JPH09508788A

JPH09508788A - ヘルペスウイルス複製欠陥突然変異体

Info

Publication number: JPH09508788A
Application number: JP51865895A
Authority: JP
Inventors: クニーペ，デイヴィッド; フィンバーグ，ロバート; サイバー，ジョージ
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1994-01-10
Filing date: 1995-01-09
Publication date: 1997-09-09
Also published as: US7223411B1; DE69535466D1; EP0739414A1; WO1995018852A1; ATE360061T1; DE69535466T2; CA2180551A1; EP0739414B1

Abstract

(57)【要約】薬学的に許容される担体に懸濁された突然変異体ウイルスを含んでなるヘルペスウイルスワクチン。突然変異体ヘルペスウイルスはワクチン化の対象となる哺乳動物の細胞を感染させることができるが、複製サイクルを完成することができず、そして該哺乳動物中に防御的免疫応答を誘導することができる。この突然変異体ヘルペスウイルスは免疫調節的疾病または免疫制御的疾病を治療することもできる。この突然変異は、ウイルスの複製に不可欠な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１個に生じており、そのためこの突然変異がウイルスを複製欠陥としている。

Description

【発明の詳細な説明】ヘルペスウイルス複製欠陥突然変異体発明の背景ヘルペスウイルスは、正二十面体の核ヌクレオキャプシド中に二本鎖ＤＮＡを含有するウイルスであってエンベロープを有する。少なくとも７種のヘルペスウイルスがヒトの感染と関連しており、この中には、単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルスタイプ２（ＨＳＶ−２）、バリセラゾスターウイルス(varicella zoster virus)(ＶＺＶ)、エブスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス− ６（ＨＨＶ−６）及びヒトヘルペスウイルス−７（ＨＨＶ−７）が含まれる。ＨＳＶ−１は最も深く研究されたヘルペスウイルスの一つである。ＨＳＶ−１は生産的感染の間の遺伝子発現パターンが厳しく制御されていることを示す（フィールズ（Fields）ら、バイロロジー、１９９０、レイブンプレス、ＮＹ）。このウイルスでは、７０個以上の遺伝子が一部にはその発現のキネティックスにより分類されている。各クラスの遺伝子発現は先行するクラスの遺伝子の発現に依存している。このウイルスの即時型遺伝子すなわちα遺伝子群が先ず発現する。次いで初期遺伝子すなわちβ遺伝子群が発現し、今度は後期遺伝子すなわちγ遺伝子群がそれに続く。γ遺伝子群はそれらの発現がウイルスＤＮＡ複製に依存する程度に応じてγ−１遺伝子とγ−２遺伝子にさらに分けられる。ウイルス蛋白質の幾つかはＨＳＶ−１遺伝子の発現を制御することが知られている。ＩＣＰ４蛋白質はβ遺伝子及びγ遺伝子の発現に不可欠である（デルカ(D eLuca)ら、J．Virol.,56，558(1985)）。ＩＣＰ２７蛋白質はγ遺伝子の発現及びウイルスＤＮＡ複製に要求される(マッカーシー(McCarthy)ら、J．Virol.,63 ，18(1989))。主要なＤＮＡ結合蛋白質（ＩＣＰ８）であるβ遺伝子産物も、ウイルスＤＮＡ複製及びγ遺伝子の発現に要求される（ガオ(Gao)ら、J．Virol.,6 3，5258（1989）、クインラン(Quinlan)ら、Cell、36、657(1984)）。ヘルペスウイルスによって惹起されるヒトの病気は軽度のものから重症のものまであり、ときには、これらのウイルスによる感染で致死的となることもある。ワクチン免疫化は病気の予防のための通常の手段である。単離された免疫原や生のウイルスもしくは弱毒化ウイルスに基づく種々のワクチンがヘルペスウイルスに対し提案されてきた（ロイズマン(Roizman)、ＵＳパテント４，８５９，５８７号、及びマイグニア(Meignier)ら、J．Inf．Dis.，3，603-613(1988)(HSV) 、タカハシら、Biken J.，18，25-33(1975)(VZV)、エレク（Elek）ら、ランセット、1，1-5（1974）、及びプロトキン(Plotkin)ら、Infect．Immun．12，521-52 7(1975)(CMV)）。さらに、ヘルペス性支質角膜炎などの免疫病理学的疾病を治療するための治療用の免疫調節物質の開発が望まれている（ジャヤーラマン(Jayaraman)ら、J．Im munology，151，57 77-5789，Nov.15，1993）。発明の概要本発明は、薬理学的に許容される担体中にヘルペスウイルス突然変異体を含んでなるヘルペスウイルスワクチンであることを特徴とする。ヘルペスウイルス突然変異体は、ワクチン免疫化の対象となる哺乳動物の細胞を感染させることができ、そして該哺乳動物中に防御的免疫応答を誘導することができ、及び／又は該哺乳動物にイン・ビボで投与されると抗体サブクラスシフトにより証明されるような免疫調節応答を誘導することができる。この突然変異はウイルスの複製に不可欠な蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子中で生じ、この変異のためウイルスは複製することができなくなる。ウイルス突然変異体は、それが防御の対象である宿主の標的細胞を感染させる能力を保持するという意味で生きている。感染は子孫を作らないが、例えば感染細胞によりウイルス的に作られる誘導又はコード化された免疫原を介して、ウイルスは防御的な免疫応答を誘導する。防御とは、宿主が野生型ウイルスによるその後の感染に対し予防され、または期間や程度においてより軽度となるように、ワクチンに対する免疫応答を生ずることを意味する。潜伏的感染の発現が防止されることが好ましい。好ましい態様においては、ヘルペスウイルスはＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７又はヒト以外のウマヘルペスウイルスタイプ１である。突然変異はＨＳＶ−１のＩＣＰ２７又はＨＳＶ−１のＩＣＰ８をコードする遺伝子、又は非−ＨＳＶ−１ヘルペスウイルス中の対応する遺伝子中に存在することが好ましい。ワクチンとしての使用に好ましいヘルペスウイルス突然変異体はｎ５０４Ｒ又はｄ３０１である。ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１のＩＣＰ２７及びＨＳＶ−１のＩＣＰ８遺伝子の両方に又は非−ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスの対応する遺伝子の両方に突然変異を含むことがさらに好ましい。ヘルペスウイルス突然変異体は、親ヘルペスウイルスとは異種の病原体に対する防御を誘導するワクチン発現ベクターとなるように１種以上の異種遺伝子を含むように遺伝子工学的に構築してもよい。ヘルペスウイルス突然変異体は、ウイルスの野生型チミジンキナーゼ遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明は上述のヘルペスウイルス変異体を構築しそしてそれを薬学的に許容される担体中に懸濁することによりヘルペスウイルスワクチンを作成する方法であることを特徴とする。本発明は、上述のヘルペスウイルス突然変異体ワクチンを投与することによりヘルペスウイルスに対し哺乳動物を免疫化する方法を含む。請求項に記載の本発明のワクチンは、防御的免疫応答を誘導することができる免疫原をコードする異種の遺伝子を含むヘルペスウイルス突然変異体を投与することにより他の病原体に対して哺乳動物を免疫化する方法にも使用することができよう。本発明は、ヘルペス性支質角膜炎などの免疫病理学的、免疫調節的もしくは免疫制御的疾病もしくは状態を、ヘルペスウイルス突然変異体の有効量をそれを必要とする哺乳動物に投与してその哺乳動物に抗体サブクラスシフトにより証明されるような免疫調節的応答を誘導することにより治療する方法を含む。