DE69535466T2 - Replikationsmangelhafte mutanten von herpesvirus - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Herpesviren stellen von einem ikosaedrischen Nucleocapsid umhüllte doppelsträngige DNA enthaltende Viren dar. Mindestens sieben Herpesviren werden mit einer Infektion beim Menschen in Zusammenhang gebracht, einschließlich das Herpes-simplex-Virus des Typs 1 (HSV-1), das Herpes-simplex-Virus des Typs 2 (HSV-2), das Varicella-Zoster-Virus (VZV), das Epstein-Barr-Virus (EBV), das Cytomegalovirus (CMV), das humane Herpesvirus 6 (HHV-6) und das humane Herpesvirus 7 (HHV-7).
  • HSV-1 ist eines der am intensivsten erforschten Herpesviren. HSV-1 zeigt während einer produktiven Infektion ein Genexpressionsmuster, welches stringent reguliert wird (Fields et al., Virology, 1990, Raven Press, NY). Die mehr als 70 Gene, die in diesem Virus identifiziert wurden, werden zum Teil nach der Kinetik ihrer Expression charakterisiert. Die Expression von jeder Klasse von Genen hängt von der Expression der Gene aus der vorhergehenden Klasse ab. Die viralen immediate early Gene oder α-Gene werden zuerst exprimiert, gefolgt von den viralen frühen Genen oder β-Genen denen ihrerseits die viralen späten Gene oder γ-Gene nachfolgen. Je nach dem Ausmaß, mit welchem ihre Expression auf eine virale DNA-Replikation angewiesen ist, werden die γ-Gene weiter in γ-1- und γ-2-Gene unterteilt.
  • Es ist gezeigt worden, dass mehrere Proteine die Expression der HSV-1-Gene regulieren. Das ICP4-Protein ist für die Expression von β- und γ-Genen essentiell (DeLuca et al., J. Virol., 56: 558 (1985). Das ICP27-Protein wird für die Expression von γ-Genen und für die Replikation von Virus-DNA benötigt (McCarthy et al., J. Virol., 63: 18 (1989). Das hauptsächliche DNA-Bindungsprotein (ICP8), ein Produkt von β-Genen, wird ebenfalls für die Replikation von Virus-DNA und für die Expression von γ-Genen benötigt (Gao et al., J. Virol., 63: 5258 (1989); Quinlan et al., Cell, 36: 657 (1984)).
  • Von Herpesviren verursachte Krankheiten variieren von leicht bis schwer und in einigen Fällen ist eine Infektion mit diesen Viren lebensbedrohlich.
  • Ein allgemeiner Ansatz zur Verhinderung einer Erkrankung besteht in einer Impfung. Für Herpesviren wurden zahlreiche auf isolierten Immunogenen und lebenden attenuierten Viren basierende Impfstoffe vorgeschlagen (Roizman, US-Patent 4,859,587 und Meignier et al., J. Inf. Dis., 3: 603-613 (1988) (HSV); Takahasi et al., Biken J., 18: 25-33 (1975) (VZV); Elek et al., Lancet, 1: 1-5 (1974) und Plotkin et al., Infect. Immun., 12: 531-527 (1975) (CMV).
  • Ferner wäre die Entwicklung von therapeutischen Immunmodulatoren zur Behandlung von immunpathologischen Krankheiten wie der herpetischen stromalen Keratitis wünschenswert (Jayaraman et al., J. of Immunology, 151: 5777-5789, 15. November 1993).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen Herpesviren, welcher ein mutantes Herpesvirus in einem pharmazeutisch zulässigen Träger umfasst. Das mutante Herpesvirus ist in der Lage, Zellen des zu impfenden Säugetiers zu infizieren und es ist in der Lage, in diesem Säugetier eine schützende Immunantwort hervorzurufen und/oder eine immunmodulatorische Antwort zu induzieren, was durch einen Shift der Antikörper-Unterklassen angezeigt wird, wenn es diesem Säugetier in vivo verabreicht wird. Die Mutation tritt in mindestens einem Gen auf, welches ein für die Replikation des Virus essentielles Protein codiert, so dass die Mutation für eine schadhafte Replikation des Virus sorgt. Das mutante Virus ist in dem Sinne lebendig, als es die Fähigkeit beibehält, Zielzellen in dem zu schützenden Wirt zu infizieren. Aus der Infektion geht keine Nachkommenschaft hervor, doch das Virus löst eine schützende Immunantwort aus, z.B. über vom Virus induzierte oder codierte, von den infizierten Zellen produzierte Immunogene. Schutz bedeutet, dass der Wirt eine Immunantwort gegen den Impfstoff aufbaut, so dass eine nachfolgende Infektion durch ein Wildtyp-Virus verhindert wird oder hinsichtlich der Dauer und des Ausmaßes weniger ernst ist. Vorzugsweise wird die Bildung einer latenten Infektion verhindert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Herpesvirus HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV, HHV-6, HHV-7 oder das nicht humane Typ 1-Herpesvirus des Pferdes. Vorzugsweise befindet sich die Mutation in dem Gen, das ICP27 von HSV-1 oder ICP8 von HSV-1 codiert, oder in den entsprechenden Genen eines anderen Herpesvirus als HSV-1. Ein bevorzugtes mutantes Herpesvirus zur Verwendung in dem Impfstoff ist n504R oder d301. Mehr bevorzugt enthält das Herpesvirus eine Mutation in sowohl ICP27 von HSV-1 als auch in den ICP8-Genen oder in beiden der entsprechenden Gene eines anderen Herpesvirus als HSV-1. Das mutante Herpesvirus kann auch technisch so verändert sein, dass es eines oder mehrere heterologe Gene umfasst, so dass es einen Impf-Expressionsvektor darstellt, der Schutz gegen ein pathogenes Heterologes zu dem elterlichen Herpesvirus bewirkt. Vorzugsweise umfasst das mutante Herpesvirus das Thymidinkinase-Gen des Wildtyp-Virus.
  • Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Herpesvirus-Impfstoffs, indem das oben beschriebene mutante Herpesvirus konstruiert und in einem pharmazeutisch zulässigen Träger suspendiert wird.
  • Die Erfindung kann zur Immunisierung eines Säugetiers gegen ein Herpesvirus verwendet werden, indem der oben beschriebene, ein mutantes Herpesvirus enthaltende Impfstoff verabreicht wird. Der Impfstoff der beanspruchten Erfindung könnte auch in einem Verfahren zur Immunisierung eines Säugetiers gegen andere Pathogene verwendet werden, indem ein mutantes Herpesvirus mit einem heterologen Gen, das ein zum Auslösen einer schützenden Immunantwort befähigtes Immunogen codiert, verabreicht wird.
  • Die Erfindung umfasst die Verwendung der Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung von herpetischer stromaler Keratitis, indem einem darauf angewiesenen Säugetier eine wirksame Menge des mutanten Herpesvirus verabreicht wird, um eine immunmodulatorische Antwort hervorzurufen, was durch einen Shift der Antikörper-Unterklassen in dem Säugetier nachgewiesen wird.
  • Die Erfindung umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Prophylaxe oder Behandlung einer immunpathologischen Krankheit oder Verfassung, wie z.B. der herpetischen stromalen Keratitis.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine graphische Darstellung der Antikörper-Antwort in mit dem Wildtyp-HSV-1 und mit den replikations-defizienten Mutanten d301, n504 und d120 geimpften Mäusen.
  • 2 ist eine graphische Darstellung der T-Zell-Antwort in mit dem Wildtyp-Virus und den replikations-defizienten Mutanten d120, d301 und n504 geimpften Mäusen.
  • 3 ist eine graphische Darstellung der Überlebensrate von mit replikations-defizienten Mutanten geimpften Mäusen, die danach dem Wildtyp-Virus ausgesetzt wurden.
  • 4 ist die Wiedergabe eines Diagramms der Lage und Struktur des Wildtyp-Gens und des ICP27-Gens des mutanten HSV-1. (A) Strukturen des Wildtyp-Gens und des mutanten LacZ-Insertionsgens. Oben wird eine Wiedergabe der Prototyp-Anordnung des HSV-1-Genoms gezeigt. Ein PstI-Restriktionsfragment aus dem Wildtyp- und dem d27-LacZ1-Gen wird unten gezeigt. Die engen Linien geben unique regions (U) des viralen Genoms an, die offenen Balken geben Repeat-Regionen (R) an und der schraffierte Balken gibt die E. coli-LacZ-Sequenz an. Der obere Pfeil stellt die codierenden Sequenzen für das ICP27-Protein von 63 kDa dar und der untere Pfeil die codierenden Sequenzen für das ICP-27-β-Galactosidase-Fusionsprotein von ungefähr 137 kDa. (B) Strukturen für die Wildtyp-Gene, die Nonsense-Gene und die Gene für die Deletions-Mutanten. Die mutanten ICP27-Gene wurden konstruiert, indem Restriktionsfragmente (in Klammern) deletiert oder XbaI- oder NheI-Oligonucleotidlinker (X bzw. N), welche in allen drei Leserastern Stop-Codons enthalten, insertiert wurden. Die Pfeile geben entweder die ICP27-Wildtyp-Proteine (oben) oder die eingekürzten Formen des von den Nonsense-Mutanten codierten ICP27 wieder. Restriktionsorte: P, PstI; B, BamHI; Sa, SalI; H, HpaI; R, RsrII; St, StuI; Ss, SspI; X, XbaI; N, NheI.
  • 5 ist die Wiedergabe eines Diagramms der Lokalisierung der Nonsense-Mutationen (n), Deletions-Mutationen (d) und Punkt-Mutationen (pm) des ICP8. Die Lage der ICP8 codierenden Region auf dem HSV-1-Genom wird in der Figur oben gezeigt. Die gezeigten Restriktionsorte sind BamHI (B), NotI (N) und SalI (S).
  • 6 ist eine graphische Darstellung der gesamten IgG2a- und IgG1-Antikörperproduktion nach Immunisierung der Mäuse mit lebenden, UV-inaktivierten HSV (mP-Stamm) oder mit PBS (Kontrolle).
  • 7 ist eine graphische Darstellung der Produktion von HSV-spezifischem IgG2a in Seren von den in 6 beschriebenen Mäusen.
  • 8 ist eine graphische Darstellung der Produktion von HSV-spezifischem IgG1 in Seren von den in 6 beschriebenen Mäusen.
  • 9 ist eine graphische Darstellung der Produktion von IgG2a nach Immunisierung der Mäuse mit Psoralen-inaktivierten oder d120 (ICP4-) HSV oder mit PBS (Kontrolle).
  • 10 ist eine graphische Darstellung der Produktion von IgG2a nach Immunisierung der Mäuse mit lebenden (KOS), d120 (ICP4-), d301 (ICP8-), n504 (ICP27-) HSV oder mit PBS (Kontrolle).
  • 11 ist eine graphische Darstellung der Wirkung des Anti-IFN-γ-Antikörpers auf den Unterklassen-Shift in Mäusen, die lebenden HSV-1 ausgesetzt wurden.
  • 12 ist eine graphische Darstellung der Auswirkung einer Virusinfektion auf das Abtöten von Vero-Zellen, das zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion untersucht wurde. Die Säulen geben die Counts der gesamten Zellen (von sowohl lebenden als auch toten Zellen) wieder, ausgedrückt als Prozentsatz der mock-infizierten Kontrolle. Das Wildtyp-Virus ist der Stamm 186 syn+-1. Die Zahlen in jedem Balken geben die Menge an toten Zellen wieder (ermittelt durch die Aufnahme des Farbstoffs Trypanblau), ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzellzahl für den einzelnen Datenpunkt; jeder Datenpunkt gibt einen Durchschritt von zwei Werten wieder.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die beanspruchte Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die hier beschriebenen replikations-defizienten Herpesviren zur Produktion von höheren IgG2a-Konzentrationen mit einem nachfolgenden Shift der IgG-Unterklassen führen, die vorzugsweise denen ähnlich sind, die nach Verabreichung von einem lebenden Virus hervorgerufen werden. Ein "Shift der Unterklassen" bedeutet, dass das Verhältnis (Gewichtsverhältnis) von IgG2a/IgG1 zunimmt im Vergleich mit dem, das bei Verabreichung eines inaktivierten Virus wie z.B. von UV- oder Psoralen-inaktivierten Viren unter den gleichen Bedingungen beobachtet wird. Vorzugsweise ist der beobachtete Shift der Unterklassen ähnlich dem, der unter den gleichen Bedingungen bei einem entsprechenden Wildtyp-Virus beobachtet wird.
  • Die Erfindung basiert auch auf der Entdeckung, dass die beschriebenen Mutanten der replikations-defizienten Herpesviren in vivo eine schützende Immunantwort hervorrufen, welche z.B. durch ein vermindertes Risiko einer latenten Infektion, eine geringere lokale Replikation und ein vermindertes Risiko einer Erkrankung des Zentralnervensystems (CNS) charakterisiert ist.
  • Erfindungsgemäß lassen sich die als Impfstoffe oder therapeutische Mittel nützlichen Mutanten von Herpesviren unter Einsatz von im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren, wie z.B. den weiter unten beschriebenen, konstruieren und testen. Die Konstruktion derartiger Mutanten wird durch die Tatsache erleichtert, dass die vollständigen DNA-Sequenzen der vier Herpesviren HSV-1, VZV, EBV und CMV bekannt sind (McGeoch et al., J. Gen. Virol., 69: 1531 (1988); McGeoch et al., J. Mol. Biol., 181: 1 (1985); McGeoch et al., Nucl. Acids Res., 14: 1727 (1986); Davison et al., J. Gen. Virol., 67: 1759 (1986); Baer et al., Nature, 310: 207 (1984); Chee et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol., 154: 125 (1990)) und Restriktionsenzym-Karten, die Partialsequenz und die Lage von vielen Genen in den restlichen Herpesviren (HSV-2, HHV-6 und HHV-7) sind ebenfalls bekannt (Fields et al., 1990 supra). Darüber hinaus stehen Genom-Bibliotheken zur Verfügung und es steht eine große Menge von Plasmiden zur Verfügung, welche viele unterschiedliche, für Herpesviren spezifische Gene codieren. Siehe allgemein Fields et al., 1990 supra und die darin zitierten Schriften sowie B. Roizman et al., "The Human Herpes-viruses," Raven Press, N.Y. (1993).
  • Beispielsweise werden Plasmide konstruiert, welche eine die passende Mutation codierende DNA umfassen, flankiert von einer DNA, welche eine homologe Rekombination eingeht. Das Plasmid wird zusammen mit dem Herpesvirus-DNA-Genom, in welches die Mutation insertiert werden soll, in Zellen wie z.B. tierische Zellen transfiziert. Die Mutation wird in dieses elterliche Genom mittels eines Verfahrens der homologen Rekombination insertiert, wenn in diesen Zellen die Virus-DNA repliziert wird. Unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Techniken wird die Virus-Nachkommenschaft auf das Vorkommen der Mutation hin gescreent. Die Virus-Nachkommenschaft wird z.B. auf ihre Fähigkeit hin gescreent, nur in einer Zelllinie zu replizieren, die eine den Wildtyp ergänzende Kopie des mutierten Gens exprimiert, indem sie für die Expression des Gens sorgt, das für die Replikation des Virus essentiell ist. Diese Viren können z.B. auch mit Hilfe einer Southern-Blot-Hybridisierung, eines Western-Blotting, der Immunfluoreszenz, der Expression einer spezifischen mRNA-Spezies usw. gescreent werden.
  • Die hier verwendeten replikations-defizienten Viren können von Herpesviren wie. z.B. HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV, HHV-6 und HHV-7 stammen. Vorzugsweise wird HSV-1 verwendet. Das Virus kann replikations-defizient gemacht werden, indem das Gen oder die Gene, welche ein oder mehrere für die Vervollständigung des Replikationszyklus benötigten Proteine codieren, wirksam mutiert werden. Die Mutationen lassen sich in Nonsense- (n), Deletions- (d) oder Punkt-Mutationen (pm) einteilen. Insbesondere ist eine Nonsense-Mutation eine Mutation, bei welcher das mutierte Gen an Stelle des gewünschten Proteins ein inaktives oder "Nonsense"-Protein codiert. Eine Deletions-Mutation ist eine Mutation, bei welcher das Gen oder ein Teil desselben, welches das gewünschte Protein codiert, zerstört ist. Bei einer Punkt-Mutation sind ein oder mehrere Nucleotide so substituiert, dass das davon codierte Protein inaktiv ist. Vorzugsweise werden Nonsense- und/oder Deletions-Mutationen verwendet.
  • Das Herpesvirus der Erfindung enthält vorzugsweise eine oder mehr Mutationen im ICP8 und/oder ICP27 des HSV-1. Alternativ können die entsprechenden Proteine in anderen Herpesviren mutiert sein. Solche Proteine sind zu dem ICP8 oder ICP27 des HSV-1 homolog.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die HSV-1-Mutante d27, HD2, d301 oder n504R, am meisten bevorzugt sind d301 oder n504R. Die Mutante d301 hat eine Deletions-Mutation in dem das ICP8 codierenden Gen (Gao et al., J. Virol., 63: 5258 (1989)). Die Mutante n504R hat eine Nonsense-Mutation in dem das ICP27 codierenden Gen. Die Besonderheiten der Mutationen werden weiter unten in den Beispielen angegeben.
  • Viren, welche zum ICP27 des HSV-1 homologe Proteine codieren umfassen VZV, RBV und das nicht menschliche Herpesvirus des Typs 1 des Pferdes (Davison et al., J. Gen. Virol., 67: 1759 (1986); Baer et al., Nature, 310: 207 (1984); Holden et al., J. Virol., 66: 664 (1992)) und Viren, die zum ICP8 des HSV-1 homologe Proteine codieren, umfassen VZV, EBV und CMV (Davison et al., J. Gen. Virol., 67: 1759 (1986); Baer et al., Nature, 310: 207 (1984); Chee et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol., 154: 125 (1990)). Es ist daher unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren möglich, Stämme dieser Viren zu erzeugen, welche über replikations-defiziente Eigenschaften ähnlich den oben für die HSV-1-Stämme beschriebenen verfügen, welche Mutationen in den Genen enthalten, die entweder ICP27 oder ICP8 codieren.
  • Wie oben angegeben, ist von HSV-2 bekannt, dass es viele Gene codiert, bei welchen die DNA-Sequenzen und Protein-Produkte homolog zu solchen sind, die von HSV-1 codiert werden, einschließlich solchen, die ICP8 und ICP27 codieren. (Field et al., 1990 supra). Die HSV-2-Proteine verfügen über Eigenschaften, die auch sehr ähnlich zu ihren HSV-1-Gegenstücken sind. Siehe Morse et al., J. Virol., 28: 624-642 (1978). Somit lassen sich replikations-defiziente Stämme des HSV-2 in der für HSV-1 beschriebenen Art und Weise erzeugen. Derartige replikations-defizienten Stämme sind als Impfstoffe von Nutzen, welche eine schützende Immunantwort oder Immunmodulations-Wirkung gegen HSV-2 hervorrufen.
  • In der HSV-Mutante kann ein zusätzliches Sicherheitsmerkmal hervorgerufen werden, um die Transformation in vivo zu verringern. Das HSV-2-Genom enthält zwei verschiedene DNA-Abschnitte, von denen gezeigt worden ist, dass sie in der Lage sind, Zellen in Gewebekultur zu transformieren. Diese Abschnitte werden als mtrII und mtrIII bezeichnet und ihre genaue Lage auf dem HSV-2-Genom ist bekannt (Galloway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4736 (1984); Alp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8257). Um die Möglichkeit auszuschalten, dass Impfstoff-Stämme des HSV-2 in der Lage sein könnten, Zellen in vivo zu transformieren, können diese DNA-Abschnitte mittels einer homologen Rekombination durch nicht transformierende HSV-1-Sequenzen ersetzt werden. Der Ersatz von solchen Sequenzen erfolgt unter Einsatz von Verfahren, die ähnlich denen sind, welche bei der Erzeugung von den hier beschriebenen Veränderungen in spezifischen HSV-1-Genen eingesetzt werden.
  • Die replikations-defizienten Mutanten der Erfindung sind nicht auf Herpesviren beschränkt, welche Mutationen in den ICP27- oder ICPB-Genen oder deren entsprechende Homologe enthalten. Jede lebensfähige Virusmutante, welche zur Replikation nicht befähigt ist und eine schützende Immunantwort oder eine Immunmodulation hervorruft, liegt im Geltungsbereich der Erfindung. Wenn beispielsweise die Gene, welche die Capsid-Proteine codieren, so mutiert werden, dass die Mutante zur Replikation unfähig ist, sind sie hier mit umfasst.
  • Vorteilhafterweise umfasst das Herpesvirus zwei oder mehr Mutationen. Dabei ist zu bedenken, dass mindestens eine Mutation die Replikation des Virus defizient machen muss. Vorzugsweise machen zwei oder mehr der Mutationen unabhängig voneinander die Replikation des Virus defizient, so wie da, wo beide der ICP8 und ICP27 codierenden Gene mutiert sind.
  • Beispiele für diese Viren sind, jedoch nicht ausschließlich, Stämme, bei denen eine Mutation im ICP8-Gen in das Genom eines Virus eingeführt wird, der bereits eine bestehende Mutation im ICP27-Gen aufweist. Umgekehrt lässt sich ein Virus-Stamm konstruieren, bei welchem eine Mutation im ICP27-Gen in das Genom eines Virus eingeführt wird, der bereits eine bestehende Mutation im ICP8-Gen aufweist. Um solche Viren zu replizieren, wird eine Zelllinie erzeugt, die in der Lage ist, sowohl das Wildtyp-Gen von ICP27 als auch das von ICP8 zu exprimieren. Die Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien, welche mehr als ein Gen eines Herpesvirus exprimieren, sind im Stand der Technik bekannt und sind den oben beschriebenen ähnlich, indem erkannt wird, dass transfizierte Zellen jedes der in der Transfektionsmischung enthaltenen Gene aufnehmen. Siehe im Allgemeinen Quinlan et al., Mol. Cell. Biol. 5: 957-963 (1983).
  • Das allgemeine Ziel für einen Virus-Impfstoff ist es, einen anhaltenden (sogar lebenslangen) Schutz vor einer Erkrankung herbeizuführen und frei von sowohl Anfangs- als auch Langzeit-Nebenwirkungen zu sein. Der Impfstoff sollte sowohl zu schützenden humoralen Antikörpern als auch zu einer zellvermittelten Immunität führen. Impfstoffe mit lebenden Viren sollten nicht in der Lage sein, sich von geimpften zu nicht geimpften Individuen auszubreiten und sie sollten in dem geimpften Individuum keine latente Infektion hervorrufen.
  • Die hier beschriebenen mutanten Herpesviren genügen im Allgemeinen diesen Kriterien. Speziell sollten die erfindungsgemäßen Impfstoffe mindesten über die folgenden Eigenschaften verfügen: Sie sollten lebensfähig sein und doch effektiv nicht in der Lage sein, in dem Wirt, in welchen sie eingeführt werden, lebensfähige Virusnachkommen zu erzeugen; sie sollten ferner in der Lage sein, in diesem Wirt eine schützende Immunantwort auszulösen. Umfasst sind lebensfähige Herpesviren, die zu einer Replikation nicht befähigt sind (in Abwesenheit einer exogenen Proteinquelle, wie z.B. aus einer unterstützenden Wirtszelllinie, welche ein ergänzendes Gen oder ergänzende Gene exprimiert) und daher nicht in der Lage sind, Virusnachkommen zu erzeugen, die aber in der Lage sind, Antigen-Determinanten zu exprimieren, so dass eine schützende Immunantwort ausgelöst wird.
  • Virus-spezifische Produkte, welche im Allgemeinen für das Auslösen einer schützenden Immunantwort verantwortlich sind, sind Proteine und Glykoproteine, die in der infizierten Zelle exprimiert werden und im Allgemeinen auf der Oberfläche des Virions anzutreffen sind. Im Falle der Herpesviren sind einige der hauptsächlichen Antigen-Determinanten vom Virus-Genom codierte Glykoproteine. Es lassen sich Impfstoff-Stämme des replikations-defizienten Herpesvirus herstellen, welche in der Lage sind, entweder eines oder mehrere Proteine oder Glykoproteine zu exprimieren, die normalerweise von einem endogenen oder heterologen Herpesvirus oder einem anderen Pathogen exprimiert werden.
  • Gemäß der beanspruchten Erfindung kann das replikations-defiziente Herpesvirus verabreicht werden, um eine schützende Immunantwort oder eine immunmodulatorische Wirkung gegen das entsprechende Wildtyp-Herpesvirus auszulösen. Alternativ kann das replikations-defiziente Herpesvirus ferner mit Hilfe bekannter Techniken gentechnisch verändert sein, um ein heterologes Antigen oder Immunogen zu exprimieren, das eine schützende Immunantwort oder eine immunmodulatorische Wirkung gegen das entsprechende heterologe Wildtyp-Pathogen hervorruft. Das heterologe Gen oder die heterologen Gene für das Antigen oder Immungen kann oder können von einem anderen Herpesvirus stammen, wie z.B. von den weiter oben angeführten, oder von anderen infektiösen Krankheitserregern wie z.B. Viren, Bakterien, Pilzen oder Parasiten.
  • Beispielsweise können eines oder mehrere Gene, welche HSV-2-spezifische Glykoproteine codieren, die in der Lage sind, eine schützende Immunantwort auszulösen, auf jeder Seite von einer HSV-1-DNA von ungefähr 100-300 bp flankiert sein, z.B. von einer HSV-1-Thymidinkinase oder mehr bevorzugt von Glykoprotein C-DNA oder von irgend einem anderen Abschnitt des HSV-1-Genoms, der für die Infektion oder Replikation des Virus benötigt wird, wie z.B. das Gen, welches ICP8 oder ICP27 codiert. Eine derartige Mutation macht das Herpesvirus replikations-defizient und ruft gleichzeitig eine schützende Immunantwort gegen das heterologe Protein hervor. Es kann von Vorteil sein, in einem Impfstoffstamm eine intakte Kopie des Thymidinkinase-Gens zurückzubehalten, weil das Produkt dieses Gens für die Aktivierung vieler Anti-HSV-Verbindungen benötigt wird (Fields et al., 1990 supra). Dieses Hybrid wird zusammen mit infektiöser HSV-1-spezifischer DNA, die entweder in einem oder beiden der ICP8- und ICP-27 Gene eine Mutation enthält, in Zellen transfiziert. Die Nachkommenschaft der Viren wird auf die Insertion des HSV-2-Gens oder der HSV-2-Gene in den spezifischen HSV-1-Locus hin gescreent, der über die wie oben beschriebene flankierende Sequenz ermittelt wird. Diese Viren können, wie weiter unten beschrieben, nach ihrer Fähigkeit zum Auslösen einer schützenden Immunantwort bewertet werden. Derartige Viren sind für den Schutz von Individuen gegen sowohl HSV-1 als auch HSV-2 von Nutzen, da sie in der Lage sind, Antigen-Determinanten, die für beide Viren spezifisch sind, zu exprimieren.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Glykoprotein-Immunogene von HSV-1 von Sarmiento et al., J. Virol., 29: 1159 (1979) ("gB"); Coker et al., J. Virol. 47: 172-181 (1978) ("gD") und DeSai et al., J. Gen. Virol., 69: 1147-1156 (1988) ("gH") beschrieben. Diese Glykoprotein-Immunogene können in mutierte Spezies insertiert werden, z.B. in die Gene, welche, wie oben beschrieben, die für die Replikation in einem anderen Herpesvirus benötigten Proteine codieren.
  • Wie oben angegeben, führen die hier beschriebenen replikations-defizienten Herpesviren zur Produktion höherer Konzentrationen von IgG2a mit nachfolgendem Unterklassen-Shift, der vorzugsweise dem ähnlich ist, der von einem lebenden Virus nach in vivo-Verabreichung an ein Säugetier hervorgerufen wird.
  • Murine Antikörper-Antworten gegen lösliche Proteine und Kohlenhydrate sind im Allgemeinen auf die Unterklassen IgG1 bzw. IgG3 beschränkt. Es ist berichtet worden, dass ein Angriff auf verschiedene Mäusestämme mit verschiedenen lebenden Viren zu einer bevorzugten Induktion von Antikörpern der IgG2a-Unterklasse führt. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass sich nur ein Teil der viralen Antwort aus Virus-spezifischen Antikörpern zusammensetzt. Somit lässt sich die Wirkung als virusinduzierte Immunmodulation ansehen.
  • Antikörpermoleküle unterscheiden sich in ihren Fähigkeiten, sich an Komplement- und Fc-Rezeptoren zu binden. Die funktionellen Eigenschaften des Unterklassen-Ig IgG2a legen nahe, dass sie bei der Abwehr einer Virusinfektion von Wichtigkeit sind, bei welcher eine Opsonisierung und Komplement-vermittelte Lyse der Viren sowie eine Zerstörung der vom Virus infizierten Zellen durch eine Antikörper-abhängige Cytotoxizität der Zelle (ADCC) bedeutsam sind. Sie stellt auch die wirksamste Unterklasse für die Induktion von Makrophagen- und Killerzellen-ADCC von Tumorzellen dar, während das IgG1 bei der ADCC über eine sehr beschränkte Aktivität verfügt.
  • Interferon γ (IFN-γ) wird von Helfer-T-Zellen der Unterabteilung Th1 produziert. IFN-γ weist verschiedene Wirkungen auf unterschiedliche Zelltypen auf. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Makrophagen und es ist auch gezeigt worden, dass es die Aktivierung und Differenzierung von polyklonalen B-Zellen beeinflusst. IFN-γ steigert die Produktion von IgG2a durch in IL-2 stimulierte aktivierte murine und humane B-Zellen und bringt mit Antikörper gegen Ig behandelte humane B-Zellen dazu, in die S-Phase des Zellzyklus einzutreten.
  • Es ist gezeigt worden, dass der primär von Makrophagen freigesetzte Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) bei verschiedenen Funktionen mit IFN-γ eine synergistische Wirkung zeigt (Lee et al., J. Immunol., 133: 1083 (1984); Stone-Wolff et al., J. Exp. Med., 159: 828 (1984); Williams et al., J. Immunol., 130: 518 (1983), einschließlich den Schutz gegen eine tödliche Infektion.
  • Ohne auf eine besondere Theorie festgelegt zu werden, aktiviert eine HSV-Infektion durch lebende oder replikations-defiziente Viren vorzugsweise die Th1-Zellen; dabei werden IFN-γ und andere Cytokine ausgeschieden. Angesichts der bekannten Beziehungen zwischen IgG2a, IFN-γ, TNFα und ADCC ist die Verabreichung von replikations-defizienten Herpesviren, die in der Lage sind, einen IgG2a/IgG1-Unterklassen-Shift hervorzurufen oder die Produktion von IFN-γ und anderen Cytokinen zu induzieren, bei der Behandlung von Infektionen mit Herpesviren wie z.B. der herpetischen stromalen Keratitis von Nutzen. Stoat et al., J. Immunol., 133: 518 (1989).
  • Replikations-defiziente Herpesviren, welche die Fähigkeit zeigten, den IgG2a/IgG1-Unterklassen-Shift zu bewirken, waren solche, wo sich eine Transkription von zumindest einigen β-Genen ereignete. Das replikations-defiziente Herpesvirus ist vorzugsweise ein mutantes HSV-1. Am meisten bevorzugt sind die ICP8 und/oder ICP27 codierenden Gene mutiert worden, um die Replikation der Herpesviren defizient zu machen. Die Mutation ist vorzugsweise eine Nonsense- oder Deletions-Mutation. Alternativ ist das Herpesvirus irgendein anderes oben beschriebenes Herpesvirus, wo die Mutation in einem Gen auftritt, welches die Transkription von mindestens einigen β-Genen gestattet und die Replikation der Herpesviren defizient macht. Vorzugsweise sind die Gene, welche die zu ICP8 und ICP27 von HSV-1 homologen Proteine codieren, wie zuvor beschrieben mutiert, um die Replikation der Herpesviren defizient zu machen. In einer Ausführungsform ist die verwendete replikations-defiziente Mutante des Herpesvirus keine Deletions-Mutante für das Gen, welches das Glykoprotein H (gH-) oder ICP4 codiert.
  • Angesichts der Fähigkeit des replikations-defizienten Herpesvirus der beanspruchten Erfindung, die Produktion von IgG2a mit einem nachfolgenden Ig-Unterklassen-Shift zu steigern, lässt sich das mutante Herpesvirus zur Behandlung von immunpathologischen Erkrankungen wie z.B. Herpesvirus-Infektionen bei Säugetieren, vorzugsweise einer herpetischen stromalen Keratitis oder Enzephalitis, verabreichen.
  • Der Fachmann wird verstehen, dass sich die Dosierung mit Hilfe von Standardverfahren optimieren lässt. Im Allgemeinen werden die Impfstoffe und pharmazeutischen Zusammensetzungen in einem geeigneten sterilisierten Puffer. formuliert und mit einer Dosierung zwischen 103 und 109 PFU/kg verabreicht (z.B. mittels subkutaner, intramuskulärer oder intradermaler Injektion). Die Zusammensetzung kann auch mit jedem bekannten Mittel verabreicht werden, das eine erfolgreiche immunmodulatorische Antwort und/oder eine schützende Immunantwort hervorruft, wie z.B. eine orale oder okulare Verabreichung in im Stand der Technik bekannten Vehikeln.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und nicht ihrer Einschränkung. Der Fachmann wird verstehen, dass sich die unten angegebenen spezifischen Ausführungsformen in Übereinstimmung mit der oben beschriebenen Erfindung auf zahlreiche Weise abändern lassen, während die entscheidenden Eigenschaften des Impfstoffs oder Immunmodulators beibehalten werden.
  • BEISPIELE
  • KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON VIREN; WELCHE MUTATIONEN IM ICP27-GEN DES HSV-1 CODIEREN
  • Zellen, Viren, Infektionen und Transfektionen.
  • Die Infektion der Zellen mit Viren und die Transfektion der Zellen mit DNA erfolgten in Vero- oder V27-Zellen. Die Vero-Zellen wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, Md. erhalten; die Herkunft der V27-Zellen wird weiter unten beschrieben. Es wurde KOS 1.1, der Wildtyp-Stamm des HSV-1 eingesetzt. Die Zellen wurden mit einer Menge von 10 PFU pro Zelle infiziert. Dem Medium wurde, wie weiter unten angegeben, Dinatrium-Phosphonoacetat (PAA) in einer Konzentration von 400 μg/ml zugesetzt. Die Transfektion von Zellen mit Virus-DNA in Marker-Transfer-Experimenten erfolgte in V27-Zellen unter Einsatz der Technik der Calciumphosphat-Fällung (Rice et al., J. Virol., 62: 3814 (1988).
  • Die V27-Zelllinie, welche eine stabil integrierte Kopie des ICP27-Gens von HSV-1 enthält, wurde auf die folgende Weise isoliert. Subkonfluente Platten von Vero-Zellen mit einem Durchmesser von 100 mm wurden mit 0,8 μg pSV2neo (Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), einem Plasmid, das gegen das Arzneimittel G418 Resistenz verleiht, und entweder mit 4 μg oder mit 10 μg pBH27 (Rice et al., J. Virol., 62: 3814 (1988)), einem Plasmid, das ICP27 des HSV-1 codiert, transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1:9 in ein Medium überführt, welches 500 μg G418 pro ml enthielt. 2 bis 4 Wochen später wurden die gegen G418 resistenten Kolonien isoliert und zu einer Massenkultur angezüchtet. Auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, eine Plaque-Bildung der ICP27-Mutanten tsY46 (Sacks et al., J. Virol., 55: 796 (1985)) und tsLG4 (Sandri-Goldin et al., J. Virol., 38: 41 (1981)) bei der nicht-permissiven Temperatur zu unterstützen, wurden die Zelllinien auf ihre ICP27-Expression hin untersucht. Sechs von 17 Isolaten wurden in diesem Assay als positiv getestet. Eine dieser Zelllinien mit der Bezeichnung V27 wurde für die Isolierung der ICP27-Mutanten verwendet. Eine Southern-Blot-Analyse zeigte, dass die V27-Zellen ungefähr eine Kopie des ICP27-Gens pro haploidem Genomäquivalent enthielten.
  • Erzeugung von ICP27-Mutanten des HSV-1.
  • Weil ICP27 ein für die Replikation des HSV-1 essentielles Gen darstellt (Sacks et al., J. Virol., 55: 796 (1985), haben Viren, die in ICP27 Mutationen enthalten einen Null-Phänotyp. Daher wurden V27-Zellen eingesetzt, um derartige Mutanten zu vermehren.
  • Die Insertion des lacZ-Gens von E. coli in das Chromosom des HSV-1 ist ein nützliches Werkzeug für die Isolierung von Virus-Mutanten (Carmichael et al., J. Virol., 63: 591 (1989); Goldstein et al., J. Virol., 62: 196 (1988)). Virale Plaques, welche β-Galactosidase, das Produkt des lacZ-Gens, exprimieren, lassen sich auf Grundlage ihrer Farbe (blau) in Gegenwart von X-Gal, einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase, identifizieren. Wie weiter unten genau beschrieben, wurde zuerst eine β-Galactodidase exprimierende Mutante des HSV-1 isoliert, welche eine im Leseraster liegende Insertion des lacZ-Gens in die das ICP29 codierenden Sequenzen enthält. Dieses Virus diente dann als Empfänger in den Marker-Transfer-Experimenten für die Einführung spezifisch mutierter ICP27-Allele in das Virus-Genom. Die Rekombinanten, welche die neu eingeführten ICP27-Gene enthielten, wurden als klare Plaques gegen einen Hintergrund von elterlichen blauen Plaques identifiziert.
  • Um die lacZ-Insertions-Mutante des HSV-1 zu erzeugen, wurde ein rekombinantes Plasmid konstruiert, in welchem der lacZ-codierende Abschnitt in eine deletierte Version des ICP27-Gens insertiert wurde. Dieses Fusions-Gen wurde dann zusammen mit infektiöser HSV-1-DNA in V27-Zellen transfiziert. Wenn die Virus-Progenitur aus dieser transfizierten Kultur in Gegenwart von X-Gal auf V27-Zellen plattiert wurde, waren ungefähr 3% der Plaques blau. Ein blauer Plaque wurde eingesammelt und der erhaltene Virus-Klon mit d27-lacZ1 bezeichnet. Eine Southern-Blot-Analyse zeigte, dass d27-IacZ1 eine genomische Struktur aufweist, welche mit dem Ersatz des WT-IPC27-Gens durch das ICP-lacZ-Fusions-Gen übereinstimmt (4A). Darüber hinaus exprimierten mit d27-lacZ1 infizierte Zellen nicht das WT-ICP27, sie exprimierten aber statt dessen ein Polypeptid von ungefähr 137 kDa, was mit der für das ICP27-β-Galactosidase-Fusionsprotein vorhergesagten Größe übereinstimmt. Der Urtyp des d27-lacZ1-Virus war nicht in der Lage, auf Vero-Zellen Plaques zu bilden (< 2 × 103 PFU/ml), bildete aber auf V27-Zellen wirksam Plaques (2 × 108 PFU/ml). Die experimentellen Details für die Isolierung von d27-lacZ1 werden nun weiter unten beschrieben.
  • Das Plasmid pPs27pd1 (Rice et al., J. Virol., 63: 3399 (1989)) enthält ein von genomischer HSV-1-DNA stammendes Pst1-Insert von 6,1 Kilobasen (kbp). Dieses Fragment enthält sowohl das gesamte ICP27-Gen als auch angrenzende Sequenzen (4A). Abkömmlinge des pPs27pd1, welche im ICP27-Gen eine Deletion und eine Insertion des lacZ-Gens enthalten, wurden auf die folgende Art und Weise konstruiert. Durch Verdau mit SalI wurde pPs27pd1 in der das ICP27 codierenden Region linearisiert. Die DNA wurde dann mit Bal 31 so behandelt, dass an jedem Ende DNA von ungefähr 0,5 kb entfernt wurde. Die Enden wurden mittels einer Auffüllreaktion unter Einsatz des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli repariert (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1987)). Diese DNA wurde an BglII-Linker (New England BioLabs, Inc., Beverly, Mass.) ligiert und das Produkt mit BglII verdaut, erneut ligiert und zur Transformation von E. coli eingesetzt. Es wurden vier Plasmid-Isolate erhalten, von denen jedes das in gleicher Orientierung wie das ICP27-Gen insertierte lacZ-Gen enthielt.
  • Jede der vier Plasmid-DNAs wurde mit PstI verdaut, einzeln mit WT-HSV-1-DNA vermischt und in V27-Zellen transfiziert. Nach vier Tagen wurden die Kulturen geerntet und die erhaltenen Virus-Stocks unter einen flüssigen Überzug aus Medium 199 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.), das 1% Serum von neugeborenen Kälbern und 0,1% humanes Immunglobulin enthielt, auf V27-Zellen plattiert. Nach 2 Tagen wurde das Medium durch Medium 199 ersetzt, das 1% Serum von neugeborenen Kälbern, 0,5% Agarose und 300 μg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Ind.) enthielt. Einer der erhaltenen vier Virus-Stocks ergab einen hohen Prozentsatz (ungefähr 3%) an blauen Plaques. Eine blaue Plaque wurde dreimal gereinigt und der erhaltene Virus-Klon wurde als d27-lacZ1 bezeichnet. Eine Southern-Blot-Analyse der d27-lacZ1-DNA zeigte, dass das WT-ICP27-Gen durch das ICP27-lacZ-Fusions-Gen (4A) ersetzt worden war. Darüber hinaus zeigte sowohl eine Southern-Blot-Analyse der Virus-DNA als auch eine Restriktions-Analyse des (als pPsd27-lacZ1 bezeichneten) elterlichen Plasmids, dass ungefähr 0,8 bp aus dem ICP27-Gen in d27-lacZ1 deletiert worden waren.
  • Konstruktion von HSV-1-Mutanten, die im ICP27-Gen Deletions- oder Nonsense-Mutationen enthalten.
  • Es wurden 5 Plasmide erzeugt, die Deletions- oder Nonsense-Codoninsertionen im ICP27-Gen enthielten, wie dies allgemein bei Knipe et al., J. Virol., 63: 3400 ff beschrieben ist. Siehe 4B. In jedem Plasmid wurden die Virus-DNA-Inserts von den Vektorsequenzen abgetrennt und zusammen mit d27lacZ1-DNA in V27-Zellen transfiziert. Die erhaltenen Virus-Nachkommen wurden in Gegenwart von X-Gal auf V27- Zellen plattiert und eine Fraktion (ungefähr 1 bis 5%) bildete klare Plaques. Die Viren, die klare Plaques bildeten wurden isoliert und in einem Immunfluoreszenzassay oder, wie weiter unten beschrieben, mittels einer DNA-Restriktionsanalyse auf das Vorkommen der neu eingeführten ICP27-Allele hin gescreent. Für jede Mutante wurde eine positive Plaque dreimal gereinigt. Eine potentielle ICP27-Deletions-Mutante wurde als d27-1 bezeichnet. Potentielle Nonsense-Mutanten wurden als n59R, n263R und n594R bezeichnet; die Zahlen in den Namen der Mutanten entsprechen der Anzahl der aminoendständigen ICP27-Reste, von denen erwartet wird, dass sie in jedem eingekürzten Protein vorkommen. Zum Vergleich besteht das Wildtyp-Protein aus 512 Aminosäureresten.
  • Die rekombinanten Virus-Genome wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert, um zu bestätigen, dass jedes Virus die geeignete Mutation aufwies. Aus infizierten V27-Zellen wurde die Virus-DNA isoliert und die PstI- und XbaI-Restriktionsenzym-Muster in Southern-Blots untersucht. Als Sonde wurde ein 6,1 kb PstI-HSV-1-DNA-Fragment verwendet, welches das Gen des ICP27-Wildtyps enthielt. Weil dieses Fragment einige der Repeat-Sequenzen in der L-Komponente des HSV-1-Genoms umfasst (4A), traten zwei Banden auf, wenn die DNA des Wildtyp-HSV-1 untersucht wurde. Diese waren das 6,1 kb ICP-27-Fragment und ein 3,3 kb Fragment, das von der anderen UL-RL-Verbindungsstelle stammte. Im Gegensatz dazu fehlte bei allen fünf ICP27-Mutanten-DNAs das 6,1 kb Fragment, aber alle enthielten das 3,3 kb Fragment. Die Mutante d27-1 enthielt ein neues DNA-Fragment von etwa 4,6 kb, was mit deren erwarteter Deletion von 1,6 kb übereinstimmte. Die vier restlichen Mutanten enthielten jeweils zwei neue Banden, von denen die kombinierten Größen annähernd 6,1 kb betrugen, was mit der Insertion einer XbaI-Stelle an der geeigneten Position in jedem Mutanten-Genom in Übereinstimmung stand. Ferner enthielt keines der Mutanten-Genome das 8,4 kb PstI-Fragment, welches nur in der elterlichen d27-lacZ1-DNA vorkommen sollte.
  • Es wurden Plaque-Assays durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Mutanten zu einem Wachstum in Vero-Zellen in der Lage waren. Alle fünf Mutanten waren unfähig, bei der niedrigsten Verdünnung, die noch untersucht werden konnte (Tabelle 1), auf Vero-Zellen Plaques zu bilden (niedrigere Verdünnungen zerstörten den Monolayer der Zellen). Jede Mutante bildete jedoch auf V27-Zellen wirksam Plaques. Weil das einzige bekannte im V27-Genom vorkommende intakte HSV-1-Gen eine Wildtyp-Kopie des ICP27-Gens ist, zeigen diese Ergebnisse, dass der tödliche Defekt in jeder Mutante von dieser ICP27-Wildtypform in trans komplementiert wird. TABELLE 1. Wachstum von ICP27-Mutantenα des HSV-1
    viraler Titer (PFU/mt)
    Virus Vero-Zellen V27-Zellen
    KOS 1.1 (Gew.) 7 × 108 5 × 108
    D27-1 < 2 × 103 3 × 108
    n59R < 2 × 103 3 × 108
    n263R < 2 × 103 3 × 108
    n406R < 2 × 103 3 × 108
    n504R < 2 × 103 3 × 108
    • a die viralen Stocks wurden durch den Plaque-Assay auf die angegebenen Zelllinien titriert.
  • Die experimentellen Details für die Isolierung dieser Mutanten werden nun im Folgenden beschrieben.
  • Die Deletions- und Nonsense-Mutationen in dem ICP27-Gen wurden gentechnisch in das Plasmid pPs27pd1 eingeführt (4B). Die die 406R-Mutation und die 504R-Mutation enthaltenden Plasmide pPs-406R bzw. pPs-504R wurden wie bei Rice et al., J. Virol., 63: 3399 (1989) beschrieben konstruiert. Das Plasmid pPsd27-1 wurde konstruiert, indem das pPs27pd1 mit BamHI und StuI verdaut wurden, die mit BamHI ausgeschnittenen 3'-DNA-Enden unter Einsatz des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli ausgefüllt wurden und das große DNA-Fragment mit DNA-Ligase rezirkularisiert wurde. Die Plasmide pPs-59R und pPs-263R wurden konstruiert, indem an Stelle des 2,4 bp WT-BamHI-SstI-Fragments von pPs27pd1 die mutanten 2,4 bp BamHI-SstI-Fragmente aus den oben beschriebenen Plasmiden pBH-59R und pBH-263R eingesetzt wurden.
  • Die rekombinanten Viren wurden wie folgt konstruiert. Die oben beschriebenen Plasmid-DNAs wurden mit PstI verdaut, einzeln mit viraler d27-lacZ1-DNA vermischt und in V27-Zellen transfiziert. Die Virusnachkommen wurden 3 bis 5 Tage später geerntet und in Gegenwart von X-Gal auf V27-Zellen plattiert. Klare Plaques, welche mit Häufigkeiten von 0,5 bis 5% beobachtet wurden, wurden ausgesucht und gescreent, um zu ermitteln, ob sie die Mutationen des ICP27-Gens erworben hatten.
  • Die Plaque-Isolate wurden auf zweierlei Weise gescreent. Die Plaque-Isolate d27-1, n59R und n263R wurden dreimal in V27-Zellen gereinigt und sodann dazu verwendet, V27-Zellen zu infizieren. Aus den infizierten Zellen wurde rohe virale DNA gewonnen (Gao et al., J. Virol., 63: 5258 (1989)). Die XbaI- und BamHI-Restriktionsenzymmuster von jeder DNA-Probe wurden untersucht, um das Auftreten von jeder Mutation zu bestätigen. Im Falle von n406R und n504R wurden die anfänglichen Plaque-Isolate dazu verwendet, kleine Virusstocks zu gewinnen. Auf Deckgläsern gewachsene Vero-Zellen wurden sodann mit jedem Virus infiziert. Die infizierten Zellen wurden fixiert und für die Immunfluoreszenz angefärbt, wobei ein monoklonaler Anti-ICP27-Antikörper zum Einsatz kam (Ackerman et al., J. Virol., 52: 108 (1984)). Die Isolate von n406R und n504R wurden dann zwei weitere Male Plaque-gereinigt und in V27-Zellen wurden große Stocks von jeder Mutante gewonnen.
  • Expression und intrazelluläre Lokalisation von mutierten ICP27-Polypeptiden.
  • Als nächstes wurden die Mutanten auf ihre Expression von mit ICP27 verwandten Polypeptiden hin untersucht. Die Vero-Zellen wurden entweder mock-infiziert oder mit jedem Virus infiziert und die Zellextrakte 10 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit dem monoklonalen Antikörper H1113 reagieren gelassen. In den Extrakten der d27-1-mock-infizierten oder der n59R-mock-infizierten Zellen wurden keine mit ICP27 verwandten Polypeptide nachgewiesen. In den Extrakten der n263-infizierten Zellen wurde ein Protein von ungefähr 38 kDa nachgewiesen und in den Extrakten der n406-infizierten Zellen wurde ein Protein von ungefähr 52 kDa nachgewiesen. Die mit n504R infizierten Zellen produzierten ein mit ICP27 verwandtes Polypeptid, das zusammen mit dem Wildtyp-Protein von 63 kDa migrierte. Die Größen der verkürzten Proteine stimmten ungefähr mit den vorausgesagten Größen überein, die auf der DNA-Sequenz des ICP27-Gens basierten (McGeoch et al., J. Gen. Virol., 69: 1531 (1988)).
  • Zur Ermittlung der intrazellulären Verteilung der auf dem viralen Genom exprimierten mutanten Proteine wurden mit jeder Mutante infizierte Vero-Zellen 4 Stunden nach der Infektion geerntet, fixiert und für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers H1113 weiterbehandelt. Die mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen zeigten eine lokalisierte Kernfärbung, wobei sich ein oder mehrere Bereiche intensiver anfärbten. Diese Bereiche entsprachen keinen besonderen Kernregionen wie z.B. den Kernkörperchen. In Zellen, die mit d27-1 oder n59R infiziert worden waren, wurde keine über dem Hintergrundrauschen liegende Färbung nachgewiesen. Mit n263R infizierte Zellen zeigten eine Kernfärbung und ähnlich den Virus-infizierten Zellen einige intensiver gefärbte Bereiche des Kerns. Diese Bereiche schienen den Kernkörperchen zu entsprechen. Mit n406R infizierte Zellen zeigten eine Kernfärbung, das Muster der Färbung unterschied sich jedoch von dem der mit einem Wildtyp-Virus infizierten Zellen in zwei Punkten. Erstens war in den meisten Zellen das n406R-codierte ICP27-Protein größtenteils von den Kernregionen ausgeschlossen. Zweitens zeigten viele der n406R-infizierten Zellen ein eher punktförmiges Färbungsmuster, wobei das mutierte Protein in kugelförmigen Cluster im Kern konzentriert war. Mit n504R infizierte Zellen zeigten ebenfalls eine Kernfärbung, aber in diesem Falle schien das Protein über den ganzen Kern verteilt vorzuliegen, wobei sie ein diffuseres Muster aufwiesen als das bei den Zellen, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die von n263R, n406R und n504R codierten mutierten Formen des ICP27 sich effizient im Zellkern festsetzten, sich aber in ihren Ansammlungsmustern im Kern voneinander und von dem des Wildtyp-Virus unterschieden.
  • Virus-DNA-Synthese in mit ICP27-Mutanten infizierten Zellen.
  • Als nächstes wurde der Phänotyp der ICP27-Mutanten in Bezug auf die Replikation der Virus-DNA ermittelt. Zur Ermittlung des Phänotyps der Virus-DNA-Synthese von jeder Mutante wurden Vero-Zellen mock-infiziert oder mit jeder der Mutanten infiziert. Nach einer Adsorptionszeit von 1 Stunde wurden die Monolayer mit warmer Medium eingehend gewaschen, um nicht adsorbierte Viren zu entfernen. Die Gesamt-DNA wurde nach der Methode von Challberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9094 (1986) entweder 1 Stunde oder 16 Stunden nach der Infektion gewonnen. Die gereinigte DNA wurde mit Hilfe der UV-Absorption bei 260 nm quantitativ bestimmt. Die DNA wurde verdünnt und in 100 mM Natriumhydroxid 30 Minuten lang bei Raumtemperatur denaturiert. Ein gleiches Volumen von 12 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M Natriumchlorid + 0,015 M Natriumcitrat) wurde zugesetzt und die DNA unter Einsatz einer Slot-Blot-Apparatur (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) auf ein Nitrocellulose-Filter aufgetragen. Die Filter wurden ofengetrocknet und die DNA an mittels Random Primer Labeling hergestellte 32P-markierte HSV-1-spezifische Sonden hybridisiert. Die Sonden umfassten entweder pSHZ, welches da ICPO-Gen enthält (Nabel et al., 1988, supra) oder pRB3441, welches das Gen für Vmw65 enthält (McKnight et al., Cancer Cells, 4: 163 (1986)). Eine HSV-1-Mutante, welche im ICP8-Gen eine große Deletion aufweist und daher zur Replikation ihrer DNA nicht befähigt ist (Gao et al., J. Virol., 63: 5258 (1989)), wurde in diesen Untersuchungen als negative Kontrolle eingesetzt. In mit einem Wildtyp-Virus infizierten Zellen wurde die Virus-DNA in hohem Grade repliziert. Im Gegensatz dazu konnte in d102-infizierten Zellen kein Anzeichen für eine Replikation von viraler DNA nachgewiesen werden. Alle fünf ICP27-Mutanten waren in der Lage, während des Verlaufs der Infektion virale DNA zu replizieren.
  • Um diese Ergebnisse quantitativ zu erfassen, wurde die Menge an Radioaktivität, die an jedem Slot hybridisiert wurde, mit Hilfe eines Scintillation Counters gemessen und die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Auf Grundlage dieser Ergebnisse ließen sich die Mutanten bezüglich der DNA-Replikation in zwei Phänotyp-Klassen unterteilen. Die erste Klasse, welche die Mutanten d27-1, n59R, n263R und n406R enthielt, zeigte bei der Amplifikation der Virus-DNA einen partiellen Defekt. (6 bis 38% des Wildtyp-Wertes). Die nur aus n504R bestehende zweite Klasse zeigte einen Wildtyp-Phänotyp für die Replikation der Virus-DNA. Es ist wichtig, zu bemerken, dass in diesen Untersuchungen der Grad der Akkumulation der Virus-DNA in infizierten Zellen gemessen wurde, eine Mengenangabe, die sowohl durch die DNA-Syntheserate als auch durch die Stabilität der replizierten DNA ermittelt wurde. TABELLE 2. Replikation der Virus-DNA in mit ICP27-Mutanten infizierten Zellen
    DNA-Amplifikationb in: % der Wildtyp-Amplifikationb in:
    Virus Exp. 1 Exp. 2 Exp. 1 Exp. 2
    KOS 1.1 (Gew.) 80 142 100 100
    d102 0,5 0,4
    d27-1 18 11 23 8
    n59R 15 22 19 15
    n263R 17 9 21 6
    n406 30 23 38 16
    n504 98 121 123 85
    • a Die angegebenen Zahlen sind das Verhältnis der Menge an HSV-1-DNA infizierten Vero-Zellen 16 Stunden nach der Infektion zu der 1 Stunde nach der Infektion vorhandene Menge. Die DNA wurde wie oben beschrieben ermittelt und quantitativ bestimmt. Die Sonde in Experiment 1 war pSHZ und die Sonde in Experiment 2 pRB3441.
    • b Die Menge der DNA-Amplifikation durch das Wildtyp-Virus in jedem Experiment wurde auf 100% normalisiert und die anderen Werte sind relativ zu diesem Wert angegeben. Weil d102 während der Infektion eine abnehmende DNA-Menge zeigte, wurde der Prozentwert nicht bestimmt.
  • Muster der viralen Proteinsynthese in mit ICP27-Mutanten infizierten Zellen.
  • Um die Wirkung der Mutationen im ICP27-Gen auf die virale Genexpression zu analysieren, wurde in den mutanten infizierten Zellen die virale Proteinsynthese untersucht. Mock- oder HSV-1-infizierte Vero-Zellen wurden 3, 6, oder 9 Stunden nach der Infektion mit 15 μCi [35S]-Methionin/ml des Mediums markiert. Aus der Zelle wurden die Proteine extrahiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Mit Ausnahme von n406R zeigten die ICP27-Mutanten 3 und 6 Stunden nach der Infektion Proteinsynthese-Muster, die qualitativ ähnlich den Muster in infizierten Zellen des Wildtyp-Virus waren. Es schien, dass mit n406R infizierten Zellen einige Proteine, einschließlich ICP6, ICP8 und der Vorläufer von gB (pgB) fehlten. 9 Stunden nach der Infektion jedoch zeigten die mit allen fünf ICP27-Mutanten infizierten Zellen im Vergleich mit dem Wildtyp-Virus sowohl quantitative als auch qualitative Unterschiede bei der viralen Proteinsynthese. Bezüglich der viralen Proteinsynthese 9 Stunden nach der Infektion ließen sich die fünf Mutanten in vier Phänotyp-Klassen unterteilen. Was ihre Muster der Proteinsynthese anbelangt, waren die Mutanten d27-1 und n59R reproduzierbar nicht voneinander zu unterscheiden. Beide dieser Mutanten exprimierten in hohem Grade die meisten β-Proteine, sie exprimierten jedoch 9 Stunden nach der Infektion geringere Mengen (relativ zu den Wildtyp-Mengen) an einigen γ-1-Proteinen, einschließlich von ICP5 und ICP25. Die Mutante n263R zeigte 9 Stunden nach der Infektion ein Proteinsynthese-Muster, das dem von d27-1 und n59R sehr ähnlich war, jedoch exprimierte diese Mutante geringfügig größere Mengen an einigen γ-1-Proteinen. Die Mutante n406R hatte bezüglich der viralen Proteinsynthese insofern einen ungewöhnlichen Phänotyp, als sehr verringerte Mengen vieler viraler Proteine unter Einschluss von ICP6, ICP8 und pgB in den mit dieser Mutante infizierten Zellen auftraten. Diese Wirkung erstreckte sich insofern nicht auf alle viralen Proteine, als 9 Stunden nach der Infektion im Vergleich mit d27-1-infizierten Zellen größere Mengen der γ-l-Proteine ICP5 und ICP25 zu beobachten waren. Die Mutante n504R exprimierte große Mengen an β- und γ-1-Proteinen wie z. B. ICP1/2 und ICP15.
  • In mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen war 9 Stunden nach der Injektion die Expression der α-Proteine ICP4 und ICP27 merklich verringert. Dies war nicht der Fall, wenn die Zellen mit irgendeiner der fünf ICP27-Mutanten infiziert wurden. Darüber hinaus konnten die n504R-infizierten Zellen die Expression des ICP27-Polypeptids nicht ausschalten (weil keine der anderen Mutanten ein Protein codiert, das zusammen mit WT-ICP27 migriert, dies war der einzige Fall, in welchem ein direkter Vergleich der ICP27-Proteinsyntheseraten möglich war). Mit Ausnahme von n406R zeigten die ICP27-Mutanten auch einen Defekt in ihrer Fähigkeit, die Expression verschiedener β-Proteine, einschließlich ICP6 und ICP8, negativ zu modulieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ICP27 einen negativen regulatorischen Effekt auf die Expression von α- und β-Genen ausübt.
  • Um zu ermitteln, ob der in mit mutanten Viren infizierten Zellen beobachtete Defekt bei der viralen Proteinsynthese durch die Expression der Wildtyp-Form des Proteins korrigiert werden könnte, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Vero- oder V27-Zellen wurden parallel mit einem Wildtyp-Virus oder mit einer der Mutanten infiziert. Die Proteine der infizierten Zellen wurden 15 Stunden nach der Infektion mit [35S]-Methionin markiert und daraufhin mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Das 15 Stunden nach der Infektion in den Vero-Zellen beobachtete Muster der Proteinexpression von jeder Mutante war ähnlich dem oben für 9 Stunden nach der Injektion beschriebenen. Wurden jedoch die V27-Zellen mit jeder der Mutanten infiziert, trat ein Proteinsynthese-Muster auf, das mit dem des Wildtyp-Virus mehr Ähnlichkeit hatte.
  • Akkumulation von viraler mRNA in mit einem ICP27-mutanten Virus infizierten Zellen.
  • Die in mutanten infizierten Zellen exprimierten Dauerspiegel an viralen mRNAs wurden mit Hilfe der Northern-Blot-Hybridisierung analysiert. Die RNA wurde aus den mit jeder Mutante infizierten Zellen isoliert, indem die Zellen mit Nonidet P-40 behandelt wurden, und dann wurde sie mit Phenol-Chloroform extrahiert. Sie wurde in Ethanol gefällt (Klessig et al., J. Virol., 16: 1850 (1975)), in Puffer suspendiert, mit RNase-freier DNase I verdaut (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.), mit Phenol-Chloroform extrahiert und dann erneut in Ethanol gefällt. 10 μg von jeder RNA-Probe wurden einer Elektrophorese durch denaturierende Formaldehyd-Agarose-Gele unterzogen (Sambrook et al., supra). Nach der Elektrophorese wurde die RNA auf GeneScreen-Filter (DuPont, NEN Research Products, Boston, MA) transferiert. Sodann wurde eine Hybridisierung der RNA an 32P-markierte Sonden durchgeführt (Rice et al., J. Virol., 49: 35 (1984)). Die Sonden umfassten pBH27, welches das ICP27-Gen codiert (Rice et al., supra), pK1-2, welches das ICP4-Gen codiert (DeLuca et al., Nucl. Acids Res., 15, 3391 (1987)) und pEcoRI-BamHI-I-I, welches das gC-Gen codiert (Frink et al., J. Virol., 45: 634 (1983). Die Autoradiogramme wurden densitometrisch in einem Ultrascan-Laser-Densitometer und einem Online-Integrator (LKB Instruments, Inc., Rockville, Md.) analysiert.
  • Speziell wurde die RNA aus Velo-Zellen extrahiert, welche mock-infiziert, mit einem Wildtyp-Virus oder mit den Mutanten n59R, d27-1 oder n504R infiziert waren. Die Infektionen mit dem Wildtyp-Virus erfolgten in Gegenwart oder Abwesenheit von PAA, einem spezifischen Inhibitor der viralen DNA-Synthese des HSV-1. Aus den infizierten Zellen wurde 9 Stunden nach der Infektion die Cytoplasma-RNA isoliert. Nach einem Northern-Blot-Transfer wurden die Filter mit radioaktiv markierten DNAs sondiert, welche spezifisch für ICP27-, ICP4- oder gC-mRNA waren. In den mock- oder d27-1-infizierten Zellen befand sich keine ICP27-spezifische mRNA. Die aus n59R- oder n504R-infizierten Zellen isolierte RNA enthielt zwei- bis dreimal mehr 2,0 kb-ICP27-mRNA als die aus den mit einem Wildtyp-Virus infizierten Zellen erhaltene RNA. Dieses Ergebnis stimmte qualitativ mit den erhöhten Werten für die ICP27-Proteinsynthese überein, die in n504R-infizierten Zellen 9 Stunden nach der Infektion beobachtet wurden.
  • Im Gegensatz zu den mit der ICP27-spezifischen mRNA erhaltenen Ergebnissen wurden in den d27-1-, n59R- und mit einem Wildtyp-Virus infizierten Zellen etwa gleiche Mengen an ICP4-mRNA beobachtet, während n504R-infizierte Zellen ungefähr 1,6-mal mehr ICP4-mRNA akkumulierten als die mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen. Diese Ergebnisse waren etwas unerwartet, weil 9 Stunden nach der Infektion in den von einem Wildtyp-Virus infizierten Zellen wenig oder kein ICP4-Protein zu beobachten war. Die Synthese des ICP4 wurde in mit den ICP27-Mutanten infizierten Zellen leicht nachgewiesen. Daher gibt das Ausmaß der Expression von ICP4 9 Stunden nach der Infektion nicht den Spiegel an cytoplasmatischen ICP4-Transkripten wieder. Dies legt nahe, dass ICP4-mRNA in den mit den ICP27-Mutanten infizierten Zellen effizienter translatiert wird als in mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen.
  • In mit den Mutanten infizierten Zellen wurde die Akkumulation von mRNA untersucht, die für das γ-2-Gen spezifisch ist, welches gC codiert. Die Hemmung der viralen DNA-Replikation durch PAA senkte drastisch die Menge an gC-mRNA, welche in den mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen akkumulierte (gC-mRNA konnte nach längerer Exposition des Autoradiogramms in Spur 1' nachgewiesen werden). Weder d27-1- noch n59R- noch n504R-infizierte Zellen exprimierten nachweisbare Mengen von gC-mRNA. Dies ist im Falle der Mutante n504R von besonderem Interesse, welche während der Infektion DNA-WT-Spiegel replizierte. Die Expression von γ-2-Genen erfordert die Replikation von sowohl der Virus-DNA als auch eines vom Virus codierten transagierenden Faktors, nämlich ICP27.
  • KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN IM ICP8-GEN DES HSV-1
  • Isolierung der ICP8 exprimierenden Zelllinien. Die Vero-Zellen wurden mit dem Plasmid pSG18-SacI (Lee et al., J. Virol., 46: 909 (1983); Quinlan et al., Mol. Cell. Biol. 5: 957 (1985)) oder p8B-S (Gao et al., Virology, 163: 319 (1988)) und pSVneo (Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1988) im Wesentlichen wie bei DeLuca et al. (DeLuca et al., J. Virol., 56: 558 (1985)) beschrieben transformiert. Nach dem Anwachsen in einem das Antibiotikum G418 enthaltendem Medium wurden 21 medikamentenresistente Kolonien isoliert, amplifiziert und auf ihre Fähigkeit hin gescreent, das Wachstum der ICP8-Mutanten ts13, ts18 und tsHA1 (Conley et al., J. Virol., 37: 413 (1981); Holland et al., J. Virol., 49: 947 (1984) zu komplementieren. Bei der nicht-permissiven Temperatur bildeten diese ts-Mutanten in 7 von 21 Zelllinien, die von Kulturen stammten, welche das ICP8-Gen erhalten hatten, Plaques aber sie bildeten keine Plaques in Neor-Zellen, die von Zellen stammten, welche mit pSV2neo allein transfiziert wurden. Die Zelllinien B10 und S2, die von Zellen stammten, welche mit den Plasmiden p8B-S bzw. pSG18-SacI transfiziert worden waren, erzielten die höchsten Komplementierungsgrade und wurden für eine weitere Untersuchung ausgewählt (Tabelle 3). Das Wildtyp-Virus bildete bei beiden Temperaturen sowohl in Neor-Zellen als auch in B10- und S2-Zellen Plaques. Die Virusmutanten ts13, ts18 und tsHA1 bildeten nur bei 33,5°C in Neor-Zellen effektiv Plaques, bildeten aber die Plaques mit einer Effizienz, die gleich der des Wildtyps bei beiden Temperaturen in B10- und S2-Zellen war. Es wurde eine Southern-Blot-Hybridisierung durchgeführt, um in diesen Zelllinien die Anzahl der Kopien des ICP8-Gens zu ermitteln und die B10- und S2-Zellen enthielten ungefähr 1 bzw. 10 Kopien pro haploidem Genom TABELLE 3. Komplementierung der ICP8-Mutanten durch B10- und S2-Zellena
    Titer (109 PFU/ml)b
    Virus B10 S2 Neor
    33,5°C 39°C 33,5°C 39°C 33,5°C 39°C
    KOS 1.1 1,7 1,7 0,7 2,0 1,3 1,8
    ts13 4,3 3,1 2,3 4,0 1,0 < 0,001
    ts18 3,0 3,2 2,3 2,7 1,7 < 0,001
    tsHA1 2,3 3,7 3,7 1,7 2,4 < 0,001
    • a Die Kulturen der B10-, S2- und Neor-Zellen wurden mit jedem Virus infiziert und bei 33,5°C oder 39°C inkubiert.
    • b Die Anzahl der Plaques wurde 2 bis 3 Tage lang gezählt.
  • Plasmide.
  • Die Plasmide p8-S, pSV8 und pm1 sowie das System der Nummerierung ihrer Nucleotide sind beschrieben (Gao et al., Virology, 163: 319 (1988); Su et al., J. Virol., 61: 615 (1987)). Das Plasmid p8B-S wurde konstruiert, indem ein 5,9 kb BamHI-SacI-Fragment (Map-Einheiten 0,374 bis 0,411) einschließlich des ICP8-Promotors in pUC18 kloniert wurden. Das Plasmid pSV8 wurde konstruiert, indem ein 5,5 kb SmaI-SacI-Fragment (Map-Einheiten 0,374 bis 0,409) downstream zum Early-Promotor des SV 40 insertiert wurde. Das Plasmid pm1 wurde von dem Plasmid pSN8 abgeleitet, indem die Codons 499 und 502 des ICP8-Gens so abgeändert wurden, dass sie eher Cystein als Glycin codieren. Die in dieser Untersuchung eingesetzten mutanten ICP8-Plasmide stammten von pICP8 oder pSPICP8, in welchen ein 5,5 kb SmaI-SacI-Fragment (Map-Einheiten 0,374 bis 0,409) in pUC19 bzw. pSP64 insertiert wurde. Die Plasmide pn10 und pn2 wurden erzeugt, indem das Plasmid spICP8 linearisiert wurde (was durch partiellen Verdau mit SmaI erreicht wurde) und nachfolgend ein XbaI-Linker von 14 Nucleotiden (Gao et al., 1988, supra; New England BioLabs, Inc., Beverly, MA), welcher bei den Nucleotiden 4084 bzw. 3695 Stop-Codons in allen drei Leserastern enthielt, insertiert wurde. Daher codiert pn10 die ersten 1.160 Aminosäurereste und pn2 codiert die ersten 1.029 Aminosäurereste des ICP8 sowie 4 zusätzliche Aminosäuren, die von der XbaI-Linker-Sequenz codiert werden. Siehe 5. Das Plasmid pd301 wurde durch eine interne im Leseraster liegende Deletion des NotI-Fragments mit 2.001 Basenpaaren (bp) (Nucleotide 1395 bis 3396) erzeugt. Die Plasmide pd101 und pd102 wurden wie folgt konstruiert: das Plasmid pSPICP8 wurde durch partiellen Verdau mit SmaI linearisiert und daran ein BglII-Linker aus 12 Nucleotiden (Gao et al., 1988, supra) ligiert. Eine 1.642-bp-Deletion wurde durch Verdau mit BglII (konvertiert von einer SmaI-Stelle bei Nucleotid 652) und BamHI (Nucleotid 2294) erzeugt, was zu dem Plasmid pd101 führte. Somit fehlen pd101 die Codons für die Reste 17 bis 563, es weist aber eine Insertion von einem Arg-Codon auf, welches von der BglII-Linker-Sequenz codiert wird. Eine Deletion von 1.188 bp wurde durch Verdau mit BglII erzeugt (konvertiert von SmaI bei den Nucleotiden 652 und 1840), um das Plasmid pd102 zu erhalten. Somit fehlen pd102 die Codons für die Reste 17 bis 411 der das ICP8 codierenden Sequenz, es codiert jedoch 3 zusätzliche Aminosäuren, Arg-Ser-Ser, in der BglII-Linker-Sequenz. Beide Plasmide enthalten auch bei dem Nucleotid 4419 downstream zum ICP8-Poly(A)-Signal einen XbaI-Linker von 14 Nucleotiden. Weil es um die Nucleotide 4084 und 1840 andere SmaI-Schnittstellen gibt, wurden sowohl pn10 als auch pn102 sequenziert, um die genauen Stellen der Mutation zu ermitteln. Siehe 5.
  • Konstruktion von mutanten Viren.
  • Um die funktionellen Domänen des ICP8 zu untersuchen, wurden einige unterschiedliche Mutationstypen in die codierende Region des ICP8-Gens eingeführt (12): (i) Nonsense-Mutationen (pn10 und pn2); (ii) interne Deletionen (pd301, pd101 und pd102); und (iii) eine ortsspezifische Mutation (pm1) (Gao et al., Virology, 163: 319 (1988)). Um nach dem Marker-Transfer das Screening nach rekombinanten Viren zu erleichtern, wurde auf ähnliche Weise wie oben für die Erzeugung von ICP27-Mutanten beschrieben ein mutantes Virus konstruiert, das ein in die ICP8 codierende Region insertiertes lacZ-Gen enthielt. Dieses als HD-2 bezeichnete rekombinante Virus bildete in den ICP8-exprimierenden Zelllinien in Gegenwart von X-Gal blaue Plaques, bildete aber in Vero-Zellen überhaupt keine Plaques. DNA, welche die verschiedenen Mutantenformen des ICP8 codiert, wurde in diesen elterlichen Stamm rekombiniert und aus den weißen Plaques die erhaltene Nachkommenschaft isoliert. Weiße Plaques tauchten mit Häufigkeiten von 2 bis 39% auf. Die Häufigkeit der weißen Plaques in mit HD-2-DNA und pd101 oder pd102 transfizierten Zellen lag nicht über dem Hintergrundrauschen. Dies war wahrscheinlich auf die beschränkte Menge an viralen Sequenzen zurückzuführen, die für eine Rekombination zwischen pd101- oder pd102- und HD-2-DNA zur Verfügung standen.
  • Es wurden die folgenden Analysenmethoden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die rekombinanten Viren im ICP8-Gen die passende Mutation aufwiesen. Die Virus-DNA wurde isoliert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und mit Hilfe einer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Eine Southern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um das Vorkommen von Mutationen in der Virus-DNA zu bestätigen und um die Reinheit der mutanten Viruspopulationen zu ermitteln. Beispielsweise wurde das 8,2 kb-BarHI-Fragment der Wildtyp-DNA in n2-DNA mit BamHI und XbaI wegen des Vorkommens des XbaI-Linkers in ein 6,8 kb- und ein 1,4 kb-Fragment aufgetrennt. Die Verbindungsregion von BamHI G und V (2,3 kb) wurde durch das lacZ-Gen in HD-2 ersetzt; daher erzeugte der Verdau von HD-2-DNA mit BamHI und XbaI ein 12,6 bp Fragment. Ein Vergleich des mit KpnI verdauten Wildtyps, des HD-2 und der n2-DNAs ergab, dass der Wildtyp und die n2-DNAs einander ähnelten, sich aber wegen der lacI-Insertion von dem der HD-2-DNA unterschieden.
  • Die experimentellen Details für die Isolierung von Viren, die Mutationen im ICP8-Gen umfassen, werden nun im Folgenden beschrieben.
  • Das mutante Virus HD-2, welches eine lacZ-Insertion im ICP8-Gen enthält, wurde wie folgt isoliert. Nach der Deletion eines 780 bp-XhoI-Fragments von pICP8 wurde dieses Plasmid kurz mit Bal 31 verdaut, an die Enden der DNA ein BglII-Linker angefügt und das lacZ-Gen (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) insertiert. Das lacZ-Gen von pMC1871 enthält keinen Transkriptions-Promotor und es fehlen auch die ersten nicht essentiellen aminoendständigen Codons. Die Mischung aus ICP8:lacZ-Plasmiden wurde in B10-Zellen zusammen mit viraler Wildtyp-DNA transfiziert. Die Virus-Nachkommenschaft wurde isoliert und auf B10- oder S2-Zellen plattiert und in Medium 199 und in 1% Kälberserum, das 0,1% humanes Immunserum enthielt, 1 bis 2 Tage lang bei 37°C inkubiert. Um β-Galactosidase-Aktivität nachzuweisen, wurde das Medium dann zu Medium 199 + 1,0% Agarose, welches 400 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactopyranosid (X-Gal) enthielt verändert und die Inkubation über einen Zeitraum von 8 bis 16 Stunden fortgesetzt. Die rekombinanten Viren wurden als blaue Plaques identifiziert und mit einer Häufigkeit von ungefähr 0,1 bis 0,5% isoliert. Ein mutantes Isolat mit der Bezeichnung HD-2 wurde Plaque-gereinigt.
  • HD-2 diente als elterliches Virus für die Erzeugung von allen mutanten Viren in dieser Studie, ausgenommen für d301. Nach Cotransfektion von infektiöser HD-2-DNA mit Plasmiden, welche ein mutantes ICP8-Gen codierten, wurden aus den in Gegenwart von X-Gal vermehrten weißen Plaques rekombinante Viren isoliert.
  • Die Konstruktion des mutanten Virus d301 erfolgte durch Cotransfektion von B10-Zellen mit infektiöser viraler Wildtyp-DNA und dem Plasmid d301, in welchem ein NotI-Fragment von 2.001 bp aus der ICP8 codierenden Sequenz deletiert war (12). Die Virus- Nachkommenschaft aus dieser Transfektion wurde auf ihre Replikation in B10-Zellen aber nicht in Vero-Zellen getestet.
  • Wachstumseigenschaften der mutanten Viren.
  • Jedes der in 12 dargestellten mutanten Viren war unfähig, in Vero-Zellen zu replizieren und benötigte eine Komplementierung durch die Wildtyp-Kopie des in B10- oder S2-Zellen vorkommenden ICP8-Gens. Jedes der mutanten Viren replizierte bis zu einem Niveau, das dem Niveau des Wildtyps in diesen ICP8 exprimierenden Zelllinien ähnelte. Die Größen der von den mutanten Viren gebildeten Plaques waren geringfügig kleiner als die, welche vom Wildtyp-Virus gebildet wurden. Ferner behielten in allen Fällen die mutanten Viren ihren mutanten Phänotyp bei, wenn sie entweder in B10- oder S2-Zellen vermehrt wurden.
  • Expression des ICP8 durch mutante Viren.
  • Die Virus-Protein-Synthese wurde wie oben beschrieben in mutanten infizierten Zellen durch Western-Blotting untersucht. Das polyklonale Serum 3-83 von Kaninchen (Knipe et al., J. Virol., 61:276 (1987)) oder der monoklonale Antikörper 10E-3 der Maus (Rose et al., J. Gen. Virol., 67: 1315 (1986)) wurden verwendet, um ICP8 nachzuweisen. Die Größen der von den mutanten Viren spezifizierten ICP8-Polypeptide stimmten mit den vorhergesagten Größen überein. Der monoklonale Antikörper 10E-3 der Maus reagierte mit den von den Mutanten pm1, d101, d102 und d301 exprimierten ICP8-Polypeptiden, nicht aber mit den von n10 und n2 exprimierten (Tabelle 4), was nahe legt, dass dieser Antikörper mit einem zumindest teilweise in den carboxylendständigen 36 Aminosäuren des ICP8 enthaltenen Epitop reagiert. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass d101, d102 und d301 in-frame-Deletionen enthalten. TABELLE 4. Löslichkeit des von Virus-Mutanten codierten ICP8
    % an ICP8
    Virus Überstanda Pellet Antikörperb
    KOS 1.1 81 19 10E-3
    pm1 12 88 10E-3
    d101 22 78 10E-3
    d102 33 77 10E-3
    d301 42 58 10E-3
    KOS 1.1 77 23 3-83
    n10 92 8 3-83
    n2 10 90 3-83
    • a Der Überstand- und die Pellet-Fraktionen wurden als die Proben definiert, welche durch Zentrifugation nach Behandlung mit DNase 1 erhalten wurden (Knipe et al., 1986, J.Virol. 44: 736).
    • b Der für die Western-Blots zur Sichtbarmachung des ICP8 eingesetzte Antikörper war der polyklonale Antikörper 3-83 von Kaninchen (Knipe et al., 1987, J. Virol. 61: 276) oder der monoklonale Antikörper 10E-3 der Maus (Rose et al., 1986, J. Gen. Virol. 67: 1315). Die Negative der Farbreaktionen der Western-Blots wurden mit einem Densitometer gescannt.
  • Virus-DNA-Replikation in mit mutanten Viren infizierten Zellen.
  • Zur Untersuchung der DNA-Replikation in Zellen, die mit jedem mutanten Virus unter nicht-permissiven Bedingungen infiziert worden waren, wurden Vero-Zellen mit jedem Virus infiziert und den Kulturen 6 und 10 Stunden nach der Infektion [3H]-Thymidin zugesetzt. Die Zellen wurden geerntet und die DNA isoliert. Jede DNA-Probe wurde mit BamHI und XhoI verdaut und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Jede der Mutanten war unfähig, Virus-DNA zu replizieren, so wie dis beim Wildtyp-Virus der Fall war, wenn er in Gegenwart von Phosphonoessigsäure gezüchtet wurde, einer Verbindung, die vorzugsweise die DNA-Polymerase des HSV-1 hemmt.
  • Es folgen nun die experimentellen Details für die Analyse der Virus-DNA.
  • (i) Gewinnung der DNA.
  • Die Plasmid-DNA und die Virus-DNAs wurden wie von Knipe et al., J. Virol., 29: 698 (1979) beschrieben gewonnen. Die für die Southern-Blot-Analyse verwendete Virus-DNA wurde wie folgt gereinigt. Die infizierten Zellen wurden zu einem späten Zeitpunkt nach der Infektion eingefroren, aufgetaut und dann 30 Sekunden lang bei 0° bis 4°C beschallt. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 480 g entfernt. Der erhaltene Überstand wurde einer Zentrifugation bei 23.500 g unterzogen. Die Pellets wurden mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (24:24:1) dreimal extrahiert. Nach der Ethanol-Fällung wurde die DNA in einem Tris-EDTA-Puffer gelöst.
  • (ii) Messung der Virus-DNA-Synthese.
  • Die Zellen wurden mit dem passenden Virus infiziert, 6 bis 10 Stunden lang mit 20 μCi [3H]-Thymidin pro ml markiert und die gesamte DNA nach der Methode von Challberg (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9094) isoliert. Die DNA wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 1,0 M Natriumsalicylat für die Fluorographie behandelt (Chamberlain, Anal. Biochem., 98: 132 (1979)).
  • DNA-Bindungseigenschaften von mutantem ICP8.
  • Vor der Untersuchung der DNA-Bindungseigenschaften der mutanten ICP8-Moleküle, wurde die Löslichkeit der einzelnen Polypeptide untersucht (Tabelle 5) und es wurde gefunden, dass sie signifikant variiert. Die DNA-Bindungseigenschaften der löslichen mutanten ICP8-Moleküle wurden sodann mittels Chromatographie durch einzelsträngige DNA-Cellulose untersucht. Die einzelsträngige DNA-Cellulose-Chromatographie der Extrakte von infizierten Zellen wurde wie beschrieben durchgeführt (Knipe et al., J. Virol., 44: 736 (1981), mit der Ausnahme, dass die Zellen während der Stunden 4 bis 6 nach der Infektion mit [35S]-Methionin markiert wurden. Die Proteine wurden auf Säulen aufgetragen, welche einzelsträngige DNA-Cellulose enthielten und wurden in steigenden Konzentrationen von NaCl eluiert. Das meiste ICP8, das in mit dem Wildtyp-Virus infizierten Zellen exprimiert wurde, wurde an die Säule gebunden, die dann bei einer NaCl-Konzentration von 0,5 M eluiert wurde. Im Gegensatz dazu wurde sehr wenig des ICP8, das in mit pm1 infizierten Zellen exprimiert wurde, an die Säule gebunden. Die Menge an ICP8, das gebunden und dann aus der Säule eluiert wurde, wurde ermittelt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Das in den mit n10 infizierten Zellen exprimierte ICP8 wurde genauso effizient und fest wie das Wildtyp-ICP8 an einzelsträngige DNA-Cellulose gebunden. Der niedrigste Grad der Bindung (21%) wurde bei ICP8 beobachtet, das in mit d301 infizierten Zellen exprimiert wurde. Das ICP8, das von den Mutanten d101 und d102 mit einer aminoendständigen Deletion codiert wurde, wurde an die DNA-Cellulose mit Graden von 72% bzw. 75% gebunden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann geschlossen werden, dass der Abschnitt des ICP8 von den Aminosäureresten 564 bis 1160 eine für die DNA-Bindung benötigte Region enthält. TABELLE 5. Fähigkeit von mutantem ICP8, sich an einzelsträngige DNA-Cellulose zu binden.
    % an ICP8
    Eluiert bei der angegebenen NaCl-Konzentration
    Virus durchgeflossen und ausgewaschen 0,3 M 0,5 M 1,0 M 4,0 M Gebunden
    KOS 1.1 2 23 67 8 < 1 98
    pm1 69 7 20 4 < 1 31
    n10 2 13 77 6 < 1 98
    d102 25 26 22 20 6 75
    d101a 28 47 22 5 < 1 72
    d301a 79 6 13 2 < 1 21
    n2a 54 1 39 3 < 1 46
    • a Daten, welche aus densitometrischen Messungen der Negative erhalten wurden, die von den Western Blots gewonnen wurden.
  • Lokalisierung der von Virus-Mutanten codierten ICP8-Moleküle im Kern.
  • Wildtyp-ICP8 ist in infizierten Zellen effizient im Kern lokalisiert (Fenwick et al., J. Gen. Virol., 39: 519 (1978); Knipe et al., J. Virol., 43: 314 (1982); Quinlan et al., Mol. Cell. Biol. 3: 315 (1983); Quinlan et al., Mol. Cell. Biol. 5: 957 (1985)). Die zelluläre Verteilung von Wildtyp- und mutanten ICP8-Molekülen wurde mittels indirekter Immunofluoreszenz untersucht, welche nach Quinlan et al., Mol. Cell. Biol., 3: 315 (1983) durchgeführt wurde, indem eine 1:10 Verdünnung von monoklonalen 793 Anti-ICP8-Antikörpern und eine 1:100 Verdünnung von Rhodamin-konjugierten Anti-Maus-Antikörpern der Ziege für alle mutanten Viren außer n2 eingesetzt wurden. Für den Nachweis von n2-ICP8 wurden eine 1:30 Verdünnung von polyklonalem Anti-ICSP-11/12-Serum (Powell et al., J. Virol., 39: 894 (1981) und eine 1:200 Verdünnung von Fluorescein-konjugiertem Anti-Kaninchen-Immunglobulin der Ziege eingesetzt. Das von n10-codierte ICP8-Polypeptid, welchem die letzten 36 Aminosäuren vom Carboxylende her fehlen und welches so effizient an eine DNA gebunden wird wie Wildtyp-ICP8 war nicht im Kern lokalisiert, eher blieb es im Cytoplasma der infizierten Zellen. Im Gegensatz dazu wurde das pm1-ICP8-Polypeptid, welches wenig an DNA gebunden wurde, vorwiegend im Kern gefunden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass das (die) Signal(e) von ICP8 für eine Lokalisierung im Kern getrennt von der DNA-Bindungs-Funktion ist (sind).
  • Das von d101 codierte ICP8 war im Kern lokalisiert und war auch in der Lage, sich an DNA zu binden (Tabelle 5), dieses Virus war jedoch nicht in der Lage, Virus-DNA zu replizieren. Der Phänotyp dieser Mutante liefert den genetischen Beweis, dass das ICP8 eine andere Funktion im Kern hat als sich an DNA zu binden.
  • Eine Zusammenfassung der phänotypischen Eigenschaften der ICP8-Mutanten wird unten in Tabelle 6 wiedergegeben. TABELLE 6. Phänotypische Klassen von Viren mit ICP8-Mutanten
    Gruppe Mutanten Wachstum auf Vero-Zellen Bindung an ssDNAa Lokalisierungb
    A n10, d102 – + C
    B pm1 – – N
    d301
    C n1 – + C
    D d101 - - N
    • a +, Bindung > 50%
    • b Moleküle der ICP8-Mutanten überwiegend im Cytoplasma (C) oder Kern (N) lokalisiert, bestimmt über indirekte Immunofluoreszenz.
  • Replikations-defiziente MUTANTEN DES HSV-1 INDUZIEREN ZELLULÄRE IMMUNITÄT UND SCHÜTZEN GEGEN TÖDLICHE INFEKTION
  • Methoden
  • In den unten beschriebenen Beispielen wurden die folgenden Materialien und Methoden eingesetzt.
  • Mäuse.
  • Weibliche Balb/c-Mäuse wurden von Taconic Laboratory, Germantown, NY gekauft und in einem Alter zwischen 6 und 12 Wochen eingesetzt. Den Mäusen wurden intraperitoneal 0,5 ml PBS oder 0,5 ml in PBS suspendierte Viren injiziert.
  • Viren.
  • Der HSV-1-Wildtyp-Stamm KOS 1.1 und der Stamm mP wurden vermehrt und wie beschrieben (Quinlan et al., Mol. Cell. Biol., 5: 957 (1985)) auf Vero-Zellen untersucht. Ein Virus mit einer Mutation in dem ICP8 codierenden Gen und der Bezeichnung d301 wurde wie von Gao et al., supra beschrieben erzeugt. Ein Virus mit einer Mutation in dem ICP27-Gen und mit der Bezeichnung n504R wurde wie unten beschrieben erzeugt. Ein Virus (d120), das ein mutiertes ICP4-Gen codiert, wurde wie von DeLuca et al., J. Virol., 56:558 (1985) beschrieben erzeugt. VSV wurde wie von Horn et al., J Virol. 63: 4157 (1989) beschrieben vermehrt. Alle Virus-Stocks wurden bei –70°C aufbewahrt und in jedem Experiment ein frisch aufgetautes Aliquot von jedem Stock eingesetzt. Die Präparate von UV-bestrahltem HSV-1 und VSV wurden erhalten, indem jedes Virus bei 0°C unter Einsatz einer 30 W UV-Quelle (G30T8; General Electric) 45 Minuten lang bei einem Abstand von 5 cm bestrahlt wurde. Mit Psoralen inaktivierte Virus-Präparate wurden von Lee Biomolecular (San Diego, CA) gewonnen.
  • Assays für T-Zell-Aktivität.
  • Immune Milzzellen wurden von Mäusen erhalten, welche 3 bis 4 Wochen vorher mit 106 PFU Wildtyp-HDV-1 oder mit Virus-Mutanten mit Mutationen in den Genen für entweder ICP4 oder ICP27 oder ICP8 intraperitoneal inokuliert worden waren. Die Mäuse, welche mit PBS inokuliert wurden, dienten als negative Kontrollen. Die von solchen Mäusen erhaltenen Milzzellen wurden mittels Ficoll-Hypaque-Gradientensedimentation von Erythrocyten und polymorphkernigen Leukocyten befreit. Durch Inkubation der Splenocyten mit für B-Lymphocyten spezifischen Antikörpern über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 4°C wurden die B-Lymphocyten aus der Mischung entfernt. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Ziegen-Ratten-Antikörper-beschichteten Latex-Polymerkügelchen mit magnetischem Kern (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) inkubiert. Die J11-d2-positiven Zellen, die an die magnetischen Kügelchen gebunden wurden, wurden sodann mit Hilfe eines Magneten (BioMag Separator, Advanced Magbetics) entfernt. Die restlichen Zellen in der Mischung, die aus > 95% T-Zellen bestanden, wurden gewaschen und bei einer Konzentration von 105 Zellen/Loch in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml in 96 Loch Round-Bottom-Kulturplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) inkubiert. Die Proben der Zellen wurden vierfach plattiert. Die Zellen, welche darauf ansprachen, wurden mit UV-bestrahltem Wildtyp-HSV-1 stimuliert. Parallel dazu wurden Kontrollzellen gewonnen, denen kein Virus zugesetzt wurde. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (Hazelton) inkubiert und mit 5% Kalbsserum (Hyclone Labs; das Serum war bei 56°C über einen Zeitraum von 1 Stunde inaktiviert worden), 100 E/ml Penicillin (Gibco), 100 E/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat (Gibco), 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (Gibco), 10–4 mM 2-Mercaptoethanol (Sigma) und 2 mM Glutamin (Gibco) supplementiert. Die Zellen wurden 3 Tage lang in Gegenwart von 10% CO2 bei 37°C inkubiert. Es wurde [3H]-Thymidin (New England Nuclear) in einer Konzentration von 1 μCi/Loch binnen 6 Stunden zugesetzt und die Zellen wurden mit Hilfe eines Skratron Cell Harvesters geerntet. Die Menge an Radioaktivität in jeder Probe wurde mit Hilfe eines Scintillation Counters (Beta Trac 6895; TM Analytic) bestimmt
  • Antikörper-Assays.
  • Die aus infizierten Mäusen erhaltenen Serumproben wurden unter Einsatz eines ELISA auf das Vorkommen von HSV-1-spezifischen Antikörpern hin untersucht. Die verwendete Vorschrift war ähnlich der von Kahlon et al., J. Inf. Dis., 158: 925 (1988) beschriebenen, die an murines Serum angepasst ist. Die Mikrotiter-Platten (Linbro/Titertek) wurden mit 0,1 ml einer 1:50 Verdünnung von 107 PFU von über Nacht in PBS suspendiertem HSV-1 behandelt. Das Serum, das von Mäusen erhalten wurde, die wie oben beschrieben mit jedem Virus immunisiert worden waren, wurde durch retroorbitale Blutentnahme an den Mäusen erhalten. Die mit HSV-1 beschichteten Mikroplatten wurden dreimal gewaschen und mit 100 μl einer 1:100 Verdünnung des Serums gefolgt von einer 1:3 Verdünnung des gleichen Serums über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikroplatten wurden erneut gewaschen und mit Anti-Maus-IgG2 der Ziege/alkalischer Phosphatase in einer 1:250 Verdünnung (Southern Biotechnology) 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. 30 Minuten nach Zugabe von 1 mg/ml des Substrats für die alkalische Phosphatase (Sigma 104) wurde die Reaktion durch Zugabe von 75 μl 3 N NaOH gestoppt. Die Ergebnisse des Experiments wurden mit Hilfe eines ELISA-Readers bei 405 nm erhalten. Das gepoolte Serum aus den mit HSV-1 immunisierten Mäusen diente als positive Kontrolle und das gepoolte Naivserum der Maus diente als negative Kontrolle. Die Mausseren wurden einzeln durchlaufen gelassen und die Daten sind als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts angegeben.
  • Ergebnisse
  • Verwendung von replikations-defizienten Viren; fehlende Morbidität.
  • Um zu untersuchen, ob replikations-defiziente Viren (d.h. solche, die in den entweder ICP8 oder ICP27 codierenden Genen Mutationen enthalten) tödlich waren, wenn sie in Mäuse inokuliert wurden, wurden die Mäuse entweder mit lebenden Wildtyp-HSV-1 oder den mutanten Viren d301 oder n504 injiziert. Die Mäuse, die von jeder Mutante 108 PFU empfingen schienen gesund und wurden von den Viren nicht angegriffen. Die Würfe, welche 107 PFU vom Wildtyp-HSV-1 empfingen, starben alle.
  • Induktion von HSV-1-spezifischen Antikörpern in mit mutanten Viren inokulierten Mäusen.
  • Um zu ermitteln, ob die mutanten Viren in der Lage waren, in Mäusen HSV-1-spezifische Antikörper zu induzieren, wurde von den Mäusen 2 Wochen nach der Inokulation (8 pro Gruppe, intraperitoneale Verabreichung von 106 PFU d301, d504 und Wildtyp) das Serum erhalten und auf das Vorkommen von HSV-1-spezifischen Antikörpern hin untersucht (gemessen mittels ELISA). Während sich HSV-1-spezifische Antikörper in den Seren dieser Mäuse nachweisen ließen, waren die Konzentrationen an Antikörpern reproduzierbar deutlich niedriger als die in den Seren von Mäusen, welche mit dem Wildtyp-Virus inokuliert wurden. Eine höhere Konzentration an Antikörpern zeigte sich in Seren, die von Mäusen erhalten wurden, welche mit d301 inokuliert worden waren (1). Ähnliche Ergebnisse wurden sowohl zwei als auch vier Wochen nach der Inokulation in einem zweiten unabhängigen Experiment erhalten.
  • Um zu ermitteln, ob die Expression von β-Proteinen des HSV-1 für die Induktion dieser Antikörper notwendig war, wurden Mäuse (8 pro Gruppe) intraperitoneal mit 106 PFU der ICP4-Deletions-Mutante d120, die weder β- noch γ-Proteine exprimiert, inokuliert. Während sich in den Seren dieser Mäuse über den Werten der Kontrolle liegende Konzentrationen von HSV-1-spezifischen Antikörpern nachweisen ließen, lagen diese Werte signifikant unter denen, die in Seren von Mäusen beobachtet wurden, die die auf ähnliche Weise mit den ICP8- oder ICP27-Mutanten inokuliert worden waren (1).
  • Induktion der T-Zellantwort in mit Virus-Mutanten inokulierten Mäusen.
  • Um die Fähigkeit der Mutanten (von denen jede für die Produktion von späten viralen Genprodukten defizient ist) zu untersuchen, eine HSV-1-spezifische Zellantwort zu induzieren, wurde die aus den viralen Antigenen von inokulierten Mäusen erhaltene Antwort der T-Zellen der Milz, in vitro gemessen. Die Mäuse empfingen 106 PFU von entweder dem lebenden Wildtyp-Virus (KOS 1.1) oder den replikations-defizienten Mutanten d120, d301 und n504. Drei Wochen später wurden die von den Mäusen in jeder Gruppe erhaltenen T-Zellen in vitro in Gegenwart des UV-bestrahlten HSV-Stammes mP (1 PFU/Zelle) inkubiert. Für die Kontrolle der Wirkung einer unspezifischen T-Zell-Stimulierung wurde die T-Zellantwort auf ein nicht verwandtes Virus, VSV (1 PFU/Zelle), ebenfalls ausgewertet. T-Zellen aus der Milz von mit VSV immunisierten Mäusen vermehrten sich als Antwort auf das HSV-1 nicht, während sich die gleichen Zellen als Antwort auf VSV vermehrten. Die von nicht immunisierten Mäusen erhaltenen T-Zellen dienten als negative Kontrolle. Die Stimulierung der T-Zellaktivität auf über dem Hintergrundrauschen gelegene Niveaus wurde in T-Zellen der Milz von Mäusen beobachtet, die mit jedem der replikations-defizienten Viren inokuliert worden waren (2). Die Ergebnisse legen nahe, dass eine Immunisierung der Mäuse mit den mutanten Viren weniger die Stimulierung von T-Zellen induzierte als diejenige, welche nach der Immunisierung mit dem Wildtyp-Virus ausgelöst wurde. Nichtsdestoweniger lösten diese mutanten Viren die wesentliche Reaktivität der T-Zellen aus (2).
  • Induktion einer schützenden Immunität durch replikations-defiziente Viren.
  • Um die Fähigkeit von replikations-defizienten Viren zur Auslösung einer schützenden Immunität gegen letalen HSV-1 zu bewerten, wurden Gruppen von 6 Mäusen intraperitoneal mit 106 PFU von jeder der replikations-defizienten Mutanten d120, d301, n504 oder mit einer äquivalenten Dosis von mit Psoralen inaktiviertem Wildtyp-HSV-1 (5 Mäuse) inokuliert. Den Kontroll-Mäusen (9) wurde PBS injiziert (i.p.). Drei bis sechs Wochen später (je nach Experiment) wurden alle Mäuse (i.p.) einer letalen Dosis (5 × 107 PFU) oder einem virulenten HSV-1-Stamm (mP) ausgesetzt. In drei getrennten Experimenten wurden Mäuse, die mit den Mutanten d301 oder n504 inokuliert worden waren, gegen einen Angriff durch das Wildtyp-Virus so geschützt, dass ihre Überlebensrate 100% betrug. Die Kontroll-Mäuse, welche nur das Wildtyp-Virus erhalten hatten, hatten eine Überlebensrate von weniger als 20%. In den mit allen drei mutanten Viren (d120, d301 und n504) durchgeführten nachfolgenden Experimenten führte eine Präinokultion der Mäuse mit entweder den ICP27- oder den ICP8-Mutanten nach einem Angriff durch das Wildtyp-Virus reproduzierbar zu einer Überlebensrate von 100%, während nur 1/9 der Kontroll-Mäuse (PBS-injiziert) überlebte. Selbst die ICP4-Mutante (d120), welche nur die Immediate-Early-Gene exprimiert, schützte die Mehrheit der Mäuse. Im Gegensatz dazu übte das UV-bestrahlte Virus eine minimale Schutzwirkung aus und eine Immunisierung mit einem Psoralen-inaktivierten Virus schützte die Mäuse nicht gegen einen letalen Angriff (3). Die Überlebensraten wurden nach einem Angriff 4 Wochen lang aufgezeichnet. Die meisten der gestorbenen Mäuse starben zwischen dem 7. und 11. Tag nach dem Angriff.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass replikations-defiziente Mutanten des HSV-1 in der Lage sind, sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunität in mit solchen Viren innokulierten Mäusen auszulösen. Eine Inokulation von Mäusen mit diesen Mutanten dient dem Schutz dieser Mäuse gegen einen Angriff mit einer letalen Dosis des Wildtyp-HSV-1. Da eine zelluläre Immunität zum Schutz gegen eine Infektion mit dem Herpes simplex Virus besonders wichtig ist (Whitley, 1990, in: Virology, Hrg. Fields und Knipe, Raven Press, SS. 1843-1887), ist jeder Wirkstoff, der in der Lage ist, eine derartige Immunität hervorzurufen, ein potentieller Kandidat für einen Impfstoff. Die Kandidaten für einen Impfstoff wie der oben beschriebene sind auch von besonderem Nutzen, weil sie Viren umfassen, die replikations-defizient sind. Da diese Viren keine Virus-Nachkommen produzieren können, sind sie wesentlich sicherer als herkömmliche Impfstoffe mit abgeschwächten lebenden Viren. Mutante Viren wie die oben beschriebenen können nicht in Zellen replizieren, die keine den Wildtyp komplementierende Form des Gens exprimieren. Sie können sich daher nicht über die Stelle der anfänglichen Infektion hinaus ausbreiten. Eine wichtige Implikation dieser Beobachtung für die Pathogenese der Herpesviren besteht darin, dass es unwahrscheinlich ist, dass solche mutanten Viren in der Lage sind, für eine latente Infektion in dem Wirt zu sorgen, in welchen sie eingeführt sind. Mit dieser Theorie steht die Tatsache in Einklang, dass kein Anzeichen einer latenten Infektion bei Mäusen nachgewiesen werden konnte, die auf der Augenhornhaut entweder mit d301 oder n504 inokuliert waren, wenn die von diesen Mäusen erhaltenen Gasser-Ganglien mittels einer in situ-Hybridisierung auf eine Latenz-assoziierte Transkription und Expression hin untersucht wurden. Siehe allgemein Coen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4736 und folgende (1989).
  • REPLIKATIONS-DEFIZIENTE MUTANTEN DES HSV-1 RUFEN EINE IMMUNMODULATORISCHE WIRKUNG HERVOR
  • Materialien
  • Die Balb/c By-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME bezogen und im Alter von 6 bis 8 Wochen eingesetzt.
  • Das elterliche Wildtyp-HSV-1 (KOS 1.1) und die replikations-defizienten Mutanten d301, n504 und d120 sind oben beschrieben. Diese Mutanten wurden angezüchtet und, wie ebenfalls oben beschrieben, auf Zellen titriert, welche das fehlende Genprodukt exprimieren. Diese mutanten Viren replizierten nicht in Primaten-Zellen oder Maus-Zellen in Kultur. Eine Inokulation dieser mutanten Viren auf die Augenhornhaut der Maus führte nicht zu einer latenten Infektion im Gasser-Ganglion, was sich durch das Fehlen von Zellen, welche für eine Hybridisierung mit für das Latenz-assoziierte Transkript spezifischen Sonden positiv sind, zu erkennen gab. Zusätzlich führt eine Infektion der Mäuse nach einer Ritzung der Hornhaut zu minimalen Mengen an Virus-DNA im Gasser-Ganglion. Somit gibt es kein Anzeichen für eine Ausbreitung dieser mutanten Viren in infizierten Mäusen. Weil es kein Anzeichen dafür gibt, dass eine Zellfunktion eines normalen Wirts diese Defekte in ICP8 oder ICP27 komplementieren kann, ist es vernünftig, zu schließen, dass diese Mutanten sowohl in Mäusen als auch in kultivierten Zellen replikations-defizient sind. Das Wildtyp-HSV wurde unter Einsatz von Vero-Zellen titriert. Vom Lee Biomolecular Research Laboratory (San Diego, CA) wurde ein Psoralen-inaktiviertes Virus erhalten und hatte im Plaque-Assay keinen nachweisbaren Titer. Ein UV-bestrahltes HSV wurde durch Bestrahlung des Virus bei 0°C mit einer 30W UV-Quelle (G30t8; General Electric) über einen Zeitraum von 1 Stunde bei einem Abstand von 5 cm gewonnen. Die UV-Bestrahlung führte zu einer Senkung des Viruseiters um 5 bis 6 log. Der gereinigte Anti-TNF-Antikörper vom Hamster war eine freundliche Spende von Robert Schreiber (Washington University, St. Louis, MO).
  • Behandlung der Antikörper in vivo
  • Ein monoklonales Anti-Maus-IFN-γ der Ratte (F3) (Amgen, Boston, MA) oder ein irrelevantes gereinigtes IgG (Amgen) wurden an den Tagen –1, 0 und 1 i.p. in Mäuse injiziert. Am Tag 0 wurden die Mäuse auch einem Angriff durch 106 PFU des HSV-1 (mP-Stamm) ausgesetzt.
  • Assays für alle Isotypen
  • Die Gesamtkonzentrationen der Unterklassen IgG1 und IgG2 wurden mit Hilfe eines Standard-ELISA ermittelt. Kurz gesagt wurde ein Anti-Maus-Ig der Ziege (Tago) bei einer Konzentration von 2,5 μg/ml in PBS unter Einsatz von 96-Loch Mikrotiter-Platten (Linbro/Titerteck) inkubiert. Dieser wurde entweder bei Raumtemperatur über Nacht oder bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden dann mit PBS und 0,1% Tween 20 gewaschen. Geeignete Verdünnungen des Serums wurden zweifach untersucht. Die monoklonalen IgG1 und IgG2 der Maus wurden für die Berechnung der für die Unterklassen spezifischen Konzentrationen eingesetzt. Nach dreimaligem Waschen wurden 100 μl der passend verdünnten mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Maus IgG1 und -IgG2 der Ziege (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) zugesetzt, bei 37°C 3 Stunden lang inkubiert und gewaschen. Die Löcher wurden mit 100 μl DEA-Puffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt. Durch Zugabe von 75 μl 3 M NaOH wurde die Reaktion gestoppt und in einem ELISA-Reader die OD abgelesen.
  • HSV-spezifische IgG1- und IgG2-Assays
  • Der bei Kahlon et al., supra beschriebene ELISA-Assay für HSV-spezifische Antikörper wurde an einen Einsatz von Mäuseserum angepasst. Die Berechnung der HSV-spezifischen Antikörper erfolgte nach dem Verfahren von Zollinger et al., J. Immunol. Methods, 46: 129 (1981). Dieses Verfahren ist von Anderen dazu verwendet worden, Ag-spezifische Antikörper gegen verschiedene Ag, einschließlich Tetanus sowie Bakterienproteine und Polysaccharide, quantitativ zu erfassen. Kurz gesagt wurde ein IgG2a-HSV-spezifischer Assay parallel mit einem Assay für das Gesamt-IgG2a der Maus durchgeführt. Eine Mikrotiter-Platte wurde mit zellfreiem HSV-1 beschichtet, das von infizierten Vero-Zellen produziert wurde. Das Virus wurde verdünnt und in PBS bei einer Konzentration von 2 × 105 PFU/ml über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden sodann dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Eine Verdünnungsreihe eines gepoolten Serums von mit HSV infizierten Mäusen wurde mit HSV-beschichteten Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses gepoolte Mausserum wurde in den nachfolgenden Experimenten als Vergleichsstandard eingesetzt. Um die Einheiten für die Extinktion in Mikrogramm Antikörper umzuwandeln, wurde die folgende Vorgehensweise benutzt: die Hälfte der Löcher einer 96-Loch-Platte wurden mit dem Anti-Maus-IgG2a-Antikörper beschichtet und die andere Hälfte mit HSV. Den mit dem Anti-Maus-IgG2a beschichteten Löchern wurden Verdünnungsreihen von einer bekannten Konzentration eines IgG2a-mAb zugesetzt und zu den Löchern mit HSV wurden Verdünnungen des gepoolten Anti-HSV-Serums gegeben. Am folgenden Tag (nach dreimaligem Waschen mit PBS und Tween) wurden zu jedem Loch 100 μl von passend verdünntem alkalische Phosphatase/Anti-Maus-IgG2a der Ziege (Southern Biotechnology) gegeben und die Platte wurde erneut bei 37°C 3 Stunden lang inkubiert. Nach dem letzen Spülvorgang wurden die Löcher mit 100 μl DEA-Puffer entwickelt. Durch Zugabe von 75 μl 3 N NaOH wurde die Reaktion gestoppt und die Extinktion mit einem automatischen ELISA-Reader bei 405 nm abgelesen. Durch Auftragen der aus der Wechselwirkung des Anti-Maus-IgG2a der Ziege mit den bekannten Konzentrationen an IgG2a erhaltenen OD gegen die OD aus dem HSV-spezifischen Assay wandelten wir die Einheiten für das Anti-HSV-IgG2a in unserem gepoolten Serum in Mikrogramm HSV-spezifisches IgG2a um. An einem geeigneten Punkt auf der Standard-Kurve für das IgG2a und auf der Kurve für den HSV-Ag-Antikörper wurde die OD abgelesen und die Einheiten wurden wie bei Zollinger et al., supra und Pasatiempo et al., FASEB J., 4: 2518 (1990) beschrieben berechnet. Das gleiche Verfahren wurde angewandt, um das HSV-spezifische IgG1 zu messen. In allen Assays wurden die Proben und Standards zweifach laufen gelassen. Dieser Assay wurde auf seine Spezifität hin untersucht, indem die mit Medien oder VSV beschichteten Platten gleichzeitig als irrelevanter Kontrollvirus gescreent wurden.
  • ERGEBNISSE
  • Nach einem Angriff mit einem inaktivierten Virus wird kein Virus-induzierter Unterklassen-Shift beobachtet.
  • Um die Unterklassen-Verteilung der murinen Unterklassen IgG2a und IgG1 nach einer Immunisierung zu untersuchen, wurden Balb/c-Mäuse (4 pro Gruppe) einem Angriff mit 106 PFU von lebendem oder UV-inaktiviertem HSV (mP-Stamm) oder von einem Kontrollmedium ausgesetzt. Der mP-Stamm des HSV-1 wurde eingesetzt, weil er in Balb/c-Mäusen ein pathogener Stamm ist. Zwei Wochen nach der i.p. Infektion wurden die Seren über eine retroorbitale Blutentnahme erhalten. Die Serumspiegel von Gesamt-IgG2a, -IgG1, -HSV-spezifischem IgG2a und -HSV-spezifischem IgG1 wurden mit einem ELISA gemessen. In der Mausgruppe, der ein lebender Virus injiziert wurde, wurde ein 15- bis 20-facher Anstieg der Gesamt-Antikörper der Unterklasse IgG2a beobachtet, während dieser markante Anstieg nicht bei Mäusen beobachtet wurde, die einem Angriff mit einem UV-inaktivierten Virus ausgesetzt worden waren (6, repräsentativ für unsere Experimente). Der Anstieg des Gesamt-IgG1-Spiegels war nicht signifikant (p = 0,962 im Students t-Test). Ähnliche Ergebnisse wurden in den Wochen 3 und 4 nach der Infektion erhalten.
  • Während der aus dem Angriff mit dem lebenden Virus resultierende Gesamtanstieg an IgG2a mehr als 1 mg/ml betrug, waren die Mengen an IgG2a, die an die HSV-beschichteten Platten gebunden wurden, in einigen der durchgeführten Assays weniger als 100 μg (6 und 7A). Dieser durch eine Infektion mit lebenden Viren hervorgerufene Anstieg an Gesamt-Ig war vorwiegend ein unspezifischer polyklonaler Effekt. Sowohl das lebende als auch das inaktivierte Virus waren in der Lage, Virus-spezifische Antikörper zu induzieren (7 und 8), während nur das lebende Virus einen dramatischen Unterklassen-Shift bewirkte (6). Die Unterschiede in den Niveaus von HSV-spezifischem IgG2a und HSV-spezifischem IgG1 aus Mäusen, die einem Angriff mit lebenden gegenüber UV-inaktivierten Viren ausgesetzt waren, ist statistisch nicht signifikant (Students t-Test). Diese Daten legten nahe, dass die Prozesse, die zum Auslösen des Unterklassen-Shifts führten, sich von solchen unterscheiden, die zur Produktion eines Virus-spezifischen Antikörpers führt.
  • Das mit Psoralen inaktivierte Virus und das immediate-early-infizierte Unterklassen-Virus mit der Deletions-Mutante des Zellproteins 4 (ICP4) konnten keinen Shift induzieren
  • Lebende Viren sind gewöhnlich in der Lage, im Wirt zu replizieren und sie können daher in Gewebe eindringen, die für inaktivierte Viren oder abgetötete Proteine nicht zugänglich sind. In diesem Experiment wurden replikations-defiziente mutante Stämme des HSV verwendet, welche sich in dem Wirt nicht ausbreiten konnten. Weil eine UV-Inaktivierung nicht zu einem völligen Verlust der Infektivität führen kann und die Möglichkeit von einigen lebenden Viren bestand, wurden mit Psoralen inaktivierte Viren auf ihr Isotyp-Profil hin untersucht. Mäuse (8 Mäuse pro Gruppe) wurden einem Angriff mit 106 PFU eines lebenden Virus, eines mit Psoralen inaktivierten Virus, oder des HSV-1-Stammes d120 ausgesetzt. Während eine Immunisierung der Mäuse mit dem lebenden Virus ein Ig-Verteilungsmuster hervorrief, das durch ein Überwiegen des IgG2a charakterisiert war, wurde bei den Mäusen, die dem Angriff mit dem Psoralen-inaktivierten Virus oder dem replikations-defizienten mutanten Virus d120 ausgesetzt waren, kein signifikanter Wechsel im Isotyp beobachtet (9).
  • Zwei replikations-defiziente mutante Viren mit späten Blockierungen der Replikation induzierten den Unterklassen-Shift
  • Um besser zu definieren, welche Aspekte des viralen Replikationsprozesses die angegebene Wirkung auslösen könnten, setzten wir an zwei anderen Punkten im viralen Lebendzyklus blockierte Viren ein. Mäusen wurde zwei Wochen nach einem Angriff mit entweder 106 PFU der ICP4-Mutante (d120), der ICP27-Mutante (n504), der ICP8-Mutante (d301) oder mit den elterlichen HSV-1-Viren (KOS 1.1-Stamm) Blut entnommen. Den Kontroll-Mäusen wurde PBS injiziert. Die Gesamt-Immunglobulinspiegel für IgG2a wurden mit einem ELISA gemessen. Die Daten wurden als Mittelwert und als Standardfehler des Mittelwerts angegeben. Dieses Experiment ist für 3 durchgeführte repräsentativ. Während die ICP4-Deletions-Mutante keine Verschiebung in den Unterklassen bewirkte, war eine andere HSV-1-Mutante (n504) mit einer Nonsense-Mutation in dem das ICP27 codierenden Gen in der Lage, einen Unterklassen-Shift ähnlich dem des Wildtyp-Virus hervorzurufen. Dies geschah trotz der Tatsache, dass es wie das Virus mit der ICP4-Mutante nicht replizieren konnte. Die gleiche Wirkung wurde auch von einer anderen replikations-defizienten Mutante hervorgerufen, die kein funktionelles frühes Protein, ICP8 oder das hauptsächliche DNA-Bindungs-Protein, die Mutante d301, codieren kann (10). Somit sind für ein Auslösen des Unterklassen-Shift spezifische Komponenten des viralen Replikationszyklus und nicht die Produktion einer infektiösen Virus-Nachkommenschaft notwendig.
  • Gereinigte mAbs gegen das IFN-γ der Maus können eine Verschiebung der Unterklassen beeinflussen
  • Um die Rolle des Cytokins IFN-γ bei der Verschiebung der Unterklassen während einer Virus-Infektion zu beurteilen, injizierten wir Mäusen gereinigte mAbs gegen IFN-γ der Maus, um dessen Wirkung auf die Produktion von IgG2a in vivo zu untersuchen. Balb/c-Mäusen (4 pro Gruppe) wurden an den Tagen –1, 0 und +1 entweder 2 mg gereinigter mAbs gegen IFN-γ der Maus oder 2 mg einer irrelevanten zum Isotyp passenden Kontrolle i.p. injiziert. Am Tag 0 wurden die Mäuse auch einem Angriff mit 106 PFU von lebendem HSB-1 (mP-Stamm) ausgesetzt. Die einen Tag vor dem Angriff und mit zwei nachfolgenden Dosen erfolgende Injektion der mAbs gegen IFN-γ blockierte teilweise die Virus-induzierte IgG2a-Produktion (11). Eine Woche später wurde den Mäusen retroorbital Blut entnommen und das gesamte IgG2a und IgG1 einzeln mit einem ELISA gemessen. Es gab keine Wirkung der Anti-IFN-γ-Antikörper auf den Gesamt-IgG1-Spiegel, was darauf hinweist, dass dies kein unspezifischer Effekt war. Die Verabreichung der Antikörper hatte keine Wirkung auf das HSV-spezifische IgG2a, was nahe legt, dass der IFN-γ-Antikörper die polyklonale Wirkung aber nicht die Ag-spezifische Reaktion ausschaltete. 11 gibt drei Durchführungen wieder.
  • IMMUNISIERUNG UND IgG2A/IgG1-UNTERKLASSEN-SHIFT MIT DER ICP8-DELETIERTEN HSV β-GALACTOSIDASE-MUTANTE
  • Immunisierung der Balb/c-Mäuse
  • Weibliche Balb/c-Mäuse wurden mit der ICP8-deletierten HSV-β-Galactosidase-Mutante (HSV-β-Gal) immunisiert. Die primäre Immunisierung erfolgte mit 106 PFU in 0,1 ml i.p. Den Mäusen wurde für Serum 11 Tage später Blut entnommen und sie wurden mit 106 PFU in 0,1 ml s.c. geboostet. Serum wurde erneut 28 Tage nach der Booster-Immunisierung erhalten.
  • Die Mäuse wurden auch mit β-Galactosidase (Grad VIII: von E. coli, Sigma Chemical Co.) immunisiert. Der primären Immunisierung mit 100 μg Protein in inkomplettem Freund-Adjuvans (0,2 ml s.c.) folgte 14 Tage später ein Boost von 100 μg löslichem Protein (0,1 ml s.c.). 11 Tage nach der Booster-Immunisierung wurde Serum zur Bestimmung der Antikörper erhalten.
  • Bestimmung der Antikörper gegen β-Galactosidase mit Hilfe eines ELISA
  • Immunlon® 2-Mikrotiterplatten (Dynatech Laboratories) wurden mit 1 μg/ml β-Glucosidase (Sigma) in phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 37°C 90 Minuten lang beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween (PBS + 0,5% Tween 20, Sigma) gewaschen. Die Serumproben wurden in PBS/Tween verdünnt und auf der Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden erneut gewaschen und die mit affinitätsgereinigter alkalischen Phosphatase konjugierten Ziegen-Antikörper gegen die IgG- Unterklassen der Maus (Southern Biotechnology Associates) in PBS verdünnt. Es wurde Tween zugesetzt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Alle nachweisenden Antikörper wurden untersucht, um sich ihrer Unterklassen-Spezifität zu versichern. Die Platten wurden gewaschen und bei Raumtemperatur mit 1 mg/ml Sigma 104®-Phosphatase-Substrat in Diethanolamin-Puffer entwickelt. Die IgG1- und IgG2a-Assays ließ man 30 Minuten lang entwickeln und die IgG2b- und IgG3-Assays 60 Minuten lang, dann wurden sie bei einer OD von 405 nm auf einem Vmax®-Microplate-Reader (Molecular Devices) gelesen.
  • Die Ergebnisse des ELISA werden als die reziproke Verdünnung des Serums angegeben, welche nach 30 Minuten für die IgG1- und IgG2a-Assays eine OD von 0,75 liefert. Die Ergebnisse für die IgG2b- und IgG3-Assays werden als die reziproke Verdünnung angegeben, welche nach 60 Minuten eine OD von 0,5 liefert. TABELLE 7
    Antigen IgG1* IgG2a* IgG2b** IgG3** Verhältnis IgG2a/IgG1
    HSV-β-Gal, 2° 300 1.200 < 20 60 4,0
    550 320 < 20 70 0,58
    350 1.000 < 20 50 0,29
    400 130 < 20 50 0,33
    MITTELWERT 400 710 < 20 58 1,3
    β-Gal, 2° 60.000 900 2.000 2.000 0,015
    36.000 270 150 1.700 0,008
    18.000 750 300 3.000 0,042
    48.000 1.200 800 1.300 0,025
    8.000 < 20 < 20 350 < 0,003
    17.000 900 400 1.300 0,053
    MITTELWERT 31,167 672 610 1.608 0,029
    • * reziproer Titer ergit von,
    • ** reziproker Titer ergibt OD von 0,50
  • Diese Offenkundigkeit zeigt, dass eine humorale Antwort von einem Fremdartigen ausgelöst wird, das von einem replikations-defizienten HSV-Stamm exprimiert wird, was beweist, dass diese vorgeschlagene Untersuchung machbar ist. Darüber hinaus unterschied sich der Antikörper-Isotyp von dem, der durch eine Injektion des β-Galactosidase-Proteins ausgelöst wird, das ein IgG2a:IgG1-Verhältnis von 0,003-0,053 produzierte. Hohe IgG1-Spiegel sind mit Th2-vermittelten Antworten gegen Proteinantigene assoziiert und hohe Spiegel von IgG2a-Antikörpern sind mit Thl-vermittelten Antworten gegen die Antigene von lebenden Viren assoziiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Th1-vermittelte Antwort auch auf das Vektor-exprimierte heterologe Antigen übertragen wird.
  • KONSTRUKTION, CHARAKTERISIERUNG UND PROPHYLAKTISCHE IMMUNISIERUNG GEGEN HERPES GENITALIS MIT EINEM HSV-2-VIRUS, DER EINE MUTATION IM ICP8-GEN ENTHÄLT
  • Isolierung von pICP8-lacZ aus dem HD-2-Stamm des HSV-1.
  • Die Virus-DNA des HSV-1-HD2-Stammes (lac2-Insertion im ICP-8-Gen) wurde mit BamHI vollständig verdaut und auf einem 0,7% niedrig schmelzenden Agarose-Gel einer Elektrophorese unterzogen. Es wurde erwartet, dass das ICP8-lacZ Fusionsgen im größten erhaltenen einzig zu HD2 gehörenden Fragment (ungefähr 12,6 kbp) enthalten ist. Ein Restriktionsanalyse-Vergleich mit dem elterlichen H2-Virus zeigte, dass dies so ist. Diese Bande wurde aus dem Gen ausgeschnitten und in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pNEB193 (New England Biolabs) kloniert. Nach der Transformation wurden die weißen Kolonien auf den LG-Platten, welche das chromogene Substrat für die β-Galactosidase, X-Gal, enthielten selektiert und auf das korrekte Insert hin gescreent. Die Identität wurde mittels Verdau in einer Restriktionsanalyse bestätigt.
  • Isolierung der Rekombinanten des HSV-2.
  • Zum Marker-Transfer der ICP8-lacZ-Fusionssequenz in das HSV-2 wurde ICP8-lacZ mit KpnI verdaut und nach einer Agarose-Gelelektrophorese das größte Fragment (ungefähr 6,4 kbp) gereinigt. Das 5'-Ende dieses Fragments befand sich 76 Codons downstream vom Initiationscodon und das 3'-Ende befand sich etwa 1,3 kbp upstream zum gB-Promotor. Das gereinigte Fragment wurde in verschiedenen Molverhältnissen zusammen mit 1 μg WT-Virus-DNA des HSV-2-Stammes 186 syn+-1 mit der Calciumphosphat-Methode in S2-Zellen (welche nach einer Virus-Infektion ICP8 exprimieren) transfiziert. Nach dem Auftreten von Plaques wurden die infizierten Zellen durch Zusatz eines halben Volumens steriler Milch geerntet, zweimal einem Frost-Tau-Wechsel unterzogen, beschallt und die Verdünnungen auf S2-Monolayer in 6- Loch-Platten plattiert. Die infizierten Monolayer wurden mit 199-Medium-1% Kälberserum (199V), das 0,1% Immunserum enthielt, überzogen und bei 37°C inkubiert.
  • Screening nach Rekombinanten.
  • Die Bildung von Plaques wurde gewöhnlich binnen 2 Tagen nach dem Plattieren auf die S2-Monolayer beobachtet. Die Zell-Monolayer wurden sodann zweimal mit 199V-Medium gewaschen und mit 199V-Medium überzogen, das 0,5% Agarose und 300 μg/ml X-Gal enthielt, ein chromogenes Substrat für die β-Galactosidase, welches eine blaue Farbe annimmt, wenn es durch das Enzym verstoffwechselt wird. Es wurde erwartet, dass die das ICP8-lacZ-Insert enthaltenden rekombinanten Viren in Gegenwart von X-Gal blaue Plaques produzieren. Die blauen Plaques wurden ausgelesen und Verdünnungen auf sowohl S2- als auch Vero-Monolayer plattiert. Diejenigen Isolate, welche auf S-2-Monolaysern aber nicht auf Vero-Monolayern blaue Plaques bildeten wurden für eine weitere Reinigung auf S-2-Zellen in Betracht gezogen. Waren die Isolate erst einmal gereinigt, wurden sie auf ihr Wachstum auf Vero-Zellen hin untersucht und es wurde keines beobachtet mit Ausnahme eines verallgemeinerten cytopathischen Effekts (CPE), der bei geringen Verdünnungen des Virus beobachtet wurde. Die viralen Rekombinanten wurden mit einer Häufigkeit um 0,1% erhalten. Zwei unabhängig isolierte Mutanten, 5BlacZ und 20BlacZ, wurden weiter charakterisiert.
  • Analyse des rekombinanten HSV-2-Virus
  • 1. Replikation in verschiedenen Zelllinien.
  • Die Replikation des mutanten 5BlacZ-Virus wurde auf verschiedenen Zelllinien über die Bildung von Plaques untersucht. 5BlacZ bildete wirksam Plaques auf S-2-Zellen, welche nach einer Infektion mit HSV das ICP8 exprimieren (Tabelle 8), es zeigte jedoch auf Vero-Zellen keine nachweisbare Plaquebildung (Tabelle 8). Im Gegensatz dazu bildete das elterliche WT-Virus, der Stamm 186 des HSV-2) auf beiden Zelllinien Plaques gleich gut.
  • 2. Genom-Analyse.
  • Die Virus-Mutanten wurden anfangs durch Restriktionsverdau und eine Southern-Hybridisierungs-Analyse analysiert. Die Virus-DNA wurde durch Zentrifugation über einen Natriumiodid-Gradienten gereinigt und einer Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen unterzogen. Die in den Southern-Blots eingesetzte Sonde war linearisiertes pICP8-lacZ, das nach der Random-Primer-Methode mit 32P-dCTP markiert war. Diese Analyse bestätigte das Vorkommen des ICP8-IacZ-Gens an dem erwarteten Ort der zwei rekombinanten HSV-2-Viren (2). Es wurde eine weitere Analyse durchgeführt, in welcher nur 5BlacZ eingesetzt wurde. TABELLE 8
    Virus-Titer (PFU/ml)
    Virus Vero-Zellen S-2-Zellen
    5BlacZ < 103a 4,5 × 108
    186 syn- -1b 1,8 × 108 1,3 × 108
    • a Bei einer Verdünnung des Virus-Stock von 1:1000 wurden keine Plaques beobachtet. Bei niedrigeren Verdünnungen wurde ein verallgemeinerter CPE beobachtet.
    • b Elterlicher Wildtyp-Stamm, von dem 5BlacZ abstammte.
  • 3. Gen-Expression.
  • Um die Gen-Expression von 5BlacZ und dem WT-Virus miteinander zu vergleichen, wurden Vero-Zellen mit 5BlacZ oder dem HSV-2-syn+-1-Virus mit einer Vielzahl von Infektionen (multiplicity of infections, MOI) (MOI = 20) infiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden die Kulturen mit 35S-Methionin markiert. Es wurden Zelllysate gewonnen und einer Elektrophorese in 9,25% SDS-Gelen unterzogen. Das 5BlacZ-Virus exprimierte die gleichen Proteine wie das WT-Virus, mit der Ausnahme, dass etwas geringere Mengen von späten Proteinen wie z.B. ICP5 und ICP25 von dem mutanten Virus im Vergleich mit dem Wildtyp-Virus exprimiert wurden. In den Western-Blot-Analysen dieser Extrakte betrug die Expression der viralen Proteine gB und gD in den mit Mutanten infizierten Zellen annähernd die Hälfte von der in den mit einem WT-Virus infizierten Zellen. Somit exprimierte das mutante 5BlacZ-Virus in normalen Zellen virale Proteine von allen kinetischen Klassen, weshalb zu erwarten wäre, dass in einem inokulierten Wirt eine Immunantwort ausgelöst wird.
  • 4. DNA-Replikation.
  • Um die Fähigkeit von 5BlacZ zur Replikation seiner DNA zu untersuchen, wurden Vero-Zellen entweder mit dem Wildtyp-Stamm 186 syn+-1 oder der ICP8-Mutante infiziert oder sie wurden mit 5BlacZ mit einer MOI von 20 infiziert oder sie wurden mock-infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen 3 Stunden lang mit 199V-Medium bedeckt und das Medium wurde dann durch 25 μCi/ml 3H-Thymidin enthaltendes 199V ersetzt und mit der Inkubation 4 weitere Stunden fortgefahren. Nach Lyse der Zellen und einer RNase A-Behandlung wurde die Gesamt-DNA gewonnen. Gleiche Mengen von DNA wurden sodann sowohl mit EcoRI als auch mit XbaI verdaut und einer Agarose-Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde dann in ExtensifyTM (New England Nuclear) fluorographiert, getrocknet und 3 Tage lang bei –80°C einem Kodak XAR-Film ausgesetzt. Das Autoradiogramm zeigte, dass 5BlacZ nicht in der Lage war, seine DNA zu replizieren.
  • 5. Abtöten der Zellen.
  • Die Fähigkeit von 5BlacZ zum Abtöten von infizierten Vero-Zellen wurde ermittelt, indem konfluente Monolayer in T25-Kolben mit einer MOI von 5 infiziert und die Zellen 24, 48 und 72 Stunden nach der Infektion geerntet wurden. Die Zellen wurden in einer 0,5% (w/v) Lösung von Trypan-Blau in phosphatgepufferter Saline resuspendiert und in einem Hämocytometer ausgezählt. Die Gesamtzellzahl wurde ermittelt; tote Zellen wurden von den lebenden durch ihre Aufnahme von Trypan-Blau unterschieden (12). Somit tötet 5BlacZ, obwohl es replikations-defizient ist, infizierte Zellen ab und besteht nicht weiter fort eine für einen Impfstoff-Virus erwünschte Eigenschaft.
  • 6. Immunisierung mit der replikations-defizienten 5BlacZ-Mutante des HSV-2 gegen eine genitale Herpes-Infektion bei Meerschweinchen.
  • Experimentelles Design:
  • 36 weibliche Hartley-Meerschweinchen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen aufgeteilt. Zur Gruppe 1 (N = 12) gehörten die nicht immunisierten Kontrolltiere. Die Gruppe 2 (N = 12) erhielt über eine subkutane Injektion in den Rücken 0,5 ml einer 1 × 107 PFU des 5BlacZ-Virus enthaltenden Suspension. Gruppe 3 (N = 12) erhielt über eine Injektion in die beiden Hinterpfoten 0,5 ml einer 1 × 107 PFU des 5BlacZ-Virus enthaltenden Suspension. Am Tag 33 nach der Immunisierung erfolgte ein viraler Angriff. Die Tiere wurden mit einem Angreifervirus inokuliert, indem die Schließmembran der Vagina mit einem befeuchteten mit einer Calciumalginat-Spitze versehenen Abstrichtupfer (Calgiswab #3, Soectrum Labs, Los Angeles, CA) aufgerissen wurde und mit einem Kunststoffkatheter (Abbocath, Abbot Labs, North Chicago, IL) 0,1 ml einer 5,7 log10 PFU des HSV-2-Stammes MS enthaltenden Virus-Suspension in die Wölbung de Vagina eingeträufelt wurden. Um die Zahl der infizierten Tiere zu maximieren, wurde der Vorgang der Inokulation 30 Minuten später wiederholt. Die Proben mit den Vaginaabstrichen wurden an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7 und 10 nach der Inokulation (PI) gesammelt und eingefroren (–70°C) aufbewahrt, bis sie mittels Titration auf primäre Nierenzellen von Kaninchen auf das Vorkommen von Viren hin untersucht wurden. Die Meerschweinchen wurden täglich beurteilt und die Schwere der primären Erkrankung der Genitalhaut mit einer früher beschriebenen Punkteskala für die Verletzung quantitativ erfasst (Stanberry LA, ER Kern, TM Abbot und JC Overall, 1982, Genital Herpes in guinea pigs: pathogenesis of the primary infection and description of recurrent disease, J. Inf. Dis. 146: 399-404). Die primäre Erkrankung der Genitalhaut wurde als jede primäre Episode einer klinischen Erkrankung mit Beginn vor dem Tag 10 PI definiert. Nach der Erholung von der Primärinfektion wurden die Tiere täglich von den Tagen 15-42 PI an auf ein Anzeichen einer spontanen rekurrenten Herpeserkrankung hin untersucht. TABELLE 9. Wirkung der Immunisierung auf eine primäre und rekurrente Erkrankung der Genitalhaut
    Primäre Genitalerkrankung Rekurrente Genitalerkrankung
    Gruppe Anzahla Schwereb Anzahlc
    1 (nicht immunisiert) 11/12 8,41 ! 0,48 6/7
    2 (subkutan) 6/12d 4,50 ! 0,52f 7/12
    3 (Pfote) 3/11e 1,00 ! 0,29fg 5/11
    • a Anzahl der Tiere mit klinischer Erkrankung/Anzahl der Tiere, in denen das Virus aus dem Genitaltrakt isoliert werden konnte.
    • b Mittelwert + Standardfehler. Schwere gemessen als Fläche unter der Kurve für die Punkteskala für die Wunde. Für Berechnung wurden nur symptomatische Tiere herangezogen.
    • c Anzahl der Tiere mit rekurrenter Erkrankung/Anzahl der infizierten Tiere, welche für Rückfälle vom Tag 15 bis zum Tag 42 PI beurteilt werden konnten.
    • d p < 0,07 im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen (Fisher's 2-tail exact test).
    • e p < 0,003 im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen (")
    • f p < 0,001 im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen (").
    • g p < 0,05 im Vergleich mit subkutan immunisierten Tieren (Bonferroni-Korrektur von ANOVA).
    TABELLE 10. Wirkung der Immunisierung auf die Replikation von Angreiferviren im Genitaltrakt
    Gruppe Mittlerer Virus-Titer im Genitaltrakt (log10/ml) am Tag
    1 2 3 5 7 10
    1 (unbehandelt) 5,55 5,79 4,35 3,09 3,3 10
    2 (subkutan) 5,99 4,58 3,24 1,02 0,10 0,44
    3 (Pfote) 4,9 4,66 3,85 1,42 0,53 0,11
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung von Meerschweinchen, insbesondere durch eine Inokulation in die Pfote, zu einer schützenden Immunität führt, welche im Genitaltrakt Genitalverletzungen und die Replikation des HSV-2 vermindert, wenn die Tiere mit einem virulenten Wildtyp-Stamm des HSV-2 in die Vagina inokuliert werden. Diese Ergebnisse liefern den Beweis, dass ein replikations-defizienter mutanter Stamm des HSV-2 für eine prophylaktische Immunität gegen Genitalherpes sorgen kann.
  • Äquivalente Ausführungsformen
  • Der Fachmann weiß oder kann feststellen, dass es nur routinemäßiger Versuche bedarf, um zu vielen der den hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung entsprechenden Anwendungen zu gelangen. Diese und alle anderen äquivalenten Ausführungsformen sollen von den folgenden Ansprüchen mit umfasst sein.

Claims (3)

  1. Verwendung von HSV-1 mit einer Mutation in einem oder mehreren Genen, die für ein Protein kodieren, das für die virale Replikation essentiell ist, um das Herpesvirus replikations-defizient zu machen, wobei dieses mutierte Herpesvirus die Fähigkeit aufweist, einen Shift der Antikörper-Unterklassen IgG2a/IgG1 nach in vivo-Verabeichung an einen Säuger herbeizuführen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von herpetischer stromaler Keratitis.
  2. Verwendung von HSV-1 mit einer Mutation in einem oder mehreren Genen, die für ein Protein kodieren, das für die virale Replikation essentiell ist, um den Herpesvirus replikations-defizient zu machen, wobei dieses mutierte Herpesvirus die Fähigkeit aufweist, die Produktion von IFN-γ nach der Verabreichung zu induzieren, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von herpetischer stromaler Keratitis.
  3. Verwendung von Anspruch 2, wobei die Mutation in dem Gen oder den Genen vorliegt, die für die Proteine ICP8 oder ICP27 kodieren.
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