 13개의 일련의 중복 20 및 21머(5개 아미노산 중복; 서열 489 내지 501)를 합성한다. 바닥이편평한 96웰 미세역가 플레이트는, 37℃에서 2시간 동안 마우스 면역반응을 일으키는데 사용된 P501S 단편 또는 펩타이드 1㎍/㎖로 피복시킨다. 웰을 공기로 빨아낸 다음, 1%(w/v) BSA를 포함한 인산염 완충된 염수로 실온에서 2시간 동안 차단시킨 다음, 0.1% Tween 20을 포함한 PBS(PBST)에서 세척한다. 정제된 항체 10E3-G4-D3을 PBST중 2배 희석 농도(1000 내지 16ng)로 가하고, 실온에서 30분 동안 배양한다. PBST로 6회 세척한 다음, HRP-접합 당나귀 항-마우스 IgG (H+L)Affinipure F(ab') 단편(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)과 1:20000의 희석비에서 30분 동안 배양한다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고 테트라메틸 벤지딘과 15분 동안 배양한다. 1N 황산을 가하여 반응을 정지시키고 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450㎚에서 플레이트를 판독한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 서열 496의 펩타이드(P501S의 아미노산 439 내지 459에 상응) 및 P501S 단편과 반응성을 나타내지만 나머지 펩타이드와는 반응하지 않았는데, 이는 10E-G4-D3에 의해 인지되는 에피토프가 서열 113의 아미노산 439 내지 459에 집중되어 있음을 입증한다.
P501S의 조직 특이성을 추가로 평가하기 위해, 모든 모든 주 기관뿐만 아니라 이들 조직으로부터 유도된 신생물을 포함하는 대략 4700개의 상이한 사람 조직상에서 다중 면역조직화학적 분석 검정을 실시한다. 이러한 사람 조직의 65개가 전립선 기원이다. 직경이 0.6㎜인 조직 단편을 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 침지시킨다. 10mM 시트레이트 완충액 pH 6.0을 사용하여 HIER로 샘플을 전처리하고 10분 동안 비등시킨다. 단편을 10E3-G4-D3으로 염색시키고, HRP로 P501S 반응성을 가시화한다. 모두 65개의 전립선 조직 샘플(정상 5개, 처리하지 않은 전립선종양 55개 및 호르몬 저항성 전립선 종양 5개)이 양성이었고, 이는 핵 주변이 뚜렷하게 염색되었다. 조사한 모든 다른 조직은 P501S 발현에 대해 음성이었다.
c) P503S에 대한 항체의 제조 및 특성화
P501S에 대해 상기한 바와 본질적으로 동일하게, P501S 단편(서열 114의 아미노산 113 내지 241)을 발현시키고 세균으로부터 정제하여 래빗 및 마우스에 면역반응을 일으킨다. 마우스 모노클로날 항체는 상기한 바와 같이 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 분리시킨다. 래빗 모노클로날 항체는 선택된 임파구 항체 방법(Selected Lymphocyte Antibody Method; SLAM) 기술(Immunohenics Pharmaceuticals, Vancouver, BC, Canada)을 사용하여 분리시킨다. 아래 표 VI는 P503S에 대해 생성된 모노클로날 항체의 명단이다.
| 항체 | 종 |
| 20D4 | 래빗 |
| JA1 | 래빗 |
| JA4 | 마우스 |
| 1C3 | 마우스 |
| 1C9 | 마우스 |
| 1D12 | 마우스 |
| 2A11 | 마우스 |
| 2H9 | 마우스 |
| 4H7 | 마우스 |
| 8A8 | 마우스 |
| 8D10 | 마우스 |
| 9C12 | 마우스 |
| 6D12 | 마우스 |
래빗 모노클로날 항체 20D4 및 JA1에 대한 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 DNA 서열이 결정되어 각각 서열 502 및 503으로 제공된다.
각 항체의 에피토프 결합 영역을 보다 확정하기 위해, 서열 114의 아미노산 109 내지 213을 포괄하는 일련의 중복 펩타이드를 생성한다. 이러한 펩타이드는, 다음과 같이 ELISA에 의해 항-P503S 모노클로날 항체의 에피토프를 맵화하는데 사용한다. 면역원으로 사용되는 P501S의 재조합 단편을 양성 대조로서 사용한다. 96웰 미세역가 플레이트는, 펩타이드 또는 재조합 항원을 1ng/웰로 4℃에서 밤새 피복시킨다. 웰을 공기로 빨아낸 다음, 1%(w/v) BSA를 포함한 인산염 완충된 염수로 실온에서 2시간 동안 차단시킨 다음, 0.1% Tween 20을 포함한 PBS(PBST)에서 세척한다. PBST에서 희석시킨 정제된 래빗 모노클로날 항체를 웰에 가하고 실온에서 30분 동안 배양한다. PBST로 6회 세척한 다음, 1:20000의 희석비로 단백질-HRP 접합체와 함께 30분 동안 추가로 배양한다. 그런 다음, 플레이트를 PBST중에서 6회 세척하고 테트라메틸 벤지딘 기질과 15분 동안 추가로 배양한다. 1N 황산을 가하여 반응을 정지시키고, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450㎚에서 플레이트를 판독한다. 검정에서 순수하게 전개된 조직 배양물의 상층액을 사용하여 마우스 모노클로날 항체와 함께 ELISA를 수행한다.
음성 대조 SP2 상층액을 제외하고는 모든 항체가 재조합 P503S 단편에 결합하였다. 20D4, JA1 및 AD12는 펩타이드 #2101(서열 504)에 강하게 결합하였는데, 이는 서열 114의 아미노산 151 내지 169에 상응한다. 1C3은 펩타이드 #2102(서열 505)에 강하게 결합하였는데, 이는 서열 114의 아미노산 165 내지 184에 상응한다. 9C12는 펩타이드 #2099(서열 522)에 결합하였는데, 이는 서열 114의 아미노산 120내지 139에 상응한다. 다른 항체는 본 연구에서는 조사하지 않은 영역에 결합하였다.
후속적인 에피토프 맵화에서는, 세포 표면 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해 P503S를 안정되게 발현하는 세포주상에서 FACS 분석으로 항체를 조사한다. 대조 플라스미드로 안정하게 형질감염시킨 세포를 음성 대조로서 사용한다. 세포는 살아있는 상태로 염색시키고 고정시키지는 않는다. 항-P503S 모노클로날 항체 5㎍을 가하고 세포를 30분 동안 얼음에서 배양한 다음, 2회 세척하고 FITC 표지된 염소 항-래빗 또는 마우스 2차 항체와 함께 20분 동안 배양한다. 2회 세척한 후, 엑스칼리버 형광 활성화 세포 분류기로 세포를 분석한다. 모노클로날 항체 1C3, 1D12, 9C12, 20D4 및 JA1은 P503S의 세포 표면 에피토프에 결합하지만 8D3은 결합하지 않는 것으로 나타났다.