本発明はヘルペス性支質角膜炎などの免疫病理学的疾病もしくは状態の予防用又は治療用の薬学的組成物を含む。図面の簡単な説明図１は、野生型ＨＳＶ−１を接種されたマウス及び複製欠陥突然変異体ｄ３０１、ｎ５０４及びｄ１２０を接種されたマウスにおける抗体応答を示すグラフである。図２は、野生型ウイルスを接種されたマウス及び複製欠陥突然変異体ｄ１２０、ｄ３０１及びｎ５０４を接種されたマウスにおけるＴ細胞応答を示すグラフである。図３は、複製欠陥突然変異体を接種した後に野生型ウイルスでチャレンジしたマウスの生存率を示すグラフである。図４は、野生型遺伝子及び突然変異体ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の位置と構造を示す図である。（Ａ）野生型遺伝子及びｌａｃＺ挿入突然変異体遺伝子の構造。ＨＳＶ−１ゲノムの原始配列の表示は上部に示す。野生型由来のＰｓｔＩ制限断片及びｄ２７−ｌａｃＺ１遺伝子は下部に示す。細い線はウイルスゲノムのユニーク（Ｕ）領域を示し、白棒は繰り返し領域（Ｒ）を示し、斜線棒は大腸菌のｌａｃＺ配列を示す。上部の矢印は６３ｋＤａのＩＣＰ２７蛋白質をコードする配列を示し、下部の矢印は約１３７ｋＤａのＩＣＰ２７−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質をコードする配列を示す。（Ｂ）野生型遺伝子、ノンセンス遺伝子及び欠失突然変異体遺伝子の構造。ＩＣＰ２７突然変異体遺伝子は制限断片（括弧）を欠失させることにより、又は３種の読み枠すべてに終止コドンを含むＸｂａＩオリゴヌクレオチドリンカーもしくはＮｈｅＩオリゴヌクレオチドリンカー（それぞれＸ及びＮ）を挿入することにより構築される。矢印は野生型ＩＣＰ２７蛋白質（上部）又はノンセンス突然変異体によりコードされたＩＣＰ２７の切断型のいずれかを示す。制限部位：ＰはＰｓｔＩ、ＢはＢａｍＨＩ、ＳａはＳａｌＩ、ＨはＨｐａＩ、ＲはＲｓｒＩＩ、ＳｔはＳｔｕｌ、ＳｓはＳｓｐＩ、ＸはＸｂａＩ、ＮはＮｈｅＩ。図５は、ＩＣＰ８のノンセンス（ｎ）、欠失（ｄ）及び点突然変異（ｐｍ）の位置を示す図である。ＨＳＶ−１ゲノム上のＩＣＰ８コード領域の位置は、図の上部に示す。示された制限部位はＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＮｏｔＩ（Ｎ）及びＳａｌＩ（Ｓ）である。図６は、生のＨＳＶ、ＵＶ−失活ＨＳＶ（ｍＰ株）又はＰＢＳ（対照）でマウスを免疫化した後のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１抗体の全生産を示すグラフである。図７は、図６に記載されたマウスの血清中のＨＳＶ−特異的ＩｇＧ２ａの生産を示すグラフである。図８は、図６に記載されたマウスの血清中のＨＳＶ−特異的ＩｇＧ１の生産を示すグラフである。図９は、生のＨＳＶ、ソラレン失活ＨＳＶもしくはｄ１２０（ＩＣＰ４）ＨＳＶ又はＰＢＳ（対照）でマウスを免疫化した後のＩｇＧ２ａの生産を示すグラフである。図１０は、生の（ＫＯＳ）、ｄ１２０（ＩＣＰ４−）、ｄ３０１（ＩＣＰ８− ）、ｎ５０４（ＩＣＰ２７−）又はＰＢＳ（対照）でマウスを免疫化した後のＩｇＧ２ａの生産を示すグラフである。図１１は、生のＨＳＶ−１でチャレンジしたマウスにおけるサブクラスシフトに対する抗−ＩＦＮ−γ抗体の効果を示すグラフである。図１２は、感染後種々の時間に試験されたベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の死滅に対するウイルス感染の効果を示すグラフである。カラムは、モック感染対照のパーセントとして表した（生細胞と死細胞の両方の）総細胞計測数を示す。野生型ウイルスは１８６ｓｙｎ⁺−１株である。各棒内の数は（トリパンブルー色素の取込みで測定された）死細胞の量を示し、特定データ点に対する総細胞数のパーセントとして表してある。各データ点は二つの値の平均を示す。発明の詳細な説明請求項記載の本発明は、本明細書に記載の複製欠陥ヘルペスウイルスが、これを投与すると、好ましいことに、生のウイルスにより誘導される場合と同様にＩｇＧ２ａの生産レベルが増大し、その結果ＩｇＧサブクラスシフトを招くという発見に基づいている。「サブクラスシフト」とは、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比（重量比）が、同一条件の下において、ＵＶ−又はソラレン− 不活性化ウイルスの投与により観察される値と比べて増大することを意味する。観察されるサブクラスシフトは同一条件下での対応する野生型ウイルスにより観察されるものと同様であることが好ましい。本発明は、記載される複製欠陥ヘルペスウイルス突然変異体が、例えば、潜伏感染の危険の減少、局部的複製の減少及び中枢神経系（ＣＮＳ）疾病の危険の減少により特徴付けられる防御的な免疫応答をイン・ビボで誘導するという発見にも基づいている。本発明により、ワクチン又は治療薬として有用なヘルペスウイルス突然変異体は、以下に記載するような、当技術分野で広く知られている諸方法を用いて構築し、試験することができる。このような突然変異体の構築は、４種のヘルペスウイルス、ＨＳＶ−１、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＣＭＶの完全なＤＮＡ配列が知られており（マックゲオチ(McGeoch)ら、J．Gen．Virol.，69，1531（1988）、マックゲオチ(McGeoch)ら、J．Mol．Biol.，181，１(1985)、マックゲオチ(McGeoch)ら、Nucl．Acids Res.，14，1727（1986）、ダビソン(Davison)ら、J．Gen．Virol .，67，1759（1986）、バエル(Baer)ら、Nature，310，207（1984）、チー(Chee )ら、Current Topics in Microbiol．and Immunol.，154，125(1990)）、そして制限酵素地図、部分配列及びその他のヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２、ＨＨＶ− ６及びＨＨＶ−７）中の遺伝子の多くの位置も知られている（フィールズ(Field s)ら、1990 同上）という事実により容易になっている。さらに、ゲノムライブラリーが入手可能であり、多数のヘルペスウイルス特異的遺伝子をコードする大量のプラスミドが入手可能である。一般的には、フィールズら（1990上掲）及びそこに引用されている文献、及びロイズマン(Roizman)ら、The Human Herpes-Virusesレイブンプレス，N.Y．（1993）を参照のこと。例えば、適当な突然変異をコードするＤＮＡを含み、相同組換えを受けるＤＮＡにより挟まれたプラスミドを構築する。このプラスミドを、動物細胞などの細胞に突然変異を挿入しようとするヘルペスウイルスＤＮＡゲノムと共に共トランスフェクトさせる。これらの細胞中でウイルスＤＮＡが複製されるときに、相同組換えのプロセスによりこの親ゲノム内に突然変異が挿入される。子孫ウイルスは、当技術分野で既知の手法を用い突然変異の存在についてスクリーニングされる。例えば、子孫ウイルスは、この突然変異遺伝子の野生型相補性コピーを発現し、ウイルス複製に必須な遺伝子の発現を可能とする細胞株の中でのみ複製し得る能力についてスクリーニングすることができる。これらのウイルスは、例えばサザンブロット・ハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法、特異的ｍＲＮＡ種の発現によりスクリーニングすることもできる。本明細書に用いられる複製欠陥ウイルスは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６及びＨＨＶ−７などのヘルペスウイルスから誘導することができる。ＨＳＶ−１を用いることが好ましい。ウイルスは、複製サイクルを完成するために必要な１種以上の蛋白質をコードする遺伝子もしくは遺伝子群を効果的に突然変異させることにより複製欠陥とすることができる。