HU220099B - Aujeszky-féle betegség és más, álveszettségvírus-mutáns által okozott állati megbetegedések elleni vakcina - Google Patents
Aujeszky-féle betegség és más, álveszettségvírus-mutáns által okozott állati megbetegedések elleni vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- HU220099B HU220099B HU9500039A HU9500039A HU220099B HU 220099 B HU220099 B HU 220099B HU 9500039 A HU9500039 A HU 9500039A HU 9500039 A HU9500039 A HU 9500039A HU 220099 B HU220099 B HU 220099B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- virus
- mutants
- disease
- virol
- Prior art date
Links
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 61
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 59
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 5
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 115
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 72
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 32
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 101150118312 gp63 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 6
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 101150015940 gL gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 51
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 abstract description 47
- 230000007480 spreading Effects 0.000 abstract description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 20
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 16
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 10
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 10
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 10
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 9
- 230000034994 death Effects 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 8
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 208000020470 nervous system symptom Diseases 0.000 description 7
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 7
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 4
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 2
- 101800001475 Spike glycoprotein E1 Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 206010016165 failure to thrive Diseases 0.000 description 2
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700664 Capripoxvirus Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 208000035032 Multiple sulfatase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000621511 Potato virus M (strain German) RNA silencing suppressor Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 101710167195 Putative adenosylcobalamin-dependent ribonucleoside-triphosphate reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 241000700568 Suipoxvirus Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 108010059485 brain synaptic membrane glycoprotein gp 50 Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006033 mucosulfatidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000009844 retrograde axon cargo transport Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A találmány állati megbetegedések megelőzésére és/vagy terjedésénekmegakadályozására szolgáló vakcinákkal foglalkozik, melyek gp50glikoproteint tartalmazó Pseudorabies vírust tartalmaznak, és a gp50génjükben mutációt hordoznak. A találmány szerinti vakcinák Aujeszky-féle megbetegedés (álveszettség) ellen alkalmazhatók, vagyalkalmazhatók egyéb állati betegségek ellen, ha a mutáció egy, azemlített állati betegségnek megfelelő antigént kó- doló heterológ génttartalmazó inszertálás. Az álveszettségvírus tartalmazhat ezenkívüllegalább még egy mutációt egy másik génjében, például a gp63 vagy a gIgénekben. A találmány szerinti vakcinák nem képesek vakcinázottállatokról nem vakcinázott állatokra való terjedésre. ŕ
Description
A találmány tárgyát feltételesen letális mutációt hordozó álveszettségvírus (PRV), más néven Aujeszky-féle betegségvírus- (ADV-) mutánsok képezik. A PRV egy igen neurotrop herpeszvírus, amely háziállatokban és vadállatokban az Aujeszky-féle betegséget okozza [összefoglalókat lásd, Mettenleiter, Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., 14, 151-163 (1991); Wittman és Rziha, G. Wittman szerkesztő, Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, Kluwer, Boston, 230-325 (1989); Pensaert és Kluge, Pensaert szerkesztő, Vírus infections of porcines, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 39-64 (1989)]. A sertések viszonylag ellenállók a PRV vírus ellen, ezért a vírus természetes gazdájának tekinthetők. A természetes fertőzési kapu az orr-garat üreg. A vírus képes az orr és garat nyálkahártyasejtjeiben szaporodni, majd a perifériás idegek fertőzését követően a központi idegrendszerbe jut, ahol súlyos agyvelőgyulladást okoz, amely fiatal malacokra gyakran végzetes. Az idősebb malacok rendszerint túlélik a fertőzést, azonban láz és tüdőgyulladás jelentkezhet náluk. Az érzékelő idegdúcok fertőzésével általában tünetmentes vírushordozás alakul ki.
Az Aujeszky-féle betegség elleni vakcinázást a fertőzött állatok pusztulása és a gyarapodás elmaradása következtében létrejött gazdasági kár mérséklése érdekében végzik. A célra legyengített élővírus- és inaktiváltvírusalapú vakcinák állnak rendelkezésre. Általában a legyengített élővírus-vakcinák előnyösebbek, mivel könnyebben előállíthatok, és ezért az maktivált vakcináknál kevésbé költségesek. Ezenkívül a legyengített vírus orron át adagolható, amivel megfelelőbb védettség hozható létre, mint a parenterálisan adagolt, legyengített élő vagy inaktivált vírussal végzett vakcinázással.
A sejttenyészeteken végzett sorozatos passzálások útján nyert, legyengített élő vírustörzseket tartalmazó korábbi vakcinák több hátránnyal rendelkeztek. Az ilyen vakcinák nem voltak homogének, és az elegyben ismeretlen virulenciájú és immunogenitású vírusvariánsokat is tartalmaztak. Az ilyen vakcinák ezenkívül azzal a kockázattal jártak, hogy bennük virulens revertánsok jöhetnek létre. Napjainkban a vírusok szerkezetére és szaporodására vonatkozó molekuláris szintű ismereteink megnövekedésével és kifinomult molekuláris biológiai eljárások ismeretében a szakmában járatos személy ahelyett, hogy a véletlenre hagyatkozna, képessé vált legyengített vakcinák tervezésére. A vírusgenetika- és DNS-szekvenciavizsgálat lehetővé teszi a vírusgenomon belül azon régiók azonosítását, melyek megváltoztatása hozzájárulhat a vírus kórokozó képességének gyengüléséhez. A rekombináns DNS-eljárások alkalmazása lehetővé teszi az ilyen régiók módosítását vagy kiiktatását, ami meghatározott és stabil módosításokat tartalmazó, legyengített vírus előállításához vezet. Ezt a megközelítést először Kit és munkatársai alkalmazták [Am. J. Vet. Rés., 46, 1359-1367 (1985)] a PRV legyengítésére. A PRV timidinkináz- (TK-) génjének inaktiválása sertésekben nagymértékben csökkent virulenciával rendelkező vírust eredményezett (141 458 számú európai szabadalmi leírás). A TK-génben létrehozott laesión kívül deléciókat hoztak létre glikoproteingénekben, például a gl, glll és gX génekben [Kit és munkatársai, Am. J. Vet. Rés., 48, 780-793 (1987); Marchioli és munkatársai, 1577-1583 (1987); Quint és munkatársai, J. Gén. Virol., 68, 523-534 (1987); Moormann és munkatársai, J. Gén. Virol., 71, 1591-1595 (1990); WO-9102795 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés], ami a vírus virulenciájának további csökkenéséhez vezetett, valamint ahhoz, hogy szerológiai módszerrel meg lehessen különböztetni a vakcinázott állatokat a fertőzött állatoktól [Platt és munkatársai, Vet. Microbiol., 11, 25-40 (1986); Van Oirschot és munkatársai, J. Gén. Virol., 67, 1179-1182 (1986); Van Oirschot és munkatársai, J. Virol. Meth., 22, 191-206 (1988); Eliot és munkatársai, Vet. Rec., 128, 91-94 (1989)].
A vakcinafejlesztés új megközelítési módja idegen kórokozókból származó gének expresszálása élő, legyengített vírusvakcinatörzsek hordozóként (vírus-vakcinavektorokként) való alkalmazásával. Az antigének élő vektorvírus által történő expresszálása utánozza a természetes fertőzést követően történő expresszálást és mind a Immorális, mind a celluláris immunválaszt stimulálhatja. Vakcinavektorok olyan betegségek ellen alkalmazhatók immunizálásra, amelyek ellen jelenleg nem áll rendelkezésre megfelelő vakcina, illetve a vakcina nem állítható elő biztonságosan vagy könnyen.
A vakcinavektorok fejlesztése főként a hímlővírusra összpontosult [Moss és Flexner, Ann. Rév., Immunoi., 5, 305-324 (1987); Piccini és Paoletti, Adv. Vírus Rés., 34, 43-64 (1988)]. A himlővírust kiteqedten alkalmazták emberben a himlő felszámolására, és az igen hatásosnak és viszonylag biztonságosnak bizonyult. A széles gazdaszervezet-spektrum és az a képessége, hogy nagy mennyiségű idegen DNS-t tud befogadni, a himlővírust tették elsősorban vakcinavektorként vizsgálandó vírussá [Hruby, Clin. Microbiol. Rév., 3, 153-170 (1990); Tartaglia és munkatársai, Crit. Rév. Immunoi., 10, 13 (1990)]. A himlővíruson kívül más poxvírusokat, például a raccoonpoxvírust, avipoxvírusokat, capripoxvírust, valamint a suipoxvírust fejlesztették vakcinavektorokká [Taylor és munkatársai, Vaccine, 6, 504-508 (1988); Lodmell és munkatársai, J. Virol., 65, 3400-3405 (1991); Letellier és munkatársai, Arch. Virol., 118, 43-56 (1991)].
Egyéb vakcinavektorokként alkalmazható vírusok az adenovírusok [Berkner, BioTechniques, 6, 6003-6020 (1988)] és herpeszvírusok [Shih és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, 5867-5870 (1984); Thomsen és munkatársai, Gene, 57, 261-265 (1987); Lowe és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 3896-3900 (1987); Colé és munkatársai, J. Virol., 64, 4930-4938 (1990); van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1991); Kit és munkatársai, Vaccine, 9, 564-572 (1991)]. Az a tény, hogy biztonságos, hatékony herpeszvírus-vakcinák állnak rendelkezésre, valamint hogy ezek nagy mennyiségű idegen DNS befogadására képesek, ezeket a vírusokat vakcinavektorok kifejlesztésére alkalmasnak látszó jelöltekké teszi. Igen ígéretes a PRV vakcinavektorként való alkalmazása. A PRV alaposan jellemzett, és célzott deletálásos eljárással biztonságos és hatékony élő vakcinákat fejlesztettek
HU 220 099 Β ki belőle (lásd fent). A vírus széles gazdaszervezetspektrummal rendelkezik, de emberre ártalmatlan. A PRV hatékony hordozóvakcinaként való alkalmazását nemrégiben van Zijl és munkatársai írták le [J. Virol., 65, 2761-2765 (1991); WO-9100352 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés], akik kimutatták, hogy a sertéskolera-vírus El burokglikoproteinjét expresszáló PRV-rekombinánsok mind álveszettség, mind sertéskolera (klasszikus sertésláz) ellen védettséget hoztak létre malacokban.
A vakcinák egyik legfontosabb tulajdonsága a biztonságosságuk. Mivel azok a pontos molekuláris változások, amelyek a szokásos módon gyengített élő vakcinák megváltozott fenotípusát eredményezik, általában nem ismertek, mindig fennáll egy kis esélye annak, hogy azok virulenciájukat visszanyerik. Ez a probléma meghatározott és stabil deléciókat hordozó rekombináns vakcinák alkalmazásával küszöbölhető ki. Stabilan legyengített vakcinák előállítása azonban néha igen bonyolult, ha éppen nem lehetetlen. Ebben az esetben elölt vakcinák, illetve biztonságos vakcinavektorok alkalmazására kell hagyatkozni. Megfelelően előállított és vizsgált, élő, gyengített deléciós vakcinák és vakcinavektorok alkalmazása normális immunválaszra képes gazdaszervezetekben általában biztonságos. Legyengült immunrendszerrel rendelkező gazdaszervezetekben azonban súlyos komplikációk fordulhatnak elő. Mivel az élő gyengített vakcinák és vakcinavektorok szaporodásra képesek, kiszabadulhatnak a környezetbe, ahol a legyengült immunrendszerrel rendelkező gazdaszervezetre veszélyt jelenthetnek. Ezenkívül a célzott fajban biztonságosan alkalmazható vakcina egyéb fajokra még virulens lehet.