P503S를 발현하는 조직을 결정하기 위해, 본질적으로는 상기한 바와 같이 정상 조직부(전립선, 부신, 유방, 경부, 결장, 십이지장, 담낭, 회장, 신장, 난소, 췌장, 이하선, 골격근, 비장 및 고환) 패널에서 면역조직화학 분석을 실시한다. TMB와 함께 배양한 HRP-표지된 항-마우스 또는 항-래빗 항체를 사용하여 P503S 면역반응을 가시화한다. P503S는 전립선 조직에서는 높게 발현되고 경부, 결장, 회장 및 신장에서는 관찰할 수 있는 수준으로 낮게 발현되며 부신, 유방, 십이지장, 담낭, 난소, 췌장, 이하선, 골격근, 비장 및 고환에서는 발현이 관찰되지 않았다.
웨스턴 블롯 분석을 사용하여 항-P503S 모노클로날 항체 특이성을 조사한다. 세균에서 발현시키고 세균으로부터 정제한 재조합(rec) P503S 및 전체 길이 P503S로 형질감염시킨 HEK293 세포로부터의 용해물로 SDS-PAGE를 실시한다. 단백질을 니트로셀룰로스로 이전시킨 다음, 1㎍/㎖의 농도로 각각의 항-P503S 모노클로날 항체(20D4, JA1, 1D12, 6D12 및 9C12)를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시한다. 염소 항-마우스 모노클로날 항체 또는 단백질 A-세파로스에 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 사용하여 단백질을 검출한다. 모노클로날 항체 20D4는 적절한 분자량이 14kDa인 재조합 P503S(아미노산 113 내지 241)를 검출하고, 전체 길이 P503S로 형질감염된 HEK293 세포 용해물중 23.5kDa 종류를 검출하였다. 다른 P503S 모노클로날 항체도 웨스턴 블롯에서 유사한 특이성을 나타낸다.
d) P703P에 대한 항체의 제조 및 특성화
상기한 바와 같이 세균내에서 단백질을 발현시키고 세균으로부터 정제한 재조합 P703P 단백질의 절단된 형태(P703Ptrl; 서열 172) 또는 전체 길이의 완전한 형태(P703Pfl; 서열 523)로 래빗에게 면역반응을 일으킨다. 친화적으로 정제한 폴리클로날 항체는 고체 지지체상에 부착되어 있는 면역원 P703Pfl 또는 P703Ptrl을 사용하여 수득한다. 래빗 모노클로날 항체는 SLAM 기술(Immgenics Pharmaceuticals)을 사용하여 분리시킨다. 표 VII는 P703P에 대해 생성된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두를 열거한 것이다.
| 항체 | 면역원 | 종/유형 |
| Aff. Purif. P703P (절단됨); #2594 | P703Ptrl | 래빗 폴리클로날 |
| Aff. Purif. P703P (전체 길이); #9254 | P703Ptrl | 래빗 폴리클로날 |
| 2D4 | P703Ptrl | 래빗 모노클로날 |
| 8H2 | P703Ptrl | 래빗 모노클로날 |
| 7H8 | P703Ptrl | 래빗 모노클로날 |
래빗 모노클로날 항체 8H2, 7H8 및 2D4에 대한 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 DNA 서열이 결정되었고 각각 서열 506 내지 508로 제공된다.
에피토프 맵화 연구는 상기한 바와 같이 수행한다. 모노클로날 항체 2D4 및 7H8은 서열 509(서열 172의 아미노산 145 내지 159에 상응) 및 서열 510(서열 172의 아미노산 11 내지 25에 상응)의 펩타이드와 각각 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 폴리클로날 항체 2594는 서열 511 내지 514의 펩타이드와 결합하고 폴리클로날 항체 9427은 서열 515 내지 517의 펩타이드와 결합하는 것으로 나타났다.
항-P703P 항체의 특이성은 다음과 같이 웨스턴 블롯으로 확인한다. SDS-PAGE는, (1) 세균 발현된 재조합 항원, (2) 전체 길이 P703P를 발현하는 플라스미드로 형질감염시키거나 감염시키지 않은 Ltk-/- 세포 및 HEK293 세포의 용해물 및 (3) 이러한 세포 배양물로부터 분리시킨 상층액으로 수행한다. 단백질을 니트로셀룰로스에 이전시킨 다음, 1㎍/㎖의 항원 농도로 항-P703P 폴리클로날 항체 #2594를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시한다. 항-래빗 항체에 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 사용하여 단백질을 검출한다. 35kDa 면역반응성 밴드가 재조합 P703P와 함께 관찰되었다. 재조합 P703P는 에피토프 tag 때문에 분자량이 약간 높게 전개되었다. 전체 길이 0703P로 형질감염된 세포의 용해물 및 상층액에서, P703P에 상응하는 30kDa 밴드가 관찰되었다. 특이성을 확인하기 위해, 대조 플라스미드로 안정하게 형질감염시킨 HEK293 세포의 용해물도 시험하였는데 P703P 발현에 대해 음성이었다. 다른 항-P703P 항체도 유사한 결과가 나타났다.
면역조직화학적 연구는 항-P703P 모노클로날 항체를 사용하여 상기한 바와 같이 수행한다. P703P는 정상 전립선 및 전립선 종양 조직에서 높은 수준으로 발현되지만 시험한 다른 모든 조직(유방 종양, 폐종양 및 정상 신장)에서는 검출되지 않는 것으로 나타났다.
e) P504S에 대한 항체의 제조 및 특성화
P501S에 대해 상기한 바와 본질적으로 동일하게, 전체 길이 P504S(서열 108)을 세균에서 발현시켜 이로부터 정제하고, 선택된 임파구 항체 방법(Selected Lymphocyte Antibody Method; SLAM, Immgenics Pharmaceuticals, Vancouver, BC, Canada) 기술을 사용하여 래빗 모노클로날 항체를 상승시킨다. 웨스턴 블롯에 의해 항-P504S 모노클로날 항체 13H4가 발현된 재조합 P504S 및 종양 세포에 있는 고유 P504S 모두와 결합하는 것으로 나타났다.