突然変異は、ノンセンス突然変異（ｎ）、欠失突然変異（ｄ）又は点突然変異（ｐｍ）に分類することができる。特に、ノンセンス突然変異は、突然変異を受けた遺伝子が標的蛋白質の代わりに不活性なもしくは「ノンセンス」な蛋白質をコードするような変異である。欠失突然変異は、標的蛋白質をコードするこの遺伝子又はその一部が欠失している変異である。点突然変異は、それがコードする蛋白質が不活性となるように１種以上のヌクレオチドが置換されているような変異である。ノンセンス突然変異及び／又は欠失突然変異を用いることが好ましい。本発明のヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１のＩＣＰ８及び／又はＩＣＰ２７中に一個以上の突然変異を含んでいることが好ましい。また、他のヘルペスウイルス中の対応する蛋白質を突然変異させることもできる。このような蛋白質はＨＳＶ−１のＩＣＰ８又はＩＣＰ２７に相同的である。好ましい態様においては、ＨＳＶ−１突然変異体はｄ２７、ＨＤ２、ｄ３０１又はｎ５０４Ｒであり、最も好ましくはｄ３０１又はｎ５０４Ｒである。突然変異体ｄ３０１はＩＣＰ８をコードする遺伝子内に欠失突然変異を有している（ガオ(Gao)ら、J．Virol.，63，5258(1989)）。突然変異体ｎ５０４ＲはＩＣＰ２７をコードする遺伝子内にノンセンス突然変異を有している。この突然変異の特徴は以下の実施例で明らかにする。ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７に相同的な蛋白質をコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢＶ、及びヒト以外のウマヘルペスウイルスタイプ１(ダビソン(Davi son)ら、J．Gen．Virol.，67，1759（1986）、バエル(Baer)ら、Nature，310，2 07（1984）、ホルデン(Holden)ら、J．Virol.，66，664(1992))などが挙げられ、そしてＨＳＶ−１のＩＣＰ８に相同的な蛋白質をコードするウイルスとしては、ＶＺＶ、ＥＢＶ及びＣＭＶなどが挙げられる（ダビソン(Davison)ら、J．Gen ．Virol.，67，1759（1986）、バエル(Baer)ら、Nature，310，207（1984）、チー（Chee）ら、Current Topics in Microbiol．and Immunol.，154，125(1990) ）。従って、上述の方法を用いて、ＨＳＶ−１株に対して上記したものに類似の複製欠陥性を有する、ＩＣＰ２７もしくはＩＣＰ８をコードする遺伝子内に突然変異を含む、これらのウイルスの株を作成することが可能である。上に述べたように、ＨＳＶ−２はＤＮＡ配列や蛋白質産物がＨＳＶ−１によりコードされるものと相同的な多くの遺伝子をコードしていることが知られており、この中にはＩＣＰ８又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子も含まれる（フィールズ(Fields)ら、1990上掲）。ＨＳＶ−２蛋白質は、そのＨＳＶ−１蛋白質に極めて類似するという性質を持っている。モース(Morse)ら、J．Virol.，26，389-41 0（1978）、及びマースデン（Marsden）ら、J．Virol.，28，624-642（1978）を参照のこと。従って、ＨＳＶ−２の複製欠陥株はＨＳＶ−１について記載された方法で作成することができる。このような複製欠陥株はＨＳＶ−２に対する防御的免疫応答又は免疫調節効果を誘導するワクチンとして有用である。ＨＳＶ−２突然変異体では、イン・ビボでの形質転換を低減させるべく付加的な安全性を誘導することができる。ＨＳＶ−２ゲノムは、組織培養で細胞を形質転換し得ることが示された二つの異なるＤＮＡ領域を含んでいる。これらの領域はｍｔｒII及びｍｔｒIIIと名付けられ、ＨＳＶ−２ゲノム上のそれらの正確な位置も知られている（ギャロウエイ（Galloway)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．US A，81，4736（1984）、アリ(Ali)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，8257）。ＨＳＶ−２のワクチン株がイン・ビボで細胞を形質転換し得る可能性を消去するために、相同組換えにより、ＤＮＡのこれらの領域を非形質転換性のＨＳＶ− １配列で置換することができる。このような配列の置換は、本明細書に記載した特異的ＨＳＶ−１遺伝子に変更を形成させた際に用いられた手順と類似の手順で達成することができる。本発明の複製欠陥突然変異体は、ＩＣＰ２７又はＩＣＰ８遺伝子又はそれぞれの相同体における突然変異を含むヘルペスウイルスに限定されない。生きており、複製をすることができずそして防御的免疫応答又は免疫調節を誘導することができるウイルス突然変異体はすべて、本発明の範囲に含まれる。例えば、突然変異体が複製できなくなるようにキャプシド蛋白質をコードする遺伝子を突然変異させることは本発明に包含される。ヘルペスウイルスは２個又はそれ以上の突然変異を含むことが有利である。重大なことは、少なくとも１個の突然変異がウイルスを複製欠陥としなければならないことである。ＩＣＰ８及びＩＣＰ２７をコードする２個の遺伝子が両方とも突然変異を受ける場合のように、２個又はそれ以上の突然変異が独立にウイルス複製を欠陥にすることが好ましい。これらのウイルスの例としては、ＩＣＰ２７遺伝子に既に突然変異が存在しているウイルスのゲノム中にＩＣＰ８遺伝子の突然変異が導入された株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。逆に、ＩＣＰ８遺伝子に既に突然変異が存在しているウイルスのゲノム中にＩＣＰ２７遺伝子の突然変異を導入したウイルス株を構築することもできる。このようなウイルス株を複製させるために、野生型のＩＣＰ２７及びＩＣＰ８を両方共発現することができる細胞株を作成する。ヘルペスウイルス遺伝子の１個以上を発現する細胞株を作成する手順は、トランスフェクトされた細胞がトランスフェクション混合物中に含まれる遺伝子のそれぞれを取り込むことを考慮すると、当技術分野で既知のものであり、上述の手順と同様である。一般的には、クインラン(Quinlan)ら、Mol．Cell．Biol．5 ，957-963(1983)を参照のこと。ウイルスワクチンの一般的目標は長期間（一生涯までも）の疾病からの防御を誘導することであり、そして初期副作用も長期副作用も起こさないことである。ワクチンは防御的体液性抗体及び細胞媒介免疫の両方を誘導すべきである。生のウイルスワクチンは、ワクチン投与を受けた者からワクチン投与を受けていない者へ拡散し得ないものであるべきであり、ワクチン投与を受けた者において潜伏感染をすることができないものであるべきである。本明細書に記載した突然変異体ヘルペスウイルスは、一般にこれらの基準を満足する。具体的にいうと、本発明のワクチンは少なくとも以下の特性を持つべきである。本発明のワクチンは生きており、しかもそれらが導入される宿主中で生きた子孫ウイルスを効果的に生産することができないものである。さらにそれらはその宿主中で防御的免疫応答を誘導することができるものであるべきである。（補完的遺伝子もしくは遺伝子群を発現する支持宿主細胞株に由来するもののような外来起源の蛋白質の非存在下においては）複製することができない、従って子孫ウイルスを生産することができないが、防御的免疫応答を誘導するような抗原決定基を発現することができる生きたヘルペスウイルスは本発明に含まれる。防御的な免疫応答の誘導を一般的に担うウイルス特異的産物は、感染細胞内において発現され、そして通常ビリオンの表面に見出される蛋白質及び糖蛋白質である。ヘルペスウイルスの場合には、主要抗原決定基のあるものはウイルスゲノムによりコードされる糖蛋白質である。内因性もしくは異種のヘルペスウイルス又は他の病原体により正常に発現される１種もしくは２種以上の蛋白質もしくは糖蛋白質を発現することができる複製欠陥ヘルペスウイルスのワクチン株を作成することができる。請求項に記載の本発明により、複製欠陥ヘルペスウイルスを投与して対応する野生型ヘルペスウイルスに対する防御的免疫応答もしくは免疫調節効果を誘導することができる。