Vakcinavektorokba építhető gének gyakran igen immunogén strukturális virionproteineket kódolnak. Ezek a proteinek lehetnek vírus eredetű glikoproteinek, fúziós proteinek, valamint hemagglutinin-neuraminidázok [Hruby, Clin. Microbiol. Rév., 3, 153-170 (1990)]. Az említett proteinek gyakran olyan vírus-sejt kölcsönhatásokban játszanak szerepet, amelyek meghatározóak a vírus-gazdaszervezet és/vagy sejt tropizmusában. Az ilyen géneknek a hordozóvírusban való expresszálása elméletileg megváltoztathatja annak biológiai sajátságait, úgymint annak kórokozó képességét, szövettropizmusát, valamint gazdaszervezet-faj lagosságát. Ezenkívül a megváltozott biológiai sajátságok homológ rekombináció révén átkerülhetnek a legyengített vektorvírusról egy virulens vad típusú vírusra.
A fent említett szempontok olyan önkorlátozó élő vakcinák és vakcinavektorok kifejlesztése mellett szólnak, amelyeket a vakcinázott gazdaszervezet nem terjeszt. Ideális esetben egy ilyen vakcinánál nem fertőző utódok jönnek létre, és nem képes a megfelelő vad típusú vírussal való rekombináció révén fertőző vírus létrehozására. Az alábbiakban ismertetett találmányunk a fenti kívánalmaknak megfelel.
A találmány tárgyát olyan feltételesen letális álveszettségvírus- (PRV-) mutánsok képezik, amelyek Aujeszky-féle betegség elleni vakcinázásra, és biztonságos vakcinavektorokként alkalmazhatók. A találmány szerinti törzsek nem képesek a vírus fertőzőképességéhez nélkülözhetetlen vírusburokprotein, a gp50 expresszálására. A gp50 gént vagy egy idegen oligonukleotid inszertálásával vagy deletálással, vagy mindkettővel (helyettesítéssel) inaktiváltuk. Pontosabban, a gp50 gént egy, mindhárom olvasási keretben transzlációs befejezőkodonokat tartalmazó szintetikus oligonukleotid inszertálásával, illetve a PRV-genom egy olyan részének deletálásával inaktiváltuk, amely a gp50, valamint a gp63 gének egy részét tartalmazza. A mutáns vírusokat egy olyan kiegészítő sejtvonalon tenyésztettük, amely expresszálja a gp50 vírusgént. A fenti sejtvonalon előállított utódvírusok fenotípusosan kiegészítettek, azaz a kiegészítő sejtvonal szolgáltatja a szükséges gp50-et. Az ilyen fenotípusosan kiegészített mutáns virionok mind in vitro, mind in vivő képesek sejtek fertőzésére, valamint sejtről sejtre való közvetlen átjutás révén szaporodni és terjedni. A fertőzött sejtekből kiszabaduló utódvirionok azonban, mivel nem rendelkeznek gp50-nel, nem fertőzőképesek. Mivel nem képesek új fertőzési ciklus megindítására, ezek a vírusok nem terjedhetnek a vakcinázott állatokról nem vakcinázottakra. Ez a korlátozás az ezen vírusokon alapuló (hordozó) vakcinákat igen biztonságossá teszi.
Következtetésképp, a találmány tárgyát gp50 mutáns álveszettségvírusok alkalmazása képezi állati megbetegedések ellen alkalmazható vakcinák előállítására, az Aujeszky-féle betegség elleni vakcina előállítására, vagy az említett mutánsokba egyéb szóba jövő kórokozókból származó antigéneket, illetve antigének részét kódoló nukleotidszekvenciák beépítése révén egyéb állati megbetegedések elleni vektorvakcinák előállítására.
A találmány kiteljed állati betegség teqedésének megakadályozására szolgáló vakcinákra, melyek olyan álveszettségvírust tartalmaznak, amelyek glikoprotein gp50-et tartalmaznak, és a gp50 génjükben mutációt hordoznak. A vakcina szolgálhat Aujeszky-féle betegség elleni védettség létrehozására, ebben az esetben a mutáció deletálás, vagy szolgálhat egyéb állati betegségek elleni védettség kialakítására, ebben az esetben a mutáció az említett, más állati betegséget kiváltó egyéb kórokozóból származó antigént vagy egy antigén részét kódoló heterológ nukleotidszekvenciát tartalmazó inszertálás. Az álveszettségvírus genomjában tartalmazhat egyéb mutációkat virulenciájának módosítása vagy egyéb proteinek expresszálása céljából, például deléciókat és/vagy inszerciókat a gp63 génben, a gl, glll, gX, 11K, a timidinkináz (TK), a ribonukleotid-reduktáz (RR), proteinkináz, illetve a 28K génekben, előnyösen a gl és a gp63 génekben.
A találmány tárgyát a gp50 génben mutációt hordozó PRV-mutánsok képezik, melyeket az R122, R332, D560 és a D1200 törzsek példáznak (lásd 1. ábra). Az RÍ 22 és az R332 törzsek nem képesek működőképes gp50 expresszálására, míg a D560, és a D1200 törzsek nem képesek működőképes gp50, valamint gp63 expresszálására. Mivel a gp50 nélkülözhetetlen a vírus penetrálásához, ezeket a mutánsokat egy gp50-et expresszáló kiegészítő sejtvonalon tenyésztjük. Bár mindegyik törzs képes egy teljes szaporodási ciklust végezni ί
HU 220 099 B nem kiegészítő sejtekben, az ezekből a sejtekből kiszabaduló utódvirionok nem fertőzőképesek, mivel nem tartalmaznak gp50-et. Az a megfigyelés, hogy a gp50 mutánsok nem kiegészítő sejtvonalon plakkokat hoznak létre, arra utal, hogy a vírus képes a fertőzött sejtről nem fertőzött sejtre való átjutásra.
Egy, az 5’-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3’ (1. szekvencia) szekvenciával rendelkező szintetikus oligonukleotidot, amely egy EcoRI restrikciós felismerőhelyet (GAATTC), valamint mindhárom olvasási keretben transzlációs befejezőkodonokat tartalmaz, inszertáltunk a pN3HB plazmidba a gp50 gén két különböző helyére Wind és munkatársai leírása szerint [J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)] (lásd 1. ábra), így kaptuk az R122 és R332 PRV törzseket. A pN3HB plazmid a pBR322 plazmidba klónozott HindlII fragmensből áll [van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1988)]. Az így kapott plazmidot, amelybe az oligonukleotidot a gp50 gén 366-367., illetve a 996-997. nukleotidjai közé inszertáltuk, Rl-nek, illetve 322-nek neveztük. A Rice PRV törzs gp50 szekvencia szerinti nukleotidszekvencia-számozást használtuk [Petrovskis és munkatársai, J. Virol., 59, 216-223 (1986), 2. ábra]. Megjegyzendő azonban, hogy a NIA-3 PRV törzs gp50 génjének nukleotidszekvenciája a 364. pozícióban eltér a Rice törzs szekvenciájától (G helyett A), ami a NIA-3 törzs gp50 génjében egy Bglil restrikciós hasítási helyet eredményez. A vírusgenomok rekonstrukcióját átfedő rekombinációs eljárással végeztük [van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1988)] a mutagenizált ffagmens (az Rl, illetve a 322), valamint a c-179, a c-27 és a c-443 kozmidokból származó, együttesen a teljes vírusgenomot tartalmazó három, átfedő szubgenomiális vad típusú PRV-fragmens kombinációjának felhasználásával. Az átfedő rekombinációt egy olyan kiegészítő sejtvonalban (G5 sejtvonal) végeztük, amely folyamatosan expresszál gp50-et [Peeters és munkatársai, J. Virol, 66, 894-905 (1992)]. Az így kapott vírustörzseket R122-nek, illetve R332-nek neveztük.
A D560 törzs előállításához a 322. jelzésű plazmidot (lásd fent) és a pN3HB plazmid egy másik, 149. jelzésű származékát használtuk [de Wind és munkatársai, J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)], amelyben az oligonukleotidot a gp63 génbe a 352-353. nukleotidok [a számozást lásd, Petrovskis és munkatársai, J. Virol., 60, 185-193 (1986), 5. ábra] közé inszertáltuk (lásd
1. ábra). A 149. jelzésű plazmidban a BglII-EcoRI fragmensnek a 322. jelzésű plazmid BglII-EcoRI ffagmensével való helyettesítésével egy új plazmidot kaptunk, amelyben a gp50 gén 966. pozíciója és a gp63 gén 353. pozíciója közti nukleotidszekvenciát az 1. szekvenciával (azaz a mutagén oligonukleotid-szekvenciával) helyettesítettük. Ezt a plazmidot használtuk az átfedő vad típusú ffagmensekkel együtt G5 sejtekben átfedő rekombinációs eljárással a vírus regenerálására. Az így kapott vírust D560-nak neveztük.
A D1200 törzs előállításához a 149. plazmidot Bglil és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és az így nyert nagyobbik fragmenst, miután a végeket
E. coli DNS-polimeráz I. Klenow-fragmensével kezeltük, T4 DNS-ligázzal körkörössé alakítottuk. Az így kapott plazmidban a gp50 gén 336. pozíciója és a gp63 gén 353. pozíciója közti nukleotidszekvenciát az AATTCTAGCCTA (2. szekvencia; vagyis a mutagén oligonukleotid-maradéka) szekvenciával helyettesítettük. Ezt a plazmidot használtuk az átfedő vad típusú ffagmensekkel együtt G5 sejtekben, átfedő rekombinációs eljárással a vírus regenerálására. Az így kapott vírust D1200 jelzéssel láttuk el.
A gp50 génben mutációt hordozó R122 és R332 mutánsok, valamint a gp50 és a gp63 génekben mutációt hordozó D560 és D1200 mutánsok képesek nem kiegészítő SK-6 sejteken plakkok létrehozására. Az SK-6 sejteken az R122 és R332 törzsek által létrehozott plakkok hasonló méretűek, mint a vad típusú NIA-3 szülői törzs által létrehozott plakkok. Az SK-6 sejteken a D560 és Dl200 törzsek által létrehozott plakkok kisebb méretűek, ami a gp63 génnek a PRV replikációs ciklusában játszott szerepére utal.
