KR100341994B1 - 가광견병비루스돌연변이체를포함하는아우제스키병및기타동물질병에대한백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당단백질 gp50을 포함하고 그의 gp50 유전자내에 돌연변이를 갖는 가광견병 비루스를 포함하는, 동물 질병을 예방 및 억제하기 위한 백신을 제공한다. 상기 백신은 돌연변이가 상기 동물 질병에 상응하는 항원을 암호화하는 이종 유전자를 포함하는 삽입인 경우, 아우제스키병(가광견병) 또는 기타 동물 질병에 대해 사용하기 적합하다. 가광견병 비루스는 추가로 gp63 유전자 또는 gI 유전자 같은 그의 기타 유전자중 1 개의 유전자 내에 1개 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 백신은 예방 접종된 동물로부터 예방접종되지 않은 동물로 확산될 수 없다.
Description
발명의 배경
본 발명은 가광견병비루스(PRV), 소위 아우제스키병 비루스(ADV)의 조건 치사 돌연변이체에 관한 것이다. PRV는 가축 및 야생동물에서 아우제스키 병을 야기시키는 강력한 향신경성 헤르페스비루스이다(참조: Mettenleiter, Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis,14, 151-163[1991] ; [G. Wittmann ed.]의 Wittmann 및 Rziha, Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, Kluwer, Boston, 230-325[1989] ; [M.B. Pensaert ed.]의 Pensaert 및 Kluge, Virus infections of porcines, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 39-64[1989]), 돼지는 PRV에 대해 비교적 내성이 있으므로 상기 비루스의 자연 숙주로 생각된다. 침입의 자연 관문은 비인두 부위이다. 상기 비루스는 코 점막 및 인두 점막의 세포에서 복제할 수 있고, 말초 신경에 감염된 후, 중추신경계로 이동하여 어린 돼지에게 종종 치명적인 악성 뇌염을 야기시킨다. 성장한 돼지는 보통 상기 감염에도 생존하나 열병과 폐렴을 발병할 수 있다. 일반적으로 감각 신경절이 감염되면 잠복 상태를 형성한다.
아우제스키병에 대한 에방접종을 수행하면, 감염된 동물의 사망 및 성장 지연에 의해 야기되는 경제적 손실을 줄일 수 있다. 이러한 목적으로 약독성생(live) 비루스에 기초한 백신 및 불활성 비루스에 기초한 백신이 유용하다. 약독성 생 비루스 백신은 불활성 백신보다 더 용이하게 제조되고 비용이 덜 들기 때문에 일반적으로 바람직하다. 게다가, 약독성 비루스는 비측내 투여되는 경우 약독성 비루스 또는 불활성 비루스를 비경구 예방접종하는 경우 보다 더 양호한 예방 효과를 제공할 수 있다.
그러나, 세포 배양물중에서 연속 계대배양후 얻어지는 약독성 생비루스 변이주를 기초로 한 초기 백신은 몇가지 단점이 있다. 즉, 이 백신은 균질하지 않고, 규명되지 않은 미지의 독성과 면역원성을 가진 비루스 변이주를 혼합물내에 함유하고 있는 것이다. 게다가 이 백신은 독성이 복원될 위험성도 있다. 최근에 분자수준에서 비루스의 구조와 복제에 대한 지식이 증가되고 정교한 분자생물학적 기술들이 유용해짐에 따라, 과학자들은 약독성 백신을 우연히 얻기보다는 직접 작제할 수 있게 되었다. 즉, 비루스 유전학 및 DNA 서열 분석을 통해, 변형(alterations)에 의해 비루스 병원성을 약독화할 수 있는 비루스성 게놈 내 부위들을 동정할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 부위를 변형 또는 결실시켜 그 특성이 규명되고 안정성 있게 변형된 약독성 비루스를 제조할 수 있다. Kit 및 그 동료(참조 : Am, J, Vet, Res,46, 1359-1367[1985])에 의해 최초 성공적으로 이러한 접근법이 PRV의 약독화에 적용되었다. PRV의 티미딘-키나제(TK) 유전자를 불활성화시켜서, 돼지에 대한 독성을 크게 감소시켰다(유럽 특허 출원 제 141,458호). 또한 TK 유전자의 손상 외에, gI, gIII 및 gX 같은 당단백질 유전자들을 결실시켜(참조: Kit 등, Am,J,Vet, Res,48, 780-793 [1987]; Marchioli등, Am,J,Vet,Res,48, 1577-1583 [1987]: Quint등, J,Gen,Virol68, 523-534 [1987]; Moormann등, J.Gen. Virol.71, 1591-1595 [1990]; 국제공개 제9102795 호), 상기 비루스의 독성을 더 감쇠시키고, 감염된 동물과 예방접종된 동물을 혈청학적으로 구별할 수 있게 하였다(참조: Platt등, Vet, Microbiol,11, 25-40 [1986] ; Van Oirschot등, J.Gen. Virol,67, 1179-1182 [1986]; Van Oirschot등, J.Virol. Meth.22, 191-206 [1988]: Eloit등, Vet. Rec.128, 91-94 [1989]).
백신 개발의 새로운 접근은 운반체(비루스성 백신 백터)로 약독성 생비루스 백신 변이주를 사용하여 외래 병원체들의 유전자들의 발현시키는 것이다. 생비루스 벡터에 의한 항원의 발현은 자연 감염후의 발현을 모사한 것으로 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응 모두를 자극할 수 있다. 백신 벡터는, 적당한 백신이 시판되고 있지 않거나 적당한 백신을 안전하고 용이하게 제조할 수 없는 질병에 대한 면역화를 위해 사용될 수 있다.
백신 벡터의 개발은 주로 백시니아 비루스에 집중되어 왔다(참조 : Moss 및 Flexner, Ann, Rev, Immunol,5, 305-324 [1987]; Piccini와 Paoletti, Adv, Virus Res,34, 43-64 [1988]), 백시니아 비루스는 인간의 천연두를 근절시키기 위해 널리 사용되어 왔으며, 매우 효과적이며 비교적 안전한 것으로 보여져 왔다. 이러한 백시니아 비루스의 광범위한 숙주 범위 및 외래 DNA를 다량 수용할 수 있는 용량으로 인해, 백시니아 비루스는 백신 백터로서 시험할 특상의 비루스가 되었다(참조: Hruby, Clin. Microbiol. Rev,3, 153-170 [1990]; Tartaglia 등, Crit. Rev. Immunol.10, 13 [1990]). 또한, 백시니아 비루스에 대한 대체물로서, 라쿤폭스 비루스, 아비폭스 비루스, 카프리폭스 비루스 및 수이폭스 비루스 같은 기타 폭스비루스군이 백신 벡터로서 개발되고 있다(참조: Tayor등, Vaccine6, 504-508[1988]; Lodmell등, J. Virol,65, 3400-3405 [1991]; Letellier 등, Arch. Virol.118, 43-56 [1991]).
백신벡터로 사용될 수 있는 다른 비루스로는 아데노비루스류(참조: Berkner, BioTechniques6, 6003-6020 [1988]) 및 헤르페스비루스(참조: Shih등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81, 5867-5870[1984]; Thomsen등, Gene57, 261-265 [1987]; Lowe 등, Proc, Natl, Acad, Sci. U.S.A.84, 3896-3900[1987]; Cole등, J, Virol,64, 4930-4938 [1990]; van Zijl등, J,Virol65, 2761-2765 [1991]; Kit등, Vaccine9, 564-572[1991])가 있다.
다량의 외래 DNA를 수용할 수 있는 용량과 함께 안전하고 효과적인 생체 헤르페르비루스 백신의 유용성으로 인해, 이들 비루스는 백신 벡터의 개발에 이용될 수 있는 유력한 후보이다. 백신 벡터로서 PRV의 사용은 매우 유망하다. PRV는 특성이 잘 규명되어 있고, 안전하고 효과적인 생 백신이 표적화된 결실돌연변이(상기 참조)에 의해 개발되었다. 상기 비루스는 숙주 범위가 광범위하나 인간에게는 무해하다. 최근에 효율적인 운반체 백신으로서 PRV의 적용가능성이 van Zijl등(참조: J, Virol,65, 2761-2765[1991], 국제 공개 제 9100352호)에 의해 입증되었으며, van Zijl 등은 돼지 콜레라 비루스의 외막(envelope) 당단백질 El을 발현하는 PRV 재조합체가 가광견병 및 돼지 콜레라(전형적인 돼지 열병) 모두로부터 돼지를 보호한다는 것을 밝혀냈다.