また、複製欠陥ヘルペスウイルスは、さらに既知の手法に従って遺伝子工学的に操作し、対応する異種の野生型病原体に対する防御的免疫応答もしくは免疫調節効果を誘導する異種抗原もしくは免疫原を発現させることができる。抗原もしくは免疫原の異種遺伝子もしくは異種遺伝子群は、上に列挙したものなどの別のヘルペスウイルス又はウイルス、細菌、カビもしくは病原体などの他の感染性実体から誘導することができる。例えば、防御的な免疫応答を誘導することができるＨＳＶ−２特異的糖蛋白質をコードする１種以上の遺伝子は、ＨＳＶ−１ＤＮＡ、例えばＨＳＶ−１チミジンキナーゼＤＮＡ又はより好ましくはグリコプロテインＣのＤＮＡ、又はＩＣＰ８もしくはＩＣＰ２７をコードする遺伝子などのウイルスの感染もしくは複製に必要なＨＳＶ−１ゲノムの他の領域、の約１００〜３００ｂｐをそのいずれかの側に連結することができる。このような突然変異は同時にこのヘルペスウイルスを複製欠陥とし、そして異種蛋白質に対する防御的免疫応答を誘導することになる。チミジンキナーゼ遺伝子の完全なコピーをワクチン株中に保持することは有益である。それはこの遺伝子の産物が多数の抗−ＨＳＶ化合物の活性化に必要であるからである（フィールズ(Fields)ら、1990上掲）。このハイブリッドＤＮＡを、ＩＣＰ８遺伝子もしくはＩＣＰ２７遺伝子の片側もしくは両側に突然変異を含む感染性のＨＳＶ−１特異的ＤＮＡと共に共トランスフェクトする。子孫ウイルスについて、上述の隣接配列(flanking sequence)により決定される特異的ＨＳＶ−１座位中へのＨＳＶ−２遺伝子（単数又は複数）の挿入をスクリーニングする。これらのウイルスの防御的免疫応答誘導能を以下に述べるように評価することができる。これらのウイルスは両ウイルスに特異的な抗原決定基を発現することができるから、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の両方に対し個体を防御する際に有用である。他の態様においては、ＨＳＶ−１糖蛋白質免疫原はサルミエント（Sarmiento ）ら、J．Virol.，29，1159(1979)(“gB”)、コウカー(Coker)ら、J．Virol.，4 7，172-181(1978)(“gD”)、及びデサイ(DeSai)ら、J．Gen．Virol.，69，1147- 1156(1988)(“gH”)により開示されている。これらの糖蛋白質免疫原は突然変異体バックグラウンド、例えば上述のような別のヘルペスウイルスの複製に必要な蛋白質をコードする遺伝子、の中に挿入することができる。上に述べたように、本明細書に記載される複製欠陥ヘルペスウイルスは、哺乳動物にイン・ビボ投与されると、ＩｇＧ２ａの生産レベルの増大、その結果として生のウイルスによって誘導されるものと同様なＩｇＧサブクラスシフトをもたらす。可溶性蛋白質への及び炭水化物へのネズミ抗体の応答は通常それぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ３サブクラスに限定される。多様な生のウイルスでマウスの数株をチャレンジするとＩｇＧ２ａサブクラスの抗体の優先的誘導をもたらすことが報告された。これらの研究は、ウイルス応答の一部しかウイルス特異的抗体から作られていないことを示した。従って、この効果はウイルス誘導免疫調節とみることができる。抗体分子は補体結合能及びＦｃ受容体結合能において異なる。ＩｇＧ２ａサブクラスのＩｇの機能的性質から、ウイルスのオプソニン作用や補体媒介溶解及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）によるウイルス感染細胞の破壊が重要であるウイルス感染に対する防御においてそれらが重要であることが示唆される。それは、マクロファージの誘導や腫瘍細胞のキラー細胞ＡＤＣＣにとって最も効果的なサブクラスでもある。一方、ＩｇＧ１はＡＤＣＣにおいて極めて限定的な活性しか持たない。インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）はＴｈ１サブディビジョンのヘルパーＴ細胞によって生産される。ＩＦＮ−γは多様な細胞型に対しさまざまな効果を有する。それはマクロファージの活性化に重要な役割を果たし、そしてポリクローナルＢ細胞活性化及び分化に影響を与えることも明らかにされた。ＩＦＮ−γは、ＩＬ２中で刺激された活性型のネズミ及びヒトのＢ細胞によるＩｇＧ２ａの生産を促進し、そしてＩｇに対する抗体で処理したヒトＢ細胞を細胞サイクルのＳ相に入れさせる。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、マクロファージから最初に放出されるが、致死的感染に対する防御を含む幾つかの機能においてＩＦＮ−γと相乗効果を発揮することが明らかにされた（リー(Lee)ら、J．Immunol.，133，1083（1984 ）、ストーン−ウオルフ(Stone-Wolff)ら、J．Exp．Med.， 159，828（1984）、ウイリアムス(Williams)ら、J．Immunol.，130，518(1983) ）。いかなる特定の理論にも限定されることなく、生のウイルス又は複製欠陥ウイルスによるＨＳＶ−感染は、Ｔｈ１細胞を優先的に活性化し、それによってＩＦＮ−γや他のサイトカインを分泌する。ＩｇＧ２ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦαやＡＤＣＣの既知の関係に照らせば、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１サブクラスシフトの誘導又はＩＦＮ−γやその他のサイトカインの生産の誘導をすることができる複製欠陥ヘルペスウイルスの投与は、ヘルペス性支質角膜炎などのヘルペスウイルス感染を治療する際に有用である。ストアト(Stoat)ら、J．Immunol.，142，760(198 9)。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１サブクラスシフトの誘導能を示した複製欠陥ヘルペスウイルスは、少なくとも一部のβ遺伝子の転写が生じたウイルスであった。複製欠陥ヘルペスウイルスはＨＳＶ−１の突然変異体であることが好ましい。ＩＣＰ８及び／又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子が突然変異を受け複製欠陥とされたヘルペスウイルスが最も好ましい。この突然変異はノンセンス突然変異又は欠失突然変異であることが好ましい。また、ヘルペスウイルスは、突然変異が少なくとも一部のβ遺伝子の転写を可能とし、かつヘルペスウイルスの複製を欠陥とする遺伝子内に起こるような上述の他のヘルペスウイルスのいずれでもよい。前述のように、ＨＳＶ−１のＩＣＰ８又はＨＳＶ−１のＩＣＰ２７に相同的な蛋白質をコードする遺伝子は、ヘルペスウイルスの複製を欠陥とするように突然変異を与えることが好ましい。一つの態様では、用いられるヘルペスウイルス複製欠陥突然変異体はグリコプロテインＨ（ｇＨ−）又はＩＣＰ４をコードする遺伝子に対する欠失突然変異ではない。請求項に記載の本発明の複製欠陥ヘルペスウイルスがＩｇＧ２ａの生産を増大しその結果Ｉｇサブクラスシフトをもたらす能力を考慮すれば、このヘルペスウイルス突然変異体は哺乳動物におけるヘルペスウイルス感染などの免疫病理学的疾病、殊に好ましくはヘルペス性支質角膜炎又は脳炎の治療のために投与することができる。当技術分野における熟練者は、標準的手順により投与量を最適化することができる。一般的にいえば、ワクチン及び薬理学的組成物を適当な無菌緩衝液中に処方され、そして１０³と１０⁹ＰＦＵ／ｋｇの間の投与量で投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射もしくは皮内注射により）される。この組成物は、当技術分野で知られたビーイクル中で経口投与又は点眼投与(ocular administration)などの免疫調節応答及び／又は防御的免疫応答を誘導するのに適した既知の手段のいずれによっても投与することができる。以下の実施例は本発明を例示するために提供するが、本発明を制限するものではない。