Bár a sejtről sejtre való terjedés független a gp50től, a gp50 mutáns vírusoktól nem vártuk, hogy jelentős mértékben szaporodjanak élő állatokban. A vírusok virulenciája általában a fertőzés elsődleges helyén való szaporodásnak és az utódvirionok a test egyéb részeire való szóródásának, valamint sokszorosan ismétlődő fertőzési körök révén létrejövő kiterjedt szaporodásának eredménye. Mivel a gp50 mutánsok csak az elsődleges fertőzés helyén képesek szaporodni, azt vártuk, hogy ezek a mutánsok nem lesznek virulensek. Ezenkívül kétséges volt, hogy ezek a mutánsok rendelkeznek-e immunogén hatással, mivel a gp50 önmagában nagymértékben immunogén hatású, amit az a megfigyelés bizonyított, hogy a gp50 képes malacokban védettséget létrehozó immunválasz kiváltására [Marchioli és munkatársai, J. Virol., 61, 3977-3982 (1987); Mukamoto és munkatársai, Vet. Microbiol., 29, 109-121 (1991); Riviere és munkatársai, J. Virol., 66, 3424-3434 (1992)]. A gp50 inaktiválása tehát nagymértékben csökkentheti a gp50, illetve gp50+gp63 mutánsok immunogén hatását. Az is váratlan felismerés volt, hogy a mutáns vírusok képesek a központi idegrendszer elérésére, mivel ez feltételezi a vírusoknak a fertőzött szövetről perifériás idegekre való átjutását, melyet a központi idegrendszerbe való szállítás követ. Amennyiben a vírus szinapszison keresztül való átjutásában szerepet játszik a szinapszist követő neuronok fertőző utódvírusokkal történő újrafertőzése [Lycke és munkatársai, J. Gén. Virol., 65, (1984); Card és munkatársai, J. Neurosci., 10, 1974-1994 (1990)], a mutáns vírusok központi idegrendszerbe való szállítását a szinapszisok meggátolhatják. Ez kizárhatja azt, hogy a vírus a központi idegrendszerbe jusson, és ily módon megakadályozhatja, hogy pusztító hatását kifejtse az agyban.
Annak megállapítása céljából, hogy a gp50 mutáns vírusok képesek-e állati szövetekben szóródni, immunhisztokémiai módszerekkel sertésormyálkahártya-explantátumokban vizsgáltuk az R122 és R332 gp50 mutánsok, valamint a D560 és D1200 gp50+gp63 mutánsok replikációját. Ezenkívül egereket fertőztünk bőr
HU 220 099 Β alá, illetve hasüregbe, annak megállapítására, hogy a vírusok in vivő szaporodnak-e és szóródnak-e. Eredményeink azt mutatták, hogy mindegyik mutáns képes sertés-ormyálkahártyában szaporodni.
Meglepetésünkre, a gp50 mutánsok és a gp50+gp63 mutánsok hasüregbe, illetve bőr alá való beoltást követően az egerek pusztulását okozták. Az R122 törzs virulenciája (a fertőzött állatok pusztulásáig eltelt idő átlagában kifejezve) csak mérsékelten csökkent a vad típusú NIA-3 törzzsel összehasonlítva. A D560 és a D1200 törzsek virulenciája azonban sokkal nagyobb mértékben csökkent, ami a gp63-nak az egérre kifejtett virulenciában játszott szerepére utal. A fertőzött állatok pusztulását követő vizsgálat azt mutatta, hogy a mutánsok képesek voltak az agyban szaporodni. A hasüregbe oltott állatok szerveinek immunhisztokémiai vizsgálata szerint a vírus előszeretettel szaporodott a perifériás idegekben. Amikor az R122 törzset nem kiegészítő sejteken tenyésztettük, tehát nem rendelkezett gp50-nel, a hasüregen keresztül történő fertőzés sikertelen volt. Ez a megfigyelés arra utal, hogy gp50 szükséges az elsődleges fertőzéshez. Az a megfigyelés, hogy a fenotípusosan kiegészített PRV gll mutáns, (amely ugyancsak nem fertőzőképes utódokat hoz létre, azonban nem képes nem kiegészítő sejtvonalakon plakkokat képezni), egerekre teljesen ártalmatlan, arra utal, hogy az elsődleges fertőzést követően a sikeres vírusteijedés a sejtről sejtre való átviteltől függ. Az a tény, hogy a gp50, illetve a gp50+gp63 mutánsokkal fertőzött állatok egyikéből sem sikerült fertőző vírust izolálni, azt mutatja, hogy az élő állatokban ezen mutánsok által létrehozott utódvirionok nem fertőzőképesek.
Együttesen ezek az eredmények azt mutatják, hogy a gp50 szükséges az elsődleges fertőzéshez, azonban nem szükséges az azt követő replikációhoz és a vírus átviteléhez, ami arra utal, hogy in vivő a vírus terjedésének fő mechanizmusa a közvetlen sejtről sejtre való átvitel. Ezek az eredmények azt jelentik továbbá, hogy a vírus szinapszison keresztül való átjutása független a gp5O-től, és nem a szinapszist követő neuronsejten kívüli virionokkal történő de novo fertőzésének következménye. Az a megfigyelés, hogy a gp50, illetve a gp50+gp63 mutánsokkal fertőzött állatok egyikéből sem sikerült fertőző vírust izolálni, azt mutatja, hogy élő állatokban a gp50 mutánsok által létrehozott utódvirionok nem fertőzőképesek. Ezen mutánsok szaporodása tehát a fertőzött/vakcinázott állatra korlátozódik. Egy gp50 mutáns alkalmazása Aujeszky-féle betegség elleni vakcina alapjául, illetve heterológ gének expresszálására szolgáló rekombináns hordozóvírusként rendkívül biztonságos vakcina előállítását teszi lehetővé, amely csak a vakcinázott állatban szaporodik és nem teljed más állatokra, tehát más fajokra sem. Továbbá, amennyiben a hordozóvírusban a heterológ gént a gp50 gén helyére inszertáljuk, a vad típusú vírussal történő rekombináció minden esetben nem fertőző rekombinánsok keletkezéséhez fog vezetni.
A gp50 mutáns R122 jelzésű törzzsel vakcinázott malacokban, amikor azokat a virulens vad típusú NIA-3 törzzsel fertőztük, teljes védettség létrejöttét tapasztaltuk az Aujeszky-féle betegség klinikai tüneteivel szemben. A gp50+gp63 mutáns D560 és D1200 törzsekkel vakcinázott malacokban rövid ideig tartó láz és gyarapodáselmaradás lépett fel, azonban a ΝΙΑ-3-fertőzést követően nem jelentkeztek idegrendszeri tünetek. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a csupán sejtről sejtre való terjedéssel szóródni képes PRV-mutánsok még nagymértékben immunogén hatásúak. Ezenkívül ezek az eredmények mutatták ki először, hogy a gp50 expresszálása, amely a leginkább immunogén hatású PRV-proteinek egyike (lásd fent), nem szükséges malacokban az Aujeszky-féle betegség elleni hatékony védettség létrehozásához. Ez az eredmény váratlanul ért bennünket.
A találmány szerinti álveszettségvírus- (Aujeszkyféle betegség) fertőzések megelőzésére vagy terjedésének megakadályozására szolgáló vakcina aktív összetevőként olyan PRV-t tartalmaz, amely a vírusburokban gp50-et tartalmaz, és a fent ismertetettek szerint működésképtelenné tett gp50 génnel rendelkezik. Tartalmaz továbbá olyan szokásos összetevőket, mint például megfelelő hordozóanyagok, tetszés szerinti stabilizátorok, adjuvánsok, oldószerek, emulgeálóanyagok stb. A vakcina különböző módokon adagolható, például bőrbe, bőr alá, izomba, vénába, illetve orron át. Az orron át történő adagolás előnyös. A vakcina multivalens vakcina előállítása céljából tartalmazhat egyéb, más betegségekkel kapcsolatos immunogén hatású anyagokat is.
Abban az esetben, ha a gp50 PRV-mutánst vírusvektorként alkalmazzuk, az a gp50 génben található mutáción kívül, előnyösen a gp50 génbe inszertálva, egyéb kórokozókból származó genetikai információt is tartalmaz, például vírusokból, mint például sertéskolera(sertésláz-) vírus, parvovírus, a fertőző gyomor-bél hurut vírusa, fertőző sertésvetélés és légzőszervi tünetegyüttes (PEARS vagy a titokzatos sertésmegbetegedés MSD, PRRS, illetve SIRS), sertéslégzőszervi megbetegedést okozó coronavírus (PRCV), endémiás sertéshasmenés-vírus és influenzavírus, valamint baktériumokból, mint például Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli, valamint Leptospira, mycoplasmákból, mint például M. hyopneumoniae és M. lyorhinis. Kórokozókból származó nukleinsavszekvenciáknak PRV szubgenomiális fragmenseibe való klónozására, és ezt követően ezeknek a PRV genomjába való beépítésére szolgáló eljárások ismertek a gyakorlatban. Ennek egy példáját ismertetik van Zijl és munkatársai [J. Virol., 62, 2191-2195 (1988)].
Míg a gp50 PRV-mutánsok képesek sejtről sejtre való terjedésre, az 1. típusú herpes simplex vírus (HSV-1), valamint az 1. típusú szarvasmarha-herpeszvírus (BHV-1) megfelelő homológ génjeiben létrejött mutációk olyan vírusmutánsokat eredményeznek, amelyek nem képesek sejtről sejtre való terjedésre [Ligás és Johnson, J. Virol., 62, 1486-1494 (1988); Fehler és munkatársai, J. Virol., 66, 831-839 (1992)]. Ez azt jelenti, hogy egyrészt a PRV gp50 génjének működése, másrésztaHSV-1 gD génjének, illetveaBHV-1 glVgénjének működése eltér. Rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával fennáll a lehetősége a HSV-1, a BHV-1, va5
HU 220 099 Β lamint egyéb herpeszvírusok módosításának oly módon, hogy azok hasonlóképpen a PRV gp50 mutánsokhoz képesek legyenek sejtről sejtre való terjedésre anélkül, hogy fertőzőképes utódok keletkeznének. Ez az eljárás számos biztonságosan alkalmazható herpeszvírus- (hordozó-) vakcina előállításához vezethet, melyek sok állati és emberi megbetegedés eradikációját és terjedésének megakadályozását tehetik lehetővé.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra: A PRV-genom egy részének fizikai térképe. A nyilak a transzláció korai befejezését jelző kodonokat jelzik, melyeket linker inszertálásával végzett mutagenezissel hoztunk létre a pN3HB plazmid, valamint az R122, az R332, az M102, és az M105 jelzésű megfelelő vírusmutánsok gp50 génjében és a gp63 génjében [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992); de Wind és munkatársai, J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)]. A vízszintes irányú csíkok a D560 és D1200 mutánsokban található deléciók helyét és kiterjedését mutatják. A felső vonal a PRV-genomnak a gp50-et folyamatosan expresszáló G5 sejtekben található BstXI-StuI fragmensét mutatja [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)].
2. ábra: A sertéskolera-vírus El génjét, valamint a humán cytomegalovírus erősítő/promoter génjét tartalmazó pEVhisl3HCVEl plazmid, melyet egy heterológ gént tartalmazó gp50 mutáns PRV előállítására használtunk (lásd 6. példa).
3. ábra: A PRV-genom egy részében, a deletált gp50 gén helyén, a sertéskolera-vírus El génjét, valamint a humán cytomegalovírus erősítő/promoter génjét tartalmazó pBP53El plazmid, melyet egy heterológ gént tartalmazó gp50 mutáns PRV előállítására használtunk (lásd 6. példa).
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
A NIA-3 PRV törzs gp50 génjének klónozása és gp50-et expresszáló sejtvonalak előállítása
Mindegyik alkalmazott rekombináns DNS-eljárást ismert technikák szerint végeztük [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1982)]. A pEVhisl4 plazmidot a pSV2his plazmidból [Hartman és Mulligan, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85, 8047-8051 (1988)] állítottuk elő az EcoRI-BamHI fragmensnek egy olyan fragmenssel való helyettesítésével, amelyben a humán cytomegalovírus (hCMV) közvetlen korai erősítő/promoter szekvenciáját [Bemard és munkatársai, EMBO J., 6,
133-138 (1987)] egy, mindhárom olvasási keretben befejezést jelző kodont és poliadenilációs helyet tartalmazó szintetikus oligonukleotid követ. A pEVhislO plazmidot a pEVhisl4 plazmidból állítottuk elő a hCMV erősítő/promoter szekvenciáját tartalmazó BamHI fragmens deletálásával. A PRV gp50 génjét egy (gp50 promotert nem tartalmazó) BstXI-StuI fragmensként klónoztuk a pEVhisl4 plazmidba, a hCMV promotertől 3’-irányban található EcoRV hasítási helyre, így kaptuk a pEVhisl4gp50 plazmidot. Az átfedő szubgenomiális PRV-fragmenseket tartalmazó c-179, c-27 és c-443 kozmidok, valamint egy pBR322-származék HindlII hasítási helyén a PRV HindIII-B fragmensét tartalmazó pN3HB plazmid előállítása és jellemzése ismeretes [van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1988)]. Leírták a gp50-expresszálás inaktiválását linker inszertálásával a pN3HB gp50 génjének két különböző helyére (Rl és 322 inszertálások) [de Wind és munkatársai, J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)].
SK-6 sejteket transzferáltunk elektroporációs eljárással a pEVhisl4gp50 plazmiddal. Az SK-6 sejteket tripszines kezeléssel összegyűjtöttük, egyszer foszfátpufferes fiziológiás sóoldattal (PBS) szobahőmérsékleten mostuk, majd 2xl01 * * * * * 7 sejt/ml töménységben jéghideg PBS-ben szuszpendáltuk. Tíz mikrogramm pEVhisl4gp50 plazmidot adtunk 0,5 ml sejthez, amelyet egy steril, eldobható elektroporációs küvettában (0,4 cm belső elektródatávolság; BioRad Laboratories) 0 °C-on tartottunk, és egy BioRad GenePulser készülékben, 25 mikrofarad kapacitás mellett, 1000 V feszültséget alkalmaztunk. A sejteket 15 percig, 0 °C-on állni hagytuk, majd egy 50 ml tápfolyadékot tartalmazó 75 cm3 térfogatú palackba vittük át, és egy éjszakán át inkubáltuk. Ezt követően a transzfektált sejteket tripszinnel kezeltük, és több hígításban, 2,5 mmol/1 hisztidinolt tartalmazó 100 mm átmérőjű Petri-csészékbe oltottuk. A tápfolyadékot 3-4 naponként cseréltük, amíg a kolóniák világosan kivehetőkké nem váltak (7-10 nap). Különálló kolóniákat gyűjtöttünk, és azokat sejttenyésztő mikrolemezeken tenyésztettük. A gp50-expresszálást egy egyrétegű immunperoxidázvizsgálattal és egy G50N2 jelzésű monoklonális ellenanyag felhasználásával, radioimmunprecipitációs eljárással határoztuk meg, és egy radioimmunprecipitációs vizsgálat szerint gp50-et nagy mennyiségben expresszáló sejtvonalat G5-nek neveztünk el [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)].
2. példa
Mutáns vírusok előállítása
Az R122 és R332 mutáns vírusokat átfedő fragmensek között végbemenő rekombinációs eljárással állítottuk elő G5 sejtekben, átfedő vad típusú PRV-szekvenciákat tartalmazó három kozmid [c-179, c-27, és c-443; lásd van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1988)] segítségével, valamint az Rí, illetve a 322. jelzésű pN3HB-származékok [de Wind és munkatársai, J. Virol., 64, 4691-4696 (1990)], melyek a gp50 génben a 366-367., illetve a 996-997. nukleotidok között található 5’-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3’ szekvenciájú mutagén oligonukleotidot (1. szekvencia) tartalmazó HindIII-B fragmensének felhasználásával (lásd 1. ábra). A vírus eredetű DNS-fragmenseket a plazmidból EcoRI-emésztéssel (a kozmidok esetében), illetve HindlII-emésztéssel (az Rí és 322. kiónok esetében) szabadítottuk ki, és azokat nem választottuk el a vektorszekvenciáktól. Transzfektálást végeztünk elektroporációs eljárással (lásd fent) a BioRad GenePulser és Capacitance Extender készülék
HU 220 099 Β felhasználásával, 250 V, illetve 960 mikrofarad kapacitás mellett. A sejteket 6 rekeszű lemezekre oltottuk, és 37 °C-on, 3 óráig tartó inkubálást követően a tápfolyadékot 2% boíjúszérumot és 1% metil-cellulózt tartalmazó Earle-féle minimális esszenciális tápfolyadékkal cseréltük ki, majd a lemezeket a plakkok megjelenéséig (2-3 nap) 37 °C-on inkubáltuk.
A D560 törzs előállításához a 149. plazmid [a pN3HB plazmidnak a gp63 génben a 352-353. nukleotidok között a mutagén oligonukleotidot tartalmazó származéka; de Wind és munkatársai, J. Virol., 64, 4691-4696 (1990); a számozást lásd: Petrovski és munkatársai, J. Virol., 60, 185-193 (1986), 5. ábra] BglII-EcoRI fragmensét a 322. plazmid BglII-EcoRI fragmensével cseréltük ki (lásd 1. ábra). Az így kapott plazmidot, amelyben a gp50 gén 966. pozíciója és a gp63 gén 353. pozíciója közti nukleotidszekvenciát a TAGGCTAGAATTCTAGCCTA szekvenciával (lásd
1. szekvencia; azaz a mutagén oligonukleotid-szekvenciájával) helyettesítettük, használtuk az átfedő vad típusú fragmensekkel együtt, G5 sejtekben, a fent ismertetettek szerint átfedő rekombinációs eljárással a vírus regenerálására.
A D1200 plazmid előállításához a 149. plazmidot BglII és EcoRI enzimekkel emésztettük, és az így kapott nagyobbik fragmenst tompa végek előállítása céljából E. coli DNS-polimeráz I enzim Klenow-fragmensével kezeltük, majd önmagával ligáltuk. A kapott plazmidot, amelyben a gp50 gén a 336. pozíciója és a gp63 gén 353. pozíciója közti nukleotidszekvenciát az AATTCTAGCCTA szekvenciával (lásd 2. szekvencia; azaz a mutagén oligonukleotid-maradékával) helyettesítettük, használtuk az átfedő vad típusú fragmensekkel együtt, a fent ismertetettek szerint G5 sejtekben, átfedő rekombinációs eljárással a vírus regenerálására.
3. példa
A gp50, valamint a gp50+gp63 mutánsok replikációja sertésorrnyálkahártya-explantátumokban
Annak megállapítása céljából, hogy ezek a mutánsok szintén képesek-e állati szövetekben való terjedésre, sertésormyálkahártya-explantátumokat használtunk. Ezek az explantátumok természetes kombinációi a hámsejteknek és a sztrómát alkotó kötőszöveti sejteknek, és korábban kimutatták, hogy ilyen explantátumok fertőzése nagymértékben hasonlít az ormyálkahártya fertőzéséhez [Pol és munkatársai, Rés. Vet., Sci., 50, 45-53 (1991)]. Explantátumokat fertőztünk a vad típusú NIA-3 PRV törzzsel, a gp50 génben inszertált linkért tartalmazó R122 és R332 mutánsokkal, valamint a gp50+gp63 deléciós mutáns D1200 és D560 törzsekkel.
A fertőzött nyálkahártya-explantátumoknak a fertőzést követően 24 órával, nyúlóan termelt anti-PRVszérummal [Pol és munkatársai, Rés. Vet., Sci., 50, 45-53 (1991)] végzett immunhisztokémiai vizsgálata azt mutatta, hogy a vad típusú NIA-3 vírus a hámsejtek nagy kiterjedésű területére szóródott. Hasonló eredményeket kaptunk az R122 és R332 gp50 mutánsokkal, valamint a D1200 és a D560 gp50+gp63 mutánsokkal.
órás inkubálást követően a vírusreplikáció csaknem kizárólag a hámsejtekre korlátozódott. Mindegyik törzs képes volt azonban hosszabb inkubációs idő elteltével az alsóbb kötőszöveti sejtek fertőzésére. Nyúlban termelt anti-PRV-szérummal és monoklonális ellenanyagokkal (gp50-re fajlagos G4ON2-vel) végzett differenciáló immunfestési eljárás igazolta, hogy a gp50 mutáns, illetve a gp50+gp63 mutánsok nem expresszáltak gp50-et. Ez a megfigyelés azt mutatja, hogy a gp50 sertés-ormyálkahártyában a vírus terjedéséhez nem szükséges.
4. példa
A gp50, valamint a gp50+gp63 mutánsok virulenciája egerekben
a) A gp50+gp63 mentes mutánsok egerekben letálisak
Az a megfigyelés, hogy a gp50 mutánsok képesek voltak szövetexplantátumokban való szaporodásra és terjedésre, arra utalt, hogy azok képesek élő állatokban is szaporodni és terjedni. Kísérleti állatokként egereket választottunk, mivel azok nagymértékben fogékonyak herpeszvírusokkal való fertőzésre, és kiterjedten használták őket modellállatként a virulencia és az idegek mentén való terjedés tanulmányozására [Fraser és Ramachandran, J. Comp. Path., 79, 435-444 (1969); Cook és Stevens, Infect Immun., 7, 272-288 (1973); Field és Hill, J. Gén. Virol., 23, 145-157 (1974); Field és Hill, J. Gén. Virol., 26, 145-148 (1975); Kristenson és munkatársai, Brain Rés., 69, 189-201 (1978); Platt és munkatársai, Arch. Virol., 63, 107-114 (1980); Dix és munkatársai, Infect. Immun., 40, 103-112 (1983)]. Az első kísérletben az R122 és R332 jelzése linker inszerciós mutánsok helyett a D560 és D1200 jelzésű gp50+gp63 deléciós mutánsokat használtuk, hogy az inokulumban vad típusú revertánsok előfordulási lehetőségét kizárjuk. Ilyen revertánsok a kiegészítő sejtvonalban jelen levő vírusszekvenciák és a vírusgenom között létrejövő homológ rekombináció révén keletkezhetnek a linker inszerciós mutánsok törzstenyészetében [Cai és munkatársai, J. Virol., 62, 2596-2604 (1988); Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992); Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 3388-3892 (1992)]. Mivel a D560 és D1200 jelzésű gp50+gp63 deléciós törzsek 3’-végén található szekvenciák a G5 kiegészítő sejtekben nem rendelkeznek homológ megfelelővel (1. ábra), ezen mutánsoknak a G5 kiegészítő sejtekben végbemenő replikációja során vad típusú revertánsok nem jöhetnek létre.