백신의 가장 중요한 특성 중 하나는 안전성이다. 종래의 약독성 생체 백신의 변형된 표현형을 그 결과로 만드는 정확한 분자 변화는 일반적으로 알려져 있지 않기 때문에, 항상 그들이 독성으로 복원될 수 있는 가능성은 약간 있다. 이 문제는 규명된 안전한 결실 돌연변이를 갖고 있는 재조합 백신을 사용함으로서 제거될 수 있다. 그러나, 안전한 약독성 백신을 구성하는 것은 불가능하지는 않으나 때로는 매우 어렵다. 이런 경우에는 사(killed) 백신류에 의존하거나 안전한 백신 벡터의 사용에 의존할 수밖에 없다. 적절히 제조되고 검사된 약독성 생 결실 백신 및 백신 벡터는 일반적으로 면역적격성 숙주에서 안전하다. 그러나, 면역 타협성 숙주에서는 심한 합병증이 발병될 수 있다. 약독성 생 백신 및 백신 벡터는 복제가 가능하기 때문에, 면역 타협성 숙주를 위협할 수 있는 환경으로 방출될 수 있다. 게다가, 표적 종에서 안전하게 사용할 수 있는 백신도 기타 다른 종에 대해서는 여전히 독성을 나타낼 수 있다.
백신 벡터내에 통합되는 후보 유전자는 자주 면역원성이 높은 비리온 구조 단백질을 코딩한다. 이러한 단백질은 비루스성 당단백질, 융합 단백질 및 혈구응집소-뉴라미니다제를 포함한다(참조: Hruby, Clin, Microbiol. Rev.3, 153-170[1990]). 이러한 단백질은 자주 비루스의 숙주-친화성 및/또는 세포-친화성을 결정하는 비루스-세포 상호작용에 관여한다. 그러므로, 이론적으로 운반체 비루스에 의한 이런 유전자의 발현은 병원성, 조직-친화성 및 숙주-특이성 같은 생물학적 특성을 변경할 수 있다. 게다가, 이렇게 변경된 생물학적 특성들은 상동 재조합에 의해 약독화 벡터 비루스로부터 독성 야생형 비루스로 전이될 수 있다.
상기 언급된 고려사항들은 자기-제한성, 즉 백신 주사를 맞은 동물에 의해 전이되지 않는 생체 백신 및 백신 벡터의 개발에서 논해지고 있다. 이상적으로는 이러한 백신은 비감염성 후대를 생산하여야 하고 대응하는 야생형 비루스와 재조합후에 감염성 비루스를 형성할 수 없어야 한다. 본 발명자는 본 명세서에서 이들 요구 조건을 충족시키는 발명을 기술한다.
발명의 개요
본 발명은 아우제스키병에 대한 예방접종에 사용할 수 있고 안전한 백신 백터로서 사용할 수 있는 조건치사 가광견병 비루스(PRV) 돌연변이체를 제공한다.
본 발명의 변이주는 비루스의 감염성에 필수적인 비루스 외막 단백질인 gp50을 발현할 수 없다. gp50 유전자는 외래 올리고뉴클레오티드의 삽입에 의해 또는 결실에 의해 또는 삽입과 결실 모두(치환)에 의해 불활성화되었다. 특히, gp50 유전자는, 3개의 모든 해독틀에 번역 종지 코돈을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입하거나, 또는 gp50 유전자 및 gp63 유전자 모두의 일부분들을 포함하는 PRV 게놈의 일부분을 결실시킴으로서 불활성화되었다. 이 비루스 돌연변이체는 비루스성 gp50 유전자를 발현하는 상보적인(complementing) 세포주에서 성장한다. 이들 세포에 의해 생성되는 후대 비리온은 표현형상 보완된 것으로서, 즉 상보적인 세포주가 제공하는 gp50을 포함한다. 이런 표현형상 보완된 비리온 돌연변이체는 시험관내 및 생체내 모두에서 세포를 감염시킬 수 있고, 복제하여 세포 대 세포 직접 전염에 의해 확산될 수 있다. 그러나, 감염된 세포로부터 방출된 후대 비리온은 gp50이 결핍되어 있기 때문에 비감염성이다. 이들 비루스는 새로운 감염 사이클을개시할 수 없기 때문에 예방접종된 동물로부터 예방접종되지 않은 동물로 전염될 수 없다. 이러한 제한성 때문에 이들 비루스에 기초한 (운반체)백신은 매우 안전하다.
결론적으로, 본 발명은 동물 질병에 대한 백신을 제조하기 위해 가광견병 비비루스 g50 돌연변이체를 사용하는 것에 대한 것으로, 아우제스키병에 대한 백신을 제조하기 위해, 또는 다른 관련 있는 병원체 유래의 항원 또는 항원의 일부를 코팅하는 뉴클레오티드 서열을 가광견병 비루스 g50 돌연변이체 안으로 통합시킴으로서 다른 동물 질병에 대한 벡터 백신을 제조하기 위해 가광견병 비루스 g50 돌연변이체를 사용하는 것에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 동물 질병을 제어하기 위한 백신으로, 당단백질 gp50을 포함하고 gp50의 유전자가 돌연변이된 가광견병 비루스를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 아우제스키병에 대한 예방용으로 사용될 수 있는데 이 경우 돌연변이는 결실 돌연변이이고, 또한 상기 백신은 기타 다른 동물질병에 대한 예방용으로 사용될 수 있는데 이 경우 돌연변이는 상기 기타 다른 질병을 야기하는 또다른 병원체 유래의 항원 또는 항원의 일부를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 삽입 돌연변이이다. 가광견병 비루스는 그의 독성을 수정하거나 또는 기타 다른 단백질을 발현하기 위해 그의 게놈내에 또다른 돌연변이를 함유할 수 있는데, 돌연변이의 예로는 상기 비루스의 gp63, gI, gIII, gX, 11K, 티미딘 키나제(TK), 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 단백질 키나제 또는 28 K 유전자내, 특히 gI 또는 gp63 유전자내의 결실 및/또는 삽입 돌연변이가 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 변이주 R122, R332, D56O 및 D1200으로 예시되는 PRV gp50 돌연변이체들에 관한 것이다(참조: 제 1도). 변이주 R122 및 R332는 기능성 있는 gp50을 발현할 수 없는 반면, 변이주 D560 및 D1200은 기능성 있는 gp50도 기능성 있는 gp63도 발현할 수 없다. gp50은 비루스 침투에 필수적이므로, 이들 돌연변이체는 gp50을 발현하는 상보적인 세포주에서 성장시킨다. 비상보적인 세포에서도 모든 변이주들은 완전한 복제 사이클을 완성할 수 있지만, 이런 세포로부터 방출된 후대 비리온은 gp50이 결핍되어 있었기 때문에, 비감염성이다. gp50 돌연변이체가 비상보적인 세포주상에 플라크를 형성할 수 있다는 관찰은 상기 비루스가 감염된 세포에서 비감염된 세포로 전염될 수 있음을 나타낸다.
do Wind등(참조: J, Virol,64, 4691-4696 [1900])에 의해 기술된 바와 같이, 3개의 모든 해독틀내에 EcoRI 제한 부위(GAATTC)와 번역 종지코돈을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 서열 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3'(서열 번호: 1)를 플라스미드 pN3HB의 gp50 유전자내의 서로 다른 두 위치에 삽입하여(참조: 제 1도) PRV 변이주 R122 및 R332를 얻었다. 플라스미드 pN3HB는 플라스미드 pBR322내에 PRV의 HindIII-B단편을 클로닝하여 얻은 것이다(참조: van Zijl등, J. Virol65, 2761-2765 [1988]), 상기 올리고뉴클레오티드를 gp50 유전자의 뉴클레오티드 366-367 사이 및 996-997 사이에 삽입한 결과로 형성된 플라스미드를 각각 R1 및 322로 명명하였다. 본 발명자들은 PRV 변이주 라이스(Rice)의 gp50 서열의 뉴클레오티드 서열 넘버링을 이용하였다(참조: Petrovskis등, J.Virol.59, 216-223[1986]의 제 2도), 그러나, PRV 변이주 NIA-3의 gp50 유전자의 뉴클레오티드 서열이 위치 364에서 변이주 라이스의 서열과 다른 결과(G 에서 A), 변이주 NIA-3의 gp50 유전자내에 BgIII 제한 부위가 존재한다는 것을 주지해야 한다.
함께 전체 비루스성 게놈을 구성하는 코스미드 c-179, c-27 및 c-443로부터 유래된 3개의 중첩 아게놈성 야생형 PRV 단편 및 돌연변이된 단편 (R1 또는 322)을 조합 사용한 중첩 재조합에 의해, 비루스성 게놈을 재구성하였다(참조: van Zijl등, J. Virol.65, 2761-2765 [1988]). 중첩 재조합은 구성성분으로 gp50을 발현하는 상보적인 세포주(G5 세포주)에서 수행하였다(참조: Peeters등, J, Virol,66, 894-905 [1992]). 그 결과 생성된 비루스 변이주를 각각 R122 및 R332로 명명하였다.