当技術分野における熟練者は以下に示す特定の構築が上述の発明と一致し、ワクチン又は免疫調節物質の本質的特性を保持しながら、無数の仕方で変更することができることを理解するであろう。実施例ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子に突然変異をコードするウイルスの構築と特性決定細胞、ウイルス、感染及びトランスフェクション。ウイルスによる細胞の感染及びＤＮＡによる細胞のトランスフェクションはベロ（Ｖｅｒｏ）細胞又はＶ２７細胞で行われた。ベロ細胞はアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション，ロックビル，Ｍｄ．から入手した。Ｖ２７細胞の誘導は以下に記す。ＨＳＶ− １の野生型株、ＫＯＳ１．１を用いた。細胞を細胞当たり１０ｐｆｕの多重度で感染させた。ジソジウムホスホノ酢酸（ＰＡＡ）（アボットラボラトリース、ノースシカゴ，ＩＬ）を以下に示すように４００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。マーカー移転実験におけるウイルスＤＮＡによる細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈澱法を用いＶ２７細胞中で行われた（ライス（Ri ce）ら、J．Virol.，62，3814(1988)）。Ｖ２７細胞株は、ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７遺伝子の安定に組み込まれたコピーを含むが、以下のようにして単離された。ベロ細胞の直径１００ｍｍプレート準コンフルエント培養を、薬物Ｇ４１８に対する耐性を付与するプラスミドであるｐＳＶ２ｎｅｏ（サザン(Southern)ら、J．Mol．Appl．Genet.，1，327(1982)) の０．８μｇ、及びＨＳＶ−１のＩＣＰ２７をコードするプラスミドであるｐＢＨ２７（ライス(Rice)ら、J．Virol.，62，3814(1988)）の４又は１０μｇのいずれかと共にトランスフェクトした。２日後に細胞をｍｌ当たりＧ４１８の６００μｇを含む培地中に１：９の比で継代した。Ｇ４１８−耐性コロニーを２〜４週間後に単離し、大量培養で生育させた。この細胞株を、非許容性温度でＩＣＰ２７突然変異体ｔｓＹ４６(サックス(Sa cks)ら、J．Virol.，55，796(1985))及びｔｓＬＧ４（サンドリ−ゴルディン(Sa ndri-Goldin)ら、J．Virol.，38，41(1981)）のプラーク形成支持能力に基づくＩＣＰ２７の発現について試験した。１７個の単離体のうち６個がこの試験で陽性を示した。これらの細胞株の一つをＶ２７と命名し、ＩＣＰ２７突然変異体の単離に用いた。サザンブロット分析によれば、Ｖ２７細胞はハプロイドゲノム当量当たりＩＣＰ２７遺伝子を約１コピー含むことが明らかとなった。ＨＳＶ−１のＩＣＰ２７突然変異体の形成。ＩＣＰ２７はＨＳＶ−１の複製の必須の遺伝子であるから(サックス(Sacks)ら、J．Virol.，55，796(1985))、ＩＣＰ２７に突然変異を含むウイルスは無表現型を持っている。Ｖ２７細胞は、従って、このような突然変異体を増殖させるために用いられた。ＨＳＶ−１染色体への大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の挿入は、ウイルス突然変異体の単離のための有用な道具である(カルミカエル(Carmichael)ら、J．Virol.，63， 591（1989）、ゴールドシュタイン(Goldstein)ら、J．Virol.，62，196(1988)) 。ｌａｃＺ遺伝子の産物であるβ−ガラクトシダーゼを発現するウイルスプラークは、β−ガラクトシダーゼの発色性基質であるＸ−ｇａｌの存在下にその発色（青色）に基づいて同定することができる。以下に詳細に述べるように、β− ガラクトシダーゼを発現するＨＳＶ−１突然変異体をまず単離した。これはＩＣＰ２７コード配列中にｌａｃＺ遺伝子の枠内挿入(in-frame insertion)を含んでいる。このウイルスを、次いで、ウイルスゲノム中へ特異的突然変異を受けたＩＣＰ２７対立遺伝子の導入を目的とするマーカー移転実験において受容体として役立った。新たに導入されたＩＣＰ２７遺伝子を含む組換え体は親の青いプラークのバックグラウンドに対して澄明なプラークとして同定された。ＨＳＶ−１のｌａｃＺ挿入突然変異体を作成するために、ｌａｃＺコード領域がＩＣＰ２７遺伝子の欠失体中に挿入された組換えプラスミドを構築した。それから、この融合遺伝子を、感染性ＨＳＶ−１のＤＮＡと共にＶ２７細胞中に共トランスフェクトした。このトランスフェクト培養から得られた子孫ウイルスをＸ −ｇａｌの存在下にＶ２７細胞上にプレート培養すると、プラークの約３％が青色であった。青色のプラークを釣り、得られたウイルスクローンをｄ２７−ｌａｃＺ１と命名した。サザンブロット分析により、ｄ２７−ｌａｃＺ１はＷＴ−ＩＣＰ２７遺伝子をＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子で置換したものと一致するゲノム構造を持つことが明らかとなった（図４Ａ）。さらに、ｄ２７−ｌａｃＺ１ −感染細胞はＷＴ−ＩＣＰ２７を発現せず、その代わりにＩＣＰ２７−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質に対して予想されるサイズと一致する、約１３７ｋＤａのポリペプチドを発現した。ｄ２７−ｌａｃＺ１貯蔵ウイルスは、ベロ細胞上ではプラークを形成することができなかった（＜２×１０³pf u/ml）が、Ｖ２７細胞上では効率的にプラークを形成することができた（２×１０⁸pfu/ml）。ｄ２７−ｌａｃＺ１の単離のための実験上の詳細は以下に記載する。プラスミドｐＰｓ２７ｐｄ１（ライス(Rice)ら、J．Virol.，63，3399(1989) ）は、ＨＳＶ−１ゲノムＤＮＡ由来の６．１キロベース（ｋｂ）ＰｓｔＩ挿入物を含んでいる。この断片はＩＣＰ２７遺伝子の全体と隣接配列を含む（図４Ａ）。ＩＣＰ２７遺伝子内の欠失とｌａｃＺ遺伝子の挿入を含むｐＰｓ２７ｐｄ１誘導体を次のようにして構築した。ｐＰｓ２７ｐｄ１をＳａｌＩで消化することによりＩＣＰ２７コード領域内で線状化した。ついで、このＤＮＡをＢａｌ３１で処理して約０．５ｋｂのＤＮＡを両端から除去した。この末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて充填反応により修復した（アウスベル(Ausub el)ら、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NY(1 987)）。このＤＮＡをＢｇｌIIリンカー（ニューイングランド・バイオラボズ・インク，ビーバリー，マサチューセッツ）に連結し、得られた産物をＢｇｌIIで消化し、再度連結し、そして大腸菌の形質転換に使用した。４個の単離プラスミドを得た。これらは、それぞれＩＣＰ２７遺伝子と同じ向きに挿入されたｌａｃＺ遺伝子を含んでいた。４個のプラスミドＤＮＡをそれぞれＰｓｔＩで消化し、それぞれＷＴのＨＳＶ −１ＤＮＡと混合し、そしてＶ２７細胞中にトランスフェクトした。４日後に培養物を収穫し、得られた貯蔵ウイルスをＶ２７細胞上にプレートし、１％新生子ウシ血清及び０．１％ヒト免疫グロブリンを含む培地１９９（ギブコラボラトリース，グランドアイランド，Ｎ．Ｙ．）の液を重層して培養した。２日後に、この培地を、１％新生子ウシ血清、０．５％アガロース、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルス，インディアナポリス，Ｉｎｄ．）３００μｇ／ｍｌを含む培地１９９で置換した。その結果得られた４種の貯蔵ウイルスの一つが高いパーセント（約３％）で青色のプラークを生じた。青色プラークの一つを３回精製し、得られたウイルスクローンをｄ２７−ｌａｃＺ１と命名した。ｄ２７−ｌａｃＺ１・ＤＮＡのサザンブロット分析により、ＷＴ−ＩＣＰ２７遺伝子がＩＣＰ２７−ｌａｃＺ融合遺伝子で置換されたことが明らかとなった（図４Ａ）。さらに、ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析及び親プラスミド（ｐＰｓｄ２７−ｌａｃＺ１と命名したもの）の制限分析により、約０．８ｋｂがｄ２７ −ｌａｃＺ１内でＩＣＰ２７遺伝子から欠失したことが明らかとなった。ＩＣＰ２７遺伝子内の欠失突然変異又はノンセンス突然変異を含むＨＳＶ−１突然変異体の構築。クニーペ(Knipe)ら、J．Virol.，63，3400及びその後の文献に一般的に記載されているようにして、ＩＣＰ２７遺伝子に欠失又はノンセンスコドン挿入を含む５個のプラスミドを作成した。図４Ｂを参照。各プラスミド中のウイルスＤＮＡ挿入物をベクター配列から分離し、ｄ２７−ｌａｃＺ１ＤＮＡと共にＶ２７細胞中へ共トランスフェクトした。得られた子孫ウイルスをＸ−ｇａｌの存在下にＶ２７細胞上にプレート培養し、そして一部（約１〜５％）が澄明なプラークを形成した。澄明なプラークを形成したウイルスを単離し、そして新たに導入したＩＣＰ２７対立遺伝子の存在について以下に述べるような免疫蛍光試験又はＤＮＡ制限分析によりスクリーニングした。突然変異体のそれぞれについて、１個の陽性プラークを３回精製した。可能性のあるＩＣＰ２７欠失突然変異体をｄ２７−１と命名した。可能性のあるノンセンス突然変異体をｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ及びｎ５０４Ｒと命名した。突然変異体の名前中の数字は各切断蛋白質中に存在すると予想されるアミノ末端ＩＣＰ２７残基の数に相当する。比較のためにいうと、野生型蛋白質は５１２アミノ酸残基から成る。組換えウイルスゲノムは、サザンブロットハイブリダイゼーションよりその特性が明らかにされ、各ウイルスが適当な突然変異を含むことが確認された。ウイルスＤＮＡを感染したＶ２７細胞から単離し、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩ制限酵素パターンをサザンブロットで検討した。野生型ＩＣＰ２７遺伝子を含む６．１ｋｂのＰｓｔＩ・ＨＳＶ−１・ＤＮＡ断片をプローブとして用いた。この断片はＨＳＶ−１ゲノムのＬ成分中の繰り返し配列を一部含むので（図４Ａ）、野生型ＨＳＶ−１・ＤＮＡを試験すると２個の明瞭なバンドが得られた。これらは６．１ｋｂＩＣＰ２７断片と他のＵ_L−Ｒ_L結合に由来する３．３ｋｂ断片であった。対照的に、５個のＩＣＰ２７突然変異体ＤＮＡはすべて、６．１ｋｂ断片を欠いていたが、３．３ｋｂ断片は含んでいた。突然変異体ｄ２７−１は、予想された１．６ｋｂの欠失と一致して、約４．６ｋｂの新たなＤＮＡ断片を含んでいた。４個の残りの突然変異体は、それぞれ二つの新たなバンドを含んでいた。これらの合わせたサイズは６．１ｋｂに近く、各突然変異体ゲノムの適当な位置におけるＸｂａＩ部位の挿入と一致した。さらに、突然変異体ゲノムは、いずれも親のｄ２７−ｌａｃＺ１のＤＮＡにのみ存在すべき８．４ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいなかった。プラーク試験は、突然変異体がベロ細胞中で増殖することができるか否かを決定するために行われた。５個の突然変異体はすべて、試験することができた最低希釈において（これより低い希釈は細胞の単層を破壊した）、ベロ細胞上でプラークを形成することができなかった（表１）。しかしながら、突然変異体はすべてＶ２７細胞上で効率的にプラークを形成した。Ｖ２７ゲノム中に存在することが知られた完全なＨＳＶ−１遺伝子はＩＣＰ２７遺伝子の野生型コピーのみであるから、これらの結果は、各突然変異体の致死的欠陥がＩＣＰ２７のこの野生型によりトランスにおいて相補されていることを示すものである。これらの突然変異体の単離の実験上の詳細は以下に述べる。ＩＣＰ２７遺伝子の欠失突然変異及びノンセンス突然変異は、遺伝子工学的にプラスミドｐＰｓ２７ｐｄｌ中に導入された（図４Ｂ）。４０６Ｒ突然変異及び５０４Ｒ突然変異を含むプラスミド、それぞれｐＰｓ−４０６Ｒ及びｐＰｓ−５０４Ｒは、ライス(Rice)ら、J．Virol.，63，3399(1989)の記載のように構築した。プラスミドｐＰｓｄ２７−１はｐＰｓ２７ｐｄｌをＢａｍＨＩとＳｔｕＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で３’−凹んだＢａｍＨＩＤＮＡ末端を充填し、ＤＮＡライゲースで大きなＤＮＡ断片を再環状化することにより構築した。プラスミドｐＰｓ−５９Ｒ及びｐＰｓ−２６３Ｒは、上に記載したプラスミドｐＢＨ−５９Ｒ及びｐＢＨ−２６３Ｒ由来の突然変異体２．４ｋｂＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片をそれぞれｐＰｓ２７ｐｄｌのＷＴ２．４ｋｂＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片と置換することにより構築した。組換えウイルスは、次のように構築した。上記のプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、それぞれｄ２７−ｌａｃＺ１ウイルスＤＮＡと混合し、そしてＶ２７細胞中にトランスフェクトした。子孫ウイルスを３〜５日後に収穫し、上記のようにＸ−ｇａｌの存在下にＶ２７細胞上でプレート培養を行った。澄明なプラークが０．５〜５％の頻度で観察された。これを釣り、これらがＩＣＰ２７遺伝子の突然変異を獲得したか否かを決定するスクリーニングを行った。単離したプラークを二つの方法でスクリーニングした。単離プラークｄ２７− １、ｎ５９Ｒ、及びｎ２６３ＲをＶ２７細胞中で３回精製し、ついでＶ２７細胞を感染させるために使用した。粗ウイルスＤＮＡをこの感染細胞から調製した（ガオ(Gao)ら、J．Virol.，63，5258(1989)）。各突然変異が存在することを確認するために、ＤＮＡ試料それぞれのＸｂａｌ及びＢａｍＨＩ制限酵素パターンを検討した。ｎ４０６Ｒ及びｎ５０４Ｒの場合は、最初のプラーク単離物を少量のウイルスストックの調製に使用した。ついで、カバーグラス上に生育させたベロ細胞を各ウイルスで感染させた。感染細胞を固定し、抗ＩＣＰ２７モノクローナル抗体を用いて免疫蛍光法用に染色した(アカーマン(Ackerman)ら、J．Virol.， 52，108(1984))。ｎ４０６Ｒ及びｎ５０４Ｒの単離物を、ついで、さらに２回プラーク精製し、各突然変異体の大量ストックをＶ２７細胞中で調製した。突然変異を受けたＩＣＰ２７ポリペプチドの発現と細胞内局在。次に、突然変異体をＩＣＰ２７−関連ポリペプチドの発現について検討した。ベロ細胞をモック感染又は各ウイルスで感染させ、感染後１０時間目に細胞抽出物を調製した。蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースへ移し、そしてモノクローナル抗体Ｈ１１１３と反応させた。モック感染細胞、ｄ２７−１感染細胞又はｎ５９Ｒ感染細胞の抽出物には、ＩＣＰ２７−関連ポリペプチドは検出されなかった。ｎ２６３−感染細胞の抽出物には、約３８ｋＤａ蛋白質が検出され、ｎ４０６−感染細胞の抽出物には約５２ｋＤａの蛋白質が検出された。ｎ５０４Ｒで感染させた細胞は６３ｋＤａの野生型蛋白質と同じ移動度を示すＩＣＰ２７− 関連ポリペプチドを産生した。切断された蛋白質のサイズはＩＣＰ２７遺伝子のＤＮＡ配列(マックゲオチ(McGeoch)ら、J．Gen．Virol.，69，1531(1988))から予想されるサイズとラフな一致を示した。ウイルスゲノム上で発現した突然変異体蛋白質の細胞内分布を調べるために、各突然変異体で感染させたベロ細胞を、感染後４時間目に収穫し、固定し、モノクローナル抗体Ｈｌ１１３を用い免疫蛍光顕微鏡用に処理した。野生型ウイルスで感染させた細胞は１箇所又は数箇所がより強く染色される局在化した核染色を示した。これらの箇所は核小体などのいかなる特定の核領域にも対応しなかった。ｄ２７−１又はｎ５９Ｒで感染させた細胞ではバックグラウンドレベル以上の染色は検出されなかった。ｎ２６３Ｒで感染させた細胞は核染色を示し、核のある箇所はより強く染色されており、ウイルス感染細胞に類似していた。これらの箇所は核小体に対応しているようであった。ｎ４０６Ｒで感染させた細胞も核染色を示したが、染色のパターンは二つの面で野生型ウイルス感染細胞とは異なっていた。第１に、多くの細胞で、ＩＣＰ２７蛋白質をコードしたｎ４０６Ｒは大部分が核小体の領域から排除されていた。第２に、多くのｎ４０６Ｒ感染細胞は、かなり小さな斑点のある染色パターンを示したが、突然変異体蛋白質は核中の球状の塊中に濃縮されていた。ｎ５０４Ｒで感染させた細胞も核染色を示したが、この場合には、野生型ウイルス感染細胞に見られるものよりもより拡散したパターンを示し、蛋白質は核全体に存在しているように見えた。これらの結果は、ｎ２６３Ｒ、ｎ４０６Ｒ及びｎ５０４ＲによりコードされているＩＣＰ２７の突然変異型は細胞核に効率的に局在していたが、それらの核内蓄積のパターンにおいて相互に異なっており、また野生型ウイルスのパターンとも異なっていた。ＩＣＰ２７突然変異体で感染させた細胞におけるウイルスＤＮＡの合成。ウイルスＤＮＡ複製に関するＩＣＰ２７突然変異体の表現型を次に決定した。各突然変異体のウイルスＤＮＡ合成表現型を決定するために、ベロ細胞をモック感染又は突然変異体のそれぞれで感染させた。１時間の吸着期間の後、単層を温かい培地で十分に洗って非吸着ウイルスを除去した。感染後１時間又は１６時間に、チャルベルグ(Challberg)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，9094（1986 ）の方法で総ＤＮＡを調製した。精製ＤＮＡを２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収により定量した。ＤＮＡを希釈し、１００ｍＭの水酸化ナトリウム中、室温で３０分間変性させた。等容量の１２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を添加し、そしてこのＤＮＡを、スロット−ブロット・マニフォールド（シュライヒェル＆シュエル、キーン，Ｎ．Ｈ．）を用いてニトロセルロースフィルターに移した。このフィルターをベークし、ＤＮＡをランダム・プライマー・ラベリング法により調製した³²Ｐ標識ＨＳＶ−１特異的プローブにハイブリダイズさせた。プローブは、ＩＣＰＯ遺伝子（ナベル(Nabel)ら、1998 ,上掲）を含むｐＳＨＺ又はＶｍｗ６５の遺伝子(マックナイト(McKnight)ら、Cancer Cells，4，163(1986))を含むｐＲＢ３４４１のいずれかを含んでいる。ＨＳＶ−１突然変異体であるｄ１０２はＩＣＰ８遺伝子に大きな欠失を含み、従ってそのＤＮＡを複製することができないが（ガオ(Gao) ら、J．Virol.，63，5258(1989)）、これらの実験ではネガティブコントロールとして含めた。ウイルスＤＮＡは野生型ウイルス感染細胞では高レベルに複製された。対照的に、ｄ１０２感染細胞ではウイルスＤＮＡ複製の証拠は検出できなかった。５個のＩＣＰ２７突然変異体はすべて、感染の過程の間にウイルスＤＮＡを複製することができた。これらの結果を定量化するために、各スロットにハイブリダイズする放射能の量をシンチレーションカウンターにより測定し、そのデータを表２に要約する。これらの結果によると、突然変異体はＤＮＡ複製に関して二つの表現型クラスに分けることができる。第１のクラスはｄ２７−１、ｎ５９Ｒ、ｎ２６３Ｒ、及びｎ４０６Ｒを含み、ウイルスＤＮＡ増幅に部分的欠陥を示した（野生型のレベルの６〜３８％）。第二のクラスはｎ５０４Ｒのみからなり、ウイルスＤＮＡ複製の野生型表現型を示した。これらの実験は感染細胞におけるウイルスＤＮＡ蓄積のレベル、すなわちＤＮＡ合成の速度並びに複製ＤＮＡの安定性により決定される量を測定したものであることに注意することが重要である。ＩＣＰ２７突然変異体感染細胞のウイルス蛋白質合成のパターン。ウイルス遺伝子の発現る対するＩＰＣ２７遺伝子における突然変異の影響を分析するため、突然変異体感染細胞のウイルス蛋白質合成を検討した。モック感染又はＨＳＶ−１感染ベロ細胞を、感染後３、６、又は９時間目に培地の１５μＣｉ〔³⁵Ｓ〕−メチオニン／ｍｌで標識した。蛋白質を細胞から抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてオートラジオグラフィーで可視化した。感染後３及び６時間に、ｎ４０６Ｒを例外として、ＩＣＰ２７突然変異体は定性的には野生型ウイルス感染細胞のパターンと類似の蛋白質合成パターンを示した。ｎ４０６Ｒで感染させた細胞はＩＣＰ６、ＩＣＰ８、及びｇＢ（ｐｇＢ）の前駆体などの幾つかの蛋白質を欠いているように見えた。しかしながら、感染後９時間目においては、５個のＩＣＰ２７突然変異体で感染させた細胞はすべて、野生型ウイルスと比較するとウイルス蛋白質合成において定量的にも定性的にも差異を示した。５個の突然変異体は、感染後９時間目におけるウイルス蛋白質合成に関して４種の表現型クラスに分けることができる。突然変異体ｄ２７−１及びｎ５９Ｒは、それらの蛋白質合成のパターンからは相互に区別し得ないことについては再現性がある。これらの突然変異体は両者とも、感染後９時間目において、ほとんどのβ−蛋白質を高レベルで発現したが、ＩＣＰ５及びＩＣＰ２５などの幾つかのγ−１蛋白質を（野生型のレベルに比して）より低レベルでしか発現しなかった。突然変異体ｎ２６３Ｒは９時間目において、ｄ２７−１及びｎ５９Ｒのそれと極めて類似する蛋白質合成パターンを示したが、この突然変異体は幾つかのγ−１蛋白質については少し多く発現した。突然変異体ｎ４０６Ｒは、この突然変異体で感染された細胞でＩＣＰ６、ＩＣＰ８、及びｐｇＢなどの多くのウイルス蛋白質が著しく低いレベルでしか検出されなかったという点でウイルス蛋白質合成に関し異常な表現型を持っていた。ｄ２７−１感染細胞と比べて感染後９時間目において、γ−１蛋白質、ＩＣＰ５及びＩＣＰ２５のより高いレベルが検出されたので、この効果はすべてのウイルス蛋白質には及ばなかった。突然変異体ｎ５０４Ｒは、ＩＣＰ１／２やＩＣＰ１５などのβ蛋白質及びγ−１蛋白質の高レベルを発現した。野生型ウイルス感染細胞の感染後９時間目では、α蛋白質であるＩＣＰ４及びＩＣＰ２７の発現は顕著に低下した。細胞を５個のＩＣＰ２７突然変異体のいずれかで感染させた場合はこうではなかった。さらに、ｎ５０４Ｒ感染細胞はＩＣＰ２７ポリペプチドの発現を止めることに失敗した（その他の突然変異体はいずれもＷＴ−ＩＣＰ２７と同じ移動度を示す蛋白質をコードしていないので、これがＩＣＰ２７蛋白質合成速度を直接比較できた唯一のケースであった）。ｎ４０６Ｒを例外として、ＩＣＰ２７突然変異体もＩＣＰ６やＩＣＰ８などの多くのβ 蛋白質の発現を負に調節する能力に欠陥を示した。これらの結果は、ＩＣＰ２７がα遺伝子及びβ遺伝子の発現に対し負の調節効果を有することを示唆する。突然変異体ウイルスで感染させた細胞で観察されるウイルス蛋白質合成における欠陥は、野生型の蛋白質の発現により補正され得るか否かを決定するために、以下の実験を行った。ベロ細胞又はＶ２７細胞を野生型ウイルスで又は突然変異体の一つで並行して感染させた。感染細胞の蛋白質を感染後１５時間目に〔³⁵Ｓ〕−メチオニンで標識し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで分析した。ベロ細胞中で感染後１５時間目に観察された突然変異体それぞれの蛋白質発現パターンは、感染後９時間目の上記のパターンに類似していた。しかしながら、Ｖ２７細胞を各突然変異体で感染させたときの蛋白質合成のパターンは、野生型ウイルスのパターンに一層類似することが明らかであった。ＩＣＰ２７突然変異体ウイルスを感染させた細胞におけるウイルスｍＲＮＡの蓄積。突然変異体で感染させた細胞において発現されたウイルスｍＲＮＡの定常状態レベルを、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。各突然変異体で感染させた細胞を、ノニデット(Nonidet)Ｐ−４０で処理し、ついでフェノール−クロロホルムで抽出することにより、感染細胞からＲＮＡを単離した。それをエタノール中で沈澱させ（クレシッグ(Klessig)ら、J．Virol.，16，18 50(1975)）、緩衝液に懸濁し、ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼＩ（ベテスダリサーチラボラトリース、ガイテルスブルグ、Ｍｄ．）で消化し、フェノールークロロホルムで抽出し、次いでエタノール中で再沈澱させた。各ＲＮＡの１０μ ｇを変性ホルムアルデヒド−アガロースゲルによる電気泳動に付した（サムブルック(Sambrook)ら、上掲）。電気泳動の後に、このＲＮＡをジーンスクリーンフィルター(GeneScreen filters)（デュポン、ＮＥＮリサーチプロダクツ、ボストン、ＭＡ）に移した。ついで、このＲＮＡの³²Ｐ標識プローブへのハイブリダイゼーションを行った（ライス(Rice)ら、J．Virol.，49，35(1984)）。このプローブはｐＢＨ２７（ＩＣＰ遺伝子をコードしている（ライス(Rice)ら、上掲））、ｐＫ１−２（ＩＣＰ４遺伝子をコードしている(デルカ(DeLuca)ら、Nucl．A cids Res.，15，3391(1987))、及びｐＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−Ｉ−Ｉ（ｇＣ遺伝子をコードしている（フリンク(Frink)ら、J．Virol.，45，634(1983)）を含んでいた。オートラジオグラムをウルトラスキャン・レーザー・デンシトメーター及びオンライン・インテグレーターでデンシトメトリックに分析した（ＬＫＢインストルメンツ，インク、ロックビル、Ｍｄ）。具体的にいうと、ＲＮＡを、モック感染させた細胞、野生型ウイルスで感染させた細胞又は突然変異体ｎ５９Ｒ、ｄ２７−１、もしくはｎ５０４Ｒで感染させた細胞から抽出した。野生型ウイルス感染は、ＨＳＶ−１のウイルスＤＮＡ合成の特異的阻害剤である、ＰＡＡの存在下又は非存在下に行った。細胞質ＲＮＡを感染後９時間目に感染細胞から単離した。ノーザンブロット移行の後、フィルターをＩＣＰ２７−ｍＲＮＡ、ＩＣＰ４−ｍＲＮＡ又はｇＣ− ｍＲＮＡに特異的な放射標識ＤＮＡをプローブとして処理した。モック感染細胞又はｄ２７−１感染細胞では、ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡは検出されなかった。ｎ５９Ｒ又はｎ５０４Ｒで感染させた細胞から単離したＲＮＡは、野生型ウイルス感染細胞から得られたＲＮＡよりも２倍から３倍多い２．０ｋｂのＩＣＰ２７ｍＲＮＡを含んでいた。この結果は、ｎ５０４Ｒ感染細胞の感染後９時間目に観察されたＩＣＰ２７蛋白質合成のレベルの上昇と定性的に一致した。ＩＣＰ２７特異的ｍＲＮＡで得られた結果と対照的に、ＩＣＰ４のｍＲＮＡは、ｄ２７−１−感染細胞、ｎ５９Ｒ−感染細胞、及び野生型ウイルス−感染細胞では、ほぼ等量観察されたが、ｎ５０４Ｒ−感染細胞は野生型ウイルス感染細胞が蓄積するよりも僅か１．６倍多く蓄積した。これらの結果は、やや予想外であった。なぜなら、野生型ウイルス感染細胞では、感染後９時間目においてＩＣＰ４蛋白質はほとんど又は全く検出されなかったからである。ＩＣＰ４の合成は、ＩＣＰ２７突然変異体で感染させた細胞中で容易に検出された。従って、感染後９時間におけるＩＣＰ４の発現レベルは細胞質ＩＣＰ４転写物のレベルを反映していない。このことは、ＩＣＰ４のｍＲＮＡが、ＩＣＰ２７突然変異体で感染させた細胞では、野生型ウイルスで感染させた細胞におけるよりもより効率的に翻訳されることを示唆する。ｇＣをコードするγ−２遺伝子に特異的なｍＲＮＡの蓄積を、突然変異体で感染させた細胞について検討した。ウイルスＤＮＡ複製をＰＡＡにより阻害すると、野生型ウイルスで感染させた細胞内に蓄積するｇＣ−ｍＲＮＡの量が顕著に低下した（ｇＣのｍＲＮＡは、オートラジオグラムをより長時間露光させるとレーン１’で検出することができる）。ｄ２７−１−感染細胞、ｎ５９Ｒ−感染細胞、ｎ５０４Ｒ−感染細胞のいずれも、検出可能なレベルのｇＣ−ｍＲＮＡを発現しなかった。このことは、突然変異体ｎ５０４Ｒの場合には、それが感染の間にＷＴレベルのＤＮＡを複製したのであるから、特に興味深い。γ−２遺伝子の発現は、ウイルスＤＮＡ及びウイルスにコードされた作用因子(transacting facto r)、すなわちＩＣＰ２７の両者を必要とする。ＨＳＶ−１のＩＣＰ８遺伝子における突然変異体の構築とその特性決定ＩＣＰ８を発現する細胞株の単離。ベロ細胞を、主としてデルカ(DeLuca)らの方法(デルカら、J．Virol.，56，558(1985))に従って、プラスミドｐＳＧ１８− ＳａｃＩ(リー(Lee)ら、J．Virol.，46，909（1983）、クインラン(Quinlan)ら、Mol．Cell．Biol.，5，957(1985))又はｐ８Ｂ−Ｓ( ガオ(Gao)ら、Virology，163，319(1988))及びｐＳＶｎｅｏ(サザン(Southern) ら、J．Mol．Appl．Genet.，1，327(1988))で形質転換した。抗生物質Ｇ４１８を含む培地に生育させた後、薬剤耐性なコロニーを２１個単離し、増幅させ、そしてＩＣＰ８突然変異体ｔｓ１３、ｔｓ１８及びｔｓＨＡ１（コンレイ(Conley) ら、J．Virol.，37，413（1981）、ホランド(Holland)ら、J．Virol.，49.947(1 984)）の生育を補完するそれらの能力についてスクリーニングした。非許容温度で、これらのｔｓ突然変異体は、ＩＣＰ８遺伝子を受け取っている培養から誘導された２１個の細胞株のうちの７個においてプラークを形成したが、ｐＳＶ２ｎｅｏのみで形質転換した細胞から誘導されたＮｅｏ^r細胞中ではプラークを形成しなかった。それぞれプラスミドｐ８Ｂ−Ｓ及びｐＳＧ１８−ＳａｃＩで形質転換した細胞から誘導した細胞株Ｂ１０及びＳ２は、最も高いレベルの補完を示したので、以後の研究にはこれらを選んだ（表３）。野生型ウイルスはＮｅｏ^r細胞でも、Ｂ１０及びＳ２細胞でも両方の温度でプラークを形成した。突然変異体ウイルスｔｓ１３、ｔｓ１８及びｔｓＨＡ１はＮｅｏ^r細胞では３３．５℃でのみ効率的にプラークを形成したが、Ｂ１０及びＳ２細胞では両方の温度で野生型のそれと同等の効率でプラークを形成した。サザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、これらの細胞株におけるＩＣＰ８遺伝子コピー数を測定した。そしてＢ１０及びＳ２細胞は、それぞれハプロイドゲノム当たり約１コピー及び１０コピーを含んでいた。プラスミド。プラスミドｐ８−Ｓ、ｐＳＶ８及びｐｍ１並びにそれらのヌクレオチドのナンバリングシステムは文献に記載されている(ガオ(Gao)ら、Virology， 163，319（1988）、すー(Su)ら、J．Virol.，61，615(1987))。プラスミドｐ８Ｂ−Ｓは５．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片（マップユニット０．３７４− ０．４１１）をクローニングし、ｐＵＣ１８にＩＣＰ８プロモーターを含めることにより構築することができる。プラスミドｐＳＶ８は、サルウイルス４０初期プロモーターの下流に５．５ｋｂＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（マップユニット０．３７４−０．４０９）を挿入することにより構築された。プラスミドｐｍ１は、グリシンではなくシステインをコードするようにＩＣＰ８遺伝子のコドン４９９及び５０２を変えることによりプラスミドｐＳＶ８から誘導された。本研究に用いられた突然変異体ＩＣＰ８プラスミドは、５．５ｋｂＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片が（マップユニット０．３７４−０．４０９）ｐＵＣ１９又はｐＳＰ６４中にそれぞれ挿入されたｐＩＣＰ８又はｐＳＰＩＣＰ８から誘導された。プラスミドｐｎ１０及びｐｎ２は、プラスミドｓｐＩＣＰ８を線状化し（ＳｍａＩで部分消化することにより達成された）、そしてそれに続き、それぞれヌクレオチド４０８４及び３６９５に３種の読み取り枠のすべてに終止コドンを含む１４ヌクレオチドＸｂａＩリンカー（ガオ(Gao)ら、1988上掲、ニューイングランド・バイオラボス・インク，ビーバリ，ＭＡ）を挿入することにより作成された。従って、ｐｎ１０は、ＩＣＰ８の最初の１，１６０個のアミノ酸残基をコードし、そしてｐｎ２はＩＣＰ８の最初の１，０２９個のアミノ酸残基とＸｂａＩリンカー配列がコードする４個の付加的なアミノ酸をコードする。図５を見よ。プラスミドｐｄ３０１は２，００１塩基対（ｂｐ）ＮