JP4969444B2 - 抗体の作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は抗体および抗体産生細胞の作製方法に関する。
蛋白質発現の多寡と細胞の機能あるいは細胞の状態との関連性を解明することはポストゲノムにおける最大の課題の１つであるが、遺伝子レベルの発現解析だけでその機能を関連づけることは非常に困難である。そこで蛋白質、あるいはペプチド鎖の検出、同定が必須となる。蛋白質の分析は、アミノ酸配列および組成解析、2次、3次構造の解析、分子量同定など様々な手法が開発されてきている。しかし、蛋白質の同定には抗体を用いる方法が現在も標準的な手法となっている（Michael Steward, Chapter 27. Immunological Techniques, pp. 417-434, in Immunology, 6th edition (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Editors), 2001, C.V. Mosby）。もちろん抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降法、免疫アフィニティーカラム法など多岐に渡る蛋白質の検出、同定だけでなく、癌細胞のミサイル療法、ベクターのターゲッティング、細胞の機能阻害など実用的にも広く用いられている。
抗体はその結合の特異性、結合性能の高さが鍵になり、モノクローナル抗体の作製法の発明によりその利用価値が一段と増したと思われる。しかしながら蛋白質によってはその形状、性質から標的としたエピトープに対する充分なアフィニティーを持つ抗体を作製することは非常に困難な場合が多くある。抗体作製のためには精製蛋白質、合成ペプチド、分離した蛋白質発現細胞、単離組織などを用い動物を免疫する場合が多いが、特定の遺伝子情報に基づく蛋白質・ペプチド鎖に対する抗体を作製する場合、当該遺伝子を載せた発現プラスミドを直接動物組織に接種する方法や、培養細胞で発現させた後、粗精製分画によって免疫する方法がある。しかし、発現量が充分でなく目的の抗体が得にくい場合も多い。
Michael Steward, Chapter 27. Immunological Techniques, pp. 417-434, in Immunology, 6th edition (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Editors), 2001, C.V. Mosby
Michael Steward, Chapter 27. Immunological Techniques, pp. 417-434, in Immunology, 6th edition (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Editors), 2001, C.V. Mosby
本発明は抗体および抗体産生細胞の作製方法を提供する。また本発明は、抗体製造用抗原組成物の製造方法を提供する。
マイナス鎖RNAウイルスは、マイナス鎖RNAをゲノムに持つウイルスであり、細胞に感染したときにゲノムRNAが細胞内で増幅し搭載遺伝子を高いレベルで発現させる（Yonemitsu Y. et al., Nat Biotechnol, 2000, 18(9):970-3）。本発明者は、マイナス鎖RNAウイルスのこの利点を生かして、抗体製造にマイナス鎖RNAウイルスを利用することを考えた。また、マイナス鎖RNAウイルスは感染後、複数のサイトカインを分泌させることにより宿主の免疫活動を高めることが報告されており（Strahle et al. J. Virol. 77(14): 7903-7913 (2003), Tsutsumi et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 20(10): 997-1001 (2001)）、この点でも抗体作製に有利に働くと予想した。そこで本発明者らは、抗原としたいポリペプチドを発現する組み換えマイナス鎖RNAウイルスを作製し、これを動物に免疫して抗体の作製を行った。
マイナス鎖RNAウイルスを直接、または該ウイルスを感染させた細胞ライセート（溶解物）を、点鼻、筋注、脾臓直接注、腰部皮下、足蹠注などの複数の投与経路により接種し、抗体産生を確認したところ、いずれの投与経路においても血中に抗体が検出された。抗体価の上昇は、特に点鼻投与で顕著であった。また、腹腔内投与によるブーストを行うことにより、抗体産生レベルをさらに上昇させることに成功した。さらに、免疫を行ったマウス脾臓細胞からハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体の作製にも成功した。マイナス鎖RNAウイルスベクターによる免疫活性化作用と抗原ポリペプチドの高発現により、効率的に抗体産生が誘導されたと考えられる。
従来抗原ポリペプチドを用いて動物を免疫する際には、皮下、皮内、腹腔内、足蹠などの投与部位が用いられ、また抗原ポリペプチド発現プラスミドを用いる際には筋注が用いられてきた。マイナス鎖RNAウイルスベクター、中でもセンダイウイルスベクターは、免疫のための投与法として、上記の部位に加えて点鼻投与を新たに提供する。また、従来の抗原ポリペプチド発現プラスミドを筋注する方法では確実に免疫を誘導することが困難であり、誘導される免疫も多くの場合充分な強さに達しないことが知られている。センダイウイルスベクターは多くの細胞に効率良く感染し外来遺伝子を高発現するので確実にかつ簡便に抗体産生を誘導することが可能であると考えられる。さらに、感染細胞から感染性粒子を産生しないなどBiosafetyの面で安全性を高めた改良型ベクターが使用可能であることもセンダイウイルスベクターを用いた抗体産生法の利点である（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。
このように、抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖RNAウイルスベクターを接種することにより、該ポリペプチドに対する抗体を効率的に産生させることができることが証明された。ベクターの接種箇所は限定されず、ブーストも有効であった。免疫は、マイナス鎖RNAウイルスベクターを直接接種する他、該ベクターを感染させた培養細胞などを用いても可能であり、作製した細胞は、免疫に用いる以外にも、目的の抗原ポリペプチドを精製し、ELISAやウエスタンブロットによる抗体の検出、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングなどに用いることも可能である。本発明の方法により得られた抗体は、生体分子の検出や分離、抗体治療など幅広い分野への適用が期待される。すなわち本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを用いた抗体および抗体産生細胞の作製方法等に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発明に既に意図されている。具体的には、本発明は、
〔１〕抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
（ａ）抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種する工程、
（ｂ）該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法、
〔２〕工程（ａ）の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足蹠皮内投与、脾臓投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、〔１〕に記載の方法、
〔３〕該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに含む、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程をさらに含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する工程をさらに含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕ハイブリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程をさらに含む、〔６〕に記載の方法、
〔８〕ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、〔６〕または〔７〕に記載の方法、
〔９〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが複製欠損型である、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルスである、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の方法、
〔１１〕パラミクソウイルスが少なくともF遺伝子を欠損する、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を選択する工程、をさらに含む、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、をさらに含む、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１５〕Ｔｈ２サイトカインまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするベクターを投与する工程をさらに含む、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕該サイトカインまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにコードされている、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕Ｔｈ２サイトカインがIL-4、IL-10、およびIL-13からなる群から選択される、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、を含むものである。
〔１〕抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、
（ａ）抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を、非ヒト動物に接種する工程、
（ｂ）該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法、
〔２〕工程（ａ）の接種が、筋注、皮下投与、点鼻投与、手掌または足蹠皮内投与、脾臓投与、および腹腔内投与からなる群より選択される投与経路により行われる、〔１〕に記載の方法、
〔３〕該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに含む、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕回収した抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を選択する工程をさらに含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する工程をさらに含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕ハイブリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程をさらに含む、〔６〕に記載の方法、
〔８〕ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、〔６〕または〔７〕に記載の方法、
〔９〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが複製欠損型である、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルスである、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の方法、
〔１１〕パラミクソウイルスが少なくともF遺伝子を欠損する、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕回収した抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を選択する工程、をさらに含む、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、をさらに含む、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１５〕Ｔｈ２サイトカインまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするベクターを投与する工程をさらに含む、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕該サイトカインまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにコードされている、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕Ｔｈ２サイトカインがIL-4、IL-10、およびIL-13からなる群から選択される、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、を含むものである。
本発明の方法は、所望の抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖RNAウイルスを用いて効率的に抗体を作製することが可能であり、抗原ペプチドを精製することは必須ではない。本発明により製造された抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降法、免疫アフィニティーカラム法など多岐に渡る蛋白質の検出、同定だけでなく、癌細胞のミサイル療法、ベクターのターゲッティング、細胞の機能阻害など臨床においても用いることができる。