Öt-öt darab 6-8 hetes korú nőstény BALB/c egeret (Charles River, Suldzfeld, Németország) fertőztünk, a NIA-3, a D560, a D1200 törzsekkel, valamint a gp63 mutáns Ml05 törzzsel a nyakon, a bőr alá 105 plakk-képző egységet adagolva. A NIA-3 törzzsel beoltott egerekben az Aujeszky-féle betegség súlyos tünetei jelentkeztek, úgymint heves vakaródzás a hátsó lábakkal, „arcmosás”, valamint bénulás, és a fertőzést követően körülbelül 70 órával ezek az egerek elhullottak. Az Ml05 törzzsel fertőzött egerekben nem jelentkezett heves viszketés, azonban meggörbült háttal
HU 220 099 Β és megnövekedett légzésszámmal elkülönülve ültek. Az állatok a fertőzést követően körülbelül 90 órával hullottak el. A D560 és a D1200 törzsekkel fertőzött egerekben hasonló tünetek jelentkeztek, mint az Ml05 törzzsel fertőzött állatokban. Apatikussá váltak és a moribund állapot beállta előtt, amely néha 42 óráig eltartott, bénulás lépett fel náluk, majd az állatok a fertőzést követő, körülbelül 130-140 óra elteltével elpusztultak (lásd 1. táblázat, 1. kísérlet). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a gp50+gp63 nullmutánsok még letális hatásúak az egerekre. Virulenciájuk azonban a vad típusú vírussal vagy egy gp63 mutáns vírussal összehasonlítva jelentősen csökkent.
b) A gp50+gp63 nullmutánsok képesek a központi idegrendszer elérésére és abban való szaporodásra
Mivel a gp63, illetve a gp50+gp63 mutánsokkal fertőzött egerekben az idegrendszeri tünetek sokkal kevésbé voltak nyilvánvalóak, mint a NIA-3 törzzsel fertőzött egerekben, a fertőzött állatok agyát immunhisztokémiai eljárással vírus jelenlétére vizsgáltuk. A fertőzött egerek agyából és a szerveiből kriosztáttal készített metszeteket fixáltuk, és az előbbiekben ismertetettek szerint immunhisztokémiai vizsgálatnak vetettük alá [Pol és munkatársai, Microb. Path., 7, 361-371 (1989)]. Amikor első ellenanyagként gp50 elleni monoklonális ellenanyagokat használtunk, a második inkubálásnál kecskében termelt, peroxidázzal konjugált egér elleni immunglobulin G ellenanyagot használtunk [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)].
Meglepetésünkre, a Dl200 és a D560 törzsekkel fertőzött egerek agyából készült metszetekben nagy mennyiségű fertőzött neuront figyeltünk meg, míg a NIA-3 vagy az M105 törzsekkel fertőzött egerek agyából készült metszetekben csak kis mennyiségű fertőzött neuront találtunk. A D1200 és a D560 törzsekkel fertőzött állatok agyában található vírusok nem expresszáltak gp50-et, amint azt nyúlban termelt anti-PRV-szérummal [Pol és munkatársai, Rés. Vet. Sci., 50, 45-53 (1991)] végzett differenciáló immunfestési eljárással megállapítottuk. Amikor az agyakból vírust izoláltunk és azokat SK-6 sejteken titráltuk, a NIA-3 és az Ml05 törzsekkel fertőzött állatokból könnyen sikerült fertőzőképes vírust nyernünk, azonban a D560 és D1200 törzsekkel fertőzött állatokból ez nem sikerült (1. táblázat, 1. kísérlet). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a gp50+gp63 nullmutánsok nem képesek fertőzőképes utódokat termelni, de képesek a központi idegrendszert elérni és abban szaporodni.
c) A gp50 nullmutánsok nagymértékben virulensek
Bár a gp63 nem szükséges a vírus szaporodásához [Petrovskis és munkatársai, J. Virol., 60, 1166-1169 (1986)], a G5 kiegészítő sejteken, illetve a nem kiegészítő SK-6 sejteken a gp50+gp63 mutánsok által képzett plakkok lényegesen kisebbek voltak, mint a gp50 mutánsok által képzett plakkok. Ezenkívül a gp63-ról kimutatták, hogy malacokban szerepet játszik a virulenciában [Kimman és munkatársai, J. Gén. Virol., 73, 243-251 (1992)]. Mivel a fenti eredmények arra utalnak, hogy a gp50 mutánsok sokkal virulensebbek, mint a gp50+gp63 mutánsok, a gp50 mutánsok virulenciáját is meg akartuk vizsgálni egerekben. Ahhoz viszont, hogy a gp50 mutánsokat egerek fertőzésére használhassuk, teljesen meg kellett bizonyosodnunk arról, hogy az inokulum nem tartalmaz vad típusú revertánsokat (lásd fent). Vad típusú revertánsoktól látszólag mentes, fenotípusosan kiegészített R122 vírustenyészetet készítettünk oly módon, hogy G5 sejtekben termelt egyetlen R122 piákkal SK-6 sejteket fertőztünk. A fertőzött SK-6 sejtekből vírus-DNS-t izoláltunk, és azzal egy réteg G5 sejttenyészetet transzfektáltunk, (ami nagymértékben csökkentette a PRV-kioltás hatékonyságát) [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)]. A transzfektált sejtekből SK-6 sejteken való titrálás alapján milliliterenként 2,1 χ 107 plakk-képző egységet (pfü/ml) tartalmazó vírustenyészetet készítettünk. Ezt a tenyészetet R122+-nak neveztük annak jelölésére, hogy fenotípusosan kiegészített vírusról van szó. gp50-et nem tartalmazó vírustenyészetet állítottunk elő oly módon, hogy SK-6 sejteket 200 mikroliter (4,2 χ 106 pfu) hígítatlan R122+ törzstenyészettel fertőztünk. Az így nyert tenyészet, amelyet annak jelzésére, hogy az nem kiegészítő sejtből származik Rl 22 -nak neveztünk, milliliterenként 150 plakk-képző egységet tartalmazott. Amikor azonban gp50 elleni monoklonális ellenanyaggal [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)] immunperoxidázfestést végeztünk, ezek a plakkok gp50 negatívnak bizonyultak. Az eredmények arra mutattak, hogy a vírustörzstenyészet nem tartalmaz vad típusú vírust, de tartalmaz néhány fertőző vírusrészecskét. Lehetséges, hogy ezek a részecskék abból az inokulumból (R122+) származtak, amelyet az R122- tenyészet előállítására használtunk. Másik lehetőség szerint az utódvirionok képesek lehetnek a fertőző R122+ virionok által az SK-6 sejtek plazmamembránjában lerakott gp50 beépítésére. Egy másik lehetőség, hogy a gp50-et nem tartalmazó virionok endocitózissal kerülnek a sejtbe, [Campadelli-Fiume és munkatársai, J. Virol., 62, 159-167 (1988)], néhány esetben elkerülik a lebontást és produktív fertőzést hoznak létre. Az R122+ és R122- törzstenyészetek fizikai titerét elektronmikroszkóp segítségével határoztuk meg, belső standardként latexgyöngyök (91 nanométer átmérőjű gyöngyök; Serva) felhasználásával.
Az R122+ törzs virulenciájának vizsgálatán felül megvizsgáltuk azt is, hogy a különböző vírusok virulenciája függ-e a fertőzés módjától. Öt-öt egérből álló csoportokat oltottunk a NIA-3, az M105, az R122+ és a D1200 törzsekkel, 105 plakk-képző egységgel, bőr alá, illetve a hasüregbe adott injekcióval. Az R122+ törzzsel fertőzött egerekben az Aujeszky-féle betegség tünetei fejlődtek ki (lásd fent), amelyek hasonlóak voltak a NIA-3 törzzsel fertőzött állatokban megfigyeltekhez. Az első tünetek a NIA-3 törzzsel bőr alá injektálva fertőzött állatokban a fertőzést követően körülbelül 34-40 óra múlva, az R122+ törzzsel bőr alá injektálva fertőzött állatokban a fertőzést követően körülbelül 42 óra múlva váltak nyilvánvalóvá. Az állatok a fertőzést követően 56, illetve 68 órával pusztultak el (1. táblázat, 2. kísérlet). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a gp50 mutáns R122+ törzs nagymértékben virulens ege8
HU 220 099 Β rekben és sokkal virulensebb, mint a gp50+gp63 mutáns D1200 vagy a gp63 mutáns M105 törzsek. A NIA-3, az R122+ és az M105 törzsek hasüregbe való injektálása esetében átlagosan 10-13 órával hosszabb idő telt el az elhullásig, mint a bőr alá történő injektálás után. Amikor a D1200 törzset hasüregbe injektáltuk, az elhullásig eltelt átlagos időtartam körülbelül 25 órával rövidebb volt, mint a bőr alá történő injektálás esetében (1. táblázat, 2. kísérlet). A tünetek és a klinikai jelek mindegyik vizsgált törzs esetében függetlenek voltak a fertőzés módjától. Tehát a fertőzés időbeli lefolyása különbözik ugyan, de mindkét beoltási mód letális fertőzést eredményez. A 2. kísérletben használt mindegyik állat agyából készült metszetekben sikerült vírust kimutatnunk immunhisztokémiai eljárással (1. táblázat). Ebben az esetben is a D1200 törzzsel fertőzött állatok agyában a vírusszaporodás sokkal kiterjedtebb volt, mint a NIA-3, az R122+ vagy az M105 törzsekkel fertőzött állatokéban.
d) A vírusreplikáció elsősorban a fertőzött szervek perifériás idegeiben megy végbe
Amikor szervmetszeteket vizsgáltunk immunhisztokémiai eljárással vírusantigének jelenlétére nézve, vírusantigéneket csak a hasüregen át fertőzött állatokban tudtunk kimutatni. Vírust mutattunk ki a májban, lépben, vesében, bélben és mellékvesében, de nem mutattunk ki vírust a tüdőkben. A vírusfertőzés a szervekben csaknem kizárólag az idegrostokra korlátozódott. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a PRV előszeretettel az idegszövetet fertőzi és abban szaporodik, és amint azt korábban kimutatták [Cook és Stevens, Infect. Immun., 7, 272-288 (1973); Field és Hill, J. Gén. Virol., 23, 145-157 (1974); Field és Hill, J. Gén. Virol., 26,
145-148 (1975); McCracken és munkatársai, J. Gén. Virol., 20, 17-28 (1973); Strack és Loewy, J. Neurosci., 10, 2139-2147 (1990); Card és munkatársai, J. Neurosci., 10, 1974-1994 (1990)] a vírus retrográd axonális transzport révén kerül a szervekből a központi idegrendszerbe. Az a megfigyelés, hogy a gp50 nullmutánsok hatékonyan elérik a központi idegrendszert, azt jelenti, hogy a neuronális szállítási folyamat független a gp50 jelenlététől.
A NIA-3 és az M105 törzsekkel hasüregen át fertőzött állatok szerveinek kivonatából fertőzőképes vírusokat izoláltunk. Várakozásunknak megfelelően, az R122+ és a D1200 törzsekkel fertőzött állatokból nem sikerült fertőzőképes vírust izolálnunk, ami arra utal, hogy ezeknek a vírusoknak az utódai nem fertőzőképesek. Meglepetésünkre, a NIA-3 törzzsel bőr alá injektálva fertőzött állatoknál a szervkivonatok titrálásával 5 esetből háromban sikerült fertőző vírust kimutatni (1. táblázat, 2. kísérlet). Ez jelentheti azt, hogy a vírus anterográd módon szállítódott a központi idegrendszerből ezekbe a szervekbe. Az, hogy az M105 törzzsel bőr alá injektálva fertőzött egerek szerveiből nem sikerült fertőző vírust kimutatnunk, valószínűleg azzal magyarázható, hogy ennek a vírusnak a transzportja késleltetett volt.
e) Az in vivő elsődleges fertőzés létrejöttéhez gp50 szükséges
Az általunk kapott in vitro eredmények, amelyek azt mutatták, hogy a gp50 szükséges a penetrációhoz, azonban nem szükséges a sejtről sejtre való terjedéshez [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)] azt sugallták, hogy ugyanez érvényes az in vivő fertőzésre is.
