DE69912925T2

DE69912925T2 - Impfstoffzusammensetzung gegen herpes simplex virus und methoden zur verwendung

Info

Publication number: DE69912925T2
Application number: DE69912925T
Authority: DE
Inventors: Laure Aurelian
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1998-01-16
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2019-01-16
Also published as: EP1047446A1; AU2231299A; AU742281B2; CA2318439A1; EP1047446B1; PT1047446E; DE69912925D1; ATE254474T1; ES2212521T3; JP2002509113A; EP1047446A4; DK1047446T3; US6054131A; WO1999036084A1; US6207168B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Herpes Simplex Virus (HSV) ist ein gut untersuchtes Virus. Beide voneinander unterscheidbaren Serotypen des Herpes Simplex Virus (HSV 1 und HSV 2) verursachen Infektionen und Krankheiten, die von relativ harmlosen Fiberbläschen auf den Lippen bis zu gravierenden Genitalinfektionen und generalisierten Infektionen Neugeborener reichen können. HSV 1 und HSV 2 sind auf DNA-Ebene zu 50% homolog und polyklonale Antikörper und MAbs gehen z. B. gegenüber gemeinsamen Epitopen jeweils eine Kreuzreaktion miteinander ein.
HSV 1 und HSV 2 weisen RR1-Proteine auf (jeweils als ICP6 und ICP10 bezeichnet), welche eine einzelne aminoendständige Domäne enthalten. Die einzelne HSV 2-Domäne kodiert für eine Ser/Thr-spezifische PK mit auto- und transphosphorylierender Aktivität und weist eine Transmembran-Domäne (TM) auf. Sequenzen, die für die PK-Domäne kodieren verursachen eine neoplastische Transformation und sind mit Gebärmutterhalskrebs assoziiert (HSV 2-Onkogen). Die einzelne endständige Domäne des RR1-Proteins (ICP6) von HSV 1 hat auch PK-Aktivität, unterscheidet sich aber sowohl strukturell als auch funktionell von der des HSV 2-Onkoproteins.
Ursprüngliche Untersuchungen, welche unter Bedingungen eines enzymatischen Tests ähnlich denen für die ICP10-PK verwendeten stattfanden, kamen zu dem Schluss, dass ICP6 über keine PK-Aktivität verfügt, obwohl die einzelne Domäne erhalten blieb (Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398. 1989). Dies war nicht unerwartet, da die Sequenz der einzelnen PK-Domäne nur eine Homologie von 38% zeigte (Nikas et al., Proteins: Structure, function and genetics 1: 376–384, 1986). Weitere Untersuchungen zeigten, dass ICP6 über PK-Aktivität verfügt, jedoch nur unter anderen Bedingungen. Über seine Fähigkeit, andere Proteine zu transphosphorylieren, gibt es widersprüchliche Ergebnisse (für einen Überblick über das Problem, siehe: Peng et al., Virology 216: 184–196, 1996; insbesondere Tabelle 1). Der Grund für die unterschiedlichen PK-Aktivitäten der ICP6- und ICP10-Proteine ist wahrscheinlich darin zu sehen, dass die ATP-Bindungsstellen der ICP6-PK vom Rest der katalytischen Strukturen entfernt angeordnet sind (Cooper et al., J. Virol. 69: 4979–4985. 1995). ICP6 weist auch keine funktionelle TM-Domäne auf und ist nicht lokal auf die Zelloberfläche beschränkt (Conner et al., Virology 213: 615, 1995). Die PK-Aktivität von nativem ICP6 ist selbst unter idealen Bedingungen sehr schwach, so dass sein K_M um das 10-fache größer ist als derjenige bei ICP10-PK (Peng et al., Virology 216: 184,1996).
Die Transformations-Aktivität von ICP6 sitzt innerhalb eines Genomfragments, das von dem, auf welchem das HSV 2-Onkogen sitzt, beabstandet ist. Die Transformation in diesem System ist morphologisch (fokusbildende Fähigkeit).
Es ist bereits früher gezeigt worden, dass DNA-Sequenzen, die für das aminoendständige Drittel von ICP10 (Aminosäuren 1–417) kodieren, über ein onkogenes Potential verfügen. Mit diesen DNA-Sequenzen transfizierte Zellen zeigen ein Wachstum unabhängig von der Verankerung und verursachen in Tieren Tumoren. Eine Transformation wird sowohl in Nagerzellen als auch in menschlichen Zellen beobachtet (Jariwalla et al., PNAS 77: 2279– 2283, 1980: Hayashi et al., PNAS 82: 8493–8497, 1985; Smith et al., Virology 200: 598–612, 1994; Hunter et al., Virology 210: 345–360, 1995).
Innerhalb der Aminosäuren 1–411 von ICP10 gibt es drei funktionelle Domänen: (i) eine intrazelluläre Domäne bei den Aminosäuren 106–411, welche die katalytische Domäne für PK mit acht konservierten katalytischen Funktionen (Aminosäuren 106–411) umfasst, (ii) eine TM-Domäne bei den Aminosäuren 88–105 und (iii) eine extrazelluläre Domäne bei den Aminosäuren 1–88 (Chung, et al. J. Virol. 63: 3389–3395, 1989; Virology 179: 168–178, 1990). Die für die PK-Aktivität benötigte minimale Größe sind die Aminosäuren 1–283 (pp29^lal) (Luo et al. J. Biol. Chem. 266: 20976–20983, 1991). Die PK-Aktivität von pp29^lal weist jedoch einige sich von der echten ICP10-PK unterscheidende Eigenschaften auf, vermutlich weil ein Teil der für PK katalytischen Domäne VI fehlt (Luo et al. J. Biol. Chem, 266: 20976–20983, 1991). Die TM-Domäne ist ebenfalls für die PK-Aktivität erforderlich (jedoch unzulänglich) (Luo and Aurelian. J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992). Es kann daher geschlossen werden, dass die PK-Aktivität innerhalb der Aminosäuren 88–411 sitzt, mit einem essentiellen Kern bei den Aminosäuren 88–283.
Der einzelne HpaI-Ort innerhalb des für ICP10 kodierenden Bereichs stellt das 3'-Ende des transformierenden Bereichs dar ((Jariwalla et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77: 2279–2283, 1980) und schneidet das Gen nach dem Codon für die Aminosäure 417. Es ist nicht bekannt, ob pp29^lal über transformierende Aktivität verfügt. PK-Aktivität ist jedoch für ein neoplastisches Potential erforderlich. PK-negative Mutanten transformieren keine Zellen. Dies trifft auch für eine Mutante mit einer Deletion in der TM-Domäne und ortsgerichteten Mutanten in den ATP-Bindungsstellen (Lys¹⁷⁶ und/oder Lys²⁵⁹) oder der Ionen-Bindungsstelle (Glu²⁰⁹) zu (Smith et al., Virology 200: 598–612.1994).
Weil eine PK-Mutante mit nur einer Mutation in der TM-Domäne über keine Transformationsaktivität verfügt (Smith et al., Virology 200: 598–612. 1994), sind DNA-Sequenzen, welche für die ICP10-Aminosäuren 106–411 kodieren, aber keine PK-Aktivität aufweisen, an sich nicht neoplastisch. Dies zeigt, dass; (i) das HSV 2-Onkoprotein innerhalb der ICP10-Aminosäuren 1–411 lokalisiert ist und (ii) ein neoplastisches Potential eine funktionelle PK-Aktivität benötigt.
Die Funktion der PK von ICP10 beim Wachstum/Pathogenese von Viren ist unbekannt.
Das HSV 2-ICP10-Protein weist an sich eine PK-Aktivität auf. Dies wurde gezeigt, indem nachgewiesen wurde, dass die ICP10-PK-Aktivität durch ortsgerichtete Mutagenese verloren geht. Das Onkogen weist auch an den Positionen 140, 149 und 396 SH3-Bindungsstellen auf, welche für die Wechselwirkung mit Signal-Proteinen benötigt werden. Diese Wechselwirkung ist für eine Transformationsaktivität notwendig. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde verwendet, um die Aminosäuren zu identifizieren, die für die Kinaseaktivität und die Wechselwirkung mit Signalproteinen erforderlich sind. Mutationen von Lys¹⁷⁶ oder Lys²⁵⁹ verminderten die PK-Aktivität (um das 5- bis 8-fache) sowie die Bindung des ¹⁴C-markierten ATP-Analogen p-Fluorosulfonylbenzoyl-5'-Adenosin (FSBA), beseitigten sie jedoch nicht. Durch Mutation beider Lys-Reste wurden die enzymatische Aktivität und die FSBA-Bindung beseitigt, was nahe legt, dass einer der beiden ATP binden kann. Eine Mutation von Glu²⁰⁹ (PK katalytische Aktivität III) beseitigte praktisch die Kinase-Aktivität in Gegenwart von Mg²⁺- und Mn²⁺-Ionen, was nahe legt, dass die Funktion von Glu²⁰⁹ auf einer ionenabhängigen PK-Aktivität beruht.
Die ICP10-PK fungiert als ein bei der Signalübertragung mitwirkender Rezeptor für einen Wachstumsfaktor und bindet in vitro das Adaptorprotein Grb₂. Die SH3-Bindungsstellen innerhalb der ICP10-PK-Domäne (an den Positionen 140, 149 und 396) werden für die Wechselwirkung mit Signalproteinen und damit auch für die Transformation benötigt (Nelson et al., J. Biol. Chem. 271: 17021–17027, 1996). Eine Mutation der prolinreichen Sequenzen von ICP10 an den Positionen 396 und 149 reduzierte die Grb₂-Bindung um das 20- bzw. zweifache. Durch Mutation beider Aminosäuren wurde die Bindung unterbunden. Die Grb₂-Bindung an Wildtyp-ICP10 konkurrierte mit einem Peptid für die C-terminalen SH3-Bindungsstellen von Grb₂, was darauf hinwies, dass es mit den C-terminalen SH3-Bindungsstellen von Grb₂ zu tun hat (Nelson et al., J. Biol. Chem. 271: 17021–17027, 1996).
Die katalytische Domäne von ICP10-PK enthält an den Positionen 106–178 auch Aminosäuren, die für die Bindung eines Down-Regulators der PK-Aktivität (ras-GAP) verantwortlich sind. Eine Deletion der Aminosäuren 106–178 vermindert die PK-Aktivität, beseitigt sie jedoch nicht (Luo and Aurelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992). Sie unterdrückt jedoch die Bindung von ras-GAP, wodurch sich das Transformationspotential erhöht.
Die Konstruktion eines Virus für ICP10-PK wird von Peng und anderen beschrieben (Virology 216, 184–196, 1996). Kurz gefasst werden die Wildtyp-Sequenzen in einem Plasmid (TP101), das die HSV 2-BamHI E- und T-Fragmente enthält, durch das 1,8 kb SaII/BgIII-Fragment von pJHL9 ersetzt. pJHL9 ist ein Plasmid, das die ICP10-Mutante mit Deletion der katalytischen PK-Domäne enthält (Luo and Aurelian. J. Biol. Chem. 267: 9645– 9653, 1992). Das erhaltene Plasmid, TP9, enthält Sequenzen, die für ICP10 mit Deletion in der katalytischen PK.-Domäne kodieren, welche am 5'- bzw. 3'-Ende von 4 und 2,8 kb DNA-Sequenzen von HSV 2 flankiert werden. Das 10 kb HindIII/EcoRI-Fragment von TP9 wurde mittels Markertransfer in ein Virus (ICP10ΔRR) eingeschleust, in welchem die RR-Domäne von ICP10 durch das LacZ-Gen ersetzt worden war. Das resultierende rekombinante Virus mit der Bezeichnung ICP10ΔPK wurde erhalten, indem nach Anfärbung mit X-Gal weiße Plaques auf einem Hintergrund von blauen Plaques selektiert wurden. Einige wenige weiße Plaques wurden ausgesondert und gereinigt. Zwei davon ließ man in Vero-Zellen mit 10% Serum (exponentielles Wachstum) zu verschiedenem, jeweils mit RF bzw. CS bezeichnetem, Stammmaterial heranwachsen.
Im Stand der Technik gibt es einige bekannte Impfstoffe gegen HSV. Die US-Patente 4,347,127; 4,452,734; 5,219,567 und 5,171,568 lehren jeweils Spalt-Impfstoffe, die gegen einen HSV 2-Infektion einen gewissen Schutz gewähren. Diese Impfstoffe sind jedoch einem Vakzin unterlegen, in welchem ein teilweise abgetötetes Virus verwendet wird. Die von einem Spalt-Impfstoff hervorgerufene Immunität ist jedoch auf das durch die immunogene Untereinheit dargestellte besondere Protein beschränkt, welches möglicherweise keine genügende Schutzwirkung entwickeln kann. Darüber hinaus ist es nicht replizierend und es gibt daher keine Amplifikation des Proteins, was die Immunogenität weiter herabsetzen würde. Diese Probleme tauchen bei jedem Spaltvakzin auf, unabhängig davon, ob das Herstellungsverfahren über ein rekombinantes Protein oder über die Reinigung eines Antigens aus dem Virus erfolgt.
Ein kreuzrekombinantes Vakzin, wie es z. B. in der US 4,554,159 offenbart wird, macht nicht die Probleme der Spalt-Vakzine, enthält jedoch das in HSV 2 vorkommende Onkogen. Falls nichts unternommen wird, um das Onkogen aufzuspüren und zu zerstören, würde der kreuzrekombinante Impfstoff in einer geimpften Person Krebs hervorrufen.
Die Kreuzrekombinante von '159 ist temperaturempfindlich. Avirulenz lässt sich erhalten, wenn nach der Temperatur-Widerstandsfähigkeit selektiert wird, die Temperatur der Maus beträgt jedoch 39°C, während die des Menschen bei 37°C liegt. Diese Temperaturempfmdlichkeit könnte bei einem Impfstoff sehr wohl eine derartige gegenseitige Problematik hervorrufen. Ein besseres Verfahren zur Selektion einer Avirulenz ist in der Entfernung von Genen zu sehen, welche für die Virulenz kodieren, ohne durch die Temperatur beeinflusst zu werden, bei welcher die Virus-Replikation stattfindet. Der Einsatz von prototypischen Kreuzungsprodukten würde ebenfalls die Verwendung von Mutanten mit Gendeletionen oder -insertionen ausschließen.
Infolge der vielen hinsichtlich des Typs gemeinsamen Epitope auf HSV 1 und HSV 2 sind die Antikörper im menschlichen Serum kreuzreaktiv (Aurelian. et al., J. Natl. Cancer Inst. 45: 455–464, 1970.). Es ist auch schon früher gezeigt worden, dass zellvermittelte Immunität eine Kreuzreaktion zeigt {Jacobs et al., J. Immunol. 116: 1520–1525, 1976).
Ein Lebendvakzin ist einem Totvakzin überlegen, weil das Lebendvakzin Herdenimmunität verleiht und es auch verschiedene Arten von Immunität hervorruft, wie z. B. Schleimhautimmunität, zellvermittelte Immunität und Humoralimmunität. Normalerweise wird ein höherer Grad an Immunität erreicht, weil die Virustiter durch Replikation in der geimpften Person erhöht werden. Schließlich weist ein Lebendvakzin eine längere Lebensdauer auf, was Auffrischungsimpfungen überflüssig macht und eine niedrigere Anfangsdosis ermöglicht. Eine absolute Notwendigkeit für ein Lebendvakzin gegen Herpes ist dann gegeben, wenn, wie bei der vorliegenden Erfindung, das Gen entfernt wird, das für die Auslösung der Transformation verantwortlich ist.
Bekannte Vakzine sind für Viren nicht typenspezifisch. Alle bekannten Impfstoffe gegen HSV 1 oder HSV 2 sind kreuzreaktiv und rufen Immunität gegen den anderen Virustyp hervor. Die am höchsten entwickelten Vakzine (nämlich solche in Neurovirulenzgenen) befinden sich im HSV 1. HSV 1 ist jedoch kein so wünschenswerter Kandidat für ein Vakzin gegen Herpes, weil das hauptsächliche klinische Problem das sexuell transmittierte HSV 2 ist, welches ebenso bei der Auslösung von Krebs involviert ist. Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Periodenprävalenz von HSV 2 in den USA nun 20,8% beträgt, ein Anstieg um nahezu 30% über die letzten 13 Jahre; (Fleming et al., New Engl. J. Med. 337: 1105–1111, 1997). Die zunehmende Verbreitung unter jungen Erwachsenen, sich HSV 2 einzufangen, erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Kinder bei der Geburt einem Angriff von HSV 2 ausgesetzt sind, was zu einer Infektion führt, die trotz antiviraler Therapie immer noch lebensbedrohlich ist > (Whitley, et al., New Engl. J. Med. 327: 782–799, 1992 [Erratum, N.Engl. J. Med. 328: 671,1993]). Ein neuer Aspekt bei einer HSV2-Infektion besteht darin, dass sie die Ausbreitung von HIV erleichtert und die Schwere der Krankheit erhöht (Aurelian, L. Hrg., Herpes viruses, the Immune System and AIDS, Kluwer Academic Publishers, Boston, Mass., 1990). Weil HSV 1 nur eine 50% Homologie zu HSV 2 aufweist, kann dies in der geimpften Bevölkerung das Tempo der Reaktion gegen den heterologen Stamm vermindern. Eine weitere absolute Bedingung für ein Lebendvakzin ist das Fehlen von Verletzungen nach der Immunisierung. Eine wünschendwerte Eigenschaft für einen Lebendimpfstoff wäre seine Fähigkeit, in einer bereits infizieren Person einen Rückgang der Häufigkeit von regelmäßig wiederkehrenden Läsionen zu verursachen. Es ist ein beträchtlicher bereits mit HSV infizierter Bevölkerungsanteil, der mit nicht infizierten Personen Geschlechtsverkehr haben kann, bei welchen ein solcher Impfstoff von Nutzen wäre.
Die vorliegende Erfindung löst alle oben angesprochenen Probleme und stellt ein ganzes lebendes attenuiertes HSV 2 zur Verfügung, wobei das HSV 2 eine Deletion des Onkogens aufweist und in einer Vakzin-Zusammensetzung formuliert ist. Die vorliegende Erfindung stellt ein Herstellungsverfahren für ein Medikament zur Verfügung, um mittels Verwendung dieser Vakzinzusammensetzung eine Person gegen das Herpes simplex Virus zu immunisieren, wodurch die Person ein besseres Verfahren erhält, um Immunität zu erlangen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vakzin-Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche, wenn sie an ein Tier einschließlich einem Menschen verabreicht wird, Schutz gegen den Angriff durch eine HSV 1- oder HSV 2-Infektion bietet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Vakzin-Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die ein ganzes attenuiertes HSV 2 enthält, worin das Onkogen oder irgend ein Abschnitt desselben, welcher eine Transformation verursacht und das Virus nicht abschwächt, eine Deletion erfahren hat.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese neue Vakzin-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung einer Person gegen das Herpes simplex Virus einzusetzen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese neue Vakzin-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments einzusetzen, welches einer Person Immunität gegen das Herpes simplex Virus verleiht.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese neue Vakzin-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments einzusetzen, das die mit dem Herpes simplex Virus in einer Person einhergehenden klinischen Symptome unterbindet oder vermindert.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese neue Vakzin-Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments einzusetzen, das die bei HSV 2 oder HSV 1 in zuvor geimpften Personen häufig wiederkehrenden Krankheiten eindämmt
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A. Eine schematische Wiedergabe der DNA für ICP10ΔPK. Die Oligosonde AU26 sollte das 7,6 kb BamHI E-Fragment der DNA für HSV 2 oder HSV 2(R) und ein 2,2 kb BamHI-Fragment der DNA für ICP10ΔPK erkennen.
B. Southern-Blot-Hybridisierung von mit BamHI verdauter ICP10ΔPK-DNA (Spur 1), HSV 2-DNA (Spur 2) oder HSV 2(R)-DNA (Spur 3) mit der dioxigeninmarkierten Oligosonde AU26. Am rechten Rand werden die Marker für die Größe angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden für die RF- und CS-Stammsubstanzen von ICP10ΔPK erhalten.
2 Expression und PK-Aktivität des p95-Proteins von ICP10ΔPK-infizierten Zellen.
A. Vero-Zellen wurden mit HSV 2 (Spuren 1, 4), ICP10ΔPK (Spur 2) oder HSV 2(R) (Spur 3) infiziert, mit [³⁵S]-Methionin 6–16 Stunden nach der Infektion markiert und die Extrakte mit LA 1-Antikörpern, welche spezifisch für ICP10 (Spuren 1–3) oder Präimmunserum (Spur 4) sind, einer Immunpräzipitation unterworfen.
B. Immunkomplex-PK-Assay mit Anti-LA 1-Antikörpern (Spuren 1–3) oder Präimmunserum (Spur 4) von Extrakten aus über 16 Stunden mit HSV 2 (Spuren 1, 4), ICP10ΔPK (Spur 2) oder HSV 2(R) (Spur 3) infizierten Vero-Zellen.
C. Die Immunpräzipitate in Charge B wurden mit LA 1-Antikörpern einem Immunoblotting unterzogen. Ähnliche Ergebnisse wurden für die RF- und CS-Stammviren von ICP10ΔPK erhalten.
3 Viruswachstum unter exponentiellen und wachstumsbeschränkten Bedingungen. In 10% Serum (•) oder 0,5% Serum (Δ) gewachsenen Vero-Zellen wurden mit HSV2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) mit einer m.o.i. von 2 infiziert. Die Virustiter wurden zwischen 2 und 36 Stunden nach der Infektion ermittelt. Die Ergebnisse sind als PFU/Zelle (Größe für den Burst) angegeben.
4 Extrazelluläre und intrazelluläre Virustiter in mit hoher m.o.i. infizierten Vero-Zellen. Vero-Zellen mit exponentiellem Wachstum wurden mit HSV 2(A) oder ICP10ΔPK (B) mit einer m.o..i. von 200 infiziert und die intrazellulären (Δ) und extrazellären (•) Virustiter wurden zwischen 2 und 36 Stunden nach der Infektion ermittelt.
5 Viruswachstum in sich teilenden, mit den beiden ICP10ΔPK-Stammviren infizierten Zellen. Vero-Zellen wurde in einem Medium mit 10% Serum wachsen gelassen und mit ICP10ΔPK(RF) (•) oder ICP10ΔPK(CS)
infiziert. Die Infektion erfolgte mit einer m.o.i. von 2 (Graph A) oder 200 (Graph B). Die Virustiter wurden zwischen 2– 35 Stunden nach der Infektion ermittelt und die Ergebnisse sind als PFU/Zelle (Größe für den Burst) angegeben.
6 ICP10ΔPK-Viruswachstum in Zellen, die konstitutiv ICP10 exprimieren. JHLal-Zellen, die konstitutiv ICP10 exprimieren (Graph A) oder 293-Zellen, die zum Herstellen der JHLal-Linie (Graph B) eingesetzt wurden, wurden mit HSV 2 (Δ) oder dem RF-Stammvirus von ICP10PK (•) mit einer m.o.i. von 200 infiziert. Die Virustiter wurden währen 2–20 Stunden nach der Infektion ermittelt. Die Ergebnisse sind als PFU/Zelle (Größe für den Burst) angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden für die C-Stammviren von ICP10ΔPK in JHLal-Zellen erhalten.
7 Adsorptions-/Penetrations-Kinetik von ICP10ΔPK. Vero-Zellen wurden 200 PFU von HSV 2 (•), ICP10ΔPK (o) oder HSV 2(R) (♢) für 0, 10, 30, 60, 90 und 120 Minuten ausgesetzt, mit MEM mit 10% Serum und 0,3% IgG überschichtet, bei 37°C über 48 Stunden reinkubiert und auf Plaquebildung hin untersucht. Die Daten sind als % des ursprünglichen Inokulums angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden für die RF- und CS-Stammviren von ICP10ΔPK erhalten.
8 Protein-Muster von mit HSV 2 und ICP10ΔPK infizierten Zellen.
A. Vero-Zellen (Spuren 1–6, 8) wurden scheininfiziert (Spur 1) oder mit HSV 2 (Spuren 2, 4), mit ICP10ΔPK(RF) (Spuren 3, 5, 6) oder mit HSV 2(R) (Spur 8) infiziert und mit [³⁵S]-Methionin 2–3 Stunden nach der Infektion (Spuren 1–3, 8), 7–8 Stunden nach der Infektion (Spuren 4, 5) oder 11–12 Stunden nach der Infektion (Spur 6) markiert. Die Protein-Muster in JHLal-Zellen (exprimieren konstitutiv ICP10), welche mit ICP10ΔPK infiziert und mit [³⁵S]-Methionin 2–3 Stunden nach der Infektion markiert worden waren, dienten als Kontrolle (Spur 7). Die Proteine aus den Zellextrakten wurden mittels PAGE auf 8,5% SDS-Acrylamidgelen aufgetrennt.
B. Die Extrakte von mit ICP10ΔPK(RF) über 3 Stunden (Spuren 1, 2) oder über 8 Stunden (Spur 3) infizierten Zellen wurden mit ICP0 MAbs (Spur 1), mit LA- 1-Antikörpern gegen ICP10 (Spur 2) oder mit ICP4 MAbs (Linie 3) einem Immunoblotting unterzogen.
C. Die Extrakte von scheininfizierten (Spur 1), über 3 Stunden mit HSV 2 (Spur 2) oder über 12 Stunden mit ICP10ΔPK infizierten Vero-Zellen wurden mit Antikörpern gegen Actin einem Immunoblotting unterzogen.
9 IE-Proteinsynthese in mit HSV 2 und mit ICP10ΔPK infizierten Zellen.
A. Vero-Zellen wurden scheininfiziert (Spur 1) oder mit HSV 2 (Spur 2) oder ICP10ΔPK(RF) (Spur 3) in Gegenwart von 50 μg/ml Cycloheximid (6 hr) infiziert und mit [³⁵S]-Methionin über 3 Stunden in einem 10 μg/ml Actinomycin D enthaltenden Medium markiert. Die Proteine wurden mittels PAGE auf 8,5% SDS-Acrylamidgelen aufgetrennt.
B. Immunoblotting der Extrakte in den Spuren 2,3 in Gel A mit ICP0 MAbs (Spur 1) und Anti-LA-1-Antikörpern gegen ICP10 (Spur 2).
10 Synthese der mRNA für ICP4 und ICP0 in mit ICP10ΔPK infizierten Zellen. Die RNA wurde aus Vero-Zellen extrahiert, welche, wie angegeben, mit HSV 2 (HSV) oder ICP10ΔPK (ΔPK) oder HSV 2(R)(R) über 3 Stunden (Gel A), 0–20 Stunden (Gel B) oder 1–8 Stunden (Gel C) infiziert waren. Es wurde mit [³²P]-markierten DNA-Sonden für ICP4 (4) oder ICP0 (0) oder mit GAPDH-Oligonucleotid (untere Gele) hybridisiert. Die Marker für das Molekulargewicht sind an den Rändern angegeben.
11 Indirekte Immunofluoreszenzfärbung von mit HSV 2 (Gele A, B, C) oder ICP10ΔPK (RF) (Gele D, E, F) über 3 Stunden (Gele A, D), 6 Stunden (Gele B, E) oder 9 Stunden (Gele C, F) infizierten und mit MAb 30 (Gele A-C) oder Anti-LA-1-Antikörpern gegen ICP10 (Gele D-F) angefärbten Vero-Zellen.
12 HSV-spezifische lymphoproliferative Reaktionen von Milzzellen aus mit ICP10ΔPK (Ausgangs-RF) immunisierten Mäusen. Den Mäusen wurde eine sübkutane Injektion mit 1·10⁶ PFU von HSV 2 oder ICP10ΔPK (ΔPK) verabreicht. Die Milzgin wurden am Tag 24 nach der Injektion gesammelt und auf [³H]-TdR-Einbau (cpm) untersucht. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als cpm für HSV-stimulierte Kulturen – cpm für mit einem Scheinantigen stimulierte Kulturen.
13 HSV-spezifische lymphoproliferative Reaktionen von Milzzellen aus mit ICP10ΔPK (Ausgangs-CS) immunisierten Mäusen. Den Mäusen wurden drei subkutane Injektionen von 1·10⁷ PFU mit ICP10ΔPK (ΔPK) verabreicht. Die Milzen wurden am Tag 14 nach der letzten Injektion gesammelt und nach einer Kultivierung mit HSV 2 oder Scheinantigenen oder dem Mitogen PHA auf [³H]-TdR-Einbau (cpm) untersucht.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung wurden ganze lebende HSV 2 mutiert und abgeschwächt, um eine neoplastische Transformation zu verhindern. Die mutierten HSV 2 können mit Immunstimulantien oder -adjuvantien formuliert und zur Immunisierung einer Person gegen HSV 1 oder HSV 2 verwendet werden. Es wurde schon früher nachgewiesen, dass die Proteinkinase-Domäne der großen Untereinheit der Ribonucleotidreductase (ICP10) über onkogene Eigenschaften verfügt. In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass die Deletion der PK-Domäne schädliche Auswirkungen auf die Fähigkeit von HSV 2 hat, Zellen zu infizieren. Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, dass Lebend-HSV 2, dem die ICP10PK-Domäne und daher das Onkogen fehlt, Immunschutz gegen einen Angriff von lebendem Wildtyp-HSV 2 bietet. Daher wurde eine neue Vakzinzusammensetzung sowie ein neues Verfahren zur Immunisierung einer Person gegen HSV 2 oder HSV 1 gefunden.
HSV 1- und HSV 2-Viren sind sehr ähnlich. Die DNA ist zu 50% homolog. Praktisch weisen alle viralen Proteine sowohl typenspezifische als auch typengemeinsame Epitope auf. Für alle außer 2 Proteinen (d. h. für 82 Proteine) überwiegen die typengemeinsamen Epitope. Ausnahmen bilden das HSV 2 gG2 (Ashley et al. J. Clin. Invest. 90: 511, 1992) and das HSV 2-Onkoprotein, welche vornehmlich typenspezifische Antikörper stimulieren. In der vorliegenden Erfindung erfährt das Onkogen eine Deletion durch ICP10ΔPK. Wir haben daher nur ein Protein, welches eine typenspezifische Immunität zu induzieren vermag. Die restlichen 83 Proteine induzieren eine typengemeinsame Immunität. Somit wird sowohl antikörper- als auch zellvermittelte Immunität induziert.
Zuvor ließen sich ganze lebende HSV 2 nicht als Option für ein Vakzin gegen HSV erforschen, da das Onkogen auf den Patienten eine potentielle neoplastische Wirkung ausübte.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass durch Entfernung des Onkogens – einer Proteinkinase – aus dem HSV 2-Genom sich nicht nur die neoplastischen Eigenschaften beseitigen ließen, sondern dass auch das Virus abgeschwächt wird und über längere Zeit ein voller Schutz gegen eine Infektion aufgebaut wird.
Ein besonderer HSV 2-Stamm mit der Deletion des Onkogens ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Beispiele für solche Stämme sind HSV 2(G), HSV 2(333). HSV 2(186), HSV 2(S-1), obwohl jeder Stamm verwendet werden kann. Diese Stämme sind gut bekannt und leicht zu besorgen.
Die Konstruktion der Virusmutante erfolgt mittels bekannter Techniken. Die Lage des Onkogens (PK) ist bekannt (DNA Tumor Viruses Oncogenic Mechanisms, Ed. C. Barbanti-Brodano et al., Plenum Press, NY, 1995, Kapitel 14 von L. Awelian, Transformation and Mutagenic Effects Induced by Herpes Simplex Virus Types 1 and 2, S. 253–280). Das Onkogen sitzt im ICP10-Abschnitt des HSV 2-Genoms. Es wurde schon früher gezeigt, dass die PK-Aktivität und die onkogene Aktivität innerhalb der Gensequenz liegen, welche für die Aminosäuren 88–411 von ICP10 kodiert. Kurz zusammengefasst wurden die Wildtyp-Sequenzen in einem Plasmid (TP101), welches das BamHI E- und T-Fragment von HSV 2 enthält, durch das 1,8 kb SaII/BgIII-Fragment von pJHL9 [eine ICP10-Mutante mit Deletion in der PK-Domäne, Luo und Awelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992)) ersetzt. Das erhaltene Plasmid T9 enthält Sequenzen, welche für ICP10 mit einer Deletion in der katalytischen PK-Domäne, flankiert am 5'- und 3'-Ende von einer 4 kb bzw. einer 2,8 kb DNA-Sequenz von HSV 2, kodiert. Das 10 kb HindIII/EcoR1-Fragment von TP9 wurde mittels Markertransfers in ein Virus (ICP10ΔRR) eingeführt, in welchem die RR-Domäne ICP10 durch das LacZ-Gen ersetzt worden war. Das erhaltene rekombinante Virus mit der Bezeichnung ICP10ΔPK wurde erhalten, indem nach Anfärben mit X-Gal weiße Plaques auf einem Hintergrund von blauen Plaques ausgesondert wurden. Einige wenige weiße Plaques wurden gesammelt und gereinigt. Zwei davon wurden in Vero-Zellen mit 10% Serum zu unabhängigen Stammviren, als RF bzw. CS bezeichnet, heranwachsen gelassen (exponentielles Wachstum).
Eine Southern-Blot-Hybridisierung wurde eingesetzt, um sicher zu stellen, dass die DNA im ICP10ΔPK-Virus im ICP10PK-kodierenden Abschnitt eine Deletion aufwies. Die DNA aus HSV 2 und ICP10ΔPK wurde mit BamHI verdaut, auf 1% Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen transferiert. Sie wurde mit der Sonde AU26(CCCCTTCATCATGTTT AAGGA) hybridisiert, welche eine Sequenz innerhalb des ICP10RR-kodierenden Abschnitts erkennt. Die für die DNA von ICP10ΔPK beobachtete Hybridisierungsbande lag bei 2,2 kb im Vergleich zu 7,6 kb für den Wildtyp von HSV 2. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Stammviren RF und CS erhalten.
Das ICP10ΔPK-Virus lässt sich vom WildtypHSV 2 mittels einer DNA-Analyse und Immunopräzipitation/Immunoblotting mit einem Antikörper gegen Epitope unterscheiden, welche auf dem vom Protein mit Deletion zurückgehaltenen ICP10-Aminosäuren sitzen.
Das ICP10ΔPK-Virus wurde mit einem Anti-LA-1-Antikörper (erkennt die ICP10-Aminosäuren 13–26) (Aurelian. et al., Cancer Cells 7: 187–191, 1989) einer Fällung/Immunoblotting unterzogen und die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Ein Protein von 95 kDa wurde von dem Antikörper in ICP10ΔPK-infizierten Zellen erkannt, im Vergleich mit dem 140 kDa Protein aus mit Wildtyp-Viren infizierten Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Stammviren RF und CS erhalten.
Am Onkogen oder jedem beliebigen Abschnitt davon kann eine Deletion vorgenommen werden. Mit dem Ausdruck jeder beliebige Abschnitt davon" ist gemeint, dass jeder Abschnitt des Onkogens mit einer einmal vorkommenden Deletion zu einer Abschwächung des Virus führt und eine neoplastische Transformation der Zellen verhindert. Die Bestimmung einer fehlenden PK-Aktivität erfordert die Expression des viralen Gens und die Durchführung von Standard-PK-Assays mit dem Genprodukt (Chung et al., J. Virol.. 63: 3389–3398, 1989). Es gibt eine Fülle von Anleitungen im Stand der Technik, wie das für die PK-Aktivität erforderliche ICP10-Gen herausgeschnitten werden kann. Die Bestimmung der viralen Abschwächung erfordert die Untersuchung in Tieren, um das Fehlen einer Läsionsbildung zu ermitteln, Die Techniken für eine diesbezügliche Durchführung stellen reine Routine dar und sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die erhaltene Virusmutante ICP10ΔPK wurde bei Infektionsversuchen eingesetzt und mit Wildtyp-HSV 2- und wieder hergestellten HSV 2(R)-Viren verglichen. Die für die Infektion verwendeten Zellen sind für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Jede menschliche oder tierische Zelllinie, die sich mit Wildtyp-HSV 2 infizieren lässt, kann für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden. Beispiele für solche Zellen sind Vero-, HeLa-, 293- oder MRCS-Zellen (alle von der American Type Culture Collection zu beziehen). ICP10ΔPK kann man auch in Zellen wachsen lassen, welche konstitutiv ICP10 exprimieren, z. B. JHLal. Es wird mittels eines Plaque-Assays auf Vero-Zellen mit MEM-10%FCS und 0,3% menschlichem IgG titriert. Die Wachstumseigenschaften der RF- und CS-Stammviren wurden unabhängig voneinander ermittelt.
Die Infektionsversuche wurden auch mit Tieren durchgeführt. Es wurden Mäuse gewählt, weil Mäuse das Standardtiermodell für HSV 2 darstellen (Wachsmau et al., Vaccine 10: 447– 454, 1992). Das Maus-Footpad-Modell wurde gewählt, um die Pathogenität des ICP10ΔPK-Virus in vivo herauszufinden. Die RF- und CS-Stammviren wurden unabhängig voneinander untersucht. Ernste Läsionen wurden bei Mäusen beobachtet, denen HSV 2 oder das als HSV 2(R) bezeichnete wiederhergestellte Virus verabreicht wurde. Mäuse, denen ICP10ΔPK (RF- oder CS-Stammviren) verabreicht wurde, wiesen während der gesamten Untersuchungen (vom Tag 1 bis zu Tag 21) keine neurologischen Symptome oder Hautläsionen auf.
Die Immunisierung einer Person weist auf die im Stand der Technik gut bekannte Standardinterpretation. hin. Nach Verabreichung der Vakzinzusammensetzung nehmen die neutralisierenden Antikörper und die zellvermittelte Immunität in der Person zu und diese Antikörper und die zellvermittelte Immunität verleihen der Person Immunität.
Die vorliegende Erfindung lehrt die Herstellung einer Zusammensetzung zur Immunisierung einer Person gegen HSV 2. Eine „PFU" (plaque forming unit) ist eine Plaques bildende Einheit und gibt die Menge an Virus wieder, die benötigt wird, um einen einzigen Plaque zu bilden, wenn eine Zellkultur mit dem Virus infiziert wird. Es wurde eine Dosis von 0,5 bis 1 Million PFU eingesetzt, um Mäuse mit dem RF-Stammvirus von ICP10ΔPK [ICP10ΔPK (RF)] zu immunisieren. Eine Dosis von 1–10 Millionen PFU wurde eingesetzt, um Mäuse mit dem CS-Stammvirus von ICP10ΔPK [ICP10ΔPK(CS)] zu immunisieren. Der Bereich für die Dosierung bei einem Menschen beträgt 1–100 Millionen PFU. Ein bevorzugter Bereich ist 1000 bis 75 Millionen PFU und ein besonders bevorzugter Bereich 10.000 bis 50 Millionen PFU. Ferner existiert wegen der 50% Homologie von HSV 1 und HSV 2 auch ein hohes Maß an Schutz gegen eine HSV 1-Infektion.
Die Formulierung von ICP10ΔPK für menschlichen Gebrauch wird mittels einer Suspension in einer Lösung mit oder ohne stabilisierende Zusätze und mit oder ohne Immunstimulantien oder Adjuvantien erreicht. Beispiele für Stabilisatoren, Immunstimulantien und Adjuvantien sind Alaun, inkomplettes Freund'sches Adjuvans, MR-59 (Chiron), MTPPE und MPL (Monophosphoryl-Lipid A). Solche Stabilisatoren, Adjuvantien und Immunstimulantien sind im Stand der Technik gut bekannt und können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden.
Die Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung lässt sich an jedes Tier, einschließlich den Menschen, verabreichen. Die Impfstoffzusammensetzung kann mit jeder Verabreichungsform verabreicht werden, wie z. B. einer intramuskulären, oralen, subkutanen, intradermalen, intravaginalen, rektalen oder intranasalen Verabreichung. Die bevorzugte Verabreichungsform ist eine subkutane oder intradermale Verabreichung.
Das ICP10ΔPK-Virus, welches für Schutz gegen eine HSV 2-Infektion sorgt, kann zusammen mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz oder einem Verdünnungsmittel verabreicht werden. Beispiele für eine solche pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz oder ein Verdünnungsmittel sind Wasser, phosphatgepufferte Saline oder ein Natriumbicarbonatpuffer. Eine Anzahl weiterer verträglicher Trägersubstanzen oder ein Verdünnungsmittel sind bekannt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es wurde gefunden, dass der rekombinante Stamm ICP10ΔPK(CS) ein bevorzugter Stamm von HSV 2 für einen Impfstoff zur Immunisierung eines menschlichen Wirts gegen sowohl HSV 1 als auch HSV 2 ist, wobei der Stamm ein für Proteinkinase kodierendes Gen aufgewiesen hat, welches zusammen mit weiteren unbekannten Modifikationen des Genoms einer Deletion unterzogen wurde, welche seine Wachstumsgeschwindigkeit herabsetzt. Dieser Stamm zeigt die erwünschten Immunogenitäts- und Latenzeigenschaften, ohne dabei toxisch oder onkogen zu sein. Dieser Stamm ist am 18. Dezember 1997 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. U.S.A. hinterlegt worden und erhielt die ATCC-Zulassungsnummer VR 2592.
Die folgenden Beispiele sollen nur der Veranschaulichung dienen und sollen in keinster Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Materialien
Zellen. Vero-Zellen (aus der Niere der afrikanischen grünen Meerkatze) wurden in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), das mit 10% fetalen Kalbsserum (FCS) und Antibiotika ergänzt worden war, wachsen gelassen. JHLal-Zellen (exprimieren konstitutiv ICP10) wurden bereits früher beschrieben (Luo and Awelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992: Smith et al., Virology 200: 598–612, 1994; Hunter et al., Virology 210: 345–360, 1995). Sie wurden in EMEM mit 10% FCS, 1 mM Natriumpyruvat (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), 1 × nichtessentiellen Aminosäuren (GIBCO-BRL) und Antibiotika kultiviert. Vero-ICP10-Zellen werden mittels Transfektion von Vero-Zellen mit einem ICP10-Expressionsvektor mit SV₂-neo cassette (pJW17N) erhalten (Luo und Awelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992; Smith et al., Virology 200: 598–612, 1994). Zur Serum-Mangelernährung wurden in Medium mit 10% FCS bis zur Konfluenz gewachsene Zellen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) von pH 7,0 gewaschen und zwei Tage in einem Medium mit 0,5% FCS wachsen gelassen.
Plaques bildende Fähigkeit. Die Virustiter wurden, wie beschrieben, mittels eines Plaque-Assays (Awelian, L., Herpes Simplex Viruses, in: Clinical Virology Manual 2^nd Edition. Specter, S. und Lancz, G., Hrsg., Elsevier Science Pub. S. 473–494, 1992) ermittelt. Vero-ICP10-Zellen wurden unter einer Überschichtung aus mit 10% oder 0,5% FCS und 0,3% IgG ergänztem MEM eingesetzt.
Antikörper. Die Herstellung und Spezifität des für die Aminosäuren 13–26 von ICP10 spezifischen Anti-LA-1-Antikörpers sowie des monoklonalen Antikörpers (MAb30), der eine Determinante in der ICP10 PK-Domäne (Aminosäuren 106–178) erkennt, wurden bereits früher beschrieben (Awelian et al., Cancer Cells 7: 187–191, 1989. Chung et al., J. Gen. Virol. 72: 1139–1144, 1991). MAbs für ICP4 und ICP10 wurden von Advanced Biotechnologies, (Columbia, MD) bezogen, der Antikörper C-11 gegen Actin von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).
Immunfluoreszenz-Färbung. Auf 22 mm² Deckgläsern aus Glass (Corning Glass Works, New York) gewachsene Vero-Zellen wurden mit HSV 2 oder ICP10ΔPK infiziert und in kaltem Methanol (–70°C) fixiert. Sie wurden mit Anti-LA-1-Antikörper (60 min., 37°C) oder MAb 30 angefärbt, jeweils gefolgt von fluoresceingekoppeltem Ziegen-Antikaninchen IgG oder Maus IgG (Wymer et al., J. Virol. 63: 277–2784, 1989. Smith etc al., Virology 200: 598–612, 1994).
Beispiel 1
Konstruktion und Charakterisierung der ICP10ΔPK- und HSV 2(R)-Viren
Die Konstruktion des ICP10ΔPK-Virus ist beschrieben worden (Peng et al., Virology 216: 184–196.1996). Kurz zusammengefasst wurden die Wildtyp-Sequenzen in einem Plasmid (TP101), welches das BamHI E- und T-Fragment von HSV 2 enthält, durch das 1,8 kb SaII/BgIII-Fragment von pJHL9 [eine ICP10-Mutante mit Deletion in der PK-Domäne (Luo und Aurelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992)] ersetzt. Das erhaltene Plasmid TP9 enthält Sequenzen, welche für ICP10 mit einer Deletion in der katalytischen PK-Domäne, flankiert am 5'- und 3'-Ende von einer 4 kb bzw. einer 2,8 kb DNA-Sequenz von HSV 2, kodiert. Das 10 kb HindIII/EcoRI-Fragment von TP9 wurde mittels Markertransfers in ein Virus (ICP10ΔRR) eingeführt, in welchem die RR-Domäne ICP10 durch das LacZ-Gen ersetzt worden war. Das erhaltene rekombinante Virus mit der Bezeichnung ICP10ΔPK wurde erhalten, indem nach Anfärben mit X-Gal weiße Plaques auf einem Hintergrund von blauen Plaques ausgesondert wurden. Einige wenige weiße Plaques wurden gesammelt und gereinigt. Zwei Stammviren wurden in Vero-Zellen in MEM mit 10% Serum heranwachsen gelassen (exponentielles Wachstum). Sie wurden jeweils als ICP10ΔPK(RF) bzw. ICP10ΔPK(CS) bezeichnet. Für die Konstruktion des wieder hergestellten Virus HSV 2(R) wurden Vero-Zellen wurden mit 1 μg infektiöser vitaler DNA aus ICP10ΔPK und dem 10-fachen molaren Überschuss des Wildtyp-BamHI E/T-Fragments einer Cotransfektion unterzogen. Eine Strategie, ähnlich der für ICP6Δ beschriebenen (Goldstein and Weller, Virology 166: 41–51, 1988), wurde verwendet, um das wieder hergestellte Virus unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen (Vero-Zellen unter Serummangel) auszusondern.
Es wurde eine Southern-Blot-Hybrisierung eingesetzt, um sicher zu stellen, dass in der ICP10ΔPK-DNA im ICP10PK kodierenden Abschnitt eine Deletion stattgefunden hat.
Allgemein wurde virale DNA aus cytoplasmatischen Virionen, wie beschrieben, isoliert (Pignatti et al., Virology 93: 260–264. 1979; Smith et al., J. Gen. Virol. 73: 1417–1428, 1992). Vero-Zellen wurden mit einer Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 5 infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen in einem Puffer aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM EDTA und 0,25% Triton resuspendiert (2·10⁷ Zellen/ml). Es folgte eine Inkubation auf Eis (15 Minuten), sodann wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M zugesetzt und die Kerne mittels Zentrifugation bei 1000 g gefällt (10 Minuten bei 4°C). Der cytoplasmatische Virionen enthaltende Überstand wurde in 200 μg/ml Proteinase K und 0,2% SDS (4 Stunden bei 37°C) inkubiert, mit gesättigtem Natriumjodid (NaJ; Endkonzentration 1,525 g/ml) und Ethidiumbromid (Endkonzentration 3 μg/ml) vermischt und bei 100.000 g 16 Stunden lang zentrifugiert.
Die virale DNA (15 μg) wurde mit BamHI verdaut und die Fragmente mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese in einem Tris-Acetat-EDTA(TAE)-Puffer (40 mM Tris-Acetat und 1 mM EDTA) aufgetrennt. Sie wurde auf Gen-Screenmembranen (New England Nuclear Corp.) übertragen und die Membranen in einer Vorhybrisisierungslösung mit 5 × SSC [750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat; pH (7,0)], 2% Casein, 0,1% N-Laurylsarcosin und 0,02% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 42°C 2 Stunden lang inkubiert. Als Hybridisierungssonde diente das Oligonucleotid AU26 (CCCCTTCATCATGTTTAAGGA), welches eine Sequenz auf dem ICP 10 RR-kodierenden Abschnitt ist. Am 3'-Ende wurde mittels terminaler Transferase (Boehringer Mannheim) in einem 20 μl Volumen mit 1 × Reaktionspuffer [5 mM Kobaltchlorid (CoCl₂), 0,05 mM DIG-dUTP, 5 nmol/ml AU26, 0,5 mM dATP und 2,5 Einheiten/ml terminaler Transferase] bei 37°C über 15 Minuten Dioxigenin-dUTP (DIG-dUTP) angehängt und in Vorhybridisierungslösung auf eine Endkonzentration von 5 pmol/ml verdünnt. Die Hybridisierung erfolgte bei 42°C über 3 Stunden. Die Membranen wurden einmal (bei Raumtemperatur) in einer Lösung mit 2 × SSC, 0,1% SDS über 5 Minuten gewaschen und zweimal in 0,5 × SSC, 0,1% SDS über 15 Minuten. Zum Nachweis der hybridisierten DNA-Fragmente wurden die Membranen in Puffer 1 (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) gespült, in Puffer 2 (2% (w/v) Casein in Puffer I] 40 Minuten lang inkubiert und sodann in Puffer 2 mit 3μ10^–4 U/ml an alkalische Phosphatase gekoppeltem Antidioxigenin-Antikörper (Boehringer Mannheim) 30 Minuten lang inkubiert. Nach dem Waschen in Puffer 1 (zweimal) und Tränken in Puffer 3 (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂) über 2 Minuten wurden die Membranen dem Chemolumineszenz- Substrat Lumi-Phos^TM 530 (Boehringer Mannheim) ausgesetzt und die Reaktion auf Röntgenfilm festgehalten.
Genauer ausgedrückt wurde die DNA (15 μg) von HSV 2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) mit BamHI verdaut, auf 1% Agarosegel aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Sie wurde mit der AU26-Sonde hybridisiert, welche eine Sequenz innerhalb des für ICP10RR kodierenden Abschnitts (1A) erkennt. Es wurde eine Hybridisierungsbande mit 7,6 kb, welche das BamHI E-Fragment darstellt, für die DNA von HSV2 (1B, Spur 2) und von HSV 2(R) (1B, Spur 3) beobachtet. Die für die DNA von ICP10ΔPK beobachtete Bande war 2,2 kb groß (1B, Spur 1), was mit der erwarteten Größe übereinstimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden für ICP10ΔPK(RF) und ICP10ΔPK(CS) erhalten. Die Daten belegen, dass für die DNA von ICP10ΔPK im PK-kodierenden Abschnitt eine Deletion stattgefunden hatte.
Beispiel 2
Expression des ICP10-Proteins (p95) mit Deletion in der 95 kDa PK-Domäne
Um zu ermitteln, ob ICP10ΔPK ein ICP10-Protein mit Deletion in seiner PK-Domäne exprimiert, wurden Vero-Zellen mit ICP10ΔPK (200 PFU/Zelle) infiziert und während 6–16 Stunden nach der Infektion mit [³⁵S]-Methionin (100 μCi/ml) markiert. Mit HSV 2 oder HSV 2(R) infizierte Zellen dienten als Kontrolle. Allgemein wurden Zellen mit PBS (pH 7,4) scheininfiziert oder mit 200 PFU/Zelle HSV 2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) infiziert. Sie wurden mit [³⁵S]-Methionin (100 μCi/ml) (sp. Akt. 1120 Ci/mmol. Dupont, NEN Research Products) in EMEM mit keinem Methionin und 10% dialysiertem FCS markiert. In einigen Experimenten erfolgte die Infektion in Gegenwart von Cycloheximid (50 μg/ml) über 6 Stunden, während welcher Zeit Cycloheximid entfernt wurde. Die Zellen wurden eingehend mit PBS gewaschen und in Gegenwart von 10 μg/ml Actinomycin D und 100 μCi/ml [³⁵S]-Methionin inkubiert (3 Stunden). Zur Immunfällung wurden die Zelllysate in kaltem RIPA-Puffer [0,01 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% SDS, 1% Nonidet P40, 1% Desoxycholat, 0,15 M NaCl, 1 mM Dithiothreitol] mit 1 mM Phenyhnethylsulfonylfluorid (PMSF) und 100 Kallikreineinheiten/ml Aprotinin (Sigma) auf Eis 15 Minuten lang inkubiert und mittels Zentrifugation bei 20.000 g über 30 Minuten von Zelltrümmern befreit. Sie wurden mit 15–20 μl des Antikörpers inkubiert (1 h, 4°C) und dann mit 100 μl Protein A-Sepharose CL4B- Kügelchen [10 mg in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,15 M NaCl und 0,5% Nonidet P40] (30 min., 4°C). Die Kügelchen wurden eingehend mit eiskaltem RIPA-Puffer gewaschen und die gebundenen Proteine durch Kochen (5 min.) in 100 μl Denaturierungslösung [150 mM Tris-HCl (pH 7,0), 5,7% SDS, 14% 2-Mercaptoethanol, 17% Sucrose und 0,04% Bromthymolblau] eluiert.
Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE auf 7% oder 8,5% Polyacrylamidgelen aufgetrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. In einigen Experimenten wurden die Zellen direkt in Denaturierungslösung resuspendiert, 5 Minuten lang gekocht und mittels SDS-PAGE analysiert.
Genauer gesagt werden die Zellextrakte mit einem Anti-LA-1-Antikörper gefällt und die Proteine mittels SDS-PAGE auf 7% Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Der Anti-LA-1-Antikörper fällte ein Protein von 140 kDa aus Zellen, die mit HSV 2 (2A, Spur 1) oder mit HSV 2(R) (2A, Spur 3) infiziert waren. Aus mit ICP10ΔPK infizierten Zellen fällte er ein Protein von 95 kDa (p95) (2A, Spur 2), was mit ICP10 mit Deletion der PK-Domäne übereinstimmt (Luo and Aurelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653, 1992). Das Präimmunserum war negativ (2A, Spur 4). Ein Protein von 38 kDa, was mit RR2 übereinstimmt, wurde vom Anti-LA-1-Antikörper aus Zellen mitgefällt, die mit allen drei Viren infiziert waren, was anzeigt, dass p95 mit RR2 einen Komplex bilden kann, vermutlich am C-terminalen Ende, welches früher bei der Komplexbildung eine Rolle spielte (Chung et al., J. Gen. Virol. 72: 1139–1144, 1991). Ähnliche Ergebnisse wurden für ICP10ΔPK(RF) und ICP10ΔPK(CS) erhalten.
Beispiel 3
Von ICP10ΔPK exprimiertes p95 verfügt über keine Kinaseaktivität
Wir haben früher gezeigt, dass: (i) ICP10 in mit HSV 2 infizierten und stabil tranfizierten Zellen über Kinaseaktivität verfügt und (ii) die PK-Aktivität mit der 57–60 kDa schweren aminoendständigen Domäne des ICP10-Proteins, nicht jedoch mit dessen 90–95 kDa schwerer C-terminalen Domäne, assoziiert ist (Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398, 1989; Smith et al., Virology 200: 598–612. 1994). Um zu ermitteln, ob das von ICP10ΔPK exprimierte p95 über PK-Aktivität verfügt, wurden mit HSV 2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) infizierten Zellen mit dem Anti-LA-1-Antikörper Immunfällungen durchgeführt (m.o.i. = 200, 16 h nach Infektion) und damit PK-Assays durchgeführt (Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398, 1989).
Allgemein wurden Immunpräzipitate, die auf die Proteinkonzentration durch den BCA-Protein-Assay-Kit (PIERCE. Rockford. IL) normiert waren, mit TS-Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl enthält, gewaschen, in 50 μl Kinase-Reaktionspuffer, bestehend aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂ und 10 μCi [³²P]-ATP (3000 Ci/mmol, Dupont, New England Research Product) suspendiert und bei 30°C 15 Minuten lang inkubiert ((Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398, 1989; Chung et al., Virology 179: 168– 178, 1990; Smith et al., J. Gen. Virol. 73: 1417–1428, 1992; Smith et al., Virology 200: 598– 612, 1994; Peng et al., Virology 216: 184–196, 1996). Die Kügelchen wurden einmal mit 1 ml TS-Puffer gewaschen, in 100 μl Denaturierungslösung resuspendiert und 5 Minuten lang gekocht. Die Proteine wurden, wie beschrieben (Chung, et al., J. Virol. 63; 3389–3398. 1989), mittels SDS-PAGE auf 7% Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die Proteine wurden, wie früher beschrieben (Awelian et al, Cancer Cells 7: 187–191, 1989), mittels Elektrotranfer auf Nitrocellulosemembranen übertragen und durch jeweilige Inkubation mit den entsprechenden Antikörpern gefolgt von Protein A-Peroxidase (Sigma) über 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde ein Immunoblotting durchgeführt. Der Nachweis erfolgte, wie beschrieben (Smith et al., Virology 200: 598 612, 1994). mit ECL-Reagentien (Amersham, Chicago, IL).
Genauer gesagt wurden die aufgetrennten Proteine auf Nitrocellulosemembranen übertragen und Anti-LA-1-Antikörper einem Immunoblotting unterzogen, um in den Niederschlägen die Proteingehalte zu ermitteln. Das ICP10-Protein von 140 kDa aus mit HSV 2 (2B, Spur 1) oder HSV 2(R) (2B, Spur 3) infizierten Zellen wurde phosphoryliert. Ein phosphoryliertes Protein von 95 kDa konnte in ICP10ΔPK-infizierten Zellen nicht nachgewiesen werden (2B, Spur 2). Dies ist nicht auf niedrige Proteingehalte in den für den PK-Assay verwendeten Niederschlägen zurückzuführen, weil durch Immunoblotting mit Anti-LA-1-Antikörpern (2C) für alle drei Viren ähnliche Proteingehalte beobachtet wurden. Ein phosphoryliertes Protern von 38 kDa wurde in mit HSV 2 (2B, Spur 1) und HSV 2(R) (2B, Spur 3) infizierten Zellen beobachtet, jedoch nicht in ICP10ΔPK-infizierten Zellen (2B, Spur 2). Das Präimmunserum war negativ (2B, C, Spur 4). Wir interpretieren diese Daten so, dass RR2 durch ICP10PK phosphoryliert wird, wie dies schon früher von Chung et al., (J. Virol 63: 3389–3398. 1989) und von Peng et al., (Virology 216: I 196, 1996) berichtet worden ist. Es wird nicht von p95 phosphoryliert, was mit dem Fehlen der PK-Domäne in Einklang steht. Ähnliche Ergebnisse wurden für ICP10ΔPK(RF) und ICP10ΔPK(CS) erhalten. Die Daten bestätigen, dass der für ICP10PK kodierende Abschnitt für die Kinaseaktivität benötigt wird, auch im Kontext einer Virusinfektion.
Beispiel 4
Ribonucleotidreductase-Aktivität von ICP10ΔPK
Es wird allgemein angenommen, dass die RR- und PK-Aktivitäten des RR1-Proteins sich voneinander trennen lassen (Ingemarson et al., Virology 156: 417–422,1987; Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398, 1989). Um die Gültigkeit dieser Interpretation zu prüfen, ist es wichtig, nachzuweisen, ob der Verlust der ICP10PK-Aktivität irgend eine Auswirkung auf die RR-Aktivität hat. Die RR-Assays wurden auf Extrakten von infizierten Zellen durchgeführt (m.o.i. = 20, 16 h nach Infektion). Die RR-Aktivität wurde, wie beschrieben (Smith et al., J. Gen. Virol. 73: 1417–1428, 1992). Die Extrakte von infizierten Zellen oder scheininfizierten Zellen wurden 16 h nach der Infektion in HD-Puffer [100 mM HEPES-Puffer (pH 7,6), 2 mM Dithiothreitol (DTT)] mit 2·10⁷ Zelläquivalenten/ml auf Eis 15 Minuten lang inkubiert, durch Beschallung zertrümmert (30–60 Sekunden bei maximaler Einstellung; Ultrasonics-Sonifier Modell 220F) und mittels Zentrifugation (100.000 g; 1 h; 4°C) von Zelltrümmern befreit. Die RR-Aktivität von HSV wurde mit kristallinem Ammoniumsulfat [45% Sättigung (0,258 g/ml)] gefällt. Es folgte eine Dialyse und eine Zentrifugation (16.000 g; 30 min.), sodann wurden die teilweise gereinigten Enzympräparationen mit gleichen Volumina 2 × Standard-Reaktionsmischung, welche 400 mM HEPES-Puffer (pH 8,0), 20 nM DTT und 0,2 mM [³H]-CDP (17,8 Ci/mM; Amersham, IL) enthielt, inkubiert (37°C; 10 min.). Die Reaktion wurde durch Zusatz von 100 mM Hydroxyharnstoff mit 10 mM EDTA (pH 8,0) und Kochen über 3 Minuten beendet. Es wurde das Gift von Crotalus atrox (Sigma, St. Louis, MO) zugesetzt [0,5 mg/ml in 12 mM Tris-HCl (pH 9,0), 4 mM MgCl₂, 1 mM Desoxycytidin], die Mischung 30 Minuten Lang bei 37°C inkubiert, 3 Minuten gekocht und auf eine 0,5 ml Dowex-1-Borat-Säule (Sigma) aufgetragen. Die Säule wurde mit 2,5 ml H₂O gewaschen und 0,5 ml der Eluatfraktionen wurden zur Scintillationsmessung mit Biofluor ((New England Nuclear, Boston, MA) vermischt. Die Aktivität der Ribonucleotidreductase wird in Einheiten/mg angegeben, wobei 1 Einheit die Überführung von 1 nMol [³H]-CDP in dCDP pro Stunde und pro mg Protein angibt.
Genauer gesagt hatte, wie in Tabelle 1 gezeigt, das ICP10ΔPK-Virus eine ähnliche RR-Aktivität wie die von HSV 2 und HSV 2(R). Dies stimmt mit dem Befund überein, dass p95 mit RR2 eine Copräzipitation eingeht und stützt den Schluss, dass die PK- und RR-Aktivitäten sich funktionell unterscheiden können.
Beispiel 5
Wachstumseigenschaften von ICP10ΔPK
Die Wachstumseigenschaften von ICP10ΔPK wurden unter exponentiellen (10% Serum) und wachstumsbehinderten (0,5% Serum) Bedingungen untersucht. In einer ersten Reihe von Experimenten wurden Vero-Zellen mit HSV 2, ICP10ΔPK(RF) oder HSV 2(R) mit einer m.o.i. von 2 infiziert und das Viruswachstum 36 h nach der Infektion untersucht. Wie in 3 gezeigt, wuchs HSV 2 gleich gut unter exponentiellen und wachstumsbehinderten Bedingungen. Die Virusreplikation begann 2 Stunden nach der Infektion und erreichte 36 Stunden nach der Infektion Spitzenwerte (Burstgröße 1000 PFU/Zelle). Ein ähnliches Wachstumsmuster wurde bei HSV 2(R) beobachtet. Im Gegensatz dazu konnte der Beginn der ICP10ΔPK-Replikation sowohl bei exponentiell wachsenden Zellen als auch bei Zellen mit behindertem Wachstum erst 15 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Replikation wieder aufgenommen und erreichte in exponentiell wachsenden Zellen 36 h nach der Infektion Titer ähnlich denen bei HSV 2 (Burstgröße 1000 PFU/Zelle), jedoch nicht bei unter Hungerserum wachsenden Zellen (Burstgröße 1 PFU/Zelle).
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden exponentiell wachsende Vero-Zellen mit HSV 2 oder ICP10ΔPK(RF) mit einer m.o.i. von 200 infiziert. Die HSV 2-Repliktion begann 2 Stunden nach der Infektion und erreichte 20 Stunden nach der Infektion maximale Titer (4A). Im Gegensatz dazu wurde eine Replikation beim ICP10ΔPK-Virus erstmals nach 10–12 Sunden nach der Infektion beobachtet mit maximalen Titern 36 Stunden nach der Infektion (4B). Das Wachstum von HSV 2(R) stimmte praktisch mit dem von HSV 2 überein (Daten nicht gezeigt). Die Titer des intrazellulären und extrazellulären Virus waren ähnlich denen von HSV 2, ICP10ΔPK und HSV 2(R), was zeigt, dass die Virusnachkommenschaft gleich gut freigesetzt wurde (4).
Als nächstes wurde das Viruswachstum der beiden Stammviren von ICP10ΔPK miteinander verglichen. Vero-Zellen mit exponentiellem Wachstum wurden mit ICP10ΔPK(RF) bzw. ICP10ΔPK(CS) mit einer m.o.i. von 2 oder. 200 PFU/Zelle infziert. In mit einer m.o.i. von 2 PFU/Zelle infizierten Zellen begann die ICP10ΔPK(RF)-Replikation 15 Stunden nach der Infektion. Im Gegensatz dazu begann die Replikation von ICP10ΔPK(CS) erst 20 Stunden nach der Infektion, was nahe legt, dass sie defekter war (5A). Für beide Stammviren konnten maximale Titer 35 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Diejenigen für ICP10ΔPK(RF) betrugen 1000 PFU/Zelle. Diejenigen für ICP10ΔPK(CS) betrugen 780 PFU/Zelle (5A). In mit einer m.o.i. von 200 PFU/Zelle infizierten Zellen begann die ICP10ΔPK(RF)-Replikation 11 Stunden nach der Infektion. Im Gegensatz dazu begann die Replikation von ICP10ΔPK(CS) erst 15 Stunden nach der Infektion, was darauf hinweist, dass die Verzögerung des Beginns der Virusreplikation proportional zu der Verzögerung bei mit niedriger m.o.i. infizierten Zellen ist (5B). Für beide Stammviren wurden die maximalen Titer 35 Stunden nach der Infektion beobachtet. Sie betrugen für ICP10ΔPK(RF) bzw. ICP10ΔPK(CS) 580 bzw. 50 PFU/Zelle (5B). Weil die ICP10ΔPK(RF)- und ICP10ΔPK(CS)-Stammvven ähnlich aufgebaut waren und beide keine ICP10PK-Aktivität zeigten aber RR-Aktivität beibehielten, schließen wir, dass ihre unterschiedlichen Wachstumsmuster zusätzliche Unterschiede wiederspiegeln, die vermutlich während der Amplifikation beim Wachsen erworben wurden und für die weitere Abschwächung von ICP10ΔPK(CS) verantwortlich sind.
Um sicher zu stellen, dass ICP10PK tatsächlich für die Virusreplikation benötigt wird, untersuchten wir auch das Viruswachstum in JHLal-Zellen, die ICP10 konstitutiv exprimieren. 293-Zellen, die zur Herstellung der JHLal-Zelllinie verwendet wurden, dienten als Kontrolle (Luo and Awelian, J. Biol. Chem. 267: 9645–9653.1992; Smith et al., Virology 200: 598–612, 1994; Hunter et al.. Virology 210: 345–360, 1995). Die Zellen wurden mit einer m.o.i. von 200 infiziert und mit MEM-1% FCS überschichtet. Das ICP10ΔPK-Wachstum in 293-Zellen war insofern ähnlich dem in Vero-Zellen beobachteten, als ein neu synthetisierter Virus früher als 10 Stunden nach der Infektion nicht beobachtet wurde (6B). Im Gegensatz dazu wuchsen in JHLal-Zellen sowohl ICP10ΔPK als auch HSV 2, wobei eine Replikation erstmals 2 Stunden nach der Infektion beobachtet wurde und 20 Stunden nach der Infektion ihren Höchststand erreichte (Burstgröße 2800 bzw. 2500 für HSV 2 bzw.
ICP10ΔPK (6A). Ähnliche Ergebnisse wurden für ICP10ΔPK(RF) und ICP10ΔPK(CS) erhalten. Wir interpretieren diese Befunde so, dass ICP10ΔPK für die Virusreplikation in sowohl exponentiell wachsenden als auch wachstumsbehinderten Zellen benötigt wird. Eine sowohl in Vero- als auch 293-Zellen beobachtet Ausgleichsfunktionen) ist jedoch für die Wiederaufnahme des Viruswachstums 10–15 Stunden nach der Infektion verantwortlich. Da die Wiederaufnahme des Wachstums des ICP10ΔPK-Virus in mit einer hohen m.o.i. infizierten Zellen früher erfolgte als bei einer mit niedriger m.o.i. infizierten, die Burstgröße in exponentiell wachsenden Zellen aber signifikant größer war als in Zellen mit Serummangel (jeweils 1000 gegenüber 1), nehmen wir an, dass die Ausgleichsfunktion eine zelluläre Ser/Thr-PK ist, die von einem nachfolgenden Strukturprotein(en) des Virus induziert wird.
Beispiel 6
ICP10ΔPK und HSV 2 haben eine ähnliche Kinetik bei der Zelladsorption
Eine mögliche Interpretation für das bei ICP10ΔPK beobachtete Wachstumsmuster ist, dass es im Hinblick auf die Adsorption/Penetration an/in die Zellen defekt ist. Um diese Frage zu klären, wurden Vero-Zellen über 0, 10, 30, 60, 90 oder 120 Minuten 200 PFU von HSV 2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) ausgesetzt. Sie wurden ausgiebig mit PBS gewaschen, mit MEM-10%FCS und 0,3% IgG überschichtet und bei 37°C 48 Stunden lang reinkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden dann die gebildeten Plaques ausgezählt. Wie in 7 gezeigt, nahm für alle drei Viren die Anzahl der Plaques als Funktion der ausgesetzten Zeit zu, erreichte bei 20–30 Minuten ein Maximum und blieb dann nahezu konstant. Die Virustiter in den ursprünglichen Inokula nahmen parallel zueinander ab, mit ähnlichen Mustern wie bei HSV 2, ICP10ΔPK und HSV 2(R) (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse wurden für ICP10ΔPK(RF) und ICP10ΔPK(CS) erhalten.
Beispiel 7
Plaque-bildende Fähigkeit des ICP10ΔPK-Virus
Zur Analyse der Plaque-bildenden Fähigkeit von ICP10ΔPK setzten wir in 10% oder 0,5% Serum gewachsene Vero- und Vero-ICP10-Zellen ein. In Übereinstimmung mit der geringen Burstgröße, die bei mit niedriger m.o.i. infizierten Zellen mit Hungerserum beobachtet wurden, war die Plaque-bildende Fähigkeit von ICP10ΔPK in mit Hungerserum ernährten Vero-Zellen ernstlich beeinträchtigt. Die Virustiter waren ähnlich denen von HSV 2 in exponentiell wachsenden Vero-Zellen (10% Serum) und in Vero-ICP10-Zellen (Tabelle 2). Bei (in 10% oder 0,5% FCS gewachsenen) Vero-Zellen waren die ICP10ΔPK-Plaques unscharf, was offenbar auf eine unvollständige Zelllyse zurückzuführen war. Das Ausmaß der Zelllyse war von einem Experiment zum nächsten etwas unterschiedlich, sie war jedoch niemals so vollständig wie bei der für HSV 2 beobachteten. Die Plaques von ICP10ΔPK(CS) waren kleiner als die von ICP10ΔPK(RF), was mit dem Schluss übereinstimmt, dass sein Wachstum ernstlicher beeinträchtigt war. Die Morphologie der ICP10ΔPK-Plaques in Vero-ICP10-Zellen sowie die von HSV 2(R)-Plaques in allen Zellen war ähnlich der von HSV 2 (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 8
Die Expression des IE-Proteins in ICP10ΔPK-infizierten Zellen wird früh in der Infektion inhbiert
Der Wachstumsdefekt des ICP10ΔPK-Virus kann die Unfähigkeit wiederspiegeln, die Proteinsynthese zu initiieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Vero-Zellen scheininfiziert oder mit HSV 2, ICP10ΔPK oder HSV 2(R) (m.o.i. = 200) über 2 oder 7 Stunden infiziert, weitere 60 Minuten mit [³⁵S]-Methionin pulsmarkiert und die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteinprofile für die HSV 2-infizierten Zellen waren ähnlich den früher beschriebenen (Wilcox et al., J. Virol 33: 167–182, 1980) und enthielten 3 Stunden nach der Infektion ICP4, ICP0, ICP10 und ICP27 (8A, Spur 2). Ähnliche Proteinprofile wurden bei HSV 2(R)-infizierten Zellen beobachtet (8A, Spur 8). Im Gegensatz dazu glichen die Proteinprofile von mit ICP10ΔPK (8A, Spur 3) über 3 Stunden infizierten Zellen denen von scheininfizierten Zellen (8A, Spur 1). Die Ausnahme bildeten die zwei Banden mit 110 kDa und 95 kDa (8A, Spur 3), welche beim Immunoblotting jeweils von ICP0- und ICP10-Antikörpern erkannt wurden (8B, Spuren 1, 2). Densitometrisches Scannen zeigte, dass die Niveaus von ICP0 in ICP10ΔPK-infizierten Zellen um das 4-fache niedriger waren als in HSV 2- [oder HSV 2(R)-] infizierten Zellen (3130 und 782 Einheiten für HSV 2 bzw. ICP10ΔPK) und dass die Niveaus von p95 (in ICP10ΔPK-infizierten Zellen) um das 7-fache niedriger waren als die ICP10-Niveaus in HSV 2- und HSV 2(R)-infizierten Zellen (3567 und 480 Einheiten für ICP10 bzw. p95). Bei mit ICP10ΔPK über 8 Stunden infizierten Zellen waren die Niveaus von ICP0 und p95 höher und die Banden für ICP4, ICP5 und ICP27 wurden nachgewiesen (8A, Spur 5). Die Identität der ICP4-Bande in 8 Stunden infizierten Zellen wurde mittels Immunoblotting mit ICP4-spezifrschen MAbs bestätigt (8B, Spur 3). Das Proteinprofil bei ICP10ΔPK-infizierten Zellen (8A, Spur 6) war 12 Stunden nach der Infektion ähnlich dem von HSV 2-infizierten Zellen 8 Stunden nach der Infektion (8A, Spur 4). Diese Befunde zeigen, dass andere virale Proteine als ICP0 und p95 bei mit ICP 10ΔPK über 3 Stunden infizierten Zellen nicht exprimiert werden, was nahe legt, dass ICP10ΔPK für die Expression der IE-Proteine ICP4 ICP22 und ICP 27 benötigt wird. Tatsächlich ist das Proteinprofil bei ICP10ΔPK-infzierten JHLal-Zellen (liefern ICP10PK-Aktivität) 3 Stunden nach der Infektion praktisch identisch mit dem von HSV 2-infizierten Zellen (8A, Spur 7). Da diese drei IE-Proteine für die Regulation der frühen und späten viralen Genexpression verantwortlich sind (Sacks et al., J. Virol 55: 796 05, 1985; McCarthy et al., J. Virol. 63: 18–27, 1989; Samaniego et al., J. Virol. 69: 5705–5715, 1995; Dixon und Schaffer, J. Virol. 36: 189–203, 1980; Rice et al., J. Virol. 69: 5550–5559, 1995; Leopardi und Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4562 576, 1996) bewirkt ihr Fehlen in ICP10ΔPK-infizierten Zellen eine vollständige Hemmung der viralen Proteinsynthese und der Produktion von infektiösen Viren.
Zur weiteren Untersuchung der Synthese von IE-Proteinen in ICP10ΔPK-infizierten Zellen erfolgte die Infektion in Gegenwart von 50 μg/ml Cycloheximid (6 hr) und die Zellen wurden mit [³⁵S]-Methionin über 3 Stunden in 10 μg/ml Actinomycin D enthaltendem Medium markiert, Bedingungen, die eine IE-Genexpression, aber keine Expression von anderen viralen Genen erlauben (Honess und Roizman, J. Virol. 14: 8–19, 1974; Strnad und Aurelian, Virology 73: 244–258, 1976). Proteine, die mit ICP4, ICP10, ICP0, ICP22. und ICP27 übereinstimmen wurden in HSV 2-infizierten Zellen beobachtet (9A, Spur 2). Im Gegensatz dazu konnten ICP4, ICP10, ICP22. und ICP27 in ICP10ΔPK-infizierten Zellen nicht beobachtet werden (9A, Spur 3). Ein Protein mit 110 kDa, welches mit ICP0 übereinstimmt, und ein Protein von 95 kDa, welches mit p95 übereinstimmt wurden in ICP10ΔPK-infizierten Zellen (9A, Spur 3) beobachtet, aber ihre Niveaus waren jeweils um das 2- bzw. 3-fache niedriger als in HSV 2-infizierten Zellen (9A, Spur 2) (densitometrische Integrationseinheiten: 1760 und 3520 für ICP0; 733 und 2200 für p95 und ICP10, jeweils in ICP10ΔPK- bzw. HSV 2-infizierten Zellen). Mittels Immunoblotting wurde bestätigt, dass die Proteine von 110 kDa und von 95 kDa jeweils ICP0 bzw. p95 waren ( 9B, Spuren 1, 2). Die Proteinprofile für HSV 2(R) waren ähnlich denen für HSV 2 (Daten nicht wiedergegeben). Diese Daten stützen den Schluss, dass ICP10PK für die Expression von ICP4, ICP22. und ICP27, nicht jedoch von ICP0 und p95, benötigt wird.
Beispiel 9
Das ICP10ΔPK-Virus ist für die Transkription von ICP4 defekt
Eine Northern-Hybridisierung wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob das Versagen beim Nachweis von ICP4 in ICP10ΔPK-infizierten Zellen auf einen Defekt bei der Transkription zurückzuführen ist. RNA wurde aus Vero-Zellen erhalten, die mit HSV 2, ICP10ΔPK(RF) oder HSV 2(R) infiziert worden waren. DNA für ICP4 oder ICP0 wurde als Sonde verwendet. GAPDH diente als Kontrolltranskript. Die Guanidiniumisothiocyanat/Cäsiumchlorid-Gradienten-Methode wurde zur Isolierung und Reinigung von RNA aus Vero-Zellen verwendet, die mit HSV-2, ICP10ΔPK oder HSV-2(R) infiziert worden waren (m.o.i. = 200). Die Northern-Blot-Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt (Feng et al., Antisense Nucleic Acid Development 6: 25–35,1996). Die Hybridisierung erfolgte über 16 Stunden bei 42°C mit [³²P]-markierten ICP4-, ICP0- oder GAPDH-Sonden in einer Lösung mit 40% Formamid, 6X SSPE, 2X Denhardt's Lösung, 0,1% SDS und 250 μg/ml DNA aus Lachsspermien. Die ICP4-Sonde war ein von pXhol-C stammendes BamHI-DNA-Fragment. Die ICP0-Sonde war ein von plGA15 stammendes 1,7 kb NruI-SaII-Fragment (O'Hare und Hayward, J. Virol. 53: 751–760, 1985). Die menschliche GAPDH-Sonde war ein von Oncogene Science (Katalog-Nr. ON407) bezogenes 40.mer Oligonucleotid. Die Sonden wurden mit Hilfe des Random-Priming-Verfahrens unter Verwendung eines Oligonucleotid-Kits (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach den Angaben des Herstellers [³⁵P]-dCTP-markiert. Die Blots wurden bei Raumtemperatur zweimal in 2 × SSC-0,1% SDS und zweimal in 0,1 × SSC-0,01% SDS jeweils 10 Minuten lang gewaschen gefolgt von einem einmaligen Waschen in 0,1 × SSC-0,1% SDS bei 50°C und sodann mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die relative Häufigkeit von ICP4- und ICP0-mRNA wurde berechnet, indem in jeder Probe zunächst auf den Wert für die GAPDH-mRNA normiert wurde.
Beide ICP4- und ICP0-mRNA wurden in Vero-Zellen beobachtet, welche mit HSV 2 ( 10A, Spuren 1, 2) oder HSV 2(R) (10A, Spuren 5, 6) über 3 Stunden infiziert worden waren. Die Kinetik der ICP4-Expression in Zellen mit HSV2-Infektion war ähnlich der vorher für Zellen mit HSV 1-Infektion beschriebenen. Optimale Niveaus wurden 3 Stunden nach der Infektion beobachtet (10C, Spur 2) und das Transkript ließ sich 8 Stunden nach der Infektion nicht mehr nachweisen (10C, Spur 4). Im Gegensatz dazu wurde eine ICP4-mRNA bei mit ICP10ΔPK über 3 Stunden infizierten Zellen nicht beobachtet (10A, Spur 3). Bei einer Inkubation über 8 Stunden (10B, Spur 3) waren ihre Niveaus jedoch ähnlich den früher bei HSV 2-infizierten Zellen (3 Stunden nach der Infektion) beobachteten (10C , Spur 2). 20 Stunden nach der Infektion wurde das Transkriptionsprodukt nicht mehr beobachtet (10B, Spur 6). Mit ICP10ΔPK über 3 Stunden infizierte Zellen waren bezüglich ICP0-mRNA positiv (10, Spur 4), aber ihre relative Häufigkeit (ausgedrückt als ICP-/GAPDH-mRNA) war um das 3-fache niedriger als bei Zellen mit HSV 2-Infektion (0,32 bzw. 1,0). Die Daten zeigen, dass ICP10PK für eine frühe Transkription von ICP4 benötigt wird und zu einer optimalen Transkription von ICP0 beiträgt.
Beispiel 10
ICP10PK spielt eine Rolle bei der Hemmung der Genexpression und Zelllyse von Wirtszellen
Die Morphologie der ICP10ΔPK-Plaques stehen mit einer unvollständigen Zelllyse in Übereinstimmung. Da ICP27 beim Ausschalten der Synthese von Wirtsprotein eine Rolle spielt (Handwicke et al., J. Virol 68: 4797–4810, 1994) und nicht in ICP10ΔPK-infizierten Zellen 8–12 Stunden nach der Infektion exprimiert wird, untersuchten wir auch die Expression eines Wirtszellgens (Actin) in Zellen, die mit HSV 2 oder ICP10ΔPK infiziert worden waren. Vero-Zellen wurden scheininifiziert oder mit HSV 2 oder ICP10ΔPK bei einer m.o.i. von 200 infiziert und mittels Immunoblotting mit Anti-Actin-Antikörpern auf eine Actinexpression hin untersucht. Actin wurde in HSV 2-infizierten Zellen nicht früher als 3 Stunden nach der Infektion beobachtet (8C, Spur 2). Im Gegensatz dazu waren die Actin-Niveaus in Zellen mit ICP10ΔPK-Infektion (8C, Spur 3) ähnlich denen in scheininfizierten Zellen zwölf Stunden nach der Infektion (8C, Spur 1). Diese Befunde stimmen mit der Beobachtung überein, dass eine cytopathogene Wirkung bei ICP10ΔPK-infizierten Zellen erst nach 15 bis 20 Stunden nach der Infektion beobachtet wurde, wenn kompensatorische Funktionen) ins Spiel kommen.
Beispiel 11
Intrazelluläre Lokalisierung der ICP10- und p95-Proteine
Frühere Untersuchungen an Zellen, die über 8 und 12 Stunden mit HSV 2 infiziert worden waren, hatten gezeigt, dass ICP10 im Cytoplasma lokalisiert und auch mit dem Cytoskelett assoziiert ist (Chung et al., J. Virol. 63: 3389–3398, 1989). Zellen jedoch, die über weniger als 8 Stunden infiziert worden waren, wurden nicht untersucht. Da ICP10PK für eine IE-Genexpression vor 8 Stunden benötigt wird, stellt sich die Frage, ob es zu diesem Zeitpunkt auch im Kern vorkommt. Vero-Zellen, die über 3, 6 oder 9 Stunden mit HSV 2 oder HSV 2(R) infiziert worden waren, wurden mit MAb30 (erkennt die Aminosäuren 106–178 von ICP 10) immunofluoreszenzgefärbt. Zellen, die ähnlich mit ICP 10ΔPK infiziert worden waren, wurden mit Anti-La-1-Antikörpern (erkennt die Aminosäuren 13–26 von ICP 10) gefärbt. Eine Starke Anfärbung innerhalb des Kerns wurde bei Zellen beobachtet, die über 3 Stunden mit HSV 2 infiziert worden waren (11A). Sie zeigte ein punktförmiges Erscheinungsbild aus diskreten sphärischen Strukturen (Körnern) ähnlich den früher für virale Replikationskompartimente beschriebenen (Rice et., J. Virol. 68: 988–1001, 1994; Mullen et al., J. Virol. 68: 3250–3266, 1994). Zu einem späteren Zeitpunkt nach der Infektion nahm die Färbung das charakteristische, um den Zellkern herum gelegene diffuse cytoplasmatische Muster an, das früher für ICP 10 beschrieben worden war (11B, C). Ähnliche Färbungsmuster wurden für HSV 2(R) beobachtet (Daten nicht wiedergegeben). Im Gegensatz dazu wurde in ICP10ΔPK-infizierten Zellen eine Färbung nicht vor 9 Stunden nach der Infektion beobachtet (11D, E) zu welchem Zeitpunkt es dann nur im Cytoplasma lokalisiert war (11F). Eine Kernfärbung wurde auch bei ICP10ΔPK-infizierten Zellen 12 oder 15 Stunden nach der Infektion nicht beobachtet (Daten nicht gezeigt). Diese Befunde legen nahe, dass die PK-Domäne von ICP10 für eine Lokalisierung im Kern in einem frühen Infektionsstadium (vor 6 Stunden) benötigt wird.
Beispiel 12
Das ICP10ΔPK-Virus ist für das Wachstum in infizierten Tieren von verminderter Virulenz
Wir verwendeten das Maus-Footpad-Modell der HSV 2-Infektion, um in vivo die Rolle von ICP10ΔPK für das Viruswachstum zu untersuchen. Swiss-Wehster-Mäuse wurden mit 5·10⁶ PFU HSV 2, ICP10ΔPK(RF) oder einem wiederhergestellten Virus mit der Bezeichnung HSV 2(R) subkutan in den Fußballen beimpft. Bei Mäusen, denen HSV 2 oder HSV 2(R) verabreicht worden war, wurden, beginnend mit dem Tag 6 nach der Infektion, neurologische Symptome und ernsthafte Hautschäden beobachtet. ICP10ΔPK-infizierte Mäuse wiesen keine neurologischen Symptome oder Hautschäden auf. 7–9 Tage nach der Infektion wurden HSV 2 und HSV 2(R) aus dem Fußballen und den Ganglion-Homogenaten isoliert. ICP10ΔPK wurde nur 4 Tage nach der Infektion isoliert. Für ICP10ΔPK waren die maximalen Titer niedriger als für HSV 2 (4,3·10⁴ und 3·10⁷ PFU für ICP10ΔPK bzw. HSV 2), und das Verhältnis von latent infizierten Virus-liefernden Ganglien war 90% und 80% für HSV 2 und HSV 2(R) im Vergleich zu 10% für ICP10ΔPK (Tabelle 3). Diese Daten legen nahe, dass ICP10ΔPK bei akuten Infektionen beteiligt ist und direkt oder indirekt bei der Reakitivierung/Ausbildung von Latenz.
Beispiel 13
ICP10ΔPK-Viren schützen vor HSV 2-Angriff
Zwei Gruppen von 10 Mäusen wurden jeweils mit phosphatgepufferter Saline (PBS) oder ICP10ΔPK(RF) (5·10⁵ bis 1·10⁶ PFU) mittels subkutaner Injektion in den Fußballen scheininfiziert. Sie entwickelten keine sichtbaren Symptome. Am Tag 16 nach der Infektion wurden sie 1·10⁷ PFU HSV 2 ausgesetzt. Alle Mäuse in der PBS-Gruppe entwickelten Läsionen aus Schwellungen und Rötungen, welche zuerst am Tag 5 sichtbar wurden und aus den Fußballen von 10/10-infizierten Mäusen wurden Viren (HSV 2) isoliert. Am Tag 15 nach der Infektion entwickelten 5/10 (50%) der Mäuse in der PBS-Gruppe eine Paralyse. Mit ICP10ΔPK-Viren immunisierte Mäuse entwickelten nach HSV 2-Befall keine sichtbaren Läsionen. Viren wurden aus den Fußballen in 3/10 (30%) Tieren isoliert. Viren wurden nicht aus den Fußballen von 7/10 (70%) der ICP10ΔPK-immunisierten Mäuse isoliert.
Diese Befunde zeigen, dass eine Immunisierung mit relativ niedrigen Dosen an ICP10ΔPK vor einem Befall mit hohen Dosen an HSV 2 schützt. Absoluter Schutz besteht im Sinne einer Ausbildung von Läsionen, dadurch, dass Hautläsionen bei allen nicht immunisierten Mäusen im Vergleich mit keinen Läsionen bei immunisierten Mäusen beobachtet wurden. Nicht immunisierte Mäuse wurden nicht vor einer Virusreplikation geschützt, indem am Tag 5 nach dem Befall Viren aus allen Tieren isoliert wurden. Immunisierte Mäuse wurden geschützt, wobei Viren nur aus 3/10 (30%) der Tiere isoliert wurden. Das Fehlen von nachweisbaren Läsionen bei den 3 Tieren, aus denen Viren isoliert wurden, spiegelt vermutlich relativ niedrige Titer wieder, was nahe legt, dass selbst wenn eine Immunisierung keinen 100% Schutz gewährte, sie dennoch den Titer für einen Virusbefall herabsetzte.
Beispiel 14
ICP10ΔPK-Viren induzieren eine HSV-spezifische Immunität
Zwei Gruppen von jeweils 4 Mäusen wurden mittels subkutaner Injektion in den Fußballen mit HSV 2 oder ICP10ΔPK(RF) (1·10⁵ PFU) immunisiert. Am Tag 24 nach der Injektion wurden die Milzen entfernt und T-Zellen im Lymphocyten-Proliferationstest mit HSV 2-Antigen eingesetzt, wie wir bereits früher beschrieben (Wachsuran, et al., Bioscience Reports, 8: 323–334. 1985; Wachsuran. et al., J. Inf. Dis. 159; 625 34,1989; Wachsuran et al., Vaccine 10: 447454, 1992). Dieser Test misst die Entwicklung eines HSV-spezifischen Gedächtnisses. Parallel zum Virus-Antigen (Scheinantigen) zubereitete nicht infizierte Zellextrakte wurden als Kontrolle für die Spezifität verwendet. Wie in 12 gezeigt, wurde durch ICP 10ΔPK-Viren eine HSV-spezifische Immunität induziert. Die Reaktion war nur um das 2- bis 3-fache niedriger als die für HSV 2 unter gleichen Bedingungen beobachtete.
Beispiel 15
ICP10ΔPK(CS) ist schwächer als ICP10ΔPK(RF)
Weil ICP10ΔPK(CS) in kultivierten Zellen schwächer zu sein scheint als ICP10ΔPK(RF), fragten wir uns, ob das gleiche auch für infizierte Tiere zutrifft. Wir verwendeten das gleiche Maus-Footpad-Modell wie für ICP10ΔPK(RF). Um das verminderte Wachstum von ICP10ΔPK(CS)-Viren [relativ zu ICP10ΔPK(RF)] zumindest teilweise zu kompensieren, wurden die Mäuse mit 1·10⁷ PFU Viren injiziert und eine proportionale Dosis von HSV 2 wurde als Kontrolle verwendet. Die Titer von HSV 2, die aus den Fußballen isoliert wurden, waren nicht signifikant höher als diejenigen, die bei den Mäusen beobachtet wurden, denen 5·10⁶ PFU verabreicht worden war (Beispiel 12). Im Gegensatz dazu waren die Titer von isolierten ICP10ΔPK(CS) niedriger als die von ICP10ΔPK(RF) und die Viren wurden nur 3 Tage, im Vergleich zu 4 Tagen, nach der Infektion isoliert. Das Verhältnis von latent infizierten Ganglien betrug 100% und 0% für HSV 2 im Vergleich zu ICP10ΔPK(CS)-infizierten Tieren (Tabelle 5).
Beispiel 16
ICP10ΔPK(CS) schützt vor einem HSV 2-Befall besser als ICP10ΔPK(RF)
Wir verwendeten das Footpad-Modell, um den Schutz durch ICP10ΔPK(CS) zu untersuchen, Das Experiment erfolgte wie zuvor für ICP10ΔPK(RF) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Mäuse mit 1·10⁷ PFU von Viren immunisiert wurden und ihnen vor dem Befall mit Wildtyp-HSV 2 drei Immunisierungen (in Intervallen von 14–16 Tagen) verabreicht wurden. Der Befall erfolgte mit 1·10⁸ PFU von HSV 2 und er wurde 3 Wochen nach der letzten Immunisierung vorgenommen. Alle Mäuse in der PBS-Gruppe entwickelten Hautläsionen, aus denen Viren isoliert wurden und 8/10 an den Tagen 8–13 nach dem Befall starben. Im Gegensatz dazu wurden bei keiner der immunisierten Mäuse Läsionen beobachtet und es wurden keine Viren isoliert (Tabelle 6). Diese Befunde zeigen, dass das ICP10ΔPK(CS)-Virus ein besseres Impfstoff Potential aufweist als das ICP10ΔPK(RF)-Virus, indem es etwas mehr attenuiert ist während es besseren Schutz gewährt. Letzteres wird durch den Befund bewiesen, dass das Virus nicht von jedem der Tiere isoliert wurde, obwohl der Befall mit dem um das 10-fache höheren Titer von HSV 2 erfolgte als der bei Tieren, die mit ICP10ΔPK(RF) immunisiert wurden, wo das Virus aus 3/10 Mäusen isoliert wurde (Beispiel 13).
Beispiel 17
Das ICP10ΔPK(CS)-Virus induziert HSV-spezifische Immunität
Eine Gruppe von 3 Mäusen wurde mit ICP10ΔPK(CS) (1·10⁷ PFU, 3 Injektionen), wie in Beispiel 16 beschrieben, immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden die Milzen entfernt und die T-Zellen wurden im Lymphocytenproliferationstest wie in Beispiel 14 eingesetzt. Bei allen Tieren wurde eine HSV-spezifische Lymphoproliferation beobachtet. Die Proliferationsniveaus (13) waren signifikant höher als die zuvor beobachteten (12) und annähernd um das 3-fache höher als die mit dem Mitogen PHA beobachteten. Diese Befunde zeigen, dass ICP10ΔPK(CS) beachtliche Niveaus von ICP10ΔPK Virus-spezifischen T-Zellreaktionen hervorruft.

Claims

Impfstoffkombination, die Herpes simplex Virus-2 mit einer Löschung in der ICP10 Sektion seines Genoms, so dass die Proteinkinase (PK) Aktivität unterbrochen ist, und einen pharmakologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel aufweist.
Verwendung einer Impfstoffkombination gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Subjekts gegen das Herpes simplex Virus.
Verwendung einer Impfstoffkombination gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments, um Immunität gegen das Herpes simplex Virus auf ein Subjekt zu übertragen.
Verwendung einer Impfstoffkombination gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung klinischer Symptome in Zusammenhang mit dem Herpes simplex Virus an einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 2, 3 oder 4, wobei das besagte Subjekt ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Dosierungsbereich des besagten Impfstoffs von 1–100 Millionen pfu reicht.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei besagte Impfstoffzusammensetzung auf intranasalem, oralem, intravaginalem, subkutanem oder intradermalem Weg verabreicht wird.