JP2003528591A

JP2003528591A - 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2003528591A
Application number: JP2001551207A
Authority: JP
Inventors: シュー，ジアンチュン; シー．ディロン，デイビン; エル．ミッチャム，ジェニファー; エル．ハーロッカー，スーザン; ジアン，ユキウ; ジー．リード，スティーブン; ディー．カロス，マイケル; リチャードファンガー，ゲイリー; エイチ．デイ，クレイグ; ダブリュ．レター，マーク; エー．ストーク，ジョン; エー．ダブリュ．スケイキー，ヤサー; ワン，アイジュン; ジョイミーガー，マデレイン
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2003-09-30
Also published as: BR0107643A; PL356908A1; KR20030016217A; NO20023402L; HUP0203968A3; AU3447401A; HUP0203968A2; CZ20022756A3; RU2002121771A; WO2001051633A2; CA2397741A1; CN1436234A; WO2001051633A9; IL150732A0; ZA200206400B; EP1261708A2; NO20023402D0; WO2001051633A3; MXPA02006934A

Abstract

(57)【要約】癌、特に前立腺の治療及び診断のための組成物及び方法が開示される。典型的な組成物は、１又は複数の前立腺−特異的ポリペプチド、その免疫原部分、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを発現する抗原提供細胞、及びそのようなポリペプチドを発現する細胞に対して特異的であるＴ細胞を含んで成る。開示される組成物は、例えば、疾病、特に前立腺の診断、予防及び／又は処理において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野：本発明は一般的に、癌、例えば前立腺癌の治療及び診断に関する。本発明はよ
り特定には、前立腺−特異的タンパク質の少なくとも一部を含んで成るポリペプ
チド、及びそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そ
のようなポリペプチド及びポリヌクレオチドは、医薬組成物、例えばワクチン、
及び前立腺癌の診断及び処理のための他の組成物において有用である。

【０００２】発明の背景：癌は世界中で有意な健康問題である。癌の検出及び治療の進歩が行われて来た
が、ワクチン又は他の一般的に好結果をもたらす予防又は処理方法は入手できな
い。一般的に化学療法又は手術、及び放射線の組み合わせに基づかれる現在の治
療は、多くの患者において不適切であることがわかっている。前立腺癌は、男性問題での最も共通する形の癌であり、そして50歳以上の男性
において30％の発生率が推定される。圧倒的な臨床学的証拠は、ヒト前立腺癌が
骨に転移する性質を有し、そしてその疾病がアンドロゲン難治性状態にアンドロ
ゲン依存性から不可避的に進行し、高められた患者の死亡率を導くように思える
ことを示す。この一般的疾病は現在、アメリカ合衆国における男性間での癌死亡
のうち第２の主要な原因である。

【０００３】疾病のための治療への相当な研究にもかかわらず、前立腺癌は処理するのに困
難なまま存続する。通常、治療は手術及び/又は放射線治療法に基づかれている
が、しかしそれらの方法は、有意な割合の患者において無効果である。２種のこ
れまで同定されている前立腺特異的タンパク質、すなわち前立腺特異的抗原（PS
A）、及び前立腺（PSA）、及び前立腺ホスファターゼ（PAP）は、治療及び診断
可能性を制限して来た。例えば、PSAレベルは、前立腺癌の存在と十分に必ずし
も相互関係するものではなく、非前立腺患者、例えば良性前立腺過形成（BPH）
の割合において陽性である。さらに、PSA測定は、前立腺体積と相互関係し、そ
して転移のレベルを示さない。

【０００４】それらの及び他の癌についての治療への相当な研究にしてもかかわらず、前立
腺癌は、効果的に診断し、そして処理するには困難のまま存続する。従って、そ
のような癌を検出し、そして処理するための改良された方法についての必要性が
当業者に存在する。本発明は、それらの必要性を満たし、そして他の関連する利
点をさらに提供する。

【０００５】発明の要約： 1つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175
, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 3
84-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-6
06, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716,
720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供さ
れる配列; （ｂ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533
, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636
, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753
, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供される配列の補体;

【０００６】（ｃ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び786-788で提供される配列の少なくとも20の連続した
残基から成る配列; （ｄ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788 で提供される配列に対して、中位の緊縮条
件下でハイブリダイズする配列;

【０００７】（ｅ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788の配列に対して少なくとも75％の同一性を
有する配列; （ｆ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788の配列に対して少なくとも90％の同一性を
有する配列; 及び

【０００８】（ｇ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供される配列の変性変異体から成る群
から選択された配列を含んで成るポリヌクレオチド組成物を提供する。

【０００９】１つの好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチド組成物は、他の正
常組織についてのレベルよりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５
倍、及び最も好ましくは少なくとも約10倍、高いレベルで、試験される前立腺組
織サンプルの少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約30％及び最も好ま
しくは少なくとも約50％で発現される。もう１つの観点においては、本発明は、上記ポリヌクレオチド配列によりコー
ドされるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド組成物を提供する。

【００１０】本発明はさらに、配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336,
339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532,
534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 6
37, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 7
36, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791で示される配列
から成る群から選択されたアミノ配列を含んで成るポリペプチド組成物を提供す
る。一定の好ましい態様においては、本発明のポリペプチド及び/又はポリヌクレ
オチドは、免疫原性であり、すなわちそれらは、本明細書にさらに記載されるよ
うに、免疫応答、特に体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘発することができる
。

【００１１】本発明はさらに、開示されるポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド配列の
フラグメント、変異体及び/又は誘導体を提供し、ここで前記フラグメント、変
異体及び/又は誘導体は好ましくは、112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331,
336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527,
532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 6
35, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-7
34, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791に示される
ポリペプチド配列、又は

【００１２】配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 33
0, 332-335, 340-375, 381, 382 and 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535,
536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-
655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764,
765, 773-776 及び 786-788に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされ
るポリペプチド配列の免疫原活性のレベルの少なくとも約50％、好ましくは少な
くとも約70％及びより好ましくは少なくとも約90％の免疫原活性のレベルを有す
る。

【００１３】本発明はさらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのよう
なポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター、及びそのような発現ベクターに
より形質転換されるか又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。他の観点においては、本発明は、上記のようなポリペプチド又はポリヌクレオ
チド、及び生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物を提供する
。本発明の関連する関する観点においては、予防又は治療用途のための医薬組成
物、例えばワクチン組成物が提供される。そのような組成物は一般的に、本発明
の免疫原ポリペプチド又はポリヌクレオチド、及び免疫刺激剤、例えばアジュバ
ント、並びに生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る。

【００１４】本発明はさらに、（ａ）本発明のポリペプチド、又はそのフラグメントに対し
て特異的に結合する抗体又はその抗原−結合フラグメント；及び（ｂ）生理学的
に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物を提供する。さらなる観点において、本発明は、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現す
る抗原提供細胞、及び（ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を含んで
成る医薬組成物を提供する。典型的な抗原提供細胞は、樹状突起細胞、マクロフ
ァージ、単球、線維芽細胞及びB細胞を包含する。関連する観点においては、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提
供細胞、及び（ｂ）免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物が提供される。

【００１５】他の観点においては、本発明はさらに、上記のような少なくとも１つのポリペ
プチドを含んで成る融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドを、典型的には、生理学的に許容できるキャリヤー及び/又
は免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物が提供される。他の観点においては、本発明はさらに、上記のような少なくとも１つのポリペ
プチドを含んで成る融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドを、典型的には、生理学的に許容できるキャリヤー及び/又
は免疫刺激剤を含んで成る医薬組成物、例えばワクチン組成物の形で提供する。
融合タンパク質は、上記のような複数の免疫原ポリペプチド又はそのタンパク質
/変異体を含んで成り、そしてさらに、ポリペプチドの発現、精製及び/又は免疫
原性を促進し、そして/又は増強するための１又は複数のポリペプチドセグメン
トを含んで成ることができる。

【００１６】さらなる観点においては、本発明は、患者における免疫応答性、好ましくはヒ
ト患者におけるT細胞応答を刺激するための、本明細書に記載される医薬組成物
を投与することを含んで成る方法を提供する。患者は、前立腺癌を有し、この場
合、前記方法は疾病の処理を提供し、又はそのような疾病の危険性を有すると思
われる患者は予防的に処理され得る。さらなる観点においては、本発明は、上記のような医薬組成物を患者に投与す
ることを含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法を提供する。
前記患者は前立腺癌を有し、この場合、前記方法は疾病の処理を提供し、又はそ
のような疾病の危険性を有すると思われる患者は予防的に処理され得る。

【００１７】他の観点においては、本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に反応
するT細胞と生物学的サンプルとを接触せしめることを含んで成る、生物学的サ
ンプルから腫瘍細胞を除去するための方法を提供し、ここで前記接触段階は、サ
ンプルからポリペプチドを発現する細胞の除去を可能にするのに十分な条件下で
及び十分な時間、行われる。関連する観点においては、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に
投与することを含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法が提供
される。

【００１８】他の観点においては、本発明はさらに、（ａ）（i）本明細書に開示されるポ
リペプチドの少なくとも免疫原性部分を含んで成るポリペプチド；（ii）そのよ
うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び（iii）そのようなポリ
ペプチドを発現する抗原提供細胞の１又は複数の成分と共に、患者から単離され
たCD4⁺及び/又はCD8⁺ T細胞をインキュベートし；そして（ｂ）有効量の前記増
殖されたT細胞を、前記患者に投与し、それにより、患者における癌の進行を阻
害する段階を含んで成る、患者における癌の進行を阻害するための方法を提供す
る。増殖された細胞は、患者への投与の前、クローン化され得るが、しかし必ず
しも必要ではない。

【００１９】さらなる観点においては、本発明は、患者における癌、好ましくは前立腺癌の
存在又は不在を決定するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）患者か
ら得られた生物学的サンプルと、上記に示されるポリペプチドに結合する結合剤
とを接触せしめ；（ｂ）前記結合剤に結合するポリペプチドの量を、前記サンプ
ルにおいて検出し；そして（ｃ）前記ポリペプチドの量を、前もって決定された
カット−オフ値に比較し、そしてそれから、患者における癌の存在又は不在を決
定する段階を含んで成る。好ましくは態様においては、結合剤は、抗体、より好
ましくはモノクローナル抗体である。

【００２０】他の観点においては、本発明は、患者における癌の進行をモニターするための
方法も提供する。そのような方法は、（ａ）第1の点で患者から得られた生物学
的サンプルと、上記のようなポリペプチドに結合する結合剤とを接触せしめ；（
ｂ）前記結合剤に結合するポリペプチドの量を、前記サンプルにおいて検出し；
（ｃ）続く点で患者から得られた生物学的サンプルを用いて、段階（ａ）及び（
ｂ）を反復し；そして（ｄ）段階（ｃ）において検出されたポリペプチドの量と
、段階（ｂ）において検出された量とを比較し、そしてそれから、患者における
癌の進行をモニターする段階を含んで成る。

【００２１】他の観点においては、本発明は患者における癌の存在又は不在を決定するため
の方法を提供し、ここで前記方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプル
と、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接
触せしめ；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、好ましくはmRNAのレベルをサンプルにおいて検出し；そして（ｃ）前記オリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルと前もって決定
されたカット−オフ値とを比較し、そしてそれから、患者における癌の存在又は
不在を決定する段階を含んで成る。

【００２２】一定の態様においては、mRNAの量は、例えば本発明のポリヌクレオチド、又は
そのようなポリヌクレオチドの補体にハイブリダイズする少なくとも１つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により検出される。他
の態様においては、mRNAの量は、本発明のポリヌクレオチド又はそのようなポリ
ヌクレオチドの補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて
、ハイブリダイゼーション技法により検出される。

【００２３】関連する観点においては、患者における癌の進行をモニターするための方法が
提供され、ここで前記方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触せし
め；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量
を、前記サンプルにおいて検出し；（ｃ）続く点で患者から得られた生物学的サ
ンプルを用いて、段階（ａ）及び（ｂ）を反復し；そして（ｄ）段階（ｃ）にお
いて検出されるポリヌクレオチドの量と、段階（ｂ）において検出される量とを
比較し、そしてそれから、患者のおける癌の進行モニターする段階を含んで成る
。

【００２４】さらなる観点においては、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗
体、例えばモノクローナル抗体、及びそのような抗体を含んで成る診断キットを
提供する。上記のような１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマ
ーを含んで成る診断用キットもまた提供される。本発明のそれらの及び他の観点は、次の特定の記載に基づいて明らかに成るで
あろう。本明細書に開示されるすべての引例は、引用により本明細書中に組み込
まれる。

【００２５】配列番号１は、F1−13についての決定されたcDNA配列である。配列番号２は、F1−12についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号３は、F1−12についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号４は、F1−16についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号５は、H1−１についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号６は、H1−９についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号７は、H1−４についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号８は、J1−17についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号９は、J1−17についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号10は、L1−12についての決定された3’側cDNA配列である。

【００２６】配列番号11は、L1−12についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号12は、N1−1862についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号13は、N1−1862についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号14は、J1−13についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号15は、J1−13についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号16は、J1−19についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号17は、J1−19についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号18は、J1−25についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号19は、J1−25についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号20は、J1−24についての決定された5’側cDNA配列である。

【００２７】配列番号21は、J1−24についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号22は、K1−58についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号23は、K1−58についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号24は、K1−63についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号25は、K1−63についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号26は、L1−４についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号27は、L1−４についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号28は、L1−14についての決定された5’側cDNA配列である。配列番号29は、L1−14についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号30は、J1−12についての決定された3’側cDNA配列である。

【００２８】配列番号31は、J1−16についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号32は、J1−21についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号33は、K1−48についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号34は、K1−55についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号35は、L1−2についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号36は、L1−6についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号37は、N1−1858についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号38は、N1−1860についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号39は、N1−1861についての決定された3’側cDNA配列である。配列番号40は、N1−1864についての決定された3’側cDNA配列である。

【００２９】配列番号41は、P5についての決定されたcDNA配列である。配列番号42は、P8についての決定されたcDNA配列である。配列番号43は、P9についての決定されたcDNA配列である。配列番号44は、P18についての決定されたcDNA配列である。配列番号45は、P20についての決定されたcDNA配列である。配列番号46は、P29についての決定されたcDNA配列である。配列番号47は、P30についての決定されたcDNA配列である。配列番号48は、P34についての決定されたcDNA配列である。配列番号49は、P36についての決定されたcDNA配列である。配列番号50は、P38についての決定されたcDNA配列である。

【００３０】配列番号51は、P39についての決定されたcDNA配列である。配列番号52は、P42についての決定されたcDNA配列である。配列番号53は、P47についての決定されたcDNA配列である。配列番号54は、P49についての決定されたcDNA配列である。配列番号55は、P50についての決定されたcDNA配列である。配列番号56は、P53についての決定されたcDNA配列である。配列番号57は、P55についての決定されたcDNA配列である。配列番号58は、P60についての決定されたcDNA配列である。

【００３１】配列番号59は、P64についての決定されたcDNA配列である。配列番号60は、P65についての決定されたcDNA配列である。配列番号61は、P73についての決定されたcDNA配列である。配列番号62は、P75についての決定されたcDNA配列である。配列番号63は、P76についての決定されたcDNA配列である。配列番号64は、P79についての決定されたcDNA配列である。配列番号65は、P84についての決定されたcDNA配列である。配列番号66は、P68についての決定されたcDNA配列である。配列番号67は、P80（P704Pとしても言及される）についての決定されたcDNA配
列である。配列番号68は、P82についての決定されたcDNA配列である。配列番号69は、U1−3064についての決定されたcDNA配列である。配列番号70は、U1−3065についての決定されたcDNA配列である。

【００３２】配列番号71は、V1−3692についての決定されたcDNA配列である。配列番号72は、1A−3905についての決定されたcDNA配列である。配列番号73は、V1−3686についての決定されたcDNA配列である。配列番号74は、R1−2330についての決定されたcDNA配列である。配列番号75は、1B−3976についての決定されたcDNA配列である。配列番号76は、V1−3679についての決定されたcDNA配列である。配列番号77は、1G−4736についての決定されたcDNA配列である。配列番号78は、1G−4738についての決定されたcDNA配列である。配列番号79は、1G−4741についての決定されたcDNA配列である。配列番号80は、1G−4744についての決定されたcDNA配列である。

【００３３】配列番号81は、1G−4734についての決定されたcDNA配列である。配列番号82は、1H−4774についての決定されたcDNA配列である。配列番号83は、1H−4781についての決定されたcDNA配列である。配列番号84は、1H−4785についての決定されたcDNA配列である。配列番号85は、1H−4787についての決定されたcDNA配列である。配列番号86は、1H−4796についての決定されたcDNA配列である。配列番号87は、1I−4807についての決定されたcDNA配列である。配列番号88は、1I−4810についての決定されたcDNA配列である。配列番号89は、1I−4811についての決定されたcDNA配列である。配列番号90は、1J−4876についての決定されたcDNA配列である。

【００３４】配列番号91は、1K−4884についての決定されたcDNA配列である。配列番号92は、1K−4896についての決定されたcDNA配列である。配列番号93は、1G−4761についての決定されたcDNA配列である。配列番号94は、1G−4762についての決定されたcDNA配列である。配列番号95は、1H−4766についての決定されたcDNA配列である。配列番号96は、1H−4770についての決定されたcDNA配列である。配列番号97は、1H−4771についての決定されたcDNA配列である。配列番号98は、1H−4772についての決定されたcDNA配列である。配列番号99は、1D−4297についての決定されたcDNA配列である。配列番号100は、1D−4309についての決定されたcDNA配列である。

【００３５】配列番号101は、1D.1−4278についての決定されたcDNA配列である。配列番号102は、1D−4288についての決定されたcDNA配列である。配列番号103は、1D−4283についての決定されたcDNA配列である。配列番号104は、1D−4304についての決定されたcDNA配列である。配列番号105は、1D−4296についての決定されたcDNA配列である。配列番号106は、1D−4280についての決定されたcDNA配列である。配列番号107は、F1−12（P504Sとしても言及される）についての決定された十
分な長さのcDNA配列である。配列番号108は、F1−12についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号109は、J1−17についての決定された十分な長さのcDNA配列である。配列番号110は、L1−12（P501Sとしても言及される）についての決定された十
分な長さのcDNA配列である。

【００３６】配列番号111は、N1−1862（P503Sとしても言及される）についての決定された
十分な長さのcDNA配列である。配列番号112は、J1−17についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号113は、L1−12（P501Sとしても言及される）についての予測されるア
ミノ酸配列である。配列番号114は、N1−1862（P503Sとしても言及される）についての予測される
アミノ酸配列である。配列番号115は、P89についての決定されたcDNA配列である。配列番号116は、P90についての決定されたcDNA配列である。配列番号117は、P92についての決定されたcDNA配列である。配列番号118は、P95についての決定されたcDNA配列である。配列番号119は、P98についての決定されたcDNA配列である。配列番号120は、P102についての決定されたcDNA配列である。

【００３７】配列番号121は、P110についての決定されたcDNA配列である。配列番号122は、P111についての決定されたcDNA配列である。配列番号123は、P114についての決定されたcDNA配列である。配列番号124は、P115についての決定されたcDNA配列である。配列番号125は、P116についての決定されたcDNA配列である。配列番号126は、P124についての決定されたcDNA配列である。配列番号127は、P126についての決定されたcDNA配列である。配列番号128は、P130についての決定されたcDNA配列である。配列番号129は、P133についての決定されたcDNA配列である。配列番号130は、P138についての決定されたcDNA配列である。

【００３８】配列番号131は、P143についての決定されたcDNA配列である。配列番号132は、P151についての決定されたcDNA配列である。配列番号133は、P156についての決定されたcDNA配列である。配列番号134は、P157についての決定されたcDNA配列である。配列番号135は、P166についての決定されたcDNA配列である。配列番号136は、P176についての決定されたcDNA配列である。配列番号137は、P178についての決定されたcDNA配列である。配列番号138は、P179についての決定されたcDNA配列である。配列番号139は、P185についての決定されたcDNA配列である。配列番号140は、P192についての決定されたcDNA配列である。

【００３９】配列番号141は、P201についての決定されたcDNA配列である。配列番号142は、P204についての決定されたcDNA配列である。配列番号143は、P208についての決定されたcDNA配列である。配列番号144は、P211についての決定されたcDNA配列である。配列番号145は、P213についての決定されたcDNA配列である。配列番号146は、P219についての決定されたcDNA配列である。配列番号147は、P237についての決定されたcDNA配列である。配列番号148は、P239についての決定されたcDNA配列である。配列番号149は、P248についての決定されたcDNA配列である。配列番号150は、P251についての決定されたcDNA配列である。

【００４０】配列番号151は、P255についての決定されたcDNA配列である。配列番号152は、P256についての決定されたcDNA配列である。配列番号153は、P259についての決定されたcDNA配列である。配列番号154は、P260についての決定されたcDNA配列である。配列番号155は、P263についての決定されたcDNA配列である。配列番号156は、P264についての決定されたcDNA配列である。配列番号157は、P266についての決定されたcDNA配列である。配列番号158は、P270についての決定されたcDNA配列である。配列番号159は、P272についての決定されたcDNA配列である。配列番号160は、P278についての決定されたcDNA配列である。

【００４１】配列番号161は、P105についての決定されたcDNA配列である。配列番号162は、P107についての決定されたcDNA配列である。配列番号163は、P137についての決定されたcDNA配列である。配列番号164は、P194についての決定されたcDNA配列である。配列番号165は、P195についての決定されたcDNA配列である。配列番号166は、P196についての決定されたcDNA配列である。配列番号167は、P220についての決定されたcDNA配列である。配列番号168は、P234についての決定されたcDNA配列である。配列番号169は、P235についての決定されたcDNA配列である。配列番号170は、P243についての決定されたcDNA配列である。

【００４２】配列番号171は、P703P-DE1についての決定されたcDNA配列である。配列番号172は、P703P-DE1についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号173は、P703P-DE2についての決定されたcDNA配列である。配列番号174は、P703P-DE6についての決定されたcDNA配列である。配列番号175は、P703P-DE13についての決定されたcDNA配列である。配列番号176は、P703P-DE13についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号177は、P703P-DE4についての決定されたcDNA配列である。配列番号178は、P703P-DE14についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号179は、1G-4736についての決定された延長cDNA配列である。配列番号180は、1G-4738についての決定された延長cDNA配列である。

【００４３】配列番号181は、1G-4741についての決定された延長cDNA配列である。配列番号182は、1G-4744についての決定された延長cDNA配列である。配列番号183は、1G-4774についての決定された延長cDNA配列である。配列番号184は、1G-4781についての決定された延長cDNA配列である。配列番号185は、1G-4785についての決定された延長cDNA配列である。配列番号186は、1G-4787についての決定された延長cDNA配列である。配列番号187は、1G-4796についての決定された延長cDNA配列である。配列番号188は、1G-4807についての決定された延長cDNA配列である。配列番号189は、1I-4810についての決定された3’cDNA配列である。配列番号190は、1I-4811についての決定された3’cDNA配列である。

【００４４】配列番号191は、1J-4876についての決定された延長cDNA配列である。配列番号192は、1K-4844についての決定された延長cDNA配列である。配列番号193は、1K-4896についての決定された延長cDNA配列である。配列番号194は、1G-4761についての決定された延長cDNA配列である。配列番号195は、1G-4762についての決定された延長cDNA配列である。配列番号196は、1H-4766についての決定された延長cDNA配列である。配列番号197は、1H-4770についての決定された3’cDNA配列である。配列番号198は、1H-4771についての決定された3’cDNA配列である。配列番号199は、1H-4772についての決定された延長cDNA配列である。配列番号200は、1D-4309についての決定された延長cDNA配列である。

【００４５】配列番号201は、1D.1-4278についての決定された延長cDNA配列である。配列番号202は、1D-4288についての決定された延長cDNA配列である。配列番号203は、1D-4283についての決定された延長cDNA配列である。配列番号204は、1D-4304についての決定された延長cDNA配列である。配列番号205は、1D-4296についての決定された延長cDNA配列である。配列番号206は、1D-4280についての決定された延長cDNA配列である。配列番号207は、10-d8fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号208は、10-h10conについての決定されたcDNA配列である。配列番号209は、11-C8rewについての決定されたcDNA配列である。配列番号210は、7.g6fwdについての決定されたcDNA配列である。

【００４６】配列番号211は、7.g6revについての決定されたcDNA配列である。配列番号212は、8-b5fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号213は、8-b5revについての決定されたcDNA配列である。配列番号214は、8-b6fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号215は、8-b6revについての決定されたcDNA配列である。配列番号216は、8-d4fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号217は、8-d9revについての決定されたcDNA配列である。配列番号218は、8-g3fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号219は、8-g3revについての決定されたcDNA配列である。配列番号220は、8-h11revについての決定されたcDNA配列である。

【００４７】配列番号221は、g-f12fwdについての決定されたcDNA配列である。配列番号222は、g-f3revについての決定されたcDNA配列である。配列番号223は、P509Sについての決定されたcDNA配列である。配列番号224は、P510Sについての決定されたcDNA配列である。配列番号225は、P703DE5についての決定されたcDNA配列である。配列番号226は、9-A11についての決定されたcDNA配列である。配列番号227は、8-C6についての決定されたcDNA配列である。配列番号228は、8-H7についての決定されたcDNA配列である。配列番号229は、JPTPN13についての決定されたcDNA配列である。配列番号230は、JPTPN14についての決定されたcDNA配列である。

【００４８】配列番号231は、JPTPN23についての決定されたcDNA配列である。配列番号232は、JPTPN24についての決定されたcDNA配列である。配列番号233は、JPTPN25についての決定されたcDNA配列である。配列番号234は、JPTPN30についての決定されたcDNA配列である。配列番号235は、JPTPN34についての決定されたcDNA配列である。配列番号236は、JPTPN35についての決定されたcDNA配列である。配列番号237は、JPTPN36についての決定されたcDNA配列である。配列番号238は、JPTPN38についての決定されたcDNA配列である。配列番号239は、JPTPN39についての決定されたcDNA配列である。配列番号240は、JPTPN40についての決定されたcDNA配列である。

【００４９】配列番号241は、JPTPN41についての決定されたcDNA配列である。配列番号242は、JPTPN42についての決定されたcDNA配列である。配列番号243は、JPTPN45についての決定されたcDNA配列である。配列番号244は、JPTPN46についての決定されたcDNA配列である。配列番号245は、JPTPN51についての決定されたcDNA配列である。配列番号246は、JPTPN56についての決定されたcDNA配列である。配列番号247は、JPTPN64についての決定されたcDNA配列である。配列番号248は、JPTPN65についての決定されたcDNA配列である。配列番号249は、JPTPN67についての決定されたcDNA配列である。配列番号250は、JPTPN76についての決定されたcDNA配列である。

【００５０】配列番号251は、JPTPN84についての決定されたcDNA配列である。配列番号252は、JPTPN85についての決定されたcDNA配列である。配列番号253は、JPTPN86についての決定されたcDNA配列である。配列番号254は、JPTPN87についての決定されたcDNA配列である。配列番号255は、JPTPN88についての決定されたcDNA配列である。配列番号256は、JP1F1についての決定されたcDNA配列である。配列番号257は、JP1F2についての決定されたcDNA配列である。配列番号258は、JP1C2についての決定されたcDNA配列である。配列番号259は、JP1B1についての決定されたcDNA配列である。配列番号260は、JP1B2についての決定されたcDNA配列である。

【００５１】配列番号261は、JP1D3についての決定されたcDNA配列である。配列番号262は、JP1A4についての決定されたcDNA配列である。配列番号263は、JP1F5についての決定されたcDNA配列である。配列番号264は、JP1E6についての決定されたcDNA配列である。配列番号265は、JP1D6についての決定されたcDNA配列である。配列番号266は、JP1B1についての決定されたcDNA配列である。配列番号267は、JP1A6についての決定されたcDNA配列である。配列番号268は、JP1E8についての決定されたcDNA配列である。配列番号269は、JP1D7についての決定されたcDNA配列である。配列番号270は、JP1D9についての決定されたcDNA配列である。

【００５２】配列番号271は、JP1C10についての決定されたcDNA配列である。配列番号272は、JP1A9についての決定されたcDNA配列である。配列番号273は、JP1F12についての決定されたcDNA配列である。配列番号274は、JP1E12についての決定されたcDNA配列である。配列番号275は、JP1D11についての決定されたcDNA配列である。配列番号276は、JP1C11についての決定されたcDNA配列である。配列番号277は、JP1C12についての決定されたcDNA配列である。配列番号278は、JP1B12についての決定されたcDNA配列である。配列番号279は、JP1A12についての決定されたcDNA配列である。配列番号280は、JP8G2についての決定されたcDNA配列である。

【００５３】配列番号281は、JP8H1についての決定されたcDNA配列である。配列番号282は、JP8H2についての決定されたcDNA配列である。配列番号283は、JP8A2についての決定されたcDNA配列である。配列番号284は、JP8A4についての決定されたcDNA配列である。配列番号285は、JP8C3についての決定されたcDNA配列である。配列番号286は、JP8G4についての決定されたcDNA配列である。配列番号287は、JP8B6についての決定されたcDNA配列である。配列番号288は、JP8D6についての決定されたcDNA配列である。配列番号289は、JP8F5についての決定されたcDNA配列である。配列番号290は、JP8A8についての決定されたcDNA配列である。

【００５４】配列番号291は、JP8C7についての決定されたcDNA配列である。配列番号292は、JP8D7についての決定されたcDNA配列である。配列番号293は、JP8D8についての決定されたcDNA配列である。配列番号294は、JP8E7についての決定されたcDNA配列である。配列番号295は、JP8F8についての決定されたcDNA配列である。配列番号296は、JP8G8についての決定されたcDNA配列である。配列番号297は、JP8B10についての決定されたcDNA配列である。配列番号298は、JP8C10についての決定されたcDNA配列である。配列番号299は、JP8E9についての決定されたcDNA配列である。配列番号300は、JP8E10についての決定されたcDNA配列である。

【００５５】配列番号301は、JP8F9についての決定されたcDNA配列である。配列番号302は、JP8H9についての決定されたcDNA配列である。配列番号303は、JP8C12についての決定されたcDNA配列である。配列番号304は、JP8E11についての決定されたcDNA配列である。配列番号305は、JP8E12についての決定されたcDNA配列である。配列番号306は、ペプチドPS2#12についてのアミノ酸配列である。配列番号307は、P711Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号308は、P712Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号309は、CLONE23についての決定されたcDNA配列である。配列番号310は、P774Pについての決定されたcDNA配列である。

【００５６】配列番号311は、P775Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号312は、P715Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号313は、P710Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号314は、P767Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号315は、P768Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号316-325は、前もって単離された遺伝子の決定されたcDNA配列である
。配列番号326は、P703PDE5についての決定されたcDNA配列である。配列番号327は、P703PDE5についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号328は、P703P6.26についての決定されたcDNA配列である。配列番号329は、P703P6.26についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号330は、P703PX-23についての決定されたcDNA配列である。

【００５７】配列番号331は、P703PX-23についての予測されるアミノ酸配列である。配列番号332 は、P509Sについての決定された十分な長さのcDNA配列である。配列番号333は、P707P（11−C9としても言及される）についての決定された延
長cDNA配列である。配列番号334は、P714Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号335は、P705P（9−F3としても言及される）についての決定されたcDN
A配列である。配列番号336は、P705Pについての予測されるアミノ酸配列である。配列番号337は、ペプチドP1S#10のアミノ酸配列である。配列番号338は、ペプチドp5のアミノ酸配列である。配列番号339は、P509Sについての予測されるアミノ酸配列である。

【００５８】配列番号340は、P778Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号341は、P786Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号342は、P789Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号343は、ホモサピエンスMM46 mRNAに対する相同性を示すクローンのた
めの決定されたcDNA配列である。配列番号344は、ホモサピエンスTNF−α刺激されたABCタンパク質（ABC50）mR
NAに対する相同性を示すクローンのための決定されたcDNA配列である。配列番号345は、E−カドヘリンに関してホモサピエンスmRNAに対する相同性を
示すクローンのための決定されたcDNA配列である。

【００５９】配列番号346は、ヒト核−コードされたミトコンドリアセリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ（SHMT）に対する相同性を示すクローンのための決定され
たcDNA配列である。配列番号347は、ホモサピエンス天然耐性−関連マクロファージタンパク質２
（NRAMP2）に対する相同性を示すクローンのための決定されたcDNA配列である。配列番号348は、ホモサピエンスホスホグルコムターゼ−関連タンパク質（PGM
RP）に対する相同性を示すクローンのための決定されたcDNA配列である。配列番号349は、プロテオソームサブユニットp40に関してヒトmRNAに対する相
同性を示すクローンのための決定されたcDNA配列である。配列番号350は、P777Pについての決定されたcDNA配列である。

【００６０】配列番号351は、P779Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号352は、P790Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号353は、P784Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号354は、P776Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号355は、P780Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号356は、P544Sについての決定されたcDNA配列である。配列番号357は、P745Sについての決定されたcDNA配列である。配列番号358は、P782Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号359は、P783Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号360は、未知の17984についての決定されたcDNA配列である。

【００６１】配列番号361は、P787Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号362は、P788Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号363は、未知の17994についての決定されたcDNA配列である。配列番号364は、P781Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号365は、P785Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号366−375は、B305Dのスプライス変異体についての決定されたcDNA配
列である。配列番号376は、配列番号366によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列
である。配列番号377は、配列番号372によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列
である。

【００６２】配列番号378は、配列番号378によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列
である。配列番号379は、配列番号374によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列
である。配列番号380は、配列番号375によりコードされる予測されるアミノ酸配列配列
である。配列番号381は、B716Pについての決定されたcDNA配列である。配列番号382は、P711Pについての決定された十分な長さのcDNA配列である。

【００６３】配列番号383は、P711Pについての予測されるアミノ酸配列である。配列番号384は、P1000CについてのcDNA配列である。配列番号385は、CGI-82についてのcDNA配列である。配列番号386は、23320についてのcDNA配列である。配列番号387は、CGI-69についてのcDNA配列である。配列番号388は、L−イジトール−２−デヒドロゲナーゼについてのcDNA配列で
ある。配列番号389は、23379についてのcDNA配列である。配列番号390は、23381についてのcDNA配列である。

【００６４】配列番号391は、KIAA0122についてのcDNA配列である。配列番号392は、23399についてのcDNA配列である。配列番号393は、前もって同定された遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号394は、HCLBPについてのcDNA配列である。配列番号395は、トランスグルタミナーセについてのcDNA配列である。配列番号396は、前もって同定された遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号397は、PAPについてのcDNA配列である。配列番号398は、Ets転写因子PDEFPについてのcDNA配列である。配列番号399は、hTGRについてのcDNA配列である。配列番号400は、KIAA0295についてのcDNA配列である。

【００６５】配列番号401は、22545についてのcDNA配列である。配列番号402は、22547についてのcDNA配列である。配列番号404は、22550についてのcDNA配列である。配列番号405は、22551についてのcDNA配列である。配列番号406は、22552についてのcDNA配列である。配列番号407は、22553（P1020Cとしても言及される）についてのcDNA配列であ
る。配列番号408は、22558についてのcDNA配列である。配列番号409は、22562についてのcDNA配列である。配列番号410は、22565についてのcDNA配列である。配列番号408は、22558についてのcDNA配列である。配列番号409は、22562についてのcDNA配列である。配列番号410は、22565についてのcDNA配列である。

【００６６】配列番号411は、22567についてのcDNA配列である。配列番号412は、22568についてのcDNA配列である。配列番号413は、22570についてのcDNA配列である。配列番号414は、22571についてのcDNA配列である。配列番号415は、22572についてのcDNA配列である。配列番号416は、22573についてのcDNA配列である。配列番号417は、22573についてのcDNA配列である。配列番号418は、22575についてのcDNA配列である。配列番号419は、22580についてのcDNA配列である。配列番号420は、22581についてのcDNA配列である。

【００６７】配列番号421は、22582についてのcDNA配列である。配列番号422は、22583についてのcDNA配列である。配列番号423は、22584についてのcDNA配列である。配列番号434は、22585についてのcDNA配列である。配列番号425は、22586についてのcDNA配列である。配列番号426は、22587についてのcDNA配列である。配列番号427は、22588についてのcDNA配列である。配列番号428は、22589についてのcDNA配列である。配列番号429は、22590についてのcDNA配列である。配列番号430は、22591についてのcDNA配列である。

【００６８】配列番号431は、22592についてのcDNA配列である。配列番号432は、22593についてのcDNA配列である。配列番号433は、22594についてのcDNA配列である。配列番号434は、22595についてのcDNA配列である。配列番号435は、22596についてのcDNA配列である。配列番号436は、22847についてのcDNA配列である。配列番号437は、22848についてのcDNA配列である。配列番号438は、22849についてのcDNA配列である。配列番号439は、22851についてのcDNA配列である。配列番号440は、22852についてのcDNA配列である。

【００６９】配列番号441は、22853についてのcDNA配列である。配列番号442は、22854についてのcDNA配列である。配列番号443は、22855についてのcDNA配列である。配列番号444は、22856についてのcDNA配列である。配列番号445は、22857についてのcDNA配列である。配列番号446は、23601についてのcDNA配列である。配列番号447は、23602についてのcDNA配列である。配列番号448は、23605についてのcDNA配列である。配列番号449は、23606についてのcDNA配列である。配列番号450は、23612についてのcDNA配列である。

【００７０】配列番号451は、23614についてのcDNA配列である。配列番号452は、23618についてのcDNA配列である。配列番号453は、23622についてのcDNA配列である。配列番号454は、葉酸ヒドロラーゼについてのcDNA配列である。配列番号455は、LIMタンパク質についてのcDNA配列である。配列番号456は、既知の遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号457は、既知の遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号458は、前もって同定された遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号459は、23045についてのcDNA配列である。配列番号460は、23032についてのcDNA配列である。

【００７１】配列番号461は、クローン23054についてのcDNA配列である。配列番号462-467は、既知の遺伝子についてのcDNA配列である。配列番号468-471は、P710PについてのcDNA配列である。配列番号472は、P1001CについてのcDNA配列である。配列番号473は、P775P（27505としても言及される）の第１のスプライス変異
体についての決定されたcDNA配列である。配列番号474は、P775P（19947としても言及される）の第2のスプライス変異体
についての決定されたcDNA配列である。配列番号475は、P775P（19941としても言及される）の第3のスプライス変異体
についての決定されたcDNA配列である。

【００７２】配列番号476は、P775P（19937としても言及される）の第4のスプライス変異体
についての決定されたcDNA配列である。配列番号477は、配列番号474によりコードされる第１の予測されるアミノ酸配
列である。配列番号478は、配列番号474によりコードされる第2の予測されるアミノ酸配
列である。配列番号479は、配列番号475によりコードされる予測されるアミノ酸配列であ
る。配列番号480は、配列番号473によりコードされる第１の予測されるアミノ酸配
列である。

【００７３】配列番号481は、配列番号473によりコードされる第2の予測されるアミノ酸配
列である。配列番号482は、配列番号473によりコードされる第3の予測されるアミノ酸配
列である。配列番号483は、配列番号473によりコードされる第4の予測されるアミノ酸配
列である。配列番号484は、M. tuberulosis抗原Ra12の最初の30個のアミノ酸である。配列番号485は、PCRプライマーAW025である。配列番号486は、PCRプライマーAW003である。配列番号487は、PCRプライマーAW027である。配列番号488は、PCRプライマーAW026である。配列番号489-501は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである
。

【００７４】配列番号502は、抗−P503Sモノクローナル抗体20D4のための相補性決定領域の
決定されたcDNA配列である。配列番号503は、抗−P503Sモノクローナル抗体Ja1のための相補性決定領域の
決定されたcDNA配列である。配列番号504＆505は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである
。配列番号506は、抗−P703Pモノクローナル抗体8H2のための相補性決定領域の
決定されたcDNA配列である。配列番号507は、抗−P703Pモノクローナル抗体7H8のための相補性決定領域の
決定されたcDNA配列である。配列番号508は、抗−P703Pモノクローナル抗体2D4のための相補性決定領域の
決定されたcDNA配列である。

【００７５】配列番号509−522は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである
。配列番号523は、P703Pに対する抗体を生ぜしめるために使用されるP703Pの成
熟形である。配列番号524は、P703Pの推定上の十分な長さのcDNA配列である。配列番号525は、配列番号524によりコードされる推定上のアミノ酸配列である
。配列番号526は、P790Pの十分な長さのcDNA配列である。配列番号527は、P790Pの予測されるアミノ酸配列である。配列番号528＆529は、PCRプライマーである。配列番号530は、配列番号366のスプライス変異体のcDNA配列である。

【００７６】配列番号531は、配列番号530の読み取り枠のcDNA配列である。配列番号532は、配列番号531の配列によりコードされる予測されるアミノ酸で
ある。配列番号533は、P775Pの推定上のORFのDNA配列である。配列番号534は、配列番号533によりコードされる予測されるアミノ酸配列であ
る。配列番号535は、P510Sのための第１の十分な長さのcDNA配列である。配列番号536は、P510Sのための第２の十分な長さのcDNA配列である。配列番号537は、配列番号535によりコードされる予測されるアミノ酸配列であ
る。配列番号538は、配列番号536によりコードされる予測されるアミノ酸配列であ
る。配列番号539は、ペプチドP501S−370である。配列番号540は、ペプチドP501S−376である。

【００７７】配列番号541−551は、P501Sのエピトープである。配列番号552は、P712Pのための延長されたcDNA配列である。配列番号553−568は、配列番号552内の予測される読み取り枠によりコードさ
れるアミノ酸配列である。配列番号569は、P776Pのための延長されたcDNA配列である。配列番号570は、コンチグ６として言及されるP776Pのスプライス変異体のため
の決定されたcDNA配列である。配列番号571は、コンチグ7として言及されるP776Pのスプライス変異体のため
の決定されたcDNA配列である。配列番号572は、コンチグ14として言及されるP776Pのスプライス変異体のため
の決定されたcDNA配列である。

【００７８】配列番号573は、配列番号570の第１の予測されるORFによりコードされるアミ
ノ酸配列である。配列番号574は、配列番号570の第２の予測されるORFによりコードされるアミ
ノ酸配列である。配列番号575は、配列番号571の予測されるORFによりコードされるアミノ酸配
列である。配列番号576−586は、配列番号569の予測されるORFによりコードされるアミノ
酸配列である。配列番号587は、P767P及びP777Pの配列のDNAコンセンサス配列である。配列番号588−590は、配列番号587の予測されるORFによりコードされるアミノ
酸配列である。

【００７９】配列番号591は、P1020Cのための延長されたcDNA配列である。配列番号592は、配列番号P1020Cの配列によりコードされる予測されるアミノ
酸配列である。配列番号593は、50748として言及されるP775Pのスプライス変異体である。配列番号594は、50717として言及されるP775Pのスプライス変異体である。配列番号595は、45985として言及されるP775Pのスプライス変異体である。配列番号596は、38769として言及されるP775Pのスプライス変異体である。配列番号597は、37922として言及されるP775Pのスプライス変異体である。配列番号598は、49274として言及されるP510Sのスプライス変異体である。配列番号599は、39487として言及されるP510Sのスプライス変異体である。配列番号600は、5167.16として言及されるP504Sのスプライス変異体である。

【００８０】配列番号601は、5167.1として言及されるP504Sのスプライス変異体である。配列番号602は、5163.46として言及されるP504Sのスプライス変異体である。配列番号603は、5163.42として言及されるP504Sのスプライス変異体である。配列番号604は、5163.34として言及されるP504Sのスプライス変異体である。配列番号605は、5163.17として言及されるP504Sのスプライス変異体である。配列番号606は、10640として言及されるP501Sのスプライス変異体である。配列番号601−615は、PCRプライマーの配列である。配列番号616は、P703P及びPSAの融合体の決定されたcDNA配列である。配列番号617は、P703P及びPSAの融合体のアミノ酸配列である。配列番号618は、遺伝子DD3のcDNA配列である。配列番号619は、P714Pのための延長されたcDNA配列である。配列番号620−622は、P704Pのスプライス変異体のためのcDNA配列である。

【００８１】配列番号623は、P553S−14として言及されるP553Sのスプライス変異体のcDNA
配列である。配列番号624は、P553S−12として言及されるP553Sのスプライス変異体のcDNA
配列である。配列番号625は、P553S−10として言及されるP553Sのスプライス変異体のcDNA
配列である。配列番号626は、P553S−6として言及されるP553Sのスプライス変異体のcDNA配
列である。配列番号627は、配列番号626によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号628は、配列番号623によりコードされる第１のアミノ酸配列である。配列番号629は、配列番号623によりコードされる第２のアミノ酸配列である。配列番号630は、前立腺−特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子（P558Sとして
も言及される）のための第１の十分な長さのcDNA配列である。

【００８２】配列番号631は、前立腺−特異的トランスグルタミナーゼ遺伝子のための第２
の十分な長さのcDNA配列である。配列番号632は、配列番号630の配列によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号633は、配列番号631の配列によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号634は、P788Pのための十分な長さのcDNA配列である。配列番号635は、配列番号634の配列によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号636は、P788Pの多形変異体のための決定されたcDNA配列である。配列番号637は、配列番号636の配列によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号638は、P703Pからのペプチド４のアミノ酸配列である。配列番号639は、P703Pからのペプチド４をコードするcDNA配列である。配列番号640−655は、P703PのエピトープをコードするcDNA配列である。

【００８３】配列番号656−671は、P703Pのエピトープのアミノ酸配列である。配列番号672及び673は、PCRプライマーである。配列番号674は、E．コリにおいて発現されるP788PのN−末端部分をコードする
cDNA配列である。配列番号675は、E．コリにおいて発現されるP788PのN−末端部分のアミノ酸配
列である。配列番号676は、M. ツベルクロシス抗原Ra12のアミノ酸配列である。配列番号677及び678は、PCRプライマーである。配列番号679は、Ra12−P510S−C構造体のためのcDNA配列である。配列番号680は、P510S−C構造体のためのcDNA配列である。

【００８４】配列番号681は、P510S−E3構造体のためのcDNA配列である。配列番号682は、Ra12−P510S−C構造体のためのアミノ酸配列である。配列番号683は、P510S−C構造体のためのアミノ酸配列である。配列番号684は、P510S−E3構造体のためのアミノ酸配列である。配列番号685−690は、PCRプライマーである。配列番号691は、Ra12−P775P−ORF3構造体のためのcDNA配列である。配列番号692は、Ra12−P775P−ORF3構造体のためのアミノ酸配列である。配列番号693及び694は、PCRプライマーである。配列番号695は、P703P His 標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸
配列である。

【００８５】配列番号696は、P703P His 標識融合タンパク質のための決定されたcDNA配列
である。配列番号697及び698は、PCRプライマーである。配列番号69９は、P705P His 標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸
配列である。配列番号700は、P705P His 標識融合タンパク質のための決定されたcDNA配列
である。配列番号701及び702は、PCRプライマーである。配列番号703は、P711P His 標識融合タンパク質のための決定されたアミノ酸
配列である。配列番号704は、P711P His 標識融合タンパク質のための決定されたcDNA配列
である。

【００８６】配列番号705は、M. ツベルクロシス抗原Ra12のアミノ酸配列である。配列番号706及び707は、PCRプライマーである。配列番号708は、Ra12−P501S−E2構造体のための決定されたcDNA配列である。配列番号709は、Ra12−P501S−E2構造体のための決定されたアミノ酸配列であ
る。配列番号710は、P501Sのエピトープのためのアミノ酸配列である。配列番号711は、配列番号710をコードするDNA配列である。配列番号712は、P501Sのエピトープのためのアミノ酸配列である。配列番号713は、配列番号712をコードするDNA配列である。配列番号714は、エピトープマッピング研究に使用されるペプチドである。配列番号715は、P501Sのエピトープのためのアミノ酸配列である。

【００８７】配列番号716は、配列番号715をコードするDNA配列である。配列番号717−719は、P501SのCD4エピトープのアミノ酸配列である。配列番号720−722は、配列番号717−719の配列をコードするDNA配列である。配列番号723−734は、P703Pの推定上のCTLエピトープのためのアミノ酸配列で
ある。配列番号735は、P789Pのための十分な長さのcDNA配列である。配列番号736は、配列番号735によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号737は、コンチグ６として言及されるP776Pのスプライス変異体のため
の決定された十分な長さのcDNA配列である。配列番号738−739は、コンチグ７として言及されるP776Pのスプライス変異体
のための決定された十分な長さのcDNA配列である。配列番号740−744は、配列番号737によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号745−750は、コンチグ７として言及されるP776Pのスプライス変異体
によりコードされるアミノ酸配列である。

【００８８】配列番号751は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２のための十分
な長さのcDNA配列である。配列番号752は、配列番号751によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号753は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２の最初の209個
のアミノ酸をコードするcDNA配列である。配列番号754は、ヒトトランスメンブランプロテアーゼセリン２の最初の209個
のアミノ酸である。配列番号755は、P501Sのペプチド296−322のアミノ酸配列である。配列番号756−759は、PCRプライマーである。配列番号760は、P501S−特異的T細胞クローン4E5のためのT細胞受容体のVb鎖
の決定されたcDNA配列である。

【００８９】配列番号761は、P501S−特異的T細胞クローン4E5のためのT細胞受容体のVa鎖
の決定されたcDNA配列である。配列番号762は、配列番号760によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号763は、配列番号761によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号764は、停止コドンを包含するP768Pのための十分な長さの読み取り枠
である。配列番号765は、停止コドンを有さないP768Pのための十分な長さの読み取り枠
である。配列番号766は、配列番号765によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号767−772は、P768Pの予測されるドメインのためのアミノ酸配列であ
る。

【００９０】配列番号773は、P835Pの十分な長さのcDNAである。配列番号774は、前もって同定されたクローンFLJ13581のcDNA配列である。配列番号775は、停止コドンを包含するP835Pのための読み取り枠のcDNA配列で
ある。配列番号776は、停止コドンを有さないP835Pのための読み取り枠のcDNA配列で
ある。配列番号777は、P835Pのための十分な長さのアミノ酸配列である。配列番号778−785は、P835Pの細胞外及び細胞内ドメインのアミノ酸配列であ
る。

【００９１】配列番号786は、P1000Cのための十分な長さのcDNA配列である。配列番号787は、停止コドンを包含するP1000Cのための読み取り枠のcDNA配列
である。配列番号788は、停止コドンを有さないP1000Cのための読み取り枠のcDNA配列
である。配列番号789は、P1000Cのための十分な長さのアミノ酸配列である。配列番号790は、配列番号789のアミノ酸1−100である。配列番号791は、配列番号789のアミノ酸100−492である。配列番号792は、αプレプロ−P501S組換えタンパク質のアミノ酸配列である。

【００９２】発明の特定の記載：本発明は、一般的に、癌、特に前立腺癌の治療及び診断のための組成物及びそ
れらの用途に向けられる。さらに下記で記載されるように、本発明の典型的な組
成物は、ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、抗体及び他の結合剤、抗原提供細胞（APC）及び
免疫系細胞（例えば、T細胞）を含むが、但しそれだけには限定されない。

【００９３】本発明の実施は、特にことわらない限り、ウィルス学、免疫学、微生物学、分
子生物学及び組換えDNA技法の従来の方法を使用し、それらの多くは、例示目的
のために下記に記載される。そのような技法は、文献において十分に説明されて
いる。例えばSambrook, など. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd
Edition, 1989); Maniatis など. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1
982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); O
ligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridizatio
n (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B.
Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed.,
1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)を参照のこ
と。本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明
細書に組み込まれる。本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形は、特にことわ
らない限り、複数形も包含する。

【００９４】ポリペプチド組成物：本明細書において使用される場合、用語“ポリペプチド”とは、その従来の意
味で、すなわちアミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さ
の生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポ
リペプチドの定義内に包含され、そしてそのような用語は、特にことわらない限
り、本明細書においては、交換可能的に使用され得る。この用語は、ポリペプチ
ドの後−発現修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化及び同様のもの
、並びに当業界において知られている他の修飾（天然に存在し、及び天然に存在
しない）を言及せず、又は排除する。ポリペプチドは、完全なタンパク質又はそ
の副配列であり得る。本発明において興味ある特定のポリペプチドは、エピトー
プを含んで成るアミノ酸副配列、すなわちポリペプチドの免疫原性質を実質的に
担当し、そして免疫応答を誘発できる抗原決定基である。

【００９５】本発明の特に典型的なポリペプチドは、配列番号：1-111, 115-171, 173-175,
177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 3
84-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-6
06, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716,
720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 又は 786-788のいずれ
か１つに示されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号：1-111, 115-171, 173-
175, 177, 179-305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及
び 384-476, 524, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 5
93-606, 618-626, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 7
16, 720-722, 735, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 又は 786-788のい
ずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に対して、

【００９６】中位の緊縮条件下で、又は他方では、高い緊縮条件下でハイブリダイズする配
列によりコードされるそれらのポリペプチドを含んで成る。特定の態様において
は、本発明のポリペプチドは、配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329,
331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525,
527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 6
33, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719,
723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791のい
ずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含んで成る。

【００９７】本発明のポリペプチドは時々、それらの同定が、前立腺組織サンプルにおける
それらの高められた発現レベルに少なくとも一部、基づかれている表示として、
前立腺−特異的タンパク質又は前立腺−特異的ポリペプチドとして本明細書にお
いて定義される。従って、“前立腺−特異的ポリペプチド”又は“前立腺−特異
的タンパク質”は一般的に、本明細書において提供される代表的アッセイを用い
て決定される場合、他の正常な組織における発現のレベルよりも、少なくとも２
倍、及び好ましくは少なくとも５倍、高いレベルで、前立腺組織サンプルの実質
的な割合で、例えば試験される前立腺組織サンプルの好ましくは約20％以上、よ
り好ましくは約30％以上、及び最も好ましくは約50％以上で発現される、本発明
のポリペプチド配列、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列を言及する。腫瘍細胞における発現のその高められたレベルに基づいての
本発明の前立腺―特異的ポリペプチド配列は、下記にさらに記載されるように、
診断マーカー及び治療標的物として特に使用される。

【００９８】一定の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、免疫原性であり、
すなわち、それらは前立腺癌を有する患者からの抗血清及び/又はT−細胞と、イ
ムノアッセイ（例えばELISA又はT−細胞刺激アッセイ）内で検出可能的に反応す
る。免疫原活性についてのスクリーニングは、当業者に良く知られている技法を
用いて行われ得る。例えば、そのようなスクリーニングは、Harlow and Lane, A
ntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Hurbor Laboratory, 1988に記
載されるそれらの方法を用いて行われ得る。１つの典型的な例においては、ポリ
ペプチドが、固体支持体上に固定され、そして固定されたポリペプチドへの血清
内の抗体の結合を可能にするために、患者の血清と接触せしめられ得る。次に、
未結合の血清が除去され、そして結合された抗体が、例えば¹²⁵I−ラベルされた
タンパク質Aを用いて検出される。

【００９９】当業者により認識されるように、本明細書に開示されるポリペプチドの免疫原
性部分はまた、本発明により包含される。“免疫原性部分”とは、本明細書にお
いて使用される場合、ポリペプチドを認識するB−細胞及び/又はT−細胞表面抗
原受容体とそれ自体、免疫学的に反応する（すなわち、特異的に結合する）、本
発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は一般的に、
良く知られている技法、例えばPaul, Fundamental Immunology, 3^rd ed., 243-2
47 (Raven Press, 1993) 及びそこに引用される文献に要約されるそれらの技法
を用いて同定され得る。

【０１００】そのような技法は、抗原−特異的抗体、抗血清及び/又はT−細胞系又はクロー
ンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングを包含する。本明細
書において使用される場合、抗血清及び抗体は、それらが抗原に対して特異的に
結合する場合（すなわち、それらがELISA又は他のイムノアッセイにおいてタン
パク質と反応し、そして関係ないタンパク質と検出できるほど反応しない場合）
、“抗原−特異的”である。そのような抗血清及び抗体は、本明細書に記載され
るようにして、及び良く知られている技法を用いて調製され得る。

【０１０１】 1つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、十
分な長さのポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで抗血清及び/
又はT−細胞と反応する部分である（例えば、ELISA及び/又はT−細胞反応アッセ
イにおいて）。好ましくは、免疫性部分の免疫原活性のレベルは、十分な長さの
ポリペプチドについての免疫原性の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約
70％及び最も好ましくは約90％以上である。多くの場合、例えば約100％又は150
％、もしくはそれ以上の免疫原活性を有する、その対応する十分な長さのポリペ
プチドの免疫原活性よりも高いレベルの免疫原活性を有する好ましい免疫原性部
分が同定されるであろう。

【０１０２】一定の他の態様においては、典型的な免疫原性部分は、N−末端リーダー配列
及び/又はトランスメンブランドメインが欠失されているペプチドを包含するこ
とができる。他の典型的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して、小さなN
−及び/又はC−末端欠失（例えば、１〜30個のアミノ酸、好ましくは５〜15個の
アミノ酸）を含むであろう。もう１つの態様においては、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチド
、特に本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその免疫
性フラグメント又は変異体に対して生成されたT細胞及び/又は抗体と免疫学的に
反応する１又は複数のポリペプチドを含んで成ることができる。

【０１０３】本発明のもう１つの態様においては、本明細書に記載される１又は複数のポリ
ペプチドと免疫学的に反応するT細胞及び/又は抗体を誘発することができる１又
は複数のポリペプチド、又は本明細書に開示されるポリヌクレオチド、又はその
免疫原性フラグメント又は変異体に含まれる連続した核酸配列、又は中位〜高い
緊縮の条件下で１又は複数のそれらの核酸配列に対してハイブリダイズする１又
は複数の核酸配列によりコードされる１又は複数のポリペプチドを含んで成るポ
リペプチドが提供される。

【０１０４】もう１つの観点においては、本発明は、本明細書に示されるポリペプチド組成
物の少なくとも約5, 10, 15, 20, 25, 50又は100個、又はそれ以上の、例えばす
べて中間の長さのアミノ酸、例えば配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 3
29, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522,
525, 527, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 63
2, 633, 635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-7
19, 723-734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791
で示されるそれらのもの、又は配列番号：1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-
305, 307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 52
4, 526, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-62
6, 630, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 7
35, 737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 又は 786-788の配列で示されるポ
リヌクレオチド配列によりコードされるそれらのものを含んで成るポリペプチド
フラグメントを提供する。

【０１０５】もう１つの観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド組
成物の変異体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド変異体
は典型的には、本明細書に示されるポリペプチド配列に対して、その長さにそっ
て、少なくとも約70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95
％，96％，97％，98％又は99％又はそれ以上の同一性（下記のようにして決定さ
れる）を示すであろう。 1つの好ましい態様においては、本発明により提供されるポリペプチドフラグ
メント及び変異体は、本明細書に特異的に示される十分な長さのポリペプチドと
反応する抗体及び/又はT−細胞と免疫学的に反応する。

【０１０６】もう１つの好ましい態様においては、本発明により提供されるポリペプチドフ
ラグメント及び変異体は、本明細書に特異的に示される十分な長さのポリペプチ
ドにより示されるレベルの少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約70％及び
最も好ましくは少なくとも約90％又はそれ以上の免疫原活性のレベルを示す。ポリペプチド“変異体”とは、本明細書において使用される場合、１又は複数
の置換、欠失、付加及び/又は挿入により、本明細書に特異的に開示されるポリ
ペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に
存在することができ、又は例えば本発明の上記１又は複数のポリペプチド配列の
修飾、及び当業界において良く知られている多くの技法のいずれかを用いての、
本明細書に記載されるようなそれらの免疫原活性の評価により合成的に生成され
得る。

【０１０７】例えば、本発明のポリペプチドの1つの典型的な変異体は、１又は複数の部分
、例えばN−末端リーダー配列又はトランスメンブランドメインが除去されてい
るそれらのものを包含する。他の典型的な変異体は、小さな部分（例えば、１〜
30個のアミノ酸、好ましくは５〜15個のアミノ酸）が成熟タンパク質のN−及び/
又はC−末端から除去されている変異体を包含する。

【０１０８】多くの場合、変異体は保存性置換を含むであろう。“保存性置換”は、ペプチ
ド化学の当業者が実質的に変更されていないポリペプチドの二次構造及び水治療
性質を予測できるように、１つのアミノ酸が、類似する性質を有するもう１つの
アミノ酸により置換されている置換である。上記に記載されるように、修飾は、
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造体において行われ得、そして
さらに、所望する特性、例えば免疫原特性を有する変異体又は誘導体ポリペプチ
ドをコードする機能的分子を得ることができる。本発明のポリペプチドの同等の
、又はさらに改良された免疫原性変異体又はその一部を創造するためにポリペプ
チドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は典型的には、表
１に従って、コードするDNA配列の１又は複数のコドンを変更するであろう。

【０１０９】例えば、一定のアミノ酸は、基質分子上の抗体の抗原−結合領域又は結合部位
との相互作用結合能力の測定できる損失を伴なわないで、タンパク質構造におけ
る他のアミノ酸により置換され得る。それは、タンパク質の生物学的機能的活性
を定義するタンパク質の相互作用能力及び性質であるので、一定のアミノ酸配列
置換は、タンパク質配列及びもちろん、その基本的なDNAコード配列いおいて行
われ得、そしてそれにもかかわらず、同様の性質を有するタンパク質を得ること
ができる。従って、種の変更は、それらの生物学的有用性又は活性の測定できる
損失を伴なわないで、開示される組成物のペプチド配列、又は前記ペプチドをコ
ードする、対応するDNA配列において行われ得る。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】そのような変更を行う場合、アミノ酸の水治療指数が考慮され得る。タンパク
質に対して相互反応性生物学的機能を付与する場合のその水治療指数の重要性は
、当業界において一般的に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982; 引用に
より本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的水治療特性が、他の分子、例
えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原及び同様のものとタンパク質との相
互作用を定義する、得られるタンパク質の二次構造に寄与することが認められる
。個々のアミノ酸は、疎水性及び電荷特徴に基づいて水治療指数を割り当てされ
ている（Kyte and Doolittle, 1982）。それらの値は次の通りである；イソロイ
シン（＋4.5）；バリン（＋4.2）；ロイシン（＋3.8）；フェニルアラニン（＋2
.8）；システイン/シスチン（＋2.5）；メチオニン（＋1.9）；アラニン（＋1.8
）；グリシン（＋0.4）；トレオニン（−0.7）；セリン（−0.8）；トリプトフ
ァン（−0.9）；チロシン（−1.3）；プロリン（−1.6）；ヒスチジン（−3.2）
；グルタメート（−3.5）；グルタミン（−3.5）；アスパーテート（−3.5）；
アスパラギン（−3.5）；リシン（−3.9）；及びアルギニン（−4.5）。

【０１１２】一定のアミノ酸が、類似する水治療指数又は評点を有する他のアミノ酸により
置換され得、そしてさらに、類似する生物学的活性を有するタンパク質をもたら
し、すなわち、生物学的機能的に同等のタンパク質をさらに得ることができるこ
とが知られている。そのような変更を行う場合、水治療指数が±２以内であるア
ミノ酸の置換が好ましく、±以１以内のそれらの置換が特に好ましく、そして±
0.5以内のそれらの置換がさらにより特別には好ましい。同様のアミノ酸の置換
は、親水性に基づいて効果的に行われ得ることはまた、当業界において理解され
ている。アメリカ特許第4,554,101号（引用により本明細書中に特別に組み込ま
れる）は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるように、タンパク質
の最高の局部平均親水性は、タンパク質の生物学的性質と相互関係することを言
及する。

【０１１３】アメリカ特許第4,554,101号に記載されるように、次の親水性値が、アミノ酸
残基に割り当てられて来た：アルギン（＋3.0）；リシン（＋3.0）；アスパーテ
ート（＋3.0±１）；グルタメート（＋3.0±１）；セリン（＋0.3）；アスパラ
ギン（＋0.2）；グルタミン（＋0.2）；グリシン（０）；トレオニン（−0.4）
；プロリン（−0.5±１）；アラニン（−0.5）；ヒスチジン（−0.5）；システ
イン（−1.0）；メチオニン（−1.3）；バリン（−1.5）；ロイシン（−1.8）；
イソロイシン（−1.8）；チロシン（−2.3）；フェニルアラニン（−2.5）；ト
リプトファン（−3.4）。アミノ酸が、類似する親水性値を有するもう１つのア
ミノ酸により置換され得、そしてさらに、生物学的に同等のもの及び特に、免疫
学的に同等のタンパク質を得ることができることは理解されている。そのような
変更においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以
内のそれらの置換が好ましく、そして±0.5以内の置換がさらにより特別には、
好ましい。

【０１１４】上記で概略されるように、従ってアミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換
基、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ及び同様のものの相対的類似
性に基づかれている。種々の前記特性を考慮しての典型的な置換は、当業者に良
く知れられており、そしてアルギニン及びリシン；グルタメート及びアスパーテ
ート；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；及びバリン、ロイ
シン及びイソロイシンを包含する。

【０１１５】さらに、いずれかのポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を高めるために
、さらに修飾され得る。可能な修飾は、5’及び/又は3’末端でのフランキング
配列の付加；主鎖におけるホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホチオエ
ート又は2’O−メチルの使用；及び/又は非従来の塩基、例えばイノシン、キュ
エオシン、ワイブトシン、及びアセチル−メチル、チオ−及び他の修飾された形
のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの封入を包含するが、但
しそれらだけには限定されない。

【０１１６】アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性及び/又は両性性
質における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸は、
アスパラギン酸及びグルタミンを包含し；正に荷電されたアミノ酸はリシン及び
アルギニンを包含し；そして類似する親水性値を有する荷電されていない極性ヘ
ッド基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及び
アラニン；アスパラギン及びグルタミン；及びセリン、トレオニン、フェニルア
ラニン及びチロシンを包含する。

【０１１７】保存性変化を提供することができる他のグループのアミノ酸は、次のものを包
含する：（１）ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; （２）cys, se
r, tyr, thr;（３）val, ile, leu, met, ala, phe;（４）lys, arg, his; 及び
（５）phe, tyr, trp, his。変異体はまた、又は他方では、非保存性変化を含
むことができる。好ましい態様においては、変異体のポリペプチドは、５個又は
それよりも少ないアミノ酸の置換、欠失又は付加により、生来の配列とは異なる
。変異体はまた（又は他方では）、例えばポリペプチドの免疫原性、二次構造及
び水治療性質に最少の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加により修飾され得る
。

【０１１８】上記に示されるように、ポリペプチドは、タンパク質の移行を、同時翻訳的に
又は後―翻訳的に方向づける、タンパク質のN−末端でのシグナル（又はリーダ
ー）配列を含んで成ることができる。前記ポリペプチドはまた、ポリペプチド（
例えば、ポリ−His）の合成、精製又は同定の容易さのために、又は固体支持体
へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカー又は他の配列に接合され得
る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域に接合され得る。

【０１１９】ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列は、それらの２種の配列におけ
るアミノ酸の配列が、下記のように、最大の対応性について一列整列される場合
、同じであるなら、“同一”であると言われる。２種の配列間の比較は典型的に
は、配列類似性の局部領域を同定し、そして比較するために、比較窓にわたって
配列を比較することによって行われる。“比較窓”とは、本明細書において使用
される場合、少なくとも約20、通常30〜約70、40〜約50個の連続した位置のセグ
メントを言及し、ここで1つの配列が、２種の配列が最適に一列整列された後、
同じ数の連続位置の対照配列に比較され得る。

【０１２０】比較のための配列の最適な一列整列は、デフォールトパラメーターを用いて、
生物情報化学ソフトウェアーのLasergene組みにおけるMegalinプログラム（DNAS
TAR, Inc., Madison, WI）を用いて行われ得る。このプログラムは、次の文献に
記載されるいくつかの一列整列スキームを具体化する：Dayhoff, M.O. (1978) A
model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting dista
nt relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and S
tructure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5,
Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and
Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press,
Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-1
53; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (197
1) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-
425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Prin
ciples and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco,
CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80
:726-730。

【０１２１】他方では、比較のための配列の最適な一列整列は、Smith and Waterman (1981
) Add. APL. Math 2: 482の局部同一アルゴリズムにより、Needleman and Wunsc
h (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の同一性一列整列アルゴリズムにより、Pearso
n and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性方法につ
いての調査により、それらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Pack
age, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIにおける
GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA及びTFASTA）のコンピューター処理された実行によ
り、又は調査により行われ得る。

【０１２２】％配列同一性及び配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの１つ
の好ましい例は、それぞれ、Altschulなど., (1977) Nucl. Acids Res. 25: 338
9-3402及びAltschulなど., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されるBL
AST及びBLAST2.0アルゴリズムである。BLAST及びBLAST2.0は、本発明のポリヌク
レオチド及びポリペプチドについての％配列同一性を決定するために、本明細書
に記載されるパラメーターと共に使用され得る。BLAST分析を行うためのソフト
ウェアは、National Center for Biotechnology Information を通して入手でき
る。

【０１２３】アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累積評点を計算するために使
用され得る。個々の方向におけるワードヒット（word hits）の拡張は、次の場
合に停止される：累積一列整列評価が、その最大の達成された値から量X、低下
する場合：累積評点が、１又は複数の負の評点残基一列整列の蓄積のために、ゼ
ロ又はそれ以下に進行する場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合。BLAS
TアルゴリズムパラメーターW, T及びXは、一列整列の感度及び速度を決定する。

【０１２４】 1つの好ましいアプローチにおいては、“配列同一性の％”は、少なくとも20
の位置の比較窓にわたって、２種の最適に一列整列された配列を比較することに
よって決定され、ここで比較窓におけるポリペプチド配列の部分は、２種の配列
の最適な一列整列に関して、対照配列（付加又は欠失を包含しない）に比較して
、20％又はそれ以下、通常５−15％又は10〜12％の付加又は欠失（すなわち、ギ
ャップ）を含んで成ることができる。百分率は、同一のアミノ酸残基が、適合さ
れる位置の数を得るために、両配列に存在する位置の数を決定し、対照配列にお
ける位置の合計数により前記適合された位置の数を割り算し、そして配列同一性
の％を得るために、前記結果に100を掛け算することによって計算される。

【０１２５】他の例示的態様においては、ポリペプチドは、本明細書に記載されるような複
数のポリペプチドを含んで成るか、又は本明細書に記載されるような少なくとも
１つのポリペプチド及び未関係の配列、例えば既知の腫瘍タンパク質を含んで成
る融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは例えば、Tヘルパーエピトー
プ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されるTヘルパーエ
ピトープの供給を助けることができ、又は生来の組換えタンパク質よりも高い収
率でのタンパク質（発現エンハンサー）の発現を助けることができる。一定の好
ましい融合パートナーは、免疫学的及び発現増強融合パートナーである。他の融
合パートナーは、ポリペプチドの融解性を高めるために、又は所望する細胞内区
画へのポリペプチドの標的化を可能にするために、選択され得る。さらに融合パ
ートナーは、ポリペプチド精製を促進する親和性標識を包含する。

【０１２６】融合ポリペプチドは一般的に、化学的接合を包含する標準の技法を用いて調製
され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現システムにおいて、融合され
ていないポリペプチドに対して、高められたレベルの生成を可能にする組換えポ
リペプチドとして発現される。手短には、ポリペプチド成分をコードするDNA配
列は、別々にアセンブリーされ、そして適切な発現ベクター中に連結される。１
つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3’末端が、配列の読み取り枠が整
合して存在するよう、第２のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5’末端に
、ペプチドリンカーを伴なって又はそれを伴わないで連結される。これは、両成
分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチド中への翻訳を
可能にする。

【０１２７】ポリペプチドリンカ−配列は、個々のポリペプチドがその二次及び三次構造に
祈りたたむことを確保するための十分な距離、第１及び第２ポリペプチド成分を
分離するために使用され得る。そのようなポリペプチドリンカー配列は、当業界
において良く知られている標準の技法を用いて、融合ポリペプチド中に導入され
る。適切なペプチドリンカー配列は、次の要因に基づいて選択され得る：（１）
柔軟な延長されたコンホメーションを採用するためのそれらの能力；（２）第１
及び第２ポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用する二次構造を採用する
それらの無能性；及び（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応する疎水性又
は荷電された残基の欠失。

【０１２８】好ましいペプチドリンカー配列は、Gly，Asn及びSer残基を含む。他の類似す
る中性アミノ酸、例えばThr及びAlaがまた、リンカー配列に使用され得る。リン
カーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Marateaなど., Gene 40: 39-46
, 1985; Murphyなど．，Proc. Natl. Acad. Sci. USA83：8258−8262、1988; ア
メリカ特許第4,935,233号及びアメリカ特許第4,751,180号に開示されるそれらの
配列を包含する。リンカー配列は一般的に、１〜約50個の長さのアミノ酸であり
得る。リンカー配列は、第１及び第２ポリペプチドが、機能的ドメインを分離し
、そして立体的障害を妨げるために使用され得る非必須N−末端アミノ領域を有
する場合、必要とされない。

【０１２９】連続されたDNA配列は、適切な転写又は翻訳調節要素に操作可能的に連結され
る。DNAの発現を胆当する調節要素は、第１ポリペプチドをコードするDNAの5’
側のみに位置する。同様に、翻訳及び転写終結シグナルを終結するために必要と
される停止コドンは、第２ポリペプチドをコードするDNA配列の3’側にのみ存在
する。融合ポリペプチドは、未関連の免疫原タンパク質、例えば再現応答を誘発でき
る免疫原タンパク質と共に、本明細書に記載されるようなポリペプチドを含んで
成る。そのようなタンパク質の例は、破傷風、結核及び肝炎タンパク質を包含す
る（例えば、Stouteなど., New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997を参照のこと
）。

【０１３０】 1つの好ましい態様においては、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリ
ウムsp., 例えばマイコバクテリウム・ツベルキロシス（Mycobacterium tubercu
losis）−由来のRa12フラグメントから誘導される。異種ポリヌクレオチド/ポリ
ペプチド配列の発現及び/又は免疫原性の増強へのそれらの使用のためのRa12組
成物及び方法は、アメリカ特許出願60/158, 585号（その開示は引用により本明
細書に組み込まれる）に記載される。手短には、Ra12は、マイコバクテリウム・
ツベルキロシスMTB32A核酸の副配列であるポリヌクレオチド領域を言及する。MT
B32Aは、M.ツベルキロシスのビルレント及び非ビルレント株における遺伝子によ
りコードされる、32KDの分子量のセリンプロレアーゼである。

【０１３１】 MTB32Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は記載されている（例えば、アメ
リカ特許出願60/158, 585号；また、Skeikyなど., infection and Immun. (1999
) 67: 3998-4007 (引用により本明細書に組み込まれる) を参照のこと）。MTB32
Aコード配列のC−末端フラグメントは、高レベルで発現し、そして精製工程を通
して可溶性ポリペプチドとして存続する。さらに、Ra12は、それが融合される異
種免疫原ポリペプチドの免疫原性を増強することができる。１つの好ましいRa12
融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14kDのC−末端
フラグメントを含んで成る。他の好ましいRa12ポリヌクレオチドは一般的に、Ra
12ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約15個の連続したヌクレオチド
、少なくとも約30個のヌクレオチド、少なくとも約60個のヌクレオチド、少なく
とも約100個のヌクレオチド、少なくとも約200個のヌクレオチド、又は少なくと
も約300個のヌクレオチドを含んで成る。

【０１３２】 Ra12ポリヌクレオチドは、生来の配列（すなわち、Ra12ポリペプチド又はその
一部をコードする内因性配列）を含んで成り、又はそのような配列の変異体を含
んで成ることができる。Ra12ポリヌクレオチド変異体は、コードされる融合ポリ
ペプチドの生物学的活性が、生来のRa12ポリペプチドを含んで成る融合ポリペプ
チドに対して、実質的に低められないように、１又は複数の置換、付加、欠失及
び/又は挿入を含むことができる。変異体は好ましくは、生来のRa12ポリペプチ
ド又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約70％
の同一性、より好ましくは少なくとも約80％の同一性及び最も好ましくは少なく
とも約90％の同一性を示す。

【０１３３】他の好ましい態様においては、免疫学的融合パートナーは、タンパク質D、す
なわちグラム陰性細菌ヘモフィラス・インフルエンザBから誘導される（WO91/18
926号）。好ましくは、タンパク質D誘導体はタンパク質のほぼ1/3（例えば、最
初のN−末端の100〜110個のアミノ酸）を含んで成り、そしてタンパク質D誘導体
は脂質化され得る。一定の好ましい態様においては、リポタンパク質D融合パー
トナーの最初の109個の残基は、追加の外因性T−細胞エピトープを有するポリペ
プチドを供給するために、及びE．コリにおける発現レベルを高めるために（従
って、発現エンハンサーとして機能する）、N−末端上に包含される。脂質末端
は、抗原提供細胞への抗原の最適な提供を確保する。他の融合パートナーは、イ
ンフルエンザウィルスからの非構造タンパク質、NS1（ヘマグルチニン）を含む
。典型的には、N−末端の８個のアミノ酸が使用され得るが、但し、T−ヘルパー
エピトープを含む異なったフラグメントも使用され得る。

【０１３４】もう１つの態様においては、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られて
いるタンパク質、又はその一部（好ましくは、C−末端部分）である。LYTAは、
アミダーゼLYTA（LytA遺伝子によりコードされる；Gene 43: 265-292, 1986）と
して知られているN−アセチル−L−アラニンアミダーゼを合成する、ストレプト
コーカス・プネウモニアエ（Streptococcus pneumoniae）から誘導される。LYTA
は、ペプチドグリカン主鎖における一定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素
である。

【０１３５】 LYTAタンパク質のC−末端ドメインは、コリン又はコリン類似体、例えばDEAE
に対する親和性を担当できる。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用
であるE．コリC−LYTA発現プラスミドの生成のために開発されて来た。アミノ末
端でC−LYTAフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は記載されてい
る（Biotechnology 10: 795-798, 1992を参照のこと）。好ましい態様において
は、LYTAの反復体部分は、融合ポリペプチド中に組み込まれ得る。反復体部分は
、残基178で開始するC−末端領域に見出される。特に好ましい部分は、残基188
−305を組み込む。

【０１３６】さらにもう1つの例示的な態様は、融合ポリペプチド及びそれらをコードする
ポリヌクレオチドを包含する。ここで融合パートナーは、アメリカ特許第5,633,
234号に記載されるように、エンドソーム/リソソーム区画にポリペプチドを方向
づけることができる標的化シグナルを含んで成る。本発明の免疫原ポリペプチド
は、この標的化シグナルとともに融合される場合、MHCクラスII分子とより効果
的に会合し、そしてそれにより、ポリペプチドに対して特異的なCD4⁺T−細胞の
増強されたインビボ刺激を提供する。

【０１３７】本発明のポリペプチドは、種々の良く知られた合成及び/又は組換え技法のい
ずれかを用いて調製され、その後者は、下記にさらに記載される。一般的に約15
0個よりも少ないアミノ酸のポリペプチド、その一部及び他の変異体は、当業者
に良く知られている技法を用いて、合成手段により生成され得る。１つの例示的
な例においては、そのようなポリペプチドは、市販の固相技法、例えばMerrifie
ld固相合成方法（ここで、アミノ酸は、成長するアミノ酸鎖に連続的に付加され
る）のいずれかを用いて合成される。Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149
-2146, 1963を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための装置は、
供給者、例えばPerkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA)
から市販されており、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。

【０１３８】一般的に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離さ
れる。“単離された”ポリペプチドは、その元の環境から除去されるポリペプチ
ドである。例えば、天然に存在するタンパク質又はポリペプチドは、それが天然
のシステムにおける同時存在する材料のいくつか又はすべてから分離される場合
、単離される。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた、精製され、例えば
少なくとも約90％の純度、より好ましくは少なくとも約95％の純度、及び最も好
ましくは少なくとも約99％の純度である。

【０１３９】ポリヌクレオチド組成物本発明は、他の面において、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「DNA
」および「ポリヌクレオチド」は、粒子の種の全ゲノムDNAを含まない単離され
たDNA分子を意味するために本質的に互換的に使用される。「単離された」は、
本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドが他のコーディング配列から
実質的に離れていること、および無関係のコーディングDNAの大きい部分、例え
ば、染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコーディン
グ領域を含有しないことを意味する。もちろん、これは本来単離されたDNA分子
を意味し、そして人間の手によりセグメントに後に付加された遺伝子またはコー
ディング領域を排除しない。

【０１４０】当業者は理解するように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、ゲノム配列、
余分のゲノムおよびプラスミドコード化配列およびタンパク質、ポリペプチド、
ペプチドおよびその他を発現するか、あるいは発現するように適合可能な、より
小さい操作された遺伝子セグメントを包含することができる。このようなセグメ
ントは自然に単離されるか、あるいは人間の手によりにより合成的に修飾するこ
とができる。

【０１４１】また、当業者は認識するように、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖（コーデ
ィングまたはアンチセンス）または二本鎖であることができ、そしてDNA（ゲノ
ム、cDNAまたは合成的）またはRNA分子であることができる。RNA分子は、イント
ロンを含有しかつ1対1の方法でDNA分子に対応するHnRNA、およびイントロンを含
有しないmRNA分子を包含することができる。追加のコーディングまたは非コーデ
ィング配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在することができるが、存在す
ることは不必要であり、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支
持物質に結合することができるが、結合することは不必要である。

【０１４２】ポリヌクレオチドは天然配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質
またはその一部分をコードする内因性配列）を含んでなることができるか、ある
いはこのような配列の変異型、好ましくは免疫原性変異型をコードする配列を含
んでなることができる。

【０１４３】したがって、本発明の他の面によれば、配列番号1〜111、115〜171、173〜175
、177、179〜305、307〜315、326、328、330、332〜335、340〜375、381〜382お
よび384〜476、524、526、530、531、533、535、536、552、569〜572、587、591
、593〜606、618〜626、630、631、634、636、639〜655、674、680、681、711、
713、716、720〜722、735、737〜739、751、753、764、765、773〜776および786
〜788のいずれか1つに記載されるポリヌクレオチド配列のいくつかまたはすべて
、

【０１４４】配列番号1〜111、115〜171、173〜175、177、179〜305、307〜315、326、328
、330、332〜335、340〜375、381〜382および384〜476、524、526、530、531、5
33、535、536、552、569〜572、587、591、593〜606、618〜626、630、631、634
、636、639〜655、674、680、681、711、713、716、720〜722、735、737〜739、
751、753、764、765、773〜776および786〜788のいずれか1つに記載されるポリ
ヌクレオチド配列の相補体、および

【０１４５】配列番号1〜111、115〜171、173〜175、177、179〜305、307〜315、326、328
、330、332〜335、340〜375、381〜382および384〜476、524、526、530、531、5
33、535、536、552、569〜572、587、591、593〜606、618〜626、630、631、634
、636、639〜655、674、680、681、711、713、716、720〜722、735、737〜739、
751、753、764、765、773〜776および786〜788のいずれか1つに記載されるポリ
ヌクレオチド配列のデジェネレイト変異型を含んでなるポリヌクレオチド組成物
が提供される。ある好ましい態様において、本明細書に記載するポリヌクレオチ
ド配列は、前述したように、免疫原性ポリヌクレオチドをコードする。

【０１４６】他の関係する態様において、本発明は、配列番号1〜111、115〜171、173〜175
、177、179〜305、307〜315、326、328、330、332〜335、340〜375、381〜382お
よび384〜476、524、526、530、531、533、535、536、552、569〜572、587、591
、593〜606、618〜626、630、631、634、636、639〜655、674、680、681、711、
713、716、720〜722、735、737〜739、751、753、764、765、773〜776および786
〜788で本明細書に開示する配列に対して実質的同一性を有するポリヌクレオチ
ド変異型、例えば、本明細書に記載する方法（例えば、後述するように、標準パ
ラメーターを使用してBLAST分析）を使用して本発明のポリヌクレオチドに比較
して少なくとも70％の配列同一性、好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90
％、95％、96％、97％、98％または99％またはそれより高い配列同一性を有する
ポリヌクレオチド変異型を提供する。当業者は認識するように、コドンデジェネ
ラシー、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決定およびその他を考慮
することによって、これらの値を適当に調節して、2つのヌクレオチド配列によ
りコードされる対応する同一性を決定することができる。

【０１４７】典型的には、ポリヌクレオチド変異型は、好ましくは詳しく本明細書に記載す
るポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに関して、変異型ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの免疫原性が実質的に減少しない
ように、1またはそれ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有するで
あろう。用語「変異型」は、また、異種由来の相同的遺伝子を包含することを理
解すべきである。

【０１４８】追加の態様において、本発明は、本明細書に開示する配列の1またはそれ以上
に対して同一であるか、あるいは相補的である配列の種々の長さの隣接ストレッ
チを含んでなるポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書に
開示する配列の1またはそれ以上の少なくとも10、15、20、30、40、50、75、100
、150、200、300、400、500または1000またはそれより長い隣接ヌクレオチドな
らびにそれらの間のすべての中間的長さのものを含んでなるポリヌクレオチドが
本発明により提供される。容易に理解されるように、「中間的長さのもの」は、
これに関して、記載値間の任意の長さ、例えば、16、17、18、19、およびその他
；30、31、32、およびその他；50、51、53、およびその他；100、101、102、103
、およびその他；150、151、152、153、およびその他を意味し、200〜500；500
〜1,000、およびその他のすべての整数を包含する。

【０１４９】本発明の他の態様において、中〜高いストリンジェンシイの条件下に本発明に
おいて提供されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、またはその相補
的配列に対してハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド組成
物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は分子生物学の分野においてよく
知られている。

【０１５０】例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションを試験するために適当な中程度のストリンジェント条件は、下
記の条件を包含する：5×SSC、0.5％SDS、1.0mMのEDTA（pH8.0）の溶液中の前洗
浄；50℃〜60℃、5×SSCにおける一夜のハイブリダイゼーション；次いで0.1％S
DSを含有する2×、0.5×および0.2×SSCの各々を使用する65℃において20分間の
洗浄。当業者は理解するように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシイ
は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイ
ゼーションを実行する温度を変更することによって、容易に操作することができ
る。例えば、他の態様において、適当な高度にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件は前述の条件を包含するが、ただしハイブリダイゼーションの温
度は、例えば、60〜65℃または65〜70℃に増加する。

【０１５１】ある好ましい態様において、前述のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオ
チド変異型、フラグメントおよびハイブリダイゼーション配列は、本明細書に詳
しく記載するポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコード
する。他の好ましい態様において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書に
詳しく記載するポリペプチド配列についての免疫原活性レベルの少なくとも約50
％、好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約90％の免疫原活
性レベルを有するポリペプチドをコードする。

【０１５２】本発明のポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントは、コーディング配
列それ自体の長さを無視して、他のDNA配列、例えば、プロモーター、ポリアデ
ニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコーディン
グセグメント、およびその他と組合わせ、それらの全体の長さをかなり変化させ
ることができる。したがって、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントを使用す
ることができ、全長さは調製の容易さおよび意図する組換えDNAプロトコルにお
ける使用により制限されることが考えられる。例えば、約10,000、約5,000、約3
,000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50塩基対長さ、およびその
他（すべての中間長さを包含する）の全長さを有する例示的ポリヌクレオチドセ
グメントは本発明の多数の実行において有効であると考えられる。

【０１５３】ポリヌクレオチド配列を比較するとき、2つの配列中のヌクレオチド配列が、
後述するように、最大対応で整列する場合、2つの配列中のヌクレオチド配列は
「同一」であると言われる。典型的には、2つの配列間の比較は、比較ウィンド
ウ上で配列を比較して配列類似性の局所的領域を同定し、比較することによって
実行される。「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用するとき、少なくと
も約20、通常30〜約75、好ましくは40〜約50の隣接位置のセグメントを意味し、
ここで2つの配列間が最適に整列された後、配列を同数の隣接位置の参照配列と
比較することができる。

【０１５４】比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォーマチックスソフトウェア
のレーザージーン（Lasergene）組中のメガリン（Megalign）プログラム（DNAST
AR，Inc.、ウイスコンシン州マディソン）に従いデフォルトパラメーターを使用
して実行することができる。このプログラムは下記の文献に記載されているいく
つかの整列スキームに具体化される：Dayhoff、M.O.（1978）A model of evo
lutionary change in proteins−Matrices for detecting distant rela
tionships．In Dayhoff、M.O.（編者）Atlas of Protein Sequence and S
tructures、National Biomedical Research Foundation、ワシントンD.C. V
ol. 5、Suppl. 3、pp. 345−358；

【０１５５】 Hein J.（1990）Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.
626−645 Methods in Enzymology Vol. 183、Academic Press，Inc．、
カリフォルニア州サンディエゴ；Higgins、D.G.およびSharp、P.M.（1989）CABI
OS 5：151−153；Myers、E.W.およびMuller W.（1988）CABIOS 4：11−17；R
obinson、E.D.（1971）Comb. Theor 11：105；Santou、N. Nes、M.（1987）M
ol. Biol. Evol. 4：406−425；Sneath、P.H.A.およびSokal、R.R.（1973）N
umerical Taxonomy−the Principles and Practice of Numerical Taxon
omy、Freeman Press、カリフォルニア州サンフランシスコ；Wilbur、W.J.およ
びLipman、D.J.（1983）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：726−730。

【０１５６】選択的に、比較のための配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman（1981）A
dd. APL. Math 2：482の局所的同一性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch
（1970）J. Mol. Biol. 48：443の局所的同一性アルゴリズム、Pearsonおよ
びLipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444の類似性の方法の
サーチ、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（GAP、BESTEIT、
BLAST、FASTA、およびTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Pack
age、Genetics Computer Group（GCG）、575 Science Dr.、ウイスコンシン
州マディソン）、または検査により実行することができる。

【０１５７】配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために適当なアルゴリズムの
1つの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、そ
れぞれ、Altschul他（1977）Nucl. Acids Res. 25：3389−3402およびAltsch
ul他（1990）J. Mol. Biol. 215：403−410に記載されている。BLASTおよびB
LAST 2.0を、例えば、本明細書に記載するパラメーターとともにを使用して、
本発明のポリヌクレオチドについての配列類似性の百分率を決定することができ
る。BLAST分析を実行するソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バ
イオテクノロジー・インフォメーション（National Center for Biological
Information）を通して公衆用に入手可能である。

【０１５８】 1つの例示的例において、例えば、ヌクレオチド配列、パラメーターM（1対の
合致する残基についての報酬スコア；常に＞0）およびN（不一致残基についての
ペナルティースコア；常に＜0）を使用して、累積スコアを計算することができ
る。各方向におけるワードのヒットのエクステンションは下記の場合に中止され
る：1またはそれ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積のために、累積がゼロ以
下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合。BLASTアルゴリズ
ムパラメーターはW、TおよびXは整列の感度および速度を決定する。BLASTNプロ
グラム（ヌクレオチド配列について）は下記の値をデフォルトとして使用する：
11のワード長さ、および10のエクステンション（E）、およびBLOSUM62スコアリ
ングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff（1989）Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 89：10915参照）整列、50の（B）、10のエクステンション（E）、M＝5
、N＝−4および両方の鎖の比較。

【０１５９】好ましくは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも20の位置の比較ウィンド
ウ上で2つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで2つ
の配列間の最適な整列についての参照配列（これらは付加または欠失を含まない
）に比較して、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分は20％以下、
通常5〜15、または10〜12％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むこ
とができる。同一核酸塩基が両方の配列の中に存在する位置の数を決定して合致
した位置の数を確定し、合致した位置の数を参照配列中の位置の全数（すなわち
、ウィンドウサイズ）で割り、100を掛けて配列同一性の百分率を決定すること
によって、百分率を計算する。

【０１６０】当業者は認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーの結果として、本明細書
に記載するようにポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在する
。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配
列に対して最小の相同性を支持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差
のために変化するポリヌクレオチドは、本発明により特別に意図される。さらに
、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子のアレレ
は本発明の範囲内に入る。アレレは、ヌクレオチドの1またはそれ以上の突然変
異、例えば、欠失、付加および／または置換の結果として、変更された内因性遺
伝子である。生ずるmRNAおよびタンパク質は変更された構造または機能を有する
ことができるが、有することは不必要である。アレレは標準2つの配列間（例え
ば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベースの配列の比較）
により同定することができる。

【０１６１】したがって、本発明の他の態様において、本明細書に記載するポリペプチドの
免疫原性変異型および／または誘導体を調製するために、突然変異誘発アプロー
チ、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用する。このアプローチにより、ポリ
ペプチドをコードする根元的ポリヌクレオチドの突然変異誘発により、ポリペプ
チド配列中の特異的修飾を行うことができる。これらの技術は、例えば、1また
はそれ以上のヌクレオチド配列をポリヌクレオチドの中に導入することによって
、前述の考えの1またはそれ以上を組込んだ、配列の変異型を調製し、試験する
簡単なアプローチを提供する。

【０１６２】部位特異的突然変異誘発により、所望の突然変異のDNA配列をコードする特異
的ポリヌクレオチド配列、ならびに十分な数の調節ヌクレオチドを使用して突然
変異を産生して、トラバースされる欠失結合部の両側に安定な二重らせんを形成
することができる。選択したポリヌクレオチド配列において突然変異を使用して
、ポリヌクレオチドそれ自体の性質を改良し、変更し、減少し、修飾し、または
そうでなければ変化させ、コード化されたポリペプチドの性質、活性、組成、安
定性、または一次配列を変更することができる。

【０１６３】本発明のある態様において、本発明は、コード化されたポリペプチドの1また
はそれ以上の性質、例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性を変更するために
、開示されたポリヌクレオチド配列の突然変異誘発を意図する。部位特異的突然
変異誘発の技術はこの分野においてよく知られており、そしてポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドの両方の変異型の調製に広く使用される。例えば、部位特異
的突然変異誘発はDNA分子の特定の部分を変更するためにしばしば使用される。
このような態様において、典型的には約14〜約23ヌクレオチドを含んでなるか、
あるいはそのような長さのプライマーを使用し、配列の結合部の両側の約5〜約1
0残基が変更される。

【０１６４】当業者は理解するように、部位特異的突然変異誘発技術において、一本鎖およ
び二本鎖の両方の形態で存在するファージベクターがしばしば使用されてきてい
る。典型的には、部位特異的突然変異誘発において有効なベクターはM13ファー
ジのようなベクターを包含する。これらのファージは容易に商業的に入手可能で
あり、そしてそれらの使用は一般にこの分野においてよく知られている。また、
問題の遺伝子をプラスミドからファージに転移させる工程を排除する二本鎖プラ
スミドが部位特異的突然変異誘発において日常的に使用される。

【０１６５】本発明に従う部位特異的突然変異誘発は、まず一本鎖ベクターを獲得するか、
あるいは所望のペプチドをコードするDNA配列をその配列の中に含む二本鎖ベク
ターの2つの鎖を溶融分離することによって実行される。所望の突然変異した配
列を支持するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成的に、調製された。
次いでこのプライマーを一本鎖ベクターとアニールし、DNA重合酵素、例えば、
大腸菌（E. coli）ポリメラーゼIクレノーフラグメントに暴露して、突然変異
を支持する鎖の合成を完結する。こうして、ヘテロ二本鎖が形成され、ここで1
つの鎖はオリジナル非突然変異化配列をコードし、そして第2鎖は所望の突然変
異を支持する。次いで、このヘテロ二本鎖を使用して適当な細胞、例えば、大腸
菌（E. coli）細胞を形質転換し、突然変異した配列配置を支持する組換えベク
ターを含むクローンを選択する。

【０１６６】選択したペプチドをコードするDNAセグメントを部位特異的突然変異誘発によ
り調製する方法は、潜在的に有効な種を産生する手段を提供し、ペプチド配列変
異型およびそれらをコードするDNA配列を得ることができる他の方法が存在する
ので、その方法に限定されない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換
えベクターを突然変異誘発因子、例えば、ヒドキシルアミンで処理して配列変異
型を得る。これらの方法およびプロトコルに関する特定の詳述は下記の教示の中
に見出される：Maloy他、1994；Segal、1976；ProkopおよびBajpai、1991；Kuby
、1994；およびManiatis他、1982、各々はその目的で引用することによって本明
細書の一部とされる。

【０１６７】本明細書において使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘
発手順」は、その初期濃度に関して特定の核酸分子の濃度を増加させるか、ある
いは検出可能なシグナル、例えば、増幅の濃度を増加させる、鋳型依存的プロセ
スおよびベクター仲介増殖を意味する。本明細書において使用するとき、用語「
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的
エクステンションを包含するプロセスを意味する。

【０１６８】鋳型依存的プロセスという用語は、RNAまたはDNA分子の核酸合成を意味し、こ
こで核酸の新しく合成された鎖の配列は相補的塩基対合のよく知られているルー
ルにより支配された（例えば、Watson、1987参照）。典型的には、ベクター仲介
法はDNAまたはRNA分子の中への核酸フラグメントの導入、ベクターのクローナル
増幅、および増幅された核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法の
例は米国特許第4,237,224号により提供され、これはその全体において引用する
ことによって特別に本明細書の一部とされる。

【０１６９】本発明のポリペプチド変異型を製造する他のアプローチにおいて、米国特許第
5,837,458号に記載されているように、リカーシブ配列組換えを使用することが
できる。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反
復サイクルを実行して、例えば、免疫原性活性が増強される、本発明の個々のポ
リヌクレオチド変異型を「進化」させる。

【０１７０】本発明の他の態様において、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列
は核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして好都合
に使用することができる。それ自体、本明細書に開示する15ヌクレオチド長さの
隣接配列と同一であるか、あるいはそれに対して相補的である少なくとも約15隣
接ヌクレオチドの配列領域を含んでなる核酸セグメントは特定の実用性を有する
と考えられる。また、より長い隣接する同一または相補的配列、例えば、約20、
30、40、50、100、200、500、1000（すべての中間長さを包含する）およびなお
さらに全長までの配列はある態様において使用されるであろう。

【０１７１】このような核酸プローブは、問題の配列に対して特異的にハイブリダイゼーシ
ョンする能力を有するために、所定の試料中の相補的配列の存在を検出するとき
使用することができる。しかしながら、他の使用、例えば、突然変異体種プライ
マー、または他の遺伝学的構築物の製造において使用するプライマーを調製する
ための配列情報の使用がまた考えられる。

【０１７２】本明細書に記載するポリヌクレオチド配列に対して同一であるか、あるいはそ
れに対して相補的である、10〜14、15〜20、30、50、またはさらに100〜200ヌク
レオチドまたはその他（その上中間長さを包含する）の隣接ヌクレオチドストレ
ッチから成る配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えば、サザンおよび
ノザンブロッティング、において使用するハイブリダイゼーションプローブとし
て特に意図される。

【０１７３】これは、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方の中の遺伝子産物、ま
たはそのフラグメントの分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに
1またはそれ以上の相補的ストレッチのサイズは究極的には意図する使用または
特定の核酸セグメントの適用に依存するであろう。より小さいフラグメントは一
般にハイブリダイゼーション態様において使用され、ここで隣接相補的領域の長
さは、例えば、約15〜約100ヌクレオチドの間で、変化することができるが、検
出しようとする長さの相補的配列に従い、より大きい隣接相補的ストレッチを使
用することができる。

【０１７４】約15〜25ヌクレオチド長さのハイブリダイゼーションプローブを使用して、安
定でありかつ選択的である二重らせん分子を形成することができる。しかしなが
ら、ハイブリッドの安定性および選択性を増加し、これにより得られた特定のハ
イブリッド分子の品質および程度を改良するために、15塩基長さより大きいスト
レッチにわたって隣接相補的配列を有する分子は一般に好ましい。一般に、15〜
25隣接ヌクレオチド、所望ならば、これより長い遺伝子相補的ストレッチを有す
る核酸分子を設計することが好ましいであろう。

【０１７５】ハイブリダイゼーションプローブは本明細書に記載する任意の配列の任意の部
分から選択することができる。必要であるすべては、本明細書に記載する配列を
概観するか、あるいは配列の任意の部分に対して、プローブまたはプライマーと
して利用しようとする、約15〜25ヌクレオチド長さから全長までの配列を概観す
ることである。プローブおよびプライマーの配列の選択は種々の因子により支配
されることがある。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用すること
ができる。

【０１７６】小さいポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、例えば、自動化オ
リゴヌクレオチド合成装置を使用して普通に実施されているように、フラグメン
トを直接的に合成することによって、容易に調製することができる。また、フラ
グメントは、核酸複製技術、例えば、米国特許第4,683,202号（引用することに
よって本明細書の一部とされる）のPCR^TM技術を適用することによって、選択し
た配列を組換え体産生のために組換えベクターの中に導入することによって、そ
して分子生物学の当業者に一般に知られている他の組換えDNA技術により、得る
ことができる。

【０１７７】本発明のヌクレオチド配列は、問題の全遺伝子または遺伝子フラグメントの相
補的ストレッチを有する二重らせん分子を選択的に形成する能力を有するために
、使用することができる。もくろむ適用に依存して、典型的にはハイブリダイゼ
ーションの条件を変化させて、ターゲット配列に対するプローブの選択性の程度
を変化させる。高い感度を必要とする適用のために、典型的には相対的ストリン
ジェントの条件を使用してハイブリッドを形成する、例えば、約50℃〜約70℃の
温度における塩濃度を約0.02M〜約0.15Mとすることによって、例えば、相対的低
い塩および／または高い温度の条件を選択する。このような選択的条件は、存在
する場合、プローブと鋳型またはターゲット鎖との間のわずかのミスマッチを許
容し、そして関係する配列の単離に特に適当であろう。

【０１７８】もちろん、いくつかの適用について、例えば、根元的鋳型に対してハイブリダ
イゼーションした突然変異体プライマー鎖を使用して突然変異体を調製しようと
する場合、ヘテロ二本鎖の形成を可能とするために、典型的には低いストリンジ
ェント（減少したストリンジェンシイ）のハイブリダイゼーション条件を必要と
するであろう。これらの環境において、約20℃〜約55℃の範囲の温度において、
約0.15M〜約0.9Mの塩の条件のような塩条件を使用することができる。

【０１７９】これにより、交差ハイブリダイゼーション性種を対照ハイブリダイゼーション
に関する正のハイブリダイゼーションシグナルとして容易に同定することができ
る。いずれの場合においても、温度の増加と同一方法でハイブリッド二重らせん
を脱安定化する働きをする、増加する量のホルムアミドの添加により、条件をい
っそうストリンジェントすることができることが一般に理解される。こうして、
ハイブリダイゼーション条件は容易に操作することができ、こうして一般に所望
の結果に依存して選択された方法であろう。

【０１８０】本発明の他の態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるポ
リヌクレオチド組成物が提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパ
ク質合成の有効な、ターゲッテッドインヒビターであること証明され、結局、疾
患に寄与するタンパク質の合成を阻害することによって疾患を治療することがで
きる、療法的アプローチを提供する。タンパク質合成を阻害するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの効率は十分に確立されている。例えば、ポリガラクトウロナ
ーゼおよびムスカリン2型アセチルコリンレセプターの合成は、それらのそれぞ
れのmRNA配列に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害さ
れる（米国特許第5,739,119号および米国特許第5,759,829号）。

【０１８１】さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、同義薬剤耐性遺
伝子（MDG1）、ICAM−1、E−セレクチン、STK−1、線条体GABA_Aレセプターおよ
びヒトEGFを使用して証明された（Jaskulski他、Science 1988 Jun 10；240
（4858）：1544−6；VasanthakumarおよびAhmed、Cancer Commun. 1989；1（4
）225−32；Peris他、Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15；57（2）
：310−20；米国特許第5,801,154号；米国特許第5,789,573号；米国特許第5,718
,709号および米国特許第5,610,288号）。また、種々の異常な細胞増殖、例えば
、癌を阻害しかつ治療するために使用できるアンチセンス構築物が記載された（
米国特許第5,747,470号；米国特許第5,591,317号および米国特許第5,783,683号
）。

【０１８２】したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオ
チド配列に特異的に結合することができる任意の配列のすべて、または一部分、
またはそれらの補体を含んでなるオリゴヌクレオチド配列を提供する。1つの態
様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNAまたはその誘導体を含んで
なる。他の態様において、オリゴヌクレオチドはRNAまたはその誘導体を含んで
なる。第3態様において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化修飾バッ
クボーンを含んでなる修飾DNAである。第4態様において、オリゴヌクレオチド配
列はペプチド核酸またはその誘導体を含んでなる。

【０１８３】各場合において、好ましい組成物は、本明細書に記載するポリヌクレオチドの
1またはそれ以上の部分に対して相補的である、より好ましくは実質的相補的で
ある、なおより好ましくは完全に相補的である配列領域を含んでなる。所定の遺
伝子配列に対して特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択したターゲット配
列の分析および二次構造、T_m、結合エネルギー、および相対安定性に基づく。宿
主細胞におけるターゲットmRNAに対する特異的結合を減少または阻害する二量体
、ヘアピン、または他の二次構造を形成する相対不能性に基づいて、アンチセン
ス組成物を選択することができる。

【０１８４】 mRNAの高度に好ましいターゲット領域は、AUG翻訳開始コドンまたはその付近
における領域、およびmRNAの5'領域に対して実質的に相補的である配列である。
これらの二次構造の分析およびターゲット部位の選択の考察は、例えば、OLIGO
プライマー分析のソフトウェアおよび／またはBLASTN2.0.5アルゴリズムソフト
ウェアのバージョン4（Altschul他、Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1；25
（17）：3389−402）を使用して、実行することができる。

【０１８５】また、MPG（27残基）と呼ぶ、短いペプチドベクターを使用してアンチセンス
デリバリー法の使用が考えられる。MPGペプチドは、HIV gp41の融合配列に由来
する疎水性ドメイン、およびSV40 T−抗原の核局在化配列からの親水性ドメイ
ンを含有する（Morris他、Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15；25（14）：2
730−6）。MPGペプチドのいくつかの分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドを
被覆し、そして比較的高い効率（90％）で1時間よりも短い時間で培養した哺乳
動物細胞の中に送出されることができる。さらに、MPGとの相互作用はヌクレア
ーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性および原形質膜を横切る能力の両方を
強く増加させることが証明された。

【０１８６】本発明の他の態様によれば、腫瘍細胞中の本発明の腫瘍ポリペプチドおよびタ
ンパク質の発現を阻害するリボザイム分子の設計および調製において、本明細書
に記載するポリヌクレオチド組成物を使用する。リボザイムは、部位特異的融合
において核酸を切断するRNA−タンパク質複合体である。リボザイムはエンドヌ
クレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する（KimおよびCech、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1987 Dec；84（24）：8788−92；ForsterおよびSym
ons、Cell 1987 Apr 24；49（2）：211−20）。

【０１８７】例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性で、ホスホエステル転移反応を促
進し、しばしばオリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルのただ1
つを切断する（Cech他、Cell 1981 Dec;27(3 Pt 2):487−96；MichelおよびWes
thof、J. Mol. Biol. 1990 Dec 5；216（3）：585−610；Reinhold−Hurek
およびShup、Nature 1992 May 14；357（6374）：173−6）。この特異性は、
化学反応前に、基質が特異的塩基対合相互作用を介してリボザイムの内部のガイ
ド配列（「IGS」）に結合するという要件に寄与する。

【０１８８】天然に存在する酵素RNAの6つの基本的変種が現在知られている。各々は生理学
的条件下にトランスでRNAホスホジエステル結合の加水分解を触媒することがで
きる（こうして他のRNA分子を切断することができる）。一般に、酵素核酸は最
初にターゲットRNAに結合することによって作用する。このような結合は酵素核
酸のターゲット結合部分を通して起こり、ここで結合部分はターゲットRNAを切
断する作用する分子の酵素部分に密接に近接して保持される。

【０１８９】こうして、酵素核酸はまず相補的塩基対合を通してターゲットRNAを認識し、
それに結合し、いったん正しい部位に結合すると、ターゲットRNAを酵素的に切
断する作用をする。このようなターゲットRNAの戦略的切断は、コード化タンパ
ク質の合成を指令するその能力を破壊する。酵素核酸がそのRNAターゲットに結
合し、それを切断した後、それはそのRNAから解放され、他のターゲットを探索
し、反復的に新しいターゲットに結合し、それを切断することができる。

【０１９０】リボザイムの酵素的性質は多数の技術、例えば、アンチセンス技術（ここで核
酸分子は核酸ターゲットに単にに結合し、その翻訳をブロックする）より有利で
ある。なぜなら、療法的治療を行うために必要なリボザイムの濃度はアンチセン
スオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は酵素的に作用す
るリボザイムの能力を反映する。こうして、単一リボザイム分子はターゲットRN
Aの多数の分子を切断することができる。

【０１９１】さらに、リボザイムは高度に特異的なインヒビターであり、阻害の特異性はタ
ーゲットRNAに結合する塩基対合メカニズムに依存するばかりでなく、かつまた
ターゲットRNAの切断のメカニズムに依存する。切断部位付近における、単一ミ
スマッチ、または塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除することがで
きる。アンチセンス分子における同様なミスマッチはそれらの作用を妨害しない（Woolf他、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1992 Aug 15；89（16）：7305−9）。こうして、リボザイムの作用の
特異性は、同一RNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれより
大きい。

【０１９２】酵素核酸分子は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、グラフIイン
トロンまたはRNアーゼP RNA（RNAガイド配列とアソシエートした）またはニュ
ーロスポラ（Neurospora）VS RNAのモチーフで形成することができる。ハンマ
ーヘッドのモチーフの例は、Rossi他、Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11；
20（17）：4559−65により記載された。ヘアピンのモチーフの例は下記の文献に
記載された：Hample他の欧州特許出願公開No.EP 0360257、HampleおよびTritz
、Biochemistry 1989 Jun 13；28（12）：4929−33；Hample他、Nucleic Ac
ids Res. 1990 Jan 25；18（2）：299−304および米国特許第5,631,359号。

【０１９３】肝炎δウイルスのモチーフの例は、PerrottaおよびBeen、Biochemistry 1992
Dec 1；31（47）：11843−52に記載された；RNアーゼPのモチーフの例はGuer
rier−Takada他、Cell 1983 Dec；35（3 Pt 2）：849−57に記載された；ニ
ューロスポラ（Neurospora）VS RNAのモチーフは下記の文献に記載された：Sav
illeおよびCollins、Cell 1990 May 18；61（4）：685−96；SavilleおよびC
ollins、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991 Oct 1；88（19）：8826−30
；CollinsおよびOlive、Biochemistry 1993 Mar 23；32（11）：2795−9；そ
してグループIイントロンの例は米国特許第4,987,071号に記載された。

【０１９４】本発明の酵素核酸分子において重要であるすべては、それがターゲット遺伝子
のRNA領域の1またはそれ以上に対して相補的である特異的基質結合部位を有する
こと、およびそれが分子にRNA切断活性を付与する基質結合部位内またはそれを
取り囲むヌクレオチド配列を有することである。こうして、リボザイム構築物は
本明細書に記載する特定のモチーフに限定する必要はない。

【０１９５】リボザイムは、国際特許出願公開No．WO 93／23569および国際特許出願公開N
o．WO 94／02595（各々は特別に引用することによって本明細書の一部とされる
）に記載されているように設計し、そして合成して、記載するように、in vitr
oおよびin vivoにおいて試験することができる。また、このようなリボザイム
はデリバリーのために最適化することができる。特定の例が提供されるが、当業
者は認識するように、他の種における同等のRNAターゲットを必要に応じて利用
することができる。

【０１９６】リボザイム結合性アームの長さを変更するか、あるいは血清リボヌクレアーゼ
によるリボザイムの分解を防止する修飾（下記の文献を参照のこと：国際特許出
願公開No．WO 92／07065；国際特許出願公開No．WO 93／15187；国際特許出願
公開No．WO 91／03162；欧州特許出願公開No. 92110298；米国特許第5,334,71
1号；および国際特許出願公開No．WO 94／13688、これらには酵素RNA分子の糖
部分に行うことができる種々の化学的修飾が記載されている）、および細胞にお
けるリボザイムの効能を増強する修飾を有し、かつ幹II塩基が除去されてRNA合
成時間が短縮されかつかつ化学的要件が減少されたリボザイムを化学的に合成す
ることによって、リボザイム活性を最適化することができる。

【０１９７】 Sullivan他（国際特許出願公開No．WO 94／02595）は、酵素RNA分子の一般的
デリバリー法を記載している。リボザイムはこの分野において知られている種々
の方法により細胞に投与することができ、このような方法は下記のものを包含す
るが、これらに限定されない：リポソーム中の包膜、イオントホレシス、または
他のベヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプ
セル、および生物接着性微小球の中への組込み。いくつかの適用のために、リボ
ザイムは前述のベヒクルを使用するか、または使用しないで細胞または組織にex
vivoで直接送出すことができる。

【０１９８】選択的に、RNA／ベヒクルの組合わせは直接的吸入、直接的注射またはカテー
テル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送出すことができる。他
の送出し経路は下記のものを包含するが、これらに限定されない：血管内、筋肉
内、皮下または関節注射、エーロゾル吸入、経口（錠剤または丸剤の形態）、局
所的、全身的、眼、腹腔内および／またはくも膜下デリバリー。リボザイムのデ
リバリーおよび投与のいっそう詳述な説明は、国際特許出願公開No．WO 94／02
595および国際特許出願公開No．WO 93／23569（各々は特別に引用することによ
って本明細書の一部とされる）に記載されている。

【０１９９】細胞内に高い濃度の1またはそれ以上のリボザイムを蓄積する他の手段は、リ
ボザイムをコードする配列をDNA発現ベクターの中に組込むことである。リボザ
イム配列の転写は、真核RNAポリメラーゼI（pol I）、RNAポリメラーゼII（pol
II）、またはRNAポリメラーゼIII（pol III）のためのプロモーターから推進
される。pol IIまたはpol IIIプロモーターからの転写物はすべての細胞にお
いて高いレベルで発現されるであろう；所定の細胞型における所定のpol IIプ
ロモーターのレベルは、付近に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレ
ンサー、およびその他）の特質に依存するであろう。

【０２００】また、原核RNAポリメラーゼプロモーターを使用することができるが、ただし
原核RNAポリメラーゼ酵素は適当な細胞において発現される。このようなプロモ
ーターから発現されたリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示さ
れた。このような転写単位は哺乳動物細胞の中への導入のための種々のベクター
の中に組込むことができ、このようなベクターは下記のものを包含するが、これ
らに限定されない：プラスミドDNAベクター、ウイルスDNAベクター（例えば、ア
デノウイルスまたはアデノ関連ウイルスのベクター）、またはウイルスRNAベク
ター（例えば、レトロウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスの
ベクター）。

【０２０１】本発明の他の態様において、ペプチド核酸（PNA）組成物が提供される。PNAは
ヌクレオ塩基がプソイドペプチドバックボーンに結合されているDNA模擬物であ
る（GoodおよびNielsen、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7（4
）431−37）。PNAは伝統的にRNAまたはDNA配列が使用されてきている多数の方法
において利用することができる。しばしばPNA配列は対応するRNAまたはDNAより
も技術においてよりよく実行し、RNAまたはDNAに対して固有でない実用性を有す
る。

【０２０２】調製方法、特性、および使用法を包含するPNAの概観は、Corey、Trends in
Biotechnol 1997 Jun；15（6）：224−9に記載されている。それ自体、ある態
様において、ACE mRNA配列の1またはそれ以上の部分に対して相補的であるPNA
配列を調製し、このようなPNA組成物を使用して、ACE特異的mRNAの翻訳を調節し
、変更し、減少し、または軽減し、これによりこのようなPNA組成物が投与され
た宿主細胞におけるACE活性レベルを変更することができる。

【０２０３】 PNAはDNAの正常のホスホジエステルバックボーンを置換する2−アミノエチル
−グリシン連鎖を有する（Nielsen他、Science 1991 Dec 6；254（5037）：1
497−500；Hanvey他、Science 1992 Nov 27；258（5087）：1481−5；Hyrup
およびNielsen、Bioorg Med Chem. 1996 Jan；4（1）：5−23）。この化学
は3つの重要な結果を有する：第1に、DNAまたはホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドと対照的に、PNAは中性分子である；第2に、PNAはアキラルであり、立
体選択的合成を開発する必要性を回避する；そして、第3に、PNA合成は固相ペプ
チド合成のために標準BocまたはFmocプロトコルを使用するが、修飾されたMerri
field法を包含する他の方法が使用されてきている。

【０２０４】 PNAモノマーまたはレディーメイドオリゴマーは、パーセプティブ・バイオシ
ステム（PerSeptive Biosystems、マサチュセッツ州ファーミンガム）から商業
的に入手可能である。BocまたはFmocプロトコルによるPNA合成は、マニュアルま
たは自動化プロトコルを使用して簡単である（Norton他、Bioorg Med Chem.
1995 Apr；3（4）：437−45）。マニュアルプロトコルは、化学的に修飾された
PNAの産生または密接に関係するPNAファミリーの同時合成を使用する。

【０２０５】ペプチド合成におけるように、特定のPNA合成の成功は選択した配列の性質に
依存するであろう。例えば、理論的にはPNAはヌクレオチド塩基の任意の組合わ
せを組込むことができるが、隣接プリンの存在は産物における1またはそれ以上
の欠失に導くことができる。この困難を期待して、隣接プリンを有するPNAの産
生において、非効率的に付加されると推測される残基のカップリングを反復すべ
きであることが示唆される。次いで、RNAを逆相高圧液体クロマトグラフィーに
より精製して、産物の収率および純度をペプチド合成間に観測されたものに類似
させる。

【０２０６】所定の適用のためのPNAの修飾は、固相合成間のアミノ酸のカップリングまた
はカルボン酸基を含有する化合物の暴露されたN末端アミンへの結合により、達
成することができる。選択的に、PNAは合成後に導入されたリシンまたはシステ
インへのカップリングにより修飾することができる。PNAを修飾できる容易さは
、よりすぐれた溶解度または特定の機能の要件のための最適化を促進する。いっ
たん合成されると、PNAの同一性およびそれらの誘導体は質量分析により確認す
ることができる。

【０２０７】いくつかの研究が実行され、これらの研究においてPNAの修飾が利用されてき
ている（例えば、Norton他、Bioorg Med Chem. 1995 Apr；3（4）：437−45
；Petersen他、J. Pept. Sci. 1995 May−Jun；1（3）：175−83；Orum他、
Biotechniques 1995 Sep；19（3）：472−80；Footer他、Biochemistry 1996
Aug 20；35（33）；10673−9；Griffith他、Nucleic Acids Res. 1995 A
ug 11；23（15）：3003−8；Pardridge他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1995 Jun 6；92（12）：5592−6；Boffa他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1995 Mar 14；92（6）1901−5；Gambacorti−Passerini他、Blood 1996 A
ug 15；88（4）：1411−7；Armitage他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19
97 Nov 11；94（23）：12320−5；Seeger他、Biotechniques 1997 Sep；23
（3）：512−7）。米国特許第5,700,922号において、キメラ分子および診断、生
物におけるタンパク質の修飾、および治療剤に対して感受性な症状の治療におけ
るそれらの使用が論じられている。

【０２０８】 PNAのアンチセンス結合性を特性決定する方法は、Rose、Anal. Chem. 1993
Dec 15；65（24）：3545−9、およびJensen他、Biochemistry 1997 Apr 2
2；36（16）：5072−7において論じられている。Roseは、毛管ゲル電気泳動を使
用して、RNAのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定し、相対
的結合の反応速度および化学量を測定している。同様な型の測定は、Jensen他に
よりBIAcore^TMを使用して実施された。記載されかつ当業者にとって明らかなPNAの他の用途は下記の用途を包含する
：DNA鎖の侵入、アンチセンス阻害、突然変異の分析、転写のエンハンサー、核
酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合のブロッキング、ゲノム切断、
バイオセンサー、in situハイブリダイゼーション、およびその他。

【０２０９】ポリヌクレオチドの同定、特性決定および発現本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術により同定
し、調製し、および／または操作することができる（下記の文献を参照のこと：
Sambrook他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Har
bor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1989、および他の同様な参考文
献）。例えば、ポリヌクレオチドは、いっそう詳述に後述するように、cDNAのミ
クロアレイを腫瘍関連発現についてスクリーニングすることによって、同定する
ことができる（すなわち、本明細書において提供される代表的アッセイを使用し
て測定して、正常組織におけるよりも腫瘍において少なくとも2倍大きい発現）
。

【０２１０】このようなスクリーニングは、例えば、アフィメトリックス・インコーポレー
テッド（Affymetrix，Inc.、カリフォルニア州サンタクララ）のミクロアレイ技
術を製造業者の使用説明書に従い使用して（かつ本質的に下記の文献に記載され
ているように、Schena他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：10614−10619
、1996およびHeller他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：2150−2155、19
97）実行することができる。選択的に、ポリヌクレオチドは本明細書に記載する
タンパク質を発現する細胞、例えば、腫瘍細胞から調製したcDNAから増幅するこ
とができる。

【０２１１】試料の中に存在する問題のターゲット配列を増幅するために、多数の鋳型依存
的プロセスが入手可能である。最もよく知られている増幅方法の1つは、米国特
許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,800,159号（それ
らの各々はその全体において引用することによって本明細書の一部とされる）に
詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR^TM）である。簡単に述べると
、PCR^TMにおいて、ターゲット配列の反対の相補的鎖上の領域に対して相補的で
ある2つのプライマー配列を調製する。

【０２１２】過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸を、DNAポリメラーゼ（例えば、Taqポリ
メラーゼ）と一緒に、反応混合物に添加する。ターゲット配列が試料の中に存在
する場合、プライマーはターゲットに結合し、ポリメラーゼはヌクレオチド上へ
の付加によりターゲット配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の上
昇および低下により、伸長されたプライマーはターゲットから解離して反応生成
物を形成し、過剰のプライマーはターゲットおよび反応生成物に結合し、このプ
ロセスを反復する。好ましくは、逆転写およびPCR^TM増幅手順を実行して、増幅
されたmRNAを定量する。ポリメラーゼ連鎖反応法はこの分野においてよく知られ
ている。

【０２１３】多数の他の鋳型依存的プロセスの多くはPCR^TM増幅技術の変法であり、この分
野において既知でありかつ容易に入手可能である。例示的に、いくつかのこのよ
うな方法は下記のものを包含する：リガーゼ連鎖反応（LCRと呼ばれる）、例え
ば、欧州特許出願公開No. 320,308および米国特許第4,883,750号に記載されて
いる；Qベータレプリカーゼ、PCT国際特許出願公開No．PCT／US87／00880に記載
されている；鎖置換増幅（SDA）および修復連鎖反応（RCR）。なお他の増幅法は
英国特許出願第2,202,328号およびPCT国際特許出願公開No．PCT／US89／01025に
記載されている。

【０２１４】他の核酸増幅手順は、転写に基づく増幅系（TAS）（PCT国際特許出願公開No．
WO 88／10315）、例えば、核酸配列に基づく増幅（NASBA）および38Rを包含す
る。欧州特許出願公開No. 329,822には、一本鎖RNA（「ssRNA」）、ssDNA、お
よび二本鎖DNA（dsDNA）のサイクル的合成を包含する、核酸増幅法が記載されて
いる。PCT国際特許出願公開No．WO 89／06700には、ターゲット一本鎖DNA（「s
sDNA」）に対するプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーションに基
づく核酸配列の増幅スキーム、および引き続く配列の多数のRNAコピーの転写が
記載されている。他の増幅法、例えば、「RACE」（Frohman、1990）および「ワ
ンサイデッドPCR」（Ohara、1989）は当業者によく知られている。

【０２１５】本発明のポリヌクレオチドの増幅された部分を使用して、よく知られている技
術に従い適当なライブラリー（例えば、腫瘍cDNAライブラリー）から全長遺伝子
を単離することができる。このような技術において、増幅に適当な1またはそれ
以上のポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー
（cDNAまたはゲノム）をスクリーニングする。好ましくは、より大きい分子を含
むように、ライブラリーをサイズで選択する。また、ランダムプライムドライブ
ラリーは遺伝子の5'および上流領域を同定するために好ましいことがある。ゲノ
ムライブラリーはイントロンを獲得し、5'配列を伸長するために好ましい。

【０２１６】ハイブリダイゼーション技術のために、よく知られている技術を使用して部分
的配列を標識化することができる（例えば、ニックトランスレーションまたは³² Pを使用する末端標識化により）。次いで、変性された細菌コロニーを含有する
フィルター（またはファージプラークを含有する菌叢）を標識化プローブとハイ
ブリダイゼーションさせることによって、細菌またはバクテリオファージを一般
にスクリーニングする（下記の文献を参照のこと：Sambrook他、Molecular Clo
ning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spr
ing Harbor、NY、1989）。ハイブリダイゼーションするクローニングまたはプ
ラークを選択し、拡張し、DNAをそれ以上の分析のために単離する。

【０２１７】例えば、部分的配列からのプライマーおよびベクターからのプライマーを使用
するPCRにより、cDNAクローンを分析して追加の配列を定量することができる。
制限地図および部分的配列を発生させて、1またはそれ以上のオーバーラップす
るクローンを同定することができる。次いで、標準技術を使用して完全な配列を
決定することができ、このような技術は1系列の欠失クローンの発生を包含する
。次いで、生ずるオーバーラップする配列を単一の隣接配列に組立てることがで
きる。よく知られている技術に従い、適当なフラグメントを結合することによっ
て、全長のcDNA分子を発生させることができる。

【０２１８】選択的に、部分的cDNA配列から全長のコーディング配列を得るために、増幅技
術、例えば、前述の技術は有効であることがある。1つのこのような増幅技術は
逆PCRであり（Triglia他、Nucleic Acids Res. 16：8186、1998参照）、これ
は遺伝子の既知領域においてフラグメントを発生させるために制限酵素を使用す
る。次いで分子内結合によりフラグメントを環化し、既知領域に由来する分岐プ
ライマーを使用するPCRのための鋳型として使用する。選択的アプローチにおい
て、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対して特異的なプライマ
ーを使用する増幅により、部分的配列に隣接する配列を取出すことができる。典
型的には、同一リンカープライマーおよび既知領域に対して特異的な第2プライ
マーを使用して増幅の第2ラウンドに、増幅された配列を付す。

【０２１９】この手順に対する変法は、既知配列から反対方向のエクステンションを開始す
る2つのプライマーを使用し、WO 96／38591に記載されている。他のこのような
技術は、「cDNA末端の急速増幅」またはRACEとして知られている。この技術は既
知配列の5'および3'に存在する配列を同定するために内部のプライマーおよび外
部のプライマーの使用を包含し、これらのプライマーはポリA領域またはベクタ
ー配列に対してハイブリダイゼーションする。追加の技術は捕捉PCR（Lagerstro
m他、PCR Methods Applic. 1：1119−19、1991）およびウォーキングPCR（Pa
rker他、Nucl. Acids Res. 19：3055−60、1991）を包含する。また、増幅を
用いる他の方法を使用して全長のcDNA配列を得ることができる。

【０２２０】ある場合において、発現された配列タグ（EST）データベース、例えば、遺伝
子バンク（GenBank）から入手可能である配列の中に提供された配列の分析によ
り、全長のcDNA配列を得ることが可能である。一般に、オーバーラップするEST
についての検索はよく知られているプログラム（例えば、NCBI BLAST検索）に
従い実行することができ、そしてこのようなESTを使用して隣接する全長の配列
を発生させることができる。また、全長のDNA配列はゲノムフラグメントの分析
により得ることができる。

【０２２１】本発明の他の態様において、本発明のポリヌクレオチド、またはその融合タン
パク質または機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列またはそれらのフ
ラグメントを組換えDNA分子において使用して、適当な宿主細胞中のポリペプチ
ドの発現を指令することができる。遺伝暗号の固有のデジェネラシーのために、
実質的に同一または機能的同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を産生
し、これらの配列を使用して所定のポリペプチドのクローニングし、発現させる
ことができる。

【０２２２】当業者は理解するように、ある場合において、天然に存在しないコドンを有す
るポリペプチドエンコーディングヌクレオチド配列を産生することが好都合であ
ることがある。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タ
ンパク質の発現速度を増加させるか、あるいは所望の性質、例えば、天然に存在
する配列から発生した転写物のそれより長い半減期を有する組換えRNA転写物を
産生することができる。

【０２２３】その上、本発明のポリヌクレオチド配列は一般にこの分野において知られてい
る方法を使用して操作して、種々の反応のためのポリペプチドエンコーディング
配列を変更することができ、このような変更は遺伝子産物のクローニング、プロ
セシング、および／または発現を修飾する変更を包含するが、これらに限定され
ない。例えば、ランダムフラグメント化によるDNAシャフリングおよび遺伝子フ
ラグメントのPCR組立ておよび合成オリゴヌクレオチドを使用して、ヌクレオチ
ド配列を操作することができる。さらに、部位特異的突然変異誘発を使用して新
しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン優先を変化させ
、スプライス変異型を産生し、または突然変異を導入し、およびその他をするこ
とができる。

【０２２４】本発明の他の態様において、天然の、修飾された、または組換えの核酸配列を
異種配列に結合して、融合タンパク質をコードするようにすることができる。例
えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリ
ーニングするために、商業的に入手可能な抗体が認識することができるキメラタ
ンパク質をコードすることは有効であることがある。また、ポリペプチドをコー
ドする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように、
融合タンパク質を操作し、こうして異種部分から離れた位置において、ポリペプ
チドを切断し、精製することができる。

【０２２５】この分野においてよく知られている化学的方法を使用して、所望のポリペプチ
ドをコードする配列を全体的にまたは部分的に合成することができる（下記の文
献を参照のこと：Caruthers、M.H.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.
215−223；Horn他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225−232）。
選択的に、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはそのを合成する化学的方法を使
用して、タンパク質それ自体を製造することができる。例えば、種々の固相技術
（Roberge、J.T.他（1995）Science 269：202−204）を使用してペプチド合成
を実行することができ、そして例えば、ABI 431Aペプチド合成装置（Perkin E
lmer、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、自動化合成を達成することが
できる。

【０２２６】新しく合成されたペプチドは、調製用高性能液体クロマトグラフィー（例えば
、Creighton、T.（1983）Proteins，Structures and Molecular Principles
、WH Freeman and Co.、New York、N. Y.）またはこの分野において入手可
能な他の匹敵する技術により、実質的精製することができる。合成ペプチドの組
成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解法）により確認する
ことができる。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはその任意の部分を
直接的合成間に変更し、および／または化学的方法に従い他のタンパク質からの
配列、またはその任意の部分と組合わせて、変異型ポリペプチドを産生すること
ができる。

【０２２７】所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド、または機能的同等物
をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、例えば、挿入されたコー
ディング配列の転写および翻訳のために必要な因子を含有するベクターの中に挿
入することができる。この分野においてよく知られている方法を使用して、問題
のポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳の制御因子を含有
する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitro組換えD
NA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えを包含する。このような技術は
、例えば、下記の文献に記載されている：Sambrook、J.他（1989）Molecular C
loning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N
. Y.、およびAusubel、F.M.他（1989）Current Protocols in Molecular B
iology、John Wiley & Sons、New York、N. Y.。

【０２２８】ポリヌクレオチド配列を含有させかつ発現させるために、種々の発現ベクター
／宿主系を利用することができる。これらの下記のものを包含するが、これらに
限定されない：微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、また
はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転
換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染され
た昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス
、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、Ti
またはpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞；または動物細胞系。

【０２２９】発現ベクターの中に存在する「制御因子」または「調節配列」は、ベクターの
非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域−これらは宿
主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う−である。このような因
子は、それらの強度および特異的を変化させることができる。利用するベクター
系および宿主に依存して、任意の数の転写および翻訳の因子（構成的および誘導
可能なプロモーターを包含する）を使用することができる。例えば、細菌系にお
いてクローニングするとき、誘導可能なプロモーター、例えば、PBLUESCRIPTフ
ァージミド（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）のハイブリッドlacZプロ
モーターまたはPSPORT1プラスミド（Gibco BRL、マリイランド州ガイサースバ
ーグ）およびその他を使用することができる。

【０２３０】哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスからのプロ
モーターは一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多数のコピーを含
有する細胞系統を発生させることが必要である場合、SV40またはEBVに基づくベ
クターを適当な選択可能なマーカーとともに好都合に使用することができる。

【０２３１】細菌系において、発現されたポリペプチドに意図する使用に依存して、任意の
数の発現ベクターを選択することができる。例えば、大量を必要とするとき、例
えば、抗体を誘導するために、精製が容易である融合タンパク質の高いレベルの
発現を指令するベクターを使用することができる。このようなベクターは下記の
ものを包含するが、これらに限定されない：多機能大腸菌（E. coli）クローニ
ングおよび発現ベクター、例えば、BLUESCRIPT（Stratagene）、ここで問題のポ
リペプチドをコードする配列をベクターの中にβ−ガラクトシダーゼのアミノ末
端のMetおよび引き続く7残基の配列とインフレームで結合してハイブリッドタン
パク質を産生することができる；pINベクター（Van Heeke、G.およびS.M. Sch
uster（1989）J. Biol. Chem. 264：5503−5509）；およびその他。

【０２３２】また、pGEXベクター（Promega、ウイスコンシン州マディソン）を使用して、
外来ポリペプチドをグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）との融合タン
パク質として発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可
溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着により溶解細胞から精製
し、次いで遊離グルタチオンの存在下に溶離することができる。このような系に
おいて作られたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または因子XAプロテアー
ゼ切断部位を含むように設計して、問題のクローニングされたポリペプチドをGS
T部分から任意に解放させることができる。

【０２３３】酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におい
て、構成的または誘導可能なプロモーター、例えば、アルファ因子、アルコール
オキシダーゼ、およびPGHを含有する多数のベクターを使用することができる。
概観については、下記の文献を参照のこと：Ausubel他（前掲）およびGrant他（
1987）Methods Enzymol. 153：516−544。

【０２３４】植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は多
数のプロモーターにより推進可能である。例えば、ウイルスプロモーター、例え
ば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターを単独で、またはTMVからのオメガリーダ
ー配列と組合わせてを使用することができる（Takamatsu、N.（1987）EMBO J.
6：307−311）。選択的に、植物プロモーター、例えば、RUBISCOの小さいサブ
ユニットまたは熱ショックプロモーターを使用することができる（Coruzzi、G.
他（1984）EMBO J. 3：1671−1680；Borglie、R.他（1984）Science 224：83
8−843；およびWinter、J.他（1991）Results Probl. Cell Differ. 17：85
−105）。これらの構築物は、直接的DNA形質転換または病原体仲介トランスフェ
クションにより、植物細胞の中に導入することができる。

【０２３５】このような技術はｍｎｔ一般的に入手可能な概観の中に記載されている（例え
ば、下記の文献を参照のこと：Hobbs、S.またはMurry、L.E.、McGraw Hill Ye
arbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill、New York、N.
Y.；pp. 191−196）。また、昆虫系を使用して問題のポリペプチドを発現させることができる。例え
ば、1つのこのような系において、オートグラファ・カリフォミカ（Autographa
califomica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして使用して、スポ
ドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア
・ラーバエ（Trichophlusia larvae）における外来遺伝子を発現させる。

【０２３６】ポリペプチドをコードする配列をウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリ
ン遺伝子の中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの条件下に配置する
ことができる。ポリペプチドエンコーディング配列の首尾よい挿入はポリヘドリ
ン遺伝子を不活性化し、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスを産生する
。次いで、例えば、問題のポリペプチドを発現するすることができるスポドプテ
ラ・フルギペルダ（S. frugiperda）細胞またはトリコプルシア・ラーバエ（Tr
ichophlusia larvae）を感染するために、組換えウイルスを使用することがで
きる（Engelhard，E.K.他（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. 91：3224−3227
）。

【０２３７】哺乳動物宿主細胞において、一般に多数のウイルスに基づく系が入手可能であ
る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合において、後期プロモー
ターおよび三部分リーダー配列から成るアデノウイルス転写／翻訳複合体の中に
、問題のポリペプチドをコードする配列を結合することができる。ウイルスゲノ
ムの非必須E1またはE3領域中の挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリ
ペプチドを発現することができる生存可能なウイルスを得ることができる（Loga
n、J.およびShenk、T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81：3655−3659）
。さらに、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサ
ーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。

【０２３８】また、特異的開始シグナルを使用して、問題のポリペプチドをコードする配列
のいっそう効率よい翻訳を達成することができる。このようなシグナルはATG開
始コドンおよび隣接する配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始
コドン、および上流配列を適当な発現ベクターの中に挿入する場合、追加の転写
または翻訳シグナルは不必要であることがある。

【０２３９】しかしながら、コーディング配列のみ、またはその一部分を挿入する場合、AT
G開始コドンを含む外因的翻訳制御シグナルを準備すべきである。さらに、開始
コドンはインサート全体の翻訳を保証するために正しいリーディングフレームで
あるべきである。外因的翻訳因子および開始コドンは、天然および合成の種々の
由来であることができる。使用する特定の細胞系に適当であるエンハンサー、例
えば、文献に記載されているものを含めることによって、発現効率を増強するこ
とができる（Scharf、D.他（1994）Results Probl. Cell Differ. 20：125
−162）。

【０２４０】さらに、挿入された配列の発現をモジュレートするか、あるいは所望の方式で
発現されたタンパク質をプロセシングする能力について、宿主株を選択すること
ができる。このようなポリペプチドの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グ
リコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を包含するが、これらに限定さ
れない。また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後のプロセシング
を使用して、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進すること
ができる。このような翻訳活性のために特異的な細胞機構および特徴的なメカニ
ズムを有する、異なる宿主細胞、例えば、CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293、およ
びW138を選択して、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証する
ことができる。

【０２４１】組換えタンパク質の長期間の、高い収率の産生のために、安定な発現が一般に
好ましい。例えば、発現ベクターを使用して問題のポリヌクレオチドを安定に発
現する細胞系統を形質転換することができ、ここで発現ベクターはウイルスの複
製起点および／または内因性発現因子、および同一または別のベクター上の選択
可能なマーカー遺伝子を含有することができる。ベクターの導入後、細胞を濃縮
培地中で1〜2日間増殖させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択
可能なマーカーの目的は選択に対する耐性を与えることであり、その存在は導入
された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質
転換された細胞の耐性クローンを細胞型に対して適当な組織培養技術により増殖
させることができる。

【０２４２】任意の数の選択系を使用して、形質転換された細胞系統を回収することができ
る。これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：単純ヘルペスウ
イルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler他（1997）Cell 11：223−32）およ
びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy、I.他（1990）Cell
22：817−23）（これらはそれぞれtk.sup.−またはaprt.sup.−細胞において
使用することができる）。

【０２４３】また、抗代謝物質、抗生物質または除草剤耐性を選択基準として使用すること
ができる；例えば、dhfr、これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Wigl
er、M.他（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. 77：3567−70）；npt、これはア
ミノグリコシド、ネオマイシンおよびG−418に対する耐性を与える（Colbere−G
arapin、F.他（1981）J. Mol. Biol. 150：1−140）；およびalsまたはpat、
これはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼに対する耐性を与える（Murry、前掲）。

【０２４４】追加の選択可能な遺伝子が記載されてきている、例えば、trpB、これはトリプ
トファンの代わりにインドールを細胞が利用できるようにする、またはhisD、こ
れはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞が利用できるようにする（Hartma
n、S.C.およびR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85：804−5
1）。可視マーカーの使用は、アントシアニン、ベータ−グルクロニダーゼおよ
びその基質GUS、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマ
ーカーとともに普及されるようになり、形質転換体を同定するばかりでなく、か
つまた特異的ベクター系に帰する一時的または安定なタンパク質の発現を定量す
るために広く使用されている（Rhodes、C.A.他（1995）Methods Mol. Biol.
55：121−131）。

【０２４５】マーカー遺伝子の存在／非存在は問題の遺伝子がまた存在することを示唆する
が、その存在および発現を確認することが必要である。例えば、ポリペプチドを
コードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含有する組換
え細胞はマーカー遺伝子の機能の非存在により同定することができる。選択的に
、ポリペプチドをコードする配列と縦列でマーカー遺伝子を単一プロモーターの
制御下に配置することができる。通常、誘導または選択に応答したマーカー遺伝
子の発現は縦列遺伝子の発現をその上示す。

【０２４６】選択的に、所望のポリヌクレオチド配列を含有しかつそれを発現する宿主細胞
は、この分野において知られている種々の手順により同定することができる。こ
れらの手順は下記のものを包含するが、これらに限定されない：DNA−DNAまたは
DNA−RNAのハイブリダイゼーションおよびタンパク質のバイオアッセイまたはイ
ムノアッセイ技術、これらは、例えば、核酸またはタンパク質を検出しおよび／
または定量する、膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する。

【０２４７】生産物に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する
、ポリヌクレオチドコード化生産物の発現を検出しかつ測定する、種々のプロト
コルはこの分野において知られている。例は酵素結合イムノアッセイ（ELISA）
、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および蛍光活性化免疫吸着アッセイ（FACS）
を包含する。所定のポリペプチド上の2つの非妨害性エピトープに対して反応性
のモノクローナル抗体を利用する、2部位のモノクローナルに基づくイムノアッ
セイはいくつかの用途について好ましいことがあるが、競合結合アッセイを使用
することもできる。これらおよび他のアッセイは、なかでも、下記の文献に記載
されている：Hampton、R.他（1990）Serological Methods，a Laboratory Ma
nual、APS Press、ミネソタ州セントポール、およびMaddox、D.E.他（1983）J.
Exp. Med. 158：1211−1216。

【０２４８】広範な種類の標識および結合技術はこの分野において知られており、そして種
々の核酸およびアミノ酸のアッセイにおいて使用することができる。ポリヌクレ
オチドに関係する配列を検出する標識化ハイブリダイゼーションプローブまたは
PCRプローブは、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化または
標識化ヌクレオチドを使用するPCR増幅を包含する。選択的に、配列、またはそ
の任意の部分をmRNAプローブの産生のためのベクターの中にクローニングするこ
とができる。

【０２４９】このようなベクターはこの分野において知られており、商業的に入手可能であ
り、そして適当なRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6および標識化ヌ
クレオチドの添加によりin vitroでRNAプローブを合成するために使用すること
ができる。これらの手順は種々の商業的に入手可能なキットを使用して実施する
ことができる。使用できる適当なリポーター分子または標識は、ラジオヌクレオ
チド、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成因子、ならびに基質、コファクタ
ー、インヒビター、磁気粒子、およびその他を包含する。

【０２５０】細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適当な条件下に、問題のポリ
ヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を培養することができる。組換え細胞
が産生するタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに依存して分泌
されるか、あるいは細胞内に含有されることができる。当業者は理解するように
、原核または真核細胞膜を通すコード化ペプチドの分泌を指令するシグナル配列
を含有するように、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを設計す
ることができる。他の組換え構築物を使用して、可溶性タンパク質の精製を促進
するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチドに、問題のポリペプチドを
コードする配列を結合することができる。

【０２５１】このような精製促進ドメインは下記のものを包含するが、これらに限定されな
い：金属キレート化ペプチド、例えば、固定化金属上の精製を可能とするヒスチ
ジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上の精製を可能とする
プロテインAドメイン、およびFLAGSエクステンション／アフィニティー精製系に
おいて使用するドメイン（Immunex Corp.、ワシントン州シアトル）。精製促進
するために、精製ドメインとコード化ポリペプチドとの間に切断可能なリンカー
配列、例えば、因子XAまたはエンテロキナーゼ（Invitrogen、カリフォルニア州
サンディエゴ）に含めることができる。

【０２５２】 1つのこのような発現ベクターは、問題のポリペプチドと、チオレドキシンま
たはエンテロキナーゼ切断部位に先行する6ヒスチジン残基をコードする核酸と
を含有する融合タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基はPorath、J.他（1992
）Prot. Exp. Purif. 3：263−281に記載されているようにIMIAC（固定化金
属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上の精製を促進するが、エンテロ
キナーゼ切断部位は融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製する手段を提
供する。融合タンパク質を含有するベクターは、Kroll、D.J.他（1993）、DNA
Cell Biol. 12：441−453に記載されている。

【０２５３】組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは
固相技術を使用して直接的ペプチド合成により製造することができる（Merrifie
ld J.（1963）J. Am. Chem. Soc. 85：2149−2154）。タンパク質合成はマ
ニュアル技術または自動化により実行することができる。自動化合成は、例えば
、アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）431Aペプチド合成装
置（Perkin Elmer）を使用して達成することができる。選択的に、種々のフラ
グメントを別々に化学的に合成し、化学的方法を使用して組合わせて全長の分子
を産生することができる。

【０２５４】抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子他の面によれば、本発明は、さらに、本明細書に開示する腫瘍ポリペプチド、
またはその一部分、変異型または誘導体に対して免疫学的結合性を示す、結合因
子、例えば、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。抗体およびそ
の抗原結合性フラグメントは、それが本発明のポリペプチドと検出可能なレベル
で反応し（例えば、ELISAアッセイにおいて）、同様な条件下に無関係のポリペ
プチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに「特異的に結合す
る」、「免疫学的に結合する」、および／またはそれと「免疫学的に反応性」で
あると言われる。

【０２５５】免疫学的に結合性は、本明細書において使用するとき、一般に免疫グロブリン
分子と、免疫グロブリンがそれに対して特異的である抗原との間で起こる型の非
共有結合の相互作用を意味する。免疫学的結合性相互作用は相互作用の解離定数
（K_d）で表すことができ、ここでより小さいK_dはより大きいアフィニティーを表
す。選択したポリペプチドの免疫学的結合性は、この分野においてよく知られて
いる方法により定量することができる。

【０２５６】 1つのこのような方法は抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測
定することを含み、ここでそれらの速度は複合体の相手の濃度、相互作用のアフ
ィニティー、および両方の方向における速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラ
メーターに依存する。こうして、「オンの速度定数」（K_on）および「オフの速
度定数」（K_off）の両方は、濃度および会合および解離の実際の速度を計算する
ことによって決定することができる。K_off／K_onの比は、アフィニティーに関係
しないすべてのパラメーターの削除を可能とし、こうして解離定数K_dに等しい。
一般に、下記の文献を参照のこと：Davies他（1990）Ann. Rev. Biochem. 59
：439−473。

【０２５７】抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原の結合に参加する免疫グ
ロブリン分子の部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖（「H」）および軽鎖（
「L」）のN末端の可変（「V」）領域のアミノ酸残基により形成される。重鎖お
よび軽鎖のV領域内の3つの高度に分岐したストレッチは「超可変性領域」と呼ば
れ、これらの領域は「フレームワーク領域」または「FR」として知られている、
いっそう保存されたフランキングストレッチ間に介在する。

【０２５８】こうして、用語「FR」は免疫グロブリン中の超可変性領域間にかつそれに隣接
して自然に見出されるアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の3つ
の超可変性領域および重鎖の3つの超可変性領域は三次元空間中で互いに関して
位置して抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は結合した抗原の三次元表面に
対して相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の3つの超可変性領域は「相
補性決定領域）または「CDR」と呼ばれる。

【０２５９】さらに、結合因子は癌、例えば、前立腺癌をもつ患者または癌をもたない患者
を、本明細書において提供される代表的アッセイにより、区別することができる
。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは疾
患を有する患者の少なくとも約20％、より好ましくは患者の少なくとも約30％に
おいて癌の存在を示すシグナルを発生させる。選択的に、またはさらに、抗体は
癌をもたない個体の少なくとも約90％において疾患の非存在を示すシグナルを発
生させるであろう。

【０２６０】結合因子がこの要件を満足するかどうかを決定するために、癌をもつか、ある
いはもなたい患者からの生物学的試料（例えば、血液、血清、痰、尿および／ま
たは腫瘍バイオプシー）を本明細書に記載するように結合因子に結合するポリペ
プチドの存在についてアッセイすることができる。好ましくは、統計的に有意な
数の疾患をもつか、あるいはもなたい試料をアッセイする。各結合因子は上記基
準を満足すべきである；しかしながら、当業者は認識するように、結合因子を組
合わせて使用して感度を改良することができる。

【０２６１】上記要件を満足する任意の因子は結合因子であることができる。例えば、結合
因子はペプチド成分、RNA分子またはポリペプチドをもつか、あるいはもなたい
リボソームであることができる。好ましい態様において、結合因子は抗体または
その抗原結合性フラグメントである。抗体はこの分野において知られている種々
の技術により調製することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Harlow
およびLane、Antibody：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labor
atory、1988。

【０２６２】一般に、細胞培養技術、例えば、本明細書に記載するようなモノクローナル抗
体の発生により、または抗体遺伝子を適当な細菌または哺乳動物細胞宿主の中に
トランスフェクトして、組換え抗体の産生を可能とすることによって、抗体を製
造することができる。1つの技術において、ポリペプチドを含んでなる免疫原を
種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）に最初
に注射する。この工程において、本発明のポリペプチドは修飾を含まない免疫原
として働くことができる。

【０２６３】選択的に、特に比較的短いポリペプチドについて、ポリペプチドを担体タンパ
ク質、例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンに
結合させる場合、よりすぐれた免疫応答を誘発させることができる。好ましくは
1またはそれ以上のブースター免疫化を組込んだ前もって決定したスケジュール
に従い、免疫原を動物宿主に注射し、周期的に動物から血を取る。次いで、例え
ば、適当な固体支持体にカップリングされたポリペプチドを使用するアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、ポリペプチドに対して特異的なポリクローナル
抗体をこのような抗血清から精製することができる。

【０２６４】例えば、KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6：511−519、1976の
技術、およびそれに対する改良された技術を使用して、問題の抗原性ポリペプチ
ドに対して特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。簡単に述べる
と、これらの方法は所望の特異性（すなわち、問題のポリペプチドとの反応性）
を有する抗体を産生することができる永久分裂能化細胞系統の調製を包含する。
このような細胞系統は、例えば、前述したように免疫化された動物から得られた
脾細胞から、産生することができる。次いで、例えば、骨髄腫細胞の融合相手、
好ましくは免疫化された動物と同系であるものとの融合により、脾細胞を免疫化
する。

【０２６５】種々の融合技術を使用することができる。例えば、脾細胞および骨髄腫細胞を
非イオン性洗浄剤と数分間組合わせ、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持する
が、骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートする。好まし
い選択技術において、HAT（ハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選
択を使用する。十分な時間後、通常約1〜2週後、ハイブリッドのコロニーが観測
される。単一コロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合
性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマは好まし
い。

【０２６６】モノクローナル抗体を増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離するこ
とができる。さらに、種々の技術、例えば、適当な脊椎動物宿主、例えば、マウ
スの腹腔の中へのハイブリドーマ細胞の注射を使用して、収率を増加させること
ができる。次いで、モノクローナル抗体を腹水または血液から収集することがで
きる。慣用技術、例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出に
より、汚染物質を抗体から除去することができる。本発明のポリペプチドは精製
プロセス、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程において使用するこ
とができる。

【０２６７】抗体分子の免疫学的結合性を示すことができる抗原結合部位を含んでなる、多
数の療法上有効な分子がこの分野において知られている。タンパク質分解性酵素
パパインはIgG分子を優先的に切断していくつかのフラグメントを産生し、それ
のうちの2つ（「F（ab）」）の各々は無傷の抗原結合部位を含む共有結合のヘテ
ロダイマーを含んでなる。酵素はIgG分子を切断していくつかのフラグメントを
産生することができ、これらのフラグメントは両方の抗原結合部位を含んでなる
「F（ab'）₂」フラグメントを包含する。

【０２６８】「Fv」フラグメントは、IgM、稀な場合においてIgGまたはIgA免疫グロブリン
分子の優先的タンパク質分解的切断により製造することができる。しかしながら
、Fvフラグメントはこの分野において知られている組換え技術により普通に誘導
される。Fvフラグメントは、天然抗体分子の抗原認識および結合能力の多くを保
持する抗原結合部位を含む、非共有結合のV_H：：V_Lヘテロダイマーを包含する。
Inbar他（1972）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：2659−2662；Hochman他
（1976）Biochem. 15：2706−2710；およびEhrlich他（1980）Biochem. 19：4
091−4096。

【０２６９】一本鎖Fv（「sFv」）ポリペプチドは共有結合したV_H：：V_Lヘテロダイマーで
あり、リンカーをコードするポリペプチドにより結合されたV_HおよびV_Lをコード
する遺伝子を包含する遺伝子融合物から発現される。Huston他（1988）Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85（16）：5879−5883。自然に凝集した−しかし化学
的に分離された−抗体のV領域からの軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部
位の構造に構造的に類似する三次元構造にフォールドするsFv分子に変換するた
めに、化学的構造を区別する、多数の方法が記載されてきている。例えば、下記
の文献を参照のこと：Huston他に対する米国特許第5,091,513号および米国特許
第5,132,405号：およびLadner他に対する米国特許第4,946,778号。

【０２７０】前述の分子の各々は、それぞれ重鎖および軽鎖のFR組間に介在する、重鎖およ
び軽鎖のCDR組を包含し、これらはCDRSに対する支持を提供し、互い関係するCDR
の空間的関係を定める。本明細書において使用するとき、用語「CDR組」は重鎖
および軽鎖のV領域の3つの超可変性領域を意味する。重鎖または軽鎖のN末端か
ら進行して、これらの領域はそれぞれ「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と表
示される。

【０２７１】したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のV領域の各々からのCDR組を含
んでなる、6つのCDRを包含する。単一CDR（例えば、CDR1、CDR2またはCDR3）を
含んでなるポリペプチドを本明細書において「分子認識単位」と呼ぶ。多数の抗
原−抗体複合体の結晶学的分析により、CDRのアミノ酸残基は結合した抗原との
広範な接触を形成し、ここで大部分の広範な接触は重鎖CDR3との接触であること
が証明された。こうして、分子認識単位は抗原結合部位の特異的に主として関係
する。

【０２７２】本明細書において使用するとき、用語「FR組」は、重鎖または軽鎖のV領域のC
DR組のCDRをフレームする、4つのフランキングアミノ酸配列を意味する。いくつ
かのFR残基は結合した抗原と接触することができる；しかしながら、FRは抗原結
合部位、特にCDRSに直接隣接するFR残基へのV領域のフォールディングに主とし
て関係する。FRにおいて、ある種のアミノ残基およびある種の構造的特徴は非常
に高度に保存される。

【０２７３】これに関して、すべてのV領域の配列は約90アミノ酸残基の内部のジサルファ
イドループを含有する。V領域が結合性部位にフォールドするとき、CDRは抗原結
合表面を形成する突起するループモチーフとして展示される。一般に、精確なCD
Rアミノ酸配列に無関係に−ある種の「カノニカル」構造にフォールドされたCDR
ループの形状に影響を及ぼすFRの保存された構造的領域が存在することが認識さ
れている。さらに、ある種のFR残基は非共有結合のドメイン間接触に参加し、抗
体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化することが知られている。

【０２７４】非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含んでなる、多数の「ヒト化
」抗体分子が記載されてきており、これらは下記のものを包含する：齧歯類V領
域を有するキメラ抗体およびヒト定常領域に融合されたそれらの関連するCDR（W
inter他（1991）Nature 349：293−299；Lobglio他（1989）Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86：4220−4224；Shaw他（1987）J. Immunol. 138：4534−45
38；およびBrown他（1987）Cancer Res. 47：3577−3583）、適当なヒト抗体
の定常ドメインとの融合前にヒト支持FRの中にグラフト化された齧歯類CDR（Rie
chmann他（1988）Nature 332：323−327；Verhoeyen他（1988）Science 239：
1534−1536；およびJones他（1986）Nature 321：522−525）、および組換え的
にベニヤ化された齧歯類FRにより支持された齧歯類CDR（欧州特許出願公開No.
519,596、1992年12月23日発行）。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエン
トにおけるそれらの部分の療法的用途の期間および有効性を制限する、齧歯類抗
ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小とするように設計される
。

【０２７５】本明細書において使用するとき、用語「ベニヤ化FR」および「組換え的にベニ
ヤ化されたFR」は、天然FRポリペプチドフォールディング構造の実質的にすべて
を保持する抗原結合部位を含んでなる異種分子を提供するために、例えば、齧歯
類の重鎖または軽鎖のV領域からの、FR残基をヒトFR残基で選択的に置換するこ
とを意味する。ベニヤ化技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が主として重
鎖および軽鎖の構造および相対的位置により決定されたという理解に基づく。

【０２７６】 Davies他（1990）Ann. Rev. Biochem. 59：439−473。こうして、抗原結合
特異性はヒト化抗体においてのみ保存することができ、ここでCDR構造、互いと
のそれらの相互作用、およびV領域ドメインの残部とのそれらの相互作用は注意
して維持される。ベニヤ化技術技術を使用することによって、免疫系が容易に直
面する外部の（例えば、溶媒アクセス可能な）FR残基をヒト残基で選択的に置換
して、弱く免疫原性の、または実質的に非免疫原性のベニヤ化表面を含んでなる
ハイブリッド分子を形成する。

【０２７７】ベニヤ化プロセスにおいて、Kabat他、Sequences of Proteins of Immuno
logical Interest、第4版（U.S. Dept. of Health and Human Services
、U.S. Government Printing Office、1987）により収集されたヒト抗体可変
ドメインについての入手可能な配列データ、Kabatデータベースに対する最新情
報、および他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタン
パク質の両方）を使用する。V領域のみアミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒト
およびネズミ抗体フラグメントについて既知の三次元構造から推定することがで
きる。ネズミ抗原結合部位のベニヤ化において、2つの一般的工程が存在する。

【０２７８】最初に、問題の抗体分子の可変ドメインのFRを、上に同定した源から得られた
ヒト可変ドメインの対応するFR配列と比較する。次いで、最も相同的なヒトV領
域を対応するネズミアミノ酸と残基対残基で比較する。ヒト対応物と異なるネズ
ミFR中の残基を、この分野においてよく知られている組換え技術によりヒト部分
の中に存在する残基と置換する。少なくとも部分的に暴露された（溶媒アクセス
可能な）部分を使用してのみ残基の交換を実施し、そしてV領域の三次構造に対
して有意な効果を有することができるアミノ酸残基、例えば、プロリン、グリシ
ンおよび帯電したアミノ酸の置換において注意を払う。

【０２７９】この方法において、生ずる「ベニヤ化」ネズミ抗原結合部位はこうして下記の
残基を保持するように設計される：ネズミCDR残基、CDRに実質的に隣接する残基
、埋没されたまたはほとんど埋没された（溶媒アクセス可能）として同定された
残基、重鎖および軽鎖ドメイン間の非共有結合的（例えば、静電的および疎水性
）接触に参加すると考えられる残基、およびCDRループの「カノニカル」三次構
造に影響を及ぼすと考えられるFRの保存された構造的領域からの残基。次いで、
これらの設計基準を使用して組換えヌクレオチド配列を調製し、これらの組換え
ヌクレオチド配列はネズミ抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のCDRを見掛け
のヒトFRに組合わせ、ネズミ抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体を発現
させるために、これらのヒトFRを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする
ことができる。

【０２８０】本発明の他の態様において、本発明のモノクローナル抗体を1またはそれ以上
の治療剤に対してカップリングさせることができる。これに関して適当な治療剤
は、放射性核種、分化インデューサー、薬剤、トキシン、およびそれらの誘導体
を包含する。好ましい放射性核種は、⁹⁰Y、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re、²¹¹At、
および²¹²Biを包含する。好ましい薬剤は、メトトレキセート、およびピリミジ
ンおよびプリンアナローグを包含する。好ましい分化インデューサーは、ホルボ
ールエステルおよび酪酸を包含する。好ましいトキシンは、リシン、アブリン、
ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン、シュードモナス（Pseudomona
s）エキソトキシン、シゲラ[赤痢菌]（Shigella）トキシン、およびアメリカヤ
マゴボウ抗ウイルスタンパク質を包含する。

【０２８１】治療剤を適当なモノクローナル抗体に直接的または間接的（すなわち、リンカ
ー基を介して）にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。治療
剤と抗体との間の直接的反応は、各々が他と反応することができる置換基を有す
るとき、可能である。例えば、一方の求核基、例えば、アミノまたはスルフヒド
リル基は、他方のカルボニル含有基、例えば、無水物または酸ハロゲン化物、ま
たはすぐれた離脱基（例えば、ハライド）を含有するアルキル基と反応すること
ができる。

【０２８２】選択的に、リンカー基を介して治療剤および抗体をカップリングさせることが
望ましいことがある。リンカー基は、治療剤から抗体を離して、結合可能性を妨
害するスペーサーとして機能することができる。また、リンカー基は治療剤上ま
たは抗体上の置換基の化学的反応性を増加させ、こうしてカップリング効率を増
加させる働きをすることができる。また、化学的反応性の増加は、そうでなけれ
ば不可能である、治療剤の使用、または治療剤上の官能基の使用を促進すること
ができる。

【０２８３】当業者にとって明らかになるように、ホモ−およびヘテロ−機能性の両方の、
種々の二機能性および多機能性試薬（例えば、Pierce Chemical Co.、イリノ
イ州ロックフォード、のカタログに記載されている試薬）をリンカー基として使
用することができる。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ス
ルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基を通して、実施することができる
。このような方法を記載する多数の参考文献が存在する。例えば、Rodwell他に
対する米国特許第4,671,958号。

【０２８４】本発明の免疫複合体の抗体部分を含有しないとき、治療剤はいっそう効力のあ
る場合、細胞の中への内在化時にまたはその間に切断可能なリンカー基を使用す
ることが望ましいことがある。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されて
きている。これらのリンカー基からの治療剤の細胞内解放のメカニズムは下記の
反応による切断を包含する：ジサルファイド結合の還元（例えば、Spitlerに対
する米国特許第4,489,710号）、光不安定性結合の照射（例えば、Senter他に対
する米国特許第4,625,014号）、誘導化アミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Kohn
他に対する米国特許第4,638,045号）、血清補体仲介加水分解（例えば、Rodwell
に対する米国特許第4,671,958号）、および酸触媒加水分解（例えば、Blattler
他に対する米国特許第4,569,789号）。

【０２８５】 2以上の治療剤を抗体にカップリングさせることが望ましいことがある。1つの
態様において、治療剤の多数の分子を1つの抗体分子にカップリングさせる。他
の態様において、2以上の型の治療剤を1つの抗体にカップリングさせることがで
きる。特定の態様に無関係に、2以上の治療剤との免疫複合体を種々の方法で調
製することができる。例えば、2以上の治療剤を抗体分子に直接カップリングさ
せるか、あるいは多数の結合部位を提供するリンカーを使用することができる。
選択的に、担体を使用することができる。

【０２８６】担体は種々の方法、例えば、直接的またはリンカー基を介する共有結合により
治療剤を有することができる。適当な担体は、タンパク質、例えば、アルブミン
（例えば、Kato他に対する米国特許第4,507,234号）、ペプチドおよび多糖、例
えば、アミノデキストリン（例えば、Shih他に対する米国特許第4,699,784号）
を包含する。また、担体は非共有結合により、または、例えば、リポソームベヒ
クル内の、包膜（例えば、米国特許第4,429,008号および米国特許第4,873,088号
）により治療剤を支持することができる。

【０２８７】放射性核種因子に対して特異的担体は、放射性ハロゲン化小分子およびキレー
ト化化合物を包含する。例えば、米国特許第4,735,792号には、代表的な放射性
ハロゲン化小分子およびそれらの合成が記載されている。放射性核種のキレート
はキレート化化合物から形成することができ、これらのキレート化化合物は窒素
および硫黄原子、例えば、金属、または金属酸化物、放射性核種と結合するため
のドナー原子を含有する化合物を包含する。例えば、Davison他に対する米国特
許第4,673,562号には、代表的キレート化合物およびそれらの合成が開示されて
いる。

【０２８８】T細胞組成物本発明は、他の面において、本明細書に記載する腫瘍ポリペプチド、またはそ
れらの変異型または誘導体に対して特異的なT細胞を提供する。一般に、このよ
うな細胞は、in vitroまたはex vivoにおいて、標準プロトコルに従い調製す
ることができる。例えば、T細胞は、商業的に入手可能な細胞分離系、例えば、
下記のものを使用して、患者の骨髄、末梢血液、または骨髄または末梢血液の画
分から単離することができる：ネキセル・セラピューディクス・インコーポレー
テッド（Nexell Therapeutics，Inc.、カリフォルニア州アービン）から入手可
能であるIsolex^TM System（また、下記の文献を参照のこと：米国特許第5,240,
856号；米国特許第5,215,926号；WO 89／06280；WO 91／16116およびWO 92／
07243）。選択的に、T細胞は関係するまたは無関係のヒト、非ヒト哺乳動物、細
胞系統または培養物から誘導することができる。

【０２８９】ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこ
のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（APC）でT細胞を刺激することが
できる。このような刺激は、問題のポリペプチドに対して特異的であるT細胞の
発生を可能とするために十分な条件下にかつ時間の間実行される。好ましくは、
本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをデリバリーベヒクル、例え
ば、微小球内に存在させて、特異的T細胞の発生を促進する。

【０２９０】 T細胞が特異的の増殖し、サイトカインを分泌し、またはペプチドで被覆され
たまたはポリペプチドをコードする遺伝子を発現するターゲット細胞を殺す場合
、T細胞は本発明のポリペプチドに対して特異的であると考える。種々の標準技
術に従い、T細胞の特異性を評価することができる。例えば、クロム解放アッセ
イまたは増殖アッセイにおいて、陰性対照に比較して、溶解および／または増殖
の3倍以上の増加の刺激指数はT細胞の特異性を示す。このようなアッセイは、例
えば、下記の文献に記載されているように実行することができる：Chen他、Canc
er Res. 54：1065−1070、1994。選択的に、T細胞増殖の検出は種々の既知技
術により達成することができる。

【０２９１】例えば、T細胞増殖はDNA合成速度の増加を測定することによって検出すること
ができる（例えば、トリチウム化チミジンを使用するT細胞培養物のパルス標識
化、およびDNAの中に導入されたトリチウム化チミジン量の測定による）。典型
的には、3〜7日間の腫瘍ポリペプチド（100ng／ml〜100μg／ml、好ましくは200
ng／ml〜25μg／ml）との接触は、T細胞増殖を少なくとも2倍増加させるであろ
う。

【０２９２】前述したように2〜3時間接触させると、標準サイトカインアッセイにより測定
して、T細胞を活性化させ、ここでサイトカイン（例えば、TNFまたはTNF−γ）
解放レベルの2倍の増加はT細胞活性化を示す（下記の文献を参照のこと：Coliga
n他、Current Protocols in Imunology、Vol. 1、Wiley Interscience（Gr
eene 1998））。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現
性APCに応答して活性化されたT細胞は、CD4⁺および／またはCD8⁺であることがで
きる。腫瘍ポリペプチド特異的T細胞は標準技術により拡大することができる。
好ましい態様において、T細胞は患者、関係するドナーまたは無関係のドナーに
由来し、下記の刺激および拡大後に患者に投与される。

【０２９３】療法上の目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはAPCに応答して
増殖するCD4⁺またはCD8⁺T細胞の数をin vitroまたはin vivoにおいて拡張する
ことができる。T細胞増殖因子、例えば、インターロイキン−2、および／または
腫瘍ポリペプチドを合成する刺激因子の細胞を添加するか、あるいは添加しない
で、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応す
る短いペプチドに対して、T細胞をin vitroで暴露することができる。選択的に
、腫瘍ポリペプチドの存在下に増殖する1またはそれ以上のT細胞の数をクローニ
ングにより拡張することができる。細胞をクローニングする方法はこの分野にお
いてよく知られており、そして限界希釈法を包含する。

【０２９４】医薬組成物追加の態様において、本発明は、単独で、または1またはそれ以上の治療法と
組合わせて細胞または動物に投与するための、1またはそれ以上の本明細書に開
示するポリヌクレオチド、ポリペプチド、T細胞および／または抗体組成物と、
薬学上許容される担体とを含んでなる処方物に関する。

【０２９５】理解されるように、必要に応じて、本明細書に開示する組成物はその上他の薬
剤、例えば、他のタンパク質またはポリペプチドまたは種々の療法上活性な薬剤
と組合わせて投与することができる。事実、追加の薬剤がターゲット細胞または
宿主組織との接触時に有意な悪い作用を引き起こさないかぎり、添加することが
できる他の成分に対する制限は事実上存在しない。次いで、組成物は特定の場合
において必要に応じて種々の他の薬剤と一緒に送出すことができる。このような
組成物は宿主細胞または他の生物学的源から精製することができるか、あるいは
選択的に本明細書に記載するように化学的に合成することができる。同様に、こ
のような組成物は置換されたまたは誘導化されたRNAまたはDNA組成物をさらに含
んでなることができる。

【０２９６】したがって、本発明の他の面において、1またはそれ以上の本明細書に開示す
るポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはT細胞組成物と、薬
学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。ある好ましい態様
において、本発明の医薬組成物は、予防的および治療的ワクチン適用において使
用するための本発明の免疫原性ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組
成物を含んでなる。一般に、ワクチン組成物は、例えば、下記の文献に記載され
ている：M.F. PowellおよびM.J. Newman編、″Vaccine Design（the subuni
t and adjuvant approach））″、Plenum Press（NY、1995）。一般に、こ
のような組成物は、1またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチド組成物と、1またはそれ以上の免疫刺激因子とを含んでなるであ
ろう。

【０２９７】当業者にとって明らかなように、本明細書に記載する任意の医薬組成物は本発
明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学上許容される塩を含有すること
ができる。このような塩は、例えば、薬学上許容される無毒の塩基、例えば、有
機塩基の塩（例えば、第一級、第二級および第三級アミンおよび塩基性アミノ酸
の塩）および無機塩基の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモ
ニウム、カルシウムおよびマグネシウム）を包含する。

【０２９８】他の態様において、本発明の例示的免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物
は、ポリペプチドがin situで発生されるように、1またはそれ以上の前述のポ
リペプチドをコードするDNAを含んでなる。前述したように、ポリヌクレオチド
はこの分野において知られている種々のデリバリー系により投与することができ
る。

【０２９９】事実、多数の遺伝子デリバリー技術はこの分野においてよく知られており、例
えば、下記の文献に記載されている：Rolland、Crit. Rev. Therap. Drug C
arrier Systems 15：143−198、1998、およびその中に引用された参考文献。
もちろん、適当なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現の必要な調節DN
A調節配列を含有するであろう（例えば、適当なプロモーターおよび終結シグナ
ル）。選択的に、細菌デリバリー系は、この場合において、細胞表面上のポリペ
プチドの免疫原性部分を発現するか、あるいはこのようなエピトープを分泌する
細菌（例えば、Bacillus−Calmette−Guerrin）の投与を包含することができる
。

【０３００】したがって、ある態様において、本明細書に開示する免疫原性ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドは、多数の既知のウイルスをベースとする系を使用
して、発現のために適当な哺乳動物宿主細胞の中に導入される。1つの例示的態
様において、レトロウイルスは遺伝子デリバリー系のために好都合かつ有効なプ
ラットフォームを提供する。この分野において知られている技術に従い、本発明
のポリペプチドをコードする選択されたポリヌクレオチドをベクターの中に挿入
し、レトロウイルス粒子の中にパッケージすることができる。

【０３０１】次いで、組換えウイルスを単離し、被検体に送出すことができる。多数の例示
的レトロウイルス系が記載されてきている（例えば、米国特許第5,219,740号；M
illerおよびRosman（1989）Bio Techniques 7：980−990；Miller、A.D.（199
0）Human Gene Therapy 1：5−14；Scarpa他（1991）Virology 180：849−8
52；Burns他（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：8033−8037；およ
びBoris−LawrieおよびTemin（1993）Cur. Opin. Genet. Develop. 3：102
−109）。

【０３０２】さらに、多数の例示的アデノウイルスをベースとする系も記載されてきている
。宿主ゲノムの中に統合するレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体
外に存続し、こうして挿入突然変異誘発に関連する危険を最小にする（Haj−Ahm
adおよびGraham（1986）J. Virol. 57：267−274；Bett他（1993）J. Virol.
67：5911−5921；Mittereder他（1994）Human Gene Therapy 5：717−729
；Seth他（1994）J. Virol. 68：933−940；Barr他（1994）Gene Therapy 1
：51−58；Berkner、K.L.（1988）Bio Techniques 6：616−629；およびRich
他（1993）Human Gene Therapy 4：461−476）。

【０３０３】また、種々のアデノ関連ウイルス（AAV）ベクター系がポリヌクレオチドのデ
リバリーのために開発された。AAVベクターは、この分野においてよく知られて
いる技術を使用して容易に構築することができる。例えば、下記の文献を参照の
こと：米国特許第5,173,414号および米国特許第5,139,941号；国際公開No. WO
92／01070およびWO 93／03769；Lebkowski他（1988）Molecl. Cell. Biol.
8：3988−3996；Vincent他（1990）Vaccines 90（Cold Spring Harbor La
boratory Press）；Carter、B.J.（1992）Current Opinion in Biotechnolo
gy 3：533−539；Muzyczka、N.(1992）Current Topics in Microbiol. and
Immunol. 158：97−129；Kotin、R.M.（1994）Human Gene Therapy 5：79
3−801；ShellingおよびSmith（1994）Gene Therapy 1：165−169；およびZho
u他（1994）J. Exp. Med. 179：1867−1875。

【０３０４】遺伝子転移により本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを送出すた
めに有効な追加のウイルスベクターは、ウイルスのポックスファミリー、例えば
、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスに由来するものを包含する。
1例として、新規な分子を発現するワクシニアウイルス組換え体を次のようにし
て構築することができる。

【０３０５】まず、ワクシニアプロモーターおよびフランキングワクシニアDNA配列、例え
ば、チミジンキナーゼ（TK）をコードする配列に隣接するように、ポリペプチド
をコードするDNAを適当なベクターの中に挿入する。次いで、このベクターを使
用して細胞をトランスフェクトし、この細胞を同時にワクシニアで感染させる。
相同的組換えはワクシニアプロモーター＋問題のポリペプチドをコードする遺伝
子をウイルスゲノムの中に挿入する働きをする。5−ブロモデオキシウリジンの
存在下に細胞を培養し、それに対して耐性であるウイルスプラークを取り上げる
ことによって、生ずるTK.sup(-)組換え体を選択することができる。

【０３０６】ワクシニアをベースとする感染／トランスフェクション系を好都合に使用して
、生物の宿主細胞中で1またはそれ以上の本明細書に記載するポリペプチドの誘
導可能な、一時的発現または共発現を提供することができる。この特定の系にお
いて、まず、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウ
イルス組換え体で細胞をin vitro感染させる。このポリメラーゼは絶妙な特異
性を展示し、ここでそれはT7ポリメラーゼを支持する鋳型のみを転写する。感染
後、細胞をポリヌクレオチドまたは問題のポリヌクレオチドでトランスフェクト
し、T7プロモーターにより推進する。

【０３０７】ワクシニアウイルス組換え体からの細胞質中で発現されたポリメラーゼはトラ
ンスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いでこれは宿主翻訳機構によりポリペ
プチドに翻訳される。この方法はRNAおよびその翻訳産物の高いレベルの、一時
的、細胞質産生を提供する。例えば、下記の文献を参照のこと：Elroy−Steinお
よびMoss、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1990）87：6743−6747；Fuerst他
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1986）83：8122−8126。

【０３０８】選択的に、アビポックスウイルス、例えば、フォウル痘およびカナリポックス
ウイルスをまた使用して問題のコーディング配列を送出すことができる。組換え
体アビポックスウイルスは、哺乳動物病原体から免疫原を発現し、非トリ種に添
加したとき、保護的免疫性を与えることが知られている。アビポックスベクター
の使用はヒトまたは他の哺乳動物種において特定の望ましい。なぜなら、アビポ
ック遺伝子のメンバーは感受性トリ種において産生的にのみ複製することができ
、形質転換哺乳動物細胞において感染性ではないからである。アビポックウイル
スはこの分野において知られており、そしてワクシニアウイルスの産生に関して
前述したように、遺伝的組換えを使用する。例えば、下記の文献を参照のこと：
WO 91／03429；およびWO 92／03545。

【０３０９】また、本発明のポリヌクレオチド組成物のデリバリーのために、多数のアルフ
ァウイルス、例えば、下記の文献に記載されているベクターを使用することがで
きる：米国特許第5,843,723号；米国特許第6,015,686号；米国特許第6,008,035
号および米国特許第6,015,694号。ベネゼラウマ脳炎（VEE）を使用することもで
き、その例示的例は米国特許第5,505,947号および米国特許第5,643,576号に記載
されている。

【０３１０】その上、複合体ベクター、例えば、Michael他、J. Biol. Chem.（1993）268
：6866−6869およびWagner他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1992）89：60
99−6103に記載されているアデノウイルスキメラベクターを本発明における遺伝
子デリバリーのために使用することもできる。

【０３１１】これらおよび他の既知のウイルスをベースとするデリバリー系についての追加
の情報は、例えば、下記の文献に記載されている：Fisher−Hoch他、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 86：317−321、1989；Flexner他、Ann. N. Y. Acad.
Sci. 569：86−103、1989；Flexner他、Vaccine 8：17−21、1990；米国特
許第4,603,112号、米国特許第4,769,330号、および米国特許第5,017,487号；WO
89／01973；米国特許第4,777,127号；GB2,200,651；EP0,345,242；WO 91／02
805；Berkner、Biotechniques 6：616−627、1988；Rosenfeld他、Science 25
2：431−434、1991；Kolls他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：215−219
、1994；Kass−Eisler他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：11498−11502
、1993；Guzman他、Circulation 88：2838−2848、1993；およびGuzman他、Cir
. Res. 73：1202−1207、1993。

【０３１２】ある態様において、ポリヌクレオチドをターゲット細胞のゲノムの中に統合す
ることができる。この統合は相同的組換え（遺伝子置換）を介する特異的位置お
よび向きであることができるか、あるいはランダムの、非特異的位置（遺伝子増
強）に統合することができる。なお他の態様において、ポリヌクレオチドは細胞
の中にDNAの別々の、エピソームセグメントとして安定に維持することができる
。このようなポリヌクレオチドのセグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞
周期に対して独立に、またはそれと同期に維持および複製を可能とするために十
分なに配列をコードする。発現構築物が細胞に送出され、そして細胞の中にポリ
ヌクレオチドが止まる方法は、使用する発現構築物の型に依存する。

【０３１３】本発明の他の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、下記の文献に記載
されているように、「裸」DNAとして投与／送出される：Ulmer他、Science 259
：1745−1749、1993およびCohen、Science 259：1691−1692、1993。細胞の中
に効率よく輸送される、生物分解性ビーズ上にDNAを被覆することによって、裸D
NAの吸収を増加させることができる。

【０３１４】なお他の態様において、本発明の組成物は粒子衝撃アプローチを介して送出す
ことができ、それらの多数は記載されてきている。1つの例示的例において、気
体推進粒子加速は装置、例えば、パウダージェット・ファーマシューティカルス
（Powderjet Pharmaceuticals）PLC（英国オックスフォード）およびパウダー
ジェット・ワクチンス・インコーポレーテッド（Powderjet Vaccines Inc.）
（ウイスコンシン州マディソン）製の装置を使用して達成可能であり、それらの
いくつかの例は下記の文献に記載されている：米国特許第5,846,796号；米国特
許第6,010,478号；米国特許第5,865,796号；米国特許第5,584,807号；およびEP
特許No.0,500,799。このアプローチは針を含まないデリバリーアプローチを提供
し、ここで微視的粒子、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの粒子の
乾燥粉末状処方物は、手で保持する装置により発生されたヘリウムガスのジェッ
ト中で高速に加速され、粒子は問題のターゲット組織の中に推進される。

【０３１５】関係する態様において、本発明の組成物の針を含まないガス推進注入に有効な
他の装置および方法は、バイオジェット・インコーポレーテッド（Biojet，Ｉｎ
ｃ）（オレゴン州ポートランド）により提供される装置を包含し、それらのいく
つかの例は下記の文献に記載されている：米国特許第4,790,824号；米国特許第5
,064,413号；米国特許第5,312,335号；米国特許第5,383,851号；米国特許第5,39
9,163号；米国特許第5,520,639号および米国特許第5,993,412号。

【０３１６】他の態様によれば、本明細書に記載する医薬組成物は1またはそれ以上の免疫
刺激因子と、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、T細胞
および／またはAPC組成物とを含んでなるであろう。免疫刺激因子は、外因的抗
原に対する免疫応答（抗体および／または細胞仲介）を増強または強化する、本
質的に任意の物質を意味する。免疫刺激因子の1つの好ましい型はアジュバント
を含んでなる。多数のアジュバントは、急速な異化作用から抗原を保護するよう
に設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の
刺激因子、例えば、脂質A、百日咳菌（Bordetella pertussis）またはヒト型結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来タンパク質を含有する。

【０３１７】ある種のアジュバントは商業的に入手可能であり、それらの例は次の通りであ
る：フロインド不完全アジュバントおよびフロインド完全アジュバント（Difco
Laboratories、ミシガン州デトロイト）；メルクアジュバント65（Merck and
Company，Inc.、ニュージャージイ州ローウェイ）；AS−2（SmithKline Beec
ham、ペンシルベニア州フィラデルフィア）；アルミニウム塩、例えば、水酸化
アルミニウムゲル（明礬）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜
鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン的またはアニ
オン的に誘導化された多糖；ポリホスファゼン；生物分解性微小球；モノホスホ
リル脂質Aおよびquil A。また、サイトカイン、例えば、GM−CSF、インターロ
イキン−2、−7、−12、および他の増殖因子をアジュバントとして使用すること
ができる。

【０３１８】本発明のある態様において、アジュバント組成物は好ましくは主としてTh1型
の免疫応答を誘導するものである。高いレベルのTh1型サイトカイン（例えば、I
FN−γ、TNFα、IL−2およびIL−12）は、投与された抗原に対する細胞仲介免疫
応答の誘導に好適である傾向がある。対照的に、高いレベルのTh2型サイトカイ
ン（例えば、IL−4、IL−5、IL−6およびIL−10）は、体液性免疫応答の誘導に
好適である傾向がある。

【０３１９】本発明において提供されるワクチンの適用後、患者はTH1型およびTh2型応答を
包含する免疫応答を支持するであろう。好ましい態様において、応答は主として
Th1型であり、Th1型サイトカインのレベルはTh2型サイトカインのレベルよりも
大きい程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは標準アッセイ
により容易に評価することができる。サイトカインファミリーの概観については
、下記の文献を参照のこと：MosmanおよびCoffman，Ann. Rev. Immunol. 7：
145−173、1989。

【０３２０】主としてTh1型応答を誘導するある種の好ましいアジュバントは、例えば、モ
ノホスホリル脂質A、好ましくは3−デ−O−アシル化モノホスホリル脂質A、とア
ルミニウム塩との組合わせを包含する。MPL^TMアジュバントは、コリクサ・コー
ポレーション（Crixa Corporation）から入手可能である（ワシントン州シアト
ル；例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第4,436,727号；米国特許第4,8
77,611号；米国特許第4,866,034号および米国特許第4,912,094号）。また、CpG
を含有するオリゴヌクレオチド（ここでCpGジヌクレオチドはメチル化されてい
ない）は主としてTh1応答を誘導する。

【０３２１】このようなオリゴヌクレオチドはこの分野においてよく知られており、そして
例えば、下記の文献に記載されている：WO 96／02555、WO 99／33488および米
国特許第6,008,200号および米国特許第5,856,462号。また、免疫刺激性DNA配列
が、例えば、Sato他、Science 273：352、1996に記載された。他の好ましいア
ジュバントは、サポニン、例えば、Quil A、またはその誘導体を含んでなり、Q
S21およびQS7aQUILA Biopharmaceuticals Inc.、マサチュセッツ州ファーミン
ガム）；エシン；ジギトニン；またはジョスソフィラ（Gyssofpila）またはケノ
ポジウム・キノア（Chenopodium quinoa）サポニンを包含する。他の好ましい
処方物は、2以上のサポニンと、本発明のアジュバントの組合わせ、例えば、少
なくとも2つの下記のグループの組合わせとを含む：QS21、QS7、Quil A、β−
エオシン、またはジギトニン。

【０３２２】選択的に、サポニン処方物を、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマー、
ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−N−アセチルグ
ルコサミンをベースとするポリマーマトリックス、多糖または化学的に修飾され
た多糖から構成された粒子、リポソームおよび脂質をベースとする粒子、グリセ
ロールモノエステルから構成された粒子、およびその他から構成されたワクチン
と組合わせることができる。

【０３２３】また、サポニンをコレステロールの存在下に処方して、粒状構造物、例えば、
リポソームまたはISCOMを形成することができる。さらに、サポニンを、非粒状
溶液または懸濁液中で、または粒状構造物、例えば、小層状リポソームまたはIS
COM中で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方することが
できる。また、サポニンを賦形剤、例えば、Carbopl^TMと処方して粘度を増加さ
せるか、あるいは乾燥粉末の形態で粉末状賦形剤、例えば、ラクトースと処方す
ることができる。

【０３２４】 1つの態様において、アジュバント系は、モノホスホリル脂質Aとサポニン誘導
体との組合わせ、例えば、WO 94／00153に記載されているような、QS21と3D−M
PL^TMアジュバントとの組合わせ、またはWO 96／33739に記載されているような
、QS21がコレステロールでクエンチされている低い反応の組成物を包含する。他
の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる
。水中油型エマルジョンのQS21、3D−MPL^TMアジュバントおよびトコフェロール
を使用する、他の特に好ましいアジュバント処方物は、WO 95／17210に記載さ
れている。

【０３２５】他の増強されたアジュバント系はCpGを含有するオリゴヌクレオチドとサポニ
ン誘導体との組合わせを包含し、特にCpGとQS21との組合わせはWO 00／09159に
開示されている。好ましくは、処方物はさらに水中油型エマルジョンおよびトコ
フェロールを含んでなる。

【０３２６】本発明の医薬組成物において使用するための追加の例示的アジュバントは下記
のものを包含する：モンタニドISA 720（Seppic、フランス国）、SAF（Chiron
、米国カリフォルニア州）、ISCOMS（CSL）、MF−59（Chiron）、アジュバント
のSBAS系列（例えば、SBAS−2またはSBAS−4、SmithKline Beecham、ベルギー
国リクセンサルト、から入手可能である）、Detox（Enhanzyn^TM；Corixa、モン
タナ州ハミルトン）、RC−59（Corixa、モンタナ州ハミルトン）、および他のア
ミノアルキルグルコサミン4−ホスフェート（AGP）、例えば、係属中の米国特許
出願第08／853,826号および同第09／074,720号（それらの開示は引用することに
よって本明細書の一部とされる）に記載されているもの、およびポリオキシエチ
レンエーテルのアジュバント、例えば、WO 99／52549A1に記載されているもの
。

【０３２７】他の好ましいアジュバントは、下記の一般式のアジュバント分子を包含する：（1） HO（CH₂CH₂O）_n−A−R ここでnは1〜50であり、Aは結合または−C（O）−であり、RはC_1-50アルキルま
たはフェニルC_1-50アルキルである。

【０３２８】本発明の1つの態様は、一般式(I)のポリオキシエチレンエーテルを含んでなる
ワクチン処方物から成り、ここでnは1〜50、好ましくは4〜24、最も好ましくは9
であり、R成分はC_1-50、好ましくはC₄−C₂₀アルキル、最も好ましくはC₁₂アルキ
ルであり、そしてAは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は0.1〜20
％，好ましくは0.1〜10％、最も好ましくは0.1〜1％の範囲である。好ましいポ
リオキシエチレンエーテルは下記のグループから選択される：ポリオキシエチレ
ン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル、ポリ
オキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエ
ーテル、ポリオキシエチレン−55−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレ
ン−23−ラウリルエーテル。

【０３２９】ポリオキシエチレンエーテル、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル
はメルクインデックス（Merck Index）（第12版：エントリー7717）に記載され
ている。これらのアジュバント分子は、WO 99／52549に記載されている。上記
一般式(I)に従うポリオキシエチレンエーテルは、必要に応じて、他のアジュバ
ントと組合わせるすることができる。例えば、好ましいアジュバントの組合わせ
は、係属中の英国特許出願GB9820956.2に記載されているように、CpGを使用する
ことが好ましい。

【０３３０】本発明の他の態様によれば、本明細書に記載する免疫原性組成物は抗原提示細
胞（APC）、例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球および効率よいAP
Cであるように操作できる他の細胞を介して宿主に送出される。このような細胞
は遺伝学的に修飾して抗原提示能力を増加させ、T細胞応答の活性化および／ま
たは維持を改良し、それ自体が抗腫瘍作用を有するようにし、および／または受
容体と免疫学的にコンパティブルである（すなわち、合致したHLAハプロタイプ
）ようにすることができるが、それは不必要である。APCは一般に種々の生物学
的流体および器官、例えば、腫瘍および腫瘍周辺組織から単離することができ、
そしてオートロガス、同種異系、同系または異種細胞であることができる。

【０３３１】本発明のある態様において、抗原提示細胞として樹状細胞またはそれらの子孫
を使用する。樹状細胞は高度に効力のあるAPCであり（BanchereauおよびSteinma
n、Nature 392：245−251、1998）そして予防的または治療的抗腫瘍免疫性を誘
発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示された（Timmerma
nおよびLevy、Ann. Rev. Med. 50：507−529、1999参照）。

【０３３２】一般に、樹状細胞はそれらの典型的な形状（in situ星状、in vitroにおい
て可視の顕著な細胞質プロセス（樹枝突起）を有する）、高い効率で抗原を取り
上げ、プロセスし、提示する能力、素朴なT細胞応答を活性化する能力に基づい
て同定ことができる。もちろん、in vivoまたはex vivoにおいて樹状細胞上に
普通に見出されない特異的細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように
、樹状細胞を操作することができ、そしてこのような修飾された樹状細胞は本発
明により意図される。樹状細胞の代替物として、分泌された小胞性抗原負荷樹状
細胞（エキソソームと呼ばれる）をワクチンにおいて使用することができる（Zi
tvogel他、Nature Med. 4：594−600、1998参照）。

【０３３３】樹状細胞および子孫は、末梢血液、骨髄、腫瘍浸潤性細胞、腫瘍周辺組織−浸
潤性細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血液または任意の他の適当な組織または
流体から得ることができる。例えば、樹状細胞はex vivoにおいてサイトカイン
、例えば、GM−CSF、IL−4、IL−13および／またはTNFαの組合わせを末梢血液
から収集した単球の培養物に添加することによって分化させることができる。選
択的に、GM−CSF、IL−3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンドおよび／ま
たは推定の分化、成熟および増殖を誘導する1またはそれ以上の他の化合物の組
合わせを培地に添加することによって、末梢血液、臍帯血液または骨髄から収集
したCD34陽性細胞を樹状細胞に分化させることができる。

【０３３４】樹状細胞は、簡単な方法で2つの十分に特性決定された表現型を識別すること
を可能とする、「未熟」および「成熟」細胞として好都合にカテゴリー化される
。しかしながら、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈
すべきではない。未熟細胞は、抗原を吸収しかつプロセシングする高い能力を有
するAPCとして特性決定され、これらはFcγレセプターおよびマンノースレセプ
ターの高い発現と相関する。成熟表現型は典型的にはこれらのマーカーの低い発
現により特性決定されるが、T細胞の活性化に関係する細胞表面の分子、例えば
、クラスIおよびクラスII MHC、接着分子（例えば、CD54およびCD11）および共
同刺激性分子（例えば、CD40、CD80、CD86および4−1BB）の高い発現により特性
決定される。

【０３３５】一般に、APCsに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）を
トランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原
性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション
処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願
明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状または
その他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与すること
によって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。例
えば樹状細胞の生体内および生体外トランスフェクション処理は、WO97/24447に
記載されているような公知の方法で、またはMahvi et alがImmunology and cell
Biology75：456-460（1997）に記述している遺伝子銃アプローチを利用して行
うことができる。樹状細胞の抗原ローディングは樹状細胞または前駆細胞を腫瘍
ポリペプチド、DNA（そのまま、またはプラスミドベクターに挿入して）またはR
NAと一緒に；または抗原発現組換え細菌またはウィルス（例えばワクシニア、鶏
痘ウィルス、アデノウィルスまたはレンチウィルスベクター）と一緒にインキュ
ベートすることによって達成される。ローディングに先立ち、ポリペプチドを、
（例えばキャリヤ分子のような）T細胞ヘルプを提供する免疫パートナーと共有
結合させる。あるいは、ポリペプチドとは別に、またはポリペプチドの存在にお
いて、樹状細胞を非共有結合免疫パートナーでパルス処理してもよい。本発明の薬剤には、当業者に公知の適当なキャリヤを使用できるが、キャリヤ
のタイプは投与態様に応じて異なるのが普通である。本発明の薬剤は局所、経口
、経鼻腔、経粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、筋肉内など、該当の投与態
様に合わせて調合すればよい。このような薬剤中に使用されるキャリヤは生体適合性であり、生物分解性であ
ってもよい。或る実施例では、活性成分の放出レベルが比較的一定となるように
調合することが好ましい。しかし、他の実施例では、投与と同時に比較的迅速に
放出することが好ましい。このような薬剤の調合は公知技術を使用する当業者の
レベルで充分可能である。この点で有用なキャリヤとしては、ポリ（ラクチド-
コ-グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、でんぷん、セルロース、デ
クストランなどの微粒子が挙げられる。抑制放出キャリヤとしては、非流動性親
水コア（例えば架橋多糖類またはオリゴ糖）および必要に応じてリン脂質のよう
な両親媒性化合物からなる外層を含む超分子バイオベクターが挙げられる（米国
特許第5,151,254号およびPCT出願WO94・20078号、WO94/23701号およびWO96/0663
8号を参照）。抑制放出調合物に含まれる活性化合物の量は、着床部位、放出速
度および放出時間および治療または予防すべき状態の性質に応じて異なる。他の実施例では、本発明の薬剤のキャリヤとして、生物分解性ミクロスフェア
（例えば、ポリアクテートポリグリコレート）を使用する。適当な生物分解性
ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号；5,075,109号；5,928,647
号；5,811,128号；5,820,883号；5,853,763号；5,814,344号；5,407,609号およ
び5,942,252号に開示されている。WO99/40934号に開示され、本願明細書にも参
考として引用している変性B型肝炎コアタンパク質キャリヤ系も種々の用途に好
適である。他のキャリヤ／デリバリ系は米国特許第5,928,647号に開示されてい
るような顆粒タンパク質複合体を使用し、この複合体は宿主におけるクラスI-被
制限細胞毒Tリンパ球応答を誘発することがある。本発明の薬剤は多くの場合、1種または2種以上の緩衝液（例えば、中性緩衝食
塩水または燐酸塩緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、
スクロースまたはデクストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドま
たはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、静菌剤、EDTAまたはグルタチオ
ンのようなキレート剤、助剤（例えば、水酸化アンモニウム）、患者の血液で調
剤を等張、高張、または劣張化する溶質、懸濁化剤、濃縮剤および／または保存
剤をも含む。本発明の薬剤は凍結乾燥物として調合することもできる。本発明の薬剤は密閉アンプルまたは密閉水薬びんのような1回服用分または複
数回服用分の容器で提供される。このような容器は使用まで無菌性と安定性を維
持するように密閉される。一般に、調剤は油性または水性ビークル中の懸濁液、
溶液またはエマルジョンの形態で保存される。凍結乾燥状態で保存され、使用の
直前に無菌液を添加するだけでよい形態も可能である。特定の薬剤を使用するため、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内投与に適
した調合を行うことは既に種々開発されており、その幾つかを以下に説明する。用途によっては、本発明の薬剤を経口方式で動物に投与することができる。そ
の場合、これらの薬剤を不活性希釈剤または同化可能な食用キャリヤで調剤する
か、または硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤
にするか、または食品と直接組合わせることができる。活性化合物を賦形剤と組合せ、錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシ
ル、懸濁液、シロップ、ウェハーなどの形態で使用できる（例えば、Mathiwits
et al., Nature 1997 Mar 27；386（6623)：410-4；Hwang et al., Crit Rev Th
er drug Carrier Syst 1998：15（3)-243-84；米国特許第5,641,515号；米国特
許第5,580,579号および米国特許第5,792,451号を参照）。錠剤、トローチ、ピル
、カプセルなどは種々の助剤、例えば、トラガカント、アカシア、コーンスター
チ、ゼラチンのようなバインダー；燐酸ジカルシウムのような賦形剤；コーンス
ターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような分散剤；ステアリン酸マグネ
シウムのような滑剤；およびスクロース、ラクトース、サッカリンのような甘味
料、またはペパーミント、ウィンターグリーン・オイル、チェリー・フレーバリ
ングのような香料をも含むことができる。服用形態がカプセルである場合、上記
材料の他に、液状キャリヤをも含むことができる。コーティングのため、または
服用形態を物理的に変えるため、他に種々の材料を含むことがある。例えば、錠
剤、ピル、またはカプセルはセラック、糖またはこれら両者でコーティングする
ことがある。当然のことながら、服用形態に関係なく、使用される材料は薬学的
に純粋であり、使用量が実質的に無害でなければならない。多くの場合、これらの調剤は少なくとも約0.1％またはそれ以上の活性化合物
を含有するが、活性成分の％は一様ではなく、調剤全体の重量または容積の約1
または2％から約60％または70％またはそれ以上である。それぞれの治療目的に
有用な薬剤中の活性化合物量は、所与の化合物の1回服用分で必要な摂取量が確
保されるように調合される。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経
路、貯蔵期間、およびその他の薬学的留意点は製薬分野の当業者が熟知であり、
多様な投与および治療方法が望ましい。経口投与の場合、本発明の薬剤は1種または2種以上の賦形剤と組合わせて、う
がい薬、歯磨き剤、口腔剤、吸入剤、舌下錠などの形態に調剤させることができ
る。活性成分を、例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、炭酸水素カリウムを
含む口腔剤に組込んだり、歯磨き剤に組込んだり、水、バインダー、研磨剤、香
料、発泡剤、湿潤剤を含む組成物に治療に有効な量を添加することもできる。舌
下に挟むなど、口腔内で溶かす錠剤または溶液の形態に調剤することもできる。場合によっては、本発明の薬剤を非経口、静脈内、筋肉内または腹腔内投与す
ることが望ましい。このようなアプローチは公知であり、そのいくつかは米国特
許第5,543,158ごうl5,641,515号および5,399,363号に開示されている。或る実施
例では、遊離塩基または薬学的に許容できる塩の形態を取る活性化合物を、ヒド
ロキシプロピルセルロースのような計面活性剤と混合した水溶液として調合する
。グリセロール、液状ポリエチレン・グリコール、およびこれらの混合物及びオ
イル中に分散させる調合も可能である。通常の貯蔵および使用条件下で、これら
の調合物は微生物の生長を防止する保存剤を含むのが普通である。注射用の形態としては、無菌の水溶液または水性ぶんさん液またはその場でこ
のような無菌の注射用水溶液または水性分散液を調製できる無菌粉末（例えば、
米国特許第5,466,468号参照）がある。いずれの場合でも、無菌でなければなら
ず、容易に注射できるだけの流動性が必要である。製造および貯蔵の段階におい
て、安定であり、細菌や黴のような微生物の汚染作用から保護されねばならない
。キャリヤは水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレン・グリコ
ールなど）これらの適当な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または
分散媒であればよい。レシチンのようなコーティングを利用するか、分散液の場
合なら必要な粒度を維持するか、および／または界面活性剤を使用することによ
って適正な流動性を維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤およ
び抗真菌剤、例えば、パラベンス、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸
、チメロサールなどによって容易に防止できる。多くの場合、糖または塩化ナト
リウムのような等張剤を含むことが好ましい。注射薬のを長く吸収させるために
は、吸収を遅らせる、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのよう
な吸収遅延剤を含有させればよい。非経口投与水溶液の形態を取る実施例では、必要に応じて溶液を適当に緩衝し
、希釈液を先ず充分な量の食塩水またはグルコースで等張化する。このような水
溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに使用で
きる無菌水性媒は本発明の開示内容に照らして当業者が容易に理解するところで
ある。例えば、1回分を1mlの等張NaCl溶液中に溶解させ、1000mlの皮下注入液に
添加するか、または所定の注入部位に注入する（例えば、“REMINGTON's Pharma
ceutical Sciences"15th Edition, pp1035-1038および1570-1580）。患者の状態
に応じて、投与量をある程度変化させる必要がある。また、ヒトに投与する場合
、当然のことながら、食品医薬品局の生物製剤基準部が定める無菌性、発熱性、
その他一般的な安全性と純粋性の基準を満たさねばならない。本発明の他の実施例では、薬剤を中性または塩形態に調合する。医薬として許
容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸添加塩があ
り、この塩は塩化水素酸または燐酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸酒石
酸、マンデル酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される
塩は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウ
ム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピル
アミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導できる。調合
を終えたら溶液は投与形態に適合した態様で、且つ治療目的に適った量が投与さ
れる。キャリヤは溶媒、分散媒、ビークル、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真
菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、緩衝液、キャリヤ溶液、懸濁液、コロイドなどを
も含む。薬剤として活性の物質にこれらの媒質や作用剤を使用することは公知で
ある。公知の媒質または作用剤が活性成分と不適合でない限り、治療剤剤中に使
用することができる。構成要素に補足的な活性成分を組込むことも可能である。
尚、“薬剤として許容可能な"とは、ヒトに投与した場合、アレルギーなどのよ
うな有害な反応を発生させない分子および組成物を意味する。或る実施例では、薬剤を鼻腔内スプレー、吸入および／またはその他のエアロ
ゾル投与ビークルによって投与することができる。遺伝子、核酸およびペプチド
を鼻腔エアロゾルスプレーを介して直接肺へ投与する方法は、例えば、米国特許
第5,756,353号および5,804,212号に開示されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂
を利用して薬剤を投与する方式（Takenaga et al.,J Controlled Release 1998
Mar 2；52（1-2)：81-7）およびリソホスファチジル-グリセロール化合物（米国
特許第5,725,871号）も公知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持
マトリックスの形態で粘膜を介して薬剤を投与する方式も米国特許第5,780,045
号に開示されている。或る実施例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子,気胞などを
利用して、本発明の薬剤を適当な宿主細胞／器官に導入する。特に、本発明の薬
剤は脂質粒子、リポソーム、気胞、ナノスフェア、ナノ粒子などに封入して投与
するように調合することができる。あるいは、共有または非共有の形でキャリヤ
・ビークルの表面に結合させることもできる。有望なキャリヤとしてのリポソームおよびリポソーム状剤の形成および利用は
当業者に公知である（例えば、Lasic,Trends Biotechol 1998 Jul；16（7)：307
-21；Takakura,Nippon Rinsho 1998 Mar；56（3)：691-5；Chandran et al.,Ind
ian J Exp Biol.1997 Aug；35（8)：801-9；Margalit, Crit Rev Ther Drug Car
rier Syst. 1995；12（2-3)：233-61；参考のため本願明細書中に引用した米国
特許第5,567,434号；米国特許第5,795,587号）。リポソームを他の方法ではトランスフェクションが困難な多くの種類の細胞、
例えば、T細胞懸濁液、1次肝細胞菌株、PC12細胞と併用して成功を収めている（
Renneisen et al.,J Biol Chem.1990 Sep 25；265（27)：16337-42；Muller et
al.,DNA Cell Biol. 1990 Apr；9（3)：221-9）。さらにまた、リポソームはウ
ィルス-ベース投与系に典型のDNA長さの制約がない。遺伝子、種々の薬剤、放射
線治療剤、酵素、ウィルス、転写調節因子、アロステリック・エフェクタなどを
種々の培養細胞系および動物に導入するために利用され、成功を収めている。ま
た、リポソームの使用が自己免疫反応や由々しき中毒事故の要因となるとは考え
られない。或る実施例では、リン脂質を水性媒中に分散させ、自然発生的に多層同心二重
気胞（多層気胞（MLVs）とも呼称される）を発生させることによってリポソーム
を形成する。他の実施例では、本発明の薬剤の、薬剤として許容可能なナノカプセル調剤を
可能にする。一般に、ナノカプセルは薬剤を安定且つ再生可能に封入することが
できる（例えば、Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pham. 1998 Dec；
24（12)：1113-28参照）。細胞内重合過負荷に起因する副作用を回避するため、
ポリマーを利用してこの超微粒子（約0.1μm）を生体内で分解できるようにする
。この粒子の製法は、例えば、Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier
Syst. 1988；5（1)：1-20；Muhlen et al., Eur J Pharm Biopham. 1998 Mar；4
5（2)：149-55；Zambaux et al.,J Controlled Release 1998 Jan 2；50（1-3)
：31-40；oyobi米国特許第5,145,684号に開示されている。癌の治療方法本発明の別の観点として、上記薬剤を癌、特に前立腺癌の免疫治療に利用する
ことができる。この治療方法では、上記薬剤を、典型的には温血動物、好ましく
はヒトに投与する。患者は癌に罹っていてもいなくてもよい。即ち、上記薬剤を
使用することによって、癌の発生を防止するか、または癌患者を治療することが
できる。原発腫瘍の外科的切除および／または放射線治療または従来の化学的治
療剤投与の前後に薬剤およびワクチンを投与する。上述したように、薬剤の投与
は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所、経口など、
適宜の方法で投与すればよい。或る実施例では、免疫療法は内因性宿主免疫システムをの生体内刺激に依存す
る積極的な免疫療法であり、免疫反応変性剤（例えば、ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチド）の投与で腫瘍を抑制するというものである。他の実施例では、免疫療法は、直接または間接的に抗腫瘍作用を仲介し、必ず
しも無傷の宿主免疫システムに依存しない、定評のある腫瘍免疫反応性を有する
薬剤（エフェクタ細胞または抗体）を投与する消極的な免疫療法である。エフェ
クタ細胞の例としては、上記T細胞、Tリンパ球（CD8⁺細胞毒Tリンパ球およびCD4⁺ T-ヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（Natural Killer細胞およびリン
パ球活性化キラー細胞）、B細胞およびポリペプチドを発現する抗原提示細胞（
樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。養子免疫療法のためには、ポリ
ペプチドに特異なT細胞レセプタおよび抗体レセプタをクローニングし、発現さ
せて、他のベクターまたはエフェクタ細胞に移行させればよい。消極的免疫療法
では、抗体または抗イディオタイプの抗体を発生させるためにもポリペプチドを
利用することができる（米国特許第4,918,164号参照）。エフェクタ細胞は、試験管内培養によって養子免疫療法に充分な量を得ること
ができる。単一の抗原特異性エフェクタ細胞を数十億個にまで増殖させて、生体
内での抗原認識を可能にする培養条件は公知である。このような試験管内培養条
件としては、多くの場合、シトカイン（例えば、IL-2）および非分割支持細胞の
存在において、間歇的な抗原による刺激が利用される。上述したように、免疫反
応性のポリペプチドを利用することによって抗原特異性T細胞菌株を急速に増殖
させ、免疫療法に必要な細胞数を発生させることができる。具体的には、公知の
技術で、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞および／またはB細胞の
ような抗原提示細胞を免疫反応性ポリペプチドでパルス処理するか、または1種
または2種以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトすればよい。例えば、抗
原提示細胞に、組換えウィルスまたは他の発現システムでの発現を促進するのに
好適なプロモータを有するポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができ
る。療法に使用するため培養されるエフェクタ細胞は成長して広く分布し、長期
にわたって生体内に生存できなければならない。研究結果によれば、培養された
エフェクタ細胞を生体内で成長させ、IL-2で補足される抗原による刺激を繰返す
ことで、長期に亙って多数のエフクタ細胞を生存させることができる（例えば、
Cheever et al.,Immunological Reviews 157：177,1997）ポリペプチドを発現するベクターを患者から採取された抗原提示細胞に導入し
、生体外でのクローニング処理で増殖させ、これを再び同じ患者に移植すること
ができる。公知の手段で、好ましくは無菌の状態で、静脈内、腔内、腹腔内また
は腫瘍内投与で患者に再導入することができる。治療薬の投与経路、頻度および用量は個々の患者に応じて異なり、標準的な技
術によって容易に決定することができる。一般に、薬剤やワクチンは注射（例え
ば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸入）または経
口で投与される。好ましくは、1ヶ月間隔で6回投与し、その後、ブースタワクチ
ン投与を行う。個々の患者にはそれぞれ異なるプロトコルが適切な場合がある。
投与した時に、抗腫瘍免疫反応を促進することができ、少なくとも（治療前に比
較して）10−50％レベルアップすれば、それが適量である。免疫反応は患者の抗
腫瘍抗体を測定するか、または試験管内で患者の腫瘍細胞を殺すことができる細
胞溶解性エフェクタ細胞の、ワクチンによる発生によってモニターすることがで
きる。このようなワクチンは免疫反応を起こさせ、ワクチンを投与されない患者
よりも臨床転帰を改善させることが可能でなければならない。（例えば、回復が
早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）。一般に、1種また
は2種以上のポリペプチドを含む薬剤およびワクチンでは、1回の投与量中に存在
する各ポリペプチドの量は宿主体重1kg当り約25μg〜5mgである。適量は患者の
サイズに応じて異なるが、約0.1mL〜約5mLが普通である。一般に、投与量と治療方法が妥当であるためには、治療および／または予防効
果を発揮するに充分な量の活性化合物が投与されねばならない。このような効果
はワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰が改善されている（例えば、回復
が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）ことでモニターす
ることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫反応は改善された臨床転帰
と相関する。このような免疫反応は治療の前後に患者から得られたサンプルを使
用して行われる標準的な増殖、細胞毒性またはサイトカイン分析によって評価す
ることができる。癌検出・診断のための薬剤、方法及びキッ一般に、患者から得られる生体サンプル（例えば、血液、血清、痰および／ま
たは腫瘍組織）中の、1つまたは2つ以上の前立腺腫瘍タンパク質および／または
このようなタンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者の
癌を検出することができる。換言すれば、このようなタンパク質をマーカーとし
て利用することによって前立腺癌のような癌の有無を検出できる。このようなタ
ンパク質はその他の癌の検出にも役立つ。一般に、本発明の結合剤は、生体サン
プル中の結合剤に結合する抗原のレベル検出を可能にする。ポリヌクレオチド・
プライマーおよびプローブを利用することによって、腫瘍タンパク質を符号化す
るmRNAレベルを検出することができ、癌の有無をも示唆する。一般に、前立腺腫
瘍配列は正常組織よりも3倍以上のレベルで存在する。サンプル中のポリペプチド・マーカーを検出するのに結合剤を使用する種々の
分析方法は当業者に公知である。例えば、Harlow and Lane,Antibodies：A labo
ratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory,1988を参照されたい。一般に、
患者における癌の有無は(a)患者から得られた生体サンプルを結合と接触させ；(
b)サンプル中の、結合剤と結合するポリペプチドのレベルを測定し；(c)ポリペ
プチドのレベルを所定の合格値と比較することによって判定できる。好ましい実施例では、この分析において、固形支持材に固定した結合剤を使用
し、これにポリペプチドを結合させ、サンプルの残余の部分から取り除く。結合
しているポリペプチドを検出するため、リポーター・グループを含有し、結合剤
／ポリペプチドと特異的に結合する検出試薬を使用する。検出試薬は、例えば、
ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する結合剤またはこの結合剤と特異的に
結合する抗免疫グロブリン、Gタンパク質、Aタンパク質またはレクチンなどであ
る。或いは、ポリペプチドをリポーター・グループで標識し、結合剤をサンプル
と共にインキュベートした後、固定結合剤に結合させる、競合アッセイを利用す
ることもできる。この分析に使用できるポリペプチドとしては、完全長前立腺腫
瘍タンパク質および、上記のように結合剤が結合するポリペプチド部分が挙げら
れる。固形支持材は、腫瘍タンパク質を付着させることができるなら、公知のいかな
る材料であってもよい。例えば、マイクロタイタープレートのテスト・ウェル、
ニトロセルロースなどのような膜を利用できる。ガラス、ファイバーグラス、ラ
テックス、またはポリスチレン、ポリ塩化ビニルのようなプラスチック材からな
るビーズやディスクでもよい。さらには、米国特許第5,359,681号に開示されて
いるような磁気粒子はファイバーオプチック・センサーでもよい。結合剤を固形
支持材に固定するには、特許文献などに数多く記載されている種々の公知技術を
利用すればよい。本発明において、“固定"とは吸着のような非共有結合と（結
合剤と支持材の官能基との間の直接的なリンケージまたは架橋剤を介してのリン
ケージである）共有結合との双方を含む。マイクロタイタープレートのウェルま
たは膜への吸着による固定が好ましい。この場合、適当な緩衝液中で結合剤を、
適当な時間に亙って固形支持材と接触させることで吸着が得られる。接触時間は
温度にも左右されるが、典型的には約1時間〜約1日である。一般に、（ポリスチ
レンやポリ塩化ビニルのような）プラスチック製マイクロタイターのウェルを、
約10ng〜約10μg、好ましくは約100ng〜約1μgの結合剤と接触させれば、充分な
量の結合剤を固定することができる。結合剤を固形支持材に共有結合させるには、支持材とも結合剤のヒドロキシル
またはアミノ基とも反応する二元機能試薬と支持材とを反応させることによって
達成される。例えば、ベンゾキノンを使用するか、または支持材のアルデヒド基
を結合パートナーの活性水素と縮合することによって、結合剤を、適当なポリマ
ー・コーティングを有する支持材と共有結合させることができる（Pierce Immun
otechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13）。或る実施例では、2抗体サンドイッチ方式分析を採用する。この分析法では、
マイクロタイター・プレートのような固形支持材に固定された抗体を、サンプル
と接触させることによって、サンプル中のポリペプチドを固定抗体と結合させる
。結合しなかったサンプルを、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除去し
、リポーター・グループを含む検出試薬（好ましくはポリペプチドの異なる部位
に結合できる第2抗体）を添加する。固形支持材と結合したままの検出試薬量を
、特定リポーター・グループに適した方法を利用して測定する。具体的には、上記のように抗体を支持材に固定したら、支持材上の残余のタン
パク質結合部位をブロックする。ブロック剤は公知のものでよく、例えば、ウシ
血清アルブミンまたはTween20（商標）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）
などがある。次いで、固定された抗体をサンプルと一緒にインキュベートし、ポ
リペプチドを抗体と結合させる。インキュベーションに先立って、サンプルを燐
酸塩緩衝食塩水（PBS）のような適当な希釈剤で希釈する。一般に、好適な接触
時間（即ち、インキュベーション時間）は前立腺癌のある個人から得られたサン
プル中のポリペプチドの存在を検出するのに充分な時間である。接触時間は結合
および非結合ポリペプチド間の平衡が少なくとも約95％となる結合レベルを達成
するのに充分な時間であることが好ましい。当業者には明らかなように、平衡を
達成するのに必要な時間は、一定時間に亙って起こる結合レベルを評価すること
によって容易に測定できる。次いで、例えば、0.1％Tween20（商標）を含有するPBSのような適当な緩衝液
で固形支持材を洗浄することによって非結合サンプルを除去する。リポーター・
グループを含有する第2抗体を固形支持材に加える。好ましリポーター・グルー
プは上述したようなものである。次に、結合ポリペプチドを検出するのに充分な時間に亙って、検出試薬を、固
定された抗体-ポリペプチド複合体と一緒にインキュベートする。検出に適当な
時間は、一定時間に亙って起こる結合のレベルを評価することによって決定する
ことができる。次いで、結合しなかった検出試薬を除去し、結合した検出試薬を
、リポーター・グループを利用して検出する。一般に、APCsに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）を
トランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原
性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション
処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願
明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状または
その他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与すること
によって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。

【０３３６】例えば樹状細胞の生体内および生体外トランスフェクション処理は、WO97/244
47に記載されているような公知の方法で、またはMahvi et alがImmunology and
cell Biology75：456-460（1997）に記述している遺伝子銃アプローチを利用し
て行うことができる。

【０３３７】樹状細胞の抗原ローディングは樹状細胞または前駆細胞を腫瘍ポリペプチド、
DNA（そのまま、またはプラスミドベクターに挿入して）またはRNAと一緒に；ま
たは抗原発現組換え細菌またはウィルス（例えばワクシニア、鶏痘ウィルス、ア
デノウィルスまたはレンチウィルスベクター）と一緒にインキュベートすること
によって達成される。ローディングに先立ち、ポリペプチドを、（例えばキャリ
ヤ分子のような）T細胞ヘルプを提供する免疫パートナーと共有結合させる。あ
るいは、ポリペプチドとは別に、またはポリペプチドの存在において、樹状細胞
を非共有結合免疫パートナーでパルス処理してもよい。

【０３３８】本発明の薬剤には、当業者に公知の適当なキャリヤを使用できるが、キャリヤ
のタイプは投与態様に応じて異なるのが普通である。本発明の薬剤は局所、経口
、経鼻腔、経粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、筋肉内など、該当の投与態
様に合わせて調合すればよい。

【０３３９】このような薬剤中に使用されるキャリヤは生体適合性であり、生物分解性であ
ってもよい。或る実施例では、活性成分の放出レベルが比較的一定となるように
調合することが好ましい。しかし、他の実施例では、投与と同時に比較的迅速に
放出することが好ましい。このような薬剤の調合は公知技術を使用する当業者の
レベルで充分可能である。この点で有用なキャリヤとしては、ポリ（ラクチド-
コ-グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、でんぷん、セルロース、デ
クストランなどの微粒子が挙げられる。

【０３４０】抑制放出キャリヤとしては、非流動性親水コア（例えば架橋多糖類またはオリ
ゴ糖）および必要に応じてリン脂質のような両親媒性化合物からなる外層を含む
超分子バイオベクターが挙げられる（米国特許第5,151,254号およびPCT出願WO94
・20078号、WO94/23701号およびWO96/06638号を参照）。抑制放出調合物に含ま
れる活性化合物の量は、着床部位、放出速度および放出時間および治療または予
防すべき状態の性質に応じて異なる。

【０３４１】他の実施例では、本発明の薬剤のキャリヤとして、生物分解性ミクロスフェア
（例えば、ポリアクテートポリグリコレート）を使用する。適当な生物分解性
ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号；5,075,109号；5,928,647
号；5,811,128号；5,820,883号；5,853,763号；5,814,344号；5,407,609号およ
び5,942,252号に開示されている。WO99/40934号に開示され、本願明細書にも参
考として引用している変性B型肝炎コアタンパク質キャリヤ系も種々の用途に好
適である。他のキャリヤ／デリバリ系は米国特許第5,928,647号に開示されてい
るような顆粒タンパク質複合体を使用し、この複合体は宿主におけるクラスI-被
制限細胞毒Tリンパ球応答を誘発することがある。

【０３４２】本発明の薬剤は多くの場合、1種または2種以上の緩衝液（例えば、中性緩衝食
塩水または燐酸塩緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、
スクロースまたはデクストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドま
たはアミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、静菌剤、EDTAまたはグルタチオ
ンのようなキレート剤、助剤（例えば、水酸化アンモニウム）、患者の血液で調
剤を等張、高張、または劣張化する溶質、懸濁化剤、濃縮剤および／または保存
剤をも含む。本発明の薬剤は凍結乾燥物として調合することもできる。

【０３４３】本発明の薬剤は密閉アンプルまたは密閉水薬びんのような1回服用分または複
数回服用分の容器で提供される。このような容器は使用まで無菌性と安定性を維
持するように密閉される。一般に、調剤は油性または水性ビークル中の懸濁液、
溶液またはエマルジョンの形態で保存される。凍結乾燥状態で保存され、使用の
直前に無菌液を添加するだけでよい形態も可能である。特定の薬剤を使用するため、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内投与に適
した調合を行うことは既に種々開発されており、その幾つかを以下に説明する。

【０３４４】用途によっては、本発明の薬剤を経口方式で動物に投与することができる。そ
の場合、これらの薬剤を不活性希釈剤または同化可能な食用キャリヤで調剤する
か、または硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入するか、または圧縮して錠剤
にするか、または食品と直接組合わせることができる。活性化合物を賦形剤と組合せ、錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシ
ル、懸濁液、シロップ、ウェハーなどの形態で使用できる（例えば、Mathiwits
et al., Nature 1997 Mar 27；386（6623)：410-4；Hwang et al., Crit Rev Th
er drug Carrier Syst 1998：15（3)-243-84；米国特許第5,641,515号；米国特
許第5,580,579号および米国特許第5,792,451号を参照）。

【０３４５】錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは種々の助剤、例えば、トラガカント、
アカシア、コーンスターチ、ゼラチンのようなバインダー；燐酸ジカルシウムの
ような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような分散
剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑剤；およびスクロース、ラクトース、
サッカリンのような甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン・オイル
、チェリー・フレーバリングのような香料をも含むことができる。

【０３４６】服用形態がカプセルである場合、上記材料の他に、液状キャリヤをも含むこと
ができる。コーティングのため、または服用形態を物理的に変えるため、他に種
々の材料を含むことがある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルはセラック、
糖またはこれら両者でコーティングすることがある。当然のことながら、服用形
態に関係なく、使用される材料は薬学的に純粋であり、使用量が実質的に無害で
なければならない。

【０３４７】多くの場合、これらの調剤は少なくとも約0.1％またはそれ以上の活性化合物
を含有するが、活性成分の％は一様ではなく、調剤全体の重量または容積の約1
または2％から約60％または70％またはそれ以上である。それぞれの治療目的に
有用な薬剤中の活性化合物量は、所与の化合物の1回服用分で必要な摂取量が確
保されるように調合される。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経
路、貯蔵期間、およびその他の薬学的留意点は製薬分野の当業者が熟知であり、
多様な投与および治療方法が望ましい。

【０３４８】経口投与の場合、本発明の薬剤は1種または2種以上の賦形剤と組合わせて、う
がい薬、歯磨き剤、口腔剤、吸入剤、舌下錠などの形態に調剤させることができ
る。活性成分を、例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、炭酸水素カリウムを
含む口腔剤に組込んだり、歯磨き剤に組込んだり、水、バインダー、研磨剤、香
料、発泡剤、湿潤剤を含む組成物に治療に有効な量を添加することもできる。舌
下に挟むなど、口腔内で溶かす錠剤または溶液の形態に調剤することもできる。

【０３４９】場合によっては、本発明の薬剤を非経口、静脈内、筋肉内または腹腔内投与す
ることが望ましい。このようなアプローチは公知であり、そのいくつかは米国特
許第5,543,158号、l5,641,515号および5,399,363号に開示されている。或る実施
例では、遊離塩基または薬学的に許容できる塩の形態を取る活性化合物を、ヒド
ロキシプロピルセルロースのような計面活性剤と混合した水溶液として調合する
。グリセロール、液状ポリエチレン・グリコール、およびこれらの混合物及びオ
イル中に分散させる調合も可能である。通常の貯蔵および使用条件下で、これら
の調合物は微生物の生長を防止する保存剤を含むのが普通である。

【０３５０】注射用の形態としては、無菌の水溶液または水性ぶんさん液またはその場でこ
のような無菌の注射用水溶液または水性分散液を調製できる無菌粉末（例えば、
米国特許第5,466,468号参照）がある。いずれの場合でも、無菌でなければなら
ず、容易に注射できるだけの流動性が必要である。製造および貯蔵の段階におい
て、安定であり、細菌や黴のような微生物の汚染作用から保護されねばならない
。キャリヤは水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレン・グリコ
ールなど）これらの適当な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または
分散媒であればよい。

【０３５１】レシチンのようなコーティングを利用するか、分散液の場合なら必要な粒度を
維持するか、および／または界面活性剤を使用することによって適正な流動性を
維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば
、パラベンス、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど
によって容易に防止できる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムのような等張
剤を含むことが好ましい。注射薬のを長く吸収させるためには、吸収を遅らせる
、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を含有
させればよい。

【０３５２】非経口投与水溶液の形態を取る実施例では、必要に応じて溶液を適当に緩衝し
、希釈液を先ず充分な量の食塩水またはグルコースで等張化する。このような水
溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに使用で
きる無菌水性媒は本発明の開示内容に照らして当業者が容易に理解するところで
ある。例えば、1回分を1mlの等張NaCl溶液中に溶解させ、1000mlの皮下注入液に
添加するか、または所定の注入部位に注入する（例えば、“REMINGTON's Pharma
ceutical Sciences"15th Edition, pp1035-1038および1570-1580）。患者の状態
に応じて、投与量をある程度変化させる必要がある。また、ヒトに投与する場合
、当然のことながら、食品医薬品局の生物製剤基準部が定める無菌性、発熱性、
その他一般的な安全性と純粋性の基準を満たさねばならない。

【０３５３】本発明の他の実施例では、薬剤を中性または塩形態に調合する。医薬として許
容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸添加塩があ
り、この塩は塩化水素酸または燐酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸酒石
酸、マンデル酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される
塩は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウ
ム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピル
アミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導できる。調合
を終えたら溶液は投与形態に適合した態様で、且つ治療目的に適った量が投与さ
れる。

【０３５４】キャリヤは溶媒、分散媒、ビークル、コーティング、希釈剤、抗菌および抗真
菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、緩衝液、キャリヤ溶液、懸濁液、コロイドなどを
も含む。薬剤として活性の物質にこれらの媒質や作用剤を使用することは公知で
ある。公知の媒質または作用剤が活性成分と不適合でない限り、治療剤剤中に使
用することができる。構成要素に補足的な活性成分を組込むことも可能である。
尚、“薬剤として許容可能な"とは、ヒトに投与した場合、アレルギーなどのよ
うな有害な反応を発生させない分子および組成物を意味する。

【０３５５】或る実施例では、薬剤を鼻腔内スプレー、吸入および／またはその他のエアロ
ゾル投与ビークルによって投与することができる。遺伝子、核酸およびペプチド
を鼻腔エアロゾルスプレーを介して直接肺へ投与する方法は、例えば、米国特許
第5,756,353号および5,804,212号に開示されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂
を利用して薬剤を投与する方式（Takenaga et al.,J Controlled Release 1998
Mar 2；52（1-2)：81-7）およびリソホスファチジル-グリセロール化合物（米国
特許第5,725,871号）も公知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持
マトリックスの形態で粘膜を介して薬剤を投与する方式も米国特許第5,780,045
号に開示されている。

【０３５６】或る実施例では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子,気胞などを
利用して、本発明の薬剤を適当な宿主細胞／器官に導入する。特に、本発明の薬
剤は脂質粒子、リポソーム、気胞、ナノスフェア、ナノ粒子などに封入して投与
するように調合することができる。あるいは、共有または非共有の形でキャリヤ
・ビークルの表面に結合させることもできる。

【０３５７】有望なキャリヤとしてのリポソームおよびリポソーム状剤の形成および利用は
当業者に公知である（例えば、Lasic,Trends Biotechol 1998 Jul；16（7)：307
-21；Takakura,Nippon Rinsho 1998 Mar；56（3)：691-5；Chandran et al.,Ind
ian J Exp Biol.1997 Aug；35（8)：801-9；Margalit, Crit Rev Ther Drug Car
rier Syst. 1995；12（2-3)：233-61；参考のため本願明細書中に引用した米国
特許第5,567,434号；米国特許第5,795,587号）。

【０３５８】リポソームを他の方法ではトランスフェクションが困難な多くの種類の細胞、
例えば、T細胞懸濁液、1次肝細胞菌株、PC12細胞と併用して成功を収めている（
Renneisen et al.,J Biol Chem.1990 Sep 25；265（27)：16337-42；Muller et
al.,DNA Cell Biol. 1990 Apr；9（3)：221-9）。さらにまた、リポソームはウ
ィルス-ベース投与系に典型のDNA長さの制約がない。遺伝子、種々の薬剤、放射
線治療剤、酵素、ウィルス、転写調節因子、アロステリック・エフェクタなどを
種々の培養細胞系および動物に導入するために利用され、成功を収めている。ま
た、リポソームの使用が自己免疫反応や由々しき中毒事故の要因となるとは考え
られない。

【０３５９】或る実施例では、リン脂質を水性媒中に分散させ、自然発生的に多層同心二重
気胞（多層気胞（MLVs）とも呼称される）を発生させることによってリポソーム
を形成する。

【０３６０】他の実施例では、本発明の薬剤の、薬剤として許容可能なナノカプセル調剤を
可能にする。一般に、ナノカプセルは薬剤を安定且つ再生可能に封入することが
できる（例えば、Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pham. 1998 Dec；
24（12)：1113-28参照）。細胞内重合過負荷に起因する副作用を回避するため、
ポリマーを利用してこの超微粒子（約0.1μm）を生体内で分解できるようにする
。この粒子の製法は、例えば、Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier
Syst. 1988；5（1)：1-20；Muhlen et al., Eur J Pharm Biopham. 1998 Mar；4
5（2)：149-55；Zambaux et al.,J Controlled Release 1998 Jan 2；50（1-3)
：31-40；oyobi米国特許第5,145,684号に開示されている。

【０３６１】癌の治療方法本発明の別の観点として、上記薬剤を癌、特に前立腺癌の免疫治療に利用する
ことができる。この治療方法では、上記薬剤を、典型的には温血動物、好ましく
はヒトに投与する。患者は癌に罹っていてもいなくてもよい。即ち、上記薬剤を
使用することによって、癌の発生を防止するか、または癌患者を治療することが
できる。原発腫瘍の外科的切除および／または放射線治療または従来の化学的治
療剤投与の前後に薬剤およびワクチンを投与する。上述したように、薬剤の投与
は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所、経口など、
適宜の方法で投与すればよい。

【０３６２】或る実施例では、免疫療法は内因性宿主免疫システムをの生体内刺激に依存す
る積極的な免疫療法であり、免疫反応変性剤（例えば、ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチド）の投与で腫瘍を抑制するというものである。