1. táblázat
Különböző PRV vírusokkal fertőzött egerekben az elhullásig eltelt átlagos időtartam, és a víruskimutatás eredménye
| Példa | Vírustörzs | Genotípus | Adagolás módja | Elhullásig eltelt átlagos időtartam (óra) (+/- S. D.) | Vírus jelenléte | |||
| (immunhisztokémia) | (vírusizolálás) | |||||||
| agy | szervek | agy | szervek | |||||
| 1. | NIA-3 | vad típus | SC.“ | 70,8 +/- 12,9 | + | n.d.b | + | n.d. |
| M105 | gp63- | SC. | 91,2 +/- 18,2 | + | n.d. | + | n.d. | |
| D560 | gp50-gp63~ | SC. | 132,2 +/- 28,6 | + + | n.d. | - | n.d. | |
| D1200 | gp50-gp63~ | SC. | 141,4 +/- 22,4 | + + | n.d. | - | n.d. | |
| 2. | NIA-3 | vad típus | SC. | 55,6 +/- 6,8 | + | - | n.d. | + (3/5) |
| R122+ | gp50- | SC. | 67,9 +/- 6,8 | + | - | n.d. | - | |
| M105 | gp63- | SC. | 78,6 +/- 18,7 | + | - | n.d. | - | |
| Dl 200 | gp5O-gp63- | SC. | 160,0 +/- 20,4 | + + | - | n.d. | - | |
| NIA-3 | vad típus | ip.c | 67,3 +/- 9,0 | + | +<* | n.d. | + | |
| R122+ | gp50- | ip· | 77,7 +/- 5,6 | + | +<* | n.d. | - | |
| M105 | gp63 | ip- | 91,6 +/- 15,6 | + | +<· | n.d. | + | |
| D1200 | gp50-gp63~ | ip- | 134,8 +/- 27,0 | + + | +d | n.d. | - |
HU 220 099 Β
1. táblázat (folytatás)
| Példa | Vírustörzs | Genotípus | Adagolás módja | Elhullásig eltelt átlagos időtartam (óra) (+/- S. D.) | Vírus jelenléte | |||
| (immunhisztokémia) | (vírusizolálás) | |||||||
| agy | szervek | agy | szervek | |||||
| 3. | R122+ | gp50- | se. | 60,0 +/- 4,2 | + | n.d. | n.d. | n.d. |
| R122- | gp50- | se. | 4 χ oo, 1 x 84 | + | n.d. | n.d. | n.d. | |
| B145 | gll- | se. | 00 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | |
| R122+ | gp50- | •P· | 85,2 +/- 5,0 | + | n.d. | n.d. | n.d. | |
| R122- | gp50- | ip· | OO | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. | |
| B145 | gll- | 'P· | 00 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
a: szubkután. b: nincs meghatározva. c: intraperitoneális. d: perifériás idegekbe.
Bár annak a lehetősége, hogy a gp50 in vivő nem szükséges a penetrációhoz, igen valószerűtlen, a forma kedvéért igazolnunk kellett, hogy ebben az esetben a gp50 az elsődleges fertőzéshez is szükséges. A gp50 szerepének vizsgálatára egy nem kiegészítő SK-6 sejteken tenyésztett R122 tenyészetet használtunk, amely így nem tartalmazott gp50-et (R122-; lásd fent). Mivel 105 plakk-képző egység R122+ megfelel 3,3 χ 106 tulajdonképpeni részecskének, ugyanennyi R122- részecskét használtunk az egerek beoltására. Várakozásunknak megfelelően, mindegyik R122+ törzzsel hasüregbe vagy bőr alá injektálva fertőzött egér elpusztult (1. táblázat, 3. kísérlet). Azonban az R122- törzzsel fertőzött egerek közül hasüregbe való fertőzést követően mindegyik túlélt, míg a bőr alá injektálva fertőzött állatok közül ötből egy elhullott. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a gp50-nek a vírusborítékban való jelenléte szükséges az állatok sikeres fertőzéséhez.
Az R122- törzzsel való fertőzést követően elhullott állatok vizsgálata szerint vírus volt kimutatható az agyban, ami arra utal, hogy az inokulumban még fertőzőképes vírus volt jelen. Amikor az inokulumot nem kiegészítő SK-6 sejteken duplikátumban titráltuk, 9, illetve 16 plakkot találtunk. Ezeket a plakkokat immunhisztokémiai vizsgálat szerint gp50 mutánsok alkották. Ezeknek a fertőző virionoknak a lehetséges eredetét a fentiekben tárgyaltuk. Mivel a NIA-3 PRV törzs LD50 (az a dózis, ami az állatok felének elhullásához vezet) értéke hasüregi fertőzésnél körülbelül 70 plakk-képző egység, lehetséges, hogy az R122- inokulumban jelen levő fertőző vírusrészecskék tehetők felelőssé az egyetlen elpusztult állat letális fertőzéséért.
f) A fertőzőképes utódok létrehozására nem képes, így sejtről sejtre való terjedés révén való szóródásra képtelen vírus nem virulens egérre
A korábbiakban kimutattuk, hogy a gp50 nullmutánsokhoz hasonlóan, a gll vagy a gH nullmutáns PRV törzseket nem kiegészítő sejtvonalakban való tenyésztése nem fertőzőképes utódvírusok termelődését eredményezte [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992); Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 3388-3892 (1992)]. Azonban eltérően a gp50 mutánsoktól, a gll és a gH mutánsok nem kiegészítő sejteken nem voltak képesek plakkokat képezni. Ez arra utalt, hogy a gll és a gH a vírus sejtről sejtre való teijedéséhez szükséges. Annak megállapítására, hogy a sejtről sejtre való terjedés in vivő is előfeltétele-e a sikeres vírusszóródásnak, a B145 jelzésű, fenotípusosan kiegészített PRVglI mutáns törzzsel [Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992)] egereket fertőztünk. Amikor a B145 vírus 105 plakk-képző egységével hasüregbe, illetve bőr alá injektálva fertőztünk egereket, egyik állatban sem jelentkezett az Aujeszky-féle betegség semmiféle tünete (1. táblázat, 3. kísérlet). Ez az eredmény arra utal, hogy egy olyan vírus, amely nem képes fertőzőképes utódok előállítására, és képtelen sejtről sejtre való terjedés révén szóródni, nem virulens egerekre.
5. példa gp50, valamint gp50+gp63 mutánsok virulenciája és immunogenitása sertésekben
A mutáns törzsek virulenciájának és immunogenitásának vizsgálatára malacokat oltottunk az R122+, a D560, és a D1200 törzsekkel. A vad típusú M209 és a gp63 mutáns Ml02 törzsek (1. ábra) [Kimman és munkatársai, J. Gén. Virol., 73, 243-251 (1992)] kontrollként szolgáltak. Az immunizálást virulens NI A-3 PRV törzzsel való fertőzés követte.
4-6 hetes malacokból álló öt csoportot (a Central Veterinary Institute fajlagos kórokozóktól mentes tenyészetéből származó holland lapály malacokat) fertőztünk orron át a vírus 105 plakk-képző egységével, a belégzés folyamán mindegyik orrlyukba lassan 0,5 ml vírusszuszpenziót adagolva. A vakcinázást követően négy héttel a malacokat orron át, a virulens NIA-3 PRV törzs 105 plakk-képző egységével fertőztük. A malacokat naponta kétszer megfigyeltük a klinikai jelekre nézve, és naponta mértük a végbélhőmérsékletet. Az állatokat heten10
HU 220 099 Β te háromszor lemertük. Mindegyik malac eseteben meghatároztuk a gyarapodás leállását mutató napok számát, a lázat és az idegrendszeri tüneteket. A gyarapodás elmaradásának időszakát a fertőzés napján mért testtömeg visszanyeréséhez szükséges napok számában ad- 5 tűk meg. Lázat abban az esetben állapítottunk meg, ha a végbélben mért hőmérséklet meghaladta a 40 °C-ot. Az idegrendszeri tünetekként viszketést, ataxiát, bénulást, remegést, és görcsöket jegyeztünk fel.
A vad típusú M209 törzzsel fertőzött malacokban 10 az Aujeszky-féle betegség tipikus tünetei jelentkeztek, úgymint láz, étvágytalanság, gyarapodás elmaradása és idegrendszeri tünetek, például ataxia és bénulás (2. táblázat). Az R122+ és M102 mutánsoknál rövid ideig tartó láz és a gyarapodás elmaradása lépett fel, idegrend- 15 szeri tünetek azonban nem jelentkeztek. A D560 és Dl 200 mutánsok nem váltottak ki semmilyen idegrendszeri tünetet, és nem okoztak lázat vagy gyarapodáselmaradást. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a D560 és a Dl200 gp50+gp63 mutánsok teljesen aviru- 20 lensek malacokra, míg az R122+ gp50 mutáns és az M102 gp63 mutáns összehasonlítva a vad típusú PRVvel nagymértékben csökkent virulenciával rendelkezik.
Az R122+ és az M102 törzsekkel vakcinázott malacoknál a NIA-3 törzzsel végzett, felül fertőzést célzó ol- 25 tást követően nem lépett fel láz vagy gyarapodás elmaradása, és nem jelentkezett semmilyen klinikai tünet (3. táblázat). A D560 és D1200 törzsekkel vakcinázott malacoknál rövid ideig tartó láz és gyarapodáselmaradás lépett fel, idegrendszeri tünetek azonban nem jelentkez- 30 tek, bár az állatok néhány napig levertek voltak, és két malac hányt. A nem vakcinázott kontrollcsoportba tartozó malacoknál az Aujeszky-féle betegségre jellemző súlyos tünetek jelentkeztek, valamint viszonylag hosszú ideig tartó lázas időszakokat és gyarapodáselmaradást észleltünk; két malac elpusztult (3. táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az R122+ gp50 mutánssal és az M102 gp63 mutánssal vakcinázott malacokban teljes védettség jött létre az Aujeszkyféle betegség klinikai tüneteivel szemben, míg a D560 és a D1200 gp50+gp63 mutánsokkal vakcinázott malacokban részleges védettség jött létre az Aujeszkyféle betegség klinikai tüneteivel szemben.
2. táblázat
Malacok immunizálása különböző PRV törzsekkel+
| Immunizálás | Láz* | Gyarapodás- elmaradás* | Klinikai tünetek |
| M209 (n=3) | 5,3 +/- 0,6 | 8,3 +/- 7,3 | + + |
| M102 (n=4)** | 2,4 +/- 1,5 | 2,4 +/- 2,2 | - |
| R122 (n=5) | 3,8 +/- 1,6 | 0,8 +/- 1,8 | - |
| D560 (n=5) | 0 | 0 | - |
| D1200 (n=5) | 0 | 0 | - |
+: a kísérlet során nem hullott el malac.
*: napok átlagos száma (+/- S. D.).
**: egy malac elpusztult, valószínűleg a vérvételt követő trauma következtében.
+ +: neurológiai tünetek, úgymint ataxia, görcs, bénulás.
3. táblázat
Vakcinázott malacok védettsége NIA-3 törzzsel való fertőzéssel szemben
| Immunizálás | Elhullás | Láz* | Gyarapodáselmaradás* | Klinikai tünetek |
| (n=6) | 2 | 6,8 +/- 0,5 | 10,3 +/- 7,1 | + + |
| M102 (n=4) | 0 | 0 | 0 | - |
| R122+ (n=5) | 0 | 0 | 0 | - |
| D560 (n=5) | 0 | 2,6 +/- 1,3 | 4,6 +/- 6,5 | +/- |
| D1200 (n=5) | 0 | 3,6 +/- 1,1 | 1,4 +/- 3,1 | +/- |
*: napok átlagos száma (+/- S. D.).
+ +: neurológiai tünetek, úgymint ataxia, görcs, bénulás. +/-: bágyadtság (néha hányás, lásd a szöveget).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PRV gp50 génje szükséges a vírus fertőzőképességéhez (pe- 50 netrációjához), azonban nem szükséges a sejtről sejtre való átviteléhez. Fenotípusosan kiegészített gp50 mutánsok és gp50+gp63 mutánsok képesek a fertőzött állatokban szaporodni és terjedni. A fertőzött sejtekből kiszabaduló utódvírusok azonban nem fertőzőképesek, és 55 igy a fertőzött állatok nem képesek fertőző vírus ürítésére. Ez a sajátság, a PRV széles gazdaszervezet-spektrumával és azzal a képességével, hogy nagy mennyiségű idegen DNS befogadására képes, a PRV gp50 mutánsokat Aujeszky-féle betegség és egyéb állati megbetege- 60 dések elleni biztonságos (hordozó-) vakcinák előállítására alkalmazható ideális jelöltekké teszi.
6. példa
Sertéskolera-vírus El borítékglikoproteinjét expresszáló gp50 deléciós mutáns előállítása
Annak vizsgálatára, hogy egy gp50 deléciós mutáns felhasználható-e heterológ gének expresszálására szolgáló vektorvírusként, a NIA-3 PRV törzs gp50 génjét a sertéskolera-vírusnak (HChV=klasszikus sertésláz) a hCMV promoter transzkripciós ellenőrzése alatt működő El génjét tartalmazó DNS-fragmensével helyettesítet11
HU 220 099 Β tűk. A PRV különösen rövid (Us) régiójából egy ScalDral fragmenst [a Seal hasítási hely a gX gén 317-322. pozíciójában található; a nukleotidszekvencia számozását, lásd: Reá és munkatársai, J. Virol., 54, 21-29 (1985); a Dral hasítási hely a gp63 és a gl gének között az 1181-1186. pozícióban található; a nukleotidszekvencia számozását, lásd: Petrovskis és munkatársai, J. Virol., 60, 185-193 (1986)] klónoztunk a pUC19M (Clontech) tompa végűvé alakított Ndel hasítási helyére. Adott helyre fajlagos in vitro mutagenezissel (Transformer-készlet, Clonetech) egyedi restrikciósenzim-felismerő helyeket hoztunk létre közvetlenül a gp50 gént megelőzően és a gp50 gént követően. Az 5’- AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC-3 ’ (3. szekvencia) és az 5’-CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG-3’ (4. szekvencia) mutagén primerek felhasználásával a Spel (ACTAGT), valamint az Avrll (CCTAGG) restrikciós enzimek számára szolgáló felismerőszekvenciákat hoztunk létre a (-17)-(-12)., illetve az 1210-1215. pozíciókban [a gp50 gén nukleotidszekvenciájának számozását lásd: Petrovskis és munkatársai, J. Virol., 59, 216-223 (1986)]. A gp50 gént a plazmid-DNS-nek Spel és Avrll enzimekkel való emésztésével deletáltuk, és egy olyan szintetikus Spel-AvrII DNS-fragmenssel helyettesítettük, amely felismerőszekvenciákat tartalmazott az EcoRI, az EcoRV és a Hindin restrikciós enzimek számára (a szintetikus DNS-fragmenst két, olyan egyszálú oligonukleotid egyenlő mólnyi mennyiségének összekapcsolásával nyertük, melyek az alábbi szekvenciával rendelkeztek: 5’-CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC-3’ (5. szekvencia), illetve 5’-CTAGGAAGCTTGATATCGAATTCA-3’ (6. szekvencia). Ezután egy, a gp50 deléciót hordozó NcoI-PstI fragmenst [a Ncol hasítási hely a gX gén 883-888. pozíciójában található, a nukleotidszekvencia számozását lásd: Reá és munkatársai, J. Virol., 54, 21-29 (1985); a PstI hasítási hely a gp63 gén 439-444. pozíciójában található, a nukleotidszekvencia számozását lásd: Petrovskis és munkatársai, J, Virol., 60, 185-193 (1986)] a pGEM5Zf(+) plazmidba (Promega) klónoztuk, miután az utóbbi plazmidot Ncol és PstI enzimekkel emésztettük. Az így kapott plazmidot pBP53-nak neveztük.
A HChV El génje a Brescia nevű HChV törzsből [Moormann és munkatársai, Virology, 127, 184-198 (1990)] származott. A gént egy Dsal-EcoRV fragmensként klónoztuk [a Dsal enzimmel hasított oldalt E. coli DNS-polimeráz I. Klenow-fragmensével feltöltöttük; a nukleotidszekvencia számozását lásd: Moormann és munkatársai, Virology, 177, 184-198 (1990)] a pEVhisl3 plazmid EcoRI (E. coli DNS-polimeráz I. Klenow-fragmensével feltöltött), valamint EcoRV hasítási helyei közé. Az utóbbi plazmid a pSV2his plazmid egy olyan származéka [Hartman és Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8047-8051 (1988)], amely tartalmazza a hCMV promotert, melyet egy ATG kezdőkodon követ, tartalmaz több egyedi restrikciós hasítási helyet és mindegyik olvasási keretben transzlációs befejezőkodonokat (Peeters és munkatársai, J. Virol., 66, 894-905 (1992); ugyancsak lásd az 1. példát]. Az így kapott plazmidban a fuzionált El gén a pEVhisl3 plazmid kezdőkodonjával azonos olvasási keretbe esik. Ezt a plazmidot pEVhisl3HCVEl-nek neveztük (2. ábra). Miután a pEVhisl3HCVEl plazmidot Hpal és PstI enzimekkel emésztettük, egy a hCMV promotert, az El gént, valamint a transzlációs befejezőkodonokat tartalmazó fragmenst izoláltunk. A Hpal-PstI fragmenst tompa végek kialakítása céljából T4 DNS-polimerázzal kezeltük, majd a pBP53 plazmid EcoRV hasítási helyére klónoztuk. Egy plazmidot izoláltunk, amelyben a fragmens olyan orientációban inszertálódott, hogy abban az El gén transzkripciójának iránya azonos volt a pBP53 plazmidban található gX és gp63 gének transzkripciójának irányával, és azt pBP53El-nek neveztük (3. ábra).
Annak ellenőrzésére, hogy az El gén klónozása megfelelő módon történt-e, G5 sejtekben vizsgáltuk az El átmeneti expresszálását. A sejteket pBP53El, illetve pEVhisl3HCVEl plazmidokkal transzferáltuk lipofektin (GIBCO BRL) felhasználásával. Két nap elteltével az egyrétegű sejttenyészeteket fixáltuk, és az El expresszálását a HChV El glikoproteinre fajlagos
3. és 4. jelzésű, torma-peroxidázzal konjugált monoklonális ellenanyagok [Wenvoort, J. Gén. Virol., 70, 2685-2876 (1989)] felhasználásával, immunfestési eljárással vizsgáltuk. A pBP53El plazmiddal transzfektált sejtekben az El expresszálás világosan kivehető volt, és a festődés még sokkal intenzívebb volt, mint a pEVhisl3HCVEl plazmiddal transzfektált sejtekben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a pBP53El plazmidkömyezetben a PRV-szekvenciákkal határolt El hatékonyan expresszálódott.
A pBP53El plazmidot PvuII és PstI enzimekkel emésztettük, és a NIA-3 PRV törzsből származó vírusDNS-sel együtt, lipofektin felhasználásával G5 sejtekbe transzferáltuk. Két nap elteltével, amikor a plakkok világosan rvehetőek voltak, az egyrétegű sejttenyészeteket fixáltuk, és az átmeneti expressziós vizsgálatban fent ismertetettek szerint immunfestési eljárással vizsgáltuk. A festődött plakkok jelenléte azt mutatta, hogy az El gén homológ rekombináció révén átkerült a vírusgenomba, és az El gént a rekombináns vírusok expresszálják. Rekombináns vírusok izolálása céljából a transzfekciós kísérletet megismételtük, és 400 különálló plakkot izoláltunk. El-et expresszáló rekombinánsok azonosítása céljából az izolátumok egy részét SK-6 sejteket tartalmazó mirolemezere vittük át. Kétnapos inkubálást követően a plakkok rvehetőek voltak, ekkor a fertőzött egyrétegű sejttenyészeteket fixáltuk, és immunfestési eljárással El expresszálásra nézve vizsgáltuk. Végül az eredeti izolátumokból olyan El-et expresszáló rekombináns vírust plakktisztítottunk, amely SK-6 sejteken festődött plakkokat eredményezett.
Kimutattuk, hogy egy, a HChV El génjét expresszáló rekombináns PRV vakcinatörzs HChV vírussal való felülfertőző oltást követően a malacokat megvédi a klasszikus sertésláz jelentkezésétől [van Zijl és munkatársai, J. Virol., 65, 2761-2765 (1991)]. Az előzőek alapján, a fent ismertetett nem fertőzőképes, Elexpresszáló gp50 deléciós mutáns ugyancsak képes malacokban klasszikus sertésláz ellen védettséget létrehozó immunválasz kiváltására.
HU 220 099 Β
SZEKVENCIALISTA Információk az 1. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 20 bázis Szálszám: egyszeres Forrás : szintetikus
Szekvencia leírása: 1. szekvencia: TAGGCTAGAATTCTAGCCTA 20
Információk a 2. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 12 bázis Szálszám: egyszeres Forrás: szintetikus
Szekvencia leírása: 2. szekvencia:
AATTCTAGCCTA 12
Információk a 3. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 33
Szálszám: egyszeres Forrás: szintetikus
Szekvencia leírása: 3. szekvencia: AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC 33 Információk a 4. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 32
Szálszám: egyszeres Forrás: szintetikus
Szekvencia leírása: 4. szekvencia: CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG 32 Információk az 5. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 24 Szálszám: egyszeres Forrás: szintetikus
Szekvencia leírása: 5. szekvencia: CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC 24
Információk a 6. szekvenciához:
Szekvenciajellemzők:
Típus: nukleotid Hossz: 24
Szálszám: egyszeres Forrás: szintetikus
Szekvencia leírása: 6. szekvencia: CTAGGAAGCTTGATATCGAATTCA 24
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Pseudorabies vírus olyan gp50 mutánsának alkalmazása, amelyek csak vírus indukálta, sejtről sejtre való átvitellel képesek terjedni, és nem fertőzőképes utódvirionokat hoznak létre, azzal jellemezve, hogy a gp50 glikoproteint tartalmazó, és a gp50 génben a funkcionális gp50 protein expresszálását megakadályozó mutációval rendelkező vírust emberi és állati megbetegedések elleni vakcinák előállítására alkalmazzuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy Aujeszky-féle betegség elleni vakcina előállítására alkalmazzuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás Aujeszky-féle betegségtől eltérő állati megbetegedések elleni vektorvakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan mutánstHU 220 099 Β alkalmazunk, amely legalább egy, más kórokozóból származó antigént vagy annak részét kódoló gént tartalmaz.
- 4. Vakcina állati megbetegedés megelőzésére és/vagy terjedésének megakadályozására, azzal jellemezve, hogy gp50 glikoproteint tartalmazó Pseudora- 5 bies vírust tartalmaz, amely gp50 génben a funkcionális gp50 protein expresszálását megakadályozó mutációval rendelkezik.
- 5. A 4. igénypont szerinti vakcina Aujeszky-féle betegség megelőzésére és/vagy terjedésének megakadályo- 10 zására, azzal jellemezve, hogy a mutáció egy deléció.
- 6. A 4. igénypont szerinti vakcina legalább egy állati megbetegedés megelőzésére és/vagy terjedésének megakadályozására, azzal jellemezve, hogy a mutáció egy, az állati megbetegedésnek megfelelő, antigént kódoló heterológ gént tartalmazó inszerció.
- 7. A 4. igénypont szerinti vakcina legalább egy állati megbetegedés megelőzésére és/vagy terjedésének megakadályozására, azzal jellemezve, hogy a Pseudorabies vírus a gp50 génjének mutációja mellett egy, az állati megbetegedésnek megfelelő antigént kódoló heterológ gént tartalmaz.
- 8. A 4-7. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a Pseudorabies vírus legalább még egy mutációt tartalmaz egy másik génjében, előnyösen a gp63 vagy a gl génjében.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92202096 | 1992-07-09 | ||
| PCT/NL1993/000146 WO1994001573A1 (en) | 1992-07-09 | 1993-07-08 | Vaccines against aujeszky's disease and other animal diseases containing pseudorabies virus mutants |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9500039D0 HU9500039D0 (en) | 1995-03-28 |
| HUT70986A HUT70986A (en) | 1995-11-28 |
| HU220099B true HU220099B (hu) | 2001-10-28 |
Family
ID=8210764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500039A HU220099B (hu) | 1992-07-09 | 1993-07-08 | Aujeszky-féle betegség és más, álveszettségvírus-mutáns által okozott állati megbetegedések elleni vakcina |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5674500A (hu) |
| EP (1) | EP0654086B1 (hu) |
| JP (1) | JPH07509127A (hu) |
| KR (1) | KR100341994B1 (hu) |
| CN (1) | CN1124159C (hu) |
| AT (1) | ATE189000T1 (hu) |
| AU (1) | AU684252B2 (hu) |
| CA (1) | CA2139507C (hu) |
| DE (1) | DE69327656T2 (hu) |
| DK (1) | DK0654086T3 (hu) |
| ES (1) | ES2143507T3 (hu) |
| HU (1) | HU220099B (hu) |
| NZ (1) | NZ254267A (hu) |
| PL (1) | PL174219B1 (hu) |
| RU (1) | RU2158308C2 (hu) |
| TW (1) | TW289731B (hu) |
| WO (1) | WO1994001573A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA934882B (hu) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0587780B2 (en) * | 1991-06-06 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| US6007825A (en) * | 1991-12-23 | 1999-12-28 | American Cyanamid Company | Serpulina hyodysenteriae vaccine comprising a tly gene mutant |
| US7223411B1 (en) * | 1992-07-31 | 2007-05-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Herpesvirus replication defective mutants |
| US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| AU696336B2 (en) * | 1993-03-19 | 1998-09-10 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Defective mutant non-retroviral virus (e.g. HSV) as vaccine |
| EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
| EP0693551A1 (en) * | 1994-07-18 | 1996-01-24 | Akzo Nobel N.V. | gD-negative bovine herpesvirus mutant, capable of direct cell-to-cell transmission |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| WO2000053787A1 (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| US6399354B1 (en) | 1998-07-31 | 2002-06-04 | President And Fellows Of Harvard College | Replication-competent virus expressing a detectable fusion protein |
| DK1183332T3 (da) * | 1999-04-22 | 2010-09-06 | Us Agriculture | Porcint Reproduktions- og Respirations Syndrom-vaccine baseret på isolere JA-142 |
| AU2003297062A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-30 | University Of Massachusetts | METHOD OF INTRODUCING siRNA INTO ADIPOCYTES |
| BRPI0510928A (pt) * | 2004-06-18 | 2007-11-13 | Univ Minnesota | identificação de organismos viralmente infectados e vacinados |
| US7632636B2 (en) * | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| UA95778C2 (ru) | 2005-06-24 | 2011-09-12 | Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота | Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения |
| CN101081298A (zh) * | 2007-06-26 | 2007-12-05 | 陈少莺 | 一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法 |
| UA106475C2 (uk) * | 2008-08-25 | 2014-09-10 | Берингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Спосіб вакцинації свині проти високопатогенного репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (hp prrs) |
| CN101457215B (zh) * | 2008-12-01 | 2010-11-17 | 华中农业大学 | 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用 |
| TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| MY186535A (en) | 2011-02-17 | 2021-07-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Novel european prrsv strain |
| WO2012110490A1 (en) | 2011-02-17 | 2012-08-23 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Commercial scale process for production of prrsv |
| US9315781B2 (en) | 2011-07-29 | 2016-04-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| EP2968513A2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
| CN104250640A (zh) * | 2014-08-22 | 2014-12-31 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN111560355A (zh) * | 2015-03-20 | 2020-08-21 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2559384B2 (ja) * | 1985-07-29 | 1996-12-04 | ジ・アップジョン・カンパニ− | ウイルスワクチン |
| US5352575A (en) * | 1985-10-04 | 1994-10-04 | The Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| US4999296A (en) * | 1986-04-29 | 1991-03-12 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase negative insertion mutants of pseudorabies virus and methods for the production of same |
| NL8902087A (nl) * | 1989-08-17 | 1991-03-18 | Stichting Tech Wetenschapp | Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten. |
| EP0550553B1 (en) * | 1990-09-25 | 2000-07-12 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line |
| ATE288483T1 (de) * | 1992-07-30 | 2005-02-15 | Akzo Nobel Nv | Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin |
-
1993
- 1993-07-02 TW TW82105279A patent/TW289731B/zh active
- 1993-07-07 ZA ZA934882A patent/ZA934882B/xx unknown
- 1993-07-08 JP JP6503188A patent/JPH07509127A/ja active Pending
- 1993-07-08 RU RU95105518A patent/RU2158308C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 WO PCT/NL1993/000146 patent/WO1994001573A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-08 NZ NZ254267A patent/NZ254267A/en unknown
- 1993-07-08 HU HU9500039A patent/HU220099B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 AU AU45898/93A patent/AU684252B2/en not_active Ceased
- 1993-07-08 US US08/373,325 patent/US5674500A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 DE DE69327656T patent/DE69327656T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 KR KR1019950700064A patent/KR100341994B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 ES ES93916297T patent/ES2143507T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-08 CA CA 2139507 patent/CA2139507C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-08 EP EP19930916297 patent/EP0654086B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-08 PL PL93307049A patent/PL174219B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-08 DK DK93916297T patent/DK0654086T3/da active
- 1993-07-08 AT AT93916297T patent/ATE189000T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-09 CN CN93108005A patent/CN1124159C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100341994B1 (ko) | 2002-11-30 |
| CA2139507C (en) | 2005-04-19 |
| RU2158308C2 (ru) | 2000-10-27 |
| AU4589893A (en) | 1994-01-31 |
| RU95105518A (ru) | 1997-03-27 |
| EP0654086A1 (en) | 1995-05-24 |
| DE69327656T2 (de) | 2000-08-03 |
| WO1994001573A1 (en) | 1994-01-20 |
| PL174219B1 (pl) | 1998-06-30 |
| ES2143507T3 (es) | 2000-05-16 |
| US5674500A (en) | 1997-10-07 |
| ZA934882B (en) | 1994-02-03 |
| HUT70986A (en) | 1995-11-28 |
| NZ254267A (en) | 1996-08-27 |
| PL307049A1 (en) | 1995-05-02 |
| CA2139507A1 (en) | 1994-01-20 |
| CN1086143A (zh) | 1994-05-04 |
| HU9500039D0 (en) | 1995-03-28 |
| AU684252B2 (en) | 1997-12-11 |
| CN1124159C (zh) | 2003-10-15 |
| EP0654086B1 (en) | 2000-01-19 |
| DK0654086T3 (da) | 2000-06-13 |
| ATE189000T1 (de) | 2000-02-15 |
| DE69327656D1 (de) | 2000-02-24 |
| TW289731B (hu) | 1996-11-01 |
| JPH07509127A (ja) | 1995-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU220099B (hu) | Aujeszky-féle betegség és más, álveszettségvírus-mutáns által okozott állati megbetegedések elleni vakcina | |
| JP6845266B2 (ja) | 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン | |
| DK172285B1 (da) | Deletionsmutant af et herpesvirus og vaccine indeholdende dette virus | |
| Csellner et al. | EHV-1 glycoprotein D (EHV-1 gD) is required for virus entry and cell-cell fusion, and an EHV-1 gD deletion mutant induces a protective immune response in mice | |
| JPH08507784A (ja) | ウイルス・ワクチン | |
| US8986707B2 (en) | gM-negative EHV-mutants without heterologous elements | |
| Helferich et al. | The UL47 gene of avian infectious laryngotracheitis virus is not essential for in vitro replication but is relevant for virulence in chickens | |
| US5626850A (en) | Non-shedding live herpesvirus vaccine | |
| JP4044131B2 (ja) | ヘルペスウイルスワクチン | |
| US7060282B1 (en) | Attenuated equine herpesvirus | |
| Chowdhury | Construction and characterization of an attenuated bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) recombinant virus | |
| Peeters et al. | Non-transmissible pseudorabies virus gp50 mutants: a new generation of safe live vaccines | |
| JP3529134B2 (ja) | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン | |
| CN101712949B (zh) | 不含异源成分的gM-阴性EHV突变体 | |
| König et al. | Recombinant virus-expressed bovine cytokines do not improve efficacy of a bovine herpesvirus 1 marker vaccine strain | |
| AU738684B2 (en) | Recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine | |
| AU784310B2 (en) | Recombinant infectious laryngotracheitis virus vaccine | |
| US5686076A (en) | gD-negative bovine herpesvirus mutant, capable of direct cell-to-cell transmission | |
| US20020086035A1 (en) | Herpevirus replication defective mutants | |
| Batra | Herpes Simplex Virus Latency: Analysis of Viral Genes Controlling Reactivation | |
| WO1998004710A9 (en) | Live recombinant bhv/brsv vaccine | |
| WO1998004710A2 (en) | Live recombinant bhv/brsv vaccine | |
| US20020155131A1 (en) | Recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |