JP2002509113A - 単純ヘルペスウイルス用のワクチン組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌遺伝子の欠失した全生ＨＳＶ−２ウイルスを含む単純ヘルペス用の新規ワクチン組成物を開示する。ワクチン組成物の使用方法も含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景

【０００２】 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、よく研究されているウイルスである。識
別可能な両方の血清型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）
は、比較的軽度の口唇上発熱性疱疹から重度の陰部感染までの範囲におよぶ感染
および疾病、並びに新生児の全身感染を引き起こす。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−
２は、ＤＮＡレベルで５０％相同性であり、一方の共通エピトープに対するポリ
クローナル抗体およびＭＡｂ抗体は、他方に交差反応する。

【０００３】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は、独特なアミノ末端ドメインを含むＲＲ１タン
パク質（それぞれＩＣＰ６およびＩＣＰ１０と称する）を有する。ＨＳＶ−２の
独特なドメインは、自己リン酸化活性およびリン酸基転移活性を有し、トランス
メンブラン（ＴＭ）ドメインを有するｓｅｒ／ｔｈｒ特異的ＰＫをコードする。
ＰＫドメインをコードする配列は、悪性形質転換を引き起こし、頸部癌に関連性
がある（ＨＳＶ−２癌遺伝子）。ＨＳＶ−１ＲＲ１タンパク質（ＩＣＰ６）の独
特な末端ドメインもＰＫ活性を有するが、構造的にも機能的にもＨＳＶ−２癌タ
ンパク質のものとは異なる。

【０００４】 ＩＣＰ１０ＰＫで使用したものと類似の酵素アッセイ条件を使用した本来の研
究により、ＩＣＰ６は、独特なドメインを保持しているが、ＰＫ活性はもたない
と結論づけられた（チュン（Chung）ら、J.Virol. 63:3389-3398、1989）。独 特なＰＫドメインの配列は僅か３８％の相同性しか示さないので、これは予期さ
れないことではなかった（ニカス（Nikas）ら、Proteins:Structure, function
and genetics 1:376-384、1986）。さらなる研究により、ＩＣＰ６は、異な
る条件下においてのみ、ＰＫ活性を有することが示された。他のタンパク質をリ
ン酸基転移する能力については矛盾した結果が得られた（問題の論評については
ペング（Peng）ら、Virology 216:184-196、1996参照、特に表１）。ＩＣＰ６ およびＩＣＰ１０タンパク質のＰＫ活性の異なる理由は、ＩＣＰ６ＰＫＡＴＰ結
合部位が、残りの触媒モチーフから遠くに位置していることにあるようである（
クーパー（Cooper）ら、J.Virol 69:4979-4985、1995）。ＩＣＰ６はまた、機 能的ＴＭドメインをもたず、それは細胞表面に局在していない（コナー（Conner
）ら、Virology 213:615、1995）。天然ＩＣＰ６のＰＫ活性は、そのＫ_ｍが、 ＩＣＰ１０ＰＫのＫ_ｍよりも１０倍高いという、理想的な条件下でさえ非常に弱
い（ペングら、Virology 216:184、1996；リー（Lee）およびオーリーリャン（
Aurelian）、準備中）。

【０００５】 ＩＣＰ６の形質転換活性は、ＨＳＶ２癌遺伝子が位置する場所より遠いゲノム
フラグメント内に位置する。この系の形質転換は形態学的である（フォーカス形
成能）。

【０００６】 アミノ末端のＩＣＰ１０の３分の１（アミノ酸１−４１７）をコードするＤＮ
Ａ配列が、発癌性を有することは以前に示されている。これらのＤＮＡ配列でト
ランスフェクトさせた細胞は、足場非依存性増殖を明示し、動物に腫瘍を引き起
こす。形質転換は、げっ歯類およびヒト細胞の両方で見られる（ジャリワラ（Ja
riwalla）ら、PNAS 77:2279-2283、1980；ハヤシ（Hayashi）ら、PNAS 82:849
3-8497、1985；スミス（Smith）ら、Virology 200:598-612、1994；ハンター（
Hunter）ら、Virology 210:345-360、1995）。

【０００７】 ＩＣＰ１０アミノ酸１−４１１内には３つの機能的ドメインがある：（ｉ）８
つの保存された触媒モチーフ（アミノ酸１０６−４１１）をもつＰＫ触媒ドメイ
ンを包含する、アミノ酸１０６−４１１の細胞内ドメイン、（ｉｉ）アミノ酸８
８−１０５のＴＭ、および（iii）アミノ酸１−８８の細胞外ドメイン（チュン ら、J.Virol.63:3389-3395、1989；Virology 179:168-178、1990）。ＰＫ活性 に必要な最少サイズは、アミノ酸１−２８３（ｐｐ２９^ｌａｌ）である（ルオ（
Luo）ら、Biol.Chem.266:20976-20983、1991）。しかし、ｐｐ２９^ｌａｌのＰＫ
活性は、真正ＩＣＰ１０ ＰＫとは異なる特性をいくらか有し、これはおそらく
、ＰＫ触媒ドメインＶＩの一部がないためであろう（ルオら、J.Biol.Chem.266:
20976-20983、1991）。ＴＭドメインも、ＰＫ活性に必要である（が十分ではな い）（ルオとオーリーリャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992）。それ故、 ＰＫ活性はアミノ酸８８−４１１内に局在し、不可欠なコアはアミノ酸８８−２
８３であると結論づけられる。

【０００８】 ＩＣＰ１０コード領域内の独特なＨｐａＩ部位は、形質転換領域の３'末端を 示し（ジャリワラら、Proc.Natl.Acad.Sci.77:2279-2283、1980）、アミノ酸残 基４１７のコドンの後で遺伝子を切断する。ｐｐ２９^ｌａｌが形質転換活性を有
するかどうかは不明である。しかし、ＰＫ活性は、腫瘍化能に必要とされる。Ｐ
Ｋ陰性の変異体は細胞を形質転換しない。これは、ＴＭドメインの欠失した変異
体、並びにＡＴＰ結合部位（Ｌｙｓ^１７６および／またはＬｙｓ^２５０）または
イオン結合部位（Ｇｌｕ^２０９）における部位特異的変異体を含む（スミスら、
Virology 200:598-612、1994；Aurelian,L.,生物学におけるフロンティア、印 刷中）。なぜなら、ＴＭドメインのみが欠失したＰＫ変異体は、形質転換活性を
もたないからである（スミスら、Virology 200:598-612、1994）。ＩＣＰ１０ アミノ酸１０６−４１１をコードするがＰＫ活性はないＤＮＡ配列は、本質的に
腫瘍性ではない。これは、（ｉ）ＨＳＶ−２癌タンパク質は、ＩＣＰ１０アミノ
酸１−４１１内に位置し、（ｉｉ）腫瘍化能は機能的ＰＫ活性を必要とすること
を実証する。

【０００９】 ウイルス増殖／病理発生におけるＩＣＰ１０ＰＫの機能は不明である。

【００１０】 ＨＳＶ−２ＩＣＰ１０タンパク質は、内在性ＰＫ活性を有する。これは、ＩＣ
Ｐ１０ＰＫ活性が部位特異的変異誘発により失われることを実証したことにより
示された。癌遺伝子はまた、１４０、１４９、および３９６位に、ＳＨ３結合部
位を有し、これは、シグナリングタンパク質との相互作用に必要とされる。この
相互作用は、形質転換活性に必要である。部位特異的変異誘発を使用して、キナ
ーゼ活性およびシグナリングタンパク質との相互作用に必要とされるアミノ酸を
同定した。Ｌｙｓ^１７６またはＬｙｓ^２５０の変異により、ＰＫ活性（５〜８倍
）および^１４Ｃ標識ＡＴＰ類似体のｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５'−ア デノシン（ＦＳＢＡ）の結合は減少したが、消失はしなかった。酵素活性および
ＦＳＢＡ結合は、両方のＬｙｓ残基の変異により消失し、これは、どちらか一方
がＡＴＰに結合できることを示唆する。Ｇｌｕ^２０９（ＰＫ触媒モチーフＩＩＩ
）の変異により、事実上、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋イオンの存在下でキナーゼ活
性は消失し、これは、Ｇｌｕ^２０９はイオン依存的ＰＫ活性に機能することを示
唆する。

【００１１】 ＩＣＰ１０ＰＫは、シグナリングに関与する増殖因子レセプターとして機能し
、それはインビトロでアダプタータンパク質Ｇｒｂ_２に結合する。ＩＣＰ１０Ｐ
Ｋドメイン内のＳＨ３結合部位（１４０、１４９および３９６位）は、シグナリ
ングタンパク質との相互作用および、よって形質転換に必要である（ネルソン（
Nelson）ら、J.Biol.Chem.271:17021-17027、1996）。３９６位および１４９位 のＩＣＰ１０プロリンリッチモチーフの変異により、Ｇｒｂ_２結合はそれぞれ２
０倍および２倍減少した。結合は、両方のモチーフの変異により消失した。野生
型ＩＣＰ１０へのＧｒｂ_２の結合は、Ｇｒｂ_２Ｃ末端ＳＨ３モチーフのペプチド
と競合し、これは、それがＧｒｂ_２Ｃ末端ＳＨ３が関与することを示唆する（ネ
ルソンら.、J.Biol.Chem.271:17021-17027、1996）。

【００１２】 ＩＣＰ１０ＰＫ触媒ドメインはまた、ＰＫ活性のダウンレギュレーター（ｒａ
ｓ−ＧＡＰ）との結合に関与する１０６−１７８位のアミノ酸も含む。アミノ酸
１０６−１７８の欠失により、ＰＫ活性は減少するが、消失はしない（ルオとオ
ーリーリャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992）。しかし、ｒａｓ−ＧＡＰ 結合は消失し、よって形質転換能は増加する（ネルソンら、原稿準備中）。

【００１３】 ＩＣＰ１０ＰＫウイルスの構築は、ペングらにより記載される（Virology 21
6、184-196、1996）。簡潔には、ＨＳＶ−２ ＢａｍＨＩ ＥおよびＴフラグメ
ントを含むプラスミド（ＴＰ１０１）中の野生型配列を、ｐＪＨＬ９由来の１. ８ｋｂのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントで置換した。ｐＪＨＬ９は、ＰＫ触
媒ドメインの欠失したＩＣＰ１０変異体を含むプラスミドである（ルオとオーリ
ーリャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992）。得られたプラスミドＴＰ９は 、５'および３'末端のＨＳＶ−２ＤＮＡ配列のそれぞれ４および２.８ｋｂによ りフランキングされる、ＰＫ触媒ドメインを欠失したＩＣＰ１０をコードする配
列を含む。ＴＰ９由来の１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを
、ＩＣＰ１０のＲＲドメインをＬａｃＺ遺伝子で置換しておいたウイルス（ＩＣ
Ｐ１０ΔＲＲ）に、マーカートランスファーにより導入した。得られた組換えウ
イルス（ＩＣＰ１０ΔＰＫと称する）は、Ｘ−ｇａｌで染色後、青色プラークの
背景で白色プラークを選択することにより得られた。数個の白色プラークを拾い
上げ、精製した。２つを、１０％血清と共にＶｅｒｏ細胞中で増殖させ（指数関
数的に増加して）それぞれＲＦおよびＣＳと称される個々の系統とした。