本発明は、抗体または抗体産生細胞の製造方法であって、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸（nucleic acids）、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を動物に接種する工程、および該動物から抗体または抗体産生細胞を回収する工程、を含む方法に関する。マイナス鎖RNAウイルスとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をセンスにコードする鎖と相補的なアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスのことである。マイナス鎖RNAウイルスはネガティブ鎖RNAウイルスとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型 (non-segmented) マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が好ましい。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。欠損型ベクターとしては、例えばエンベロープを構成する蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損するベクターが挙げられる。具体的には、ウイルスの種類によっても異なるが、F、H、HN、G、M、M1などのエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損するベクターが例示できる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。
本発明において特に好適に用いられるマイナス鎖RNAウイルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(mumps virus)、麻疹ウイルス(measles virus)、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(rabies virus)等が例示できる。本発明においてパラミクソウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
例えばパラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、NP遺伝子は"N"とも表記される。また、HNはノイラミニダーゼ活性を有さない場合にはH (ヘマグルチニン) と表記される。
レスピロウイルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
レスピロウイルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
マイナス鎖RNAウイルスベクターは、ゲノムRNA中に抗原としたい所望の外来ポリペプチドをコードすることができる。外来ポリペプチドとしては、天然のマイナス鎖RNAウイルスが持たないポリペプチドであれば特に制限はなく、天然の蛋白質全長、その部分断片（7アミノ酸以上、好ましくは8、10、または15アミノ酸以上）、またはそれらと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド等であってよい。外来ポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターは、マイナス鎖RNAウイルスベクターのゲノムに該ポリペプチドをアンチセンスにコードする遺伝子を挿入することによって得られる。遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムRNAの3'リーダー領域と3'端に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、および/または5'端に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、M、FまたはHN遺伝子などのエンベロープ構成蛋白質遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入してもよい。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Kolakofski, D. et al., J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Roux, L. J. Virol. 1993: 67; 4822-4830）。挿入した外来遺伝子とウイルスORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。E-I-S配列を介して2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することもできる。
外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖（ネガティブ鎖）の3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の3'の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。一般に、抗原ポリペプチドを高発現させることが有利と考えられるため、外来ポリペプチドをコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3'リーダー領域と3'に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間に挿入される。あるいは、3'に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と2番目のウイルス蛋白質遺伝子のORFの間、または3'から２番目と３番目のウイルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの3'に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はN遺伝子であり、2番目の遺伝子はP遺伝子、3番目の遺伝子はM遺伝子である。逆に、抗原ポリペプチドの高発現が望ましくない場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するS配列としては、例えばマイナス鎖RNAウイルスの所望のS配列を用いることができるが、センダイウイルスであれば、3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはC; V= A, C, またはG）（配列番号：１）のコンセンサス配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：２）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：３）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：４）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：５）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：６）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：７）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（配列番号：８）（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3' (配列番号：９)）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
組み換えRNAウイルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的には、（ａ）哺乳動物細胞において、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質の存在下、所望の外来性抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA。プラス鎖）をコードするDNAを転写させる工程、（ｂ）生成したマイナス鎖RNAウイルスまたは該ゲノムRNAを含むRNPを回収する工程、により製造することができる。上記のRNPを構成するウイルス蛋白質(viral proteins)とは、ウイルスゲノムRNAと共にRNPを形成し、ヌクレオカプシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群であり、典型的には、N（ヌクレオキャプシド (またはヌクレオプロテイン (NP) とも言う)）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）蛋白質である。ウイルス種によっては、表記は異なることもあるが、対応する蛋白質群は当業者には知られている (Anjeanette Robert et al., Virology 247:1-6 (1998))。例えば、NはNPと表記されることもある。
ウイルス再構成に際しては、上記にように、マイナス鎖RNAゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させても、プラス鎖RNA（アンチゲノム。ゲノムRNAの相補鎖）を生成させてもよいが、ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。ウイルスゲノムRNAとしては、RNPの再構成に必要なウイルス蛋白質をコードしていれば、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子は欠失していてもよい。具体的には、例えば、N、P、およびL蛋白質をコードしていれば、F、HN、Mなどのウイルス蛋白質はコードしていなくてもよい。このような欠損型ウイルスは、細胞内でゲノムRNAを増幅できるが、感染性ウイルス粒子を放出しないため、安全性の高い遺伝子導入ベクターとして有用である（WO00/70055、WO00/70070、および WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ウイルスベクターを製造する場合は、これらのエンベロープ構成蛋白質を、ウイルス産生細胞内で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該蛋白質またはゲノムをコードするDNAが連結されたベクターを、宿主細胞に導入する。プロモーターとしては、例えばCMVプロモーターやCAGプロモーターなどが用いられる（Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平3-168087）。
RNA末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3'リーダー配列と5'トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。このためには、例えば転写産物の5'端に自己切断型のリボザイムを付加しておき、リボザイムによりマイナス鎖RNAウイルスゲノムの末端を正確に切り出させる（Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236）。あるいは、転写産物の5'端を正確に制御するために、転写開始部位にバクテリオファージのRNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させて転写を誘導する。バクテリオファージのRNAポリメラーゼとしては、例えば大腸菌T3ファージおよびT7ファージ、およびサルモネラSP6ファージ等が用いられる (Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987, Methods Enzymol. 155: 397-15; Milligan, J.F. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V., 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23)。バクテリオファージのRNAポリメラーゼは、例えばこれを発現するワクシニアウイルス (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) を用いて供給することができるし、あるいはプラスミドなどの発現ベクターから供給することもできる。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3'端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3'端が切り出されるようにする（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 1997: 78; 2813-2820、Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578-587 及び Yu, D. et al., Genes Cells. 1997: 2; 457-466）。リボザイムとしては、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リボザイムが使用できる。
エンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠失させたウイルスの再構成においては、欠失させたエンベロープ構成蛋白質でウイルスの感染性を相補してもよいが、例えば、欠失させた蛋白質とは別のエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化することもできる。このようなエンベロープ蛋白質としては、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）（J. Virology 39: 519-528 (1981)）を用いることができる（Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6:1069-1081）。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF、HN、H、Gなどのスパイク蛋白質遺伝子、Mなどのエンベロープ裏打ち蛋白質遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。スパイク蛋白質遺伝子の欠失は、マイナス鎖RNAウイルスベクターを非伝播性にするために有効であり、また、M蛋白質などのエンベロープの裏打ち蛋白質遺伝子の欠失は、感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。例えば、F遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルスベクター（Li, H.-O. et al., J.Virol. 74, 6564-6569 (2000)）、M遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルスベクター（Inoue, M. et al., J.Virol. 77, 6419-6429 (2003)）などは好適に用いられる。例えばF遺伝子を欠損するベクターを用いることにより、宿主マウスでの病原性が抑えられ、良好な抗体産生を実現させることが可能であった（実施例参照）。また、F、HN (またはH)、およびMの少なくとも２つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するベクターは、より安全性が保障される。例えば、MおよびF遺伝子両欠失型ベクターは、高レベルの感染性および遺伝子発現能を保ったまま、非伝播性でかつ粒子形成を欠くベクターとなる。
F遺伝子欠失型の組み換えウイルスの製造を具体的に例示すれば、例えばF遺伝子が欠損したマイナス鎖RNAウイルスゲノムまたはその相補鎖を発現するプラスミドを、F蛋白質を発現する発現ベクター、ならびにN、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションする。または、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いれば、より効率的にウイルスを製造することができる（WO00/70070）。この場合は、F遺伝子を誘導発現できるように、Cre/loxPやFLP/FRTなどの配列特異的組み換え酵素とその標的配列を用いて、発現を誘導できるようにしておくことが好ましい（WO00/70055 および WO00/70070；Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820参照）。具体的には、例えばCre/loxP誘導型発現プラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121）等の組み換え酵素標的配列を持つベクターにエンベロープ蛋白質遺伝子を組み込む。発現の誘導は、例えばアデノウイルスAxCANCreをmoi=3〜5 で感染させて行う（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)）。
本発明において用いるマイナス鎖RNAウイルスは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばセンダイウイルス（SeV）のアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減弱する（Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179）。
またマイナス鎖RNAウイルスは、感染の持続性を高めるために、P遺伝子またはL遺伝子に変異を有するものを使用してもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。
マイナス鎖RNAウイルスは、抗原に加え、Th2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインをさらにコードすることができる（実施例１１）。本発明においてTh2サイトカインとは、1型のヘルパーT細胞（Th1 cells）よりも2型のヘルパーT細胞（Th2 cells）において優位に産生されるサイトカインを言い、具体的にはIL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13 およびTGF-βが含まれる。また、抗炎症サイトカイン（抗炎症性サイトカインとも言う）とは、炎症を抑制する方向に作用するポリペプチドを総称し、炎症を抑制するシグナル伝達を促進するシグナル伝達分子および/または炎症を促進するシグナル伝達を阻害するシグナル伝達分子（例えば炎症性サイトカインインヒビター）が含まれる。本発明において抗炎症サイトカインには、具体的には、interleukin (IL)-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β、soluble TNF-α receptor，およびIL-1 receptor antagonist (IL-1ra) が含まれる。ベクターにコードされるTh2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインは、天然のポリペプチドの全長でもよく、活性が維持される限りその部分ペプチド（活性断片など）でもよい。例えば、N末端および/またはC末端のアミノ酸残基の欠失（例えば1〜30アミノ酸、より特定すれば、1、2、3、4、5、10、15、20、または25アミノ酸）はサイトカインの活性に影響を与えない可能性が高い。また、炎症性サイトカイン受容体の可溶型断片（リガンド結合ドメインを含む）や、炎症性サイトカイン受容体のリガンド結合ドメインに結合する抗体または抗体断片などであって、炎症性サイトカインのシグナル伝達を阻害するポリペプチドでもよい。またTh2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインは、シグナル配列が除去された成熟ポリペプチドを含む所望の断片を利用することができ、細胞外に分泌させるためのN末端のシグナル配列は、適宜所望の蛋白質のシグナル配列を利用することができる。分泌シグナル配列としては、例えば interleukin (IL)-2やtissue plasminogen activator (tPA) などの所望の分泌蛋白質のシグナル配列を用いることができるが、これらに限定されない。また、他のペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよい。
本発明においてTh2サイトカインは、より好ましくはIL-4、IL-10、IL-13、およびTGF-beta からなる群より選択されるサイトカインであり、最も好ましくはIL-10である。各サイトカイン遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は知られている（IL-4：NM_000589, NP_000580, AAH66277, AAH67515, NP_758858, NP_067258, NP_958427； IL-10：NM_000572, NP_000563, CAG46825, NP_034678, NP_036986；IL-13：NM_002188, NP_002179, AAB01681, NP_032381, NP_446280；TGF-beta（transforming growth factor-beta）：M_60316）。
各Th2サイトカインまたは抗炎症サイトカインの活性は、公知の方法により検出することができる。例えば、マウスmast cell MC/9（ATCC CRL-8306）、ヒト赤白血病（erythroleukemia）細胞株 TF-1 (ATCC CRL-2003) などを用いた増殖アッセイにより活性を検出する方法が知られている（Thompson-Snipes, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173:507-510；Kruse N et al., EMBO J. 1993;12:5121-5129; Oshima Y et al., J Biol Chem 2001;276:15185-91; Oshima, Y., et al., J. Biol. Chem. 275, 14375-14380, 2000; Leland, P. et al.,Oncol. Res. 7, 227-235, 1995）。例えば、遺伝子組み換え技術を用いて作製した各種Th2サイトカインまたは抗炎症サイトカインの欠失変異体をこの方法によりアッセイして、活性断片を同定することができる。50% effective dose (ED50) を算出し、これを基に算出した活性（例えば ED50の逆数）が野生型と比べ50％以上、好ましくは60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上の部分ペプチドを用いるとよい。
ベクターにコードされるTh2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインの由来に特に制限はなく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、イヌ、チンパンジー、サル、ヒト等の哺乳類のいずれをも用いることができるが、投与対象と同種由来のものを用いるのが適当である。これらのサイトカインをコードする核酸の塩基配列は、上記のようにデータベースから入手可能であるが、さらに例を挙げれば、マウスIL-10であれば、Genbank Accession No. AY410237、NM_010548、ヒトIL-10であれば、Genbank Accession No.AY029171、NM_000572 が挙げられる。
また本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、所望の疾患に関与する蛋白質またはその部分ペプチド（例えば9、8、7、6、または5アミノ酸以上の部分ペプチド）を含むポリペプチドをコードしないことができる。そのような疾患には、例えば神経変性疾患が挙げられ、神経変性疾患に関与する蛋白質としては、例えばamyloid βが挙げられる。
より具体的な組み換えウイルスの再構成は、例えば以下の文献を参照することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスを、DNAから再構成させることができる。
ウイルス産生には所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）およびCV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。また、大量にウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。
回収したウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクターの成分として含まれる蛋白質の割合が10% (重量/重量) 以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができるが、これらに制限されない。
マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、またはそのライセートは、薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わされて抗体製造用組成物となる。抗体製造用組成物とは、もっぱら抗体の製造の用途のみに用いる組成物である。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ウイルスベクターまたは細胞を懸濁できる所望の溶液が挙げられ、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。本発明は、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞のライセートと、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造する工程を含む、抗体製造用抗原ベクター組成物の製造方法に関する。また本発明は、抗体製造用組成物の製造における、マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、またはそのライセートの使用にも関する。抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載する組み換えマイナス鎖RNAウイルスベクターの製造については、本明細書の上記の記載を参照すればよい。抗体製造用組成物には、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫活性化剤を添加することができる。またミョウバン、完全Freund'sアジュバント、不完全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、または QS-21 (soapbark tree Quilaja saponaria 由来)、Alum（水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物粒子）などのアジュバントを組み合わせることもできる。
また、上記組成物は、Th2サイトカインまたはTh2サイトカインをコードする核酸をさらに含むことも好ましい。あるいは、それ以外の抗炎症サイトカインまたは抗炎症サイトカインをコードする核酸を単独で、または上記Th2サイトカインまたはTh2サイトカインをコードする核酸と組み合わせて含んでもよい。Th2サイトカインや抗炎症サイトカインは、本明細書に記載したもの、およびそれらの組み合わせを用いることができる。好ましくは、Th2サイトカインは、IL-4、IL-10、およびIL-13 からなる群から選択される。また、上記組成物は、Th2アジュバントを含むことができる。例えば、Th2アジュバントを含む組成物を用いることにより、Th1/Th2バランスのTh2へのシフトをより促進することができる。Th2アジュバントとは、1型のヘルパーT細胞（Th1 cells）よりも2型のヘルパーT細胞（Th2 cells）を優位に活性化するアジュバントを言い、具体的には、aluminum hydroxide (alum)、cholera toxin (B subunit)、Schistosoma mansoni egg抽出蛋白質（例えば Lacto-N-fucopentaose III）などを用いることができる (Grun, J. L. and P. H. Maurer, 1989, Cellular Immunology 121: 134-145; Holmgren J et al., 1993, Vaccine 11:1179-1184; Wilson AD et al., 1993, Vaccine 11:113-118; Lindsay DS et al, 1994, Int Arch Allergy Immunol 105:281-288; Xu-Amano J et al., 1993, J Exp Med 178:1309-1320; Okano M et al., 2001, J Immunol. 167(1):442-50)。