【０３６３】他の実施例では、免疫療法は、直接または間接的に抗腫瘍作用を仲介し、必ず
しも無傷の宿主免疫システムに依存しない、定評のある腫瘍免疫反応性を有する
薬剤（エフェクタ細胞または抗体）を投与する消極的な免疫療法である。エフェ
クタ細胞の例としては、上記T細胞、Tリンパ球（CD8⁺細胞毒Tリンパ球およびCD4⁺ T-ヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（Natural Killer細胞およびリン
パ球活性化キラー細胞）、B細胞およびポリペプチドを発現する抗原提示細胞（
樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。

【０３６４】養子免疫療法のためには、ポリペプチドに特異なT細胞レセプタおよび抗体レ
セプタをクローニングし、発現させて、他のベクターまたはエフェクタ細胞に移
行させればよい。消極的免疫療法では、抗体または抗イディオタイプの抗体を発
生させるためにもポリペプチドを利用することができる（米国特許第4,918,164
号参照）。

【０３６５】エフェクタ細胞は、試験管内培養によって養子免疫療法に充分な量を得ること
ができる。単一の抗原特異性エフェクタ細胞を数十億個にまで増殖させて、生体
内での抗原認識を可能にする培養条件は公知である。このような試験管内培養条
件としては、多くの場合、シトカイン（例えば、IL-2）および非分割支持細胞の
存在において、間歇的な抗原による刺激が利用される。上述したように、免疫反
応性のポリペプチドを利用することによって抗原特異性T細胞菌株を急速に増殖
させ、免疫療法に必要な細胞数を発生させることができる。

【０３６６】具体的には、公知の技術で、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞お
よび／またはB細胞のような抗原提示細胞を免疫反応性ポリペプチドでパルス処
理するか、または1種または2種以上のポリヌクレオチドをトランスフェクトすれ
ばよい。例えば、抗原提示細胞に、組換えウィルスまたは他の発現システムでの
発現を促進するのに好適なプロモータを有するポリヌクレオチドをトランスフェ
クトすることができる。

【０３６７】療法に使用するため培養されるエフェクタ細胞は成長して広く分布し、長期に
わたって生体内に生存できなければならない。研究結果によれば、培養されたエ
フェクタ細胞を生体内で成長させ、IL-2で補足される抗原による刺激を繰返すこ
とで、長期に亙って多数のエフクタ細胞を生存させることができる（例えば、Ch
eever et al.,Immunological Reviews 157：177,1997）

【０３６８】ポリペプチドを発現するベクターを患者から採取された抗原提示細胞に導入し
、生体外でのクローニング処理で増殖させ、これを再び同じ患者に移植すること
ができる。公知の手段で、好ましくは無菌の状態で、静脈内、腔内、腹腔内また
は腫瘍内投与で患者に再導入することができる。

【０３６９】治療薬の投与経路、頻度および用量は個々の患者に応じて異なり、標準的な技
術によって容易に決定することができる。一般に、薬剤やワクチンは注射（例え
ば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸入）または経
口で投与される。好ましくは、1ヶ月間隔で6回投与し、その後、ブースタワクチ
ン投与を行う。個々の患者にはそれぞれ異なるプロトコルが適切な場合がある。
投与した時に、抗腫瘍免疫反応を促進することができ、少なくとも（治療前に比
較して）10−50％レベルアップすれば、それが適量である。

【０３７０】免疫反応は患者の抗腫瘍抗体を測定するか、または試験管内で患者の腫瘍細胞
を殺すことができる細胞溶解性エフェクタ細胞の、ワクチンによる発生によって
モニターすることができる。このようなワクチンは免疫反応を起こさせ、ワクチ
ンを投与されない患者よりも臨床転帰を改善させることが可能でなければならな
い。（例えば、回復が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存
）。一般に、1種または2種以上のポリペプチドを含む薬剤およびワクチンでは、
1回の投与量中に存在する各ポリペプチドの量は宿主体重1kg当り約25μg〜5mgで
ある。適量は患者のサイズに応じて異なるが、約0.1mL〜約5mLが普通である。

【０３７１】一般に、投与量と治療方法が妥当であるためには、治療および／または予防効
果を発揮するに充分な量の活性化合物が投与されねばならない。このような効果
はワクチンを投与されない患者よりも臨床転帰が改善されている（例えば、回復
が早く、完全に、または部分的に、または長期に亙って生存）ことでモニターす
ることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫反応は改善された臨床転帰
と相関する。このような免疫反応は治療の前後に患者から得られたサンプルを使
用して行われる標準的な増殖、細胞毒性またはサイトカイン分析によって評価す
ることができる。

【０３７２】癌検出・診断のための薬剤、方法及びキッ一般に、患者から得られる生体サンプル（例えば、血液、血清、痰および／ま
たは腫瘍組織）中の、1つまたは2つ以上の前立腺腫瘍タンパク質および／または
このようなタンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者の
癌を検出することができる。換言すれば、このようなタンパク質をマーカーとし
て利用することによって前立腺癌のような癌の有無を検出できる。

【０３７３】このようなタンパク質はその他の癌の検出にも役立つ。一般に、本発明の結合
剤は、生体サンプル中の結合剤に結合する抗原のレベル検出を可能にする。ポリ
ヌクレオチド・プライマーおよびプローブを利用することによって、腫瘍タンパ
ク質を符号化するmRNAレベルを検出することができ、癌の有無をも示唆する。一
般に、前立腺腫瘍配列は正常組織よりも3倍以上のレベルで存在する。

【０３７４】サンプル中のポリペプチド・マーカーを検出するのに結合剤を使用する種々の
分析方法は当業者に公知である。例えば、Harlow and Lane,Antibodies：A labo
ratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory,1988を参照されたい。一般に、
患者における癌の有無は(a)患者から得られた生体サンプルを結合と接触させ；(
b)サンプル中の、結合剤と結合するポリペプチドのレベルを測定し；(c)ポリペ
プチドのレベルを所定の合格値と比較することによって判定できる。

【０３７５】好ましい実施例では、この分析において、固形支持材に固定した結合剤を使用
し、これにポリペプチドを結合させ、サンプルの残余の部分から取り除く。結合
しているポリペプチドを検出するため、リポーター・グループを含有し、結合剤
／ポリペプチドと特異的に結合する検出試薬を使用する。検出試薬は、例えば、
ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する結合剤またはこの結合剤と特異的に
結合する抗免疫グロブリン、Gタンパク質、Aタンパク質またはレクチンなどであ
る。或いは、ポリペプチドをリポーター・グループで標識し、結合剤をサンプル
と共にインキュベートした後、固定結合剤に結合させる、競合アッセイを利用す
ることもできる。この分析に使用できるポリペプチドとしては、完全長前立腺腫
瘍タンパク質および、上記のように結合剤が結合するポリペプチド部分が挙げら
れる。

【０３７６】固形支持材は、腫瘍タンパク質を付着させることができるなら、公知のいかな
る材料であってもよい。例えば、マイクロタイタープレートのテスト・ウェル、
ニトロセルロースなどのような膜を利用できる。ガラス、ファイバーグラス、ラ
テックス、またはポリスチレン、ポリ塩化ビニルのようなプラスチック材からな
るビーズやディスクでもよい。さらには、米国特許第5,359,681号に開示されて
いるような磁気粒子はファイバーオプチック・センサーでもよい。結合剤を固形
支持材に固定するには、特許文献などに数多く記載されている種々の公知技術を
利用すればよい。

【０３７７】本発明において、“固定"とは吸着のような非共有結合と（結合剤と支持材の
官能基との間の直接的なリンケージまたは架橋剤を介してのリンケージである）
共有結合との双方を含む。マイクロタイタープレートのウェルまたは膜への吸着
による固定が好ましい。この場合、適当な緩衝液中で結合剤を、適当な時間に亙
って固形支持材と接触させることで吸着が得られる。接触時間は温度にも左右さ
れるが、典型的には約1時間〜約1日である。一般に、（ポリスチレンやポリ塩化
ビニルのような）プラスチック製マイクロタイターのウェルを、約10ng〜約10μ
g、好ましくは約100ng〜約1μgの結合剤と接触させれば、充分な量の結合剤を固
定することができる。

【０３７８】結合剤を固形支持材に共有結合させるには、支持材とも結合剤のヒドロキシル
またはアミノ基とも反応する二元機能試薬と支持材とを反応させることによって
達成される。例えば、ベンゾキノンを使用するか、または支持材のアルデヒド基
を結合パートナーの活性水素と縮合することによって、結合剤を、適当なポリマ
ー・コーティングを有する支持材と共有結合させることができる（Pierce Immun
otechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13）。

【０３７９】或る実施例では、2抗体サンドイッチ方式分析を採用する。この分析法では、
マイクロタイター・プレートのような固形支持材に固定された抗体を、サンプル
と接触させることによって、サンプル中のポリペプチドを固定抗体と結合させる
。結合しなかったサンプルを、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除去し
、リポーター・グループを含む検出試薬（好ましくはポリペプチドの異なる部位
に結合できる第2抗体）を添加する。固形支持材と結合したままの検出試薬量を
、特定リポーター・グループに適した方法を利用して測定する。

【０３８０】具体的には、上記のように抗体を支持材に固定したら、支持材上の残余のタン
パク質結合部位をブロックする。ブロック剤は公知のものでよく、例えば、ウシ
血清アルブミンまたはTween20（商標）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）
などがある。次いで、固定された抗体をサンプルと一緒にインキュベートし、ポ
リペプチドを抗体と結合させる。インキュベーションに先立って、サンプルを燐
酸塩緩衝食塩水（PBS）のような適当な希釈剤で希釈する。

【０３８１】一般に、好適な接触時間（即ち、インキュベーション時間）は前立腺癌のある
個人から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するのに充分な時間で
ある。接触時間は結合および非結合ポリペプチド間の平衡が少なくとも約95％と
なる結合レベルを達成するのに充分な時間であることが好ましい。当業者には明
らかなように、平衡を達成するのに必要な時間は、一定時間に亙って起こる結合
レベルを評価することによって容易に測定できる。

【０３８２】次いで、例えば、0.1％Tween20（商標）を含有するPBSのような適当な緩衝液
で固形支持材を洗浄することによって非結合サンプルを除去する。リポーター・
グループを含有する第2抗体を固形支持材に加える。好ましリポーター・グルー
プは上述したようなものである。

【０３８３】次に、結合ポリペプチドを検出するのに充分な時間に亙って、検出試薬を、固
定された抗体-ポリペプチド複合体と一緒にインキュベートする。検出に適当な
時間は、一定時間に亙って起こる結合のレベルを評価することによって決定する
ことができる。次いで、結合しなかった検出試薬を除去し、結合した検出試薬を
、リポーター・グループを利用して検出する。（115ページ、1行目まで）リポー
ター・グループを検出する方法はリポーター・グループの性質に応じて異なる。

【０３８４】放射性グループならば、シンチレーション・カウントまたはオートラジオグラ
フィが適当である。染料、発光性グループおよび蛍光性グループならば、分光分
析を利用すればよい。ビオチンは異なるリポーター・グループ（通常は放射性ま
たは蛍光性グループまたは酵素）と結合しているアビジンを利用して検出すれば
よい。酵素リポーター・グループは（特定時間に亙って）基質を加え、次いで反
応物質の分光分析またはその他の分析を行うことによって検出するのが普通であ
る。

【０３８５】前立腺癌のような癌の有無を判定するには、固形支持体と結合したままのリポ
ーター・グループから検出される信号を、所定の合格値に相当する信号と比較す
る。好ましい実施例では、癌を検出するための合格値は固定された抗体を癌のな
い患者からのサンプルと一緒にインキュベートする時に得られる平均信号である
。所定の合格値より3標準偏差高い信号を発するサンプルは癌に関して陽性と考
えられる。

【０３８６】他の好ましい実施例では、Sackett et al., Clinical Epidemioloty：A Basic
Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985,p.106-7に記載
の方法に従い、Receiver Operator Curveを利用して合格値を設定する。この実
施例では、診断テスト結果に照らしたそれぞれ妥当と思われる合格値に相当する
複数対の真陽性率（即ち、感度）と偽陽性率（100％-特異度）のプロットから合
格値を算出する。偽陽性率を極力小さくするため合格値をプロットに沿って左へ
ずらし、偽陰性率を極力小さくするため右へずらしてもよい。一般に、この方法
で設定された合格値よりも高い信号を発するサンプルは癌に関して陽性と考えら
れる。

【０３８７】関連する実施例においては、フロースルーまたはストリップ・テスト・フオー
マットで分析を行い、結合剤をニトロセルロースのような膜に固定する。フロー
スルー・テストでは、サンプルが膜を通過すると、サンプル中のポリペプチドが
固定された結合剤と結合する。次に、第2結合剤を含む溶液が膜を通過すると、
標識されたこの第2結合剤が結合剤-ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結
合した第2結合剤の検出が上述したように行われる。ストリップ・テスト・フォ
ーマットでは、結合剤が結合する膜の一端がサンプルを含有する溶液に浸漬され
る。

【０３８８】サンプルは膜に沿って第2結合剤を含む部位を固定されている結合剤の部位に
向かって移動する。固定計都合剤の部位における第2結合剤濃度が癌の存在を示
唆する。前記部位における第2結合剤の濃度は視認可能な線を画くパターンを形
成する。このパターンが存在しなければ、結果が陰性であることを示唆する。膜
に固定される結合剤の量は、サンプルが上記フオーマットにおける2-抗体サンド
イッチ分析において陽性信号を発するに充分なレベルのポリペプチドを含む時は
っきり視認できるように設定される。

【０３８９】この分析に使用される好ましい結合剤は抗体およびその抗原結合フラグメント
である。膜に固定される抗体の量は約25ng〜約1μgであり、より好ましくは約50
ng〜約500ngである。このテストは極めて少量のサンプルで行うことができる。

【０３９０】本発明の腫瘍タンパク質または結合剤と併用できる分析プロトコルが他にも種
々存在することはいうまでもない。上記のプロトコルはあくまでも例である。例
えば、サンプル中のポリペプチドと結合するを検出するのに腫瘍ポリペプチドを
利用する上記プロトコルは容易に変更することができる。腫瘍タンパク質に特異
な抗体の検出は癌の存在と相関する。

【０３９１】サンプル中の腫瘍タンパク質と特異に反応するT細胞の存在に基づいて癌を検
出することもできる。患者から分離されたCD4⁺および／またはCD8⁺T細胞を含む
サンプルを腫瘍ポリペプチド、これを符号化するポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するAPCと一緒にインキュベー
トし、T細胞の特異活性化の有無を検出する。適当なサンプルとしては、例えば
、分離T細胞がある。T細胞は（例えば、末梢血リンパ球のFicoll／Hypaque密度
勾配遠心沈殿法のような）公知技術によって患者から分離することができる。

【０３９２】ポリペプチド（5-25μg/ml）と一緒に2-9日間37℃において、試験管内でT細胞
をインキュベートする。対照として腫瘍ポリペプチドが存在しないT細胞サンプ
ルをもインキュベートすることが望ましい。CD4⁺T細胞については、T細胞の増殖
評価によって活性化を検出することが好ましい。CD8⁺につては、細胞毒活性の評
価によって活性化を検出することが好ましい。疾病のない患者よりも増殖レベル
が少なくとも2倍高く、および／または細胞毒活性が少なくとも20％高ければ、
患者に癌が存在することを示唆する。

【０３９３】上述のように、サンプル中の腫瘍タンパク質を符号化するmRNAのレベルに基づ
いて癌を検出することもできる。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）に基づく分析に、
少なくとも2種ノオリゴヌクレオチド・プライマーを使用することにより、サン
プルからの腫瘍cDNAの一部を増幅することができ、その場合、オリゴヌクレオチ
ド・プライマーの少なくとも一方が腫瘍タンパク質を符号化するポリヌクレオチ
ドに対して特異である（即ち、これと雑種を形成する）。増幅されたcDNAを分離
し、ゲル電気泳動のような公知技術で検出する。同様に、腫瘍タンパク質を符号
化するポリヌクレオチドと特異に交雑するオリゴヌクレオチドを雑種形成分析に
利用すれば、サンプル中の腫瘍タンパク質を符号化するポリヌクレオチドの存在
を検出することができる。

【０３９４】分析条件下で交雑を可能にするためには、オリゴヌクレオチド・プライマーお
よびプローブは少なくとも10個、好ましくは20個のヌクレオチドに相当する長さ
の本発明の腫瘍タンパク質符号化ポリヌクレオチドの部分と、少なくとも約60％
、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは約90％の同一性を有するオリゴ
ヌクレオチド配列を含まねばならない。好ましくは、オリゴヌクレオチド・プラ
イマーおよび／またはプローブは上記の条件下でポロペプチド符号化ポリヌクレ
オチドと交雑する。

【０３９５】診断に使用されるオリゴヌクレオチド・プライマーおよび／またはプローブは
好ましくは少なくとも10-40個のヌクレオチドに相当する長さを有する。このま
しいじっしれいでは、オリゴヌクレオチド・プライマーは上記配列を有するDNA
分子の、少なくとも10個の連続するヌクレオチド、より好ましく葉少なくとも15
個の連続するヌクレオチドをふくむ。PCR分析も交雑分析も公知である（Mullis
et al.,Col；d Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51：263,1987；Erlich ed.
, PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989）。

【０３９６】好ましい分析では、PCRを逆転写と併用するRT-PCRを利用する。RNAは生体組織
のようなサンプルから抽出され、逆転写されてcDNA分子を生成する。少なくとも
1つの特異プライマーを使用するPCR増幅によって、cDNAを生成し、これを分離し
、ゲル電気泳動などを利用して可視化する。増幅はテスト患者から得たサンプル
と健常者から得たサンプルで行う。増幅反応は2桁の範囲で数回希釈したcDNAで
行う。テスト患者のサンプルを数回希釈した結果、健常者に比較して発現が2倍
以上増大し、陽性と判定される。

【０３９７】他の実施例では、癌進行のマーカとして本発明の薬剤を使用することができる
。この実施例では、癌診断のための上記分析を継続的に実施し、反応性ポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドのレベル変化を評価する。例えば、6ヶ月〜1年間、
24-72時間ずつ分析を行い、必要に応じてその後も行う。検出されたポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドのレベルが増大する患者では、癌が進行中である場合
が多い。逆に、レベルが一定のままか、または低下する場合、癌は進行していな
い。

【０３９８】生体診断分析を直接腫瘍において行う。この分析では、腫瘍細胞を結合剤と直
接接触させる。結合した結合剤は直接またはリポーター・グループを介して間接
的に検出する。結合剤は組織学的にも利用できる。この場合、ポリヌクレオチド
・プローブを使用することもできる。

【０３９９】感度を高めるには、所与のサンプル内で、多重腫瘍タンパク質マーカを分析す
ればよい。種々のタンパク質に対して特異な結合剤を単一の分析内で組合わせる
ことができる。多重プライマーまたはプローブを同時に使用することができる。
腫瘍タンパク質マーカの選択は一連の実験に基づいて行い、最適感度となるよう
にする。腫瘍タンパク質の分析を、たの既知腫瘍抗原分析と組合わせてもよい。

【０４００】本発明は上記診断方法に使用されるキットをも提供する。このキットは2つま
たh2つ以上の、診断分析に必要な成分を含む。成分は化合物、試薬、容器および
／または装置を含む。キット内の1つの容器はモノクローン抗体またはそのフラ
グメントを収容する。このキットは抗体結合を直接または間接的に検出するリポ
ーター・グループを含む検出試薬をも収容する。

【０４０１】あるいは、生体サンプル中の腫瘍たんぱく質を符号化するmRNAレベルを検出す
るようにキットを構成することもできる。このようなキットは多くの場合、上述
のように,腫瘍たんぱく質を符号化するポリヌクレオチドと雑種形成する少なく
とも1つのオリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマーを含む。このような
オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRまたは雑種形成分析に使用することができ
る。この種のキット中に存在するその他の成分としては、第2オリゴヌクレオチ
ドおよび／または診断試薬または腫瘍たんぱく質を符号化するポリヌクレオチド
の検出を容易にする容器が挙げられる。下記の例は説明のためのものであり、本発明を制限するものではない。

【０４０２】例実施例１．前立腺特異性ポリペプチドの分離および特徴づけこの例は前立腺腫瘍cDNAライブラリーからの幾つかの前立腺特異性ポリペプチ
ドの分離に係わる。 Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit
（BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD20897）を使用し、メーカーのプロ
トコルに従って、前立腺腫瘍ポリA⁺RNAからヒトの前立腺腫瘍cDNAライブラリー
を構成した。具体的には、ポリトロン（Kinematica, Switzerland）で前立腺腫
瘍組織を均質化し、メーカーの指示に従ってTrizol試薬（BRL Life Technologie
s）を使用して全RNAを抽出した。

【０４０３】次いで、メーカーのプロトコルに従って、Qiagen oligotex spin column mRNA
精製キット（Qiagen, Santa Clarita, CA91355）を使用して、ポリA^；RNAを精製
した。NotI/Oligo-dT18プライマーを使用して第1ストランドcDNAを合成した。二
重鎖cDNAを合成し、EcoRI/BAXIアダプタ（Invitrogen, San Diego,CA）と結合さ
せ、NotIで消化した。Chroma Spin-1000カラム（Clontech, Palo Alto, CA）で
サイズ分画した後、cDNAをpCDNA3.1（Invitrogen）のEcoRI/NotI部位に結合させ
、電気穿孔により、ElectroMax E. coli DH10B細胞に形質変換した。

【０４０４】同じ方法を利用して、正常なヒト膵臓cDNA発現ライブラリーを、6個の組織試
料（Clontech）から作成した。独立コロニーの数、挿入断片を有するコロニーの
％、平均挿入断片サイズを測定すると共に、配列分析によってcDNAライブラリー
を特徴づけた。前立腺腫瘍ライブラリーは1.64x10⁷個の独立コロニーを含み、コ
ロニーの70％が挿入断片を有し、平均挿入断片サイズは1745塩基対であった。正
常な膵臓cDNAライブラリーは3.3x10⁶個のコロニーを含み、コロニーの69％が挿
入断片を有し、平均挿入断片サイズは1120塩基対であった。いずれのライブラリ
ーでも、配列分析の結果、クローンの大部分が完全な長さのcDNA配列を有し、mR
NAから合成され、rRNAおよびミトコンドリアDNA汚染は極めて少ないことが判明
した。

【０４０５】 Hara et al（Blood,84：189-199,1994）が報告している方法に幾つかの変更を
加え、上記前立腺腫瘍および正常な膵臓cDNAライブラリーを利用して、cDNAライ
ブラリー減算を行った。具体的には、下記のようにして前立腺特異性減算cDNAラ
イブラリーを形成した。正常な膵臓cDNAライブラリー（70μg）をEcoRI,NotI,お
よびSfuIで消化し、DNAポリメラーゼ・クレナウ・フラグメントとフィリング-イ
ン反応させた。

【０４０６】フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、DNAを100μlのH₂O
に溶解させ、過熱変性し、100μl（100μg）のPhotoprobeビオチン（Vector Lab
oratories,Burlingame,CA）と混合した。メーカーの勧めに従い、氷上で、得ら
れた混合物を270W太陽灯で20分間照射した。追加のPhotoprobeビオチン（50μl
）を添加し、ビオチン化反応を繰返した。ブタノールで5回抽出した後、DNAをエ
タノール沈殿させ、23μlのH₂Oに溶解させてドライバーDNAを形成した。

【０４０７】トレーサーDNA形成のため、10μgの前立腺腫瘍cDNAライブラリーをBamHIおよ
びXhoIにて消化し、フェノールクロロホルムで抽出してから、Chrmoma spin-400
カラム（クローンテック（Clontech））に通した。エタノール沈殿後、トレーサ
ーDNAは5μlのH₂Oに溶解された。トレーサーDNAを15μlのドライバーDNAおよび2
0μlの２×ハイブリダイゼーションバッファー（1.5MのNaCl/10mM EDTA/50mM HE
PES pH7.5/0.2%ドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、ミネラルオイル重層後完全
に熱変性した。

【０４０８】サンプルは直ぐに68℃の水槽に移され、20時間インキュベーションされた（長
時間ハイブリダイゼーション［LH］）。次に反応混合液をストレプトアビジン処
理にかけてからフェノール／クロロフォルム抽出した。この工程をさらに３回繰
り返した。サブトラクション処理されたDNAを沈殿させ、12μlのH₂Oに溶解、8μ
lのドライバーDNAおよび20μｌの２×ハイブリダイゼーションバッファーと混合
してから、68℃にて２時間ハイブリダイゼーションにかけた（短時間ハイブリダ
イゼーション［SH］）。

【０４０９】ビオチン化２本鎖DNAを除いた後、サブトラクション処理されたcDNAをクロラ
ムフェニコールpBCSK＋（ストラタジーン(Stratagene)、ラジョラ（La Jolla）
、カリフォルニア州（CA）92037）のBamHI/XhoI部位に連結し、エレクトロポレ
ーションによりElectroMaxE.coliDH10B細胞内に形質転換し、前立腺腫瘍特異的
サブトラクション処理cDNAライブラリー（「前立腺サブトラクションＩ」と呼ぶ
）が作製された。

【０４１０】サブトラクションcDNAライブラリーを解析するため、サブトラクション処理し
た前立腺腫瘍特異的ライブラリーより無作為に取り上げた100個の独立クローン
よりプラスミドDNAを調製し、そのインサートの大きさに基づいてグループ分け
した。代表的なcDNAクローンは、パーキンエルマー／アプライドバイオシステム
ズ部門（Perkin Elmer/Applied Biosystems)自動シークエンサーモデル373A（フ
ォスターシティー（Foster City）、カリフォルニア州(CA)）を用いたDNA配列決
定によりさらに特性分析された。

【０４１１】以後F1-13、F1-12、F1-16、H1-1、H1-9およびH1-4と呼ぶ６個のcDNAクローン
がサブトラクション処理された前立腺特異的cDNAライブラリー中に豊富に存在す
ることが示された。F1-12について決定された3’および5’ｃDNA配列は、それぞ
れ配列番号２および３に示されており、F1-13、F1-16、H1-1、H1-9およびH1-4に
ついて決定された3’cDNA配列はそれぞれ配列番号１および4-7に示されている。

【０４１２】単離クローンのcDNA配列はEMBLおよびGenBankデータベース（96版）を用い、
遺伝子バンク内の既知配列と比較された。４種類の前立腺腫瘍cDNAクローンF1-1
3、F1-16、H1-1およびH1-4は次の同定済み蛋白質をコードしていることが判明し
た：前立腺特異抗原（PSA)、ヒト腺カリクレイン、ヒト腫瘍発現増進遺伝子、お
よびミトコンドリアチトクロームC酸化酵素サブユニットII。H1-9は以前同定さ
れた自律的複製配列に同一であることが判明した。F1-12に関するcDNA配列には
有意な相同体は見出されなかった。

【０４１３】次の研究ではF1-12の全長cDNA配列（P504Sとも呼ぶ）の単離が行われた。この
配列は配列番号107に示されており、対応する推定アミノ酸配列は配列番号108に
示されている。P504SのcDNAスプライス変異体は配列番号600-605に示されている
。

【０４１４】より少ない前立腺腫瘍特異遺伝子をクローン化するために、上記前立腺腫瘍cD
NAライブラリーから正常膵臓cDNAライブラリーおよび先のサブトラクション前立
腺腫瘍特異的cDNAライブラリーで最も多く存在した３種類の遺伝子、即ちヒト腺
カリクレイン、前立腺特異抗原(PSA)およびミトコンドリアチトクロームC酸化酵
素サブユニットIIの遺伝子を差し引いてcDNAライブラリーサブトラクションを行
った。具体的にはpCDNA3.1に入ったヒト腺カリクレイン、PSAおよびミトコンド
リアチトクロームC酸化酵素サブユニットIIのcDNAをそれぞれ１μgドライバーDN
Aに加え、上記同様にサブトラクション処理し、以後「スパイクサブトラクショ
ン前立腺腫瘍特異cDNAライブラリー」とよぶ第２回目サブトラクション処理済み
cDNAライブラリーを得た。

【０４１５】 22個のｃDNAクローンがスパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異cDNAライブ
ラリーより単離された。J1-17、L1-12、NJ-1862、J1-13、J1-19、J1-25、J1-24
、K1-58、K1-63、L1-4およびL1-14と呼ばれるクローンについて決定された3’お
よび5’cDNAは配列番号8-9、10-11、12-13、14-15、16-17、18-19、20-21、22-2
3、24-25、26-27および28-29にそれぞれ示されている。J1-12、J1-16、J1-21、K
1-48、K1-55、L1-2、L1-6、N1-1858、N1-1860、N1-1861、N1-1804と称されるク
ローンについて決定された3’cDNA配列はそれぞれ配列番号30-40に示されている
。

【０４１６】これら配列と上記遺伝子バンク内の配列との比較からは、最も多く存在した５
種類のDNA種のうち３種（J1-17、L1-12およびN1-1862；それぞれ配列番号8-9、1
0-11および12-13）とは有意な相同性を示されなかった。残り２最多存在種のう
ちの１種（J1-12；配列番号30）はこれまでに同定されたヒト肺界面活性剤関連
蛋白質と同一であることが見出され、そして残りの１種（K1-48；配列番号33）
は2-アリールプロピオニル-CoAエピメラーゼのR.norvgicus mRNAと相同性を有す
ると判定された。

【０４１７】スパイクサブトラクション前立腺腫瘍特異的cDNAライブラリーより単離された
量的に少ない腫瘍17種のうち４種（J1-16、K1-35、L1-6およびN1-1864；それぞ
れ配列番号31、34、36および40）は非ヒト配列と相同性を示すことが見出され、
２種（L1-2およびN1-1861；それぞれ配列番号35および39）は既知ヒト配列と相
同性を示すことが見出された。ポリペプチドJ1-13、J1-19、J1-24、J1-25、K1-5
8、K1-63、L-4、L1-14（それぞれ配列番号14-15、16-17、20-21、18-19、22-23
、24-25、26-27、28-29）に対して相同性は認められなかった。

【０４１８】続く研究ではJ1-17、L1-12およびN1-1862（それぞれ配列番号109-111）の全長
cDNA配列の単離が行われた。対応する推定アミノ酸配列は配列番号112-114に示
されている。L1-12はまたP501Sとも呼ばれる。p501SのcDNAスプライス変異体は
配列番号606に示されている。

【０４１９】別の実験では、前立腺腫瘍cDNAライブラリーから３種類の正常前立腺ポリA+RN
Aのプールより調製された正常前立腺cDNAをサブトラクションすることで（「前
立腺サブトラクション２」と称する）さらに４種類のクローンが同定された。以
後U1-3064、U1-3065、V1-3692および1A-3905と称される、これらクローンの決定
cDNA配列はそれぞれ配列番号69-72に示されている。決定されたこれら配列と遺
伝子バンクとの配列比較からは、U1-3065との有意な相同性は見出されなかった
。

【０４２０】スパイクによる第２サブトラクション（「前立腺サブトラクションスパイク２
」と称する）は、前立腺腫瘍特異cDNAライブラリーより正常前立腺cDNAライブラ
リーを持つスパイクでサブトラクションし、さらにPSA、J1-17、肺表面活性剤関
連蛋白質、ミトコンドリアDNA、チトクロームｃ酸化酵素サブユニットII、N1-18
62、自律複製配列、L1-12および腫瘍発現増大遺伝子でスパイクされ除かれた。
以後V1-3686、R1-2330、1B-3976およびV1-3679と呼ばれる４種類の追加クローン
が単離された。これらクローンについて決定されたcDNA配列はそれぞれ配列番号
73-76に示されている。これら配列と遺伝子バンク内配列との比較からは、V1-36
86およびR1-2330との有意な相同性は見出されなかった。

【０４２１】上記３種類の前立腺サブトラクション（前立腺サブトラクション２、スパイク
サブトラクション前立腺腫瘍特異cDNAライブラリー、および前立腺サブトラクシ
ョンスパイク２）を更に分析した結果、1G-4736、1G-4738、1G-4741、1G-4744、
1G-4734、1H-4774、1H4781、1H-4785、1H4787、1H4796、1I-4810、1I-4811、1J-
4876、１K-4884および1K-4896と称される16個の更なるクローンが同定された。

【０４２２】これらクローンの配列と上記遺伝子バンクの配列との比較からは、1G-4741、1
G-4734、1I-4807、IJ-4876および1K-4896（それぞれ配列番号79、81、87、90お
よび92）との有意な相同性は示されなかった。更なる単離クローン分析より、そ
れぞれ配列番号179-188および191-193に示される1G-4736、1G-4738、1G-4741、1
G-4744、1H-4774、1H4781、1H-4785、1H4787、1H4796、1I-4807、1J-4876、１K-
4884および1K-4896の延長cDNA配列が決定され、さらにそれぞれ配列番号189およ
び190に示される1I-4810および1I-4811に関する追加の部分cDNA配列が決定され
た。

【０４２３】前立腺サブトラクションスパイク２の追加研究より、さらに３個のクローンが
分離された。それらの配列は上記同様にして決定され、最新のGeneBankと比較さ
れた。３クローン全てが既知遺伝子であるシステインリッチ蛋白質、LIAA0242お
よびKIAA0280（それぞれ配列番号317、319および320）と相同性を有することが
見出された。シンテニ（Synteni）マイクロアレイ（シンテニ（Synteni）、パロ
アルト（Palo Alto）、カリフォルニア州(CA)）によるこれらクローンの更なる
分析からは、これら３種類全てのクローンが大部分の前立腺腫瘍および前立腺BP
H、ならびに試験した正常前立腺組織の多くで過剰発現されているものの、その
他の正常組織ではいずれも発現が低いことが示された。

【０４２４】更なるサブトラクションが、正常前立腺cDNAライブラリーを正常膵臓cDNAでサ
ブトラクションすることで実施された（「前立腺サブトラクション３」と称する
）。その結果1G-4761、1G-4762、1H-4766、1H-4770、1H-4771および1H-4722（配
列番号93-98）と称される６個の追加クローンが同定された。これら配列と遺伝
子バンク配列との比較からは、1G-4761および1H4711（それぞれ配列番号93およ
び97）に対し有意な相同性は示されなかった。単離クローンの更なる分析から、
それぞれ配列番号194-196および199に示される1G-4761、1G-4762、1H-4766およ
び1H-4772に関する延長cDNA配列が決定され、そしてそれぞれ配列番号197および
198に示される1H-4770および1H-4771に関する追加部分cDNA配列が決定された。

【０４２５】前立腺癌患者３例のポリA+RNAプールより調製された前立腺腫瘍cDNAライブラ
リーを正常膵臓cDNAライブラリーでサブトラクションし（前立腺サブトラクショ
ン４）たところ、1D-4297、1D-4309、1D.1-4278、1D-4288、1D-4283、1D-4304、
1D-4296および1D-4280（配列番号99-107）と称される８個のクローンが同定され
た。これらの配列は上記遺伝子バンクの配列と比較された。1D-4283および1D-43
04（それぞれ配列番号103および104）との有意な相同性は見出されなかった。単
離クローンの更なる分析から、それぞれ配列番号200-206に示される1D-4309、1D
.1-4278、1D-4288、1D-4283、1D-4304、1D-4296および1D-4280に関する延長cDNA
配列が決定された。

【０４２６】上記前立腺サブトラクション１および前立腺サブトラクション２で単離された
cDNAクローンはコロニーPCRで増幅され、マイクロアレイ技術（シンテニ(Synten
i)、パルアルト(Palo Alto)、カリフォルニア州(CA)）を用い、前立腺腫瘍、正
常前立腺および各種その他組織中に於けるそれらのmRNA発現レベルが決定された
。簡単に述べると、各産物がアレイ中に特有位置を占める様にPCR増幅産物をス
ライド上にアレイフォーマットにドットした。試験対象となる組織サンプルより
mRNAを抽出し、逆転写し、蛍光標識cDNAプローブを作製した。マイクロアレイを
標識cDNAプローブでプロービングし、スライドをスキャンして蛍光強度を測定し
た。

【０４２７】この強度はハイブリダイゼーション強度に比例する。２つのクローンが、前立
腺腫瘍および正常前立腺で過剰に発現され、そして試験したその他全ての正常組
織（肝臓、膵臓、皮膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎
臓、卵巣、肺、脊髄、骨格筋および結腸）では発現が低レベルであることが見出
された。P509SおよびP510Sについて決定されたcDNA配列はそれぞれ配列番号223
および224に示されている。これら配列と上記遺伝子バンク中の配列との比較か
らは、これまでに同定された幾つかのESTと相同性が示された。

【０４２８】さらに研究はP509Sの完全長cDNA配列の分離を行った。この配列は配列番号332
に示されており、対応する推定アミノ酸配列は配列番号339に示されている。２
種類のP510Sに関する変種完全長cDNA配列が配列番号535および536に、対応する
推定アミノ酸配列がそれぞれ配列番号537および538に示されている。P510Sの更
なるスプライス変異体が配列番号598および599に示されている。

【０４２９】実施例２．前立腺特異的ポリペプチドの組織特異性の決定遺伝子特異的プライマーを用い、代表的前立腺特異的ポリペプチドF1-16、H1-
1、J1-17（P502Sとも称される）、L1-12（P501Sとも称される）、F1-12（P504S
とも称される）およびN1-1862（P503Sとも称される）のmRNA発現レベルを、RT-P
CRを利用して各種正常および腫瘍組織について調べた。

【０４３０】簡単に述べると、全RNAはTrizol試薬を用い、上記の如く各種正常および腫瘍
組織から抽出された。第１鎖合成は全RNA1-2μgを使い、SuperScriptII逆転写酵
素（BRLライフテクノロジーズ（LifeTechnologies)）により42℃、１時間行われ
た。次にcDNAが遺伝子特異プライマーを用いたPCRにより増幅された。RT-PCRの
判定量性を保証するために、β-アクチンを各検討組織の内部コントロールとし
て用いた。

【０４３１】まず第１鎖cDNAの連続希釈体を調製し、βアクチン特異プライマーを用いてRT
-PCRを実施した。次にβアクチン鋳型が直線増幅され、そして初期コピー数の差
を反映できる十分な感度が得られる希釈率が選ばれた。これら条件下に於いて、
各組織からの各逆転写反応についてβアクチンレベルが決定された。DNase処理
すること、および逆転写酵素を加えずに調製された第１鎖cDNAを用いた場合に陰
性のPCR結果であることを確認することによって、DNAの混入は最小限に留められ
た。

【０４３２】 mRNA発現レベルを、４種類の腫瘍組織（２患者の前立腺組織、３患者の乳癌、
結腸癌、肺癌）および前立腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、平滑筋、皮
膚、胃、精巣、骨髄および脳を含む16種類の正常組織について検討した。F1-16
は前立腺腫瘍組織、結腸癌および正常前立腺に於いて高レベルに、そして正常肝
臓、皮膚および精巣では低レベルに発現されること、さらに検討したその他組織
では検出されないことが判明した。H1-1は前立腺腫瘍、肺癌、乳癌、正常前立腺
、正常結腸および正常脳で高いレベルに、正常肺、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、
骨髄では遙か低レベルに、そして試験したその他組織では検出されないことが見
出された。

【０４３３】 J1-17(P502S)およびL1-12(P501S)は、前立腺で特異的に過剰発現されると思わ
れ、そして両遺伝子とも前立腺腫瘍と正常前立腺組織で高レベルに発現されてい
たが、検討したそのいずれの他組織での発現は低レベルで検出できなかった。N1
-1862（P503S)は前立腺腫瘍の60%で過剰発現されていること、そして正常結腸お
よび腎臓でも検出可能であることが見出された。即ちRT-PCRの結果は、F1-16、H
1-1、J1-17(P502S)、N1-1862(P503S)およびL1-12(P501S)は前立腺特異的である
か、または前立腺にて有意に高いレベルで発現されていることを示している。

【０４３４】さらなるRT-PCR研究は、F1-12(P504S)が前立腺腫瘍において過剰発現されてい
ること、そして正常腎臓でも検出されるが試験したその他全ての組織では検出さ
れないことを示した。同様にR1-2330は前立腺腫瘍の40%で過剰発現され、そして
正常腎臓および肝臓で検出可能であるが、試験したその他全ての組織では検出さ
れないことが示された。U1-3064は前立腺腫瘍の60%で過剰発現され、そして乳癌
および結腸癌でも検出可能であるが、正常組織では検出されないことが示された
。 R1-2230、U1-3064および1D-4279のRT-PCR特性分析は、これら３抗原が前立腺
および／または前立腺腫瘍にて過剰発現されていることを示した。

【０４３５】４種類の前立腺腫瘍と２種類の正常前立腺サンプル、２種類のBPH前立腺なら
びに正常結腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、脳、胃、精巣、小腸および骨髄
を用いたノーザン分析は、L1-12（P501S)が前立腺腫瘍および正常前立腺では過
剰発現されているが、その他試験した正常組織では検出できないことを示した。
J1-17（P502S)は２種類の前立腺腫瘍で検出されたが、その他試験した組織では
検出されなかった。N1-1862（P503S)は３種類の前立腺腫瘍で過剰発現され、そ
して正常前立腺、結腸および腎臓でも発現されているが、試験したその他組織で
は発現されていないことが見出された。F1-12(P504S)は２前立腺腫瘍では高発現
されていたが、試験したその他全ての組織では検出されないことが見出された。

【０４３６】上記マイクロアレイ技術を用い、ここに記した代表的な抗原の前立腺腫瘍、乳
癌および以下正常組織に於ける発現レベルを決定した：前立腺、肝臓、膵臓、皮
膚、骨髄、脳、乳房、副腎、膀胱、精巣、唾液腺、大腸、腎臓、卵巣、肺、脊髄
、骨格筋および結腸。L1-12(P501S)は正常前立腺および前立腺腫瘍において過剰
発現されていること、そして正常骨格筋でいくらかの発現が検出されることが見
出された。J1-12およびF1-12(P504S)は前立腺腫瘍で過剰発現され、試験したそ
の他全ての組織ではより低いか、または検出できないことが見出された。

【０４３７】 N1-1862(P503S)は前立腺腫瘍および正常前立腺において高レベルに発現され、
正常大腸および正常結腸では低レベルに発現され、そして試験したその他全ての
組織では検出されないことが見出された。R1-2330は前立腺腫瘍および正常前立
腺では過剰発現されており、そしてその他試験した全ての組織ではより低レベル
に発現されることが見出された。1D-4279は前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰
発現されており、正常脊髄ではより低レベルに発現され、試験したその他の組織
では検出できないことが見出された。

【０４３８】 P501S（配列番号110）がどの程度乳癌で発現しているかについて特異的に解析
した別のマイクロアレイでは、乳癌だけでなく転移性乳癌でも(2/31)軽度の過剰
発現があること、そして正常組織では無視できるほど低発現であることが示され
た。このデータは、P501Sが各種乳癌ならびに前立腺腫瘍でも過剰発現されてい
ることを示唆している。

【０４３９】 Vasmatzisら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：300-304、1998）により各種腫瘍
および正常組織に記載された32種類のEST（発現配列タグ）を上記マイクロアレ
イ技術を用いて検討した。これらクローンの内の２クローン（P1000CおよびP100
1Cと称する）が前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰発現されていること、および
試験したその他全ての組織（正常大動脈、胸腺、休止および活性化PBMC、上皮細
胞、脊髄、副腎、胎児組織、皮膚、唾液腺、大腸、骨髄、肝臓、肺、樹状細胞、
胃、リンパ節、脳、心臓、小腸、骨格筋、結腸および腎臓）では低ないし検出不
能レベルに発現されていることが見出された。

【０４４０】 P1000CおよびP1001Cについて決定されたcDNA配列はそれぞれ配列番号384およ
び472に示されている。P1001Cの配列はこれまでに単離されているJM27蛋白質に
関するヒトmRNAと相同性をしめすことが判明した。配列番号384と公開データベ
ース中配列との更なる比較から、492アミノ酸配列をコードするp1000Cの全長cDN
A配列が同定された（配列番号786）。PSORTIIプログラムを用いたアミノ酸配列
分析より、アミノ酸84-100由来の推定膜貫通ドメインが同定された。停止コドン
を含むP100CのオープンリーディングフレームのcDNA配列は配列番号787に示され
ており、停止コドンを含まないオープンリーディングフレームのそれは配列番号
788に示されている。P1000Cの完全長アミノ酸配列は配列番号789に示されている
。配列番号790および791はそれぞれアミノ酸1-100および100-492を示している。

【０４４１】 F1-12の完全長cDNA（P504Sとも称される；配列番号108）にコードされている
ポリペプチドの発現を免疫組織学的分析により調べた。標準的技術により完全長
504S蛋白質に対しウサギ抗P504Sポリクローナル抗体を作製した。続いてポリク
ローナル抗体の単離および特性分析を、当分野周知の技術により実施した。免疫
組織学的分析は、P504Sポリペプチドが試験した前立腺癌サンプル(n=5)の100%で
発現されていることを示した。

【０４４２】ウサギ抗P504Sポリクローナル抗体は良性前立腺細胞を一様に細胞質顆粒を染
色し染めるのではなく、むしろ核を軽く染色した。正常組織分析からは、コード
されたポリペプチドが試験したヒト組織全てではないが、幾つかの組織で発現さ
れていることが示された。ウサギ抗P504Sポリクローナル抗体による陽性の細胞
質染色像は正常ヒト腎臓、肝臓、脳、結腸および肺関連マクロファージに見出さ
れたが、一方心臓および骨髄は陰性であった。

【０４４３】このデータは、P504Sポリペプチドが前立腺癌組織内に存在すること、そして
良性前立腺肥大組織と前立腺癌組織との間には染色に定性的および定量的な違い
が存在することを示しており、このポリペプチドが前立腺腫瘍で選択的に検出さ
れることから、前立腺癌の診断に有用であることを示唆している。

【０４４４】実施例３．PCRベースサブトラクションによる前立腺特異的ポリペプチドの単離
および特性分析正常前立腺を10種類のその他正常組織cDNA（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣
、胎盤、骨格筋、脾臓および胸腺）でサブトラクションされ、次に第１ラウンド
PCR増幅されたcDNAを含む、cDNAサブトラクションライブラリーはクローンテッ
ク（Clontech)より購入した。このライブラリーをメーカーのプロトコールに従
って第２ラウンドPCR増幅にかけた。

【０４４５】得られたcDNA断片をベクターpT7BlueT-ベクター（ノバゲン（Novagen)、マジ
ソン（Madison)、ウイスコンシン州(WI)）にサブクローニングし、XL-1BlueMRF
’ E.coli（ストラタジーン（Stratagene)）を形質転換した。独立したクローン
よりDNAを単離し、パーキンエルマー／アプライドバイオシステム（Perkin Elme
r/Applied Biosystems）部門、自動シークエンサーモデル373Aを用いて配列決定
した。

【０４４６】 49個の陽性クローンについて配列決定した。これらクローンのDNA配列を上記
遺伝子バンク内の配列と比較したところ、そのうちの以後P5、P8、P9、P18、P20
、P30、P34、P36、P38、P39、P42、P49、P50、P53、P55、P60、P64、P65、P73、
P75、P76、P79およびP84と呼ぶ25クローンについては有意な相同性が認められな
かった。これらクローンについて決定されたcDNA配列は、配列番号41-45、47-52
および54-65にそれぞれ示されている。P29、P47、P68、P80およびP82（それぞれ
配列番号46、53および66-68）は、これまでに同定されたDNA配列とある程度相同
性を示すことが判明した。発明者の知りうる限りにおいて、これまでこれら配列
が前立腺内に存在することは示されていない。

【０４４７】標準的完全長クローニング法にて配列番号67の配列をプローブとして用いる別
の研究からは、P80（P704Pとしても知られる）のスプライ変異体と思われる３種
類のcDNA配列が単離された。これら配列は配列番号620-622に示されている。

【０４４８】上記PCRをベースとした技術を用いた別の研究からは、さらに180種類の追加ク
ローンが単離され、そのうち23クローンが既知配列と有意な相同性を持たないこ
とが見出された。これらクローンについて決定されたcDNA配列は配列番号115-12
3、127、131、137、145、147-151、153、156-158および160に示されている。23
クローン（配列番号124-126、128-130、132-136、138-144、146、152、154、155
および159）はこれまでに同定されたESTといくらかの相同性を示すことが見出さ
れた。

【０４４９】さらに10クローン（配列番号161-170）は既知遺伝子とある程度の相同性を持
つことが判明した。P20を含むより大型のcDNAクローンは、P703Pと称される遺伝
子のスプライト変異体である。DE1、DE13およびDE14と称される変異体について
決定されたDNA配列がそれぞれ配列番号171、175および177に示されており、そし
て対応する推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号172、176および178に示されて
いる。P703の延長スプライス型について決定されたcDNA配列は配列番号225に示
されている。DE2およびDE6と称されるスプライス変異体のDNA配列はそれぞれ配
列番号173および174に示されている。

【０４５０】腫瘍組織（前立腺(n=5)、乳房(n=2)、結腸および肺）、正常組織（前立腺(n=5
）、結腸、腎臓、肝臓、肺(n=2)、卵巣(n=2）、骨格筋、皮膚、胃、小腸および
脳）、および活性化ならびに非活性化PBMCの代表クローンに於けるmRNA発現レベ
ルを、上記RT-PCRより決定した。発現は特記無い限り各組織について１サンプル
づつ検討された。

【０４５１】 P9は、同等の発現を示した正常結腸を除き、試験した全正常試験組織に比べて
、正常前立腺および前立腺腫瘍で高く発現していることが判明した。P703P遺伝
子の一部であるP20は、試験した全12種類の正常組織に比べて正常前立腺および
前立腺腫瘍で高く発現していることが見出された。肺（２例のうち１）を除く全
ての正常組織に比べた場合、乳癌(n=2）、結腸癌および肺癌でP20はいくらか増
加を示した。肺および胃を除くその他正常細胞に比べ、正常前立腺、前立腺腫瘍
および乳癌でP18の発現増加が認められた。

【０４５２】正常前立腺では、その他多くの正常組織に比べ若干のP5発現の増加が観察され
た。しかし、正常肺およびPBMCにおいて、いくらかの発現増加が見られた。P5の
発現増加は前立腺腫瘍（５例中２例）、乳癌および１例の肺癌サンプルでも観察
された。P30に関しては、正常前立腺および前立腺腫瘍において、試験した残り1
2種類の他正常組織中有６組織と類似の発現レベルが認められた。

【０４５３】乳癌、１肺癌サンプルおよび１結腸癌サンプル、ならびに正常PBMCにおいて発
現増加が認められた。P29は前立腺腫瘍（５例中５例）および正常前立腺（５例
中５例）に於いて、大部分の正常組織と比較した時過剰発現が認められた。しか
し、P29の実質的発現が正常結腸および正常肺（２例中２例）に観察された。P80
は、試験したその他全ての正常組織に比べ前立腺腫瘍（５例中５例）および正常
前立腺（５例中５例）で過剰発現が認められ、そして結腸癌でも発現増加が認め
られた。

【０４５４】さらなる研究の結果、以後10-d8、10-h10、11-c8、7-g6、8-b5、8-b6、8-d4、
8-d9、8-g3、8-h11、9g-12および9-f3と称される追加クローンが単離された。10
-d8、10-h11、11-c8、8-d4、8-d9、8-h11、9g-12および9-f3について決定された
配列は配列番号207、208、209、216、217、220、221および222にそれぞれ記され
ている。

【０４５５】 7-g6、8-b5、8-b6および8-g3について決定された正方向および逆方向のDNA配
列はそれぞれ配列番号210と211、212と213、214と215および218と219に記載され
ている。これら配列と遺伝子バンク配列との比較から、9-f3の配列に対し有意な
相同性がないことが示された。10-d8、11-c8および8-h11のクローンは既に単離
されているESTといくらかの相同性を示し、そして10-h10、8-b5、8-b6、8-d4、8
-d9、8-g3および9-f12は既に同定された遺伝子といくらかの相同性を示すことが
見いだされた。

【０４５６】これらクローンのmRNA発現レベルは上記マイクロアレイ技術を用い決定された
。クローン7-G6、8-G3、8-B5、8-B6、8-D4、8-D9、9-F3、9-F12、9-H3、10-A2、
10-A4、11-C9および11-F2が前立腺腫瘍および正常前立腺で過剰発現されている
ことが見いだされた。8-F11の発現増加は前立腺腫瘍および正常な前立腺、膀胱
、骨格筋および結腸で見られた。10-H10の発現増加は、前立腺腫瘍および正常な
前立腺、膀胱、肺、結腸、脳および大腸に見られた。9-B1の発現増加は前立腺癌
、乳ガンおよび正常前立腺、唾液腺、大腸および皮膚に見られ、11-C8の発現増
加は前立腺腫瘍および正常の前立腺と大腸に見られた。

【０４５７】上記のPCRをベースとした正常前立腺サブトラクションより得た追加cDNAの１
断片が前立腺特異的であることが、マイクロアレイ技術およびRT-PCRにより見い
だされた。このクローン（9-A11と称される）について決定されたcDNA配列は配
列番号226に示されている。この配列と公開データベースとの比較したところ、
既知遺伝子HOXB13と99%の同一性が示された。さらに研究を行い、クローン8-C6および8-H7を単離した。これらクローンにつ
いて決定されたcDNA配列はそれぞれ配列番号227および228に示されている。これ
ら配列は単離済みのESTといくらか相同性を示すことが見いだされた。

【０４５８】 PCRおよびハイブリダイゼーションをベースとする方法を用いてクローンP20（
P703Pとも呼ばれる）に関するより長いcDNA配列を得、遺伝子の5'末端をさらに
伸ばした３種類の追加のcDNA断片を得た。これらP703PDE5、P703P6.26およびP70
3PX-23（配列番号326、328および330、それぞれ対応する推定アミノ酸配列が配
列番号327、329および331に示される）と呼ばれる断片は、cDNAライブラリー（#
141-26）をP703Pの一部をプローブとして用いるスクリーニングにかけることで
、回収された追加の5'配列P703PDE5を含む。

【０４５９】 P703P6.26は３種類の前立腺腫瘍cDNA混合体より回収され、そしてP703PX_23は
cDNAライブラリー（#438-48）より回収された。まとめると、追加配列は推定シ
グナル配列の一部と共に推定成熟型セリンプロテアーゼの全てを含んでいる。P7
03Pの完全長cDNA配列は配列番号524に、そして対応するアミノ酸配列は配列番号
525に示されている。

【０４６０】コンピューターアルゴリズムを用いたところ、P703Pの以下の領域が潜在的なH
LA A2-結合CTLエピトープを示すことが予測された：配列番号525のアミノ酸164-
172（配列番号723）；配列番号525のアミノ酸160-168（配列番号724）；配列番
号525のアミノ酸配列239-247（配列番号725）；配列番号525のアミノ酸118-126
（配列番号726）；配列番号525のアミノ酸112-120（配列番号727）；配列番号52
5のアミノ酸155-164（配列番号728）；配列番号525のアミノ酸117-126（配列番
号729）；配列番号525のアミノ酸164-173（配列番号730）；配列番号525のアミ
ノ酸154-163（配列番号731）；配列番号525のアミノ酸163-172（配列番号732）
；配列番号525のアミノ酸58-66（配列番号733）；および配列番号525のアミノ酸
59-67（配列番号734）。

【０４６１】 P703Pはトロンビンの様な既に同定済みのプロテアーゼにいくらかの相同性を
示すことが判明した。トロンビン受容体は主に高い転移性を示す乳ガン細胞およ
び乳ガン生検サンプルに発現していることが分かっている。トロンビン受容体ア
ンチセンスcDNAの導入は、培養転移性乳ガン細胞の浸潤を阻害することが示され
ている。トロンビン受容体に対する抗体は、トロンビン受容体の活性化およびト
ロンビン誘導血小板活性化を阻害する。さらに受容体の係留リガンドドメインを
組み立てるペプチドは、トロンビンによる血小板凝集を阻害する。P703Pは前立
腺癌では、癌細胞または間質細胞上のプロテアーゼ活性化受容体を介しその役割
を果たすだろう。

【０４６２】 P703Pの持つ潜在的トリプシン様プロテアーゼ活性は、癌細胞膜上のプロテア
ーゼ活性化受容体を活性化して癌発生を促進するか、または隣接細胞（間質細胞
の様な）上のプロテアーゼ活性化受容体を活性化して増殖因子および／またはプ
ロテアーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）を分泌し、これが腫瘍形成、浸
潤および転移を促進するかもしれない。即ちP703Pはプロテアーゼ活性化受容体
の活性化を通じ癌進行および／または転移を促進するのだろう。従ってP703P-受
容体相互作用を遮断するポリペプチドおよび抗体は、前立腺癌の治療に有効に利
用できるだろう。

【０４６３】 P703Pの発現が腫瘍ステージの指標であるグレアソン（Gleason）重症度の上昇
に伴って増加するか決定するために、グレアソンスコア５ないし＞８の範囲の前
立腺腫瘍サンプルに定量PCR分析を行った。P703P発現の平均レベルはグレアソン
スコアの上昇に伴い増加し、P703Pの発現が疾患重傷度の増加と相関するらしい
ことが示された。

【０４６４】前立腺腫瘍プールを正常組織のプールでサブトラクションしたPCRをベースと
したサブトラクションライブラリー（JP：PCRサブトラクションと称する）を用
いた別の研究より13個の追加クローンが単離され、そのうちの７個は既知GenBan
k配列と有意な相同性を共有しなかった。これら７個のクローン（P711P、P712P
、novel23、P774P、P775P、P710PおよびP768P）について決定されたcDNA配列は
それぞれ配列番号307-311、313および315に示している。

【０４６５】残りの６クローン（配列番号316および321-325）は既知遺伝子といくらかの相
同性を示した。マイクロアレイ分析より、これら13個のクローン全てが正常非前
立腺組織に比べ前立腺腫瘍、BPHおよび正常前立腺において３またはそれ以上の
倍率で過剰発現していることが示された。クローンP711P、P712P、novel23およ
びP768Pは試験した大部分の前立腺腫瘍およびBPH組織(n=29）ならびに正常前立
腺組織の多く(n=4)で過剰発現を示したが、全ての正常組織ではバックグランド
ないし低いレベルの発現であった。クローンP774P、P775PおよびP710Pは比較的
低い発現を示し、発現を示す前立腺腫瘍およびBPHサンプルも少数であり、正常
前立腺では陰性ないし低い発現であった。

【０４６６】更なる研究よりP712P（配列番号552）に関する延長cDNA配列が単離された。配
列番号552の配列内に存在する16個の推定オ−プンリーディングフレームにより
コードされたアミノ酸配列は配列番号553-568に示されている。

【０４６７】 P711Pに関する完全長cDNAは、配列番号307の部分配列を用いて前立腺cDNAライ
ブラリーをスクリーニングすることで得た。具体的には標準的技術を用いて定方
向クローニングされた前立腺cDNAライブラリーを調製した。このライブラリーの
100万個のコロニーをLB/Ampプレートに接種した。ナイロン膜フィルターを用い
てこれらクローンをつり上げ、そしてこれらフィルターによって取り上げられた
cDNAを変性し、UV光を用いてフィルターに架橋結合した。配列番号307のP711PcD
NA断片を放射線標識し、これらフィルターのハイブリダイゼーションに用いた。
陽性クローンを選択し、cDNAを調製、自動パーキンエルマー／アプライドバイオ
システムズシークエンサーを用い配列決定した。決定されたP711Pの全長配列は
配列番号382に、そして対応する推定アミノ酸配列は配列番号383に示されている
。

【０４６８】 PCRおよびハイブリダイゼーションをベースとする方法を用いて、上記２クロ
ーン、即ち以後それぞれここではP707PおよびP714Pと称される11-C9および9-F3
より追加のcDNA配列情報を得た（配列番号333および334）。最新のGenBankとの
比較より、P707Pは既知遺伝子HoxB13のスプライス変異体であることが判明した
。これに対しP714Pについては有意な相同性は認められなかった。配列番号334を
標準的全長クローニング法に於けるプローブとして用いた別の研究から、P714P
に関する延長cDNA配列を得た。この配列は配列番号619に示されている。この配
列はリボソームL23A蛋白質をコードする遺伝子にある程度の相同性を示すことが
見いだされた。

【０４６９】クローン8-B3、P-89、P98、P130およびP201（1998年、２月９日出願、米国特
許出願第09/020,956に開示される様に）は、P705P（配列番号335で、対応する推
定アミノ酸配列は配列番号336に示される）と呼ばれる１個の連続配列内に含ま
れていることが見いだされており、それは既知遺伝子NKX3.1のスプライス変異体
であることが決定されている。

【０４７０】 P775Pに関する更なる研究の結果、全てP775P遺伝子のスプライス変異体である
４個の追加配列（配列番号473-476）が単離された。配列番号474の配列は２個の
オ−プンリーディングフレーム(ORF）を含むことが見いだされている。これらOR
Fにコードされる推定アミノ酸配列は配列番号477および478に示されている。配
列番号475のcDNA配列は配列番号479のアミノ酸配列をコードするORFを含むこと
が見いだされている。配列番号473のcDNA配列は４つのORFを含むことが見いださ
れている。これらOFRによりコードされるcDNA配列は配列番号480-483に示されて
いる。追加のP775Pのスプライス変異体は配列番号593-597に示されている。

【０４７１】続く研究よりキャッツアイ症候群領域として知られる染色体22q11.2上のゲノ
ム領域が同定され、その領域は５個の前立腺遺伝子P704P、P712P、P774P、P775P
およびB305Dを含でいた。このゲノム領域内にあるこれら５遺伝子の相対位置を
図10に示す。従ってこの領域は悪性腫瘍と関連すると思われ、そしてその他潜在
的腫瘍遺伝子がこの領域に含まれている可能性がある。これら研究はさらにP775
P（配列番号533に示す）に関する、配列番号534のアミノ酸配列をコードしてい
る潜在的オ−プンリーディングフレーム(ORF）も同定した。

【０４７２】配列番号325のクローン（P558Sと呼ぶ）とGenBankおよびGeneSeqDNAデータベ
ースとの比較からは、P558Sが、２つの形を持つことが知られている前立腺特異
的トランスグルタミナーゼ遺伝子と同一であることが示された。この２つの形の
完全長配列はそれぞれ配列番号630および631、対応するアミノ酸配列は配列番号
632および633に示されている。配列番号631のcDNA配列は15対塩基のインサート
を有しており、その結果対応するアミノ酸配列中に５アミノ酸の挿入が生じた（
配列番号633）。この挿入は配列番号630の配列内には存在していない。

【０４７３】 P768P（配列番号315）に関する更なる研究により、推定完全長オープンリーデ
ィングフレーム(ORF)が同定された。停止コドンを持つORFのcDNA配列は配列番号
764に示されている。停止コドンを持たないOFRのcDNA配列は配列番号765に示さ
れており、対応するアミノ酸配列は配列番号766に示されている。この配列はラ
ットカルシウム輸送蛋白質と80%の同一性を示し、P767Pがヒトカルシウム輸送蛋
白質である可能性を示唆した。P768P内の膜貫通ドメインの位置は、PSORTIIコン
ピューターアルゴリズムを用い推測された。６個の膜貫通ドメインがアミノ酸位
置118-134、172-188、211-227、230-246、282-298および348-364に推測された。
配列番号767-722のアミノ酸配列はそれぞれP768Pのアミノ酸1-134、135-188、18
9-227、228-246、247-298および299-511を表している。

【０４７４】実施例４．ポリペプチドの合成ポリペプチドはパーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ430Aペプチド
合成装置を用い、HPTU(O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウ
ムヘキサフルオロリン酸）活性化を利用したFMOC化学を利用して合成される。ペ
プチドのアミノ末端には、固定面へ共役し、結合し、またはペプチド標識する方
法を提供するためにGly-Cys-Gly配列を取り付けても良い。固相支持体からのペ
プチド切断は、次の切断混合液を利用し実施される：トリフルオロ酢酸：エタン
ジチオール：チオアニソール：水：フェノール（40:1:2:2:3）。

【０４７５】２時間切断した後、ペプチドは冷メチル-t-ブチル-エーテルで沈殿される。次
にペプチド沈渣は0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水に溶解され、C18逆相HPLC
で精製される前に凍結乾燥される。0%-60%（0.1%TFAを含む）のアセトニトリル
勾配水溶液（0.1%TFAを含む）を用いペプチドを溶出する。精製分画を凍結乾燥
した後、ペプチドはエレクトロスプレーまたはその他タイプのマススペクトロメ
トリーにより、およびアミノ酸分析により特性分析される。

【０４７６】実施例５．PCRベースサブトラクションを用いた前立腺特異ポリペプチドの更な
る単離および特性分析上記の様に前立腺原発性腫瘍mRNAより作成されたcDNAを、正常前立腺由来cDNA
でサブトラクションした。サブトラクションは、より長い断片を生成するように
改良されたPCRをベースとするプロトコール（クローンテック(Clontech））を用
い実施された。

【０４７７】このプロトコールでは、テスターおよびドライバーの２本鎖cDNAは別々に、６
種類のヌクレオチド制限部位（MluI、MscI、PvuII、SaIIおよびStuI）を認識す
る５種類の制限酵素で消化された。この消化では、クローンテックプロトコール
のRsaI消化で生じる平均サイズ300bpではなく、平均サイズ600bpのcDNAが生じた
。この改良はサブトラクション効率に影響しなかった。次に異なるアダプターを
使って２種類のテスター集団が作成され、そしてドライバーライブラリーはアダ
プターなしの状態で維持された。

【０４７８】次にテスターおよびドライバーライブラリーは、過剰のドライバーcDNAを用い
ハイブリダイゼーションされた。第１ハイブリダイゼーション段階では、ドライ
バーは２種類のテスターcDNA集団それぞれに別々にハイブリダイゼーションされ
た。その結果、(a)ハイブリダイゼーションしていないテスターcDNA、(b)他のテ
スターcDNAとハイブリダイゼーションしたテスターcDNA、(c)ドライバーcDNAと
ハイブリダイゼーションしたテスターcDNA、および(d)ハイブリダイゼーション
しなかったドライバーcDNAの集団が生じた。

【０４７９】次に２つの別々のハイブリダイゼーション反応液をまとめ、追加の変性ドライ
バーcDNA存在下に再ハイブリダイゼーションを行った。この２回目のハイブリダ
イゼーション後に、(a)ないし(d)の集団に加え、あるアダプターを持つテスター
cDNAで第２アダプターを持つテスターcDNAをハイブリダイゼーションした５番目
の集団(e)が生成された。その結果第２ハイブリダイゼーション段階では、アダ
プター特異的プライマーを用いたPCR増幅に鋳型として利用できる差別的に発現
された配列が濃縮された。

【０４８０】末端部分を充足し、アダプター特異的プライマーを用いてPCR増幅を行った。
ドライバーcDNAとハイブリダイゼーションしなかったテスターcDNAを含む集団(e
)のみが対数的に増幅された。次に第２PCR増幅段階を実施し、バックグランドを
下げ、さらに差別的に増幅された配列を濃縮した。このPCRをベースとするサブトラクション技術は、差別的に発現したcDNAを正
規化するため、前立腺腫瘍組織内で過剰発現されている稀な転写体を回収するこ
とができる。この様な転写体は従来のサブトラクション法で回収することは困難
であろう。

【０４８１】前立腺腫瘍内で過剰発現されていることが既知の遺伝子に加え、77個のクロー
ンがさらに同定された。これら部分cDNAの配列は配列番号29ないし305に示され
ている。これらクローンの大部分はデータベース配列と有意な相同性を示さなか
った。例外はJPTPN23（配列番号231；ブタバロシン含有蛋白質に類似）、JPTPN3
0（配列番号234；プロテオソームに関するラットmRNAに類似）JPTPN30（配列番
号234；ラットノルベギカス（norvegicus）細胞質NADP-依存型イソシトレートデ
ヒドロゲナーゼに類似）、JPTPN46（配列番号244；ヒトサブクローンH8 4 d4 DN
A配列に類似）、Jp1d6（配列番号265；G.gallusダイニン軽鎖-Aに類似）、JP8D6
（配列番号288；ヒトBACクローンRG016J04に類似）、JP8F5（配列番号289；ヒト
サブクローンH8 3 b5 DNA配列に類似）およびJP8E9（配列番号299；ヒトAlu配列
に類似）であった。

【０４８２】 PCRをベースとした、正常前立腺プールに対し前立腺腫瘍プールをサブトラク
ションすること（PT-PN PCRサブトラクションと呼ぶ）を含むサブトラクション
ライブラリーを用いた追加研究から、さらに３個の追加クローンが得られた。こ
れらクローンのcDNA配列と最新のGenBankとの比較からは、P715PおよびP767P（
配列番号312および314）と称される２クローンについて、有意な相同性は示され
なかった。

【０４８３】マイクロアレイ分析を用い各種組織中のmRNA発現レベルを測定したところ、３
クローン全てが前立腺腫瘍およびBPH組織内で過剰発現していることが見いださ
れた。具体的にはクローンP715Pは大部分の前立腺腫瘍およびBPH組織において３
倍またはそれ以上過剰発現されており、また多くの正常前立腺サンプルおよび胎
児組織でも発現増加が認められるが、その他全ての正常組織での発現は陰性また
は低かった。クローン767Pは複数の前立腺腫瘍およびBPH組織で過剰発現され、
半数の正常前立腺サンプルでは軽度の発現レベルを示し、その他の試験した全正
常組織ではバックグランドまたは低発現であった。

【０４８４】上記マイクロアレイによる、PT-PN PCRサブトラクションライブラリーおよび
正常組織cDNAのプールでサブトラクションされた前立腺腫瘍由来のcDNAを含むDN
Aサブトラクションライブラリーを更に分析した結果、前立腺腫瘍で過剰発現す
ることが確定された27個のクローンがさらに単離された（配列番号340-365およ
び381）。配列番号341、342、345、347、348、349、351、355-359、361、362お
よび364のクローンは正常前立腺で発現していることが見いだされた。

【０４８５】各種正常組織内では全26クローンとも発現が低いかまたは検出されないことが
見いだされたが、P544S（配列番号336）は例外で、小腸にて発現していることが
見いだされた。26クローンのうち11（配列番号340-349および362）はこれまでに
同定されている配列にいくらか相同性を示すことが判明した。配列番号350、351
、353-361および363-365のクローンについては有意な相同性は認められなかった
。

【０４８６】配列番号362とGenBankおよびGeneSeq DNAデータベースとの比較からは、この
クローン（P788Pと称す）はGeneSeq登録番号X27262と同一で、GeneSeq登録番号Y
00931に見いだされる蛋白質をコードしている。P788Pの完全長cDNA配列は配列番
号635に示されており、対応する推定アミノ酸は配列番号635に示されている。続
いて配列番号634の配列には認められない多形を含むP788Pの完全長cDNA配列を、
３個人に由来する複数のRNA鋳型から調製したcDNAからPCR増幅し、複数回クロー
ン化した。P788Pのこの多形について決定されたcDNA配列は配列番号636に示され
ており、対応するアミノ酸配列はは配列番号637に示されている。配列番号637の
配列は配列番号635の配列と６カ所のアミノ酸残基で異なっていた。P788P蛋白質
は７個の潜在的膜貫通ドメインをC-末端部分に有しており、そして細胞外N-末端
老域を持つ原形質膜蛋白質と推定されている。

【０４８７】配列番号352のクローン（P790Pと称す）について更に研究したところ、配列番
号526の完全長cDNA配列が単離された。対応する推定アミノ酸は配列番号527に示
されている。２回の定量的PCR実験のデータよりP790Pが試験した前立腺腫瘍サン
プル中11/15で過剰発現されていること、そして脊髄では発現が低レベルである
こと、ならびに試験したその他正常サンプルでは発現が見られないことが示され
た。さらなるPCR実験およびマイクロアレイ実験のデータは、正常前立腺および
前立腺腫瘍では過剰発現していること、そしてその他試験した組織では発現がほ
とんどないか、または全くないことが示された。その後P790Pは従来同定されて
いるG-蛋白質結合前立腺組織受容体と有意な相同性を示すことが判明した。

【０４８８】配列番号354のクローン（P776Pと称す）について更に研究したところ、配列番
号569に示す延長cDNA配列が単離された。P776Pの３種類の追加スプライス変異体
について決定されたcDNA配列を配列番号570-572に示す。配列番号570に含まれ２
個の推定オープンリーディングフレーム(ORF)、配列番号571に推定ORFが含まれ
る１個の推定ORF、そして配列番号569内に含まれる11個の推定ORFによりコード
されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号573-586に示されている。更に研究し
たところ、配列番号570クローンに関する完全長配列（配列番号737に示される）
が単離された。

【０４８９】配列番号571のクローンについて完全長クローニングを試みた結果、２種類の
配列（配列番号738および739に示す）が単離され、一方のクローンは位置1293に
ある多形の挿入／欠失以外は同一であった。具体的には、配列番号739のクロー
ン（クローンF1と称す）は位置1293の位置に１塩基対の欠失を持つ。配列番号73
7内に位置する５個のオープンリーディングフレームによりコードされる推定ア
ミノ酸配列は配列番号740-744に、そして配列番号738および739のクローンにコ
ードされる推定アミノ酸配列は、配列番号745-750に示されている。

【０４９０】クローンP767P（配列番号314）およびP777P（配列番号350）のcDNA配列とGenB
ankヒトESTデータベースとの比較より、２クローンが多くのEST配列と共通して
合致することが示され、P767PおよびP777Pが同一遺伝子であることが示唆された
。P767P、P777Pおよび複数のESTクローンのDNA配列アラインメントより得たDNA
配列を配列番号587に示す。配列番号587内に存在する３個の推定ORFによりコー
ドされるアミノ酸配列は配列番号588-590に示す。

【０４９１】配列番号342のクローン（P789Pと称す）はこれまでに同定された遺伝子と相同
性を示すことが判明した。P789Pの完全長cDNA配列および対応するアミノ酸配列
はそれぞれ配列番号735および736に示す。

【０４９２】実施例６．マウスのペプチドプライミングおよびCTL細胞株の継代 6.1 本実施例はP502S遺伝子を発現している細胞に特異的なCTL細胞株の調製
を例示する。ヒトHLA A2Kb（Dr.L.Sherman,スクリプス（Scripps)研究所、ラジョラ（La Jo
lla）、カリフォルニア州(CA)）に関するトランス遺伝子を発現しているマウス
を、以下変更を加えTheobaldら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.92：11993-11997
、1995記載の様に P502S遺伝子（ここではJ1-17とも称する、配列番号８）より
得たP2S#12ペプチド（VLGWVAEL；配列番号306）で免疫した。

【０４９３】マウスは100μgのP2S#12および不完全フレンドアジュバント中に乳剤化された
B型肝炎ウイルス蛋白質に由来する120μgのI-A^b結合ペプチドで免疫された。３
週後これらマウスを屠殺し、ナイロンメッシュを使って単細胞懸濁液を調製した
。次に細胞を10%FSC、2mMグルタミン（ギブコ(Gibco）BRL、ガイザイースブルグ
（Gaitehrsbrug）、メリーランド(MD)、ピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）、
非必須アミノ酸（Gbico BRL)、2×10^-5M 2-メルカプトエタノール、50U/mlのペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを含む完全培地（RPMI-1640；ギブコ(Gibco
）BRL、ガイザイースブルグ（Gaitehrsbrug）、メリーランド(MD)中に６×10⁶細
胞/mlに懸濁し、放射線照射照射された（3000rads）、P2S#12でパルス（5mg/mlP
2S#12および10mg/mlβ2-ミクログロブリン）処理したLPSブラスト存在下に（7μ
g/mlの硫酸デキストランおよび25μg/mlのLPS存在下に３日間培養したA2トラン
スジェニック脾臓細胞）培養した。

【０４９４】６日後、細胞（５×10⁵/ml）を2.5×10⁶/mlのペプチドパルス処理した放射線
照射（20,000rads）EL4A2Kb細胞（Shermanら、Science 258:815-818, 1992)およ
び3×10⁶/mlA2トランスジェニック脾臓細胞フィーダー細胞で再刺激した。細胞
を20U/mlのIL-2存在下に培養した。細胞はさらに１週ベースで、細胞株クローニ
ング調製について記載されている様にして再刺激された。

【０４９５】 P2S#12細胞株は、ペプチドパルスされたEL4A2Kb腫瘍細胞（1×10⁴細胞/ウエル
）を刺激体として用い、そしてA2トランス遺伝子脾臓細胞をフィーダー細胞（5
×10⁵細胞/ウエル）として14日間30U/mlのIL-2存在下に増殖される限界希釈分析
によりクローン化され、細胞は以前同様に再刺激された。21日目に増殖したクロ
ーンを単離し、培養して維持した。これらクローンの幾つかがコントロールの繊
維芽細胞に対するよりも、P502Sで形質転換されたヒト繊維芽細胞（HLA A2Kb発
現）に対し有意に高い反応性（溶解）を示した。例を図１に示す。このデータはP2S#12が、ヒトHLA A2Kb分子と関連して発現されるP502S蛋白質
の自然処理型エピトープを表すことを示している。

【０４９６】 6.2 本実施例はマウスCTL細胞株の調製およびP501S遺伝子を発現している細
胞に特異的なCTLクローンを例示する。この一連の実験は、上記同様にして実施された。マウスをP501S遺伝子（ここ
ではL1-12とも呼ばれる、配列番号110）より得たP1S#10ペプチド（配列番号337
）で免疫した。P1S#10ペプチドは公開されているHLA-A2結合モチーフ（Parker、
KCら、J.Immunol.,152:163、1994）により定義された潜在的HLA-A2結合配列に関
するP501Sの推定ポリペプチドの分析より得た。

【０４９７】 P1S#10ペプチドは実施例４記載の様に合成され、T細胞をベースとする競合ア
ッセイを用いHLA-A2結合について経験的に試験された。推定A2結合ペプチドは、
HLA-A2結合インフルエンザマトリックスペプチド、fluM58に特異的であるHLA-A2
拘束CTLクローン（D150M58)に対するHLA-A2特異ペプチド提示と競合する能力に
ついて試験された。

【０４９８】競合アッセイでは、CTL上にHLA-A2を結合させるため、D150M58CTLの培養体に1
00-200μg/mlの試験ペプチドが加えられた。30分後、標準的TNFバイオアッセイ
を用い、試験ペプチドまたはコントロールペプチドと共に培養したCTLを、それ
らの抗原がfluM58ペプチドに対し反応するか試験した。図３に示す様に、ペプチ
ドP1S#10はfluM58のHLA-A2拘束提示を競合し、ペプチドP1S#10がHLA-A2に結合す
ることを示した。

【０４９９】ヒトHLA A2Kbに関するトランス遺伝子を発現しているマウスを、Theobaldら（
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11993-11997, 1995）報告を以下の如く変更し
て用い免疫した。マウスを62.5μgのP1S#10および不完全フレンドアジュバント
中に乳剤化されたB型肝炎ウイルス蛋白質に由来する120μgのI-A^b結合ペプチド
で免疫した。３週後これらマウスを屠殺し、ナイロンメッシュを用い単細胞懸濁
液を調製した。

【０５００】次に細胞を完全培地（上記）中に６×10⁶細胞/mlに懸濁し、放射線照射した（
3000rads）P2S#12パルス処理済み（2μg/mlP1S#10および10mg/mlβ2-ミクログロ
ブリン）LPSブラスト（7μg/mlの硫酸デキストランおよび25μg/mlのLPS存在下
に３日間培養したA2トランスジェニック脾臓細胞）存在下に培養した。６日後、
細胞（５×10⁵/ml）を上記の2.5×10⁶/mlのペプチドパルス処理した放射線照射
（20,000rads）EL4A2Kb細胞および3×10⁶/mlA2トランスジェニック脾臓細胞フィ
ーダー細胞で再刺激した。細胞を20U/mlのIL-2存在下に培養した。細胞はさらに
１週ベースで再刺激し、クローニングに備えた。インビトロ刺激を３回繰り返し
た後、図４に示す様にP1S#10パルス処理したJurkat A2Kb標的細胞およびP501S-
形質転換Jurkat標的細胞を認識する１細胞株胞株が生成された。

【０５０１】 P1S#10特異的CTL細胞株は、ペプチドパルスされたEL4A2Kb腫瘍細胞（1×10⁴細
胞/ウエル）を刺激体として用い、A2トランスジェニック脾臓細胞をフィーダー
細胞（5×10⁵細胞/ウエル）として14日間30U/mlのIL-2存在下に増殖される限界
希釈分析によりクローン化された。21日目に生存クローンが単離され、培養し維
持された。図５に示す様に、これらクローンのうちの５クローンが、P501S形質
転換Jurkat A2Kb標的細胞に対し特異的細胞溶解性活性を示した。このデータはP
1S#10が、ヒトHLA-A2.1分子と関連して発現されるP501S蛋白質の自然処理エピト
ープを表すことを示している。

【０５０２】実施例７．前立腺抗原を有する裸DNA免疫を用いたインビボでのCTLプライミング前立腺特異抗原L1-12は、上記の如くP501Sとも呼ばれる。HLA A2Kb Tgマウス
（Dr.L.Sherman、スクリプス研究所、ラジョラ、カリフォルニア州提供）を100
μgのベクターVR1012中P501Sを用いて筋肉内または経皮的に免疫した。マウスは
３回、２週間隔免疫された。最終免疫から２週後、免疫脾臓細胞をJurkat A2Kb-
P501S形質導入刺激細胞と共に培養した。インビトロ刺激２週後、CTL活性をP501
S形質導入標的細胞に対し調べた。８匹のマウスの内２匹が強い抗P501SCTL反応
を生じた。これらの結果は、P501Sが少なくとも１個自然処理されたHLA-A2拘束C
TLエピトープを含むことを示している。

【０５０３】実施例８．前立腺特異ポリペプチドを認識するヒトT細胞の能力本実施例は前立腺腫瘍ペプチドに対し特異的なT細胞のヒト腫瘍認識能力を例
示する。ヒトCD8+T細胞をVan Tsaiら、（Critical Reviews in Immunology 18:65-75,
1998）に従って樹状細胞を用い、P502S（J1-17とも呼ばれる）由来のP2S-12ペプ
チド（配列番号306）に対しインビトロでプライムした。得られたCD8⁺T細胞の微
量培養体を、γ-インターフェロンELISPOTアッセイ（Lalvaniら、J.Exp.Med. 18
6:859-8657参照）を用い、自家繊維芽細胞またはP502S遺伝子を発現する様に形
質導入された繊維芽細胞が提示するP2S-12ペプチドを認識するそれらの能力につ
いて試験した。

【０５０４】簡単に述べると、T細胞の力価数を3μg/mlのヒトβ2-ミクログロブリンおよび
１μg/mlのP2S-12ペプチドまたはコントロールのE75ペプチド存在下、10⁴繊維芽
細胞について二重アッセイした。さらにT細胞は同時にP502S遺伝子で形質導入さ
れた自家繊維芽細胞、またはコントロールとしてHER-2/neuで形質導入された繊
維芽細胞についてもアッセイされた。アッセイ前、繊維芽細胞は10ng/mlのγ-イ
ンターフェロンで48時間処理され、クラスIMHCの発現をアップレギュレーション
した。微量培養体の一つ(#5)が、γ-インターフェロンELISPOTアッセイでペプチ
ドパルス処理した繊維芽細胞ならびに形質導入繊維芽細胞の両方に強い認識を示
した。

【０５０５】図2Aは、P2S-12ペプチドでパルス処理された繊維芽細胞上のT細胞数の増加に
伴って、γ-インターフェロンのスポット数も大きく増加するが（実線）、コン
トロールE75ペプチドでは増加しない（破線）ことを示す。これは、これらT細胞
のP2S-12ペプチドを特異的に認識する能力を示している。

【０５０６】図2Bに示す様にこの微量培養体も、P502S遺伝子を発現するがHER-2/neu遺伝子
は発現しない様形質導入された繊維芽細胞上のT細胞が増加するのに伴ってγ-イ
ンターフェロンスポット数が増加するが、ことを示した。これらの結果は、P2S-
12ペプチドが自然処理されたP502S蛋白質エピトープであること証明する更なる
証拠を提供している。さらに、このことはヒトＴ細胞レパートリーの中にこのエ
ピトープを認識できる高親和性T細胞が存在することも示している。これらT細胞
はP502S遺伝子を発現するヒト腫瘍を認識することもできる。

【０５０７】実施例９．ヒト血液中での前立腺抗原特異的CTL反応の誘導本実施例は、正常人の血液に於いてCTL反応を惹起する前立腺特異抗原の能力
について例示する。自家樹状細胞（DC)は、正常人ドナーのPBMCに由来する単球培養体より、10%ヒ
ト血清、50ng/mlのGMCSFおよび30ng/mlのIL-4を含むRPMI培地中に５日間増殖さ
せることで分化させた。培養後、一晩DCをM.O.I５の組換え体P501S発現ワクシニ
アウイルスで感染させ、２μg/mlのCD40リガンドを加え８時間成熟させた。

【０５０８】ウイルスをUV照射により不活性化し、CD8+細胞を磁性ビーズを用いポジティブ
選別して単離し、24ウエルプレート内にて初代培養を開始した。レトロウイルス
によりP501SおよびCD80を発現するよう形質導入された自己繊維芽細胞を使って
５回刺激サイクルを実施した後、自己P501S形質導入繊維芽細胞で刺激したとき
特異的にインターフェロンガンマを生ずるCD8+細胞株を同定した。

【０５０９】細胞株3A-1のP501S特異活性は、P501Sで形質導入された自己B-LCLに追加の刺
激サイクルを行うことで維持できるだろう。細胞傷害性アッセイ（⁵¹Cr放出）お
よびインターフェロンガンマ生産（Interferon gamma Elispot;上記およびLavan
iら、J. Exp. Med. 186:859-865, 1997参照）より測定したところ、細胞株3A-1
はP501Sを発現する様形質導入された自己B-LCLを特異的に認識するが、PGFP形質
導入自己B-LCLは認識しないことが示された。これらアッセイの結果を図6Aおよ
び6Bに示す。

【０５１０】実施例10 ．前立腺特異抗原P703P内に含まれる自然処理CTLエピトープの同定９merのペプチドP5（配列番号338）はP703P抗原（P20とも呼ばれる）より得た
。p5ペプチドはヒトHLA-A2ドナー中の免疫源であり、自然処理されたエピトープ
である。抗原特異的CD8+T細胞は、p5ペプチドでパルス処理された単球を用いイ
ンビトロ刺激を反復することでプライムできる。これらCTLはELISPOT（上記）お
よびクロム放出アッセイに於いて、p5-パルス処理された標的細胞、およびP703P
形質導入された標的細胞を特異的に認識する。さらに、p5を使ったHLA-A2Kbトラ
ンスジェニックマウスの免疫化によりHLA-A2KbまたはHLA-A2が形質導入されたP7
03Pを発現する各種標的細胞を認識するCTL細胞株が生成された。

【０５１１】 p5が自然処理されたエピトープであることを示した最初の研究は、HLA-A2Kbト
ランスジェニックマウスを用いて行われた。HLA-A2Kbトランスジェニックマウス
は、140μgのB型肝炎ウイルスコアペプチド（Thペプチド）のフレンド不完全ア
ジュバント液と共に100μgのp5ペプチドで足蹠に皮下免疫された。免疫後３週目
に免疫マウスの脾臓細胞をペプチドパルス処理したLPL芽細胞でインビトロ刺激
した。CTL活性は、最初のインビトロ刺激後５日目にクロム放出アッセイにより
調べた。レトロウイルスで形質導入された、コントロール抗原P703PおよびHLA-A
2bを発現する細胞を標的として用いた。p5-パルス処理された標的細胞およびP70
3Pを発現する標的細胞の両方を特異的に認識するCTL細胞株が同定された。

【０５１２】ヒトでのインビトロプライミング実験は、p5ペプチドがヒトに於いて免疫原性
であることを示した。樹状細胞(DC)は正常人ドナーのPBMCより、５日間10%ヒト
血清、50ng/mlのヒトGM-CSFおよび30ng/mlのヒトIL-4を含むRPMI培地中で培養す
ることで分化させた。培養後、DCを1μg/mlのp5ペプチドでパルス処理し、CD8+T
細胞リッチPBMCと共培養した。CTL細胞株はp5-パルス処理した単球を用い週ベー
スで刺激された。CTL培養開始５ないし６週後に、p5-パルス処理標的細胞のCTL
認識が示された。CTLはさらにP703Pを発現するよう形質導入されたヒト細胞を認
識することが示され、p5が自然処理されたエピトープであることが示された。

【０５１３】さらにHLAクラスII分子と関連して細胞表面上にてCD4T細胞により認識される
前立腺腫瘍特異的抗原P703P由来ペプチドエピトープ（ペプチド４と呼ぶ）を同
定する研究を次の様にして行った。ペプチド４のアミノ酸配列は配列番号638に
示されており、対応するcDNA配列は配列番号639に示されている。

【０５１４】 10アミノ酸づつ重複する、P703Pのカルボキシ末端に由来する12種類の15-mer
ペプチドが標準的手順により作製された。樹状細胞（DC)はGM-CSFおよびIL-4を
用い、標準的プロトコールにより正常女性ドナーのPBMCと共培養より得た。CD4T
細胞は同一ドナーより、MACSビーズとネガティブ選別法を用いDCとして生成され
た。DCは一晩、それぞれペプチド最終濃度が0.25μg/mlである15-merのペプチド
のプールでパルス処理された。パルス処理されたDCは洗浄され、1×10⁴細胞/ウ
エルの割合で96-ウエル型V底プレートに接種され、精製CD4T細胞を１×10⁵/ウエ
ルで加えられた。

【０５１５】培養体には60ng/mlのIL-6および10ng/mlのIL-12が添加され、37℃にてインキ
ュベーションされた。培養体は生成されたDCを用いて上記同様週ベースに再刺激
され、上記同様抗原提示細胞でパルス処理され、5ng/mlのIL-7および10u/mlのIL
-2が補給された。４回インビトロ刺激サイクルを行った後、96細胞株（１ウエル
に各細胞株に対応する）をコントロールとして用いられる乳グロビン由来の無関
係なペプチドのプールを使ったプール刺激に対する特異的増殖およびサイトカイ
ン産生について試験した。

【０５１６】 P703Pペプチドのプール#1に反応して、特異的増殖（3H増殖アッセイにより測
定した）およびサイトカイン産生（インターフェロンガンマELISAアッセイによ
り測定された）を示した細胞株１株（1-F9と呼ぶ）が同定された。この細胞株は
さらに、ペプチドプールの特異認識、プール中の個別ペプチドの特異認識、およ
び関連拘束アリルを同定するためのHLAミスマッチ分析について試験された。

【０５１７】細胞株1-F9は、ペプチドプール#1および同様にペプチド４（配列番号638）に
反応し特異的に増殖し、そしてインターフェロンガンマを生産することが見出さ
れた。ペプチド４は配列番号327のアミノ酸126-140に対応する。ペプチド力価実
験を行い、特異的ペプチドに対する細胞株1-F9の感受性について調べた。この細
胞株はペプチド４と0.25ng/ml程度の低濃度で特異的に反応することが見出され
、T細胞が非常に感受性であり、従ってこのエピトープに対し高い親和性を持つ
と思われることを示した。

【０５１８】 P703P反応のHLA拘束を決定するために、T細胞の作製に使用したドナーと一部
一致する抗原提示細胞(APC)のパネルを作った。APCはペプチドでパルスされ、細
胞株1-F9と共に増殖およびサイトカインアッセイに使用された。HLA-DRB0701お
よびHLA-DQB02アリルがドナーと一致するAPCはT細胞にペプチドを提示すること
ができ、P703P-特異的反応がこれらアリルの一つに拘束されていることが示唆さ
れた。

【０５１９】抗体ブロッキングアッセイを使って、拘束アリルがHLA-DR0701またはHLA-DQ02
であるか決定した。抗HLA-DRブロッキング抗体L243または無関係なイソ型が一致
するIgG2aを、250ng/mlのペプチドRMPTVLQCVNVSVVS（配列番号638）でパルス処
理したT細胞およびAPC培養体に加えた。標準的なインターフェロンガンマおよび
増殖アッセイを行った。コントロール抗体はT細胞のペプチドパルス処理APCの認
識能力に影響を及ぼさなかったが、いずれのアッセイでも抗HLA-DR抗体はT細胞
のペプチドパルス処理APCを特異的に認識する能力を完全に遮断した。

【０５２０】ペプチドエピトープRMPTVLQCVNVSVVS（配列番号638）が自然処理されるか決定
するために、組換え体P703P蛋白質でパルス処理されたAPCを認識する1-F9細胞株
の能力について検討した。これら実験には複数の組換え体P703P源が用いられた
；大腸菌由来P703P、酵母（Pichia）由来P703Pおよびバキュロウイルス由来P703
Pである。使用した無関係な蛋白質コントロールは大腸菌由来のL3E、肺特異的抗
原およびバキュロウイルス由来乳グロビンである。

【０５２１】インターフェロンガンマELISAアッセイでは、細胞株I-F9は大腸菌型P703Pおよ
び酵母由来組換え体P703Pの両方を効率的に認識できたが、バキュロウイルス由
来P703Pは効果的には認識されなかった。その後のウエスタンブロット分析では
、大腸菌および酵母P703P蛋白質標本は無傷であったが、バキュロウイルスP703P
標本はおよそ75%が分解していた。即ちP703P由来ペプチドRMPTVLQCVNVSVVS（配
列番号638）はP703P由来の自然処理された得プチドエピトープであり、HLA-DRB-
0701に関連してT細胞に提示される。

【０５２２】さらなる研究では、10アミノ酸づつ重複する、P703PN-末端由来の12種類の15-
merペプチド（配列番号525のアミノ酸27-154に相当する）が標準的手順により作
製され、そして本質的には上記同様にしてCD4細胞により認識されるそれらの能
力が決定された。DCは一晩、各ペプチドの最終濃度が0.25μg/mlである15-merの
ペプチドのプールでパルス処理された。多くの個別CD4T細胞株（65/480）が、P7
03Pペプチドプールに反応して有意な増殖およびサイトカイン放出（IFN-ガンマ
）を示したが、コントロールペプチドプールに対してはこれらを示さなかった。
特異活性を示したCD4T細胞株は適当なP703Pペプチドプールで再刺激され、各プ
ールの個別ペプチドについて再アッセイされ、そしてIFN-γ放出アッセイおよび
増殖アッセイにてペプチドプールのペプチド投与量力価がアッセイされた。

【０５２３】 16種類の免疫源ペプチドが試験したペプチド抗原の全セットから得たT細胞に
より認識された。これらペプチドのアミノ酸配列は配列番号656-671に示されて
おり、対応するcDNA配列は配列番号640-655にそれぞれ示されている。幾つかの
例では、T細胞株のペプチド反応性は単一ペプチドにマッピングされたが、幾つ
かは各プール中のなかの１より多いペプチドにマッピングされた。

【０５２４】これらペプチドに対し合理的な親和性を持つ各ペプチドプールから、代表的な
認識パターンを示したCD4T細胞株を選びだし更に解析した（I-1A、-6A；II-4C、
-5E；III-6E、IV-4B、-3F、-9B,-10F、V-5B-4Dおよび-10F）。これらCD4T細胞株
は適当な個別ペプチドで再刺激され、大腸菌で作製された組換え体P703P蛋白質
の切断型（配列番号525のアミノ酸96-254）、バキュロウイルス発現システムで
作製された完全長P703P、および大腸菌で作製されたインフルエンザウイルスNS1
およびP703Pの融合体によりパルス処理された自己DCを用い再アッセイされた。

【０５２５】試験したT細胞株のうち、細胞株I-1Aは切断型P703P（大腸菌）を特異的に認識
したが、他のP703Pの組換え体型は認識しなかった。この細胞株はT細胞惹起に用
いたペプチドも認識した。細胞株2-4Cは、P703P（大腸菌）切断型およびバキュ
ロウイルスで作製されたP703Pの完全長型、ならびにペプチドを認識した。試験
したT細胞株の残りは、ペプチドにのみ特異的であるか（II-5E、II-6F、IV-4B、
IV-3F、IV-9B、IV-10F、V-5BおよびV-4D）または試験したいずれの抗原にも非反
応性であった（V-10F）。

【０５２６】これら結果は、T細胞株I-1Aに認識されるペプチド配列RPLLANDLMLIKLDE（配列
番号671、即ち配列番号525のアミノ酸110-124に相当）およびT細胞株II-4Cによ
り認識されるペプチド配列SVSESDTIRSISIAS（配列番号668；配列番号525のアミ
ノ酸125-139に相当）およびISIASQCPTAGNSCL（配列番号667；配列番号525のアミ
ノ酸135-149に相当）がP703蛋白質の自然処理エピトープであることを示してい
る。

【０５２７】実施例11 ．前立腺に於ける乳癌由来抗原の発現示差表示法による乳癌からの抗原B305Dの単離は、1996年８月20日出願の米国
特許出願第08/700,014号に記載されている。本抗原の複数の異なるスプライス型
が単離されている。これらスプライス型について決定されたcDNA配列は、配列番
号366-375に示されており、配列番号292、298および301-303の配列に対応する推
定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号299-306に示されている。

【０５２８】さらなる研究で、位置884にグアニンの付加残基を含み、オープンリーディン
グフレーム内にフレームシフトを生じせしめることが分かっている配列番号366
のcDNA配列のスプライス変異体（配列番号530)が単離された。このOFRについて
決定されたDNA配列は配列番号531に示されている。このフレームシフトにより、
B305Dの他イソ型に共通したC-末端ドメインを含むが、N-末端領域が異なる蛋白
質配列（配列番号532に示されている）が生じる。

【０５２９】各種腫瘍および正常組織中のB305Dの発現レベルは、リアルタイムPCRおよびノ
ーザン分析により検討された。結果は、B305Dが乳癌、前立腺癌、正常前立腺お
よび正常精巣で高く発現されており、検討したその他組織（結腸癌、肺癌、卵巣
癌および正常骨髄、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、皮膚、小腸、胃）ではその発
現は低いかまたは検出されないことを示した。前立腺腫瘍パネルについてリアル
タイムPCRを用いたところ、前立腺腫瘍でのB305Dの発現はグレアソン等級の上昇
に伴って増加することが示され、前立腺癌が進行するとB305Dの発現が増加する
ことが示された。

【０５３０】実施例12 ．全遺伝子プライミングおよび前立腺特異抗原P501Sによる刺激を用い
たインビトロでのヒトCTLの生成 P501Sワクシニア感染DCによるインビトロ全遺伝子プライミング（例えばYeeら
、The Journal of Immunology, 157(9):4079-86, 1996参照）を利用して、上記
インターフェロンγELISPOT分析により決定した時に、P501S(L1-12としても知ら
れる）で形質導入された自己繊維芽細胞を特異的に認識するヒトCTL細胞株が誘
導された。P501Sで形質導入されたHLA-ミスマッチB-LCL細胞株のパネルを用いて
、これらCTL細胞株がHLABクラスIアリルに拘束されると思われることが示された
。

【０５３１】具体的には、樹状細胞（DC)は正常人ドナーのPBMCに由来する単球培養体より
、10%ヒト血清、50ng/mlのヒトGM-CSFおよび30ng/mlのヒトIL-4を含むRPMI培地
中に５日間増殖させることで分化させた。培養後DC細胞を一晩感染多重度（M.O.
I）５の組換え体P501Sワクシニアウイルスで感染させ、3μg/mlのCD40リガンド
を加え一晩成熟させた。ウイルスをUV照射により不活性化された。CD8+T細胞は
磁性ビーズシステムを用い単離され、標準的培養技術を用いて初代培養が開始さ
れた。

【０５３２】培養体をレトロウイルスによりP501SおよびCD80が形質導入された自己初代繊
維芽細胞を使って7-10日ごとに再刺激した。４回の再刺激サイクル後、自己P501
SおよびCD80-形質導入された自己の繊維芽細胞で刺激したとき特異的にインター
フェロンガンマを生ずるCD8+T細胞株を同定した。反応の拘束アリルを基底する
ために、P501Sで形質導入されたHLAミスマッチB-LCL細胞株のパネルが作られた
。ELISPOTアッセイによりインターフェロン-γを測定し、P501S特異反応がHLA B
アリルにより拘束されるらしいことが示された。これらアッセイの結果は、P501
Sに対するCD8+CTLが惹起可能なことを示している。

【０５３３】認識されるエピトープを同定するために、P501SをコードするcDNAを様々な制
限消化して断片にし、レトロウイルス発現ベクターであるpBIB-KSにサブクロー
ニングした。レトロウイルス上清は、ヘルパーパッケージング細胞株Phenix-Amp
hoのトランスフェクションにより作製された。次に上清を用い、CTLスクリーニ
ング用にJurkat/A2Kb細胞を形質導入した。CTLはIFN-ガンマELISPOTアッセイで
、P501S断片の「ライブラリー」で形質導入されたこれらA2Kb標的についてスク
リーニングされた。

【０５３４】最初の陽性断片P501S/H3およびP501S/F2が配列決定され、それらがそれぞれ配
列番号113のアミノ酸106-553およびアミノ酸136-547をコードしていることが見
出された。配列番号113のアミノ酸106-351をコードする様にH3の切断が行われた
が、これはCTLを刺激できなきなかったことからエピトープはアミノ酸残基351-5
47にあるとされた。アミノ酸1-472（断片A)およびアミノ酸1-351（断片B)をコー
ドする別の断片も作られた。断片Bだけでなく、断片AもまたCTLを刺激したこと
から、エピトープはアミノ酸残基351-472にあることが判明した。

【０５３５】この領域を表す重複する20-merおよび18-merのペプチドについて、Jurkat/A2K
b細胞をパルス処理しIFN-ガンマアッセイでCTLについて試験した。ペプチドP501
S-369(20)とP501S-369(18)のみがCTLを促進した。この領域を表す9-merおよび10
-merのペプチドを合成して、同様に試験した。ペプチドP501S-370（配列番号539
）が強い反応を示す最小の9-merであった。ペプチドP501S-376（配列番号540)も
弱い反応を示したことから、これが交叉反応エピトープでることが示唆された。

【０５３６】続く研究では、P501Sで形質導入された初代ヒトB細胞の、MHCクラスI拘束、P5
01S特異的、自己CD8T細胞をプライムする能力が検討された。初代B細胞はCD40リ
ガンドおよびIL-4存在下に培養し、組換え体P501SのベクターｐBIBで高頻度に形
質導入され、そしてブラストシジン-Sで選別されることによりホモ接合体HLA-A2
ドナーのPBMCより得た。インビトロプライミングを行う場合には、精製CD8+T細
胞を自己由来CD40リガンド+1L-4で誘導したP501S-形質導入B細胞と96ウエル微量
培養形式で共培養した。

【０５３７】これらCTL微量培養体はP501S-形質導入B細胞で再刺激されてから、特異性につ
いてアッセイされた。この最初のスクリーニングの後、バックグランドより高い
有意なシグナルを示した微量培養体を自己由来EBV-形質導入B細胞（BLCL)にクロ
ーン化し、さらにP501Sで形質導入した。検出にはIFN-ガンマELISPOTを用い、こ
れらCD8T細胞クローンの幾つかがP501Sに対し特異的であることが見出され、BLC
L/P501Sには反応するがコントロール抗原で形質導入されたBLCLには反応しない
ことが示された。

【０５３８】さらに抗P501S CD8T細胞特異性はHLA-A2拘束性であることが示された。第１に
抗HLA-A-A、B、Cモノクローナル抗体（W6.32）、抗-HLA-B、Cモノクローナル抗
体（B1.23.2）およびコントロールモノクローナル抗体を用いた抗体遮断実験は
、抗HLA-A、B、C抗体のみがP501S発現自己由来BLCLの認識を遮断することを示し
た。第２に、抗P501SCTLはまたHLA-A2が一致した、P501Sで形質導入された異種B
LCLを認識したが、対応するEGFPで形質導入されたコントロールBLCLは認識しな
かった。

【０５３９】自然に処理されたP501SのCD8、クラスI拘束ペプチドエピトープは次の様にし
て同定された。樹状細胞(DC)はパーコル（Percol)勾配で単離された後、差別的
接着にかけられてから1%ヒト血清、50ng/mlGM-CSFおよび30ng/mlのIL-4を含むRP
MI培地存在下に５日間培養された。培養後、2μg/mlのCD40リガンドを加えて更
に24時間DCを培養した。CD8細胞はPBMCよりCD4+細胞、CD14+およびCD16+集団を
磁性ビーズを使ってサブトラクションすることで濃縮された。

【０５４０】ウエル当たり10,000個のP501S発現DCと100,000個のCD8+細胞を含むプライミン
グ培養体を、10%ヒト血清、5ng/ml IL-12および10ng/ml IL-6を含むRPMIの入っ
た96ウエル型V底プレートに準備した。培養体は７日ごとに、レトロウイルスに
よりP501SとCD80を発現するよう形質導入された自己由来繊維芽細胞で刺激され
、48-72時間INF-ガンマにより処理されてMHCクラスIの発現をアップレギュレー
ションした。刺激時および刺激後２と５日目に10u/mlのIL-2が加えられた。

【０５４１】刺激サイクル４回後、γ-IFN Elispotアッセイに於いて、IFNガンマ処理され
た、P501S/CD80を発現する自己由来繊維芽細胞に反応しIFN-ガンマを産生するが
、IFN-ガンマ-処理したP703P/CD80発現自己由来繊維芽細胞との反応ではこれを
産生しない１株のP501S特異的CD8+T細胞株（2A2と呼ぶ）が同定された。細胞株2
A2は75,000PBMC/ウエル、10,000B-LCL/ウエル、30ng/mlOKT3および50u/ml IL-2
存在下に0.5細胞/ウエルまたは２細胞/ウエルの割合で96ウエルプレートにクロ
ーン化された。形質導入繊維芽細胞に対する反応に強いP501S特異性を示した12
クローンが単離された。

【０５４２】蛍光活性化細胞ソーティング（FACS)分析を、それぞれPercP、FITCおよびPEで
標識されたCD3-、CD4+およびCD8-特異的抗体を行いてP501S特異クローンについ
て行った。プライミング培養体中での富CD8T細胞の使用に一致し、P5401S-特異
的クローンがCD3+、CD8+およびCD4-であることが決定された。

【０５４３】 P501S特異的CTLにより認識される関連P501Sエピトープを同定するために、P50
1Sのアミノ酸配列の大部分をカバーする18-20merまたは30merペプチドのプール
を自己由来B-LCLに負荷し、γ-IFN Elispotアッセイにより、4E5および4E7と呼
ばれる２種類のP501S特異的CTLクローンを刺激する能力について試験した。P501
S（配列番号113）のアミノ酸411-486をカバーする５種類の18-20merのペプチド
からなる１つのプールは、両P501S-特異的クローンにより認識されることが見出
された。

【０５４４】これらクローンに認識される特異的18-20merペプチドを同定するために、２種
類のP501S-特異的CTLクローン、4E5および4E7を刺激する能力について、陽性プ
ールを構成する各18-20merペプチドをγ-IFN Elispotアッセイで個別に試験した
。4E5および4E7はいずれもP501Sのアミノ酸453-472に広がる１つの20mer-ペプチ
ド（配列番号710；配列番号711に示されたcDNA配列）を特異的に認識した。

【０５４５】 CD8+T細胞により認識される最小エピトープは多くの場合９または10-merペプ
チド配列であることから、配列番号710の全配列をカバーする、１アミノ酸づつ
異なる10-merペプチドを合成した。これら10-merペプチドのそれぞれについて、
２種類のP501S-特異クローン（1D5および1E12と呼ぶ）を刺激する能力を試験し
た。P501S-特異クローンを特異的に刺激する１個の10-merペプチド（配列番号71
2；配列番号713に示したcDNA配列）。このエピトープはP501Sのアミン酸463-472
をカバーしている。この配列は自然の処理が可能であり、そして正常PBMCに於い
てCTL反応が同定できるP501S由来の最小の10-merエピトープを規定している。即
ち、このエピトープが前立腺癌のワクチン成分として、および治療薬および／ま
たは診断薬としての使用に適した候補である。

【０５４６】配列番号712のP501S-由来配列に関するクラスI拘束要素を同定するために、HL
A遮断分析およびミスマッチ分析を行った。γ-IFN Elispotアッセイでは、P501S
形質導入自己由来繊維芽細胞に対するクローン4A7および4E5の特異反応は25ug/m
lのW6/32（汎クラスI遮断抗体）およびB1.23.2(HLA-B/C遮断抗体）との前インキ
ュベーションにより遮断された。これらの結果は、配列番号712特異的反応がHLA
-BまたはHLA-Cアリルにより拘束されていることを示す。

【０５４７】 HLAミスマッチ分析では、HLAB51が共通である自己由来B-LCL（HLA-A1、A2、B8
、B51、Cw1、Cw7）および異種B-LCL（HLA-A2、A3、B18、B51、Cw5、Cw14）を１
時間、20ug/mlの配列番号712のペプチドでパルスし、洗浄後γ-IFN Elispotアッ
セイを用いクローン4A7および4E5刺激能について試験された。B1.23.2(HLA-B/C
遮断抗体）を使った抗体遮断アッセイも行われた。配列番号712-特異反応は自己
由来（D326)および異種(D107)B-LCLの両方を使って検出され、さらにこの反応は
25ug/mlのB1.23.2HLA-B/C遮断抗体との前インキュベーションにより遮断された
。これらの結果は、配列番号712のペプチドに対するP501S特異反応はHLA-B51ク
ラスIアリルに拘束されることを示している。D3326からのHLA-B51アリルの分子
クローニングおよび配列分析は、D326のHLA-B51サブタイプがHLA-B51011である
ことを示している。

【０５４８】配列番号712の10-merのP501S由来エピトープに基づき、配列番号714および715
の配列を持った２種類の9-merを合成し、Elispotアッセイを用いて細胞株2A2由
来の２種類のP501S-特異的CTLクローンに対する刺激能について試験した。配列
番号712の10-merペプチドならびに配列番号715の9-merペプチドはP501S特異的CT
Lを刺激して、IFN-ガンマを産生できたが、配列番号714の9-merペプチドは刺激
できなかった。これらの結果は、配列番号715のペプチドがP501S-特異的CTLによ
り認識される9-merのP501S由来エピトープであることを示している。配列番号71
5のエピトープをコードするDNA配列は配列番号716にしめされている。

【０５４９】配列番号712および715特異反応のP501S由来ペプチドに関するクラスI拘束アリ
ルを同定するために、HLA BおよびCアリルのそれぞれをインビトロプライミング
実験で用いたドナーからクローン化した。配列分析は、関連するアリルがHLA-B8
、HLA-B51、HLA-Cw01およびHLA-Cw07であることを示した。これらアリルのそれ
ぞれを発現ベクター内にサブクローニングし、P501S遺伝子と共にBA-13細胞内に
コトランスフェクションした。次にトランスフェクションされたVA-13細胞を、E
LISPOTアッセイを持ちいP501S特異的CTLの特異的刺激能力について試験した。

【０５５０】 P501SおよびHLA-B51がトランスフェクションされたVA-13細胞はP501S特異的CT
Lを刺激して、γ-IFNを分泌させることができた。HLA-B51のみ、またはP501S+そ
の他HLAアリルがトランスフェクションされたVA-13細胞は、P501S特異的CTLを刺
激できなかった。これらの結果は、P501S-特異的反応に関する拘束アリルがHLAB
51アリルであることを示している。配列分析は、関連する拘束アリルのサブタイ
プがHLA-B51011であることを示した。

【０５５１】 P501S-特異的CTLがP501Sを発現している前立腺腫瘍細胞を認識できるかを決定
するために、P501S陽性細胞株LnCAPおよびCRL2422（共にP501SmRNAおよび蛋白質
を“中程度”の量発現している）、ならびにPC-3（P501SmRNAと蛋白質を低量発
現している）、さらにP501S-陰性細胞株DU-145を、レトロウイルスを使ってP501
S特異的CTLを生成するのに使用したドナーよりクローン化されたHLA-B51011アリ
ルで形質導入した。HLA-B51011-またはEGFO-形質導入され、選択された腫瘍細胞
をガンマインターフェロンおよびアンドロゲン（それぞれ刺激機能およびP501S
をアップレギュレーションする）で処理し、P501S-特異的CTLクローンの４E5お
よび4E7と共にガンマインターフェロンElispotアッセイに用いた。

【０５５２】 4E5および4E7は共にHLA-B51011アリルが形質導入されたLnCAPおよびCRL2422細
胞を効率的かつ特異的に認識したが、EGFPが形質導入された同一細胞株は認識し
なかった。さらに両CTLクローンはHLA-B51011が形質導入されたPC-3細胞を特異
的に認識したが、P501S-陰性腫瘍細胞株であるDU-145は認識しなかった。ガンマ
インターフェロンまたはアンドロゲンによる処理はCTLの腫瘍細胞認識能を高め
なかった。これらの結果は、インビトロにて全遺伝子をプライミングして作製さ
れたP501S-特異的CTLがP501Sを発現する前立腺腫瘍細胞株を特異的かつ効率的に
認識することを示している。

【０５５３】 P501Sの自然処理されたCD4エピトープは次の様にして同定された。 P501Sに特異的なCD4細胞を上記同様に調製した。P501S遺伝子のアミノ末端部
分の約50%に広がる（配列番号113のアミノ酸1-325）16種類の重複ペプチドのシ
リーズを合成した。プライミングに備え、ペプチドを４種類のペプチドプールに
まとめ、TNF-アルファと共に４μg/mlで樹状細胞（DC)を24時間パルスした。つ
ぎにDCを洗浄し、ネガティブ選別したCD4+T細胞を96ウエルU底プレート中に混合
した。

【０５５４】培養体を新しいDC上で、ペプチドプールを加えて毎週刺激した。合計４回刺激
サイクルを行った後に、細胞をさらに１週間休息させてから、γ-IFN ELISAおよ
び増殖アッセイを用いて、ペプチドプールを使ってパルスされたAPCに対する特
異性を試験した。これらアッセイでは、4ug/mlの関連ペプチドプールまたはug/m
lの無関係ペプチドの何れかが負荷された接着単球がAPCとして用いられた。次に
特異的サイトカイン分泌または増殖を示したT細胞株について、プール中に存在
する個別のペプチドについての認識を試験した。プールAおよびBより、これらプ
ール由来の個別ペプチドを認識するT細胞株が同定できた。

【０５５５】プールAからは、細胞株AD9およびAE10がペプチド１（配列番号719）を特異的
に認識し、細胞株AF5がペプチド39（配列番号718）を認識した。プールBでは、
ペプチド58（配列番号717）を認識する細胞株BC6が同定できた。これら細胞株の
それぞれが特異ペプチドにより刺激され、力価アッセイおよびHEK293細胞にP501
Sまたは無関係抗原を発現するアデノウイルスを感染させ生成した細胞溶解物を
用いて、ペプチドの特異認識について試験された。

【０５５６】これらアッセイでは、APC接着単球は10、１または0.1μg/mlの個別P501Sペプ
チドでパルス処理され、そしてDCは一晩1:5に希釈されたアデノウイルス感染細
胞溶解物でパルス処理された。細胞株AD9、AE10およびAF5は0.1mg/mlの濃度でも
関連するP501S由来ペプチドを有意に認識した。さらに細胞株AD9は、アデノウイ
ルスP501S感染細胞由来の溶解物に対しても有意（8.1倍の刺激指数）特異活性を
示した。これらの結果は、抗親和性CD4T細胞株がP501S由来エピトープに対し生
成できること、および少なくとも配列番号719のP501S由来配列に特異的なこれら
T細胞のサブセットが、ヒト細胞により自然に処理されるエピトープに対し特異
的であるこをと示している。配列番号717-719のアミノ酸配列をコードするDNA配
列はそれぞれ配列番号720-722に示されている。

【０５５７】 AD9のP501S特異的活性をさらに特性分析するために、この細胞株を抗CD3を使
ってクローン化した。P501S-1ペプチド（配列番号719)に特異的な1A1、1A9およ
び1F5と呼ばれる３種類のクローンが同定された。P501S-1特異反応に関するHLA
拘束アリルを決定するために、これらクローンそれぞれについて増殖およびガン
マインターフェロンアッセイを利用したクラスII抗体遮断アッセイおよびHLAミ
スマッチアッセイを使い試験した。

【０５５８】抗体遮断アッセイおよびELISAアッセイを利用したガンマインターフェロン産
生測定では、３クローン全てのペプチドパルスAPC認識能力が、汎クラスII遮断
抗体またはHLA-DR遮断抗体との共インキュベーションにより特異的に遮断された
が、HLA-DQまたは無関係な抗体によっては遮断されなかった。同一細胞を用い同
時に実施された増殖アッセイもこの結果を確認した。これらデータは、クローン
のP501S特異反応がHLA-DRアリルにより拘束されていることを示す。別の研究はP
501S-特異反応に関する拘束アリルがHLA-DRB1501であることを示した。

【０５５９】実施例13 ．マイクロアレイ分析による前立腺特異的抗原の同定この実施例では、特定の前立腺特異的ポリペプチド類の、前立腺腫瘍cDNAライ
ブラリーからの分離について述べる。上記のヒト前立腺腫瘍cDNA発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析を利用し
選抜して、前立腺腫瘍および／または正常前立腺の組織において、前立腺以外の
正常組織（精巣を除く）と比較して少なくとも３倍の過剰発現を示すクローンを
同定した。372のクローンを同定し、そして319のクローンの配列決定に成功した
。

【０５６０】表Ｉはこれらクローンの要約を示し、これらのクローンは配列番号：385〜400
に示してある。これら配列のうち、配列番号：386, 389, 390および392は新規な
遺伝子であり、そして配列番号：393と396は、以前に同定された配列である。そ
の外の配列（配列番号：385, 387, 388, 391, 394, 395および397〜400）は表Ｉ
に示すように既知の配列である。

【０５６１】

【表２】

【０５６２】 CGI-82は、前立腺組織内で、試験を行った他の正常組織と比べて4.06倍の過剰
発現を示した。CGI-82は、前立腺腫瘍の43％および正常前立腺の25％で過剰発現
を行い、試験を行った他の正常組織には検出されなかった。Ｌ−イジトール−２
−デヒドロゲナーゼは、前立腺組織中で、試験を行った他の正常組織と比べて4.
94倍の過剰発現を示した。Ｌ−イジトール−２−デヒドロゲナーゼは、前立腺腫
瘍の90％で過剰発現し、正常前立腺の100％で過剰発現し、試験を行った他の正
常組織中には検出されなかった。Ets転写因子PDEFは前立腺組織内で、試験を行
った他の正常組織と比べて5.55倍の過剰発現を示した。

【０５６３】 Ets転写因子PDEPは、前立腺腫瘍の47％で過剰発現し、正常前立腺の25％で過
剰発現し、そして試験を行った他の正常組織中には検出されなかった。hTGR1は
、前立腺組織中で、試験を行った他の正常組織と比べ9.11倍の過剰発現を示した
。hTGR1は、前立腺腫瘍の63％で過剰発現し、正常前立腺を含む試験を行った正
常組織には検出されなかった。KIAA0295は、前立腺組織中で、他の被検正常組織
と比べて5.59倍の過剰発現を示した。KIAA0295は、前立腺腫瘍の47％で過剰発現
し、正常前立腺組織を含む被検正常組織中では発現が低く検出できなかった。前
立腺酸性ホスファターゼは、前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて9.14倍
の過剰発現を示した。

【０５６４】前立腺酸性ホスファターゼは、前立腺腫瘍の67％で過剰発現し、正常前立腺の
50％で過剰発現し、そして他の被検正常組織中には検出されなかった。トランス
グルタミナーゼは、前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べて14.84倍の過剰
発現を示した。トランスグルタミナーゼは、前立腺腫瘍の30％の過剰発現し、正
常前立腺の50％で過剰発現し、そして他の被検正常組織中には検出されなかった
。高密度リポタンパク質結合タンパク質（HDLBP）は、前立腺組織内で、他の被
検正常組織と比べて28.06倍の過剰発現を示した。

【０５６５】 HDLBPは、前立腺腫瘍の97％で過剰発現し、正常前立腺の75％で過剰発現し、
そして、他のすべての被検正常細胞には検出できなかった。CGI-69は、前立腺組
織内で、他の被検正常組織と比べて3.56倍の過剰発現を示した。CGI-69は低存在
度（low abundant）遺伝子であり、前立腺腫瘍の90％及び正常前立腺組織の75％
に検出される。この遺伝子の正常組織内での発現は非常に低かった。KIAA0122は
、前立腺組織内で、他の被検正常組織に比べて4.24倍の過剰発現を示した。KIAA
0122は、前立腺腫瘍の57％で過剰発現し、そして正常前立腺組織を含むすべての
正常組織中には検出できなかった。

【０５６６】 19142.2 bangurは、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて23.25倍の過
剰発現を示した。19142.2 bangurは、前立腺腫瘍の97％および正常前立腺の100
％で過剰発現した。19142.2 bangurは、他の被検正常組織では検出できなかった
。5566.1 Wangは、前立腺組織内で、他の被検正常組織と比べて3.31倍の過剰発
現を示した。5566.1 Wangは、前立腺腫瘍の97％及び正常前立腺の75％で過剰発
現し、そして正常な骨髄、膵臓および活性化PBMC内でも過剰発現した。新規のク
ローン23379（P553Sとも呼称する）は前立腺組織中で、他の被検正常組織と比べ
て、4.86倍の過剰発現を示した。

【０５６７】クローン23379は、前立腺腫瘍の97％及び正常前立腺の75％で検出できたが、
他のすべての被検正常組織内では検出できない。新規のクローン23399は、前立
腺組織内で、他の被検正常組織と比べて4.09倍の過剰発現を示した。クローン23
399は、前立腺腫瘍の27％で過剰発現し、正常な前立腺組織を含むすべての被検
正常組織内に検出できなかった。新規なクローン23320は、前立腺組織内で他の
被検正常組織と比べて3.15倍の過剰発現を示した。クローン23320は、すべての
前立腺腫瘍におよび正常前立腺組織の50％に検出できた。またクローン23320は
、正常な結腸および気管内でも発現した。他の正常細胞は、この遺伝子を、高レ
ベルでは発現しない。

【０５６８】標準の方法を利用して続いて行ったP553Sに関する完全長クローン化試験によ
って、このクローンが、不完全なスプライスされた形態のP501Sであることが明
らかになった。P553Sの四つのスプライス変異体の決定されたcDNA配列は、配列
番号：623〜626に示してある。配列番号：626がコードするアミノ酸配列は、配
列番号：627に示してある。配列番号：623のcDNA配列は、二つのオープンリーデ
ィングフレーム（ORF）を含有していることが分かった。これら二つのORFがコー
ドするアミノ配列は配列番号：628と629に示してある。

【０５６９】実施例14 ．電子サブトラクション法（electronic subtractiion）による前立腺
特異的抗原の同定この実施例では、電子サブトラクション法を使用して行う前立腺特異的抗原の
同定について説明する。 GenBankのヒトESTデータベース中の潜在前立腺特異的遺伝子（potential pros
tate-specific gene）を、電子サブトラクション法（Vasmatizisら、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 95 : 300-304, 1998に記載されているのと類似の方法）で同
定した。各種の前立腺ライブラリーから誘導したESTクローン（43, 482）の配列
を、GenBankのパブリックヒトESTデータベースから得た。各前立腺EST配列を、
ヒトESTデータベースに対するBLASTN（National Center for Biotechnology Inf
ormation）サーチの際の質問配列（query sequence）として使用した。

【０５７０】同一とみなされたすべてのマッチ（match）（マッチング配列の長さ＞100塩基
対、この領域の同一マッチの密度＞70％）を、一つのクラスターにまとめた（並
べた）。200以上のESTを含有するクラスターは、恐らく、反復要素またはリポソ
ームタンパク質の遺伝子のような高度に発現される遺伝子であるから廃棄した。
二つ以上のクラスターがコモンクラスターを共有する場合、それらクラスターを
「スーパークラスター」にまとめて、4,345の前立腺スーパークラスターを得た
。

【０５７１】 GenBank release中の479のヒトcDNAライブラリーの記録を、ダウンロードして
、これらcDNAライブラリーの記録のデータベースをつくった。これら479のcDNA
ライブラリーを、次の三つのグループにまとめた。すなわち、プラスグループ（
発現が望ましい正常な前立腺と前立腺腫瘍のライブラリーおよび乳房（breast）
細胞系ライブラリー）、マイナスグループ（発現が望ましくない他の正常成人の
組織からのライブラリー）、ならびにその他のグループ（発現が関連性がない（
irrelevaxt）と考えられる、胎児組織、乳児組織、女性にのみ見られる組織、前
立腺以外の腫瘍および前立腺細胞系以外の細胞系からのライブラリー）である。
これらライブラリーのグループの要約を表IIに示す。

【０５７２】

【表３】

【０５７３】各スーパークラスターを、そのスーパークラスター内のESTについて分析した
。各ESTクローンの組織源に注目し利用してスーパークラスターを次の四グルー
プに分類した。すなわちタイプ１−前記プラスグループのライブラリーのみに見
られるESTクローンであって、前記マイナスまたはその他のグループのライブラ
リーには発現が検出されないESTクローン；タイプ２−前記プラスおよびその他
のグループのライブラリーのみから誘導されるESTクローンであって、前記マイ
ナスグループでは発現が検出されないESTクローン；タイプ３−前記プラス、マ
イナスおよびその他のグループのライブラリーから誘導されるESTクローンであ
って、前記プラスグループから誘導されるESTの数が前記マイナスまたはその他
のグループより高いESTクローン；ならびにタイプ４−前記プラス、マイナスお
よびその他のグループのライブラリーから誘導されるESTクローンであって、前
記プラスグループから誘導される数が、前記マイナスグループから誘導される数
より高いESTクローンである。この分析によって、4,345の乳房のクラスターが同
定された（表III参照）。これらのクラスターから、3,172のESTクローンを、Res
earch Genetics, Inc.に発注し、そして96ウェルプレートの冷凍グリセリンスト
ックとして受け取った。

【０５７４】

【表４】

【０５７５】 ESTクローンの挿入断片を、Synteniマイクロアレイ分析用のアミノ連結PCRプ
ライマーを使用してPCR増幅した。２以上のPCR産物を特定のクローンについて得
たとき、そのPCR産物は発現分析に使用しなかった。電子サブトラクション法由
来の合計2,528のクローンを、マイクロアレイ分析で分析して、腫瘍組織mRNA対
正常組織mRNAのレベルが高い電子サブトラクションのブレストクローンを同定し
た。

【０５７６】このようなスクリーンは、Synteni（米国カリフォルニア州パロ・アルト）の
マイクロアレイを使用し、生産者の指示にしたがい、そして事実上、Schenaら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 10614-10619, 1996およびHellerらProc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 94 : 2150-2155, 1997に記載されているようにして実施し
た。これらの分析において前記クローンをチップ上に配列し、次にそのチップを
、正常前立腺と腫瘍前立腺のcDNAおよび各種の他の正常組織からつくった蛍光プ
ローブでプローブした。そのスライドガラスを走査してその蛍光強度を測定した
。

【０５７７】発現比が３より大きいクローン（すなわち、前立腺腫瘍と正常前立腺のmRNAの
レベルが他の正常組織mRNAのレベルの少なくとも３倍であるクローン）を、前立
腺腫瘍特異的配列として同定した（表IV）。これらクローンの配列は配列番号：
401〜453に示してあり、特定の新規な配列は、配列番号：407, 413, 416〜419,
422, 426, 427および450に示してある。

【０５７８】

【表５】

【０５７９】

【表６】

【０５８０】配列番号：407（P1020Cとも呼称される）のクローンについてさらに研究して
、配列番号：591に示した伸長（extended）cDNA配列を単離した。この伸長cDNA
配列は、配列番号：592の予測アミノ酸配列をコードするオープンリーディング
フレームを含有することが分かった。P1020C cDNAおよびアミノ酸配列は、ヒト
内因性レトロウイルスHERV-Kポル遺伝子およびタンパク質といくらか類似性を示
すことが分かった。

【０５８１】実施例15 ．前立腺特異的抗原の、マイクロアレイ分析によるさらなる同定この実施例では、追加の前立腺特異的ポリペプチドの、前立腺腫瘍cDNAライブ
ラリーからの単離について述べる。上記のようなヒト前立腺腫瘍cDNA発現ライブラリーを、マイクロアレイ分析法
を使用し選抜して、前立腺腫瘍組織および／または正常前立腺組織内で、前立腺
以外の正常組織（精巣を含まない）と比べて少なくとも３倍の過剰発現を示すク
ローンを同定した。142のクローンを同定して配列を決定した。これらクローン
のうち特定のクローンを配列番号：454〜467に示してある。これらの配列のうち
、配列番号：459〜460は新規の遺伝子である。その他の配列（配列番号：454〜4
58と461〜467）は既知の配列である。

【０５８２】決定されたcDNA配列の配列番号：461は、BLASTプログラムを使ってGenbankデ
ータベースの配列と比較した結果、以前に同定された膜貫通プロテアーゼセリン
２（TMPRSS2）と相同性であることが明らかになった。このクローンの完全長cDN
A配列は配列番号：751に示してあり、対応するアミノ配列は配列番号：752に示
してある。TMPRSS2の第一の209のアミノ酸をコードするcDNA配列は配列番号：75
3に示し、第一の209のアミノ酸は配列番号：754に示してある。

【０５８３】配列番号：462の配列（P835Pと呼称される）は、関連するオープンリーディン
グフレーム（ORF）をもっていない以前に同定されたクローンFLJ13518（受託番
号AK023643；配列番号：774）であることが分かった。このクローンを使用してG
eneseq DNAデータベースをサーチして、七つの膜貫通ドメインが存在することを
特徴とするＧタンパク質共役型受容体タンパク質（DNA Genseq受託番号A09351；
アミノ酸Geneseq受託番号Y92365）として以前に同定されたクローンと一致した
。これらドメイン間のフラグメントの配列は配列番号：778〜785に示してあり、
そして配列番号778, 780, 782および784は細胞外ドメインを表し、配列番号779,
781, 783および785は細胞内ドメインを表す。

【０５８４】配列番号：778〜785は、それぞれ、P835Pのアミノ酸１〜28，53〜61，83〜103
，124〜143，165〜201，226〜238，263〜272および297〜381を示す。P835Pの完
全長cDNAの配列は配列番号：773に示してある。ストップコドンを含む、P835Pの
オープンリーディングフレームのcDNA配列を配列番号775に示し、そしてストッ
プコドンなしのオープンリーディングフレームを配列番号：776に示し、そして
対応するアミノ酸配列を配列番号：777に示してある。

【０５８５】実施例16 ．前立腺特異的抗原P710Pのさらなる特性決定この実施例では、P710Pの完全長クローニングについて述べる。上記前立腺cDNAライブラリーを上記P710Pフラグメントでスクリーニングした
。100万個のコロニーを、LB／アンピシリンプレート上に平板培養した。ナイロ
ン膜フィルターを使用してこれらのコロニーを持ち上げ、次いでこれらフィルタ
ーでピックアップされたcDNAを、UV光で変性して、該フィルターに架橋させた。
そのP710Pフラグメントを放射能で標識し、そのフラグメントを使用して該フィ
ルターとハイブリッドを形成させた。

【０５８６】正のcDNAクローン（positive cDNA clone）を選択し、それらcDNAを回収し次
いで自動Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Sequencerによって配列を
決定した。四種の配列が得られ、配列番号：468〜471に示してある。これらの配
列は、P710P遺伝子の異なるスプライス変異体のようである。続いて、P710PのcD
NA配列を、Genbankの配列と比較したところ、DD3遺伝子（Genbank受託番号AF103
907およびAF103908）と相同であることが明らかになった。DD3のcDNAの配列は配
列番号：618に示してある。

【０５８７】実施例17 ．前立腺特異的抗原のタンパク質発現本実施例は、E.coli、バキュロウィルス、哺乳動物、及び酵母の細胞内での前
立腺特異的抗原の発現及び精製を記載する。ａ）E.coli内でのP501Sの発現 PS501Sの全長の発現を、pET17b内のM. tuberculosis抗原Ra12の最初の30アミ
ノ酸（配列番号484）から下流にリーダー配列をもたないP501S（配列番号113の
アミノ酸36〜553）をまずクローニングすることにより達成した。特に、P501S D
NAを、プライマーAW025（配列番号485）とAW003（配列番号486）を用いてPCRを
行うために使用した。AW025は、HindIII部位を含むセンス・クローニング・プラ
イマーである。AW003は、EcoRI部位を含むアンチセンス・クローニング・プライ
マーである。

【０５８８】 DNA増幅を、５μl 10×Pfuバッファー、１μl 20mM dNTPs、10μm濃度におけ
る１μlの各PCRプライマー、40μl水、１μl Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene
, La Jolle, CA）、及び100ng/μlにおける１μl DNAを用いて行った。95℃にお
ける変性を30秒間、その後、10サイクルの95℃30秒間、60℃１分間、及び72℃３
分間を行い、20サイクルの95℃30秒間、65℃１分間、及び72℃３分間、そして最
後に、１サイクルの72℃10分間を行った。このPCR産物を、HindIIIとEcoRIを用
いてRa12m/p ET17bにクローニングした。（Ra12-P501S-Fという）得られた融合
構築物の配列をDNAシークエンシングにより確認した。

【０５８９】この融合構築物をBL21（DE3）pLysE/pLysS 及びCodonPlus E.coli（Stratagen
e）内に形質転換させ、そしてカナマイシンを含むLBブロス中で一夜培養した。
得られたカルチャーをIPTGにより誘導した。タンパク質をPVDF膜に転写し、（PB
S-Tweenバッファー中）５％非脂肪ミルクでブロックし、そして３回洗浄し、そ
して１時間マウス抗-Hisタグ抗体（Clontech）とともにインキュベートした。こ
の膜を、３回洗浄し、そして30分間HRP-プロテインＡ（Zymed）でプローブした
。最後に、この膜を３回洗浄し、そしてECL（Amersham）で発色させた。発現は
、Western ブロットにより検出されなかった。同様に、Ra12-P501S-F融合がCE6
ファージ（Invitrogen）によるBL21 CodonPlus内での発現のために使用されたと
き、Western ブロットにより発現は検出されなかった。

【０５９０】 P501SのN-末端断片（配列番号113のアミノ酸36-325）を、以下のように、PET1
7b内にM.tuberculosis抗原Ra12の最初の30アミノ酸の下流にクローン化した。P5
01S DNAを使用して、プライマーAW025（配列番号485）とAW027（配列番号487）
を使用したPCR を行った。AW027 は、EcoRI部位と終止コドンを含むアンチセン
ス・クローニング・プライマーである。DNA 増幅を本質的に先に記載したように
行った。得られたPCR産物を、HindIII部位とEcoRI部位においてpET17b内のRa12
にクローニングした。（Ra12-P501S-Nという）融合構築物を、DNAシークエンシ
ングにより確認した。

【０５９１】本質的に先に記載したように、上記Ra12-P501S-N融合構築物を、BL21(DE3)pLy
sE，φLysS、及びCodonPlus内での発現のために使用した。Western ブロット分
析を使用して、36KDa の予想分子量においてタンパク質バンドを観察した。おそ
らく上記組換えタンパク質の凝集に因り、いくつかの高分子量のバンドも観察さ
れた。CE6ファージによるBL21 CodonPlus内での発現のためにRa12-P501S-F融合
物を使用したとき、Westenブロットにより発現は検出されなかった。

【０５９２】 M. tuberculosis抗原Ra12の最初の30アミノ酸（配列番号484）の下流によるP5
01SのC-末端部分（配列番号113のアミノ酸257〜553）を含む融合構築物を、以下
のように調製した。P501S DNAを使用して、プライマーAW026（配列番号488）とA
W003（配列番号486）を使用したPCRを行った。AW026は、HindIII部位を含むセン
ス・クローニング・プライマーである。本質的に先に記載したようにDNA増幅を
行った。得られたPCR 産物を、HindIII部位とEcoRI部位においてpET17b内のRa12
にクローン化した。（Ra12-ｐ501S-Cという）融合構築物のための配列を確認し
た。

【０５９３】先に記載したように、上記Ra12-P501S-C融合構築物を、BL21(DE3)pLysE、ｐLy
sS、及びCodonPlus内での発現のために使用した。少量のタンパク質がWesternブ
ロットにより検出され、いくつかの分子量も観察された。CE6ファージにより誘
導されるBL21 CodonPlus内での発現のために上記Ra12-P501S-C融合物を使用した
とき、Westernブロットによっても発現が検出された。

【０５９４】 M. tuberculosis抗原Ra12の下流にあるP501Sの断片（配列番号113のアミノ酸3
6〜298）を含む融合構築物（配列番号705）を、以下のように調製した。P501S D
NAを使用して、プライマーAW042（配列番号706）とAW053（配列番号707）を用い
たPCR を行った。AW042は、E.coRI部位を含むセンス・クローニング・プライマ
ーである。AW053は、終止部位とXhoI部位をもつアンチセンス・プライマーであ
る。DNA 増幅を、先に記載したように行った。得られたPCR産物を、EcoRI部位と
XhoI部位においてpET17b内のRa12にクローン化した。（Ra12-P501S-E2といわれ
る）得られた融合構築物を、室温で２時間TB培地中B834（DE3）pLysS E.coli宿
主細胞内で発現させた。

【０５９５】発現されたタンパク質を、封入体を洗浄することにより精製し、そしてNi-NTA
カラム上を流した。この精製されたタンパク質は、20mM Tris-HCl (pH8)，100m
M NaCl，10mMβ-Me、及び５％グリセロールを含有するバッファー中に可溶のま
まであった。上記の発現された融合タンパク質に関する決定されたcDNA配列とア
ミノ酸配列を、それぞれ、配列番号708と709に提供する。

【０５９６】ｂ）バキュロウィルス内でのP501Sの発現昆虫細胞内でP501Sタンパク質を発現させるために、Bac-to-Bacバキュロウィ
ルス発現系（BRL Life Techndogies, Inc.）を使用した。全長P501S（配列番号1
13）を、PCRにより増幅し、そしてドナー・プラスミドpFastBacIのXbaI部位内に
クローン化した。組換えbacmidとバキュロウィルスを、製造者の指示に従って調
製した。この組換えバキュロウィルスをsf9細胞内で増幅させ、そして高力価の
ウィルス保存株を、High Five 細胞（Invitrogen）を感染させて組換えタンパク
質を製造するために使用した。全長タンパク質の同定を、上記組換えタンパク質
のＮ−末端シークエンシングにより、そしてWesternブロット分析により確認し
た（図７）。

【０５９７】特に、６ウェル・プレート内で60万個のHigh Five細胞を、未処理対照ウィル
スBV/ECD-PD（レーン２）か又は異なる量又はMOIsにおけるP501Sのための組換え
バキュロウィルスで感染させ（レーン４〜８）、あるいは感染させなかった（レ
ーン３）。細胞溶解産物を還元条件下でSDS-PAGE上で造らせ、そして（以下に記
載するように調製した）抗-P501Sモノクローナル抗体P501S-10E3-G4D3によるWes
ternブロットにより分析した。レーン１は、ビオチン化されたタンパク質分子量
マーカー（BioLabs）である。

【０５９８】昆虫細胞内での組換えP501Sの局在化を以下のようにして調べた。P501Sを過剰
発現する昆虫細胞を、核、ミトコンドリア、膜、サイトゾルの画分に分画した。
各画分からの等量のタンパク質を、P501Sに対するモノクローナル抗体によるウ
ェスタン・ブロットにより分析した。分画のスキームに因り、核画分とミトコン
ドリア画分の両者が、いくつかの血漿膜成分を含有する。しかしながら、上記膜
画分は、ミトコンドリアと核を基本的に含有しない。P501Sは、上記膜成分を含
有する全ての画分中に存在することが判った。これは、P501Sが、上記組換えタ
ンパク質を発現している昆虫タンパク質の血漿膜に会合されているかもしれない
ということを示唆している。

【０５９９】ｃ）哺乳動物細胞内でのP501Sの発現全長P501S（553アミノ酸；配列番号113）を、pCEP4（Invitrogen）、pVR1012
（Vicol, San Diego, CA）、及びpBIBという、レトロウィルス・ベクターpBMNの
修飾形態を含む、さまざまな哺乳動物発現ベクター内にクローン化した。HEK293
線維芽細胞内へのP501S/pCEP4とP501S/pVR1012のトランスフェクションを、Fuge
neトランスフェクション試薬（Boehringer Mannheim）を用いて行った。簡単に
言えば、２μlのFugene試薬を、100μlの無血清培地内で希釈し、そして５〜10
分間室温でインキュベートした。この混合物を、１μgのP501SプラスミドDNAに
添加し、短時間混合し、そして室温で30分間インキュベートした。このFugene/D
NA混合物を、細胞に添加し、そして24〜48時間インキュベートした。トランスフ
ェクトされたHEK293線維芽細胞内での組換えP501Sの発現を、P501Sに対するモノ
クローナル抗体を用いたWesternブロットにより検出した。

【０６００】 CHO-K細胞（American Type Culture Collection, Rockville, MD）内へのP501
S/ｐCEP4のトランスフェクションを、GenePorterトランスフェクション試薬（Ge
ne Therapy Systems, San Diego, CA）を用いて行った。簡単に言えば、15μlの
Gone Porterを、500μlの無血清培地中で希釈し、そして10分間室温でインキュ
ベートした。このGene Porter／培地混合物を、２μgのプラスミドDNAに添加し
、これを500μlの無血清培地中で希釈し、短時間混合し、そして室温で30分間イ
ンキュベートした。CHO-K細胞を、PBS 中で濯いで血漿タンパク質を除去し、そ
して上記Gene Porter/DNAミックスを添加し、そして５時間インキュベートする
。次に、トランスフェクトされた細胞に、等容精の２倍培地を与え、そして24〜
48時間インキュベートした。

【０６０１】 P501Sにより一過性に感染されたCHO-K細胞のFACS分析は、P501S の表面発現を
証明した。以下に記載するような、P501Sペプチドに対するウサギ・ポリクロー
ナル抗血清を用いて発現を検出した。フロー・サイトメトリーによる分析を、Fa
CScan（Becton Dickinson）を用いて行い、そしてそのデータをthe Cell Quest
プログラムを用いて分析した。

【０６０２】ｄ）S. cerevisiae内でのP501Sの発現 P50Sを、酵母αプレプロ・シグナル配列を用いて、酵母内で発現させ、そして
膜に向けた。P501S の天然シグナル配列と第１の内腔ドメインを、発現されたP5
01Sタンパク質の天然の位置を保存するように、欠失させた。特に、Hisタグ尾をもつ配列番号113のアミノ酸55〜553に連絡されたS. cerevi
siaeのαプレプロ・シグナル配列を、CUP1プロモーターをもつプラスミドpRIT15
068内にクローン化し、そしてS. cerevisiae株Y1790内にトランスフェクトさせ
た。このY1790株は、Leu⁺ 、及びHis^- である。

【０６０３】タンパク質の発現を、ヒスチジンを補った最小培地中30℃における500μM又は
250μMのいずれかのCuSO₄ の添加により誘導した。細胞を誘導から24時間後に収
穫した。抽出物を、プロテアーゼ阻害剤を補った50mMクエン酸・リン酸バッファ
ー（pH 4.0）及び130mM NaCl中、OD600の濃度、5.0まで細胞を培養することによ
り調製した。細胞をガラス・ビーズを用いて破砕し、そして15,000ｇで20分間遠
心分離した。この組換えタンパク質は、 100％ペレットに会合していることが判
った。

【０６０４】上記組換えタンパク質（分子量63KD）の発現を、以下に記載する抗-P501Sモノ
クローナル抗体10E-D4-G3を用いて、Westernブロット分析により証明した。上記
の発現されたタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号792に提供する。

【０６０５】 S. cerevisiae（株Y1790-CUP1誘導プロモーター）内の上記αプレプロ-P501S-
Hisタグ組換えタンパク質の製造のための発酵方法を、以下のように評価した。2
.5 ×10⁸ 細胞／mlの形質転換されたS. cerevisiae Y1790 を含有する種母100μ
lをFSC004AA団体培地上に拡げた。上記FSC004AA培地の組成を以下に示す：グルコース10g/l；Na₂MoO₄.２H₂O 0.0002g/l；葉酸0.000064g/l；KH₂PO₄ １g/
l；MnSO₄.H₂O 0.0004g/l；イノシトール0.064g/l；MgSO₄.７H₂O 0.5g/l；H₃BO₃
0.0005g/l；ピリドキシン0.008g/l；CaCl₂.２H₂O 0.1g/l；KI 0.0001g/l；チア
ミン0.008g/l；NaCl 0.1g/l；CoCl₂.６H₂O 0.00009g/l；ナイアシン0.000032g/l
；FeCl₃.６H₂O 0.0002g/l；リボフラビン0.000016g/l；パントテン酸 Ca 0.008g
/l；CuSO₄.５H₂O 0.00004g/l；ビオチン0.000064g/l；パラ−アミノ安息香酸0.0
00016g/l；ZnSO₄.７H₂O 0.0004g/l；(NH₄)₂SO₄ ５g/l；寒天18g/l；ヒスチジン0
.1g/l。

【０６０６】２つのプレートを30℃で26時間インキュベートした。これらの団体プレーカル
チャーを、５mlの液体培地FSC007AA中に収穫し、そして上記懸濁液 0.5ml（又は
9.3×10⁷ 細胞）を、２つの液体プレカルチャーを接種するために使用した。

【０６０７】上記FSC007AA培地の組成を以下に示す：グルコース10g/l；Na₂MoO₄.２H₂O 0.0002g/l；葉酸0.000064g/l；KH₂PO₄ １g/
l；MnSO₄. H₂O 0.0004g/l；イノシトール0.064g/l；MgSO₄.７H₂O 0.5g/l；H₃BO₃ 0.0005g/l；ピリドキシン0.008g/l；CaCl₂.２H₂O 0.1g/l；KI0.0001g/l；チア
ミン0.008g/l；NaCl 0.1g/l；CoCl₂.６H₂O 0.00009g/l；ナイアシン0.000032g/l
；FeCl₃.６H₂O 0.0002g/l；リボフラビン0.000016g/l；パントテン酸Ca 0.008g/
l；CuSO₄.５H₂O 0.00004g/l；ビオチン0.000064g/l；パラアミノ安息香酸0.0000
16g/l；ZnSO₄.７H₂O 0.0004g/l；(NH₄)₂SO₄ ５g/l；ヒスチジン0.1g/l。

【０６０８】 1.8のODを得るために、上記のプレカルチャーを、培地FSC007AA 400mlを入れ
た２Ｌフラスコ内で20時間、培養した。上記プレカルチャーの他の特徴を以下に示す：pH2.8；グルコース 2.3g/l；エタノール 3.4g/l。株Y1790のための液体プレカルチャーのための最良タイミングを、予備実験に
おいて決定した。400mlの培地を含み、そして各種容積（0.25、0.5又は２ml）の
種母（Master Seeds）により接種された液体プレカルチャーを、最良接種物サイ
ズ及び接種タイミングを決めるために、モニターした。グルコース、エタノール
、pH、OD、及び（フロー・サイトメトリーにより測定された）細胞数が、培養か
ら16〜23時間の間に測定された。グルコース消費、及び最大バイオマスは、0.5
接種物を用いた20時間のインキュベーション後に得られた。上記条件を、上記プ
レカルチャーを発酵に移ために採用した。

【０６０９】合計800mlのプレカルチャーを、SLの培地FSC002AAを含む20Ｌの発酵槽に接種
するために使用した。３mlの照射した消泡剤を接種前に加えた。ISC002AA培地の
組成は以下の通りである： (NH₄)₂SO₄ 6.4g/l；Na₂MoO₄.２H₂O 2.05mg/l；葉酸0.54mg/l；KH₂PO₄ 8.25g/l
；MnSO₄.H₂O 4.1mg/l；イノシトール540mg/；MgSO₄.７H₂O 4.69g/l；H₃BO₃ 5.17
m/l；ピリドキシン68mg/l；CaCl₂.２H₂O 0.92g/l；KI 1.03mg/l；チアミン68mg/
l；NaCl 0.06g/l；CoCl₂.６H₂O 0.92mg/l；ナイアシン0.27mg/l；HCl １ml/l；F
eCl₃.６H₂O 9.92mg/l；リボフラビン0.13mg/l；CuSO₄.５H₂O 0.41mg/l；グルコ
ース0.14g/l；パントテン酸Ca 68mg/l；ZnSO₄.７H₂O 4.1mg/l；ビオチン0.54mg/
l；ｐ−アミノ安息香酸0.13mg/l；ヒスチジン0.3g/l

【０６１０】炭素源（グルコース）は、FFB004AA培地の連続供給によって添加した。FFB004
AA培地の組成は以下の通りである：グルコース350g/l；Na₂MoO₄.２H₂O 5.15mg/l；葉酸1.36mg/l；KH₂PO₄ 20.6g/l
；MnSO₄.H₂O 10.3mg/l；イノシトール1350mg/l；MgSO₄.７H₂O 11.7g/l；H₃BO₃ 1
2.9m/l；ピリドキシン170mg/l；CaCl₂.２H₂O 2.35g/l；KI 2.6mg/l；チアミン17
0g/l；NaCl 0.15g/l；CoCl₂.６H₂O 2.3mg/l；ナイアシン0.67mg/l；HCl 2.5ml/l
；FeCl₃.６H₂O 24.8mg/l；リボフラビン0.33mg/l；CuSO₄.５H₂O 1.03mg/l；ビオ
チン1.36mg/l；パントテン酸Ca 170mg/l；ZnSO₄.７H₂O 10.3mg/l；ｐ−アミノ安
息香酸0.33mg/l；ヒスチジン5.35g/l。

【０６１１】残留グルコース濃度は、発酵によるエタノール産生を最小化するために、非常
に低く（□50mg/L）維持された。これは制限したグルコース供給速度を用いて微
生物の発生を制限することによって達成した。標準的なバイオマス含量（OD80〜
90）は、44時間の増殖期後の発酵で到達した。

【０６１２】次に、CUP1プロモーターが、P501S抗原を産生するために、500μlのCuSO₄を添
加することで誘導された。CuSO₄の添加にエタノールの蓄積（最大６g/L）が続き
、そして次にグルコースの供給速度を、エタノールを消費するために低下させた
。微生物にとって利用可能な銅は、分光光度的銅アッセイ（DETC法）をブロスの
上清中のCuイオン濃度を試験することでモニタリングした。発酵液には、上清中
の濃度を150〜250μMに維持するために誘導期を通じてCuSO₄が添加された。バイ
オマスは、誘導の終わりにOD100に達した。細胞は、８時間の誘導後に回収され
た。

【０６１３】細胞のホモジェネートを調製し、そしてSDS-PAGE及びウェスタンブロットを標
準的なプロトコールで用いることによって解析した。推定分子量62kDの主要なタ
ンパク質のバンドは、抗P501Sモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット
によって検出した。ウェスタンブロット解析は更に、主要な62kDのバンドが誘導
開始から30分間徐々に産生され、そして３時間後に最大に達したことを示した。
誘導３〜12時間の間には、抗原はもはや産生されていない様であった。

【０６１４】前記細胞から全ての抗原を抽出するために必要なフレンチプレスを通過する回
数が評価された。１，３、そして５回の通過が試験され、そして合計の細胞溶解
物、細胞溶解物の上清及びペレットがウェスタンブロットで解析された。フレン
チプレスの３回の通過は、完全に抗原を抽出するのに十分であった。抗原は不溶
性画分に存在していた。

【０６１５】ｅ）バキュロウイルスにおけるP703Pの発現複数の隣接する制限部位を有する完全長P703P-DE5（配列番号326）のcDNAは、
プラスミドpCDNA703を制限エンドヌクレアーゼXbaI及びHindIIIで消化すること
によって得た。生じた制限フラグメント（約800塩基対）を、同一の制限酵素で
消化したトランスファーベクター内にライゲーションした。インサートの配列は
DNA配列決定で確認した。組換えトランスファープラスミドpFBP703は、Bac-To-B
acバキュロウイルス発現系（BRL Life Technologies）を用いて、バクミドDNA及
びバキュロウイルスを作製するために使用した。High Five細胞は、上述の様に
組換えP703Pタンパク質を得るために、組換えウイルスBVP703に感染した。

【０６１６】ｅ）Ｅ．コリにおけるP788Pの発現Ｃ末端性６×Hisタグを融合したP788Pの短いＮ末端部分（配列番号777の残基
１〜644；P788P-Nとも称する）を以下の様にＥ．コリで発現した。P788PのcDNA
を、プライマーAW080及びAW081（配列番号672及び673）を用いて増幅した。AW08
0は、NdeI部位を有するセンスのクローニングプライマーである。PCR増幅した78
8P、及びベクターpCRX1をNdeI及びXhoIで消化した。ベクターとインサートをラ
イゲーションし、そしてNova Blue細胞を形質転換した。コロニーをインサート
について無作為にスクリーニングし、そして次に配列決定した。

【０６１７】 P788P-Nクローン#6は、設計したコンストラクトと同一であることが確認され
た。発現コンストラクトP788P-N #6/pCRX1で、Ｅ．コリ BL21 CodonPlus-RILコ
ンピテント細胞を形質転換した。誘導後、ほとんどの細胞が良好に生育し、３時
間後にOD600が2.0以上に達した。クーマシー染色したSDS-PAGEは、約75kDに過剰
発現したバンドを示した。６×Hisタグ抗体を用いるウェスタンブロット解析は
、当該バンドがP788P-Nであることを確認した。P788P-Nに関して決定されたcDNA
配列を配列番号674に示し、同時に相当するアミノ酸配列を配列番号675を示す。

【０６１８】ｆ）Ｅ．コリにおけるP510Sの発現 P510Sタンパク質は９個の潜在的な膜貫通ドメインを有し、そして原形質膜に
存在すると推定される。このタンパク質のＣ末端ドメイン、及び推定されるP510
Sの第３の細胞外ドメインは、以下の様にＥ．コリで発現した。

【０６１９】 Ra12-P501S-Cと称される発現コンストラクトは、Ｎ末端に６Hisタグ、続いて
結核（M. tuberculosis）抗原Ra12（配列番号676）及びP510SのＣ末端部分（配
列番号538のアミノ残基1176〜1261）を有する様に設計された。完全長のP510Sは
、プライマーAW056及びAW057（それぞれ配列番号677及び678）を用いるPCRによ
って、P510S-Cフラグメントを増幅するために使用した。AW056はEcoRI部位を有
するセンスのクローニングベクターである。AW057は、停止部位及びXhoI部位を
有するアンチセンスのプライマーである。増幅したP501Sフラグメント及びRa12/
pCRX1をEcoRI及びXhoIで消化し、そして次に精製した。インサートとベクターを
共にライゲーションし、そしてNova Blueを形質転換した。

【０６２０】コロニーをインサート及び配列に関して無作為にスクリーニングした。タンパ
ク質の発現のために、発現コンストラクトでＥ．コリBL21（DE3）を形質転換し
た。ミニ誘導スクリーニングは、発現条件を最適化するために実施した。誘導後
、当該細胞は良好に生育し、３時間後にはOD600nmが2.0以上に達した。クーマシ
ー染色したSDS-PAGEは、約30kDの高度に過剰発現したバンドを示した。これは推
定した分子量以上であるが、ウェスタンブロット解析はポジティブであり、この
バンドがHisタグ含有タンパク質であることを示した。最適化した培養条件は以
下の通りである。

【０６２１】一晩の培養液／昼間の培養液（LB＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を
、１Ｌの２×YTに対して25mlの培養液の比率で、２×YT（カナマイシン及びクロ
ラムフェニコールを有する）中で希釈する。37℃でOD600＝0.6となるまで生育さ
せる。TOの試料としてアリコートを採取する。１mMのIPTGを加え、そして30℃で
３時間生育させる。T3試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして−80℃で保存
する。Ra12-P510S-Cコンストラクトに関して決定したcDNA及びアミノ酸配列を、
それぞれ配列番号679の及び682に示す。

【０６２２】発現コンストラクトP510S-Cは、５′側に加えられた開始コドン及びグリシン
（GGA）コドン、そして次にP510S Ｃ末端フラグメント、続いてインフレームの
６×ヒスチジンタグ及びpET286ベクター由来の停止コドンを有する様に設計され
た。クローニング戦略はRa12-P510S-Cで使用したものと類似しているが、但し、
利用したPCRプライマーは、それぞれ配列番号685及び686に示したものであり、
そしてpET28bにおいてNcoI/XhoI切断を使用した。配列番号685のプライマーは５
′のNcoI部位を作製し、そして開始コドンを加えた。

【０６２３】配列番号686のアンチセンスプライマーは、P510S Ｃ末端フラグメント上にXho
I部位を作製する。クローンは配列決定で確認した。タンパク質発現のために、
発現コンストラクトでＥ．コリBL21（DE3）CodonPlus-RILコンピテント細胞を形
質転換した。2.0以上のOD600は、誘導から30時間後に得られた。クーマシー染色
したSDS-PAGEは、約11kDの過剰発現したバンドを示した。ウェスタンブロット解
析は、当該バンドがＮ末端のタンパク質配列決定を行った場合に、P510S-Cであ
ることを確認した。最適化した培養条件は以下の通りである：

【０６２４】一晩の培養液／昼間の培養液（LB＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を
、１Ｌの２×YTに対して25mlの培養液の比率で、２×YT（カナマイシン及びクロ
ラムフェニコールを有する）中で希釈する。37℃でOD600＝0.6となるまで生育さ
せる。TOの試料としてアリコートを採取する。１mMのIPTGを加え、そして30℃で
３時間生育させる。T3試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして−80℃で精製
まで保存する。P510S-Cコンストラクトに関して決定したcDNA及びアミノ酸配列
を、それぞれ配列番号680の及び683に示す。

【０６２５】 P510Sの推定される第３の細胞外ドメイン（P510S-ES；配列番号538の残基328
〜676）を以下の通りにＥ．コリで発現させた。P510Sフラグメントは、配列番号
687及び688に示すプライマーを用いるPCRによって増幅した。配列番号687のプラ
イマーは、pPDMにライゲーションする際に使用するために、NdeI部位を有するセ
ンスプライマーである。配列番号688のプライマーは、pPPMにライゲーションす
る際に使用するために加えられたXhoI部位を有するアンチセンスプライマーであ
る。生じたフラグメントは、NdeI及びXhoI部位でpPDMにクローニングされた。ク
ローンは配列決定によって確認した。タンパク質の発現のために、当該クローン
でＥ．コリBL21（DE3）CodonPlus-RILコンピテント細胞を形質転換した。

【０６２６】誘導から３時間後にはOD600nmが2.0以上に達した。クーマシー染色したSDS-PA
GEは、約39kDの過剰発現したバンドを示し、そしてＮ末端の配列決定は、P510S-
E3であることを確認した。最適化した培養条件は以下の通りである。一晩の培養
液／昼間の培養液（LB＋カナマイシン＋クロラムフェニコール）を、１Ｌの２×
YTに対して25mlの培養液の比率で、２×YT（カナマイシン及びクロラムフェニコ
ールを有する）中で希釈する。37℃でOD600＝0.6となるまで生育させる。TOの試
料としてアリコートを採取する。１mMのIPTGを加え、そして30℃で３時間生育さ
せる。T3試料を採取し、細胞を遠心沈澱させ、そして精製まで−80℃で保存する
。P501S-E3コンストラクトに関して決定したcDNA及びアミノ酸配列を、それぞれ
配列番号681の及び684に示す。

【０６２７】ｇ）Ｅ．コリでのP775Sの発現抗原P775Pは、多類のオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。配列番号
483のタンパク質をコードする第３のORFは、最良なエモーチフ（emotif）スコア
を有する。結核抗原Ra12（配列番号676）及びＮ末端の６×Hisタグを有するP775
P-ORF3は以下の通りに調製した。P775P-ORF3は、配列番号689のセンスPCRプライ
マー及び配列番号690のアンチセンスプライマーを用いて増幅した。P775P及びRa
12/pCRX1のPCR増幅フラグメントは、制限酵素EcoRI及びXhoIで消化した。ベクタ
ーとインサートをライゲーションし、そして次にNovaBlue細胞を形質転換した。

【０６２８】コロニーをインサートについて無作為にスクリーニングし、そして次に配列決
定した。所望の配列を有するクローンでＥ．コリBL21（DE3）CodonPlusコンピテ
ント細胞を形質転換した。誘導から２時間後、細胞密度は約1.8のOD600に達した
。クーマシー染色したSDS-PAGEは、約31kDの過剰発現したバンドを示した。６×
Hisタグ抗体を用いるウエスタンブロットは、当該バンドがRa12-P775P-ORF3であ
ることを確認した。融合コンストラクトに関して決定されたcDNA及びアミノ酸配
列を、それぞれ配列番号691及び692に示す。

【０６２９】ｈ）Ｅ．コリにおけるP703P Hisタグ融合タンパク質の発現 P703Pのコード領域に関するcDNAは、配列番号693及び694のプライマーを用い
るPCRによって調製した。PCR産物はEcoRI制限酵素で消化し、ゲル精製し、そし
てEco72I及びEcoRI制限酵素で消化した、インフレームでHisタグを有する修飾型
pET28ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはDNA配列解析に
よって確認し、そして次にＥ．コリBL21（DE3）pLys Ｓ発現宿主細胞を形質転換
した。発現した組換えP703Pに関して決定されたアミノ酸及びcDNA配列を、それ
ぞれ配列番号695及び696に示す。

【０６３０】ｉ）Ｅ．コリにおけるP705P Hisタグ融合タンパク質の発現 P705Pのコード領域に関するcDNAは、配列番号697及び698のプライマーを用い
るPCRによって調製した。PCR産物はEcoRI制限酵素で消化し、ゲル精製し、そし
てEco72I及びEcoRI制限酵素で消化した、インフレームでHisタグを有する修飾型
pET28ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはDNA配列解析に
よって確認し、そして次にＥ．コリBL21（DE3）pLys Ｓ及びBL（DE3）CodonPlus
発現宿主細胞を形質転換した。発現した組換えP705Pに関して決定されたアミノ
酸及びcDNA配列を、それぞれ配列番号699及び700に示す。

【０６３１】ｊ）Ｅ．コリにおけるP711P Hisタグ融合タンパク質の発現 P711Pのコード領域に関するcDNAは、配列番号701及び702のプライマーを用い
るPCRによって調製した。PCR産物はEcoRI制限酵素で消化し、ゲル精製し、そし
てEco72I及びEcoRI制限酵素で消化した、インフレームでHisタグを有する修飾型
pET28ベクター内にクローニングされた。正確なコンストラクトはDNA配列解析に
よって確認し、そして次にＥ．コリBL21（DE3）pLys Ｓ及びBL21（DE3）CodonPl
us発現宿主細胞を形質転換した。発現した組換えP711Pに関して決定されたアミ
ノ酸及びcDNA配列を、それぞれ配列番号703及び704に示す。

【０６３２】実施例18 ．前立腺特異的ポリペプチドに対する抗体の調製及び特性決定ａ）P703P、P504S及びP509Sに対するポリクローナル抗体の調製及び特性決定 P703P、P504S及びP509Sに対するポリクローナル抗体を以下の通りにして調製
した。

【０６３３】Ｅ．コリ組換発現系において発現された各前立腺腫瘍抗原を適当な抗生物質を
有するLBブロスの中で一夜、37℃にて振盪インキュベーター内で増殖させた。翌
朝、10mlの一夜培養物を２Ｌのバッフル付きエーレンマイヤーフラスコの中の適
当な抗生物質の入った２×YTに加えて500mlにした。この培養物の光学密度（560
nmにて）が0.4〜0.6に達したら、細胞をIPTG（１mM）で誘導した。IPTGによる誘
導から４時間後、細胞を遠心分離により回収した。これらの細胞をリン酸緩衝食
塩水で洗い、そして再度遠心分離した。この上清液を捨て、そしてそれらの細胞
をその後の使用のために凍結させておくか、又は直ちに処理した。20mlの溶解バ
ッファーを細胞ペレットに加え、そしてボルテックスにかけた。

【０６３４】Ｅ．コリ細胞を破裂させるため、この混合物をフレンチプレスに16,000psiの
圧力にかけた。これらの細胞を再度遠心分離し、次いでその上清液及びペレット
を組換タンパク質の分配についてSDS-PAGEにより検定した。細胞ペレットに局在
したタンパク質については、ペレットを10mMのTris pH8.0, １％のCHAPSに際懸
濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして再び遠心分離した。この手順を更
に２回繰り返した。洗浄した封入体を10mMのTris pH8.0と10mMのイミダゾールを
含む８Ｍの尿素又は６ＭのグアニジンHCLのいずれかで可溶化させた。

【０６３５】この可溶化させたタンパク質を５mlのニッケル−キレート樹脂（Qiagen）に加
え、そして室温にて連続撹拌しながら45min〜１時間インキュベーションした。
インキュベーション後、その樹脂及びタンパク質の混合物をディスポーザブルカ
ラムに通し、そしてフロースルー画分を集めた。次いでこのカラムを10〜20カラ
ム容量の可溶化バッファーで洗った。次に抗原を８Ｍの尿素、10mMのTris pH8.0
及び300mMのイミダゾールを用いてカラムから溶出させ、そして３mlのフラクシ
ョンで集めた。更なる精製のためにどのフラクションをプールするかを決定する
ためにSDS-PAGEゲルを泳動させた。

【０６３６】最終精製工程として、強力なアニオン交換樹脂、例えばHiPrepQ（Biorad）を
適当なバッファーで平衡にし、そして上記のプールしたフラクションをこのカラ
ムに載せた。各抗原を上昇していく塩勾配を利用してこのカラムから溶出させた
。カラムに流しながらフラクションを集め、そしてこのカラムからのどのフラク
ションをプールするかを決定するために別のSDS-PAGEゲルを泳動させた。このプ
ールしたフラクションを10mMのTris pH8.0に対して透析した。次いでこのタンパ
ク質を0.22ミクロンのフィルターで濾過してからバイアルに詰め、そしてその抗
原を免疫のために必要となるまで凍結した。

【０６３７】 400μgづつの前立腺抗原を100μgのムラミルジペプチド（MDP）と組合せた。
４週間毎にウサギを等容量の不完全フロインドアジュバント（IFA）と混合した
抗原100μgでブーストした。各ブーストの７日後、動物の採血を行った。血清は
血液を４℃にて12〜４時間インキュベーションし、次いで遠心分離することによ
り作製した。

【０６３８】 96穴プレートを50μl（一般に１μg）の組換タンパク質と４℃で20時間インキ
ュベーションすることによって抗原でコーティングした。このウェルに250μlの
BSAブロッキングバッファーを加え、そして室温で２時間インキュベーションし
た。プレートをPBS/0.01％のTweenで６回洗った。ウサギ血清をPBSに希釈した。
55μlの希釈した血清を各ウェルに加え、そして室温で30分インキュベーション
した。プレートを上述の通りに洗浄し、１：10000の希釈率の50μlのヤギ抗ウサ
ギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を加え、そして室温で30分インキュベー
ションした。プレートを再び上述の通りに洗浄し、そして100μlのTMBマイクロ
ウェルペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加えた。暗所にて室温において15分イ
ンキュベーション後、比色反応を100μlの１ＮのH₂SO₄で停止させ、そして450nm
で直ちに測定した。全てのポリクローナル抗体が適当な抗原に対して免疫反応性
を示した。

【０６３９】ｂ）P501Sに対する抗体の調製及び特性決定前立腺特異的抗原P501Sのカルボキシ末端に対して特異的なネズミモノクロー
ナル抗体を以下の通りにして調製した。 P501Sの切頭フラグメント（SEQ ID NO：113のアミノ酸355〜526）を作り、そ
してpET28bベクター（Novagen）にクローニングし、そしてＥ．コリの中でヒス
チジンタグの付いたチオレドキシン融合タンパク質として発現させた。このtrx-
P501S融合タンパク質をニッケルクロマトグラフィーにより精製し、トロンビン
で消化してtrxフラグメントを除去し、そして酸沈殿手順、それに続く逆相HPLC
により更に精製した。

【０６４０】マウスを切頭P501Sタンパク質で免疫した。抗P501Sポリクローナル血清を潜在
的に含むマウス由来の採血血清を精製P501S及びtrx-P501Sタンパク質を用いるEL
ISAアッセイを利用し、P501S−特異的反応性について試験した。P501Sと特異的
に反応するようである採血血清を次にウェスタン分析によりP501S反応性につい
てスクリーニングした。P501S特異的抗体成分を含むマウスを殺し、そして脾臓
細胞を用い、標準の技法を利用して抗P501S抗体産生ハイブリドーマを作製した
。

【０６４１】ハイブリドーマ上清液をP501S特異的反応性について、まずELISAにより、次い
でP501S形質導入細胞との反応性のFACS分析により試験した。これらの結果に基
づき、10ESと命名したモノクローナルハイブリドーマを更なるサブクローニング
のために選定した。いくつかのサブクローンができ、ELISAを用いてP501Sに対す
る特異的反応性について試験し、そしてIgGアイソタイプについて分類した。こ
の分析の結果を以下の表Ｖに示す。試験した16のサブクローンのうち、モノクロ
ーナル抗体10E3-G4-DSを更なる研究のために選択した。

【０６４２】

【表７】

【０６４３】 P501Sに対する10E3-G4-D3の特異性をFACS分析により調べた。詳しくは、細胞
を固定し（２％のホルムアルデヒド、10分）、浸透化させ（0.1％のサポニン、1
0分）、そして0.5〜１μg/mlの10E3-G4-D3で染色し、次いで第二FITC接合ヤギ抗
−マウスIg抗体（Pharmigen, San Diego, CA）とインキュベーションさせた。次
に細胞をExcaliburフルオレセンス活性化セルソーターを用い、FITC蛍光につい
て分析した。形質導入された細胞のFACS分析のため、B-LCLにP501Sをレトロウィ
ルス的に形質導入した。感染細胞の分析のため、B-LCLをP501Sを発現するワクシ
ニアベクターで感染させた。これらのアッセイにおける特異性を実証するため、
別の抗原（P703P）を形質導入したB-LCL及び非感染B-LCLベクターを利用した。

【０６４４】 10E3-G4-D3はP501S−形質導入B-LCLに結合し、更にはP501S感染化B-LCLにも結
合するが、非感染細胞又はP703P形質導入細胞とは結合しないことが示された。 10E3-G4-D3により認識されるエピトープが細胞の表層上か又は細胞内区画内に
見い出せるかを検討するため、B-LCLにP501S又はコントロール抗原としてのHLA-
B8を形質導入し、そして上述の通りに固定及び浸透化させるか、又は上述の通り
10E3-G4-D3で直接染色して分析した。10E3-G4-D3によるP501Sの特異的な認識は
浸透化を要することが見い出され、この抗体により認識されるエピトープが細胞
内にあることが示唆された。

【０６４５】 10E3-G4-D3と、高、中及び超低レベルのP501Sをそれぞれ発現することで知ら
れる３つの前立腺腫瘍細胞系Lncap、PC-3及びDU-145との反応性を、上述の通り
細胞を浸透化させ、そして処理することにより調べた。PC-3よりもLncapとのよ
り高い10E3-G4-D3の反応性が認められ、そしてPC-3との反応性はDU-145との反応
性よりも高かった。これらの結果はリアルタイムPCRと一致し、そしてこの抗体
がこのような腫瘍細胞系内のP501Sを特異的に認識し、そして前立腺腫瘍細胞系
内で認識されるエピトープが細胞内にあることも実証する。

【０６４６】 10E3-G4-D3のP501Sに対する特異性はウェスタンブロット分析によっても実証
された。前立腺腫瘍細胞系Lncap、DU-145及びPC-3、P501Sで過渡的にトランスフ
ェクションされたHEK293細胞及び非トランスフェクションHEK293細胞由来のリゼ
ートを作った。これらのリゼートの10E3-G4-D3によるウェスタンブロット分析は
Lncap、PC-3及びP501SトランスフェクションHEK細胞内で46kDaの免疫反応性バン
ドが示されたが、DU-145細胞もしくは非トランスフェクションHEK293細胞では示
されなかった。

【０６４７】 P501S mRNA発現はこれらの結果と一致し、なぜなら半定量PCR分析はP501S mRN
AがLncap内で発現され、PC-3ではより弱いが検出可能なレベルで発現され、そし
てDU-145細胞では全く発現されないことを示したからである。細菌的に発現され
、精製された組換P501S（P501SStr2と称する）は、発現ベクターVR1012又はpCEP
4のいずれかを用いてHEK293細胞内で過渡的に発現された全長P501Sと同様に、10
E3-G4-D3（24kDa）により認識された。P501の推定分子量は60.5kDaであるが、ト
ランスフェクションP501S及び「天然」P501Sは共にその疎水性的性質により若干
低い移動度で泳動した。

【０６４８】前立腺腫瘍及び正常組織切片パネル（前立腺、副腎、胸、頸、結腸、十二指腸
、胆嚢、回腸、腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓及び精巣）に対し免疫
組織化学分析を実施した。組織サンプルをホルマリン溶液の中で24時間かけて固
定し、そしてパラフィンに包埋し、そして10ミクロンの切片にスライスした。組
織切片を浸透化させ、そして10E3-G4-D3抗体と１時間インキュベーションした。
HRP−ラベル化抗マウス、それに続くDABクロモゲンとのインキュベーションを利
用してP501S免疫反応性を可視化させた。P501Sは正常前立腺及び前立腺腫瘍組織
の双方で高度に発現されるが、試験したその他の組織では検出されないことが見
い出された。

【０６４９】 10E3-G4-D3により認識されるエピトープを同定するため、エピトープマッピン
グアプローチを追究した。10E3-G4-D3を作るのに利用したP501Sのフラグメント
を横断（スパン）する一連の13通りの重複20〜21mer（５個のアミノの重複；SEQ
ID NO：489〜501）を作った。平底96穴マイクロタイタープレートに、マウスを
免疫するのに用いたペプチド又はP501Sフラグメントのいずれかを１μg/mlにて3
7℃で２時間かけてコーティングした。次にウェルをアスピレーションにかけ、
そして１％（w/v）のBSAを含むリン酸緩衝液食塩水で室温で２時間かけてブロッ
キングし、次いで0.1％のTween 20を含むPBS（PBST）で洗った。精製抗体10E3-G
4-D3をPBST中の２倍希釈系列（1000ng〜16ng）で加え、そして室温で30分インキ
ュベーションした。

【０６５０】その後PBSTで６回洗い、そして１：20000のHRP−接合ロバ抗マウスIgG（H+L）
Affinipure Ｆ(ab'）フラグメント（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA
）と30分インキュベーションした。次にプレートを洗い、そしてテトラメチルベ
ンジジンの中で15分インキュベーションした。反応を１Ｎの硫酸の添加により停
止させ、そしてプレートをELISAプレートリーダーを用いて450nmで測定した。図
８に示すように、SEQ ID NO：496のペプチド（P501Sのアミノ酸439〜459に相当
）及びP501Sフラグメントとの間で反応性が認められたが、残りのペプチドとは
反応性が認められず、10E3-G4-D3により認識されるエピトープがSEQ ID NO：113
のアミノ酸439〜459に存在することを示す。

【０６５１】 P501Sの組織特異性を更に評価するため、マルチアレー免疫組織化学分析を、
全ての主要正常器官を包含する約4700通りのヒト組織及びこれらの組織に由来す
る新生物に対して実施した。これらのヒト組織サンプルのうちの65が前立腺起源
である。直径0.6mmの組織切片をホルマリン固定し、そしてパラフィン包埋した
。サンプルを10mMのクエン酸バッファーpH6.0を用いてHIERで予備処理し、そし
て10分煮沸した。切片を10E3-G4-D3で染色し、そしてP501S免疫反応をHRPで可視
化させた。65の前立腺組織サンプルの全て（５つが正常、55が未処置前立腺腫瘍
、５がホルモン難治前立腺腫瘍）が陽性であり、異なる核周囲染色を示した。調
べたその他の認識は全てP501S発現に関して陰性であった。

【０６５２】ｃ）P503Sに対する抗体の調製及び特徴付け P503S（配列番号：114のアミノ酸113〜241）の１つのフラグメントは、P501S
に対して、上に記載したように本質的にバクテリアから発現、及び精製し、ウサ
ギ及びマウスの両者を免疫化するために使用した。マウス・モノクローナル抗体
は、上に記載したように、通常のハイブリドーマ技術を使用して単離した。ウサ
ギ・モノクローナル抗体は、イムジェニックス・ファーマソイティカルズ（Immg
enics Pharmaceuticals）（バンクーバー、BC、カナダ）において、選択的リン
パ球抗体法（Selected Lymphocyte Antibody Method (SLAM) ）を使用して単離
した。下の表VIは、P503Sに対して開発（developed）されたモノクローナル抗体
を列挙する。

【０６５３】

【表８】

【０６５４】ウサギ・モノクローナル抗体20D4及びJA1に対する相補性決定領域（CDRs）を
エンコードするDNA配列を決定し、それぞれ、配列番号：502及び503に提供した
。この抗体のそれぞれのエピトープ結合領域をさらに良好に定義するため、一系
列の重複ペプチド（overlapping peptides）を産生させたが、それは配列番号：
114のアミノ酸109〜213にまたがる（span）。これらのペプチドは、以下のよう
にELISAによって、抗P503Sモノクローナル抗体のエピトープ・マップに使用され
た。免疫原として使用された、P503Sの組換え型フラグメントは、陽性対照とし
て使用した。96ウェルのマイクロタイター・プレートを、４℃で一晩、20ng／ウ
ェルで、ペプチド又は組換え型抗原でコートした。

【０６５５】プレートを吸引し、さらに室温において２時間、１％（w/v）BSAを含むリン酸
で緩衝された食塩水でブロックし、次に0.1％ Tween 20（PBST）を含むPBS中で
洗浄した。PBST中に希釈された、精製されたウサギ・モノクローナル抗体を、上
記のウェルに添加し、室温で30分、インキュベートした。PBSTで６回洗浄するこ
と、そして、さらに30分間、１：2000希釈のプロテイン−Ａ HRPコンジュゲー
ト（conjugate）でのインキュベーションをこれに続けた。プレートを、PBST中
で６回洗浄し、さらに15分間、テトラメチルベンジジン（TMB）基質でインキュ
ベートした。この反応を、１Ｎ硫酸の添加によって停止し、さらにプレートを、
ELISAプレート・リーダーを使用して、450nmで読みとった。マウス・モノクロー
ナル抗体を用いたELISAは、組織培養液からの上清を用いて実施したが、この試
験法において適切に進行した。

【０６５６】上記抗体の全ては、負の対照（ネガティブ・コントロール）SP2上清を例外と
して、組換え型P503Sフラグメントに結合した。20D4、JA1、及び1D12は、ペプチ
ド#2101（配列番号：504）に厳密に結合したが、このペプチドは配列番号：114
のアミノ酸151〜169に一致する。1C3は、ペプチド#2102（配列番号：505）に結
合したが、このペプチドは、配列番号：114のアミノ酸165〜184に一致する。9C1
2は、ペプチド#2099（配列番号：522）に結合したが、このペプチドは、配列番
号：114のアミノ酸120〜139に一致する。その他の抗体が結合した領域は、本研
究においては、調べられていない。

【０６５７】エピトープ・マッピングに続いて、抗体を、P503Sを安定して発現した１つの
細胞系統に対するFACS分析によって試験し、抗体が細胞表面のエピトープに結合
することを確認した。対照のプラスミドで、きちんと形質導入された細胞を、負
の対照として使用した。細胞は、生きたまま、固定液を用いずに染色した。0.5u
gの抗P503Sモノクローナル抗体を添加し、さらに細胞を30分間、氷上でインキュ
ベートし、FITCラベルされたヤギ抗ウサギ、又はマウス二次抗体で2回の洗浄、
及び20分間のインキュベートをした。２回洗浄後、細胞をエクスカリバー蛍光活
性化セル・ソーター（Excalibur fluorescent activated cell sorter）で分析
した。モノクローナル抗体1C3、1D12、9C12、20D4、及びJA1は、P503の細胞表面
エピトープに結合することを発見したが、8D3は結合することが発見されなかっ
た。

【０６５８】どの組織がP503Sを発現するかを決定するため、本質的には上述のように、通
常組織（前立腺、副腎、乳房、頸部（cervix）、大腸、十二指腸、胆嚢、回腸、
腎臓、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓、精巣）のパネル上で、免疫組織化学
的分析を行った。HRP標識された抗マウス、又は抗ウサギ抗体を使用し、次にTMB
でのインキュベーションを行って、P503Sの免疫反応性を可視化した。P503Sは、
前立腺組織中で高度に発現されることが発見され、頸部（cervix）、大腸、回腸
、腎臓においては、それより低いレベルの発現であり、副腎、乳房、十二指腸、
胆嚢、卵巣、膵臓、耳下腺、骨格筋、脾臓、及び精巣においては、いかなる発現
も観測されなかった。

【０６５９】ウエスタンブロット分析を、抗P503Sモノクローナル抗体の特異性を特徴づけ
るために使用した。バクテリア中で発現され、かつバクテリアから精製された組
換え型（rec）P503S、及び完全長P503Sを形質移入されたHEK293細胞からの可溶
化液（ライセート）について、SDS-PAGEを行った。タンパク質をニトロセルロー
スに移し、そして次に、抗体濃度１μg/mlにおいて、各々の抗P503Sモノクロー
ナル抗体（20D4、JA1、1D12、6D12、9C12）でウエスタンブロットを行った。ヤ
ギ抗マウスモノクローナル抗体、又はプロテイン・Ａ−セファロース（protein
A-sepharose）の何れかに複合化（conjugated）された、ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase (HRP) ）を使用して、タンパク質
を検出した。モノクローナル抗体20D4は、妥当な分子量14kDaの組換え型P503S（
アミノ酸113〜24 ｃ）P503Sに対する抗体の調製及び特徴付け P503S（配列番号：114のアミノ酸113〜241）の１つのフラグメントは、P501S
に対して、上に記載したように本質的にバクテリアから発現、及び精製し、ウサ
ギ及びマウスの両者を免疫化するために使用した。マウス・モノクローナル抗体
は、上に記載したように、通常のハイブリドーマ技術を使用して単離した。ウサ
ギ・モノクローナル抗体は、イムジェニックス・ファーマソイティカルズ（Immg
enics Pharmaceuticals）（バンクーバー、BC、カナダ）において、選択的リン
パ球抗体法（Selected Lymphocyte Antibody Method (SLAM) ）を使用して単離
した。下の表VIは、P503Sに対して開発（developed）されたモノクローナル抗体
を列挙する。ウサギ・モノクローナル抗体20D4及びJA1に対する相補性決定領域（CDRs）を
エンコードするDNA配列を決定し、それぞれ、配列番号：502及び503に提供した
。この抗体のそれぞれのエピトープ結合領域をさらに良好に定義するため、一系
列の重複ペプチド（overlapping peptides）を産生させたが、それは配列番号：
114のアミノ酸109〜213にまたがる（span）。これらのペプチドは、以下のよう
にELISAによって、抗P503Sモノクローナル抗体のエピトープ・マップに使用され
た。免疫原として使用された、P503Sの組換え型フラグメントは、陽性対照とし
て使用した。 96ウェルのマイクロタイター・プレートを、４℃で一晩、20ng／ウェルで、ペプ
チド又は組換え型抗原でコートした。プレートを吸引し、さらに室温において２
時間、１％（w/v）BSAを含むリン酸で緩衝された食塩水でブロックし、次に0.1
％ Tween 20（PBST）を含むPBS中で洗浄した。PBST中に希釈された、精製された
ウサギ・モノクローナル抗体を、上記のウェルに添加し、室温で30分、インキュ
ベートした。PBSTで６回洗浄すること、そして、さらに30分間、１：2000希釈の
プロテイン−Ａ HRPコンジュゲート（con 1）、及び完全長P503Sを形質移入さ
れたHEK293細胞可溶化液中の23.5kDaの化学種を検出した。他の抗P503Sモノクロ
ーナル抗体は、ウエスタンブロットによって、類似の特異性を示した。

【０６６０】ｄ）P703Pに対する抗体の調製及び特徴付けウサギを、組換え型P703Pタンパク質の、切断型（P703Ptrl；配列番号：172）
又は完全長成熟型（P703Pfl；配列番号：523）のいずれかで免疫化したが、この
タンパク質は上述のようにバクテリア中で発現され、かつバクテリアから単離さ
れた。アフィニティー精製されたポリクローナル抗体は、固体支持体に結合され
た免疫原P703Pfl又はP703Ptrlを使用して作成された。ウサギ・モノクローナル
抗体は、イムジェニック・ファーマソイティカル（Immgenics Pharmaceuticals
）において、SLAM技術を使用して単離した。下の表VIIは、P703Pに対して産生さ
れたポリクローナル抗体、及びモノクローナル抗体の両者を列挙する。

【０６６１】

【表９】

【０６６２】ウサギ・モノクローナル抗体8H2、7H8、及び2D4に対する相補性決定領域（CDR
s）をエンコードするDNA配列を決定し、それぞれ、配列番号：506〜508に提供す
る。エピトープ・マッピング研究を、上述のように行った。モノクローナル抗体2D
4、及び7H8は、それぞれ、配列番号：509（配列番号：172のアミノ酸145〜159に
一致する）、及び配列番号：510（配列番号：172のアミノ酸11〜25に一致する）
のペプチドに、特異的に結合することが発見された。ポリクローナル抗体9427が
、配列番号：515〜517のペプチドに結合することと共に、ポリクローナル抗体25
94が、配列番号：511〜514のペプチドと結合することが発見された。

【０６６３】抗P703P抗体の特異性は、以下のようにウエスタンブロット分析によって決定
した。（１）バクテリアによって発現された組換え型抗原；（２）完全長P703P
を発現しているプラスミドで形質移入されていないか、又は形質移入されたHEK2
93細胞及びLtk-/-細胞の可溶化液；さらに（３）これらの細胞培養液から単離さ
れた上清について、SDS-PAGEを実施した。タンパク質は、ニトロセルロースに移
し、さらに次に、抗P703Pポリクローナル抗体#2594を、１ug/mlの抗体濃度で使
用して、ウエスタンブロットを行った。

【０６６４】タンパク質は、抗ウサギ抗体に複合化されたホースラディッシュ・ペルオキシ
ダーゼ（HRP）を使用して検出した。35kDaの免疫反応性バンドが、組換え型P703
Pについて観測された。組換え型P703Pは、わずかに高分子量で移動するのは、そ
れがエピトープをぶら下げているからである。完全長P703Pを形質移入された細
胞からの可溶化液及び上清中、P703Pに一致する30kDaのバンドが観測された。特
異性を確実にするため、対照プラスミドで確実に形質移入されたHEK293細胞から
の可溶化液をさらに試験したが、P703P発現に対して陰性であった。他の抗P703P
抗体は、類似の結果を示した。

【０６６５】抗P703Pモノクローナル抗体を使用して、免疫組織化学的研究を上述のように
行った。P703Pは、正常な前立腺、及び前立腺腫瘍組織中で、高いレベルで発現
されることが発見されているが、試験した全てのその他の組織（乳ガン、肺ガン
、及び正常な腎臓）中では検出されなかった。

【０６６６】ｅ）P504Sに対する抗体の調製及び特徴付け完全長P504S（配列番号：108）は、P501Sに対し、上述のように本質的にバク
テリアで発現され、かつ単離され、イムジェニックス・ファーマソイティカル（
Immgenics Pharmaceuticals）（バンクーバー、BC、カナダ）で、選択的リンパ
球抗体法（SLAM）を使用して、ウサギ・モノクローナル抗体を産生するために使
用した。抗P504Sモノクローナル抗体13H4は、ウエスタンブロットにより、ガン
細胞中で、発現された組換え型P504S、及び天然型P504Sの両者に結合することが
示された。

【０６６７】様々な前立腺組織中のP504Sの発現を評価するための、13H4を使用した免疫組
織化学的研究を、上述のように行った。前立腺ガン（PC）を伴う根治的前立腺切
除術の65症例、前立腺生検の26症例、及び良性の前立腺肥大（BPH）の13症例を
含む、全部で104の症例は、抗P504Sモノクローナル抗体13H4で染色した。P504S
は、前立腺切除術において、PCの64/65（98.5％）で、さらに前立腺生検の26/26
（100％）において、細胞質顆粒染色を強く示した。P504Sは、ガン（carsinomas
）（PCの症例の91.2％において４＋、5.5％において３＋、2.2％において２＋、
1.1％において１＋）及び前立腺上皮内腫瘍（全ての症例で４＋）において、強
く、かつ拡散して染色された。

【０６６８】 P504Sの発現は、グレーソン・スコア（Gleason score）に伴って変化しなかっ
た。PCの周りのNP/BPHの症例のわずか17/91（18.7％）、及びBPH症例の1/13（15
.4％）が、病巣であり（全ての症例で１＋、２＋〜４＋はなし）、かつ、ラージ
腺（large glands）中で、P504Sに対し、弱い陽性であった。P504Sの発現は、生
検又は前立腺切除術のいずれかにおける小萎縮性腺（small atrophic glands）
、ポストアトロフィック過形成（postatrophic hyperplasia）、基底細胞過形成
、移行細胞化生（transitional cell metaplasia）においては、発見されなかっ
た。

【０６６９】 P504Sは、従って、前立腺ガンの全てのグレーソン・スコア（Gleason scores
）（98.5〜100％の敏感さ）において、過剰発現されていることが発見され、か
つ、大きな正常前立腺においては、症例の19/104において（82.3％の特異性）、
病巣陽性（focal posibivities）のみが示されることが発見された。これらの発
見は、P504Sが、前立腺ガンの診断のために有用に使用されうることを示す。

【０６７０】実施例19 ．細胞表面発現の特徴付け及び前立腺特異的抗原P501Sの染色体の所在この実施例は、前立腺特異的抗原P501Sが細胞の表面で発現されることを示す
研究を、P501Sの、蓋然性のある染色体の所在を決定するための研究とともに記
述する。

【０６７１】タンパク質P501S（配列番号：113）は、11の膜貫通ドメインを有することが示
唆される。抗P501Sモノクローナル抗体10E-G4-D3（実施例17中に上述したもの）
によって、認識されたエピトープが細胞内にあるという発見に基づき、以下の膜
貫通決定因子（transmembrane determinants）は、P501Sの細胞外ドメインの予
言を許すだろう。図９は、膜貫通ドメインの予言された所在、及び実施例17中に
記述された細胞内エピトープを示す、P501Sタンパク質の図式的表現である。

【０６７２】下線を付した配列は、予言された膜貫通ドメインを表し、太字の配列は、予言
された細胞外ドメインを表し、さらに、イタリックの配列は、予言された細胞内
ドメインを表す。太字かつ下線の両者が付された配列は、ポリクローナル・ウサ
ギ血清を産生するために使用された配列を表す。膜貫通ドメインの所在は、トス
ナディ（Tusnady）及びシモン（Simon）によって記述されたように、HHMTOPを使
用して予言された（Princeples Governing Amino Acid Composition of Integra
l Membrane Proteins：Appplications to Topology Prediction, J. Mol. Biol.
283 : 489〜506, 1998）。

【０６７３】図９に基づき、アミノ酸274〜295及び323〜342に一致する膜貫通ドメインが側
面に位置したP501Sドメインは、細胞外であることが予言される。配列番号：518
のペプチドは、P501Sのアミノ酸306〜320に一致し、予言された細胞外ドメイン
中にある。配列番号：519のペプチド、これは、アスパラギニンとヒスチジンの
置換を除いて、配列番号：518のペプチドと同一であるが、上述のように合成し
た。担体タンパク質に対する結合を容易にするため、このペプチドのＣ末端にCy
s-Glyが付加された。

【０６７４】固体支持体からのペプチドの開裂は、以下の開裂混合物を使用して行った：ト
リフルオロ酢酸：エタンジオール：チオアニソール：水：フェノール（40：１：
２：２：３）。２時間の開裂の後、このペプチドを、冷エーテル中で沈殿させた
。ペプチドの粒は、次に10％（v/v）酢酸中に溶解し、C18逆相hplcによって精製
する前に、凍結乾燥した。水（0.05％TFAを含む）中、５〜60％アセトニトリル
（0.05％TFAを含む）のグラジエント（gradient）を使用し、このペプチドを溶
離した。ペプチドの純度は、phlc及びマス・スペクトルによって確認し、＞95％
であることを決定した。精製したペプチドは、上述のように、ウサギ・モノクロ
ーナル抗体抗血清を産生するために使用した。

【０６７５】 P501Sの表面発現をFACS分析により試験した。細胞を10μg/mlのポリクローナ
ル抗P501Sペプチド血清により染色し、洗浄し、２次FITCコンジュゲート・ヤギ
・抗ウサギ・Ig抗体（ICN）と一緒にインキュベートし、洗浄し、そしてExcalib
ur蛍光細胞分析分離装置を用いてFITC蛍光について分析した。形質導入細胞のFA
CS分析のために、B-LCLをレトロウイルス的にP501Sにより形質導入した。これら
の分析の特異性を証明するために、関連性のない抗原（P703P）により形質導入
したB-LCL又は形質導入しなかったB-LCLを平行して染色した。

【０６７６】前立腺癌細胞株のFACS分析のために、Lncap、PC-3、及びDU-145を使用した。
前立腺癌細胞株を細胞分離メジュームを用いて組織培養皿から分離し、そして前
記のとおり染色した。全てのサンプルをFACS分析の前にヨウ化プロピジウム（PI
）により処理し、そしてデータをPI排除（すなわち、無傷の、そして非透過性）
細胞から得た。配列番号519のペプチドに対して製造されたウサギ・ポリクロー
ナル血清は、ポリクローナル血清により認識されるエピトープが細胞外のもので
あることを証明する、P501Sを発現するために形質導入された細胞の表面の特異
的な認識を示した。

【０６７７】 P501Sが細胞表面に発現されているとき、生化学的に測定するために、Lncap細
胞の周辺膜を分離し、そしてウエスタン・ブロット分析に供した。具体的には、
Lncap細胞を５mlの均質化バッファー（250mMスクロース、10mM HEPES, １mM EDT
A, pH8.1、１つの完全プロテアーゼ阻害剤錠（Boehringer Mannheim））中、ダ
ウンス（dounce）・ホモジナイザーを用いてすりつぶした。ライゼート・サンプ
ルを1000ｇ、５分間４℃で遠心分離した。次にその上清を8000ｇ、10分間、４℃
で遠心分離した。8000ｇの遠心分離からの上清を回収し、そして30分間、４℃で
の100,000ｇの遠心分離に供して周辺膜を回収した。

【０６７８】次にサンプルをSDS-PAGEにより分離し、そして前記の条件を用いたマウス・モ
ノクローナル抗体10E3-G4-D3（実施例17中に前記）によりウエスタン・ブロット
した。組換え精製P501S、並びにP501により形質導入し、そしてそれを過剰発現
するHEK293細胞をP501S検出の陽性対照として含んだ。LCL細胞ライセートを陰性
対照として含んだ。P501Sを、Lncap全細胞ライセート中、8000ｇ（内膜）画分中
、及び100,000ｇ（原形質膜）画分中にも検出することができた。これらの結果
は、P501Sが周辺膜で発現され、そしてそこに配置されていることを示している
。

【０６７９】配列番号519のペプチドに対して製造されたウサギ・ポリクローナル抗血清が
、このペプチド並びに配列番号518の対応の天然ポリペプチドを特異的に認識す
ることを証明するために、ELISA分析を実施した。この分析のために、平底96ウ
ェル・マイクロタイター・プレートを配列番号519のペプチド、完全に予測され
た細胞外ドメインに及ぶ配列番号520のより長いポリペプチド、P501S特異的抗体
10E3-G4-D3により認識されるエピトープを表す配列番号521のペプチド、又は免
疫性ペプチド配列を含まない（配列番号113の355〜526アミノ酸に対応の）P501S
断片のいずれかにより１μg/mlで２時間37℃でコートした。

【０６８０】ウェルを吸引し、１％（w/v）BSA含有リン酸緩衝生理食塩水により室温で２時
間ブロッキングし、そして続いて0.1％ Tween 20含有PBS（PBST）により洗浄し
た。精製抗P501Sポリクローナル・ウサギ血清をPBST中に２倍希釈（1000ng〜125
ng）で加え、そして室温で30分間インキュベートした。引き続きこれをPBSTによ
り６回洗浄し、１：20000でHRPコンジュゲート・ヤギ抗ウサギIgG（H+L）Affini
pure Ｆ(ab') 断片と一緒に30分間インキュベートした。次にプレートを洗浄し
、そしてテトラメチル・ベンジジン中、15分間インキュベートした。１Ｎ硫酸の
添加により反応を停止させ、そしてプレートをELISAプレート・リーダーを用い
て450nmで読んだ。図11に示すとおり、抗P501Sポリクローナル・ウサギ血清は、
免疫に用いた配列番号519のペプチド、並びに配列番号520のより長いペプチドを
特異的に認識したが、しかし関連のないP501S由来のペプチド及び断片は認識し
なかった。

【０６８１】さらなる研究において、ウサギをP501Sの配列由来のポリペプチドにより免疫
し、そして図９に示すとおり細胞外又は細胞内のいずれかであるかを予測した。
前記のとおり、ポリクローナル・ウサギ血清を分離し、そしてその血清中のポリ
クローナル抗体を精製した。P501Sとの特異的反応性を測定するために、P501S若
しくは関連性のない抗原P703Pにより形質導入したB-LCL、又はワクシニア・ウイ
ルス発現P501Sを注入したB-LCLのいずれかを用いたFACS分析を使用した。表面発
現のために、死細胞及び損傷細胞を前記のとおり分析から除外した。細胞内染色
のために、前記のとおり細胞を固定し、そして透過化処理した。P501Sの181〜19
8アミノ酸に対応の配列番号548のペプチドに対して産生されたウサギ・ポリクロ
ーナル血清がP501Sの表面エピトープを認識することが分かった。

【０６８２】異なる実験において無傷又は透過化処理細胞がこのポリクローナル血清により
認識されたので、P501Sの543〜553アミノ酸に対応の配列番号551のペプチドに対
して産生されたウサギ・ポリクローナル血清は、細胞外又は細胞内いずれかの可
能性をもつエピトープを認識することがわかった。同様の推理的な論法に基づき
、それぞれP501Sの109〜122、539〜553、509〜520、37〜54、342〜359、295〜32
3、217〜274、143〜160、及び75〜88アミノ酸に対応する配列番号541〜547、549
、及び550の配列は抗体に認識される潜在的な表面エピトープであると考えられ
うる。

【０６８３】さらなる研究において、マウス・モノクローナル抗体を細胞外ドメインと予測
されるP501Sの296〜322アミノ酸に対して作った。A/JマウスをP501S/アデノウイ
ルスにより免疫し、続いてP501Sの296〜322アミノ酸を含むP501Nと称するＥ．コ
リ（E.coli）組換えタンパク質、及びKLHと結合した296〜322ペプチド（配列番
号755）により追加免疫した。続いてマウスを、抗ペプチド・ハイブリドーマ産
生のための脾臓Ｂ細胞融合のために利用した。4F4（IgG1、カッパ）、4G5（IgG2
a、カッパ）、及び9B9（IgG1、カッパ）と称する、結果として得られた３種のク
ローンを抗体製造のために生育させた。4G5mAbを、その上清をProtein A−セフ
アロース・カラムを通過させ、続いて0.2Ｍグリシン、pH2.3を用いて溶出するこ
とで精製した。精製抗体を１Ｍトリス、pH８の添加により中和し、そしてバッフ
ァーをPBSに交換した。

【０６８４】 ELISA分析のために、96ウェル・プレートを、全て２μg/mlの濃度でP501Sペプ
チド296〜322（長P501Sと称する）、関連のないP775ペプチド、P501S〜Ｎ、P501
TR2、長P501S-KLH、P501Sペプチド306〜319（短P501と称する）-KLH又は関連の
ないペプチド2073-KLHによりコートし、37℃で60分間インキュベートした。コー
ティング後、0.1％ Tween含有PBSにより５回洗浄し、そして次に0.5％ BSA、0.4
％ Tween 20含有PBSにより室温で２時間ブロッキングした。

【０６８５】上清又は精製mAbの添加に続き、そのプレートを室温で60分間インキュベート
した。プレートを前記のとおり洗浄し、そしてロバ抗マウスIgHRP結合２次抗体
を添加し、そして室温で30分間インキュベートし、引き続き前記のとおり最後の
洗浄をした。TMB基質を加え、そして暗闇の中室温で15分間インキュベートした
。前記反応を１Ｎ H₂SO₄の添加により停止させ、そして吸光度を450nMで読んだ
。３種のハイブリッド・クローンの全てが296〜322ペプチド、及び組換えタンパ
ク質P501Nを認識するmAbを分泌した。

【０６８６】 FACS分析のために、HEK293細胞を、Fugene ６試薬を用いてP501S/VR1012発現
構築物により一時的に形質導入した。培養２日後細胞を採取し、そして洗浄し、
次に精製4G5 mAbと一緒に水上で30分間インキュベートした。PBSによる数回の洗
浄の後、0.5％ BSA、0.01％アザイド、ヤギ抗マウスIg-FITCを前記細胞に添加し
、そして氷上30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして１％ヨウ化プロ
ピジウム含有洗浄バッファーにより再懸濁し、そしてFACS分析に供した。FACS分
析は、P501Sの296〜322アミノ酸が細胞外ドメイン内に存在し、そして細胞表面
に発現されていることを確かにした。

【０６８７】 P501Sの染色体配置を、Gene Bridge 4 Radiation Hybridパネル（Research Ge
netics）を用いて決定した。配列番号528及び529のPCRプライマーを製造者の指
示に導いハイブリッド・パネルからのDNAプールによるPCRに使用した。38サイク
ルの増幅の後、反応産物を1.2％アガロース・ゲルにより分離し、そしてその結
果をWhitehead Institute/MIT Center for Genome Research web server (http:
//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）を通して分析し、有望
な染色体配置を決定する。この方法を用いて、P501Sを第１染色体の長腕、WI-96
41のq32〜q42の間に位置付けた。第１染色体のこの領域は、遺伝性前立腺癌にお
いて前立腺癌感受性に関連している（Smith et al. Science 274 : 1371-1374,
1996、及びBerthon et al. Am. J. Hum. Genet. 62 : 1416-1424, 1998）これら
の結果は、P501Sが前立腺癌悪性腫瘍において役割を担いうることを示唆する。

【０６８８】実施例20 ．前立腺特異性抗原P501Sの発現調節ステロイド（アンドロゲン）ホルモン調節は前立腺癌における一般的な治療の
様相である。多くの前立腺組織特異性抗原の発現がアンドロゲンに対応すること
はこれまでに証明されている。アンドロゲン処理に対する前立腺特異性抗原P501
Sの対応を以下の組織培養系により試験した。

【０６８９】前立腺癌細胞株LNCaPからの細胞を1.5×10⁶細胞／T75フラスコ（RNA分離用）
又は３×10⁵細胞／６ウェル・プレートのウェル（FACS分析用）で播種し、そし
て10％チャコール・ストリップ（charcoal-stripped）牛胎児血清（BRL Life Te
chnologies, Gaithersburg, MD）含有RPMI1640培地中で一晩培養した。さまざま
な時点で加えた１nMの合成アンドロゲン・メチルトリエノロン（R1881；New Eng
land Nuclear）とともに10％チャコール・ストリップ牛胎児血清含有RPMI1640培
地中、さらに72時間細胞培養を続けた。次にRNA分離及びFACS分析のためにアン
ドロゲン添加後０，１，２，４，８，16，24，28、及び72時間で細胞を採取した
。FACS分析を抗P501S抗体10E3-G4-D3及び透過化細胞を用いて実施した。

【０６９０】ノザン分析のために、５〜10μgの総RNAをホルムアルデヒド変性ゲルにより泳
動し、Hybond-Nナイロン膜（Amersham Pharmacia Biothech, Piscataway, NJ）
に転写し、交差結合し、そしてメチレン・ブルーにより染色した。次にそのフィ
ルターをChurch'sバッファー（250mM Na₂HPO₄, 70mM H₃PO₄, １mM EDTA, １％SD
S, １％BSA, pH7.2）により65℃で１時間プレハイブリダイズした。P501S DNAを
High Primeランダム・プライムDNAラベリング・キット（Boehringer Mannheim）
を用いて³²Ｐにより標識した。組み込まれていない標識をMicro Spin S300-HRカ
ラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて除去した。

【０６９１】次に前記RNAフィルターを標識cDNAを含む新しいChurch'sバッファーにより一
晩ハイブリダイズさせ、１×SCP（0.1M NaCl, 0.03Ｍ Na₂HPO₄・７H₂O, 0.001Ｍ
Na₂EDTA）、１％サルコシル（ｎ−ラウロイルサルコシン）により洗浄し、そし
てＸ線フィルムに感光させた。 FACS及びノザン分析の両者を用いて、P501Sメッセージ及びタンパク質レベル
がアンドロゲン処理に対応して減少することが分かった。

【０６９２】実施例20 ．前立腺特異的薬剤の融合タンパク質の調製この実施例は前立腺特異的抗原P703Pと端を切り取った形の既知の前立腺抗原P
SAとの融合タンパク質の調製を記載する。端を切り取った形のPSAは活性セリン
部位のあたりに21アミノ酸の欠失を有する。融合タンパク質についての発現構築
体も停止コドンの直前である３′末端に制限部位を有し、追加の抗原のためのcD
NAを加えることについて援助する。

【０６９３】 PSAについての全長cDNAを配列番号607及び608のプライマーを用いてヒト前立
腺腫瘍組織からのRNAのプールからRT-PCRにより得て、pCR−ブランドII-TOPOベ
クター中にクローン化した。得られたcDNAを鋳型として用いて、２組のプライマ
ー（配列番号609及び610並びに配列番号611及び612）を用いてPCRにより、PSAの
２つの異ったフラグメントを作成した。予測したサイズを有するPCR生成物を鋳
型として用いて配列番号611及び613のプライマーを用いてPCRにより、端を切り
取った形のPSAを作成した。これはPSAを生じた（アミノ酸中のデルタ208〜218）
。５′末端に６×ヒスチジン標識を有する成熟した形のP703PについてのcDNAをP
703P及び配列番号614及び615のプライマーを用いてPCRにより調製した。

【０６９４】次いで、P703Pと端を切り取った形のPSAとの融合についてのcDNA（FOPPという
）を、改変したP703P cDNA及び端を切り取った形のPSA cDNAを鋳型として、配列
番号614及び615のプライマーを用いて得た。FOPP cDNAを発現ベクターpCRX1のNd
eI部位及びXhoI部位中にクローン化し、DNA配列決定により確認した。融合構築
体FOPPについての決定したcDNA配列を配列番号616として提供し、アミノ酸配列
を配列番号617として提供した。

【０６９５】融合FOPPを以下のように大腸菌中に単一組換えタンパク質として発現させた。
発現プラスミドpCRX1FOPPを大腸菌株BL21−コドンプラスPIL中に形質転換した。
形質転換体は１mMのIPTGを用いる誘発によりFOPPタンパク質を発現することが分
かった。対応する発現クローンの培養を50μg/mlのカナマイシン及び34μg/mlの
クロラムフェニコールを含有する25mlのLBブロス中に接種し、約１のOD600まで
の37℃で増殖させ、４℃で一夜貯蔵した。培養を50μg/mlのカナマイシン及び34
μg/mlのクロラムフェニコールを含有する１リットルのTB LB中に希釈し、0.4の
OD600まで37℃で増殖させた。１mMの最終濃度となるまでIPTGを加え、培養を30
℃で３時間インキュベートした。

【０６９６】細胞を5,000RPMで８分間遠心分離することによりペレット化した。タンパク質
を精製するために、細胞ペレットを25mlの10mMのトリス−Cl pH8.0, ２mMのPMSF
（完全なプロテアーゼ阻害剤）及び15μgのリゾチーム中に懸濁した。細胞を４
℃で30分間溶解させ、数回超音波処理し、溶解物を10,000×ｇで30分間遠心分離
した。封入体を含有する沈澱物を10mMのトリス−Cl pH8.0及び１％のCHAPSで２
回洗浄した。封入体を40mlの10mMのトリス−Cl pH8.0, 100mMのリン酸ナトリウ
ム及び８Ｍの尿素に溶解した。

【０６９７】溶液を８mlのNiNTA（Qiagen）に室温で１時間結合させた。混合物を25mlのカ
ラムに注ぎ、50mlの10mMのトリス−Cl pH6.3, 100mMのリン酸ナトリウム、0.5％
のDOC及び８Ｍの尿素で洗浄した。結合タンパク質を350mMのイミダゾール、10mM
のトリス−Cl pH8.0, 100mMのリン酸ナトリウム及び８Ｍの尿素で溶出させた。F
OPPタンパク質を含有する分画を一緒にして、10mMのトリス−Cl pH4.6に対して
広範囲にわたって透析し、分取し、−70℃で貯蔵した。

【０６９８】実施例21 ．前立腺がん患者の末梢血中の前立腺特異的抗原P501Sのリアルタイム
のPCR特性付け正常な個体及び転移前立腺がん患者の新鮮な血液から、循環する上皮細胞を単
離し、mRNAを単離し、リアルタイムPCR手順を用いてcDNRを調製した。リアルタ
イムPCRを遺伝子発現レベルを決定するために遺伝子特異的プライマーとプロー
ブの両方を用いて、Taqman（商標）手順で実施した。免疫磁性ビーズ分離法（Dynal A.S.、ノルウェー国オスロ）を用いて血液サン
プルから上皮細胞を富化した。単離細胞を溶解させ、磁性ビーズを除去した。次
いで、溶解物をOligo（dT）25で被覆した磁性ビーズを用いてポリＡ＋mRNA単離
のために処理した。緩衝液中のビーズを洗浄した後、ビーズ／ポリＡ＋RNAサン
プルを10mMのトリスHCl pH8.0に懸濁し、逆転写をさせた。

【０６９９】生じたcDNAを遺伝子特異的プライマーを用いるリアルタイムPCRにかけた。ベ
ータアクチン含量も測定し、標準化のために用いた。正常のサンプルの平均＋３
標準偏差よりも多いP501Sを有するサンプルは陽性と考えた。血液サンプルにつ
いてのリアルタイムのPCRをTaqman（商標）手順を用いるが、ただし、前進及び
逆向プライマー並びにP501Sに特異的なプローブを用いて50サイクルまで拡大し
て実施した。試験した８サンプル中、６つのサンプルはP501S及びβ−アクチン
シグナルに陽性であった。残りの２つのサンプルにはβ−アクチンまたはP501S
は検出されなかった。４つの試験した正常なサンプル中にはP501Sシグナルは認
められなかった。

【０７００】実施例22 ．SCIDマウス継代前立腺腫瘍における前立腺特異的抗原P703P及びP501S の発現前立腺がんの治療における抗原の有効性を考える時、アンドロゲン切除療法中
の腫瘍における抗原の継続した存在が重要である。テストステロンの存在下でSC
IDマウスにおいて増殖した前立腺腫瘍サンプル中の前立腺特異的抗原P703P及びP
501Sの存在を次のように評価した。

【０７０１】骨まで転移した２つの前立腺腫瘍を患者から除去し、SCIDマウスに移植し、テ
ストストロンの存在下に増殖させた。腫瘍をSYBRグリーンアッセイ法を用いる定
量リアルタイムPCRを用いて、P703P、P501S及びPSAのmRNA発現について評価した
。前立腺腫瘍中のP703P及びP501Sの発現を陽性の対照として、正常な腸及び正常
な心臓におけるその不存在を負の対照として用いた。両方の場合において、特異
的mRNAは遅い継代腫瘍において存在した。骨の転移はテストストロンの存在にお
いて増殖したので、これは、これらの遺伝子の存在はアンドロゲン切除療法中に
なくならなかっただろうということを暗示する。

【０７０２】実施例23 ．抗−P503Sモノクローナル抗体はインビボにおける腫瘍の増殖を阻害
する抗−P503Sモノクローナル抗体20D4のネズミにおける腫瘍形成を抑制する能力
を次のように調べた。 10匹のマウスにP503Sを発現したHEK293細胞を皮下注射した。５匹のマウスは
０日、５日及び９日（腫瘍細胞の注射時）に150μgの20D4を静脈注射で受け取っ
た。腫瘍のサイズを50日間測定した。20D4を受け取らなかった５匹のマウスの内
、３匹は約２週間後に検出可能な腫瘍を形成し、それは研究の間中大きくなり続
けた。それに対して、20D4を受け取った５匹のマウスのいずれもが腫瘍を形成し
なかった。これらの結果は、抗−P503S Mab 20D4がインビボにおける強力な抗−
腫瘍活性を発揮することを示す。

【０７０３】実施例24 ．P501S特異的Ｔ細胞クローンからのＴ細胞受容体クローンの特徴付けＴ細胞は限定された寿命を有する。しかしながら、Ｔ細胞受容体（TCR）鎖の
クローン化及びそれに続く転移はＴ細胞特異性の無限の伝播を本質的に可能にす
る。腫瘍抗原TCR鎖のクローン化は、TCR MHC制限アレレを共有する患者から単離
されたＴ細胞にその特異性の転移を可能にする。次いで、このようなＴ細胞を発
達させ、抗原を発現する腫瘍を担う患者に腫瘍抗体特異性を導入するために選択
の転移環境で用いることができるだろう。前立腺特異的抗原P501Sに特異的なCD8
Ｔ細胞クローンからのＴ細胞受容体アルファ及びベータ鎖を以下のように単離
し、配列決定した。

【０７０４】 CTLクローン4E5（前記実施例12に記載された）からの２×10⁶細胞からの全mRN
AをTrizol試薬を用いて単離し、cDNAを合成した。このクローン中のVa及びVb配
列を決定するために、一連のVa及びVbサブタイプ特異的プライマーを合成し、各
クローンから生じたcDNAとのRT-PCR反応に用いた。RT-PCR反応は、各クローンが
Vb7サブファミリーに対応する共通のVb配列を発現したことを示した。さらに、
そのクローンから生じたcDNAを用いて、発現したVa配列はVa6であると決定され
た。クローン4E5から全長TCRアルファ及びベータ鎖をクローン化するために、開
始及び停止コードTCRヌクレオチドにわたるプライマーを設計した。

【０７０５】プライマーは次のとおりであった：TCR Vアルファー６５′（センス）：GGA
TCC---GCCGCCACC−ATGTCACTTTCTAGCCTGCT（配列番号756）BamHI部位Kozak TCRア
ルファ配列TCRアルファ３′（アンチセンス）：GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCA
G（配列番号757）SalI部位TCRアルファ不変配列TCR Vベーター７５′（センス
）：GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCTGCAGGCTGCTCT（配列番号758）BamHI部位Kozak
TCRアルファ配列TCRベータ３′（アンチセンス）：GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTC
TTGAC（配列番号759）SalI部位TCRベータ不変配列。CTLクローン及び上記プライ
マーから合成したcDNAを用いて、校正熱安定性ポリメラーゼPWO（Roche、ニュー
ジャージー州ナットレイ）を用いて標準的な35サイクルのRT-PCR反応を確立した
。

【０７０６】得られた特異的なバンド（アルファについては約850塩基対、ベータについて
は約950塩基対）をPCRブラントベクター（Invitrogen）に連結し、大腸菌に形質
転換した。全長のアルファ及びベータ鎖を含有するプラスミドを形質転換された
大腸菌を同定し、対応するプラスミドの大規模調製を引き起こした。全長のTCR
アルファ及びベータ鎖を含有するプラスミドを配列決定のために提出した。配列
決定反応Vb及びVa鎖について決定されたcDNA配列を有する全長のTCRアルファ及
びベータ鎖のクローン化がそれぞれ配列番号760及び761で示されることを証明し
た。対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号762及び763に示す。Va配列はVa6.
2と99％同一（348/348）であり、VbはVb7（336/338）と99％同一であることがヌ
クレオチド配列アラインメントで分かった。

【０７０７】上記したことから、本発明の特定の態様を明細書中に説明のために記載したけ
れども、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の改変をなし得ること
が分かるであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によって以外は
制限されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、対照の線維芽細胞に比較して、代表的な前立腺−特異的ポリペプチド
P502Sを発現する線維芽細胞を殺害するT細胞の能力を示す。％溶解性は、示され
るように、一連のエフェクター：標的物の比として示される。

【図２Ａ】図２Aは、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドp502Sを発現する細胞を認識す
るT細胞の能力を示す。個々の場合、γ−インターフェロンスポットの数が、異
なった数の応答体のために示される。図２Aにおいては、データは、対照E75ペプ
チドによりパルスされた線維芽細胞に比較して、P2S−12ペプチドによりパルス
された線維芽細胞について示される。

【図２Ｂ】図２Bは、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドp502Sを発現する細胞を認識す
るT細胞の能力を示す。個々の場合、γ−インターフェロンスポットの数が、異
なった数の応答体のために示される。図２Bにおけては、データは、HER−２/neu
を発現する線維芽細胞に比較して、P502Sを発現する線維芽細胞について示され
る。

【図３】図３は、P501Sに由来するP1S＃10ペプチドがHLA−A2を結合することを示すペ
プチド競争結合アッセイを示す。ペプチドP1S＃10は、TNF開始バイオアッセイに
おいてD150M58をCTLクローン化するためにFlu M58ペプチドHLA−A2制限された
提供を阻害する。D150M58 CTLは、HLA−A2結合インフルエンザマトリックスペプ
チドFlu M58に対して特異的である。

【図４】図４は、EGFP−トランスダクトされたJurkat A2Kbに比較して、P1S＃10−パル
スされたJurkat A2kb標的物及びP501S−トランスダクトされたJurkat A2kb標的
物を特異的に溶解する、P1S＃10免疫化されたマウスから生成されたT細胞の能力
を示す。％溶解率は、示されるように一連のエフェクター：標的物の比として示
される。

【図５】図５は、代表的な前立腺−特異的ポリペプチドP501Sを発現するJurkat A2kb細
胞を認識し、そして特異的に溶解するT細胞クローンの能力を示して、それによ
り、P1S＃10ペプチドがp501Sポリペプチドの天然においてプロセッシングされた
エピトープであり得ることを示す。

【図６Ａ】図６Aは、代表的な前立腺−特異的抗原（P501S）に対するCD8⁺細胞系（３A−
１）の特異性を示すグラフである。図６Aは、⁵¹Cr開放アッセイの結果を示す。
％特異的溶解率は、示されるように一連のエフェクター：標的物の比として示さ
れる。

【図６Ｂ】図６Bは、代表的な前立腺−特異的抗原（P501S）に対するCD8⁺細胞系（３A−
１）の特異性を示すグラフである。図６Bは、示されるような種々のエフェクタ
ー：標的物の比で、P501Sによりトランスダクトされた自己由来のB−LCLにより
刺激された３A−１細胞によるインターフェロン−γの生成を示す。

【図７】図７は、バキュロウィルスにおけるP501Sの発現を示すウェスターンブロット
である。

【図８】図８は、P501Sに対するエピトープマッピング研究の結果を示す。

【図９】図９は、トランスメンブランドメイン、及び予測される細胞内及び細胞外ドメ
インの位置を示すP501Sタンパク質の図示である。

【図１０】図10は、染色体22q11.2のCat Eye Syndrome領域内の前立腺遺伝子P775P、P704
P，B305D, P712P及びP774Pの位置を示すゲノム地図である。

【図１１】図11は、P501Sに対して生ぜしめられたウサギポリクローナル抗血清の特異性
を決定するためのELISAアッセイの結果を示す。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年８月５日（２００２．８．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０３３５】一般に、APCsに本発明のポリヌクレオチド（またはその部分または変異体）を
トランスフェクトさせることにより、コード化ポリペプチド、またはその免疫原
性部分を細胞表面に発現させることができる。このようなトランスフェクション
処理を生体外で行い、このトランスフェクトされた細胞を含有する薬剤を、本願
明細書中に述べるよう治療目的に使用することができる。あるいは、樹状または
その他の抗原提示細胞をターゲットとする遺伝子運搬手段を患者に投与すること
によって、トランスフェクションが生体内で起こるようにすることもできる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０６５９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０６５９】ウエスタンブロット分析を、抗P503Sモノクローナル抗体の特異性を特徴づけ
るために使用した。バクテリア中で発現され、かつバクテリアから精製された組
換え型（rec）P503S、及び完全長P503Sを形質移入されたHEK293細胞からの可溶
化液（ライセート）について、SDS-PAGEを行った。タンパク質をニトロセルロー
スに移し、そして次に、抗体濃度１μg/mlにおいて、各々の抗P503Sモノクロー
ナル抗体（20D4、JA1、1D12、6D12、9C12）でウエスタンブロットを行った。ヤ
ギ抗マウスモノクローナル抗体、又はプロテイン・Ａ−セファロース（protein
A-sepharose）の何れかに複合化（conjugated）された、ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase (HRP) ）を使用して、タンパク質
を検出した。モノクローナル抗体20D4は、妥当な分子量14kDaの組換え型P503S（
アミノ酸113〜241）、及び完全長P503Sを形質移入されたHEK293細胞可溶化液中
の23.5kDaの化学種を検出した。他の抗P503Sモノクローナル抗体は、ウエスタン
ブロットによって、類似の特異性を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 37/04 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 37/04 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 ＡＧ０１Ｎ 33/574 ＢＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミッチャム，ジェニファーエル．アメリカ合衆国，ワシントン 98052，レッドモンド，ノースイーストエイティーエイスストリート 16677 (72)発明者ハーロッカー，スーザンエル．アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シアトル，サーティーンスアベニュウエスト 7522 (72)発明者ジアン，ユキウアメリカ合衆国，ワシントン 98032，ケント，サウストゥーハンドレッズサーティーセカンドストリート 5001 (72)発明者リード，スティーブンジー．アメリカ合衆国，ワシントン 98005，ベルビュー，ワンハンドレッドトゥエンティーセカンドプレイスノースイースト 2843 (72)発明者カロス，マイケルディー．アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シアトル，デイトンアベニュノース 8116 (72)発明者ファンガー，ゲイリーリチャードアメリカ合衆国，ワシントン 98012，ミルクリーク，トゥエンティーナインスドライブサウスイースト 15906 (72)発明者デイ，クレイグエイチ．アメリカ合衆国，ワシントン 98133，シアトル，ストーンアベニュノース 11501，シー122 (72)発明者レター，マークダブリュ．アメリカ合衆国，ワシントン 98104，カーネーション，ノースイーストフォーティーサードプレイス 33402 (72)発明者ストーク，ジョンエー．アメリカ合衆国，ワシントン 98011，ボセル，ノースイーストワンハンドレッドフォーティーフォースプレイス 7436 (72)発明者スケイキー，ヤサーエー．ダブリュ．アメリカ合衆国，ワシントン 98006，ベルビュー，サウスイーストフォーティーセブンスプレイス 15106 (72)発明者ワン，アイジュンアメリカ合衆国，ワシントン 98029，イサクアー，トゥーハンドレッズサーティーンスプレイスサウスイースト 3106 (72)発明者ミーガー，マデレインジョイアメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，ノースイーストセブンティーファースト 507，＃１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA36 BA45 CA04 CA07 CA09 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA03 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR74 QR80 QR82 QS05 QS25 QS33 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA89X AA89Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 CA18 NA14 ZB09 ZB26 4C085 AA03 AA13 AA14 BB01 BB11 CC21 CC23 EE01 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB09 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305,
307-315, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 5
26, 530, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 6
30, 631, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735,
737-739, 751, 753, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供される配列; （ｂ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供される配列の補体; （ｃ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び786-788で提供される配列の少なくとも20の連続した
残基から成る配列; （ｄ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788 で提供される配列に対して、中位の緊縮条
件下でハイブリダイズする配列; （ｅ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788の配列に対して少なくとも75％の同一性を
有する配列; （ｆ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788の配列に対して少なくとも90％の同一性を
有する配列; 及び（ｇ）配列番号: 1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-315, 326, 3
28, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 530, 531, 53
3, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 631, 634, 63
6, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-739, 751, 75
3, 764, 765, 773-776 及び 786-788で提供される配列の変性変異体から成る群
から選択された配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】（ａ）配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-380, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527
, 532, 534, 537-551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633,
635, 637, 638, 656-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-
734, 736, 740-750, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791で示され
る配列；（ｂ）配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-3
80, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-
551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 6
56-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-75
0, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791の配列に対して少なくとも7
5％の同一性を有する配列; の配列に対して少なくとも75％の同一性を有する配
列; （ｃ）配列番号: 112-114, 172, 176, 178, 327, 329, 331, 336, 339, 376-3
80, 383, 477-483, 496, 504, 505, 519, 520, 522, 525, 527, 532, 534, 537-
551, 553-568, 573-586, 588-590, 592, 627-629, 632, 633, 635, 637, 638, 6
56-671, 675, 683, 684, 710, 712, 714, 715, 717-719, 723-734, 736, 740-75
0, 752, 754, 755, 766-772, 777-785 及び 789-791の配列に対して少なくとも7
5％の同一性を有する配列; の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配
列; （ｄ）請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列；（ｅ）請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列に対して少な
くとも70％の同一性を有する配列；及び（ｆ）請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列に対して少な
くとも90％の同一性を有する配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含ん
で成る単離されたポリペプチド。
【請求項３】発現制御配列に操作可能的に連結される請求項１記載のポリ
ヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項４】請求項３記載の発現ベクターにより形質転換されるか又はト
ランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５】請求項２記載のポリペプチドに対して特異的に結合する単離
された抗体、又はその抗原−結合フラグメント。
【請求項６】患者における癌の存在を検出するための方法であって、（ａ）前記患者から生物学的サンプルを獲得し：（ｂ）前記生物学的サンプルと、請求項２記載のポリペプチドに結合する結合
剤とを接触せしめ；（ｃ）前記結合剤に結合するポリペプチドの量を、前記サンプルにおいて検出
し；そして（ｄ）前記ポリペプチドの量を、前もって決定されたカット−オフ値に比較し
、そしてそれから、患者における癌の存在を決定する段階を含んで成る方法。
【請求項７】請求項２記載の少なくとも１つのポリペプチドを含んで成る
融合タンパク質。
【請求項８】前記融合タンパク質が、（ａ）配列番号682, 692, 695, 699, 703及び709で提供される配列；及び（ｂ）配列番号679, 691, 696, 700, 704及び708によりコードされる配列から
成る群から選択された配列を含んで成る請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】配列番号：1-111, 115-171, 173-175, 177, 179-305, 307-3
15, 326, 328, 330, 332-335, 340-375, 381, 382 及び 384-476, 524, 526, 53
0, 531, 533, 535, 536, 552, 569-572, 587, 591, 593-606, 618-626, 630, 63
1, 634, 636, 639-655, 674, 680, 681, 711, 713, 716, 720-722, 735, 737-73
9, 751, 753, 764, 765, 773-776 又は 786-788で表される配列に対して、中位
の緊縮条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】腫瘍タンパク質に対して特異的なT細胞を刺激し、そして/
又は拡張するための方法であって、（ａ）請求項２記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１記載のポリヌクレオチド；及び（ｃ）請求項１記載のポリペプチドを発現する抗原−提供細胞から成る群から
選択された少なくとも１つの成分とT細胞とを、T細胞の刺激及び/又は拡張を可
能にするのに十分な条件下で及び十分な時間、接触せしめることを含んで成る方
法。
【請求項１１】請求項10記載の方法に従って調製されたT細胞を含んで成
る単離されたT細胞集団。
【請求項１２】生理学的に許容できるキャリヤー及び免疫刺激剤から成る
群から選択された第１成分、及び（ａ）請求項２記載のポリペプチド；（ｂ）請求項１記載のポリヌクレオチド；（ｃ）請求項５記載の抗体；（ｄ）請求項７記載の融合タンパク質；（ｅ）請求項11記載のT細胞集団；及び（ｆ）請求項２記載のポリペプチドを発現する抗原提供細胞から成る群から選
択された第２成分を含んで成る組成物。
【請求項１３】患者における免疫応答を刺激するための方法であって、請
求項12記載の組成物を、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項１４】患者における癌の処理方法であって、請求項12記載の組成
物を、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項１５】患者における癌の存在を決定するための方法であって、（ａ）前記患者から生物学的サンプルを獲得し；（ｂ）前記生物学的サンプルと、請求項９記載のオリゴヌクレオチドとを接触
せしめ；（ｃ）前記オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチド
の量を、前記サンプルにおいて検出し；そして（ｄ）前記オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチド
の量を、前もって決定されたカットオフ値に比較し、そしてそれから、前記患者
における癌の存在を決定する段階を含んで成る方法。
【請求項１６】請求項９記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含
んで成る診断用キット。
【請求項１７】請求項５記載の少なくとも１つの抗体、及び受容体グルー
プを含んで成る検出試薬を含んで成る診断用キット。
【請求項１８】患者における癌の進行を阻害するための方法であって、（ａ）（i）請求項２記載のポリペプチド；（ii）請求項１記載のポリヌクレ
オチド；及び（iii）請求項２記載のポリペプチドを発現する抗原提供細胞から
成る群から選択された少なくとも１つの成分と共に、患者から単離されたCD4⁺及
び/又はCD8⁺ T細胞を、T細胞が増殖するようインキュベートし；そして（ｂ）有効量の前記増殖されたT細胞を、前記患者に投与し、それにより、患
者における癌の進行を阻害する段階を含んで成る方法。