【００１４】 従来技術には公知のＨＳＶワクチンがいくつかある。米国特許第４,３４７,１
２７号；第４,４５２,７３４号；第５,２１９,５６７号；および第５,１７１,５
６８号は各々、ＨＳＶ−２感染に対する防御を提供するサブユニットワクチンを
教示する。これらのワクチンは、生弱毒ウイルスを使用したワクチンよりも劣る
。サブユニットワクチンにより誘導される免疫は、サブユニットにより提示され
る特定のタンパク質に限られ、これには十分な防御能がないこともある。さらに
、それは複製せず、それ故、タンパク質は全く増幅されず、これによりさらに免
疫原性が減少するだろう。これらの問題は、調製法が、組換えタンパク質を介す
るかまたはウイルス由来の抗原の精製を介するかに関係なく、どのサブユニット
ワクチンでも生じる。

【００１５】 米国特許第４,５５４,１５９号に開示したような交差組換えワクチンは、サブ
ユニットワクチンのような問題はないが、ＨＳＶ−２に存在する癌遺伝子を含ん
でいる。癌遺伝子を明確にし削除するように注意を払わなければ、交差組換えワ
クチンは、ワクチン接種者に癌を誘発するだろう。

【００１６】 '１５９号の交差組換え体は、温度感受性である。非病原性体は、温度耐性を 選択することにより得られ得るが、マウスの体温は３９℃であり、一方ヒトの体
温は３７℃である。この温度感受性は、ワクチンにかかる交雑した問題をよく与
える。非病原性体の優れた選択方法は、ウイルスが複製する温度と関係のない、
病原性体をコードする遺伝子の除去による。また、原型交差の使用により、遺伝
子が欠失または挿入した変異体の使用は妨げられるだろう。

【００１７】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２上には多くの型共通エピトープが存在するため、
ヒト血清の抗体は交差反応性である（オーリーリャンら、J.Natl.Cancer Inst.
45:455-464、1970）。また、細胞性免疫が交差反応することも以前に示されてい
る（ジャコブス（Jacobs）ら、J.Immunol.116:1520-1525、1976）。

【００１８】 生ワクチンは、死菌ワクチンよりも優れている。なぜなら、生ワクチンは、多
くの免疫を誘導し、また、粘膜性、細胞性および体液性などの異なる型の免疫も
誘導するからである。ウイルス力価はワクチン接種者内で複製により増加するた
め、通常、より高レベルの免疫が得られる。最終的に、生ワクチンがより長く持
続し、よってブースターの必要がなくなり、初期投与量は減少させることができ
る。しかし、生ヘルペスワクチンに絶対に必要なのは、本発明のように、形質転
換を引き起こす原因の遺伝子の除去である。

【００１９】 既知のワクチンはウイルス型特異的ではない。ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２用
の既知の全てのワクチンは交差反応性であり、他のウイルス型にも免疫を提供す
る。最も開発の進んでいるワクチン（すなわち、神経毒性遺伝子のワクチン）は
、ＨＳＶ−１におけるものである。しかし、ＨＳＶ−１は、ヘルペスに対する望
ましいワクチン候補ではない。なぜなら、主な臨床的問題は、癌誘発にも関連し
ている、性的に伝達されるＨＳＶ−２であるからである。近年の研究により、米
国でのＨＳＶ−２の年齢調整罹患率は、現在、２０.８％であり、過去１３年間 に約３０％増加していることが示される（フレミング（Fleming）ら、New Engl
.J.Med.337:1105-1111、1997）。若い成人の間でＨＳＶ−２罹患率が増加してい
ることにより、乳児が出産時にＨＳＶ−２に曝露され、その結果、抗ウイルス療
法を受けても、依然として生命に危険を及ぼす感染にかかる可能性が高まる（ウ
イットレイ（Whitley）ら、New Engl.J.Med.327:782-799、1992［Erratum、N.E
ngl.J.Med.328:671、1993］）。ＨＳＶ−２感染に関する新たな懸念は、それが ＨＩＶの蔓延を促進し、疾病の重度を増加させるかもしれないというものである
（オーリーリャン,エル.編、ヘルペスウイルス、免疫系およびエイズ、Kluwer
Academic Publishers、Boston、Mass、1990）。ＨＳＶ−１はＨＳＶ−２に対し
て僅か５０％しか相同性を示さないので、これが、ワクチン接種個体群の異種株
に対する応答率を低下させているのかもしれない。生ワクチンの他の絶対必要条
件は、免疫時に病変がないことである。生ワクチンの望ましい特性は、すでに感
染した個人において再発病変の頻度を減少できることであろう。かかるワクチン
の恩恵を受けたであろう非感染個体と性交したかもしれないＨＳＶにすでに感染
した個体群はかなり多い。

【００２０】 本発明は、上記した全ての問題を解決し、ＨＳＶ−２の癌遺伝子が欠失され、
ワクチン組成物に製剤化された、全生弱毒ＨＳＶ−２が提供される。本発明は、
ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に対して、該ワクチン組成物を用いて被検者を免疫
化する方法を提供し、被検者に免疫を与える優れた方法を提供する。

【００２１】 発明の要約

【００２２】 本発明の目的は、ヒトを含む動物に投与した場合、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−
２感染による攻撃からの防御を提供する、ワクチン組成物を提供することである
。

【００２３】 本発明のさらなる目的は、形質転換を引き起こしウイルスを弱毒化させない癌
遺伝子またはその任意の部分を欠失させた、全生弱毒ＨＳＶ−２を含むワクチン
組成物を提供することである。

【００２４】 本発明のさらなる目的は、新規なワクチン組成物を投与することを含む、ＨＳ
Ｖ−２またはＨＳＶ−１に対して、被検者を免疫化する方法を提供することであ
る。

【００２５】 本発明のまたさらなる目的は、新規なワクチン組成物を投与することを含む、
ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−１感染に関連した臨床症状を軽減または防ぐことであ
る。

【００２６】 本発明のまたさらなる目的は、新規なワクチン組成物を投与することを含む、
以前に感染した被検者における、ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−１に関連した再発疾
病を減少させることである。

【００２７】 発明の詳細な説明

【００２８】 本発明において、生全ＨＳＶ−２を変異させ弱毒化し、悪性形質転換を防いだ
。変異ＨＳＶ−２は、免疫刺激剤またはアジュバントと共に製剤化でき、ＨＳＶ
−１またはＨＳＶ−２に対して被検者を免疫化するために使用できる。リボヌク
レオチドレダクターゼの大サブユニットのプロテインキナーゼドメイン（ＩＣＰ
１０）は、以前、発癌特性を有することが示されている。ＰＫドメインの欠失は
、本発明で、ＨＳＶ−２の細胞感染能に対して有害な効果を有することが示され
る。本発明は、初めて、ＩＣＰ１０ＰＫドメインの欠如した、従って癌遺伝子の
欠如した生ＨＳＶ−２が、生野生型ＨＳＶ−２による攻撃に対して免疫原性防御
を提供することを実証する。それ故、新規ワクチン組成物並びにＨＳＶ−２また
はＨＳＶ−１に対して被検者を免疫化する新規な方法が発見された。

【００２９】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスは、非常に類似している。ＤＮＡは５０
％相同性である。事実上、全てのウイルス性タンパク質は、型特異的および型共
通的エピトープの両方を有する。２つを除く全てのタンパク質で（すなわち８２
個のタンパク質で）、型共通的エピトープが優勢である。例外は、型特異的抗体
を優勢に顕現するＨＳＶ−２ｇＧ２（アッシュレイ（Ashley）ら、J.Clin.Inves
t.90:511、1992）およびＨＳＶ−２癌タンパク質である。本発明では、ＨＳＶ−
２癌タンパク質を、ＩＣＰ１０ΔＰＫから欠失させた。それ故、我々は、型特異
的免疫を誘導できるタンパク質を１つ有するのみである。残りの８３個のタンパ
ク質は、型共通的免疫を誘導する。これは、抗体および細胞性免疫の両方を含む
。

【００３０】 以前、生全ＨＳＶ−２は、癌遺伝子が患者に強力な腫瘍の意味をもつことから
、ＨＳＶのワクチン選択肢として開発できなかった。本発明は、ＨＳＶ−２ゲノ
ムから、癌遺伝子であるプロテインキナーゼを除去することによって、腫瘍特性
が除去されるだけでなく、ウイルスは弱毒化され、長時間攻撃に対する完全な防
御を提供することを実証する。

【００３１】 癌遺伝子欠失を含む特定のＨＳＶ−２株は、本発明に重要ではない。かかる株
の例は、ＨＳＶ−２（Ｇ）、ＨＳＶ−２（３３３）、ＨＳＶ−２（１８６）、Ｈ
ＳＶ−２（Ｓ−１）を含むが、任意の株が許容可能である。これらの株は、公知
であり、容易に入手できる。

【００３２】 変異ウイルスの構築は、公知の技術によりなされる。癌遺伝子（ＰＫ）の位置
は、公知である（ＤＮＡ腫瘍ウイルス発癌機構、シー．バルバンチ−ブロダーノ
（C.Barbanti-Brodano）ら編、Plenum Press、NY、1995、第14章、エル．オー リーリャン、単純ヘルペスウイルス１型および２型により誘導される形質転換お
よび変異原性効果、p253-280）。癌遺伝子は、ＨＳＶ−２ゲノムのＩＣＰ１０区
分に位置する。以前に、ＰＫ活性および発癌活性は、ＩＣＰ１０アミノ酸８８−
４１１をコード化する遺伝子配列内に位置することが示されている。簡潔には、
ＨＳＶ−２ ＢａｍＨＩ ＥおよびＴフラグメントを含むプラスミド（ＴＰ１０
１）中の野生型配列を、ｐＪＨＬ９の１.８ｋｂＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩフラグメ ントで置換した［ＰＫドメインの欠失したＩＣＰ１０変異体、ルオとオーリーリ
ャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992］。得られたプラスミドＴＰ９は、５'
および３'末端のＨＳＶ−２ＤＮＡ配列のそれぞれ４および２.８ｋｂによりフラ
ンキングされる、ＰＫ触媒ドメインを欠失したＩＣＰ１０をコードする配列を含
む。ＴＰ９由来の１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＩＣ
Ｐ１０のＲＲドメインをＬａｃＺ遺伝子で置換しておいたウイルス（ＩＣＰ１０
ΔＲＲ）に、マーカートランスファーにより導入した。得られた組換えウイルス
（ＩＣＰ１０ΔＰＫと称する）は、Ｘ−ｇａｌで染色後、青色プラークの背景で
白色プラークを選択することにより得られた。数個の白色プラークを拾い上げ、
精製した。２つを、１０％血清と共にＶｅｒｏ細胞中で増殖させ（指数関数的に
増殖して）それぞれＲＦおよびＣＳと称される個々の系統とした。

【００３３】 サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、ＩＣＰ１０ΔＰＫウイル
スのＤＮＡに、ＩＣＰ１０ＰＫコード領域が欠失していることを確認した。ＨＳ
Ｖ−２およびＩＣＰ１０ΔＰＫ由来のＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化し、１％アガ
ロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写した。ＩＣＰ１０ＲＲコード領域内の
配列を認識する、ＡＵ２６（ＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡ）プ
ローブとハイブリダイズさせた。ＩＣＰ１０ΔＰＫＤＮＡに見られるハイブリダ
イズしたバンドは２.２ｋｂであり、これに対し、野生型ＨＳＶ−２では７.６ｋ
ｂであった。類似の結果が、系統ＲＦおよびＣＳでも得られた。

【００３４】 ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスは、ＤＮＡ解析、並びに、欠失タンパク質により保
持されるＩＣＰ１０アミノ酸に位置するエピトープに対する抗体での免疫沈降／
免疫ブロットにより野生型ＨＳＶ−２から区別できる。