また、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。
製造されたマイナス鎖RNAウイルスまたはそれを含む組成物を動物に投与することにより、抗原ポリペプチドを発現させ、抗体産生を誘導する。ベクターの投与は、in vivo投与でも、細胞を介したex vivo投与でもよい。また、接種するマイナス鎖RNAウイルスベクターは、搭載する抗原ポリペプチド遺伝子をゲノムRNAから発現する能力を有する限り、感染性ウイルス粒子でなくても、非感染性ウイルス粒子やウイルスのコア（ゲノムおよびゲノム結合ウイルス蛋白質を含むRNP複合体）などであってもよい。本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖RNAウイルス由来のゲノムRNAおよび該RNAの複製および搭載遺伝子の発現に必要なウイルス蛋白質を有するリボヌクレオプロテイン（RNP）複合体を含み、感染した細胞において該ゲノムRNAを複製し、搭載遺伝子を発現する複合体を言う。該RNPは、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖(アンチゲノムRNA)と、N、L、P蛋白質とを含む複合体である。すなわち、本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターには、ウイルスの感染粒子、非感染性粒子（ウイルス様粒子；VLPとも言う）、およびマイナス鎖RNAウイルスのヌクレオカプシドなどの、ゲノムRNAおよびゲノムRNAに結合するウイルス蛋白質を含むRNPなどが含まれる。ウイルス粒子からエンベロープを除去したRNP（ウイルスコア）であっても、細胞に導入されれば、細胞内においてウイルスゲノムRNAを複製することができる（WO97/16538; WO00/70055）。RNPまたはVLPは、例えばトランスフェクション試薬などと共に動物に接種するとよい（WO00/70055; WO00/70070）。
細胞を介して接種する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などにマイナス鎖RNAウイルスベクターを導入する。マイナス鎖RNAウイルスを体外（例えば試験管またはシャーレ内）で細胞に感染させる場合は、例えば培養液または生理食塩水など所望の生理的水溶液中でin vitro（またはex vivo）で行う。この時、MOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜1000の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜500、さらに好ましくは3〜300、さらに好ましくは5〜100である。マイナス鎖RNAウイルスと細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば1分以上、好ましくは3分以上、5分以上、10分以上、または20分以上接触させればよく、例えば1〜60分程度、より特定すれば5分〜30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
ウイルスゲノムRNAを含むRNPや非感染性ウイルス粒子（ウイルス様粒子 (VLP)）を細胞に導入するには、周知のトランスフェクション方法を利用することができる。具体的には、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、DEAE-デキストラン (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリポソームベースのトランスフェクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレーション (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 および 9) など、当業者に知られる様々な技術で細胞にトランスフェクトすることが可能である。エンドソームでの分解を抑制するため、トランスフェクションにおいてクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。トランスフェクション試薬を幾つか例示すれば、DOTMA（Roche）、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300)、CalPhosTM Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051-1)、CLONfectinTM (Clontech #8020-1) などが挙げられる。エンベロープウイルスはウイルス粒子形成の際に宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584）。従って、エンベロープが除去されたRNPを用いることには利点がある（WO00/70055）。
また、ウイルスゲノムRNAを発現する発現ベクター、および該ゲノムRNAの複製に必要なウイルス蛋白質（N、PおよびL蛋白質）をコードする発現ベクターを細胞に導入して、細胞内でウイルスRNPを直接形成させることもできる。ウイルスベクターが導入された細胞をこのようにして作製してもよい。
マイナス鎖RNAウイルスベクターが導入された細胞を調製したら、これを12時間〜5日間（好ましくは1〜3日間）程度培養し、抗原ポリペプチドを発現させる。得られた細胞は、そのまま、あるいは溶解してライセート（溶解物）として動物に接種する。ベクター感染細胞のライセートは界面活性剤で細胞膜を溶解する方法、凍結・融解をくり返す方法などで作製することができる。界面活性剤としては非イオン性のTriton X-100、Nonidet P-40などが0.1〜1%の濃度で用いられる。例えばPBSで洗浄したあと遠心によって回収した細胞塊をTNE buffer [25mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40]に再懸濁し氷上で１０から３０分間放置することで得られる。抗原として使用するタンパクが細胞質に可溶性である場合は得られたライセートを遠心（10,000 x g, 10分）して不要な不溶性画分を沈澱として除去した後の上清を免疫に用いることができる。界面活性剤を用いることが望ましくない投与部位に使用するライセートは洗浄後PBSに再懸濁した細胞を５-６回にわたってくり返し凍結・融解して破壊することで得られる。本発明の抗体または抗体産生細胞の製造方法は、動物への接種の前に、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、または該細胞の溶解物を調製する工程、およびその任意の組み合わせをさらに含んでもよい。
また、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するマイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸を、動物に投与することにより、動物内で目的の抗原ポリペプチドを発現するマイナス鎖RNAウイルスベクターを生成させ、抗体産生を誘導してもよい。該マイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸とは、該マイナス鎖RNAウイルスベクターの組み換え体の生成に必要なRNAおよび蛋白質群を発現する核酸のセットである。具体的には、所望の外来ポリペプチドをコードするマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA。プラス鎖）をコードする核酸、およびマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質群をコードする核酸を含む核酸のセットを言う。これらの核酸は、コードするRNAや蛋白質を発現できるように適当なプロモーターを含む。具体例を挙げれば、例えば、CMVプロモーター（Foecking, M.K, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-105）、レトロウイルスLTR（Shinnik, T. M., Lerner, R. A. & Sutcliffe (1981) Nature, 293, 543-548）、EF1プロモーター、CAGプロモーター (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平3-168087) などが用いられる。核酸としては、プラスミドベクターを好適に用いることができる。該マイナス鎖RNAウイルスのゲノムは、ゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質群（典型的には N、L、およびP）をコードする遺伝子を搭載し、かつ親株の野生型ウイルスが持つ全てのエンベロープ構成蛋白質遺伝子を搭載するものが好ましい。該マイナス鎖RNAウイルスのゲノムが、エンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠損する場合においては、感染性ウイルス粒子の形成を相補するエンベロープ蛋白質（例えば該ゲノムで欠損するエンベロープ蛋白質あるいはVSV-Gなどの他のエンベロープ蛋白質）をコードする核酸を、上記の核酸のセットに含めてもよい。これらの核酸を動物に投与することにより、動物内で組み換えマイナス鎖RNAウイルスが生成する。マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質群とは、ウイルスゲノムRNAと共にRNPを形成し、ヌクレオカプシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群であり、典型的には、N、P、およびL蛋白質である。すなわち本発明は、（ａ）(i) 外来ポリペプチドをコードするマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸、および (ii) それぞれ N、P、およびL蛋白質をコードする核酸、を動物に接種する工程、および（ｂ）該動物から、抗体または抗体産生細胞を回収する工程を含む方法にも関する。
( a )に関しては、動物に直接接種せず、あらかじめ該ウイルスベクターを生成する核酸が導入された細胞を調製後、その細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から生成された抗原を接種してもよい。マイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸の詳細については、以下の文献を参照することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。
( a )に関しては、動物に直接接種せず、あらかじめ該ウイルスベクターを生成する核酸が導入された細胞を調製後、その細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から生成された抗原を接種してもよい。マイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸の詳細については、以下の文献を参照することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。
接種ルートに特に制限はないが、例えば筋注（例えば腓腹筋）、皮下投与、点鼻投与、手掌または足蹠皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好適である。点鼻投与とは、感染部位が鼻腔内に留まる場合（鼻腔内投与）から、気道・肺まで至る場合（経鼻肺投与）などを含む。
また、経口投与、経肛門（直腸）投与、経子宮（泌尿器または生殖器官）投与であってもよく、標的器官としては、口腔、腸管、泌尿生殖器または上気道粘膜等を含む。経口投与の場合は、酸性度の強い胃液に晒されても運搬能力を保持するために、徐放性マイクロカプセル化ベクター等に加工することによって、標的器官への感染が可能となる。
接種部位は、一箇所または複数箇所（例えば2〜15箇所）であってよく、また、接種量は、接種対象動物、接種部位、接種回数などに応じて適宜調整してよい。例えば、一箇所当たりの接種量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜 5×1011 CIU (cell infectious unit)、好ましくは1×106 CIU 〜 1×1010 CIU とするとよい。細胞を介して接種（ex vivo投与）する場合は、例えば同種の培養細胞株（例えばサルコーマ細胞株）にマイナス鎖RNAウイルスベクターを感染させ、104〜109細胞、好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。初回免疫だけでも有意な抗体価を誘導できるが、２回以上の接種によりブーストを行えば、抗体価をより上昇させることができる。
また、経口投与、経肛門（直腸）投与、経子宮（泌尿器または生殖器官）投与であってもよく、標的器官としては、口腔、腸管、泌尿生殖器または上気道粘膜等を含む。経口投与の場合は、酸性度の強い胃液に晒されても運搬能力を保持するために、徐放性マイクロカプセル化ベクター等に加工することによって、標的器官への感染が可能となる。
接種部位は、一箇所または複数箇所（例えば2〜15箇所）であってよく、また、接種量は、接種対象動物、接種部位、接種回数などに応じて適宜調整してよい。例えば、一箇所当たりの接種量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜 5×1011 CIU (cell infectious unit)、好ましくは1×106 CIU 〜 1×1010 CIU とするとよい。細胞を介して接種（ex vivo投与）する場合は、例えば同種の培養細胞株（例えばサルコーマ細胞株）にマイナス鎖RNAウイルスベクターを感染させ、104〜109細胞、好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを動物に接種することができる。初回免疫だけでも有意な抗体価を誘導できるが、２回以上の接種によりブーストを行えば、抗体価をより上昇させることができる。