변이주 D560을 얻기 위해, 플라스미드 322(상기 참조) 및 플라스미드 pN3HB의 다른 유도체 (149로 명명됨, 참조: de Wind 등, J. Virol64, 4691-4696 [1990])를 사용하였는데, 상기 pN3HB 유도체는 상기 올리고뉴클레오티드가 gp63 유전자 내 뉴클레오티드 352-353(Petrovskis등, J. Virol.60, 185-193 [1986]의 제5도에 따라 번호 매겨짐)사이에 삽입된 것이다(참조: 제 1 도), 플라스미드 149의 BgIII-EcoRI 단편을 플라스미드 322의 BgIII-EcoRI 단편으로 대체시킴으로써, 새로운 플라스미드가 형성되었는데, 상기 새로운 플라스미드는 gp50 유전자의 위치 996 및 gp63 유전자의 위치 353사이의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1의 서열(즉, 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 서열)로 대체된 것이다. 이 플라스미드를 중첩 야생형 단편과 함께 사용하고, G5 세포내에서 중첩 재조합을 이용하여 비루스를 재구성하였다. 결과로 형성되는 비루스를 D560이라 명명하였다.
변이주 D1200을 얻기 위해, 플라스미드 149를 제한효소 BgIII 와 EcoRI로 절단하고, 그 결과로 생성된 단편 중 더 큰 단편의 말단을이.콜리DNA 폴리머라제I의 클리노우 단편으로 처리한 후 T4 DNA 리가제를 사용하여 환형화시켰다. 그 결과로 형성된 플라스미드는, gp50 유전자의 위치 336 및 gp63 유전자의 위치 353 사이의 뉴클레오티드 서열이 서열 AATTCTAGCCTA(서열 번호 2; 즉, 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드의 단편)로 대체되었다. 이 플라스미드 및 중첩 야생형 단편을 사용하고, G5 세포에서 중첩 재조합을 이용하여 비루스를 재구성 하였다. 그 결과로 형성되는 비루스를 D1200이라 명명하였다.
이와 같이 형성된 gp50 돌연변이체 R122 및 R332와, gp50 + gp63 돌연변이체 D560 및 D1200은 비상보성 SK6 세포에서 플라크를 형성할 수 있다. 변이주 R122와 R332에 의해 형성된 SK6 세포상의 플라크는 야생형인 어버이 변이주 NIA-3에 의해 형성된 플라크와 크기가 유사하다. 변이주 D560 및 D1200에 의해 형성된 SK6 세포상의 플라크는 크기가 더 작은데, 이는 PRV의 복제 싸이클에 gp63이 관여하고 있음을 나타내는 것이다.
비록 세포 대 세포 전염이 gp50과 무관하다고 하더라도, gp50 돌연변이체 비루스는 살아있는 동물에서 감지할 수 있을 정도로 복제할 것이라고 기대되지는 않았다. 비루스의 독성은 일반적으로 최초 감염 부위에서 복제되어 신체의 다른 부위로 후대 비리온이 확산된 결과 및 수회의 감염을 통해 광범위하게 증식된 결과이다. gp50 돌연변이체는 감염의 최초 부위에서만 복제할 수 있기 때문에, 이들 돌연변이체는 비독성이라고 예상된다. 게다가, 돼지에서 gp50가 방어용 면역 반응을 유도할 수 있다는 발견에 의해 입증되는 바와 같이, gp50 자체가 면역원성이 매우 높기 때문에, 이들 돌연변이가 면역원성이 있는지 여부가 의심스러웠다(참조: Marchioli등, J, Virol.61, 3977-3982 [1987], Mukamoto 등, Vet. Microbiol.29, 109-121 [1991]; Riviere 등, J. Virol.66, 3424-3434 [1992]), 따라서, gp50의 불활성화는 gp50 돌연변이체 및 gp50 + gp63 돌연변이체의 면역원성을 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 돌연변이체 비루스가 중추신경계에 이르지 못할 것으로 예상하였는데, 이는 감염된 조직으로부터 말초신경으로 비루tm가 전파되고 그 후 중추신경계로 이동하기 때문이다. 만일, 비루스의 트랜스-시냅스 이동이 감염성 후대 비리온에 의해 후-시냅스 뉴우런을 재감염시키는 것과 관련이 있다면(참조 : Lycke 등, J. Gen, Virol,65, [1984] ; Card 등, J. Neurosci.10, 1974-1994 [1990]), 돌연변이체 비루스의 중추신경계로의 이동은 시냅스에서 차단될 수 있다. 이것은 비루스가 중추신경계로 들어 가는 것을 방해하며, 따라서 뇌속에서 비루스의 파괴 효과를 방지한다.
gp50 돌연변이 비루스가 동물 조직에서 확산되는지 여부를 결정하기 위해, 면역조직화학법을 사용하여 돼지의 코 점막의 외식편에서 gp50 돌연변이체 R122 및 R332, 및 gp50+gp63 돌연변이체 D560 및 D1200의 복제를 연구하였다.
또한, 생체내 비루스의 복제 및 확산여부를 결정하기 위해 피하 또는 복강내로 쥐를 감염시켰다. 연구결과, 모든 돌연변이체들이 돼지의 코 점막에서 복제할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
놀랍게도, 복강내 또는 피하 접종후 gp50 돌연변이체 및 gp50+gp63 돌연변이체는 쥐에게 치명적인 것으로 밝혀졌다. 변이주 R122의 독성(감염된 동물이 사망하는데 결리는 평균 시간으로 표현됨)은 야생형 변이주 NIA-3에 비해 단지 중간정도로 감소되었다. 그러나, 변이주 D560 및 D1200의 독성은 더 많이 감소되었는데 이는 쥐에 대한 독성에 gp63 이 관여하고 있다는 것을 의미한다. 감염된 동물의 사후 검시 결과 상기 돌연변이체가 뇌 속에서 복제할 수 있는 것으로 나타났다. 복강내로 감염된 동물의 장기에 대한 면역조직화학법을 실시한 결과는 상기 비루스가 말초 신경에서 우선적으로 복제되었다는 것을 보여주었다. 변이주 R122 가 비상보적인 세포에서 성장하여 gp50이 결핍된 경우, 복강내 경로를 통한 감염은 성공하지 못했다. 이는 최초 감염에 gp50이 필요하다는 것을 나타낸다.
표현형이 보완된 PRV gII 돌연변이체(비상보적인 세포주에서 플라크를 형성할 수 없는 비감염성 후대를 생산함)는 쥐에 대해 완전히 무해하다는 관찰 결과는 최초 감염후 성공적인 비루스 확산이 세포 대 세포 전염에 의존함을 나타낸다. 감염성 비루스를 gp50 돌연변이체 또는 gp50+gp63 돌연변이체로 감염시킨 임의의 동물로부터 분리할 수 없다는 발견은 살아있는 동물에서 상기 돌연변이체들에 의해 생산된 후대 비리온이 비감염성이라는 것을 의미한다.
종합적으로, 이러한 결과들은 gp50이 최초 감염에는 필요하나, 비루스의 차후 복제 및 전염에는 필요하지 아니하다는 것을 보여주며, 이는 세포 대 세포 직접 전염이 생체내 비루스 확산의 주 메카니즘이라는 것을 의미한다. 게다가, 이러한 결과들은 비루스의 트랜스-시냅스 이동이 gp50과 무관하며 세포외 비리온에 의한후-시냅스 뉴우런의 드 노보(de novo) 감염의 결과는 아니라는 것을 의미한다.
gp50 돌연변이체 또는 gp50+gp63 돌연변이체로 감염된 임의의 동물로부터 감염성 비루스를 분리할 수 없다는 발견은 살아있는 동물에서 gp50 돌연변이체에 의해 생산된 후대 비리온이 비감염성이라는 것을 의미한다. 이들 돌연변이체의 복제는 감염된/예방접종된 동물에 제한된다. 아우제스키병에 대한 백신의 기초로서 또는 이종 유전자의 발현을 위한 재조합 운반체 비루스로서 gp50 돌연변이체를 사용하면, 예방접종된 동물내에서만 복제되며 다른 종을 포함하는 기타 동물에 확산되지 않는 매우 안전한 백신이 형성될 것이다. 게다가, 만일 이종 유전자를 운반체 비루스 내 gp50 유전자의 위치에 삽입시키면, 야생형 비루스로 재조합시켜도 항상 비감염성 재조합체를 형성할 것이다.
gp50 돌연변이체 R122로 예방접종된 돼지는 독성 야생형 변이주 NIA-3로 추가 접종시킨 후 아우제스키병의 임상적인 증후가 전혀 나타나지 않았다.
gp50+gp63 돌연변이체 D560 및 D1200 로 예방접종된 돼지는 NIA-3로 추가 접종시킨 후 단기간 발열 및 성장 지연을 나타내지만 신경학적 증후를 나타내지는 않았다. 이들 결과는 세포 대 세포 전염에 의해서만 확산될 수 있는 PRV 돌연변이체가 여전히 높은 면역원성을 갖는다는 것을 나타낸다. 게다가, 이들 결과는 최초로 가장 면역원성이 강한 PRV 단백질중 하나인 gp50 (상기 참조)의 발현이 아우제스키병에 대해 돼지를 효율적으로 보호하기 위해 필요한 것은 아니라는 것을 밝혀냈다. 이 결과는 예상하지 못한 것이었다.
가광견병 비루스 감염(아우제스키 병)을 예방 또는 억제하기 위한 본 발명의백신은 활성 성분으로서 전술한 바와 같이 비루스 외막에 gp50이 있고 탈기능화한 gp50 유전자를 갖는 PRV를 함유한다. 추가로 상기 백신은 적합한 캐리어, 임의의 안정화제, 보조제, 용해제, 유화제와 같은 통상의 성분을 포함한다. 상기 백신은 각종 경로, 예를 들어 피내, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비강내로 투여할 수 있다. 비강내 투여가 바람직하다. 또한, 백신은 다가의(multivalent) 백신을 제조하기 위해 기타 질병과 관련된 다른 면역원을 포함할 수 있다.
PRV gp50 돌연변이체가 비루스 벡터로서 사용되는 경우, gp50 유전자내 돌연변이, 바람직하게는 gp50 유전자내 삽입 돌연변이 외에 기타 다른 병원체로부터 유래된 유전 정보를 포함하는데, 상기 병원체의 예로는 돼지콜레라(돼지 열병)비루스, 파르보비루스, 전염성 위-장염 비루스, 돼지 유행성 유산 및 호흡기 증후군(PEARS, 또는 미스테리 돼지병 MSD, PRRS 또는 SIRS), 돼지 호흡기 코로나비루스(PRCV), 돼지 풍토성 설사 비루스 및 인플루엔자 비루스와 같은 비루스 ;파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida),보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica),액티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae),스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis),트레포네마 히오디센테리아(Treponema hyodysenteria),에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 및렙토스피라(Leptospira)와 같은 박테리아; 및엠. 히오뉴모니아(M. hyopneumoniae)와엠. 리오르히니스(M. lyorhinis)와 같은 미코플라스마타가 있다. 병원체의 핵산 서열을 PRV 아게놈 단편내로 클로닝하고 차후 이들을 PRV의 게놈내에 통합시키는 방법은 일반적으로 공지되어 있다. Van Zijl 등에 의한 문헌 (참조 : J. Virol.62, 2191-2195 [1988])에 그 예가 기술되어 있다.
PRV gp50 돌연변이체는 여전히 세포 대 세포 전염에 의해 확산될 수 있지만, 단순 헤르페스 비루스 유형 1 (HSV-1) 및 소 헤르페스비루스 유형-1(BHV-1)의 상동 유전자내 돌연변이는 세포 대 세포 전염에 의해 확산될 수 없는 비루스 돌연변이체를 형성한다(참조 : Ligas 및 Johnson, J, Virol62, 1486-1494 [1988] ; Fehler 등, J Virol.66, 831-839 [1992]). 이는 PRV의 gp50의 기능과 HSV-1 의 gD 및 BHV-1 의 gIV의 기능 사이에 다른점들이 존재한다는 것을 의미한다. 재조합 DNA 기술을 사용하여, PRV gp50 돌연변이체와 유사한 방법으로, HSV-1, BHV-1 및 기타 헤르페스 비루스를 변형시켜서, 이러한 비루스들이 감염성 후대를 생산하지 않으면서 세포 대 세포 전염에 의해 확산될 수 있게 하는 것이 가능할 수 있다. 이는 다수의 안전한 헤르페스 비루스 (운반체)백신을 생성하여, 많은 동물 질병 및 인간 질병을 박멸 및 억제하는데 사용할 수 있다.
도면의 설명
제 1 도
제 1 도는 PRV 게놈 일부의 물리적 지도이다. 화살표는 플라스미드 pN3HB의 gp50유전자 및 gp63유전자 내 링커 삽입 돌연변이생성에 의해 도입될 조기 종결용 종지코돈의 위치 및 이에 상응하는 비루스 돌연변이체 R122, R332, M102 및 M105를 나타낸다(참조 : Peeters 등, J Virol.66, 894-905 [1992]; de Wind 등, J. Virol.64, 4691-4696 [1990]). 수평 막대는 돌연변이체 D560 및 D1200 내에서의 결실 위치와 범위를 나타낸다. 위쪽의 선은 구성성분으로 gp50 을 발현하는 G5 세포에 존재하는 PRV 의 BstXI-StuI 단편을 나타낸다(Peeters 등, J. Virol.66, 894-905 [1992]).
제 2 도
제 2 도는 인간 사이토메갈로비루스 인헨서(enhancer)/프로모터 및 돼지콜레라 비루스 E1 유전자를 포함하는 플라스미드 pEVhis13HCVE1을 나타내는데, 이 플라스미드는 이종 유전자를 포함하는 PRV gp50 돌연변이체를 작제하는데 사용된다(참조 : 실시예 6).
제 3 도
제 3 도는 결실된 gp50 유전자 위치에 있는 PRV 게놈 일부 안에 인간 사이토메갈로비루스 인헨서/프로모터 및 돼지 콜레라 E1 유전자를 포함하는 플라스미드 pBP53E1을 나타내는데, 이 플라스미드는 이종 유전자를 포함하는 PRV gp50 돌연변이체를 작제하는데 사용된다(참조 : 실시예 6).
실시예 1
PRV 변이주 NIA-3의 gp50 유전자의 클로닝 및 gp50을 발현하는 세포주의 작제
모든 재조합 DNA 방법은 표준 기법에 의해 수행되었다(참조 : Maniatis 등, Molecular cloning : a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York [1982]), 플라스미드 pEVhis 14 는 pSV2his(참조 : Hartman 및 Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci, USA85, 8047-8051 [1988])로부터 유래된 것으로, EcoRI-BamHI 단편이 인간 사이토메갈로비루스(hCMV)의 초기즉석(immediate early) 인헨서/프로모터(참조 : Bernard 등, EMBO J.6, 133-138 [1987]), 3 개의 모든 해독틀내에 종지 코돈을 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드 및 폴리 아데닐화 부위를 포함하는 단편으로 대체된 것이다. 플라스미드 pEVhis10은 pEVhis14 로부터 유래된 것으로, hCMV 인헨서/프로모터를 포함하는 BamHI 단편을 결실시킨 것이다. pEVhis14 의 hCMV 프로모터의 하류에 위치한 EcoRV 부위 안으로 PRV 의 gp50 유전자를 (gp50 프로모터가 없는) BstXI-StuI 단편으로 클로닝시켜, 플라스미드 pEVhis14gp50을 수득하였다. 중첩하는 아게놈성 PRV 단편을 함유하는 코스미드 c179, c27 및 c443의 작제 및 그 특성과, pBR322 유도체의 Hind III 부위에 PRV 의 Hind III-B 단편을 함유하는 플라스미드 pN3HB의 작제 및 특성이 개시되어 있다(참조 : Van Zijl 등, J, Virol,65, 2761-2765 [1988]), pN3HB의 gp50 유전자의 2 개의 다른 위치에 링커를 삽입(삽입 R1 및 322)함으로서 gp50-발현을 불활성시키는 방법이 개시되어 있다(참조 : de Wind 등, J. Virol.64, 4691-4696 [1990]).
일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 SK-6 세포를 플라스미드 pEVhis14gp50)으로 형질감염시켰다. 트립신처리에 의해 SK-6 세포를 수집하고, 실온에서 인산염-완충처리한 염수(PBS)로 1 회 세척한 후 얼음-냉 PBS 에 2 × 107세포/ml 로 재현탁시켰다. 멸균한 1 회용 일렉트로포레이션 큐벳(내부 전극 간격 0.4 cm ; BioRad Laboratories)안에서 0℃ 로 보존된 0.5 ml의 세포에 10 ㎍의 플라스미드 pEVhis14gp50을 첨가하였고, 바이오라드 진펄서를 사용하여 25 μF의 전하용량에서 1000 V 방전을 가하였다. 세포를 0℃ 에서 15 분동안 유지시키고 50 ml의배지를 함유하는 75 ㎠ 플라스크에 이전한 후 밤새 항온배양 하였다. 이어서, 형질감염된 세포를 트립신처리하고, 수회 희석시켜, 2.5 mM 히스티디놀을 함유하는 배지를 갖는 100 mm 페트리 접시에 재도포하여 배양하였다. 콜로니가 뚜렷이 가시화 될 때(7-10 일)까지 3-4 일마다 배지를 교환하였다. 각각의 콜로니를 취하여 미량역가 배양 플래이트에 성장시켰다. 단클론성 항체 G50N2 를 사용한 방사능면역침전법 및 면역퍼옥시다제 단층 분석으로 gp50의 발현을 측정하고, 방사능면역침전법으로 측정된 바와 같이 다량의 gp50 을 발현하는 세포주를 G5라고 명명하였다 (참조 : Peeters 등, J. Virol.66, 894-905 [1992]).
실시예 2
돌연변이 비루스의 작제
G5 세포에서 중첩 재조합에 의해 돌연변이체 비루스 R122 및 R332를 작제하였는데, 여기서, 중첩하는 야생형 PRV 서열을 포함하는 3 개의 코스미드 (c-179, c-27 및 c-443, 참조 : Zijl 등, J, Virol.65, 2761-2765 [1988]에 기재됨)와, gp50 유전자의 뉴클레오티드 위치 366-367 사이 및 996-997 사이 각각에 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3' (서열 번호 : 1)을 포함하는 pN3HB 유도체 RI 또는 322 (참조 : de Wind 등, J. Virol,64, 4691-4696 [1990])의 HindIII-B 단편을 사용하였다(제 1 도). EcoRI 제한효소처리(코스미드) 또는 HindIII 제한효소처리(클론 RI 및 322)에 의해 플라스미드로부터 비루스성 DNA 단편을 절단시켰으나, 더 나아가 벡터 서열로부터 분리시키지는 않았다.
250 V 및 960 μF 로 각각 설정한 바이오라드 진펄서 및 전하용량 확장기를사용한 일렉트로포레이션(상기 참조)을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 세포를 6 웰 플래이트에 접종하고 37℃ 에서 3 시간동안 항온배양한 후 배지를 2% 태아송아지혈청, 1% 메틸셀룰로즈를 포함하는 얼의 최소 필수 배지로 교체하고 플라크가 나타날 때(2-3 일)까지 37℃ 에서 항온배양하였다.
변이주 D560 을 얻기 위해, 플라스미드 149 (gp63 유전자의 뉴클레오티드 352-353 사이에 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 pN3HB 유도체, 참조: de Wind 등, J. Virol,64, 4691-4696 [1990]; Petrovskis 등, J. Virol,60, 185-193 [1986] 의 제 5 도에 따른 넘버링)의 Bgl II-EcoRI 단편을 플라스미드 322 의 BgIII-EcoRI 단편으로 대체하였다(참조 : 제 1 도). 그 결과로 나온 플라스미드는 gp50 유전자의 위치 996 과 gp63 유전자의 위치 353 사이의 뉴클레오티드 서열이 서열 TAGGCTAGAATTCTAGCCTA(서열 번호 : 1 ; 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 서열)로 대체된 것으로, 전술한 바와 같이, 중첩하는 야생형 단편과 함께 사용하여 G5 세포에서 중첩 재조합에 의해 비루스를 재생시켰다.
변이주 D1200 을 얻기 위해, 플라스미드 149 를 제한 효소 BglII 와 EcoRI 로 절단시키고, 그 결과로 나온 단편 중 더 큰 단편을이.콜리DNA 폴리머라제 I 의 클리노우 단편으로 처리하여 블런트 말단을 생성시킨 후 자가-라이게이션시켰다. 그 결과로 나온 플라스미드는 gp50 유전자의 위치 336 과 gp63 유전자의 위치 353 사이의 뉴클레오티드 서열이 서열 AATTCTAGCCTA (서열 번호 2 : 즉, 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드의 잔해)로 대체된 것으로, 전술한 바와 같이, 중첩하는 야생형 단편과 함께 사용하여 G5 세포에서 중첩 재조합에 의해 비루스를 재생시켰다.
실시예 3
돼지 코 점막의 외식편에서 gp50 및 gp50 + gp63 돌연변이체의 복제
이들 돌연변이체가 동물 조직내에서 확산 가능한지를 알기 위해서, 돼지 코점막의 외식편을 사용하였다. 이들 외식편은 상피 세포와 간질 섬유아세포의 자연적인 조합을 제공하며, 이들 외식편의 감염은 생체내 코 점막 감염을 매우 유사하게 모사한다는 것이 밝혀졌다(참조 : Pol 등, Res, Vet, Sci,50, 45-53 [1991]), 야생형 PRV 변이주 NIA-3, gp50 링커 삽입 돌연변이체 R122 및 R332, 그리고 gp50+gp63 결실 돌연변이체 D560 및 D1200으로 외식편을 감염시켰다.
감염 24 시간 후, 토끼 항-PRV 혈청(참조 : Pol 등, Res, Vet, Sci,50, 45-53 [1991])을 사용하여, 감염된 점막 외식편을 면역조직화학법으로 관찰한 결과, 야생형 비루스 NIA-3 이 광범위한 면적의 상피 세포에 확산되었다. gp50 돌연변이체 R122 및 R332 그리고 gp50+gp63 돌연변이체 D1200 및 D560 을 사용하여도 유사한 결과가 나타났다. 감염 24 시간후, 거의 상피 세포에서만 한정되게 비루스가 복제되었다. 그러나, 장시간 배양후 모든 변이주는 섬유아세포 근저를 감염시킬 수 있었다. 토끼 항-PRV 혈청 및 단클론성항체 (gp50 에 특이적인 G50N2)를 사용한 감별 면역학적 염색법에 의해 gp50 이 gp50+gp63 돌연변이체 또는 gp50 돌연변이체에서 발현되지 않았음을 확인하였다. 이들 관찰 결과는 gp50 이 돼지 코 점막에서의 비루스 확산에 필수적인 것이 아니라는 것을 보여준다.
실시예 4
생쥐에서 gp50 돌연변이체 및 gp50 + gp63 돌연변이체의 독성
a. gp50 + gp63 무효 돌연변이체(null mutant)는 쥐에 대해 치명적이다.
gp50 돌연변이체가 조직 외식편에서 복제 및 확산할 수 있다는 관찰 결과는 그들이 살아있는 동물에서 복제 및 확산할 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 생쥐는 헤르페르비루스에 대한 감수성이 매우 높고, 독성 및 뉴우런 확산을 연구하기 위한 모델계로서 널리 사용되어 왔기 때문에 실험동물로서 선택하였다(참조 : Fraser 과 Ramachandran, J. Comp. Path,79, 435-444 [1969] : Cook 및 Stevens, Infect, Immun,7, 272-288 [1973] ; Field 및 Hill, J. Gen. Virol.23, 145-157 [1974], Field 및 Hill, J. Gen. Virol.26, 145-148 [1975] ; Kristenson 등, Brain Res.69, 189-201 [1978] : Platt 등, Arch. Virol.63, 107-114[1980]; Dix 등, Infect. Immun,40, 103-112 [1983]), 첫번째 실험에서, 본 발명자들은 접종물안에 야생형 복귀돌연변이체가 존재하는 것을 배제하기 위해 링커 삽입 돌연변이체 R122 또는 R332 대신에 gp50+gp63 결실 돌연변이체 D560 및 D1200 을 사용하였다. 이런 복귀 돌연변이체는 링커 삽입 돌연변이체 군체에서 상보적인 세포주에 있는 비루스 서열들과 비루스 게놈의 상동 재조합에 의해 발생할 수 있다(참조 : Cai 등, J. Virol.62, 2596-2604 [1988] ; Peeters 등, J. Virol.66, 894-905 [1992] ; Peeters 등, J. Virol.66, 3388-3892 [1992]), 변이주 D560 및 D1200 의 gps50+gp63 결실 부위의 3' 쪽에서 서열은 상보적인 G5 세포내에서 상동 대응물이 없기 때문에(제 1 도), 상보적인 G5 세포내에서 이들 돌연변이체가 복제하는 동안야생형 복귀돌연변이체를 생성하는 것이 불가능하다.
6 내지 8 주된 암컷 BALB/c 생쥐(독일연방공화국, 술쯔펠드, 챨스리버) 5 마리를 105플라크 형성 유닛의 변이주 NIA-3, D560, D1200 및 gp63 돌연변이체 M105로 목에서 피하 감염시켰다. 변이주 NIA-3 로 접종된 생쥐는 뒷다리를 사용하여 세차게 긁는, "안면 긁음(face washing)" 및 마비와 같은 심한 아우제스키병 증후을 나타내며, 감염된 지 약 70 시간 후에 죽었다. 변이주 M105로 감염된 동물은 심한 가려움증을 보이지는 않았으나 등을 구부리고 호흡 속도가 증가한채 떨어져 앉아 있었다. 이 동물은 감염된 지 약 90시간 후에 죽었다. 변이주 D560 또는 D1200로 감염된 생쥐는 변이주 M105로 감염된 동물과 유사한 증상을 보였다. 이 동물들은 마비증상을 보인 후, 종종 최대 42 시간까지 지속되는 빈사상태로 진입되고 결국 감염된 지 약 130 내지 140 시킨 후에 죽었다(표 1, 실험 1). 이들 결과는 gp50+gp63 무효 돌연변이체는 여전히 쥐에 대해 치명적임을 보여주었다. 그러나 그들의 독성은 야생형 비루스 또는 gp63 돌연변이체 비루스에 비해 상당히 감소된 것이다.
b. gp50+gp63 무효 돌연변이체는 중추신경계에 도달할 수 있고 중추신경계에서 복제할 수 있다.
변이주 NIA-3로 감염된 생쥐에 비해 gp63 또는 gp50+gp63 돌연변이체로 감염된 생쥐는 신경학적 장애 증상이 훨씬 덜 나타나기 때문에, 면역조직화학법으로 비루스의 존재에 대해 감염된 동물의 뇌를 검사하였다. 감염된 생쥐의 뇌 및 장기의 저온유지 박편을 고정시키고 앞서 상술된 바와 같이 면역조직화학법을 수행하였다(참조: Pol 등, Microb, Path,7, 361-371 [1989]), 제1차 항체로 gp50 에 대한 단클론성 항체를 사용하는 경우, 퍼옥시다제-결합된 염소 항-생쥐 면역글로불린 G 항체를 제2차 배양에 사용하였다(참조 : Peeters 등, J, Virol66, 894-905 [1992]).
놀랍게도, D1200 및 D560으로 감염된 생쥐의 뇌 박편에는 다수의 감염된 뉴우런이 존재하지만, NIA-3 또는 M105로 감염된 쥐의 뇌 박편에는 단지 소수의 감염된 뉴우런이 존재하는 것으로 관찰되었다. 토끼 항-PRV 혈청을 사용한 감별 면역염색법(참조 : Pol 등, Res, Vet, Sci,50, 45-53 [1991])에 의해 측정된 바와 같이, D1200 및 D560으로 감염된 동물의 뇌에 존재하는 비루스는 gp50 을 발현하지 않았다, 비루스를 뇌로부터 분리하여 SK-6 세포상에서 역가측정하였을 때, 감염성 비루스는 NIA-3 또는 M105으로 감염된 동물로부터 용이하게 회수할 수 있었으나, D560 또는 M1200으로 감염된 동물로부터 용이하게 회수할 수 없었다(표 1, 실험 1), 이들 결과는 감염성 후대를 생산할 수 없는 gp50+gp63 무효 돌연변이체는 여전히 중추신경계에 도달할 수 있으며, 중추신경계에서 복제할 수 있음을 나타낸다.
c. gp50 무효 돌연변이체는 강독성이다.
gp63은 비루스 증식에 없어도 되지만 (참조: Petrovskis등, J. Virol,60, 1166-1169 [1986]), 상보적인 G5세포 및 비상보적인 SK-6 세포상에 gp50 + gp63 돌연변이체에 의해 형성된 플라크는 gp50 돌연변이체에 의해 형성된 플라크 보다 훨씬 더 작다. 게다가, gp63은 돼지에서의 독성과 관련 있는 것으로 밝혀져 왔다(참조: Kimman등, J. Gen, Virol.73, 243-251 [1992]). 이러한 발견은 gp50 돌연변이체가 gp50 + gp63 돌연변이체보다 강독성임을 암시하는 것이기 때문에, 본 발명자들은 또한 생쥐에서 gp50 돌연변이체의 독성을 검사하고자 했다. 그러나, 생쥐의 감염에 gp50 돌연변이체를 사용하기 위해서, 접종물이 야생형 복귀 돌연변이체(상기 참조)를 포함하지 않는다는 것이 절대적으로 보장되어야 했다. R122에 의해 형성된 G5세포상의 단일 플라크로 SK-6 세포를 감염시킴으로써, 실질적으로 야생형 복귀돌연변이체가 없는 표현형이 보완된 1 배치(batch)의 R122 비루스를 제조하였다. 감염된 SK-6 세포로부터 비루스 DNA를 분리하고 이 DNA로 단층의 G5세포(PRV에 대한 플래이팅 효율이 크게 감소되어 있음;
Peeters등, J. Virol.66, 894-905 [1992])를 형질감염시켰다. SK-6 세포에서 역가측정된 바와 같이, 2.1 × 107플라크 형성 유닛(pfu)/ml을 포함하는 비루스 배치가 형질감염된 세포로부터 생산되었다. 상기 비루스의 표현형이 보완되었음을 나타내기 위해 이 배치를 R122+로 명명하였다. 희석하지 않은 R122+군체 20㎕ (4. 2×106pfu)로 SK-6세포를 감염시킴으로써 gp50이 결여된 비루스 배치를 생산하였다. 결과물인 비루스 배치는 비루스가 비상보적인 세포로부터 유래되었음을 나타내기 위해 R122로 명명하였으며, 150pfu/ml만큼 함유하였다. 그러나, gp50에 대한 단클론성 항체를 사용하여 면역퍼옥시다제 염색법을 수행하였을 때(참조 : Peeters 등, J. Virol.66, 894-905[1992]), 이들 플라크는 gp50 음성으로 판명되었다. 이 발견은 비루스 군체가 야생형 비루스를 포함하지 않으나 여전히 몇몇 감염성 비루스 입자를 함유하였다는 것을 나타내었다. 이들 입자는 R122-배치를 제조하기 위해 사용된 접종물(R122+)로부터 유도되었을 가능성이 있다. 또는, 후대 비리온이 감염성 R122+비리온에 의해 SK-6 세포의 세포막 안에 놓여진 gp50을 재통합할 수 있을지도 모른다. 다른 가능성으로는 gp50이 결여된 비리온이 세포내 함입(참조: Campadelli-Fiume등, J. Virol.62, 159-167 [1988])에 의해 흡수되고 우연히 분해작용을 피한 결과 생산성 있는 감염을 형성하였을지도 모른다.
R122+및 R122-군체의 물리적 역가는 내부 기준으로 라텍스 비드(직경 91nm; 세르바)를 사용하여 전자 현미경의 도움으로 측정하였다.
R122+독성 검사 외에, 다른 비루스의 독성이 감염 경로에 의존하는지 여부를 검사하였다. 5마리의 생쥐의 군을 105pfu의 변이주 NIA-3, M105, R122+및 D1200로 피하주사 또는 복강내주사를 통해 접종하였다. 변이주 R122+로 감염된 쥐는 NIA-3 감염된 동물에서 보여진 증후와 닮은 아우제스키병의 증후를 나타냈다(상기 참조). NIA-3로 피하 감염시킨 동물에서 첫 번째 증상이 감염된 지 약 34-40시간 후에 나타났으며, R122+로 피하 감염시킨 동물에서는 감염된 지 약 42시간 후에 첫 번째 증상이 나타났다. 상기 동물은 각각 감염된 지 약 56시간 및 68시간 후에 죽었다(표1, 실험 2). 이들 결과는 gp50 돌연변이체 R122+가 여전히 생쥐에 대해 강독성이며, gp50 + gp63 돌연변이체 D1200 또는 gp63 돌연변이체 M105보다 더 독성이강함을 의미한다. 변이주 NIA-3, R122+및 M105를 복강내 주사한 결과, 사망에 이르는 평균 시간이 피하주사에 비해 약 10-13시간 더 연장되었다. 변이주 D1200의 경우, 피하 주사에 비해 사망에 이르는 평균시간이 복강내 주사 후 약 25시간 더 단축되었다(표1, 실험2). 시험한 모든 변이주에 대해, 증상 및 임상적 증후는 감염 경로와 관련이 없었다. 따라서, 감염의 시간 경과에 차이가 있지만, 두 개 모두의 접종 경로는 치명적인 감염을 나타낸다. 실험 2에 사용된 모든 동물의 뇌 박편에서 면역조직화학법으로 비루스를 검출하였다(표1). 또다시, NIA-3, R122+또는 M105로 감염된 동물에 비해 D1200로 감염된 동물의 뇌에서 비루스가 더 광범위하게 복제되었다.
d. 감염된 장기의 말초 신경내에서의 비루스의 우선 복제
비루스 항원의 존재에 대해 면역조직화학법으로 장기의 박편을 검사하였을 때, 복강내로 감염된 동물에서만 비루스 항원을 검출할 수 있었다. 비루스는 간, 비장, 신장, 장 및 부신에서 검출되었으나 폐에서는 검출되지 않았다. 장기에서 비루스 감염은 거의 완전히 신경 섬유에 한정되었다. 이 관찰 결과는 신경 조직이 PRV의 감염 및 복제에 있어서 선호되는 부위라는 것을 의미하며, 이전에 보여준 바와 같이, 역행 축삭 전달에 의해 장기로부터 중추신경계로 비루스가 전달된다는 것을 암시하는 것이다(참조 : Cook 및 Stevens, Infect Immun,7, 272-288 [1973]; Field 및 Hill, J. Gen. Virol.23, 145-157 [1974], Field 및 Hill, J. Gen, Virol.26, 145-148 [1975]; McCracken등, J. Gen. Virol.20, 17-28 [1973];strack 및 Loewy, J. Neurosci,10, 2139-2147[1990]; Card 등, J. Neurosei,101974-1994[1990]), gp50 무효 돌연변이체가 효과적으로 중추신경계로 전달된다는 관찰은 신경전달이 gp50존재에 비의존적이라는 것을 나타낸다.
변이주 NIA-3 및 M105로 복강내 감염된 동물의 장기 추출물로부터 감염성 비루스를 회수하였다. 예상한 바와 같이, 감염성 비루스가 R122+또는 D1200 감염된 동물로부터 회수되지 않았는데, 이는 또다시 이러한 비루스들의 후대가 비감염성이라는 것을 나타내는 것이다. 놀랍게도, 변이주 NIA-3로 피하 감염된 5마리의 동물중 3마리는 장기 추출물의 역가 측정결과 감염성 비루스를 생산하였다(표1, 실험2). 이것은 상기 비루스가 전행성 운동에 의해 중추신경계로부터 이들 장기로 전달되었다는 것을 의미할 수 있다. 변이주 M105로 피하 감염된 생쥐의 장기에 감염성 비루스가 부재하는 것은, 아마도 이 비루스의 전달이 지연되고 있음을 나타내는 것이다.
e. gp50은 생체내 최초 감염에 필요하다.
gp50가 침투에 필요하나 세포 대 세포 확산에 필요하지 않다는 것을 보여준 우리의 생체외 결과(참조: Peeters등, J. Virol.66, 894-905[1992])는 생체내 감염에도 동일하게 적용된다는 것을 제시하였다.
a피하로
b측정되지 않음
c복강내로
d말초신경내로
비록 gp50이 생체내 침투에 필수적이 아니라는 가능성은 거의 없지만, 본 발명자들은 이 경우에 또한 gp50이 최초 감염에 필요하다는 것을 정식으로 입증해야 했다. gp50의 관여 여부를 조사하기 위해, 비상보적인 SK-6세포에서 성장되어 gp50이 결핍된 1 배치의 R122(R122-: 상기 참조)를 사용하였다. 105pfu의 R122+가 3.3 × 106개의 물리적 입자에 해당하기 때문에, 생쥐를 접종하는데 동일 수의 R122-입자를 사용하였다. 예상한 바와 같이, R122+로 복강내 또는 피하 감염된 모든 생쥐가 죽었다(표1, 실험 3), 그러나, R122-로 감염된 모든 생쥐는 복강내 감염된 후 생존하였으며, 다섯마리의 동물 중 1마리는 피하 감염 후 죽었다. 이들 결과는 비루스 외막내에 gp50가 존재하는 것이 동물의 성공적인 감염을 위해 필요하다는 것을 보여준다.
R122-로 감염된 후 죽은 동물을 조사한 결과, 비루스가 뇌에 존재하는 것을 알 수 있었으며, 이는 감염성 비루스가 여전히 접종물에 존재하였다는 것을 의미하는 것이다. 접종물을 비상보적인 SK-6세포상에서 2번 역가측정하였을 때, 각각 9개 및 16개의 플라크가 발견되었다. 면역조직화학법에 의해 측정된 바와 같이, gp50 돌연변이체에 의해 이들 플라크가 생산되었다. 이들 감염성 비리온에 대한 가능성있는 출처는 상기에서 논의되었다. 복강내 감염후 PRV 변이주 NIA-3의 LD50가 약 70 puf이기 때문에, R122-접종물에 존재하는 감염성 비루스 입자는 죽은 한 마리의 동물의 치병적인 감염에 책임이 있을 가능성이 있다.
f. 감염성 후대를 생산할 수 없고, 세포 대 세포 전염에 의해 확산할 수 없는 비루스는 쥐에 대해 무독성이다.
이전에, 본 발명자들은 gp50 무효 돌연변이체와 유사하게 PRV의 gII 또는 gH 무효 돌연변이체가 비상보적인 세포주에서 복제되면 비감염성 후대 비리온이 생성된다는 것을 밝혔다(참조: Peeters 등, J. Virol.66, 894-905 [1992], Peeters등, J. Virol,66, 3388-3892 [1992]). 그러나, gp50 돌연변이체와 대조하여, gII 및 gH 돌연변이체는 비상보적인 세포상에서 플라크를 생산할 수 없었다. 이 발견은 gII 및 gH가 비루스의 세포 대 세포 전염에 필요하다는 것을 의미한다. 세포 대 세포 전염이 생체내에서 성공적인 비루스 확산에 필수조건인지를 확인하기 위해, 표현형이 보완된 PRV gII 무효 돌연변이체 B145(참조 Peeters등, J. Virol. 66, 894-905 [1992])를 사용하여 쥐를 감염시켰다. 105pfu의 B145 비루스로 생쥐를 복강내 또는 피하 감염시켰을 때 아우제스키병의 임의의 증후를 나타내는 동물은 없었다(표 1, 실험 3). 이 결과는 감염성 후대를 생산할 수 없고 세포 대 세포 전염에 의해 확산될 수 없는 비루스는 생쥐에 대해 무독성이라는 것을 의미한다.
실시예 5
돼지에서 gp50 돌연변이체 및 gp50 + gp63 돌연변이체의 독성 및 면역원성
돌연변이체의 독성 및 면역원성을 조사하기 위해 변이주 R122+, D560 및 D1200으로 돼지를 접종시켰다. 야생형 변이주 M209 및 gp63 돌연변이체 M102(제 1 도)(참조: Kimman등, J. Gen. Virol. 73, 243-251[1992])는 대조군으로 사용하였다. 독성 PRV 변이주 NIA-3를 투여하여 면역화시켰다.
들숨시 각 콧구멍으로 비루스 현탁액 0.5ml을 천천히 투여함으로서, 4 내지 6주된 5마리의 돼지 군(중앙 가축병원 연구소에서 특정 병원체가 없는 무리로부터 나온 네덜란드 랜드레이스 돼지)을 105pfu의 비루스로 비강내 감염시켰다. 예방접종한 지 4주 후, 105Pfu의 득성 PRV 변이주 NIA-3을 돼지에 투여하였다. 임상적 증후에 대해 1일 2회 돼지를 관찰하였으며, 매일 직장 온도를 측정하였다. 상기 동물의 체중을 1주당 3회 측정하였다. 각 돼지에 대해 성장 지체, 발열 및 신경학적 증후를 나타내는 일수를 측정하였다, 성장 지체 기간은 투여한 날의 동물의 체중을 재획득하는데 필요한 일수로서 정의하였다. 발열은 40℃를 초과하는 직장온도로 정의하였다. 신경학적 증후는 가려움증, 운동실조증, 마비, 흥분 및 경련으로 정의하였다.
야생형 변이주 M209로 감염된 돼지는 발열, 식욕, 상실, 성장 지체와 같은 전형적인 아우제스키병 증후 및 운동실조증, 마비와 같은 신경학적 증후를 나타냈다(표 2). 돌연변이체 R122+및 M102는 단기간동안 발열 및 성장 지체를 초래하였으나, 신경학적 증후를 나타내지는 않았다. 돌연변이체 R560 및 D1200은 임의의 신경학적 증후를 나타내지 않았고 발열 및 성장 지체도 초래하지 않았다. 이들 결과는 gp50 + gp63 돌연변이체 D560 및 D1200이 돼지에 대해 완전히 무독성인 반면, gp50 돌연변이체 R122+및 gp63 돌연변이체 MIO2는 야생형 PRV에 비해 독성이 상당히 감소된다는 것을 의미한다.
변이주 R122+및 M102로 예방접종된 돼지는 발열 또는 성장 지체를 나타내지 않았고, NIA-3 추가 접종후 임의의 임상적 증후를 나타내지 않았다(표 3).
변이주 D560 및 D1200로 예방접종된 돼지가 몇일동안 무기력하고 2마리의 돼지는 구토 증상이 있었음에도 불구하고, 단기간의 발열 및 성장 지체를 나타냈으나 신경학적 증후는 나타내지 않았다. 예방접종하지 않은 대조군 그룹의 돼지는 아우제스키병의 심한 증후와 비교적 장기간의 발열 및 성장 지체를 나타냈고; 2마리는 죽었다(표 3). 이들 결과는 gp50 돌연변이체 R122+및 gp63 돌연변이체 M102로 예방접종된 돼지는 아우제스키병의 임상적 증후에 대해 완전히 보호되는 반면, gp50 + gp63 돌연변이체 D560 및 D1200로 예방접종된 돼지는 아우제스키병의 임상적 증후에 대해 부분적으로 보호된다는 것을 나타낸다.
$실험중 죽은 돼지 없음.
*평균 일수(+/- 표준 편차)
#1 마리의 돼지가 죽음, 아마도 혈액 샘플 채취 후 외상의 결과인 듯함.
++ 보행실조, 경련 및 마비 같은 신경학적 증후를 나타냄.
*평균 일수(+/- 표준 편차)
++ 보행실조, 경련 및 마비 같은 신경학적 증후를 나타냄
+/- 둔감을 나타냄(때때로 구토함, 본문 참조)
이들 실시예는 PRV의 gp50이 비루스의 감염(침투)에 필수적이나 세포 대세포 전염을 위해서는 필수적이 아니라는 것을 보여준다. 표현형이 보완된 gp50 돌연변이체 및 gp50+gp63 돌연변이체는 감염된 동물에서 복제 및 확산할 수 있다. 그러나, 감염된 세포로부터 방출된 후대 비루스는 비감염성이며, 따라서 감염된 동물은 감염성 비루스를 방출시킬 수 없다. PRV의 넓은 숙주범위 및 다량의 이종 DNA를 수용할 수 있는 능력과 함께 상기 특성으로 인해 PRV gp50 돌연변이체는 아우제스키병 및 기타 동물 질병에 안전한 (운반체)백신을 제조하는데 이상적으로 적격이다.
실시예 6
돼지 콜레라 비루스의 외막 당단백질 E1을 발현하는 gp50 결실 돌연변이체의 작제
gp50 결실 돌연변이체가 이종 유전자의 발현을 위한 벡터 비루스로서의 사용 가능 여부를 검사하기 위해, PRV 변이주 NIA-3의 gp50 유전자는 hCMV 프로모터의 전사 조절하에 있는 돼지 콜레라 비루스(HChV=전형적인 돼지 열병)의 E1 유전자를 포함하는 DNA 단편으로 대체하였다.
PRV 의 Us 영역으로부터 나온 Scal-DraI 단편(gX 유전자의 위치 317-332에서 있는 ScaI 부위, Rea 등, J. Virol.54, 21-29 [1985]의 뉴클레오티드 서열 넘버링; gp63 유전자 및 gI 유전자 사이의 위치 1181-1186 에서 있는 DraI 부위, Petrovskis 등, J. Virol.60, 185-193 [1986]의 뉴클레오티드 서열 넘버링)을 플라스미드 pUC19M (클론테크)의 블런트 NdeI 부위에 클로닝시켰다. 시험관내 위치-특이 돌연변이 생성법 (형질전환기 키트, 클론테크)에 의해 유일한 제한 효소 인식 부위를 gp50 유전자 바로 앞 및 gp50 유전자 바로 뒤에 형성시켰다. 돌연변이 유발성 프라이머 5'-AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC-3'(서열 번호 : 3) 및 5'-CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG-3'(서열 번호 : 4)를 사용하여, 제한 효소 SpeI (ACTAGT) 및 AvrII (CCTAGG)의 인식 서열을 각각 위치-17 내지 위치-12, 위치 1210 내지 위치 1215 에 형성시켰다(참조 : Petrovskis 등, J. Virol.59, 216-223 [1986]에 따른 gp50 유전자의 뉴클레오티드 서열 넘버링), SpeI 및 AvrII로 플라스미드 DNA를 절단시켜 gp50 유전자를 결실시키고, 합성 SpeI-AvrII DNA 단편로 대체시켰다. 상기 합성 SpeI-AvrII DNA 단편은 제한 효소 EcoRI, EcoRV 및 HindIII의 인지 서열을 포함하며, 상기 합성 DNA 단편은, 서열 5'-CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC-3'(서열 번호 : 5) 및 서열 5'-CTAGGAAGCTTGAT ATCGAATTCA-3'(서열 번호 : 6)을 각각 갖는 2 개의 1본쇄 올리고뉴클레오티드를 등몰 함량으로 아닐링시킴으로서 얻어졌다. 이어서, NcoI 및 PstI로 플라스미드 pGEM5Zf(+) (프로메가)를 절단시킨 후, gp50 결실을 함유하는 NcoI-PstI 단편(gX 유전자의 위치 883-888 에 있는 NcoI 부위, Rea 등, J. Virol.54, 21-29 [1985]의 뉴클레오티드 서열 넘버링 ; gp63 유전자의 위치 439-444에서 있는 PstI 부위, Petrovskis 등, J. Virol.60, 185-193 [1986]의 뉴클레오티드 서열 넘버링)을 상기 플라스미드 안으로 클로닝시켰다. 결과로 생성되는 플라스미드를 pBP53으로 명명하였다.
HChV의 E1 유전자는 HChV 변이주 브레시아(Brescia)의 cDNA 클론으로부터 유래되었다(참조 : Moormann 등, Virology177, 184-198 [1990]). 상기 유전자를 DsaI-EcoRV 단편(이. 콜리DNA 폴리머라제 I 의 클리노우 단편으로 DsaI 부위가 채워져 있음; Moormann 등, Virology177, 184-198 [1990]의 뉴클레오티드 서열 넘버링에 따른 뉴클레오티드 2337-3804)으로써 플라스미드 pEVhis13의 EcoRI 부위(이. 콜리DNA 폴리머라제 I 의 클리노우 단편으로 채워져 있음)와 EcoRV 부위 사이에 클로닝시켰다. 후자의 플라스미드는 플라스미드 pSV2his (참조 : Hartman 및 Mulligan, Proc, Natl Acad, Sci, USA85, 8047-8051 [1988]의 유도체인데, 플라스미드 pSV2his는 hCMV 프로모터와 그 다음에 오는 ATG 개시코돈, 다수의 유일한 제한 부위 및 3 개의 모든 해독틀내의 번역 종지 코돈을 포함한다(참조 : Peeters 등, J. Virol.66, 894-905 [1992] ; 실시예 1 참조). 결과로 나온 플라스미드에서 E1 유전자는 pEVhis13의 개시코돈과 함께 프레임내에 융합되어 있다. 이 플라스미드를 pEVhis13HCVE1 으로 명명하였다(제 2 도). Hpa I 및 PstI 로 플라스미드 pEVhis13HCVE1을 절단한 후, hCMV 프로모터, E1 유전자 및 번역 종지 코돈을 포함하는 단편을 분리하였다. HpaI-PstI 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 형성한 후, pBP53 의 EcoRV 부위에 클로닝시켰다. E1 유전자의 전사 방향이 pBP53의 gX 및 gp63 유전자의 전사 방향과 유사한 방향으로 단편이 삽입된 플라스미드를 분리하고 pBP53E1 으로 명명하였다(제 3 도).
E1 유전자가 정확하게 클로닝되었는지 여부를 시험하기 위해, G5 세포에서 E1 의 일시적 발현을 조사하였다. 리포펙틴 (lipofectin)(지브코 비알엘)을 사용하여 플라스미드 pBP53E1 또는 pEVhis13HCVE1로 세포를 형질감염시켰다. 2일후 단층을 고정시키고, HChV 의 당단백질 E1 에 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 단클론성 항체 3 및 4 를 사용한 면역학적 염색법으로 E1 의 발현을 검사하였다(참조 : Wensvoort, J. Gen. Virol.70, 2685-2876 [1989]).
pBP53E1 로 형질감염된 세포에서 E1 의 발현을 명백하게 볼 수 있었으며, pEVhis13HCVE1로 형질감염된 세포보다 훨씬 더 강한 염색을 나타냈다. 이 결과는 E1이 pBPS3E1의 환경내에서, 즉 PRV 서열과 접할 때 효율적으로 발현된다는 것을 의미한다.
플라스미드 pBP53E1 을 PvuII 및 PstI 로 절단하고, 리포펙틴을 사용하여 G5 세포를 PRV 변이주 NIA-3의 비루스 DNA와 함께 플라스미드 pBP53E1로 공동 형질감염시켰다. 2일 후, 플라크가 분명하게 보일 때, 단층을 고정시키고 일시적 발현 분석을 위해 전술한 바와 같이 면역학적으로 염색하였다. 염색된 플라크의 존재는 E1 유전자가 상동 재조합에 의해 비루스 게놈에 이전되었고, E1 유전자가 재조합 비루스에 의해 발현되었다는 것을 의미한다. 재조합 비루스를 분리하기 위해, 형질감염 실험을 반복하고 400 개의 개별적인 플라크를 분리하였다. E1을 발현하는 재조합체를 동정하기 위해, SK-6 세포를 포함하는 미량역가 플래이트에 분리주의 일부분을 옮겼다. 2 일 동안 항온배양한 후, 플라크가 보였고, 감염된 단층을 고정하여 면역학적 염색에 의해 E1의 발현을 검사하였다. 결국, E1 을 발현하는 재조합 비루스는 SK-6 세포 상에서 염색된 플라크를 생성하는 최초 분리주로부터 정제된 플라크였다.
HChV 의 E1을 발현하는 PRV 의 재조합 백신 변이주는, HChV 의 추가 항원 접종 후 전형적인 돼지 콜레라로부터 돼지를 보호한다는 것이 밝혀졌다(참조 : Van Zijl 등, J. Virol.65, 2761-2765 [1991]), 이들 발견을 기초로, 상기한 비전염성 E1-발현 gp50 결실 돌연변이체는 또한 돼지에서 전형적인 돼지 콜레라에 대한 방어성 면역 반응을 유도할 수 있다.
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Claims (4)
- 헤르페스비루스에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 억제용 백신에 있어서,상기 백신은 당단백질 gp50을 함유하고 gp50 유전자를 돌연변이시킨 결과 gp50 유전자가 불활성화된 가광견병 비루스 돌연변이체를 포함하되,상기 가광견병 비루스 돌연변이체는 비루스-유도성 세포 대 세포 전염에 의해서만 확산될 수 있고 비감염성 후대 비리온을 형성하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제1항에 있어서,상기 돌연변이는 결실 돌연변이이며,상기 질병은 아우제스키병인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제1항이 있어서,상기 질병은 하나 이상의 동물 질병을 포함하되,상기 돌연변이는 상기 동물 질병에 상응하는 항원을 코팅하는 이종 유전자(heterologous gene)를 포함하는 삽입 돌연변이인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제1항에 있어서,상기 가광견병 비루스는 gp63 유전자 또는 gI 유전자 같은 기타 다른 유전자중 어느 1 개의 유전자내에 1종 이상의 돌연변이를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
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