【００３５】 ＩＣＰ１０ΔＰＫは、抗ＬＡ−１抗体（ＩＣＰ１０アミノ酸１３−２６を認識
する）で前沈降／免疫ブロットし（オーリーリャンら、Cancer Cells 7:187-1
91、1989）、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。９５ｋＤａのタ
ンパク質が、ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスで感染させた細胞において抗体により認
識され、これに対し、１４０ｋＤａのタンパク質が野生型ウイルスで感染させた
細胞において認識された。類似の結果が、系統ＲＦおよびＣＳでも得られた。

【００３６】 癌遺伝子またはその任意の部分を欠失させ得る。一旦欠失されれば、ウイルス
は弱毒化され細胞の悪性形質転換は防がれる、癌遺伝子の任意の部分を、「また
はその任意の部分」の表現によって、意味する。ＰＫ活性がないことを決定する
には、ウイルス遺伝子を発現させ、その結果を標準的なＰＫアッセイにかけるこ
とが必要である（チュンら、J.Virol.、63:3389-3398、1989）。ＰＫ活性に必要
なＩＣＰ１０遺伝子の区分については、従来技術に数多くの指針がある。ウイル
ス弱毒化の決定には、動物を試験して、病変形成のないことを決定することが必
要である。これをなす技術は、標準的であり、当分野では公知である。

【００３７】 得られた変異ウイルスＩＣＰ１０ΔＰＫは、感染実験で使用し、野生型ＨＳＶ
−２および回復ＨＳＶ−２(Ｒ)ウイルスによる感染と比較した。感染に使用した
細胞は、本発明に重要ではない。野生型ＨＳＶ−２で感染できる任意のヒトまた
は動物細胞系を、本発明に使用してよい。かかる細胞系の例は、Ｖｅｒｏ細胞、
ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、またはＭＲＣ５細胞（全て米国細胞培養バンク協会
から入手可能）を含む。ＩＣＰ１０ΔＰＫはまた、ＩＣＰ１０を構成的に発現す
る細胞、例えばＪＨＬａ１中で増殖できる。ＭＥＭ−１０％ＦＣＳおよび０.３ ％ヒトＩｇＧと共にＶｅｒｏ細胞上でプラークアッセイにより滴定する。ＲＦお
よびＣＳウイルス系統の増殖特性は、個々に決定した。

【００３８】 感染実験も動物で実施した。マウスは、ＨＳＶ−２の標準的な動物モデルを示
すので、マウスを選択した（ヴァクスマン（Wachsman）ら、Vaccine 10:447-45
4、1992）。マウス足蹠モデルを選択し、インビボでＩＣＰ１０ΔＰＫウイルス の病原性を調べた。ＲＦおよびＣＳウイルス系統は、個々に研究した。重度の病
変が、ＨＳＶ−２、またはＨＳＶ−２(Ｒ)と称される回復ウイルスを投与したマ
ウスに見られた。ＩＣＰ１０ΔＰＫ（ＲＦまたはＣＳ系統）を投与したマウスに
は、全試験プロトコル中（１〜２１日）、神経学的症状も皮膚病変もなかった。

【００３９】 被検者の免疫化は、当分野で公知の標準的な解釈を示す。ワクチン組成物の投
与時に、中和抗体および細胞性免疫が被検者に生じ、該抗体および細胞性免疫は
、被検者に免疫を与える。

【００４０】 本発明は、ＨＳＶ−２に対する被検者の免疫化を教示する。「ｐｆｕ」は、プ
ラーク形成単位であり、細胞培養物をウイルスに感染させる場合、単一のプラー
クを形成するのに必要なウイルスの量を示す。それは当業者により使用されるウ
イルス感染性の定量的尺度である。０.５〜１ミリオンｐｆｕの用量を使用して 、ＩＣＰ１０ΔＰＫ系統ＲＦ［ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)］でマウスを免疫化した
。１〜１０ミリオンｐｆｕの用量を使用して、ＩＣＰ１０ΔＰＫ系統ＣＳ［ＩＣ
Ｐ１０ΔＰＫ(ＣＳ)］でマウスを免疫化した。ヒトでの用量の範囲は、１〜１０
０ミリオンｐｆｕである。好ましい範囲は、１０００〜７５ミリオンｐｆｕであ
り、特に好ましい範囲は１０,０００〜５０ミリオンｐｆｕである。さらに、Ｈ ＳＶ−１とＨＳＶ−２の５０％相同性により、ＨＳＶ−１感染に対しても高度の
防御が得られる。

【００４１】 ヒトに使用するＩＣＰ１０ΔＰＫの製剤化は、安定化成分を含むまたは含まな
い、および免疫刺激剤およびアジュバントを含むまたは含まない溶液中に懸濁す
ることにより行われる。安定化剤、免疫刺激剤、およびアジュバントの例は、ミ
ョウバン、不完全フロイントアジュバント、ＭＲ−５９（カイロン）、ＭＴＰＰ
Ｅ、ＭＰＬ（モノ−ホスホリル脂質Ａ）を含む。かかる安定化剤、アジュバント
、および免疫刺激剤は、当分野で公知であり、単独でまたは組合せて使用できる
。

【００４２】 本発明のワクチン組成物は、ヒトを含む任意の動物に投与できる。ワクチン組
成物は、任意の適切な投与形態、例えば、筋肉内、経口、皮下、皮内、膣内、直
腸、または鼻腔内投与を介して投与し得る。好ましい投与形態は、皮下または皮
内投与である。

【００４３】 ＨＳＶ−２感染に対する防御を提供するＩＣＰ１０ΔＰＫは、医薬的に許容さ
れる担体または希釈剤と共に投与できる。かかる医薬的に許容される担体または
希釈剤の例は、水、リン酸緩衝食塩水または重炭酸ナトリウム緩衝液を含む。多
くの他の許容される担体または希釈剤が知られている。

【００４４】 好ましい例の態様

【００４５】 組換え株ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)は、単純ヘルペスウイルス２型の好ましい株
であることが判明し、これは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方に対してヒト
宿主を免疫化するワクチン用に、その増殖速度を減少させる他の未知のゲノム修
飾を有すると共に、プロテインキナーゼをコードする遺伝子が欠失されている。
この株は、望ましい免疫原性特徴を示し、潜伏に毒性または発癌性をもたない。
この株は、１９９７年１２月１８日、米国、２０８５２メリーランド、ロックバ
イル、パークローン・ドライブ１２３０１の米国細胞培養バンク協会（ＡＴＣＣ
）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２５９２により同定される。

【００４６】 以下の例は、説明の目的のためのみに提供し、決して本発明の範囲を限定する
意図はない。

【００４７】材料

【００４８】 細胞 Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞を、１０％ウシ胎児血清（
ＦＣＳ）および抗生物質を補充したイーグルス最少必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖
させた。ＪＨＬａ１細胞（ＩＣＰ１０を構成的に発現する）は先に記載した（ル
オとオーリーリャン、J.Biol.Chem. 267:9645-9653、1992；スミスら、Virolog
y 200:598-612、1994；ハンターら、Virology 210:345-360、1995）。それら を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸Ｎａ（ギブコBRL、Gaithersburg、メリー ランド）、１×非必須アミノ酸（ギブコBRL）および抗生物質と共にＥＭＥＭ中 で培養した。Ｖｅｒｏ−ＩＣＰ１０細胞は、Ｖｅｒｏ細胞を、ＳＶ_２−ｎｅｏカ
セットを有するＩＣＰ１０発現ベクター（ｐＪＷ１７Ｎ）でトランスフェクショ
ンして得た（ルオとオーリーリャン、J.Biol.Chem. 267:9645-9653、1992；ス ミスら、Virology 200:598-612、1994）。血清を不足させるために、１０％Ｆ ＣＳを含む培地中で増殖させて集密とした細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
ｐＨ７.０で洗浄し、２日間０.５％ＦＣＳを含む培地中で増殖させた。

【００４９】 プラーク形成能 ウイルス力価は、記載したようにプラークアッセイにより決
定した（オーリーリャン，エル．、単純ヘルペスウイルス、Clnival Virology Manual 、第２版、スペクター（Specter）,Sおよびランツ（Lancz）,G.編、Els
evier Science出版p473-494、1992）。Ｖｅｒｏ−ＩＣＰ１０細胞を、１０％ま
たは０.５％ＦＣＳおよび０.３％ＩｇＧで補充したＭＥＭからなる付加分下で使
用した。

【００５０】 抗体 ＩＣＰ１０ＰＫドメインの決定基（アミノ酸１０６−１７８）を認識す
るＩＣＰ１０アミノ酸１３−２６に特異的な抗ＬＡ−１抗体およびモノクローナ
ル抗体（ＭＡｂ３０）の産生および特異性は、以前に記載された（オーリーリャ
ンら、Cancer Cells 7:187-191、1989、チュンら、J.Gen.Virol 72:1139-114
4、1991）。ＩＣＰ４およびＩＣＰ０ＭＡｂは、アドバンスト・バイオテクノロ ジー（コロンビア、メリーランド）から購入した。アクチンに対する抗体Ｃ−１
１は、サンタクルス・バイオテクノロジー（サンタクルス、カリフォルニア）か
ら購入した。

【００５１】 免疫蛍光染色 ２２ｍｍ^２カバーガラス（Corning Glass Works、ニューヨ ーク）上に増殖させたＶｅｒｏ細胞を、ＨＳＶ−２またはＩＣＰ１０ΔＰＫで感
染させ、冷メタノール（−７０°）中に固定した。それらを抗ＬＡ−１抗体また
はＭＡｂ３０で、その後、それぞれフルオレセイン−コンジュゲートヤギ抗ウサ
ギまたはマウスＩｇＧで染色（６０分間、３７℃）した（ワイマー（Wymer）ら 、J.Virol.63:277-2784、1984、スミスら、Virology 200:598-612、1994）。

【００５２】 例１ＩＣＰ１０ΔＰＫおよびＨＳＶ−２(Ｒ)ウイルスの構築および特徴づけ

【００５３】 ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスの構築は記載されている（ペングら、Virology 21
6:184-196、1996）。簡潔には、ＨＳＶ−２ ＢａｍＨＩ ＥおよびＴフラグメ ントを含むプラスミド（ＴＰ１０１）中の野生型配列を、ｐＪＨＬ９由来の１. ８ｋｂＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントで置換した［ＰＫドメインの欠失した
ＩＣＰ１０変異体（ルオとオーリーリャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992 ）］。得られたプラスミドＴＰ９は、５'および３'末端のＨＳＶ−２ＤＮＡ配列
のそれぞれ４および２.８ｋｂによりフランキングされる、ＰＫドメインの欠失 したＩＣＰ１０をコードする配列を含む。ＴＰ９由来の１０ｋｂのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＩＣＰ１０のＲＲドメインをＬａｃＺ遺伝子で
置換しておいたウイルス（ＩＣＰ１０ΔＲＲ）に、マーカートランスファーによ
り導入した。得られた組換えウイルス（ＩＣＰ１０ΔＰＫと称する）は、Ｘ−ｇ
ａｌで染色後、青色プラークの背景で白色プラークを選択することにより得られ
た。数個の白色プラークを拾い上げ、精製した。２つの系統を、１０％血清と共
にＭＥＭ中でＶｅｒｏ細胞で増殖させた（指数関数的）。それらは、それぞれ、
ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)と称した。回復ウイルス
ＨＳＶ−２(Ｒ)を構築するために、Ｖｅｒｏ細胞を、ＩＣＰ１０ΔＰＫ由来の１
μｇの感染性ウイルスＤＮＡおよび１０倍モル過剰の野生型ＢａｍＨＩ Ｅ／Ｔ
フラグメントで同時トランスフェクトさせた。ＩＣＰ６Δで報告されたものと類
似の戦略（GoldsteinおよびWeller、Virology 166:41-51、1988）を使用して、
増殖制限条件下で回復ウイルスを選択した（血清不足Ｖｅｒｏ細胞）。

【００５４】 サザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、ＩＣＰ１０ΔＰＫ ＤＮ
Ａが、ＩＣＰ１０ＰＫコード領域で欠失していることを確認した。一般に、ウイ
ルスＤＮＡを、記載のように細胞質ビリオンから単離した（ピグナッティ（Pign
atti）ら、Virology 93:260-264、1979；スミスら、J.Gen.Virol.73:1417-1428
、1992）。簡潔には、Ｖｅｒｏ細胞を、感染多重度（ｍｏｉ）５で感染させた。
感染の４８時間後、細胞を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.２５％トリトンからなる緩衝液中に再懸濁（２×１０^７細 胞／ｍｌ）した。氷上でインキュベートした後（１５分間）、ＮａＣｌを最終濃
度０.２Ｍで加え、核を、１,０００×ｇ（１０分間、４℃）での遠心により沈降
させた。細胞質ビリオンを含む上清を、２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫおよ
び０.２％ＳＤＳ中インキュベート（４時間、３７℃）し、飽和ヨウ化ナトリウ ム（ＮａＩ；最終濃度１.５２５ｇ／ｍｌ）および臭化エチジウム（最終濃度３ μｇ／ｍｌ）と混合し、１００,０００×ｇで１６時間遠心した。

【００５５】 ウイルスＤＮＡ（１５μｇ）を、ＢａｍＨＩで消化し、フラグメントを、トリ
ス−アセテートＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液（４０ｍＭトリスアセテートおよび１
ｍＭ ＥＤＴＡ）中、１％アガロースゲル電気泳動により分離した。それを、ジ
ーンスクリーンメンブラン（NEN（New England Nuclear）社）に転写し、膜を
、５×ＳＳＣ［７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；ｐＨ(７.
０)］、２％カゼイン、０.１％Ｎ−ラウリルサルコシンおよび０.０２％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション液中、４２℃で
２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションプローブは、ＩＣＰ１０Ｒ
Ｒコード領域の配列を示す、オリゴヌクレオチドＡＵ２６（ＣＣＣＣＴＴＣＡＴ
ＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡ）であった。それに、プレハイブリダイゼーション液
中最終濃度５ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈した１×反応緩衝液［５ｍＭ塩化コバルト（
ＣｏＣｌ_２）、０.０５ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、５ｎｍｏｌ／ｍｌＡＵ２６、 ０.５ｍＭ ｄＡＴＰおよび２.５単位／μｌ末端転移酵素］を用いて２０μｌ容
量中、末端転移酵素（ベーリンガーマンハイム）により、３７℃で１５分間、ジ
ゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）を３'末端につないだ。ハイブリ ダイゼーションは、４２℃で３時間実施した。膜は、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ Ｓを含む溶液中で５分間１回、および０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で１５分
間２回洗浄（室温）した。ハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを検出するた
めに、膜を緩衝液１（１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ）中で濯ぎ、緩衝液２［緩衝液１中、２％（ｗ／ｖ）カゼイン］中で４０分
間、および３×１０^−４Ｕ／ｍｌのアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ジ
ゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイム）を含む緩衝液２中で３０分間イン
キュベートした。緩衝液１で洗浄（２回）し、緩衝液３（１００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ９.５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に２分間浸 した後、膜を化学ルミネセンス基質ルミ−ホス（Lumi-Phos）530（登録商標）（
ベーリンガーマンハイム）に曝露し、反応をＸ線フィルム上に現像した。

【００５６】 より具体的には、ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫまたはＨＳＶ−２(Ｒ)由来の
ＤＮＡ（１５μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、ナ
イロン膜に転写した。それに、ＩＣＰ１０ＲＲコード領域内の配列を認識するＡ
Ｕプローブ２６とハイブリダイズさせた（図１Ａ）。ＢａｍＨＩ Ｅフラグメン
トを示すハイブリダイズしている７.６ｋｂのバンドが、ＨＳＶ−２（図１Ｂ、 レーン２）およびＨＳＶ−２(Ｒ)（図１Ｂ、レーン３）ＤＮＡに観察された。Ｉ
ＣＰ１０ΔＰＫ ＤＮＡに見られるハイブリダイズしているバンドは、２.２ｋ ｂであり（図１Ｂ、レーン１）、期待したサイズと一致した。類似の結果が、Ｉ
ＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)でも得られた。データによ
り、ＩＣＰ１０ΔＰＫ ＤＮＡはＰＫコード領域を欠失していることが確認され
る。

【００５７】 例２９５ｋＤａのＰＫ欠失ＩＣＰ１０タンパク質（ｐ９５）の発現

【００５８】 ＩＣＰ１０ΔＰＫが、ＰＫドメインの欠失したＩＣＰ１０タンパク質を発現す
るかを決定するために、Ｖｅｒｏ細胞を、ＩＣＰ１０ΔＰＫ（２００ｐｆｕ／細
胞）で感染させ、感染後６〜１６時間[^３５Ｓ]−メチオニン（１００μＣｉ／ｍ
ｌ）で標識した。ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−２(Ｒ)で感染させた細胞は、対照と
して使用した。一般に、細胞は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）で偽感染させるか、また は２００ＰＦＵ／細胞のＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ、またはＨＳＶ−２(Ｒ)
で感染させた。それらを、メチオニンを全く含まず１０％透析ＦＣＳを含むＥＭ
ＥＭ中で、[^３５Ｓ]−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）（sp Act １１２０ Ｃｉ／mmol、デュポン、NEN Research Products）で標識した。いくつかの実 験で、感染は、シクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で６時間実施し、
６時間目にシクロヘキシミドを除去し、細胞をＰＢＳで徹底的に洗浄し、１０μ
ｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤおよび１００μＣｉ／ｍｌの[^３５Ｓ]−メチオニ
ンの存在下、インキュベート（３時間）した。免疫沈降させるために、細胞溶解
液を、冷ＲＩＰＡ緩衝液［０.０１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.１％ＳＤ Ｓ、１％ノニデットＰ４０、１％デオキシコレート、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１ ｍＭジチオトレイトール］中、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ）、１００カリクレイン単位／ｍｌアプロチニン（シグマ）と共に、１５
分間氷上でインキュベートし、３０分間２０,０００×ｇでの遠心により細胞片 を除去した。それらは、１５〜２０μｌの抗体（１時間、４℃）および１００μ
ｌのプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズ［０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ８.０）、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.５％ノニデットＰ４０中、１０ｍｇ ］と共にインキュベート（３０分間、４℃）した。ビーズを、氷冷ＲＩＰＡ緩衝
液で徹底的に洗浄し、結合したタンパク質を１００μｌの変性溶液［１５０ｍＭ
トリス塩酸塩（ｐＨ７.０）、５.７％ＳＤＳ、１４％２−メルカプトエタノール
、１７％スクロースおよび０.０４％ブロモチモールブルー］中煮沸（５分間） することにより溶離させた。

【００５９】 タンパク質を、７％または８.５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。いくつかの実験
では、細胞を、直接変性溶液に再懸濁し、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析した。

【００６０】 より具体的には、細胞抽出物を、抗ＬＡ−１抗体で沈降させ、タンパク質を、
７％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。抗ＬＡ−１
抗体は、ＨＳＶ−２（図２Ａ、レーン１）またはＨＳＶ−２(Ｒ)（図２Ａ、レー
ン３）感染細胞からの１４０ｋＤａタンパク質を沈降させた。ＩＣＰ１０ΔＰＫ
感染細胞からは、９５ｋＤａタンパク質（ｐ９５）（図２Ａ、レーン２）を沈降
させ、これは、ＰＫ欠失ＩＣＰ１０と一致する（ルオとオーリーリャン、J.Biol
.Chem.267:9645-9653、1992）。免疫前の血清は陰性であった（図２Ａ、レーン ４）。ＲＲ２と一致する３８ｋＤａタンパク質が、３つの全てのウイルスで感染
させた細胞から抗ＬＡ−１抗体により共沈し、これは、ｐ９５は、おそらく、前
の複合体形成と関係するカルボキシ末端でＲＲ２と複合体を形成できることを示
す（チュンら、J.Gen.Virol.72:1139-1144、1991）。類似の結果が、ＩＣＰ１０
ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)で得られた。

【００６１】 例３ＩＣＰ１０ΔＰＫにより発現されるｐ９５はキナーゼ活性が欠如している

【００６２】 我々は、以前に、（ｉ）ＩＣＰ１０は、ＨＳＶ−２で感染および安定にトラン
スフェクトした細胞でキナーゼ活性を有し、（ｉｉ）ＰＫ活性は、ＩＣＰ１０タ
ンパク質の５７−６０ｋＤａアミノ末端ドメインと関連性があるが、９０−９５
ｋＤａカルボキシ末端ドメインとは関連性がないことを示した（チュンら、J.Vi
rol.63:3389-3398、1989；スミスら、Virology 200:598-612、1994）。ＩＣＰ １０ΔＰＫにより発現されるｐ９５は、ＰＫ活性を有するかを決定するために、
ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫまたはＨＳＶ−２(Ｒ)で感染（ｍｏｉ＝２００、
感染後１６時間）させた細胞の抽出物を、抗ＬＡ−１抗体で免疫沈降させ、ＰＫ
アッセイにかけた（チュンら、J.Virol.63:3389-3398、1989）。

【００６３】 一般に、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス、ロックフォード、イリノ
イ）によりタンパク質濃度を規格化した細胞抽出物の免疫沈降物を、２０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７.４）、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＳ緩衝液で洗浄し、２
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.４）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＭｎＣｌ_２ および１０μＣｉの[^３２Ｐ]ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／mmol、デュポン、New Eng
land Research Product）からなる５０μｌのキナーゼ反応緩衝液に懸濁し、 ３０℃で１５分間インキュベートした（チュンら、J.Virol.63:3389-3398、1989
；チュンら、Virology 179:168-178、1990；スミスら、J.Gen.Virol.73:1417-1
428、1992；スミスら、Virology 200:598-612、1994；ペングら、Virology 21
6:184-196、1996）。ビーズを、１回、１ｍｌのＴＳ緩衝液で洗浄し、１００μ ｌの変性溶液に再懸濁し、５分間煮沸した。タンパク質を、記載のように７％ポ
リアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（チュンら、J.Viro
l.63:3389-3398、1989）。タンパク質を、前記したように、ニトロセルロース膜
にエレクトロトランスファーし（オーリーリャンら、Cancer Cell.7:187-191、
1989）、免疫ブロットを、それぞれの抗体、その後、プロテインＡ−ペルオキシ
ダーゼ（シグマ）と共に各々１時間室温でインキュベートすることにより実施し
た。検出は、ＥＣＬ試薬（アマシャム、シカゴ、イリノイ）で記載の通り（スミ
スら、Virology 200:598-612、1994）行った。

【００６４】 より具体的には、分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、抗Ｌ
Ａ−１抗体で免疫ブロットし、沈降物中のタンパク質レベルを決定した。ＨＳＶ
−２（図２Ｂ、レーン１）またはＨＳＶ−２(Ｒ)（図２Ｂ、レーン３）感染細胞
由来の１４０ｋＤａのＩＣＰ１０タンパク質がリン酸化された。リン酸化９５ｋ
Ｄａタンパク質は、ＩＣＰ１０ΔＰＫで感染した細胞には見られなかった（図２
Ｂ、レーン２）。これは、ＰＫアッセイに使用した沈降物中のタンパク質レベル
が低いためではない。なぜなら、類似のタンパク質レベルが、抗ＬＡ−１抗体で
免疫ブロットすることにより、全ての３つのウイルスで見られたからである。（
図２Ｃ）。リン酸化３８ｋＤａタンパク質は、ＨＳＶ−２（図２Ｂ、レーン１）
およびＨＳＶ−２(Ｒ)（図２Ｂ、レーン３）感染細胞で見られたが、ＩＣＰ１０
ΔＰＫで感染した細胞では見られなかった（図２Ｂ、レーン２）。免疫前の血清
は陰性であった（図２Ｂ、Ｃ、レーン４）。以前にチュンら（J.Virol.63:3389-
3398、1989）およびペングら（Virology 216:1 196、1996）により報告された
ように、我々は、これらのデータを、ＲＲ２は、ＩＣＰ１０ＰＫによりリン酸化
されることを示唆するものと解釈する。それはｐ９５によりリン酸化されず、こ
れはＰＫドメインがないことと一致する。類似の結果が、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(Ｒ Ｆ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)で得られた。このデータにより、ＩＣＰ１０ ＰＫコード領域は、キナーゼ活性に必要とされ、ウイルス感染とも関連している
ことが確認される。

【００６５】 例４ＩＣＰ１０ΔＰＫのリボヌクレオチドレダクターゼ活性

【００６６】 ＲＲ１タンパク質のＲＲ活性とＰＫ活性は解離できると一般に信じられている
（インゲマーソン（Ingemarson）ら、Virology 156:417-422、1987；チュンら 、J.Virol.63:3389-3398、1989）。この解釈の妥当性を調べるために、ＩＣＰ１
０ＰＫ活性の欠如は、ＲＲ活性に影響を及ぼすかを文書で裏付けることは重要で
ある。ＲＲアッセイは、感染細胞（ｍｏｉ＝２０、感染後１６時間）由来の抽出
物で実施した。ＲＲ活性は、記載のようにアッセイした（スミスら、J.Gen.Viro
l.73:1417-1428、1992）。１６時間感染させた細胞または偽感染細胞由来の抽出
物を、ＨＤ緩衝液［１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.６）、２ｍＭジチ オトレイトール（ＤＴＴ）］中、２×１０^７細胞等価体／ｍｌで再懸濁し、氷上
で１５分間インキュベートし、超音波により破壊し（最大設定で３０〜６０秒間
；ウルトラソニックスモデル２２０Ｆソニフィアー（sonifier））、遠心分離（
１００,０００×ｇ；１時間、４℃）により細胞片を除去した。ＨＳＶ ＲＲ活 性は、結晶性硫酸アンモニウム［４５％飽和（０.２５８ｇ／ｍｌ）］で沈降さ せた。透析および遠心分離（１６,０００×ｇ；３０分間）後、部分精製酵素調 製物を、４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８.０）、２０ｎＭ ＤＴＴおよ び０.２ｍＭ[^３Ｈ]−ＣＤＰ（１７.８Ｃｉ／mmol、アマシャム、イリノイ）を含
む、等容量の２×標準反応混合物と共にインキュベート（３７℃；１０分間）し
た。反応は、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）と共に１００ｍＭのヒドロキシ尿 素の添加により終結させ、３分間煮沸した。Crotalus atrox毒液（シグマ、セ ントルイス、ミズーリ）を加え［１２ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９.０）、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭデオキシシチジン中、０.５ｍｇ／ｍｌ］、混合物を３０ 分間３７℃でインキュベートし、３分間煮沸し、０.５ｍｌのDowex-1ボレートカ
ラム（シグマ）に適用した。カラムを、２.５ｍｌＨ_２Ｏで洗浄し、０.５ｍｌの
溶出画分を、シンチレーション計測のためにバイオフルオア（Biofluor）（ＮＥ
Ｎ、ボストン、マサチューセッツ）と混合した。リボヌクレオチドレダクターゼ
活性は、単位／ｍｇとして表し、ここで１単位は、１ｎｍｏｌの[^３Ｈ]−ＣＤＰ
のｄＣＤＰへの変換／時間／タンパク質ｍｇを示す。

【００６７】 より具体的には、表１に示すように、ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスは、ＨＳＶ−
２およびＨＳＶ−２(Ｒ)の活性と類似したＲＲ活性を有していた。これは、ｐ９
５がＲＲ２と共沈するという所見と一致し、ＰＫとＲＲ活性は、機能的に解離で
きるという結論を支持する。

【００６８】

【表１】

【００６９】 例５ＩＣＰ１０ΔＰＫの増殖特性

【００７０】 ＩＣＰ１０ΔＰＫの増殖特性は、指数関数的（１０％血清）および増殖制限的
（０.５％血清）条件下で研究した。最初のシリーズの実験では、Ｖｅｒｏ細胞 を、感染多重度２で、ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)、またはＨＳＶ−２
(Ｒ)で感染させ、ウイルス増殖を、感染後３６時間調べた。図３に示すように、
ＨＳＶ−２は、指数関数的および増殖制限条件下で十分に等しく増殖した。ウイ
ルス複製は、感染の２時間後に開始し、感染の３６時間後にピークレベルに到達
した（バーストサイズ１０００ｐｆｕ／細胞）。類似の増殖パターンが、ＨＳＶ
−２(Ｒ)により明示された。これに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫ複製の開始は、指数
関数的および血清不足細胞の両方において、感染の１５時間後まで見られなかっ
た。その時点で、複製は再開され、指数関数的細胞における感染の３６時間後の
ＨＳＶ−２の力価と類似した力価に達したが（バーストサイズ１０００ｐｆｕ／
細胞）、血清不足細胞ではそうではなかった（バーストサイズ１ｐｆｕ／細胞）
。

【００７１】 第二シリーズの実験において、指数関数的Ｖｅｒｏ細胞を、感染多重度２００
で、ＨＳＶ−２またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)で感染させた。ＨＳＶ−２複製は
、感染の２時間後に開始し、感染の２０時間後に最大力価に達した（図４）。こ
れに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスの複製は、感染の１０〜１２時間後に初め
て見られ、最大力価は感染の３６時間後であった（図４Ｂ）。ＨＳＶ−２(Ｒ)の
増殖は、事実上、ＨＳＶ−２の増殖と同一であった（データは示していない）。
細胞内および細胞外ウイルスの力価は、ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫおよびＨ
ＳＶ−２(Ｒ)において類似しており、子孫ウイルスは等しくよく遊離されたこと
を示唆する（図４）。

【００７２】 ウイルス増殖について、次に、２つのＩＣＰ１０ΔＰＫウイルス系統を比較し
た。指数関数的Ｖｅｒｏ細胞を、感染多重度２または２００ｐｆｕ／細胞で、Ｉ
ＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)で感染させた。感染多重度
２ｐｆｕ／細胞で感染させた細胞では、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)複製は、感染の
１５時間後に開始された。これに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)の複製は感染の
２０時間後まで開始されず、これは、それはより欠損のあることを示唆する（図
５Ａ）。両方のウイルス系統において、ピーク力価は、感染の３５時間後に見ら
れた。ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)の力価は１０００ｐｆｕ／細胞であった。ＩＣＰ
１０ΔＰＫ(ＣＳ)の力価は、７８０ｐｆｕ／細胞であった（図５Ａ）。感染多重
度２００ｐｆｕ／細胞で感染させた細胞では、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)複製は、
感染の１１時間後に開始された。これに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)の複製は
、感染の１５時間後まで開始されず、これは、低い感染多重度で感染させた細胞
で見られるものと釣合ったウイルス複製開始遅延を示す（図５Ｂ）。両方のウイ
ルス系統において、ピーク力価は、感染の３５時間後に見られた。それらは、Ｉ
ＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)についてそれぞれ５８０お
よび５０ｐｆｕ／細胞であった（図５Ｂ）。ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣ
Ｐ１０ΔＰＫ(ＣＳ)ウイルス系統は、同じように構築され、両方共ＩＣＰ１０Ｐ
Ｋ活性が欠如しているが、ＲＲ活性は保持するので、我々は、その異なる増殖パ
ターンは、増殖増幅中におそらく獲得された追加の差異を反映し、ＩＣＰ１０Δ
ＰＫ(ＣＳ)のさらなる弱毒化を説明すると結論する。

【００７３】 ＩＣＰ１０ＰＫが実際にウイルス複製に必要であるかを確認するために、我々
はまた、ＩＣＰ１０を構成的に発現するＪＨＬａ１細胞でのウイルス増殖を調べ
た。ＪＨＬａ１系を確立するために使用した２９３細胞は対照として使用した（
ルオとオーリーリャン、J.Biol.Chem.267:9645-9653、1992；スミスら、Virolog
y 200:598-612、1994；ハンターら、Virology 210:345-360、1995）。細胞を 感染多重度２００で感染させ、ＭＥＭ‐１％ＦＳＣをのせた。２９３細胞で増殖
させたＩＣＰ１０ΔＰＫは、新規合成ウイルスは感染の１０時間後より前には見
られなかった点で、Ｖｅｒｏ細胞で見られるものと類似した（図６Ｂ）。これに
対し、ＪＨＬａ１細胞では、ＩＣＰ１０ΔＰＫは、ＨＳＶ−２と同程度よく増殖
し、複製は初めて感染の２時間後に見られ、感染後２０時間目に最大レベルに達
した（バーストサイズ；ＨＳＶ−２およびＩＣＰ１０ΔＰＫについてそれぞれ２
８００および２５００）（図６Ａ）。類似の結果が、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)お
よびＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)で得られた。我々は、これらの所見を、ＩＣＰ１０
ＰＫは、指数関数的および増殖制限細胞の両方でのウイルス複製に必要であるこ
とを示すと解釈する。しかし、Ｖｅｒｏおよび２９３細胞の両方で見られる代償
性機能は、感染の１０〜１５時間後のウイルス増殖回復に関与している。ＩＣＰ
１０ΔＰＫウイルスの増殖は、低感染多重度よりも高感染多重度で感染させた細
胞でより早く再開されるが、バーストサイズは、血清不足細胞よりも指数関数的
細胞において有意に高かったので（それぞれ、１０００対１）、我々は、代償性
機能は、入来ウイルス構造タンパク質により誘導される細胞性Ｓｅｒ／ＴｈｒＰ
Ｋであると推定する。

【００７４】 例６ＩＣＰ１０ΔＰＫおよびＨＳＶ−２は、類似の細胞吸着動態を有する

【００７５】 ＩＣＰ１０ΔＰＫにより明示される増殖パターンの１つの可能な解釈は、細胞
を吸着／浸透する能力の欠損である。この疑問に取り組むために、Ｖｅｒｏ細胞
を２００ｐｆｕのＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ、またはＨＳＶ−２(Ｒ)に、０
、１０、３０、６０、９０、または１２０分間曝露させた。それらをＰＢＳで徹
底的に洗浄し、ＭＥＭ‐１０％ＦＣＳおよび０.３％ＩｇＧをのせ、３７℃で４ ８時間再度インキュベートした。この時点で、それらをプラーク形成について評
価した。図７に示すように、プラーク数は、曝露時間の関数として全３つのウイ
ルスにおいて増加し、２０〜３０分で最大レベルに達し、その後、平坦となった
。最初の接種のウイルス力価は平行して減少し、類似のパターンがＨＳＶ−２、
ＩＣＰ１０ΔＰＫ、およびＨＳＶ−２(Ｒ)についても見られた（データは示して
いない）。類似の結果が、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)およびＩＣＰ１０ΔＰＫ(Ｃ Ｓ)でも得られた。

【００７６】 例７ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスのプラーク形成能

【００７７】 ＩＣＰ１０ΔＰＫのプラーク形成能を分析するために、我々は、１０％または
０.５％血清中で増殖させたＶｅｒｏおよびＶｅｒｏ−ＩＣＰ１０細胞を使用し た。低感染多重度で感染させた血清不足細胞で観察された低バーストサイズと一
致して、ＩＣＰ１０ΔＰＫプラーク形成能は、血清不足Ｖｅｒｏ細胞で重度に損
なわれた。ウイルス力価は、指数関数的増殖Ｖｅｒｏ細胞（１０％血清）および
Ｖｅｒｏ−ＩＣＰ１０細胞のＨＳＶ−２の力価と類似していた（表２）。Ｖｅｒ
ｏ細胞（１０％または０.５％ＦＣＳ中で増殖）において、ＩＣＰ１０ΔＰＫプ ラークはぼやけており、見かけ不完全な細胞溶解を反映する。細胞溶解の程度は
、実験によって幾分異なるが、ＨＳＶ−２に見られるほど決して完全ではなかっ
た。ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)のプラークは、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)のプラーク
よりも小さく、その増殖は重度に損なわれているという結論と一致した。Ｖｅｒ
ｏ−ＩＣＰ１０細胞のＩＣＰ１０ΔＰＫプラークの形態および全細胞のＨＳＶ−
２(Ｒ)プラークの形態は、ＨＳＶ−２の形態と類似していた（データは示してい
ない）。

【００７８】

【表２】

【００７９】 例８ＩＥタンパク質発現は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞で感染の初期に阻害される

【００８０】 ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスの増殖欠損は、タンパク質合成を開始できないこと
を反映するかもしれない。この可能性に取り組むために、Ｖｅｒｏ細胞を偽感染
させるか、またはＨＳＶ−２、ＩＣＰ１−ΔＰＫ、またはＨＳＶ−２(Ｒ)（感染
多重度＝２００）で２〜７時間感染させ、[^３５Ｓ]−メチオニンでさらに６０分
間パルス標識し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＨＳＶ−２感
染細胞のタンパク質プロフィルは、以前に記載のものと類似しており（ウイルコ
ックス（Wilcox）ら、Virol 33:167-182、1980）、感染の３時間後に、ＩＣＰ ４、ＩＣＰ０、ＩＣＰ１０、およびＩＣＰ２７を含んでいた（図８Ａ、レーン２
）。類似のタンパク質プロフィルが、ＨＳＶ−２(Ｒ)で感染させた細胞で見られ
た（図８Ａ、レーン８）。これに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫで３時間感染させた細
胞のタンパク質プロフィル（図８Ａ、レーン３）は、偽感染細胞のものと類似し
ていた（図８Ａ、レーン１）。例外は、２つのバンド、１１０ｋＤａおよび９５
ｋＤａ（図８Ａ、レーン３）であり、それらは、免疫ブロットでそれぞれＩＣＰ
０およびＩＣＰ１０抗体により認識された（図８Ｂ、レーン１、２）。密度走査
により、ＩＣＰ０のレベルは、ＨＳＶ−２［またはＨＳＶ−２(Ｒ)］感染細胞よ
りも、ＩＣＰ１０ΔＰＫで４倍低く（ＨＳＶ−２およびＩＣＰ１０ΔＰＫでそれ
ぞれ３１３０および７８２単位）、ｐ９５レベル（ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞に
おける）はＨＳＶ−２およびＨＳＶ−２(Ｒ)感染細胞のＩＣＰ１０レベルよりも
７倍低い（ＩＣＰ１０およびｐ９５でそれぞれ３５６７および４８０単位）こと
が示された。ＩＣＰ１０ΔＰＫで８時間感染させた細胞において、ＩＣＰ０およ
びｐ９５のレベルはより高く、ＩＣＰ４、ＩＣＰ５、およびＩＣＰ２７と一致す
るバンドが検出された（図８Ａ、レーン５）。８時間感染させた細胞におけるＩ
ＣＰ４バンドの実体が、ＩＣＰ−４特異的ＭＡｂでの免疫ブロットにより確認さ
れた（図８Ｂ、レーン３）。感染の１２時間後のＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞のタ
ンパク質プロフィル（図８Ａ、レーン６）は、感染の８時間後のＨＳＶ−２感染
細胞のものと類似していた（図８Ａ、レーン４）。これらの所見は、ＩＣＰ０お
よびｐ９５以外のウイルスタンパク質は、３時間ＩＣＰ１０ΔＰＫで感染させた
細胞では発現されないことを示し、これは、ＩＣＰ１０ＰＫが、ＩＥタンパク質
ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ２７の発現に必要であることを示唆する。実
際、感染の３時間後のＩＣＰ１０ΔＰＫ感染ＪＨＬａ１細胞（ＩＣＰ１０ＰＫ活
性を供給する）のタンパク質プロフィルは、事実上、ＨＳＶ−２感染細胞のもの
と同一である（図８Ａ、レーン７）。これらの３つのＩＥタンパク質は、初期お
よび後期ウイルス遺伝子発現の調節に関与するので（サックス（Sacks）ら、J.V
irol 55:796 05、1985；マッカーシー（Mc Carthy）ら、J.Virol.63:18-27、
1989；サマニエゴ（Samaniego）ら、J.Virol.69:5705-5715、1995；ディクソン （Dixon）およびシャファー（Schaffer）、J.Virol 36:189-203、1980；ライス
（Rice）ら、J.Virol.69:5550-5559、1995；レオパルディ（Leopardi）およびロ
イズマン（Roizman）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:4562- 576、1996）、ＩＣ
Ｐ１０ΔＰＫ感染細胞にそれが存在しないことにより、ウイルスタンパク質合成
および感染性ウイルス産生は完全に阻害される。

【００８１】 ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞でのＩＥタンパク質の合成をさらに調べるために、
５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下感染させ（６時間）、細胞を、１０μ
ｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む培地中、ＩＥ遺伝子発現は可能であるが、他
のウイルス遺伝子の発現は可能でない条件で、[^３５Ｓ]−メチオニンで３時間標
識した（ホーネス（Honess）およびロイズマン、J.Virol.14:8-19、1974；スト ルナッド（Strnad）およびオーリーリャン、Virology 73:244-258、1976）。Ｉ
ＣＰ４、ＩＣＰ１０、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ２７と一致するタンパ
ク質が、ＨＳＶ−２感染細胞で見られた（図９Ａ、レーン２）。これに対し、Ｉ
ＣＰ４、ＩＣＰ１０、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ２７は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細
胞では見られなかった（図９Ａ、レーン３）。ＩＣＰ０と一致する１１０ｋＤａ
タンパク質、およびｐ９５と一致する９５ｋＤａタンパク質が、ＩＣＰ１０ΔＰ
Ｋ感染細胞で見られたが（図９Ａ、レーン３）、そのレベルは、ＨＳＶ−２感染
細胞よりもそれぞれ２倍および３倍低かった（図９Ａ、レーン２）（それぞれ、
ＩＣＰ１０ΔＰＫおよびＨＳＶ−２感染細胞において、ＩＣＰ０では密度積分単
位１７６０および３５２０；ｐ９５およびＩＣＰ１０では７３３および２２００
）。免疫ブロットにより、１１０ｋＤａおよび９５ｋＤａタンパク質は、それぞ
れＩＣＰ０およびｐ９５であることが確認された（図９Ｂ、レーン１、２）。Ｈ
ＳＶ−２(Ｒ)のタンパク質プロフィルは、ＨＳＶ−２のものと類似していた（デ
ータは示していない）。これらのデータは、ＩＣＰ１０ＰＫは、ＩＣＰ４、ＩＣ
Ｐ２２、およびＩＣＰ２７の発現に必要であるが、ＩＣＰ０およびｐ９５の発現
には必要でなないことを支持する。

【００８２】 例９ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスは、ＩＣＰ４転写が欠損している

【００８３】 ノーザンハイブリダイゼーションを使用して、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞でＩ
ＣＰ４を検出できないのは、転写欠損に因るものかを調べた。ＲＮＡを、ＨＳＶ
−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)またはＨＳＶ−２(Ｒ)で感染させたＶｅｒｏ細胞
から得た。ＩＣＰ４またはＩＣＰ０ ＤＮＡを、プローブとして使用した。ＧＡ
ＰＤＨは、対照転写物として使用した。イソチオシアン酸グアニジニウム／塩化
セシウム勾配法を使用して、ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫまたはＨＳＶ−２( Ｒ)で感染（感染多重度＝２００）させたＶｅｒｏ細胞由来のＲＮＡを単離およ び精製した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは記載の通り行った（フ
ェング（Feng）ら、Antisense Nucleic Acid Development 6:25-35、1996）
。ハイブリダイゼーションは、４０％ホルムアミド、６×ＳＳＰＥ、２×デンハ
ート液、０.１％ＳＤＳ、および２５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する溶 液中、[^３２Ｐ]標識ＩＣＰ４、ＩＣＰ０またはＧＡＰＤＨプローブを用いて１６
時間４２℃で行った。ＩＣＰ４プローブは、ｐＸｈｏＩ−Ｃ由来の１.９ｋｂの ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントであった。ＩＣＰ０プローブは、ｐＩＧＡ１５
由来の１.７ｋｂのＮｒｕＩ−ＳａｌＩフラグメントであった（オハ（O'Hare） およびハイワード（Hayward）、J.Virol.53:751-760、1985）。ヒトＧＡＰＤＨ プローブは、オンコジーン・サイエンスから購入した４０−ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドであった（製造番号ＯＮ４０７）。プローブは、オリゴヌクレオチドキッ
ト（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、製造業者の指示に従
って、ランダムプライマー法により[^３５Ｐ]ｄＣＴＰ標識した。ブロットを、２
×ＳＳＣ−０.１％ＳＤＳ中で２回、０.１×ＳＳＣ−０.０１％ＳＤＳ中で１０ 分間２回、各々周囲温度で洗浄し、その後、０.１×ＳＳＣ−０.１％中５０℃で
１回洗浄し、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＩＣＰ４およびＩＣＰ
０ｍＲＮＡの相対存在量は、最初に各サンプルのＧＡＰＤＨｍＲＮＡの数値に規
格化することにより概算した。

【００８４】 ＩＣＰ４およびＩＣＰ０ｍＲＮＡは両方共、ＨＳＶ−２（図１０Ａ、レーン１
、２）またはＨＳＶ−２(Ｒ)（図１０Ａ、レーン５、６）で３時間感染させたＶ
ｅｒｏ細胞で見られた。ＨＳＶ−２感染細胞におけるＩＣＰ４発現の動態は、Ｈ
ＳＶ−１感染細胞で以前に記載されたものと類似していた。最適レベルが、感染
の３時間後に見られ（図１０Ｃ、レーン２）、転写物は、感染の８時間後にはも
はや検出できなかった（図１０Ｃ、レーン４）。これに対し、ＩＣＰ４ｍＲＮＡ
は、ＩＣＰ１０ΔＰＫで３時間感染させた細胞では見られなかった（図１０Ａ、
レーン３）。しかし、感染の８時間後までに（図１０Ｂ、レーン３）、そのレベ
ルはＨＳＶ−２感染細胞で初期（感染の３時間後）に見られたものと類似してい
た（図１０Ｃ、レーン２）。転写物は、感染の２０時間後にはもはや見られなか
った（図１０Ｂ、レーン６）。ＩＣＰ１０ΔＰＫで３時間感染させた細胞は、Ｉ
ＣＰ０ｍＲＮＡについては陽性であったが（図１０、レーン４）、その相対存在
量（ＩＣＰ０／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡとして表す）は、ＨＳＶ−２感染細胞におけ
るものより３倍低かった（それぞれ０.３２および１.０）。データにより、ＩＣ
Ｐ１０ＰＫはＩＣＰ４の初期転写に必要とされ、ＩＣＰ０の最適転写に寄与する
ことが示される。

【００８５】 例１０ＩＣＰ１０ＰＫは、宿主細胞遺伝子発現および細胞溶解の阻害に役割を果たす

【００８６】 ＩＣＰ１０ΔＰＫプラークの形態は、不完全細胞溶解と一致する。ＩＣＰ２７
は、宿主タンパク質合成の遮断に役割を果たし（ハードウィック（Hardwicke） ら、J.Virol.68:4797-4810、1994）、感染後８〜１２時間、ＩＣＰ１０ΔＰＫで
感染させた細胞では発現されないので、我々はまた、ＨＳＶ−２またはＩＣＰ１
０ΔＰＫで感染させた細胞における宿主細胞遺伝子（アクチン）の発現を調べた
。Ｖｅｒｏ細胞は、偽感染させるか、または感染多重度２００で、ＨＳＶ−２ま
たはＩＣＰ１０ΔＰＫで感染させ、抗アクチン抗体での免疫ブロットによりアク
チン発現についてアッセイした。アクチンは、感染後３時間という初期にはＨＳ
Ｖ−２感染細胞には見られなかった（図８Ｃ、レーン２）。これに対し、ＩＣＰ
１０ΔＰＫで感染させた細胞のアクチンレベル（図８Ｃ、レーン３）は、感染後
１２時間という後期で偽感染細胞（図８Ｃ、レーン１）のものと類似していた。
これらの所見は、細胞変性効果（ＣＰＥ）は、代償性機能が実行される、感染後
１５〜２０時間までは、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞で見られないという観察と一
致する。

【００８７】 例１１ＩＣＰ１０およびｐ９５タンパク質の細胞内局在化

【００８８】 ＨＳＶ−２で８および１２時間感染させた細胞に関する以前の研究により、Ｉ
ＣＰ１０は、細胞質に局在し、細胞骨格とも会合していることが示されていた（
チュンら、J.Virol.63:3389-3398、1989）。しかし、８時間以下感染させた細胞
は研究されなかった。ＩＣＰ１０ＰＫは、８時間より前にＩＥ遺伝子発現に必要
とされるので、この時点でこれも核に存在するのかという疑問が生じる。ＨＳＶ
−２またはＨＳＶ−２(Ｒ)で３、６、または９時間感染させたＶｅｒｏ細胞を、
ＭＡｂ３０（ＩＣＰ１０アミノ酸１０６−１７８を認識する）による免疫蛍光で
染色した。ＩＣＰ１０ΔＰＫで同じように感染させた細胞を、抗ＬＡ−１抗体（
ＩＣＰ１０アミノ酸１３−２６を認識する）で染色した。強力な核内染色が、Ｈ
ＳＶ−２で３時間感染させた細胞で見られた（図１１Ａ）。それは、以前にウイ
ルス複製コンパートメントで記載したのと類似した別々の球状構造（顆粒）から
なる点状外観を有していた（ライスら、J.Virol.68:988-1001、1994；ミューレ ンら、J.Virol.68:3250-3266、1994）。感染後、染色は、以前にＩＣＰ１０で記
載した特徴的な核周囲および拡散細胞質パターンを示した（図１１Ｂ、Ｃ）。類
似の染色パターンが、ＨＳＶ−２(Ｒ)で見られた（データは示していない）。こ
れに対し、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞では、染色は、感染後９時間前には見られ
ず（図１１Ｄ、Ｅ）、その時点では細胞質にのみ局在していた（図１１Ｆ）。核
染色も、感染の１２または１５時間後、ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞では見られな
かった（データは示していない）。これらの所見により、ＩＣＰ１０のＰＫドメ
インは、感染初期の核局在化に必要であることが示唆される。

【００８９】 例１２ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスは、感染動物で増殖させるために弱毒化される

【００９０】 我々は、インビボでウイルス増殖におけるＩＣＰ１０ΔＰＫの役割を調べるた
めに、ＨＳＶ−２感染のマウス足蹠モデルを使用した。スイス−ウェブスターマ
ウスの足蹠に、５×１０^６ｐｆｕのＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)または
ＨＳＶ−２(Ｒ)と称される回復ウイルスを、皮下接種した。神経学的症状および
重度の皮膚病変が、ＨＳＶ−２またはＨＳＶ−２(Ｒ)を投与したマウスで見られ
、感染後６日目に始まった。ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染マウスは、神経学的症状も皮
膚病変も全く示さなかった。ＨＳＶ−２およびＨＳＶ−２(Ｒ)が、感染後７〜９
日間、足蹠および神経節ホモジネートから単離された。ＩＣＰ１０ΔＰＫは、感
染後４日間単離されたのみであった。最大力価は、ＨＳＶ−２よりもＩＣＰ１０
ΔＰＫで低く（ＩＣＰ１０ＰＫおよびＨＳＶ−２でそれぞれ４.３×１０^４およ び３×１０^７ｐｆｕ）、ウイルスを産生する潜伏感染神経節の比率は、ＨＳＶ−
２およびＨＳＶ−２(Ｒ)で９０％および８０％であり、これに対し、ＩＣＰ１０
ΔＰＫでは１０％であった（表３）。これらのデータにより、ＩＣＰ１０ＰＫは
、急性感染、および直接的または間接的に潜伏再活性化／確立に関与しているこ
とが示唆される。

【００９１】

【表３】

【００９２】 例１３ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスは、ＨＳＶ−２攻撃から防御する

【００９３】 １０匹のマウスの２グループ各々を、それぞれ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
で偽感染させるか、またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)（５×１０^５〜１×１０^６ｐ
ｆｕ）で足蹠への１回の皮下注射により感染させた。それらに、全く目に見える
症状は発達しなかった。感染後１６日目に、それらに、１×１０^７ｐｆｕのＨＳ
Ｖ−２で攻撃した。ＰＢＳグループの全マウスに、腫脹および発赤からなる病変
が発達し、感染後５日目に初めて目に見え、ウイルス（ＨＳＶ−２）が、１０／
１０感染マウスの足蹠から単離された。感染後１５日目に、ＰＢＳグループの５
／１０（５０％）のマウスに麻痺が発達した。ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスで免疫
化したマウスに、ＨＳＶ−２攻撃後、目に見える病変は発達しなかった。ウイル
スが、３／１０（３０％）の動物の足蹠から単離された。ウイルスは、ＩＣＰ１
０ΔＰＫ免疫化マウスの７／１０（７０％）の足蹠から単離された。

【００９４】

【表４】

【００９５】 これらの所見は、比較的少量のＩＣＰ１０ΔＰＫが、高用量のＨＳＶ−２によ
る攻撃から防御することを示す。病変発達に関して完全な防御が得られ、皮膚病
変が全ての非免疫化マウスで見られたが、免疫化マウスでは病変は全く見られな
かった。非免疫化マウスは、ウイルス複製から防御されず、ウイルスは、攻撃後
５日目に全ての動物から単離された。免疫化マウスは防御され、ウイルスは動物
の僅か３／１０（３０％）から単離された。ウイルスが単離された３匹の動物に
検出可能な病変がなかったことは、おそらく、比較的低い力価を反映するもので
あり、これは、免疫により１００％の防御レベルが得られないとしても、攻撃ウ
イルスの力価は減少したこととを示唆する。

【００９６】 例１４ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスはＨＳＶ特異的免疫を誘導する

【００９７】 ４匹のマウスの２つのグループ各々に、ＨＳＶ−２またはＩＣＰ１０ΔＰＫ( ＲＦ)（１×１０^６ｐｆｕ）を、足蹠に皮下注射して免疫化した。感染後２４日 目に、脾臓を取り出し、Ｔ細胞を、我々が以前に記載したように（ヴァクスマン
（Wachsman）ら、Bioscience Reports、8:323-334、1985；ヴァクスマンら、J.
Inf.Dis.159:625-34、1989；ヴァクスマンら、Vaccine 10:447454、1992）、Ｈ
ＳＶ−２抗原と共にリンパ球増殖アッセイに使用した。このアッセイは、ＨＳＶ
特異的記憶の発達を測定する。ウイルス抗原（偽抗原）と平行して調製した非感
染細胞抽出物を、特異性対照として使用した。図１２に示すように、ＨＳＶ特異
的免疫は、ＩＣＰ１０ΔＰＫウイルスにより誘導された。応答は、同条件下でＨ
ＳＶ−２で見られた応答よりも僅か２〜３倍低いだけであった。

【００９８】 例１５ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)よりも弱毒化されている

【００９９】 ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)は、培養細胞においてＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)よりも
弱毒化されているようであるので、我々は、同じことが感染動物にも当てはまる
かを問うた。我々は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)で使用したものと同じマウス足蹠
モデルを使用した。ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)ウイルスの増殖減少［ＩＣＰ１０Δ
ＰＫ(ＲＦ)と比較して］を少なくとも部分的に補うために、マウスに、１×１０ ^７ ｐｆｕのウイルスを注射し、釣合った量のＨＳＶ−２を対照として使用した。
足蹠から単離したＨＳＶ−２の力価は、５×１０^６ｐｆｕを投与したマウスに見
られた力価よりも有意に高くはなかった（例１２）。これに対し、単離ＩＣＰ１
０ΔＰＫ(ＣＳ)の力価は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)の力価よりも低く、ウイルス
は、感染後４日間に対して、３日間しか単離されなかった。潜伏感染神経節の比
率は、ＨＳＶ−２とＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ）感染動物で１００％および０％で あった（表５）。

【０１００】

【表５】

【０１０１】 例１６ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)よりもＨＳＶ−２攻撃から 強く防御する。

【０１０２】 我々は、足蹠モデルを使用して、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)による防御を調べた
。実験は、マウスを１×１０^７ｐｆｕのウイルスで免疫化し、野生型ＨＳＶ−２
で攻撃する前に３回免疫化（１４〜１６日間隔で）する以外は、以前にＩＣＰ１
０ΔＰＫ(ＲＦ)で記載した通り実施した。攻撃は、１×１０^８ｐｆｕのＨＳＶ−
２で行い、最後の免疫化の３週間後に実施した。ＰＢＳグループの全マウスに、
皮膚病変が発達し、それからウイルスが単離され、８／１０匹が攻撃後８〜１３
日目に死亡した。これに対し、免疫化マウスのいずれにも病変は見られず、ウイ
ルスも単離されなかった（表６）。これらの所見は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)ウ
イルスは、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)ウイルスよりも優れたワクチン能を有し、幾
分より弱毒化されているが優れた防御を提供することを示す。後者は、ＩＣＰ１
０ΔＰＫ(ＲＦ)で免疫化した動物（ここでウイルスは３／１０マウスから単離さ
れた）で使用したＨＳＶ−２の力価より１０倍高い力価で攻撃したが、ウイルス
は、いずれの動物からも単離されなかったという所見により明示される（例１３
）。

【０１０３】

【表６】

【０１０４】 例１７ＩＣＰΔＰＫ(ＣＳ)ウイルスは、ＨＳＶ特異的免疫を誘導する

【０１０５】 ３匹のマウスのグループに、例１６に記載のように、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)
（１×１０^７ｐｆｕ、３回注射）で免疫化した。最後の注射から２週間後、脾臓
を取り出し、Ｔ細胞を例１４のように実施したリンパ球増殖アッセイに使用した
。ＨＳＶ特異的リンパ増殖が全動物で見られた。増殖レベル（図１３）は、以前
に見られたものより有意に高く（図１２）、マイトジェンＰＨＡで見られたもの
より約３倍高かった。これらの所見は、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)は、良好なレベ
ルのウイルス特異的Ｔ細胞応答を誘導することを示す。

【０１０６】 本明細書で引用した全ての参考文献は、その全体を参考としてここに援用する
。

【０１０７】 本発明は、詳細に、そしてその具体的な実施形態に関して記載したが、様々な
変更および修飾を、その精神および範囲から逸脱することなく実施し得ることは
当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ａ．ＩＣＰ１０ΔＰＫ ＤＮＡの概略図。オリゴプローブＡＵ２６は、ＨＳＶ
−２またはＨＳＶ−２(Ｒ)ＤＮＡ由来の７.６ｋｂＢａｍＨＩ Ｅフラグメント およびＩＣＰ１０ΔＰＫ ＤＮＡ由来の２.２ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを認 識する。 Ｂ．ＢａｍＨＩで消化したＩＣＰ１０ΔＰＫ（レーン１）、ＨＳＶ−２（レーン
２）、またはＨＳＶ−２(Ｒ)（レーン３）ＤＮＡの、ジゴキシゲニン標識ＡＵ２
６オリゴプローブとのサザンブロットハイブリダイゼーション。サイズマーカー
は右端に示す。類似の結果が、ＩＣＰ１０ΔＰＫ系統ＲＦおよびＣＳで得られた
。

【図２】 ＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞由来のｐ９５タンパク質の発現およびＰＫ活性。 Ａ．Ｖｅｒｏ細胞を、ＨＳＶ−２（レーン１、４）、ＩＣＰ１０ΔＰＫ（レーン
２）、またはＨＳＶ−２(Ｒ)（レーン３）で感染させ、感染後６〜１６時間[^{３ ５} Ｓ]−メチオニンで標識し、抽出物を、ＩＣＰ１０（レーン１〜３）または前 免疫血清（レーン４）に特異的な抗ＬＡ−１抗体を用いて免疫沈降させた。 Ｂ．１６時間、ＨＳＶ−２（レーン１、４）、ＩＣＰ１０ΔＰＫ（レーン２）ま
たはＨＳＶ−２(Ｒ)（レーン３）で感染させたＶｅｒｏ細胞由来の抽出物の抗Ｌ
Ａ−１抗体（レーン１〜３）または前免疫血清（レーン４）との免疫複合体ＰＫ
アッセイ。 Ｃ．パネルＢの免疫沈降物を、抗ＬＡ−１抗体で免疫ブロットした。類似の結果
が、ＩＣＰ１０ΔＰＫ系統ＲＦおよびＣＳで得られた。

【図３】 指数関数的および増殖抑制的条件下でのウイルス増殖。１０％血清（●）また
は０.５％血清（△）中で増殖させたＶｅｒｏ細胞を、感染多重度２で、ＨＳＶ −２、ＩＣＰ１０ΔＰＫ、またはＨＳＶ−２(Ｒ)で感染させた。ウイルス力価は
、感染の２〜３６時間後にアッセイした。結果はＰＦＵ／細胞（バーストサイズ
）として表す。

【図４】 高感染多重度で感染させたＶｅｒｏ細胞の細胞外および細胞内ウイルス力価。
指数関数的Ｖｅｒｏ細胞を、感染多重度２００で、ＨＳＶ−２(Ａ)またはＩＣＰ
１０ΔＰＫ(Ｂ)で感染させ、細胞内（△）および細胞外（●）ウイルス力価を、
感染の２〜３６時間後に決定した。

【図５】 ２つのＩＣＰ１０ΔＰＫ系統で感染させた分裂中の細胞のウイルス増殖。Ｖｅ
ｒｏ細胞を、１０％血清と共に培地中で増殖させ、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)（●
）またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)（▲）で感染させた。感染は、感染多重度２（
パネルＡ）または２００（パネルＢ）であった。ウイルス力価は、感染の２〜３
５時間後に決定し、結果は、ＰＦＵ／細胞（バーストサイズ）で表す。

【図６】 ＩＣＰ１０を構成的に発現する細胞におけるＩＣＰ１０ΔＰＫウイルス増殖。
ＩＣＰ１０を構成的に発現するＪＨＬａ１細胞（パネルＡ）、またはＪＨＬａ１
系の確立に使用した２９３細胞（パネルＢ）を、感染多重度２００で、ＨＳＶ−
２（△）またはＩＣＰ１０ΔＰＫ系統ＲＦ（●）で感染させた。ウイルス力価は
、感染の２〜２０時間後にアッセイした。結果は、ＰＦＵ／細胞（バーストサイ
ズ）として表す。類似の結果が、ＪＨＬａ１細胞のＩＣＰ１０ΔＰＫ系統Ｃで得
られた。

【図７】 ＩＣＰ１０ΔＰＫの吸着／浸透動態。Ｖｅｒｏ細胞を、２００ｐｆｕのＨＳＶ
−２（●）、ＩＣＰ１０ΔＰＫ（○）またはＨＳＶ−２（Ｒ）（◇）に、０、１
０、３０、６０、９０、１２０分間曝露させ、ＭＥＭ１０％血清および０.３％ ＩｇＧをのせ、３７℃で４８時間、再度インキュベートし、プラーク形成につい
て評価した。データは、最初の接種の％として提示する。類似の結果が、ＩＣＰ
１０ΔＰＫ系統ＲＦおよびＣＳで得られた。

【図８】 ＨＳＶ−２およびＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞のタンパク質プロフィル。 Ａ．Ｖｅｒｏ細胞（レーン１〜６、８）を、偽感染（レーン１）させるか、また
はＨＳＶ−２（レーン２、４）、ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)（レーン３、５、６）
またはＨＳＶ−２（Ｒ）（レーン８）で感染させ、 [^３５Ｓ]−メチオニンで、
感染後２〜３時間（レーン１〜３、８）、感染後７〜８時間（レーン４、５）、
または感染後１１〜１２時間（レーン６）標識した。ＩＣＰ１０ΔＰＫで感染さ
せ、感染後２〜３時間[^３５Ｓ]−メチオニンで標識したＪＨＬａ１細胞のタンパ
ク質プロフィルを、対照として使用した（レーン７）。細胞抽出物由来のタンパ
ク質を、８.５％ＳＤＳアクリルアミドゲル上でＰＡＧＥにより分離した。 Ｂ．感染後３時間（レーン１、２）または８時間（レーン３）、ＩＣＰ１０ΔＰ
Ｋ(ＲＦ)で感染させた細胞の抽出物を、ＩＣＰ０ ＭＡｂ（レーン１）、ＩＣＰ
１０に対するＬＡ−１抗体（レーン２）またはＩＣＰ４ ＭＡｂ（レーン３）で
免疫ブロットした。 Ｃ．偽感染（レーン１）、ＨＳＶ−２で３時間（レーン２）、またはＩＣＰ１０
ΔＰＫで１２時間感染させた、Ｖｅｒｏ細胞の抽出物を、アクチンに対する抗体
で免疫ブロットした。

【図９】 ＨＳＶ−２およびＩＣＰ１０ΔＰＫ感染細胞におけるＩＥタンパク質合成。 Ａ．Ｖｅｒｏ細胞を、偽感染（レーン１）させるか、またはＨＳＶ−２（レーン
２）またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)（レーン３）で、５０μｇ／ｍｌシクロヘキ
シミドの存在下感染させ（６時間）、１０μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含む
培地中、３時間、[^３５Ｓ]−メチオニンで標識した。タンパク質を、８.５％Ｓ ＤＳアクリルアミドゲル上でＰＡＧＥにより分離した。 Ｂ．ＩＣＰ０ ＭＡｂ（レーン１）およびＩＣＰ１０に対する抗ＬＡ−１抗体（
レーン２）との、パネルＡのレーン２、３の抽出物の免疫ブロット。

【図１０】 ＩＣＰ１０ΔＰＫで感染させた細胞におけるＩＣＰ４およびＩＣＰ０ ｍＲＮ
Ａ合成。ＲＮＡを、ＨＳＶ−２（ＨＳＶ）またはＩＣＰ１０ΔＰＫ（ΔＰＫ）ま
たはＨＳＶ−２(Ｒ)(Ｒ)で、記載のように３時間（パネルＡ）、０〜２０時間（
パネルＢ）または１〜８時間（パネルＣ）感染させたＶｅｒｏ細胞から抽出した
。それを、[^３２Ｐ]標識ＩＣＰ４（４）またはＩＣＰ０（０）ＤＮＡプローブま
たはＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチド（パネル下）とハイブリダイズさせた。分子
量マーカーは端に示す。

【図１１】 ＨＳＶ−２（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）またはＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＲＦ)（パネルＤ、
Ｅ、Ｆ）で、３時間（パネルＡ、Ｄ）、６時間（パネルＢ、Ｅ）、または９時間
（パネルＣ、Ｆ）感染させ、ＭＡｂ３０（パネルＡ〜Ｃ）またはＩＣＰ１０に対
する抗ＬＡ−１抗体で染色したＶｅｒｏ細胞の間接的免疫蛍光染色。

【図１２】 ＩＣＰ１０ΔＰＫ（系統ＲＦ）で免疫化したマウスの脾臓細胞のＨＳＶ特異的
リンパ増殖応答。マウスに、１×１０^６ｐｆｕのＨＳＶ−２またはＩＣＰ１０Δ
ＰＫ（ΔＰＫ）を皮下注射した。脾臓を、感染後２４日目に集め、[^３Ｈ]−Ｔｄ
Ｒ取り込み（ｃｐｍ）についてアッセイした。結果は、ＨＳＶ刺激培養物のｃｐ
ｍ−偽抗原で刺激した培養物のｃｐｍとして表現する。

【図１３】 ＩＣＰ１０ΔＰＫ（系統ＣＳ）で免疫化したマウスの脾臓細胞のＨＳＶ特異的
リンパ増殖応答。マウスに、１×１０^７ｐｆｕのＩＣＰ１０ΔＰＫ（ΔＰＫ）を
３回皮下注射した。脾臓を、最後の注射後１４日目に集め、ＨＳＶ−２または偽
抗原またはマイトジェンＰＨＡと共に培養後、[^３Ｈ]−ＴｄＲ取り込み（ｃｐｍ
）についてアッセイした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA02 CA09 DA02 EA02 HA13 HA14 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC20 BC01 BD50 CA45 4C085 AA03 BA78 DD88 GG04 GG05 GG08

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単純ヘルペスウイルス−２ＩＣＰ１０ΔＰＫ(ＣＳ)および薬
   学的に許容される担体または希釈剤を含むワクチン組成物。
2. 【請求項２】 被検者に請求項１のワクチン組成物を投与して、単純ヘルペ
   スウイルスに対して該被検者を免疫化する方法。
3. 【請求項３】 請求項１のワクチン組成物を投与することを含む、被検者に
   単純ヘルペスウイルスに対する免疫を与える方法。
4. 【請求項４】 請求項１のワクチン組成物を投与することを含む、単純ヘル
   ペスウイルスに関連した被検者の臨床症状を防ぐ方法。
5. 【請求項５】 前記被検者はヒトである、請求項２、３、または４の方法。
6. 【請求項６】 前記ワクチンの投与量の範囲は１〜１００ミリオンｐｆｕで
   ある、請求項５の方法。
7. 【請求項７】 前記ワクチン組成物は、鼻腔内、経口、膣内、皮下または皮
   内経路を介して投与される、請求項５の方法。