다양한 전립선 조직에서 P504S 발현을 평가하기 위해 13H4를 사용하는 면역조직학적 연구는 상기한 바와 같이 수행한다. 전립선 암(PC)이 있는 근차적 전립선 적출물 65가지, 전립선 생검물 26가지 및 양성 전립선 과형성물(BPH) 13가지를 포함하여 총 104가지 경우를 항-P504S 모노클로날 항체 13H4로 염색시킨다. P504S는 전립선 암의 근차적 전립선 적출물에서는 64/65(98.5%), 전립선 생검물에서는 전립선 암의 26/26(100%)에서 강력한 세포질 과립성 염색을 나타낸다. P504S는 암종(PC의 경우 91.2%에서 4+; 5.5%에서 3+; 2.2%에서 2+ 및 1.1%에서 1+) 및 고도의 전립선 상피내 종양(모든 경우에서 4+)에서 강력하게 널리 염색되었다. P504S의 발현은 글리슨 수치로 변화시키지 않았다. 거대선에서 전립선 암 주변의 NP/BPH에서는 17/91(18.7%), BPH에서는 2/13(15.4%)만이 P504S에 대해 집중적(모든 경우에 있어서 1+, 2+ 내지 4+ 없음)이면서 약한 양성이다. P504S의 발현은 생검 또는 근차적 전립선 적출에서 위축성 선, 위축후 과형성물, 기저세포 과형성물 및 일시적 세포 이형성물에서는 나타나지 않는다. P504S는 전립선 암의 글리슨 수치 모두에서 과발현되는 것으로 나타났고(감수성 98.5 내지 100%), 정상 거대선에서만 집중적으로 양성을 나타내었다(19/104, 특이성 82.3%). 이러한 조사 결과는 P5048이 전립선 암 진단에 유용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 19
전립선-특이적 항원 P501S의 세포 표면 발현 및 염색체 위치의 특성화
본 실시예는, 전립선 특이적 항원 P501S가 세포 표면에서 발현됨을 입증하는 연구와 함께 P501S의 가능한 염색체상 위치를 결정하기 위한 연구를 기술할 것이다.
단백질 P501S(서열 113)은 11개의 막통과 도메인을 갖는 것으로 예상된다. 항-P501S 모노클로날 항체 10E3-G4-D3에 의해 인지되는 에피토프가 세포내에 있다는 발견(실시예 17에서 기술함)을 기초로 하여, 다음의 막 통과 결정체가 P501S의 세포외 도메인 예상을 가능하게 할 것이다. 도 9는 실시예 17에서 기술한 세포내 에피토프와 막통과 도메인의 예상 위치를 나타내는, P501S 단백질의 개략도이다. 강조한 서열은 예상되는 막통과 도메인을 나타내고 진한 색의 서열은 예상되는 세포외 도메인을 나타내며 이탤릭체 서열은 예상되는 세포내 도메인을 나타낸다. 막통과 도메인의 위치는 HHHMTOP를 사용하여 예측한다[참조 문헌: Tusnady and Simon, Principles Governing Amino Acid Composition of Integral Membrane Proteins: Applications to Topology Prediction, J. Mol. Biol. 283:489-506, 1998].
도 9를 기초로 하여, 아미노산 274 내지 295 및 323 내지 342에 상응하는 막통과 도메인이 플랭킹된 P501S 도메인은 세포내에 있는 것으로 예상된다. 서열 518의 펩타이드는 P501S의 아미노산 306 내지 320에 상응하고 예상되는 세포외 도메인에 있다. 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 것을 제외하고는 서열 518과 동일한 서열 519의 펩타이드는 상기한 바와 같이 합성한다. Cys-Gly를 펩타이드 C-말단에 가하여 운반 단백질에 접합이 잘 되도록 한다. 고상 지지체로부터 펩타이드를 절단하는 것은 다음 절단 혼합물을 사용하여 수행한다: 트리플루오로아세트산: 에탄디올: 티오아니솔: 물: 페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 절단한 다음, 차가운 에테르에서 펩타이드를 침전시킨다. 펩타이드 펠렛을 1% v/v 아세트산에 용해시킨 다음, 냉동건조시키고 C18 역상 HPLC로 정제한다. 물(0.05% TFA 함유)중의 5 내지 60% 아세토니트릴(0.05% TFA 함유) 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시킨다. 펩타이드의 순도는 HPLC 및 질량 분광광도계로 확인하는데 95% 이상인 것으로 나타났다. 정제된 펩타이드를 사용하여 상기한 바와 같이 래빗 폴리클로날 항혈청을 생성한다.
P501S의 표면 발현은 FACS 분석으로 조사한다. 세포는 10㎍/㎖의 폴리클로날 항-P501S 펩타이드로 염색시키고 세척하고, 2차 FITC-접합된 염소 항-래빗 Ig 항체(ICN)와 배양하고 세척하고, 엑스칼리버 형광 활성화 세포 분류기를 사용하여 FITC 형광도에 대해 분석한다. 형질유도된 세포의 FACS 분석에서, 레트로바이러스를 사용하여 B-LCL을 P501S로 형질유도시킨다. 이러한 검정에서 특이성을 입증하기 위해, 부적절한 항원(P703P)으로 형질유도되거나 형질유도되지 않은 B-LCL를 동일하게 염색시킨다. 전립선 종양 세포주의 FACS 분석의 경우, Lncap, PC-3 및 DU-145를 사용한다. 전립선 종양 세포주는 세포 분리 배지를 사용하여 조직 배양 플레이트로부터 분리시키고 상기한 바와 같이 염색시킨다. 모든 샘플은 FACS 분석 전에 프로피듐 요오다이드(PI)로 처리하고, PI가 차단된(즉, 완전하여 투과되지 않은) 세포로부터 데이타를 수득한다. 서열 519의 펩타이드에 대해 생성된 래빗 폴리클로낭 항체는 P5018을 발현하도록 형질유도된 세포의 표면을 특이적으로 인지하는 것으로 나타났고, 이는 폴리클로날 항체에 의해 인지되는 에피토프가 세포외에 있다는 것을 입증한다.
P5018이 세포 표면상에서 발현된다는 것을 생화학적으로 입증하기 위해, Lncap 세포의 주변막을 분리시키고 웨스턴 블롯을 실시한다. 상세하게는, Lncap 세포를 도운스(dounce) 균질기를 사용하여 균질 완충액(250mM 슈크로스, 10mMHEPES, 1mM EDTA, pH 8.0, 1개의 프로테아제 완전 억제제 정제(Boehringer Mannheim))중에서 용해시킨다. 용해 샘플을 1000g, 4℃에서 5분 동안 회전시켜 가라앉힌다. 그런 다음, 상층액을 8000g, 4℃에서 10분 동안 회전시켜 가라앉힌다. 8000g 회전의 상층액을 회수하고 100,000g, 4℃에서 30분 동안 회전시켜 주변막을 회수한다. 샘플을 SDS-PAGE로 분리시킨 다음, 상기한 조건을 사용하여 마우스 모노클로날 항 10E3-G4-D3(실시예 17에서 기술)을 사용하여 웨스턴 블롯을 실시한다. P501S로 형질감염되어 이를 과발현하는 HEK293 뿐만 아니라 재조합 정제된 P501S가 P501S 검출용 양성 대조로서 포함된다. LCL 세포 용해물은 음성 대조로서 포함된다. P501S는 Lncap 전체 세포 용해물, 8000g(내막) 분획 및 또한 100,000g(원형질막) 분획에서 검출될 수 있다. 이러한 결과는, P501S가 주변막에서 발현되고 이에 위치한다는 것을 나타낸다.
서열 519의 펩타이드에 대해서 생성된 래빗 폴리클로날 항혈청이 이 펩타이드뿐만 아니라 서열 518의 상응하는 고유 펩타이드도 특이적으로 인지한다는 것을 입증하기 위해, ELISA 분석을 실시한다. 이 분석의 경우, 바닥이 편평한 96웰 미세역가 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 1㎍/㎖의 서열 519의 펩타이드, 전체 예상 세포외 도메인을 포괄하는 서열 520의 보다 긴 펩타이드, P501S 특이적 항체 10E3-G4-D3에 의해 인지되는 에피토프를 나타내는 서열 521의 펩타이드 또는 면역 펩타이드 서열을 포함하지 않는 P501S 단편(서열 113의 아미노산 355 내지 526에 상응)으로 피복시킨다. 웰을 공기로 빨아낸 다음, 1%(w/v) BSA를 포함한 인산염 완충된 염수로 실온에서 2시간 동안 차단시킨 다음, 0.1% Tween 20을 포함한 PBS(PBST)에서 세척한다. 정제된 항-P501S 폴리클로날 래빗 항체를 PBST중에서 2배 희석 농도(1000 내지 125ng)로 가하고, 실온에서 30분 동안 배양한다. PBST로 6회 세척한 다음, HRP-접합 당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 아핀푸어(Affinipure) F(ab') 단편과 1:20000의 희석비에서 30분 동안 배양한다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고 테트라메틸 벤지딘과 15분 동안 배양한다. 1N 황산을 가하여 반응을 정지시키고 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450㎚에서 플레이트를 판독한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 항-P501S 폴리클로날 래빗 혈청은 면역반응에 사용된 서열 519의 펩타이드뿐만 아니라 서열 520의 보다 긴 펩타이드를 특이적으로 인지하지만 부적절한 P501S 유래의 펩타이드 및 단편을 인지하지는 않는다.
추가 연구에서, P501S 서열로부터 유래하고 도 9에 나타낸 바와 같이 세포외 또는 세포내에 있는 것으로 예상되는 펩타이드로 래빗에 면역반응을 일으킨다. 폴리클로날 래빗 혈청을 분리하고 혈청중 폴리클로날 항체를 상기한 바와 같이 분리한다. P501S와의 특이적 반응성을 조사하기 위해, 유두 바이러스를 발현하는 P501S로 감염된 B-LCL중에서, P501S 또는 부적절한 항원 P703P로 형질감염된 B-LCL을 사용하여 FACS 분석을 실시한다. 표면 발현의 경우, 죽은 세포 및 불완전한 세포는 상기한 바와 같이 분석으로부터 배제시킨다. 세포내 염색의 경우, 세포를 고정시키고 상기한 바와 같이 삼투시킨다. P501S의 아미노산 181 내지 198에 상응하는 서열 548의 펩타이드에 대해 생성된 래빗 폴리클로날 항체가 P501S의 표면 에피토프를 인지하는 것으로 나타났다. 다른 실험에서는 폴리클로날 혈청에 의해 완전한 세포 또는 삼투시킨 세포가 인지되므로, P501S의 아미노산 543 내지 553에 상응하는 서열 551의 펩타이드에 대해 생성된 래빗 폴리클로날 항체가 세포외 또는 세포내일 수 있는 에피토프를 인지하는 것으로 나타났다. 유사한 연역 추론을 기본으로 하여, P501S의 아미노산 109 내지 122, 539 내지 553, 509 내지 520, 37 내지 54, 342 내지 359, 295 내지 323, 217 내지 274, 143 내지 160 및 75 내지 88에 각각 상응하는 서열 541 내지 547, 549 및 550의 서열이 항체에 의해 인지되는 P501S의 표면 에피토프일 수도 있다.
추가 연구에서, 세포외 도메인으로 예상되는 P501S의 아미노산 296 내지 322에 대해 마우스 모노클로날 항체를 증강시킨다. A/J 마우스는 P501S/아데노바이러스를 사용하여 면역반응을 일으킨 다음, P501S의 아미노산 296 내지 322를 포함하고 P501N으로 지칭되는 이. 콜라이 재조합 단백질 및 KLH와 커플링된 펩타이드 296 내지 322(서열 755)를 추가 접종시킨다. 항-펩타이드 하이브리도마를 생성하기 위해 비장 B 세포 융합용으로 마우스를 사용한다. 4F4(IgG1, kappa), 4G5(IgG2a, kappa) 및 9B9(IgG1, kappa)인 수득한 3개의 클론은 항체를 생성하기 위해 성장시킨다. 4G5mAb는, 상층액을 단백질 A-세파로스 칼럼에 통과시킨 다음, 0.2M 글리신, pH 2.3을 사용하여 항체를 용출시킴으로써 정제한다. 정제된 항체는 1M Tris, pH 8 및 PBS로 교환된 완충액을 부가하여 중화시킨다.
ELISA 분석의 경우, 96웰 플레이트는 모두 2㎍/㎖의 P501S 펩타이드 296 내지 322(P501-long으로 지칭함), 부적절한 P775 펩타이드, P501S-N, P501TR2, P501S-long-KHL, P501S 펩타이드 306 내지 319(P501-short으로 지칭함) 또는 부적절한 펩타이드 2073-KHL로 피복시키고 37℃에서 60분 동안 배양한다. 피복시킨후, 플레이트를 PBS+0.1% Tween으로 5X 세척한 다음, PBS, O.5% BSA, 0.4% Tween 20으로 실온에서 2시간 동안 차단시킨다. 상층액 또는 정제된 mAb를 가한 후, 플레이트를 실온에서 60분 동안 배양한다. 상기한 바와 같이 플레이트를 세척하고 당나귀 항-마우스 IgHRP 결합된 2차 항원을 가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음, 상기한 바와 같이 최종적으로 세척한다. TMB 퍼옥시다제 기질을 가하고 암실 실온에서 15분 동안 배양한다. 1N H2SO4를 가하여 반응을 종결시키고 450㎚에서 OD를 판독한다. 모두 2가지 유형의 클론이, 펩타이드 296 내지 322 및 재조합 단백질 P501N을 인지하는 mAb를 분비한다.
FACS 분석의 경우, 푸진 6 시약을 사용하여 P501S/VR1012 발현 작제물로 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시킨다. 배양한지 2일 후, 세포를 수집하고 세척한 다음, 정제된 4G5 mAb와 30분 동안 얼음에서 배양한다. PBS에서 수차례 세척한 후, 0.01% 아지드, 염소 항-마우스 Ig-FITC를 세포에 가하고 얼음에서 30분 동안 배양한다. 세포를 세척하고 1% 프로피듐 요오다이드를 포함한 세척 완충액에 재현탁시키고 FACS 분석을 실시한다. FACS 분석으로 P501S의 아미노산 296 내지 322가 세포외 도메인이고 세포 표면에서 발현된다는 것을 확인하였다.
P501S의 염색체상 위치는 진브리지 4 라디에이션 하이브리드 패널(GeneBridge 4 Radiation Hybrid panel (Research Genetics))을 사용하여 확인한다. 제조자의 지시에 따라 하이브리드 패널의 DNA 집단과 서열 528 및 529의 PCR 프라이머를 PCR에서 사용한다. 38사이클 동안 증폭시킨 후, 반응 산물을 1.2%아가로스 겔상에서 분리시키고, 결과는 게놈 연구 웹 지원을 위한 화이트헤드 인스티튜트/MIT 센터(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research web server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl))를 통해 분석하여 가능성있는 염색체 위치를 찾아낸다. 이러한 방법을 사용하여 P501S는 1번 염색체 긴 팔의 q32와 q42 사이의 WI-9641에 위치하는 것으로 맵이 작성되었다. 1번 염색체의 이 영역은 유전성 전립선 암에서 전립선 암 감수성과 연관이 있다[참조 문헌: Smith et al. Science 274:1371-1374, 1996 and Berthon et al. Am. J. Hum. Genet. 62:1416-1424, 1998]. 이러한 결과는 P501S가 전립선 암 악성도에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 20
전립선-특이적 항원 P501S의 발현 조절
전립선 암에서 스테로이드(안드로겐) 호르몬 조절은 일반적인 치료 방식이다. 다수의 전립선 조직 특이적 항원 발현은 안드로겐에 반응하는 것으로 이미 입증되었다. 안드로겐 치료에 대한 전립선 특이적 항원 P501S의 반응도는 조직 배양 시스템에서 다음과 같이 조사한다.
전립선 종양 세포주 LnCaP 세포를 1.5x106세포/T75 플라스크(RNA를 분리하는 경우) 또는 6웰 플레이트에 3x105세포/웰(for FACS를 분석하는 경우)로 플레이팅하고, 탄소가 제거된 10% 송아지 태아 혈청을 포함한 RPMI 1640 배지(BRL LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)에서 밤새 성장시킨다. 탄소가 제거된 10% 송아지 태아 혈청을 포함한 RPMI 1640에서 세포 배양물을 72시간 동안 추가로 유지시키고, 다양한 시점에서 1nM의 합성 안드로겐 메틸트리에놀론(R1881; New England Nuclear)을 가한다. 안드로겐을 가한 후, RNA 분리용 및 FACS 분석용으로 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 28 및 72시간에 세포를 수집한다. FACS 분석은 항-P501S 항체 10E3-G4-D3 및 삼투된 세포를 사용하여 실시한다.
노던 분석의 경우, 전체 RNA의 5 내지 10㎍을 포름알데히드 변성 겔에서 전개하고 하이본드-N 나일론 막(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 이전시킨 다음, 가교결합시키고 메틸렌 블루로 염색시킨다. 필터를 처치(Church) 완충액 (250mM Na2HPO4, 70mM H3PO4, 1mM EDTA, 1% SDS, 1% BSA, pH 7.2)으로 65℃에서 1시간 동안 미리 하이브리드화한다. P501S DNA는 하이 프라임 랜덤 프라임 DNA 표지 키트(High Prime random-primed DNA labeling kit; Boehringer Mannheim)를 사용하여32P로 표지시킨다. 혼입되지 않은 표지물은 마이크로스핀 S300-HR 칼럼(MicroSpin S300-HR columns; Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 제거한다. RNA 필터를 표지된 cDNA를 포함한 신선한 처치 완충액으로 밤새 하이브리드화한 다음, 1X SCP(0.1M NaCl, 0.03M Na2HPO4·7H2O, 0.001M Na2EDTA), 1% 사르코실(n-라우로일사르코신)로 세척하고 X-선 필름에 노출시킨다.
FACS 및 노던 분석 모두에서 P501S의 신호 및 단백질 수준은, 안드로겐 처리에 반응하여 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 20
전립선-특이적 항원 융합 단백질의 제조
본 실시예는 전립선 특이적 항원 P703P와 공지된 전립선 항원 PSA의 절단된 형태와의 융합 단백질을 제조하는 방법을 기술할 것이다. PSA의 절단된 형태는 활성 세린 부위 부근에 21개 아미노산이 결실되어 있다. 융합 단백질에 대한 발현 작제물은 또한 종결 코돈 바로 전에 3' 말단에 제한 부위가 있는데, 이는 추가 항원을 위해 cDNA를 부가하기 위해서이다.
PSA용 전체 길이 cDNA는 사람 전립선 종양 조직의 RNA 집단으로부터 서열 607 및 608의 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 수득하고, pCR-Blunt II-TOPO에 클로닝한다. 수득한 cDNA를 주형으로 하여 2세트의 프라이머(서열 609 및 610, 서열 611 및 612)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 PSA의 2개의 상이한 단편을 제조한다. 예상 크기의 PCR 산물을 주형으로 하여, PSA를 생성하는 서열 611 및 613의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 PSA의 절단된 형태를 제조한다(아미노산중 델타 208-218). 5' 말단에 6X 히스티딘 tag이 있는 P703P의 완전한 형태를 위한 cDNA는, 서열 614 및 615의 프라이머와 P703P를 사용하여 PCR을 수행함으로써 제조한다. 그런 다음, 절단된 형태의 PSA와 P703P의 융합을 위한 cDNA(FOPP로 지칭함)는, 주형으로서 변형된 P703P cDNA 및 PSA cDNA의 절단된 형태를 사용하고 서열 614 및 615의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득한다. FOPP cDNA를 발현 벡터 pCRX1의 NdeI 부위 및 XhoI 부위에 클로닝하고 DNA 서열분석을 하여 이를확인한다. 융합 작제물 FOPP에 대해 결정된 cDNA는 서열 616으로 제공되고 아미노산 서열은 서열 617로 제공된다.
융합 FOPP는 다음과 같이 이. 콜라이에서 단일 재조합 단백질로서 발현된다. 발현 플라스미드 pCRX1FOPP로 이. 콜라이 균주 BL21-CodonPlus RIL를 형질전환시킨다. 형질전환체를 1mM IPTG로 유도하면 FOPP 단백질을 발현하는 것으로 나타난다. 상응하는 발현 클론의 배양물은 50㎍/㎖의 가나마이신 및 34㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함한 LB 배지 25㎖에 접종하고 DO600이 약 1이 되도록 37℃에서 성장시키고 4℃에서 밤새 저장한다. 50㎍/㎖의 가나마이신 및 34㎍/㎖의 클로람페닐콜을 포함한 TB LB 1ℓ에 배양물을 희석시키고, DO600이 0.4가 되도록 37℃에서 성장시킨다. IPTG를 1mM의 최종 농도로 가하고, 배양물을 30℃에서 3시간 동안 배양한다. 5,000RPM에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 단백질을 정제하기 위해, 세포 펠렛을 10mM Tris-Cl pH 8.0, 2mM PMSF, 프로테아제 완전 억제제 및 라이소자임 15㎍의 25㎖에 현탁시킨다. 세포를 4℃에서 30분 동안 용해시키고, 수회 초음파분쇄한 다음, 용해물을 10,000xg에서 30분 동안 원심분리한다. 함유체를 포함한 침전을 10mM Tris-Cl pH 8.0 및 1% CHAPS로 2회 세척한다. 함유체를 10mM Tris-Cl pH 8.0, 100mM 인산나트륨 및 8M 우레아 40㎖에 용해시킨다. 용액을 실온에서 1시간 동안 Ni-NTA(Qiagen) 8㎖과 결합시킨다. 혼합물을 25㎖ 칼럼에 붓고 10mM Tris-Cl pH 6.3, 100mM 인산나트륨, 0.5% DOC 및 8M 우레아 50㎖로 세척한다. 결합된 단백질은 350mM 이미다졸, 10mM Tris-Cl pH 8.0, 100mM 인산나트륨 및 8M 우레아로 용출시킨다. FOPP 단백질을 포함한 분획을 합하고, 10mM Tris-Cl pH 4.6에 대해 광범위하게 투석하고 분취량을 취한 다음, -70℃에서 저장한다.
실시예 21
전립선 암환자의 말초 혈액중 전립선 특이적 항원 P501S의 실시간 PCR 특성화
정상인과 전이성 전립성 암환자의 신선한 혈액으로부터 순환 상피 세포를 분리하고, mRNA를 분리하도 실시간 PCR 공정을 사용하여 cDNA를 제조한다. 유전자 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하고 TaqmanTM공정을 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 발현 수준을 결정한다.
상피 세포는 면역자기 비드 분리 방법(immunomagnetic bead separation method, Dynal A.S., Oslo, Norway)을 사용하여 혈액 샘플로부터 수집한다. 분리된 세포를 용해시키고 자기 비드를 제거한다. Oligo(dT)25로 피복된 자기 비드를 사용하여 폴리 A+ mRNA를 분리하기 위해 용해물을 처리한다. 완충액중 비드를 세척한 다음, 비드/폴리 A+ RNAS 샘플을 10mM Tris HCl pH 8.0에 현탁시키고 역전사시킨다. 수득한 cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행한다. 베타-액틴 함량도 측정하여 표준화에 사용한다. P501S 복사체가 정상 샘플의 평균보다 +3의 표준편차로 많은 샘플을 양성으로 간주한다. 혈액 샘플상의 실시간 PCR은 TaqmanTM공정을 사용하되, 전방향 및 역방향 프라이머와 P501S에 특이적인 프로브를 사용하여 50사이클로 증폭시킨다. 시험한 8개의 샘플중에서, 6개는 P501S 및 β-액틴 신호에 대해 양성이다. 나머지 2개의 샘플에서는액틴 및 P501S를 검출할 수 없었다. 시험한 정상 혈액 샘플 4개중에서 P501S는 관찰되지 않았다.
실시예 22
SCID 마우스-계대 전립선 종양에서 전립선-특이적 항원 P703P 및 P501S의 발현
전립선 암 치료에서 항원의 유효성을 고려하는 경우, 안드로겐 제거 치료 동안에 종양에서 항원이 지속적으로 존재하는 것이 중요하다. 테스토스테론의 존재하에 SCID 마우스에서 성장한 전립선 종양 샘플에서 전립선 특이적 항원 P703P 및 P501S의 존재는 다음과 같이 평가한다.
뼈로 전이된 2개의 전립선 종양을 환자로부터 절제해 SCID 마우스에 이식하고 테스토스테론의 존재하에 성장시킨다. 종양은 SYBR 그린 검정법과 함께 실시간 정량 PCR을 사용하여 P703P, P501S 및 PAS의 mRNA 발현에 대해 평가한다. 전립선 종양에서의 P703P 및 P501S의 발현을 양성 대조로서 사용하고, 정상 장관 및 정상 심장에서의 이들의 부재를 음성 대조로서 사용한다. 양쪽의 경우에서, 특이적 mRNA가 말기 종양에 존재하였다. 테스토스테론의 존재하에서 뼈 전이물이 성장하기 때문에, 이는 안드로겐 제거 치료에서 이들 유전자의 존재가 무의미한 것이 아님을 암시한다.
실시예 23
항-P503S 모노클로날 항체는 생체내 종양 성장을 억제한다
마우스에서 항-P503S 모노클로날 항체의 종양 형성 억제능은 다음과 같이 조사한다.
10마리의 SCID 마우스에게 P503S를 발현하는 HEK293 세포를 피하 주사한다. 5마리의 마우스에게는 0일(종양 세포 주입 시기), 5일 및 9일째에 20D4 150㎍을 정맥주사한다. 50일 동안 종양 크기를 측정한다. 20D4를 주사하지 않은 5마리의 마우스중에서, 3마리는 약 2 주 후에 검출가능한 종양이 형성되었고 연구 기간동안 지속적으로 확대되었다. 이와는 반대로, 20D4를 주사한 5마리의 마우스에서는 종양이 형성되지 않았다. 이 결과는 항-P503S Mab 20D4가 생체내에서 효능있는 항종량 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 24
P501S-특이적 T 세포 클론으로부터의 T 세포 수용체 클론의 특성화
T 세포는 수명이 제한되어 있다. 그러나, T 세포 수용체(TCR) 쇄의 클로닝과 후속적인 전달은 본질적으로 T 세포 특이성의 무한한 보급을 가능하게 한다. 종양 항원 TCR 쇄의 클로닝은 TCR MHC-제한 대립유전형질을 보유하는 환자로부터 분리된 T 세포에 특이성을 전달할 수 있다. 이러한 T 세포는 증폭되어 인입 면역 전달시 사용되어서 항원을 발현하는 종양이 있는 환자에게 종양 항원 특이성을 도입할 수 있다. 전립선 특이적 항원 P501S에 대해 특이적인 CD8 T 세포 클론으로부터의 T 세포 수용체 알파 및 베타 쇄를 분리하여 다음과 같이 서열분석한다.
CTL 클론 4E5(실시예 12에서 기술)의 2x106세포로부터 트리졸 시약을 사용하여 전체 mRNA를 분리시키고 cDNA를 합성한다. 클론에서 Va 및 Vb 서열을 결정하기 위해, Va 및 Vb 이소타입 특이적 프라이머의 패널을 합성하고 클론 각각으로부터 생성된 cDNA와 함께 RT-PCR에 사용한다. RT-PCR 반응으로 각 클론이 Vb7 서브패밀리에 상응하는 공통의 Vb 서열을 발현한다는 것이 입증되었다. 또한, 클론으로부터 생성된 cDNA를 사용하여 발현된 Va 서열이 Va6인 것으로 확인되었다. 클론 4E5로부터 전체 TCR 알파 및 베타 쇄를 클로닝하기 위해, 개시자 및 종결자를 암호화하는 TCR 뉴클레오타이드를 포괄하도록 프라이머를 디자인한다. 프라이머는 다음과 같다: TCR V알파-6 5'(센스): GGATCC---GCCGCCACC_ATGTCACTTTCTAGCCTGCT(서열 756) BamHI 부위 Kozak TCR 알파 서열 TCR 알파 3'(안티센스): GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCAG(서열 757) SalI 부위 TCR 알파 불변 서열 TCR V베타-7. 5'(센스): GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCTGCAGGCTGCTCT (서열 758) BamHI 부위 Kozak TCR 알파 서열 TCR 베타 3' (안티센스): GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC (서열 759) SalI 부위 TCR 베타 불변 서열. 표준 35사이클 RT-PCR 반응은 CTL 클론으로부터 합성한 cDNA 및 상기한 프라이머를 사용하고 교정 열안정성 폴리머라제 PWO를 사용하여 실시한다.
생성된 특이적 밴드(알파의 경우 대략 850bp이고 베타의 경우 대략 950bp)를 PCR 블런트 벡터(Invitorgen)에 접합시키고 이. 콜라이를 형질전환시킨다. 전체 길이 알파 및 베타 쇄로 형질전환된 이. 콜라이를 확인하고, 상응하는 플라스미드를 대규모로 제조한다. 전체 길이 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 플라스미드를 서열분석용으로 준비한다. 서열분석 반응으로, 각각 서열 760 및 761로 나타낸 Vb 및 Va 쇄에 대해 결정된 cDNA 서열을 갖는 전체 길이 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝을 입증하였다. 상응하는 아미노산 서열은 각각 762 및 763에 나타내었다. Va 서열은 Va6.2와 99%(347/348) 동일한 뉴클레오타이드 서열 배열을 나타내고 Vb는 Vb7과 99.9%(336/338) 동일하다.
상기한 바로부터 명백한 바와 같이, 본원에서 본 발명의 특별한 양태가 설명할 목적으로 기술되어 있지만 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구항에 의해서가 아니면 제한되지 않는다.
Claims (18)
- (a) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열;(b) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열에 대한 상보체;(c) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열의 20개 이상의 연속하는 잔기로 이루어진 서열;(d) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680,681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열;(e) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788의 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는 서열;(f) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788의 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열 및(g) 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 및 786-788로 제공되는 서열의 축퇴성 변이체로 이루어진 그룹으로 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- (a) 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791;(b) 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791의 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열;(c) 서열 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 및 789-791의 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열;(d) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 암호화되는 서열;(e) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 및(f) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는분리된 폴리펩타이드.
- 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
- 제3항에 따르는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제2항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- (a) 생물학적 샘플을 환자로부터 수득하는 단계;(b) 제2항의 폴리펩타이드에 결합하는 결합제를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;(c) 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 샘플 중에서 검출하는 단계 및(d) 미리 측정한 컷오프 값과 폴리펩타이드의 양을 비교하여, 이로부터 환자에서 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 존재를 결정하는 방법.
- 제2항에 따르는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 있어서,(a) 서열 682, 692, 695, 699, 703 및 709로 제공된 서열; 및(b) 서열 679, 691, 696, 700, 704 및 708에 의해 암호화된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 융합 단백질.
- 서열 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382, 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 또는 786-788의 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드.
- T 세포를,(a) 제2항에 따르는 폴리펩타이드;(b) 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 및(c) 제1항에 따르는 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분과 T 세포를 자극 및/또는 증폭시키기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, 종양 단백질에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 증폭시키는 방법.
- 제10항의 방법에 따라서 생성된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단.
- 생리학적으로 허용되는 담체 및 면역자극제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제1 성분, 및(a) 제2항에 따르는 폴리펩타이드;(b) 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드;(c) 제5항에 따르는 항체;(d) 제7항에 따르는 융합 단백질;(e) 제11항에 따르는 T 세포 집단 및(f) 제2항에 따르는 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 성분을 포함하는 조성물.
- 제12항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 면역 반응을 자극시키는 방법.
- 제12항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 암을 치료하는 방법.
- (a) 생물학적 샘플을 환자로부터 수득하는 단계;(b) 제9항에 따르는 올리고뉴클레오타이드를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;(c) 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 샘플 중에서 검출하는 단계 및(d) 미리 측정한 컷오프 값과 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 비교하여, 이로부터 환자에게서 암의 유무를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 유무를 결정하는 방법.
- 제9항에 따르는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 진단 키트.
- 제5항에 따르는 하나 이상의 항체, 및 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약을 포함하는 진단 키트.
- (a) 환자로부터 분리한 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 (i) 제2항에 따르는 폴리펩타이드, (ii) 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 및 (iii) 제2항에 따르는 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분과 함께 배양하여, T 세포를 증식시키는 단계 및(b) 유효량의 증식된 T 세포를 환자에게 투여하여, 환자에서 암의 발현을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 발현을 억제하는 방법.
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| US6800746B2 (en) | 1997-02-25 | 2004-10-05 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| US6620922B1 (en) | 1997-02-25 | 2003-09-16 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
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| US6861215B1 (en) | 1998-05-21 | 2005-03-01 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, and staging prostate cancer |
| US6833438B1 (en) | 1999-06-01 | 2004-12-21 | Agensys, Inc. | Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof |
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| US20030149531A1 (en) | 2000-12-06 | 2003-08-07 | Hubert Rene S. | Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof |
| US7037667B1 (en) | 1998-06-01 | 2006-05-02 | Agensys, Inc. | Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer |
| US6902892B1 (en) | 1998-10-19 | 2005-06-07 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer |
| US7022497B1 (en) | 1999-03-11 | 2006-04-04 | Mt. Sinai Hospital | Human kallikrein-like genes |
| US6943235B1 (en) | 1999-04-12 | 2005-09-13 | Agensys, Inc. | Transmembrane protein expressed in prostate cancer |
| WO2001023550A2 (en) | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Diagnocure Inc. | Pca3 messenger rna species in benign and malignant prostate tissues |
| US7361338B2 (en) | 1999-10-05 | 2008-04-22 | Agensys, Inc. | Methods to inhibit growth of prostate cancer cells |
| US6790631B1 (en) | 1999-10-05 | 2004-09-14 | Agensys, Inc. | G protein-coupled receptor up-regulated in prostate cancer and uses thereof |
| PT1517913E (pt) * | 1999-10-07 | 2007-05-31 | Corixa Corp | Sequência codificante de mycobacterium turberculosis para expressão de proteínas heterólogas. |
| US20020048777A1 (en) | 1999-12-06 | 2002-04-25 | Shujath Ali | Method of diagnosing monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer |
| AU2001249549A1 (en) * | 2000-03-27 | 2001-10-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| JP5139618B2 (ja) | 2000-06-20 | 2013-02-06 | コリクサ コーポレイション | Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの融合タンパク質 |
| AU2001281322A1 (en) * | 2000-07-13 | 2002-01-30 | Biogen, Inc. | Methods of identifying renal protective factors |
| EP1366158B1 (en) | 2000-07-28 | 2008-05-21 | Ulrich Wissenbach | Trp8 markers for cancer |
| US7048931B1 (en) | 2000-11-09 | 2006-05-23 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
| CA2443123A1 (en) | 2001-04-10 | 2002-10-24 | Agensys, Inc. | Nuleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers |
| JP2005504513A (ja) * | 2001-05-09 | 2005-02-17 | コリクサ コーポレイション | 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法 |
| US6897024B2 (en) | 2001-05-31 | 2005-05-24 | Stichting Katholieke Universiteit More Particularly The University Medical Centre Nijmegen | Nucleic acid molecules comprising the promoter for PCA3, and uses thereof |
| MXPA03011985A (es) * | 2001-06-20 | 2004-03-26 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores. |
| US20050272120A1 (en) | 2001-06-20 | 2005-12-08 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
| AU2002336446B2 (en) * | 2001-09-06 | 2008-03-06 | Agensys, Inc. | Nucleic acid and corresponding protein entitled STEAP-1 useful in treatment and detection of cancer |
| US7494646B2 (en) | 2001-09-06 | 2009-02-24 | Agensys, Inc. | Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins |
| AU2003210663A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-09-02 | The Regents Of The University Of California | Methods of modulating cold sensory perception |
| DE10215321A1 (de) * | 2002-04-02 | 2003-10-23 | Metagen Pharmaceuticals Gmbh | Trp-p8 Splice Varianten und regulatorische RNA |
| DE60313163T2 (de) * | 2002-06-11 | 2008-01-03 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogene zusammensetzungen |
| DE10234901A1 (de) * | 2002-07-26 | 2004-02-12 | Metagen Pharmaceuticals Gmbh | Verwendung von am Mrp4 bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen |
| US20040081653A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-04-29 | Raitano Arthur B. | Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer |
| WO2004070056A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-19 | Diagnocure Inc. | Method to detect prostate cancer in a sample |
| EA014870B1 (ru) | 2004-04-22 | 2011-02-28 | Эдженсис, Инк. | Антитела к белку steap-1 и их применение |
| CA2491067A1 (en) | 2004-12-24 | 2006-06-24 | Stichting Katholieke Universiteit | Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer |
| EP1916298B1 (en) * | 2005-06-14 | 2011-12-28 | Dnavec Corporation | Methods for producing monoclonal antibodies |
| RS53942B1 (en) | 2006-10-27 | 2015-08-31 | Genentech Inc. | Antibodies and Immunoconjugates and Their Use |
| SG11201407802WA (en) * | 2012-05-25 | 2015-01-29 | Cellectis | Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy |
| CN104357451B (zh) * | 2014-12-02 | 2016-09-21 | 广州市番禺区中心医院 | 针对dd3基因的小干扰rna及其表达载体构建与应用 |
| GB201513921D0 (en) * | 2015-08-05 | 2015-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers |
| GB201520550D0 (en) | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
| GB201520566D0 (en) * | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
| GB201520568D0 (en) | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd | Peptides |
| IL308851A (en) * | 2016-12-22 | 2024-01-01 | Cue Biopharma Inc | Multimeric polypeptides modulate T cells and methods for their use |
| JP7247101B2 (ja) | 2017-04-03 | 2023-03-28 | エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体 |
| CN110988348B (zh) * | 2019-11-06 | 2022-07-05 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法 |
| CN114250238B (zh) * | 2021-11-26 | 2023-08-25 | 北京航空航天大学 | 基因编码的神经元发育调控多肽及其应用 |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
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| IL131560A0 (en) * | 1997-02-25 | 2001-01-28 | Corixa Corp | Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use |
| WO2000004149A2 (en) * | 1998-07-14 | 2000-01-27 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer |
| DE69831222T2 (de) * | 1997-02-25 | 2006-07-13 | Corixa Corp., Seattle | Verbindungen zur immundiagnose von prostatakrebs und deren verwendung |
| WO2001025272A2 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer |
| WO2001034802A2 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
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