抗原をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターとして、Th2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインをさらにコードするものを好適に用いることができる。あるいは、抗原をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターで免疫する際、および/またはその前後（例えば抗原をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターの投与の前後１-72時間以内、好ましくは1-48時間以内、好ましくは1-24時間以内）に、Th2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカインあるいはそれらをコードするベクターを投与してもよい。投与部位は特に制限はないが、抗原をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターと同じ箇所またはその周辺（1 mmから3 cm以内、好ましくは3 mmから10 mm以内）に投与するとよい。
マイナス鎖RNAウイルスベクターを生成する核酸を動物に接種する場合は、外来ポリペプチドをコードするマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸、ならびに N、P、およびL蛋白質をコードする核酸を、それぞれ5：0.5：0.5：2の重量比で動物に投与するとよいが、各核酸の量比は適宜調整してよい。例えば発現プラスミドを用いる場合は、ウイルスゲノムRNA (プラス鎖またはマイナス鎖) をコードするプラスミドを5μg〜1000μg、N、P、およびL発現プラスミドを、それぞれ 0.5μg〜200μg、0.5μg〜200μg、2μg〜500μg投与するとよい。核酸の投与は、例えばnaked DNAの注入またはトランスフェクション試薬と混合して注入することなどにより行う。トランスフェクション試薬としては、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどが挙げられ、具体的には、DOTMA（Roche）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300) などが利用できる。
ブーストは、初回免疫から１〜数週間（例えば１〜３週間、より具体的には約2週間後）に上記と同様に接種を行う。例えば、腹腔内投与および/または背部、足蹠などへの皮内注射によるブーストが好適である。抗体価をさらに上げたい場合は、さらにブーストを繰り返してよい。ブーストでは、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載する上記のマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原を動物に接種するのが好ましい。ブースト免疫用の細胞溶解物は、上記の記載に従って調製することができる。精製抗原の精製度は特に限定されず、様々な程度に精製されたものであってよい。例えば、遠心、濾過、透析、各種のクロマトグラフィーなどで溶解物から精製された抗原を用いることができる。また、抗原としたい外来ポリペプチドまたはその部分ペプチドを接種するのも好適である。例えば部分ペプチドを合成し、適宜KLH (keyhole limpet hemocyanin)、ウシ血清アルブミン（BSA）、チログロブリン（THY）、またはオボアルブミン（OVA）などのキャリア蛋白質にコンジュゲートして免疫することができる。部分ペプチドの長さは、例えば8から25残基（9〜20、10〜18、または12〜16残基）とするとよい。ブーストに際しても、Th2サイトカインおよび/または抗炎症サイトカイン、あるいはそれらをコードするベクターを投与してよい。
十分な抗体価が得られたら、採血により抗体を回収する（ポリクローナル抗体の場合）。モノクローナル抗体を調製する場合は、免疫した動物の脾臓またはリンパ節などから細胞を回収し、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを作製するなどの操作で不死化した後、目的の抗体を産生する細胞を選択、クローニングする（Harlow, E., 1988, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; John E. Coligan et al. (Eds), Current Protocols in Immunology (Chapter 2); Peter J. Delves (Ed), Antibody Production: Essential Techniques, 1997, John Wiley & Sons; R. Kontermann & S. Dubel (Ed), Antibody Engineering, 2001, Springer Verlag, Heidelberg; Caponi, L. & Migliorini, P. (Eds), Antibody Usage In The Lab, Springer Lab Manual, 1999, Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co.; William C. Davis (Ed.), Monoclonal Antibody Protocols., Methods in Molecular Biology, Vol 45, 1995, Humana Press Inc., Totowa, N.J.）。接種対象となる動物としては、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類などの抗体を持つ所望の非ヒト脊椎動物が含まれるが、好ましく鳥類および非ヒト哺乳類であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物である。具体的には、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、マウスおよびラットなどのげっ歯類、サル等の非ヒト霊長類およびその他の哺乳動物が挙げられる。
抗体価は、ELISA法（Enzyme-linked immunosorbent assay）やオクタローニ法（Ouchterlony法）により測定することができる。ELISA法を例示すれば、マイクロプレートに抗原を吸着させた後、作製した抗血清を、1000倍から2倍段階希釈をおこなって、プレートに加え抗原抗体反応を行なわせる。更に二次抗体として、免疫動物の抗体に対するパーオキシダーゼ酵素標識した異種動物の抗体を反応させた後、発色させる。最大発色吸光度の1/2の発色吸光度を示すときの希釈倍率を抗体の抗体価として抗体価が算出できる。また、オクタローニ法（Ouchterlony法）においては、寒天ゲル内に抗原および抗体が拡散して、免疫沈降反応を呈し白い沈降線が生じるのを利用し、免疫沈降反応を呈した時の抗体の希釈倍率を抗体価として測定できる。
抗体は、血清やその希釈溶液の状態で調製してもよいし、精製してもよい。例えば、IgGやIgM抗体などの所望のクラスを精製することができる。例えば、一般にアフィニティーが高いことから最もよく利用されるIgG抗体を精製する場合は、Protein AまたはProtein Gを担体に固定化したカラムやビーズなどを利用することができる。IgM抗体であれば、2-メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムにより精製することができる。2-メルカプトピリジンカラムは、IgY（ニワトリ卵黄抗体）の精製にも用いられる（HiTrap IgY Purification HP, Amersham Biosciences K.K.）。あるいは抗体を、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー法により精製することもできる。例えば、ヤギ、ヒツジなどから大量に精製する場合に、まず、硫酸塩で塩析し粗IgG画分とし、DEAE-セルロースカラムに通すと、IgG画分はカラムに吸着されることなく、素通り画分に回収される。また、抗血清から抗体を特異的精製する方法として、アフィニティー精製法を用いることもできる。抗原を担体ゲルに固相化し、アフィニティーゲルを作製し、このゲルに抗血清を通し、抗原に結合したIgGを回収することで、抗原に結合する抗体を特異的に回収することができる。回収された抗体は、HPLC（例えば東ソー製 TSK G3000 SWXLカラム）等により純度を分析することができる（Howard, C.C. and Bathell, D.R. eds., Basic Methods in Antibody Production and Characterization, 2001, CRC Press BocaRaton, London, New York.）。
本発明の方法により作製した抗体または抗体を産生するハイブリドーマを選択または精製する時に、目的の抗原ポリペプチドに結合しない抗体をネガティブ選択により除去することができる。例えば、作製した抗体の中から、マイナス鎖RNAウイルス由来のウイルス蛋白質に結合する抗体を除去することができる。このためには、例えば目的とする抗原ポリペプチドをコードしないマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスの1つまたは複数のウイルス蛋白質を調製し、これに結合する抗体を除去すればよい。具体的には、抗体を含む溶液を、目的とする抗原ポリペプチドをコードしない該マイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質が固定化された担体ゲルと混合し、これらと結合する抗体を除去する。この操作により、マイナス鎖RNAウイルスベクターに結合する抗体が除去されることから、残った溶液を回収することにより、目的の抗原ポリペプチドに結合する抗体の純度を上げることができる。同様の操作はハイブリドーマなどに対しても適用することが可能である。例えば、ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液を、目的の抗原ポリペプチドをコードしないマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質と混合し、結合を検出する。これらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、ウイルスベクター自体に結合する抗体を産生するハイブリドーマを除外することができる。
得られた抗体は、溶液または凍結乾燥品などの形態で保存することができる。溶液とする場合は、防腐剤としてアジ化ナトリウムを添加してもよい。また、安定化剤としてウシ血清アルブミン（BSA）を含んでもよい。一例を挙げれば、2 mg/mLのウシ血清アルブミンと0.1％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水に抗体を希釈することができる。抗体の用途としては、例えばフローサイトメトリーによる表面抗原の解析、フローサイトメトリーによる細胞内抗原の解析、免疫組織染色、イムノブロッティング（ウェスタンブロット）、免疫沈降、ELISA、ELISPOT、マウスや他の哺乳動物におけるin vivoアッセイ、バイオアッセイ、ブロッキング、中和アッセイ、抗体治療等が挙げられるが、これらに制限されない。バイオアッセイやin vivo用途には、アジ化ナトリウムなどの防腐剤を含まない抗体が好ましい。蛋白質の検出に用いる場合、抗体は、適宜標識することができる。例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識、金コロイド標識などの様々な標識方法が知られている（P. Cuatrecasas, et al., Biochemistry, 11, 2291 (1972); S. Yoshitake, et al., Eur. J. Biochem., 101, 395(1979); M. J. O'Sullivan, et al., Anal. Biochem., 100, 100(1979); S. Yoshitake, et al., Anal. Lett., 15, 147(1982); J. V. Staros, Biochemistry, 21, 3950(1982); E. Ishikawa, et al., J. Immunoassay, 4, 209(1983); S. Yoshitake, et al., Scand. J. Immunol.,10, 81(1979); K. Fujiwara, et al., J. Immunol. Methods, 112, 77(1988)）。蛍光色素により抗体を標識する場合、蛍光色素としては、例えばFITC、PE、ECD（PE-TxRED）、PC5（PE-Cy5）、PC5.5（PE-Cy5.5）、PC7（PE-Cy7）、APC、APC5.5（APC-Cy5.5）、APC7(APC-Cy7)、Cy5、Alexa FluorTM などが用いられる。また抗体は、断片化して、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどの形態にすることができる。抗体断片は、パパインまたはペプシン等のペプチダーゼを用いて抗体を分解することによって得ることができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］LacZ遺伝子搭載マイナス鎖RNAウイルスベクター投与による抗LacZ抗体産生
１．免疫
6週齢オスのBALB/cAマウス6頭の腓腹筋に生理食塩水で2x10８CIU/mlに調製した、LacZを発現するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF（WO00/70070）を投与した。筋肉内注射により片側の２ケ所に１ケ所当たり100μlずつ接種した。ベクター接種５週後に眼窩静脈叢より採血し、血漿を分離した。
２．抗体の検出
抗体アッセイのため、市販の大腸菌由来βガラクトシダーゼ（シグマ G5635）を用いレーン当たり4μgになるようSDS電気泳動を行った。泳動した蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクによりブロッキングを行った。免疫したマウスの血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗LacZ抗体（プロメガ社 Z378A）を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体として、HRP-標識抗マウスIgs（Biosource AMI4704）を5%スキムミルク、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。ECL plus（アマシャム）を用いた化学発光によりLAS1000装置（FUJI FILM）を用いてシグナルを検出した。
[結果]
SeV18+LacZ/ΔFを用いたプライミング１回のみで、５週後に抗LacZ抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図１）。
１．免疫
6週齢オスのBALB/cAマウス6頭の腓腹筋に生理食塩水で2x10８CIU/mlに調製した、LacZを発現するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF（WO00/70070）を投与した。筋肉内注射により片側の２ケ所に１ケ所当たり100μlずつ接種した。ベクター接種５週後に眼窩静脈叢より採血し、血漿を分離した。
２．抗体の検出
抗体アッセイのため、市販の大腸菌由来βガラクトシダーゼ（シグマ G5635）を用いレーン当たり4μgになるようSDS電気泳動を行った。泳動した蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクによりブロッキングを行った。免疫したマウスの血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗LacZ抗体（プロメガ社 Z378A）を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体として、HRP-標識抗マウスIgs（Biosource AMI4704）を5%スキムミルク、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。ECL plus（アマシャム）を用いた化学発光によりLAS1000装置（FUJI FILM）を用いてシグナルを検出した。
[結果]
SeV18+LacZ/ΔFを用いたプライミング１回のみで、５週後に抗LacZ抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図１）。
［実施例２］GFP遺伝子搭載マイナス鎖RNAウイルスベクター投与による抗GFP抗体産生
１．免疫
(1) プライミング
A: 6週齢メスのBALB/cAマウス16頭（各投与経路につき４頭ずつ）に、点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により、生理食塩水で希釈調製した、GFP発現F遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔF（WO00/70070）を１頭あたり5 x 106 CIU投与した。点鼻投与ではセボフレンによる軽微な麻酔下においたマウスに100μlのベクター懸濁液を少量ずつ経鼻的に自然呼吸により吸引させた。筋注は片脚腓腹筋内に50μlずつ2箇所に、脾臓直接注射では50μlのベクター懸濁液をそのまま注射した。足蹠注では片足25μlずつ両足計50μlを注射した。
B: 6週齢メスのBALB/cAマウス2頭ずつに、腹腔、あるいは腰部皮下に生理食塩水で 1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを投与した。腹腔には100μlのベクター懸濁液をそのまま、皮下投与は腰部2箇所にそれぞれ50μlずつ注射を行った。
(2) ブースト
A: プライミング2週後、全てのマウスに腹腔内に5x107 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
B: プライミング16日後、全てのマウスの腹腔内に生理食塩水で 1 x108 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18＋GFP/ΔFを100μl投与した。
(3) 採血
A: プライミング前（非免疫対照）、プライミング後28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
B: プライミング後19日目（ブースト3日後）に眼窩静脈より同様に約100μl採血し、血清を分離した。
(4) 抗体の検出
A: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体および非免疫マウス血漿を用いた。
B: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定したGFP遺伝子搭載センダイウイルスベクター感染LLC-MK2細胞ライセートタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。
１．免疫
(1) プライミング
A: 6週齢メスのBALB/cAマウス16頭（各投与経路につき４頭ずつ）に、点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により、生理食塩水で希釈調製した、GFP発現F遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔF（WO00/70070）を１頭あたり5 x 106 CIU投与した。点鼻投与ではセボフレンによる軽微な麻酔下においたマウスに100μlのベクター懸濁液を少量ずつ経鼻的に自然呼吸により吸引させた。筋注は片脚腓腹筋内に50μlずつ2箇所に、脾臓直接注射では50μlのベクター懸濁液をそのまま注射した。足蹠注では片足25μlずつ両足計50μlを注射した。
B: 6週齢メスのBALB/cAマウス2頭ずつに、腹腔、あるいは腰部皮下に生理食塩水で 1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを投与した。腹腔には100μlのベクター懸濁液をそのまま、皮下投与は腰部2箇所にそれぞれ50μlずつ注射を行った。
(2) ブースト
A: プライミング2週後、全てのマウスに腹腔内に5x107 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
B: プライミング16日後、全てのマウスの腹腔内に生理食塩水で 1 x108 CIU/mlに調製したウイルスベクター SeV18＋GFP/ΔFを100μl投与した。
(3) 採血
A: プライミング前（非免疫対照）、プライミング後28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
B: プライミング後19日目（ブースト3日後）に眼窩静脈より同様に約100μl採血し、血清を分離した。
(4) 抗体の検出
A: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体および非免疫マウス血漿を用いた。
B: 血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定したGFP遺伝子搭載センダイウイルスベクター感染LLC-MK2細胞ライセートタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。
２．ウエスタンブロット用細胞ライセートの調整
10cmシャーレにてLLC-MK2細胞にmoi 10になるようにSeV18+ GFP/ΔFを感染させ、２日後に細胞を4℃のPBSにて２回洗浄した。細胞溶解バッファー（10mM CHAPS、2mM EDTA、2mM PMSFを添加したPBS）を5 ml加え４℃で20分静置した後、セルスクレーパにて可溶物を回収した。回収物は9000rpmで遠心した後、上清を回収し、透析チューブ、Slide-A-Lyzer 2000MW（Piarce社）に入れ、4℃のPBSに対し透析を行い、CHAPSを除去した。可溶蛋白質はブラッドフォード法（Bio-Rad社DC Protein Assay kit）にて定量、１レーン当たり５μgになるようにアプライし、SDS-PAGEを行った。
３．ウエスタンブロット
蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミンによりブロッキングを行った。血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗GFP抗体（Invitrogen社）を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体HRP-標識抗マウスIgs（Biosource AMI4704）を5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミン、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。検出はECL plus（アマシャム）を用いた化学発光によりLAS1000装置（FUJI FILM）を用いて検出した。
10cmシャーレにてLLC-MK2細胞にmoi 10になるようにSeV18+ GFP/ΔFを感染させ、２日後に細胞を4℃のPBSにて２回洗浄した。細胞溶解バッファー（10mM CHAPS、2mM EDTA、2mM PMSFを添加したPBS）を5 ml加え４℃で20分静置した後、セルスクレーパにて可溶物を回収した。回収物は9000rpmで遠心した後、上清を回収し、透析チューブ、Slide-A-Lyzer 2000MW（Piarce社）に入れ、4℃のPBSに対し透析を行い、CHAPSを除去した。可溶蛋白質はブラッドフォード法（Bio-Rad社DC Protein Assay kit）にて定量、１レーン当たり５μgになるようにアプライし、SDS-PAGEを行った。
３．ウエスタンブロット
蛋白質はセミドライブロッターにてPVDF膜に転写し、5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミンによりブロッキングを行った。血漿は4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて200倍に希釈し一次抗体反応に用いた。陽性対照には抗GFP抗体（Invitrogen社）を4%ウシ血清アルブミン入りPBSにて5000倍に希釈したものを用いた。二次抗体HRP-標識抗マウスIgs（Biosource AMI4704）を5%スキムミルクあるいは4%ウシ血清アルブミン、0.1%Tween20添加TBSにて希釈したものを用いた。検出はECL plus（アマシャム）を用いた化学発光によりLAS1000装置（FUJI FILM）を用いて検出した。
[結果]
SeV18+GFP/ΔFによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図２）。抗体価の上昇は特に点鼻投与のマウスで顕著であった。
SeV18+GFP/ΔFによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図２）。抗体価の上昇は特に点鼻投与のマウスで顕著であった。
［実施例３］マイナス鎖RNAウイルスベクター感染細胞ライセートの腹腔内投与による抗体産生
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス2頭の腹腔に、センダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞 Meth-A（RIKEN RCB0464; Old, L. et al. (1962) Ann. N.Y. Acad. Sci. 101, 80-106）のライセートを１頭あたり5 x 106 細胞相当量投与した。Meth-A細胞にmoi=1,000でセンダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを感染させ、３日後に遠心で集めた細胞をDPBS(-)で洗浄後、凍結融解を５回くり返した後に細胞破片を遠心で除去した後の上清分画をライセートとして用いた。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内に5x107CIU/mlに調製したウイルスベクターSeV18＋GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス2頭の腹腔に、センダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞 Meth-A（RIKEN RCB0464; Old, L. et al. (1962) Ann. N.Y. Acad. Sci. 101, 80-106）のライセートを１頭あたり5 x 106 細胞相当量投与した。Meth-A細胞にmoi=1,000でセンダイウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを感染させ、３日後に遠心で集めた細胞をDPBS(-)で洗浄後、凍結融解を５回くり返した後に細胞破片を遠心で除去した後の上清分画をライセートとして用いた。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内に5x107CIU/mlに調製したウイルスベクターSeV18＋GFP/ΔFを100μl投与した。対照の非ブーストマウスには100μlの生理食塩水を同様の方法で投与した。
２．抗体の検出
(1) 採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後14日目（ブースト前）、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価を実施例2同様SDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパク（Wako chemicals）に対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を用いた。
(1) 採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後14日目（ブースト前）、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価を実施例2同様SDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパク（Wako chemicals）に対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を用いた。
[結果]
SeV18+GFP/ΔF感染細胞ライセートによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図３）。
SeV18+GFP/ΔF感染細胞ライセートによるプライミングで、ブーストのあるなしにかかわらず4週後に抗GFP抗体の産生をマウス血中に確認することができた（図３）。
［実施例４］ウイルスベクターによるプライム、および同ベクター感染細胞ライセートによるブーストの組み合わせによる抗体の産生
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス計8頭（各投与経路につき２頭）に、実施例2と同様の方法で点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により生理食塩水で希釈調製したセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを１頭あたり5 x 106 CIU投与した。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内にセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞Meth-A（RIKEN RCB0464）のライセートを、１頭あたり5 x 106細胞相当量投与した。ライセートは実施例３と同様の方法で作製した。
２．抗体の検出
(1) 採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後14日目（ブースト前）、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を用いた（図４）。
[結果]
SeV18+GFP/ΔFベクターでプライム後、同ベクターの感染細胞によるブーストで、抗GFP抗体の産生増強をマウスの血中に確認することができた（図４）。
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス計8頭（各投与経路につき２頭）に、実施例2と同様の方法で点鼻、筋注、脾臓直接注、足蹠注により生理食塩水で希釈調製したセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを１頭あたり5 x 106 CIU投与した。
(2) ブースト
プライミング2週後、全てのマウスの腹腔内にセンダイウイルスベクター SeV18+GFP/ΔF感染マウス サルコーマ細胞Meth-A（RIKEN RCB0464）のライセートを、１頭あたり5 x 106細胞相当量投与した。ライセートは実施例３と同様の方法で作製した。
２．抗体の検出
(1) 採血
プライミング前（非免疫対照）、プライミング後14日目（ブースト前）、28日目に眼窩静脈よりヘパリン塗布キャピラリーを用いて約100μl採血し、血漿を分離した。
(2) ウエスタンブロット
血漿中の抗GFP抗体価をSDS-PAGEにて電気泳動後PVDF膜に転写・固定した市販精製GFPタンパクに対するウエスタンブロッティングにて検出した。対照として市販抗GFP抗体（Invitrogen社）および非免疫マウス血漿を用いた（図４）。
[結果]
SeV18+GFP/ΔFベクターでプライム後、同ベクターの感染細胞によるブーストで、抗GFP抗体の産生増強をマウスの血中に確認することができた（図４）。
［実施例５］抗GFPモノクローナル抗体の作製
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス１頭の腹腔内に、生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
(2) ブースト
プライミング16日後、腹腔内に生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
１．免疫
(1) プライミング
6週齢メスのBALB/cAマウス１頭の腹腔内に、生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクターSeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
(2) ブースト
プライミング16日後、腹腔内に生理食塩水で1 x108 CIU/ml に調製したウイルスベクター SeV18+GFP/ΔFを100μl投与した。
２．ハイブリドーマの作製
ミエローマ（P3-X63-Ag8.653）(RIKEN RCB0146) は10%牛胎児血清（FBS）を含むRPMI1640培地で培養を行ない、融合当日に対数増殖期になるように用意した。ブースト後３日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中で滅菌したステンレス網を用い、脾臓細胞を濾し単離した。脾細胞を３回、ミエローマを２回無血清RPMI1640培地で洗浄後、両者を数比１：１で混合し、遠心した。上清除去後、50%ポリエチレングリコールPEG（Sigma Hybri-Max mw3000-3700）にて脾細胞とミエローマの細胞融合を行った。融合細胞は無血清培地で洗浄、遠心を２回繰り返したのち、20%FBS/10mM HEPES/1mM sodium pyruvate添加RPMI1640培地40mlに懸濁し、wellあたり約10５細胞になるように96wellプレートに播種した。融合の翌日、HAT選択培地を100μlずつwellに添加し、翌日より培地上清を半量除去後100μlずつHAT培地（20%FBS/1xHAT supplement Hybri-Max (Sigma H0262) 添加RPMI1640）を添加した。半量ずつの培地交換は、細胞融合後1週間後までは毎日HAT選択培地にて行い、それ以降はHT培地（20%FBS/1xHT supplement Hybri-Max (Sigma H0137) 添加RPMI1640）にて２日ごとあるいは生細胞の密度に合わせて行った。HAT選択培地によって選択された融合細胞がwellの底をだいたい半分以上覆うくらいの大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットを行い融合細胞のうち抗GFP抗体を産生するものを選択した。増殖してきた融合細胞は、BALB/cAマウスの胸腺細胞をフィーダーとした96 wellプレートを用いて限界希釈法にてクローニングを行った。得られたクローンが増幅し、wellの約半分を覆う位の大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットにより、抗GFP抗体の産生するクローンを回収した。その結果、GFP搭載センダイウイルスベクターにより免疫したマウスの脾細胞を用い、GFPを認識するモノクローナル抗体の作製に成功した（図５）。
ミエローマ（P3-X63-Ag8.653）(RIKEN RCB0146) は10%牛胎児血清（FBS）を含むRPMI1640培地で培養を行ない、融合当日に対数増殖期になるように用意した。ブースト後３日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中で滅菌したステンレス網を用い、脾臓細胞を濾し単離した。脾細胞を３回、ミエローマを２回無血清RPMI1640培地で洗浄後、両者を数比１：１で混合し、遠心した。上清除去後、50%ポリエチレングリコールPEG（Sigma Hybri-Max mw3000-3700）にて脾細胞とミエローマの細胞融合を行った。融合細胞は無血清培地で洗浄、遠心を２回繰り返したのち、20%FBS/10mM HEPES/1mM sodium pyruvate添加RPMI1640培地40mlに懸濁し、wellあたり約10５細胞になるように96wellプレートに播種した。融合の翌日、HAT選択培地を100μlずつwellに添加し、翌日より培地上清を半量除去後100μlずつHAT培地（20%FBS/1xHAT supplement Hybri-Max (Sigma H0262) 添加RPMI1640）を添加した。半量ずつの培地交換は、細胞融合後1週間後までは毎日HAT選択培地にて行い、それ以降はHT培地（20%FBS/1xHT supplement Hybri-Max (Sigma H0137) 添加RPMI1640）にて２日ごとあるいは生細胞の密度に合わせて行った。HAT選択培地によって選択された融合細胞がwellの底をだいたい半分以上覆うくらいの大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットを行い融合細胞のうち抗GFP抗体を産生するものを選択した。増殖してきた融合細胞は、BALB/cAマウスの胸腺細胞をフィーダーとした96 wellプレートを用いて限界希釈法にてクローニングを行った。得られたクローンが増幅し、wellの約半分を覆う位の大きさになったら、培養上清を回収し、ウエスタンブロットにより、抗GFP抗体の産生するクローンを回収した。その結果、GFP搭載センダイウイルスベクターにより免疫したマウスの脾細胞を用い、GFPを認識するモノクローナル抗体の作製に成功した（図５）。
［実施例６］ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のエンベロープタンパクgp160を認識するモノクローナル抗体の作製
１．免疫
(1) プライミング
セボフレン麻酔下に７週齢メスのBALB/cAマウス計８頭に、生理食塩水で5 x108 CIU/ml に調製した、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のエンベロープタンパクgp160遺伝子を搭載するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GP160/ΔFを１頭あたり100μl点鼻投与した。
(2) ブースト
プライミング後14、28、42、56日目に凍結・融解法で作製したSeV18+GP160/ΔF感染7T1細胞ライセート（5x106 個細胞相当/100μl）を１頭当たり100μl腹腔内投与した。
２．ハイブリドーマの作製
ミエローマ（P3-X63-Ag8.653）は実施例５に記載された方法で用意した。最終ブースト後４日目に、最終ブースト時に採取した血漿中の抗gp160抗体価が高かった４頭を頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中のナイロンメッシュ上で脾臓をすり潰すことにより脾臓細胞を分離、回収した。脾細胞とミエローマの細胞融合と融合細胞の培養は実施例５に記載された方法で行った。
１．免疫
(1) プライミング
セボフレン麻酔下に７週齢メスのBALB/cAマウス計８頭に、生理食塩水で5 x108 CIU/ml に調製した、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のエンベロープタンパクgp160遺伝子を搭載するF遺伝子欠損型センダイウイルスベクターSeV18+GP160/ΔFを１頭あたり100μl点鼻投与した。
(2) ブースト
プライミング後14、28、42、56日目に凍結・融解法で作製したSeV18+GP160/ΔF感染7T1細胞ライセート（5x106 個細胞相当/100μl）を１頭当たり100μl腹腔内投与した。
２．ハイブリドーマの作製
ミエローマ（P3-X63-Ag8.653）は実施例５に記載された方法で用意した。最終ブースト後４日目に、最終ブースト時に採取した血漿中の抗gp160抗体価が高かった４頭を頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。無血清のRPMI1640培地中のナイロンメッシュ上で脾臓をすり潰すことにより脾臓細胞を分離、回収した。脾細胞とミエローマの細胞融合と融合細胞の培養は実施例５に記載された方法で行った。
HAT選択培地によって選択された融合細胞がwellの底を半分以上覆うほど増殖したら、培養上清を回収し、SeV18+GP160/ΔFベクター感染LLC-MK2細胞ライセートを固定した96 well プレートおよび搭載遺伝子を搭載しない空のSeV18+/ΔFベクター感染LLC-MK2細胞ライセートを固定した96 well プレートを用いたELISA法を行ない、SeV18+GP160/ΔFベクター感染LLC-MK2細胞ライセートを固定した96 well プレートでのみ陽性となる培養上清を検出することにより抗体産生細胞を同定した。gp160特異的抗体であることは、凍結、融解法で作製したSeV18+GP160/ΔFベクター感染LLC-MK2細胞ライセートをSDS-PAGE後に転写したPVDF膜を用いたウエスタンブロットを実施例２同様に行って確認した（図６）。このようにして得られたハイブリドーマが産生する抗gp160抗体のsubclassは市販のキット（Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Genzyme社、カタログ番号 97-6550)）によりIgG1と決定された（図７）。HIVやその他のウイルスのウイルス蛋白質に対する抗体は、例えばウイルス感染の検査・診断に有用である。
［実施例７］ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のエンベロープタンパクgp160を認識するモノクローナル抗体のペプチドを用いたブーストによる作製
１．免疫
(1) プライミング
実施例６と同様に行なった。
(2) ブースト
gp160蛋白質のアミノ酸配列の一部をなすペプチド３種類を人工合成し、キャリア蛋白質KLH (keyhole limpet hemocyanin) に常法を用いて結合した。合成したペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。括弧内の番号はGenbank（accession number NP_057856）に登録されているgp160のアミノ酸配列上の相当する部分のアミノ酸番号である。ただし、#493と#495のアミノ末端のシステインおよび#494のカルボキシ末端のシステインは、KLHとの結合のために付加されたもので、gp160の配列には含まれない。
＃493 CTRKRIRIQRGPGRAFV (303-318)（配列番号：10）
＃494 SELYKYKVVKIEPLGVC (481-496)（配列番号：11）
＃495 CPRGPDRPEGIEEEGGER (724-740)（配列番号：12）
上記３種のペプチドを等重量（１頭あたり各50μg）混合した溶液とFreund's incomplete adjuvantとのエマルジョンをブースト直前に作製し、プライミング後14、28、42、56日目に１頭当たり200μlを背部皮内注射した。
１．免疫
(1) プライミング
実施例６と同様に行なった。
(2) ブースト
gp160蛋白質のアミノ酸配列の一部をなすペプチド３種類を人工合成し、キャリア蛋白質KLH (keyhole limpet hemocyanin) に常法を用いて結合した。合成したペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。括弧内の番号はGenbank（accession number NP_057856）に登録されているgp160のアミノ酸配列上の相当する部分のアミノ酸番号である。ただし、#493と#495のアミノ末端のシステインおよび#494のカルボキシ末端のシステインは、KLHとの結合のために付加されたもので、gp160の配列には含まれない。
＃493 CTRKRIRIQRGPGRAFV (303-318)（配列番号：10）
＃494 SELYKYKVVKIEPLGVC (481-496)（配列番号：11）
＃495 CPRGPDRPEGIEEEGGER (724-740)（配列番号：12）
上記３種のペプチドを等重量（１頭あたり各50μg）混合した溶液とFreund's incomplete adjuvantとのエマルジョンをブースト直前に作製し、プライミング後14、28、42、56日目に１頭当たり200μlを背部皮内注射した。
２．ハイブリドーマの作製、選択およびウエスタンブロット
実施例６と同様に行ない、ペプチドでブーストしたマウスから作製した融合細胞中に抗gp160抗体を産生するハイブリドーマC1-182を検出した（図8）。C1-182のsubclassは実施例６同様に市販のキット（Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Genzyme社、カタログ番号 97-6550)）によりIgG1と決定された。よって、細胞ライセートだけでなく合成ペプチドによってもモノクローナル抗体作製に有効なブーストを行ない得ることが示された。
実施例６と同様に行ない、ペプチドでブーストしたマウスから作製した融合細胞中に抗gp160抗体を産生するハイブリドーマC1-182を検出した（図8）。C1-182のsubclassは実施例６同様に市販のキット（Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Genzyme社、カタログ番号 97-6550)）によりIgG1と決定された。よって、細胞ライセートだけでなく合成ペプチドによってもモノクローナル抗体作製に有効なブーストを行ない得ることが示された。
３．抗体結合阻害によるエピトープの確認
ハイブリドーマC1-182が産生する抗体がブーストに使用したペプチドのいずれをエピトープとして認識するかを結合阻害アッセイにて確認した。ウエスタンブロットは上記同様におこなったが、上清ハイブリドーマC1-182の上清と反応させる際、あらかじめ反応液に0.1, 1.0 あるいは10μg/mlになるように#493, #494, #495のうちのいずれかのペプチドを混合したものを用いた。上清中の抗体とメンブレン上のgp160の反応はペプチド#495が混合されている時のみ阻害され、C1-182が産生する抗体がペプチド#495のアミノ酸配列をエピトープとして認識することがわかった。これによりペプチドによるブーストが有効であったことが裏付けられた（図9）。
ハイブリドーマC1-182が産生する抗体がブーストに使用したペプチドのいずれをエピトープとして認識するかを結合阻害アッセイにて確認した。ウエスタンブロットは上記同様におこなったが、上清ハイブリドーマC1-182の上清と反応させる際、あらかじめ反応液に0.1, 1.0 あるいは10μg/mlになるように#493, #494, #495のうちのいずれかのペプチドを混合したものを用いた。上清中の抗体とメンブレン上のgp160の反応はペプチド#495が混合されている時のみ阻害され、C1-182が産生する抗体がペプチド#495のアミノ酸配列をエピトープとして認識することがわかった。これによりペプチドによるブーストが有効であったことが裏付けられた（図9）。
［実施例８］gp160を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニング
作製したハイブリドーマを安定して継代維持できるようにするため、6-76とC1-182の細胞クローニングを行なった。96ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり0.3, 1, 3個の細胞が入るように希釈して播種し、約２週間後に細胞コロニーが１ウェルあたり１個のみ出現したウェルを顕微鏡下に確認後、その上清を採取して抗gp160抗体の存在をELISA法で検出した。クローニングにあたっては10%FBS含有RPMI1640培地にさらにBM Condimed H1 (Roche Diagnostics社カタログ番号1 088 947)を10%加えて用いた。クローニングは２回行なった。２回目には１回目で陽性を示したハイブリドーマ株6-76-14, 6-76-17, C1-182-40, C1-182-48を用いた。２回目クローニングの陽性率は、それぞれ35/36 (97%), 26/26 (100%), 20/29 (69%), 29/29 (100%) で、#6-76、C1-182はいずれもクローン化に成功したと結論した（図10）。
さらに、２回目陽性の細胞6-76-14-21, 6-76-14-29, C1-182-48-5, C1-182-48-35の培養上清を用いて実施例6同様のウエスタンブロットを行なったところ、もとになったハイブリドーマおよび１回目クローニング陽性細胞とまったく同様にgp160とgp41を検出することができた（図11）。
作製したハイブリドーマを安定して継代維持できるようにするため、6-76とC1-182の細胞クローニングを行なった。96ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり0.3, 1, 3個の細胞が入るように希釈して播種し、約２週間後に細胞コロニーが１ウェルあたり１個のみ出現したウェルを顕微鏡下に確認後、その上清を採取して抗gp160抗体の存在をELISA法で検出した。クローニングにあたっては10%FBS含有RPMI1640培地にさらにBM Condimed H1 (Roche Diagnostics社カタログ番号1 088 947)を10%加えて用いた。クローニングは２回行なった。２回目には１回目で陽性を示したハイブリドーマ株6-76-14, 6-76-17, C1-182-40, C1-182-48を用いた。２回目クローニングの陽性率は、それぞれ35/36 (97%), 26/26 (100%), 20/29 (69%), 29/29 (100%) で、#6-76、C1-182はいずれもクローン化に成功したと結論した（図10）。
さらに、２回目陽性の細胞6-76-14-21, 6-76-14-29, C1-182-48-5, C1-182-48-35の培養上清を用いて実施例6同様のウエスタンブロットを行なったところ、もとになったハイブリドーマおよび１回目クローニング陽性細胞とまったく同様にgp160とgp41を検出することができた（図11）。
［実施例９］ハイブリドーマ6-76-14-29が産生する抗体の精製
ハイブリドーマ6-76-14-29の培養上清中の抗体タンパクをイムノグロブリン結合タンパクLを固定化したカラム（Pierce社 ImmunoPure Immobilized Protein L，カタログ番号 20510）を用いて精製した。プロトコルは添付説明書に従った。精製した抗体はSypro Orange蛍光染色（BioRad社 カタログ番号 170-3120）、抗マウスIgG(L+H)抗体（MP Biomedicals社 カタログ番号 67428）によるウエスタンブロットのいずれにおいてもコントロールとして用いた市販抗Ovalbumin抗体（AntibodyShop社 カタログ番号 HYB094-07）同様H鎖、L鎖それぞれ１本のバンドを示し、ハイブリドーマ6-76-14-29がクローンであること、産生される抗体タンパクが単一種であることを示した（図12）。さらに、この精製抗体を用いてウエスタンブロットを行なったところ、精製前の上清と同様にgp160, gp41を検出することができた（図13）。
ハイブリドーマ6-76-14-29の培養上清中の抗体タンパクをイムノグロブリン結合タンパクLを固定化したカラム（Pierce社 ImmunoPure Immobilized Protein L，カタログ番号 20510）を用いて精製した。プロトコルは添付説明書に従った。精製した抗体はSypro Orange蛍光染色（BioRad社 カタログ番号 170-3120）、抗マウスIgG(L+H)抗体（MP Biomedicals社 カタログ番号 67428）によるウエスタンブロットのいずれにおいてもコントロールとして用いた市販抗Ovalbumin抗体（AntibodyShop社 カタログ番号 HYB094-07）同様H鎖、L鎖それぞれ１本のバンドを示し、ハイブリドーマ6-76-14-29がクローンであること、産生される抗体タンパクが単一種であることを示した（図12）。さらに、この精製抗体を用いてウエスタンブロットを行なったところ、精製前の上清と同様にgp160, gp41を検出することができた（図13）。
［実施例１０］gp120を認識するハイブリドーマの取得
免疫、ハイブリドーマの作製、選択およびウエスタンブロットは実施例６にならって行なった。ただし、免疫部位として足蹠注を用い、Priming時のベクターは2x109 CIU/mouse を用いた。gp41を認識するもの（D1-518, A2-12, B2-39, B2-103）だけではなくgp120を認識するもの(D1-106, D1-137, D1-526, D2-26)も含む複数の抗gp160抗体産生ハイブリドーマの取得に成功した（図14）。
免疫、ハイブリドーマの作製、選択およびウエスタンブロットは実施例６にならって行なった。ただし、免疫部位として足蹠注を用い、Priming時のベクターは2x109 CIU/mouse を用いた。gp41を認識するもの（D1-518, A2-12, B2-39, B2-103）だけではなくgp120を認識するもの(D1-106, D1-137, D1-526, D2-26)も含む複数の抗gp160抗体産生ハイブリドーマの取得に成功した（図14）。
［実施例１１］IL10同時搭載F遺伝子欠損型センダイウイルスベクター投与による血漿中抗gp160抗体の誘導
F遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF（WO00/70070）に、CTL抑制と同時に抗体産生刺激効果があることが知られているサイトカインinterleukin (IL)-10をコードする核酸と、gp160をコードする核酸とを同時搭載したベクターを作製し、これを用いてマウスを免疫し、56日後の血漿中に産生される抗体を調べた。免疫およびウエスタンブロットは実施例７にならって行なった。IL-10が同時搭載されたセンダイウイルスベクターで抗gp160抗体が有効に誘導されることが示された。（図15）
F遺伝子欠損型センダイウイルスベクター SeV18+LacZ/ΔF（WO00/70070）に、CTL抑制と同時に抗体産生刺激効果があることが知られているサイトカインinterleukin (IL)-10をコードする核酸と、gp160をコードする核酸とを同時搭載したベクターを作製し、これを用いてマウスを免疫し、56日後の血漿中に産生される抗体を調べた。免疫およびウエスタンブロットは実施例７にならって行なった。IL-10が同時搭載されたセンダイウイルスベクターで抗gp160抗体が有効に誘導されることが示された。（図15）
本発明により、マイナス鎖RNAウイルスベクターを用いた抗体の製造方法が提供された。本発明の方法により製造された抗体は、蛋白質の検出や精製、中和、臨床検査、病理診断、抗体治療などに用いられる。
Claims (9)
- モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体産生細胞の製造方法であって、
（ａ）抗原としたい外来ポリペプチドをコードする核酸を搭載するセンダイウイルスベクターであって、F遺伝子を欠損する複製欠損型のセンダイウイルスベクターを、マウスに手掌または足蹠皮内投与で接種する工程、
（ｂ）該動物から、抗体産生細胞を回収する工程、
（ｃ）回収した抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させ、ハイブリドーマを調製する工程、および
（ｄ）ハイブリドーマが産生する抗体と該抗原とを接触させ、該抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、
を含む方法。 - 該センダイウイルスベクター、該ウイルスベクターを生成する核酸、該ベクターまたは該ベクターを生成する核酸が導入された細胞、該細胞の溶解物、または該細胞の溶解物から精製された抗原の接種によりブーストを行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドによりブーストを行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 該ブーストが、該細胞の溶解物の腹腔内投与、または該ポリペプチドまたはその断片を含むポリペプチドの皮内投与により行われる、請求項２または３に記載の方法。
- ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- ハイブリドーマが産生する抗体を含む溶液と、該外来ポリペプチドをコードしないセンダイウイルスベクター、該ウイルスベクターが導入された細胞、該細胞の溶解物、または該ウイルスのウイルス蛋白質とを共存させる工程、および、それらと結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- Ｔｈ２サイトカインまたはその活性部分ペプチド、あるいはそれらをコードするベクターを投与する工程をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 該サイトカインまたはその活性部分ペプチドが、抗原としたい外来ポリペプチドをコードする該センダイウイルスベクターにコードされている、請求項７に記載の方法。
- Ｔｈ２サイトカインがIL-4、IL-10、およびIL-13からなる群から選択される、請求項７または８に記載の方法。
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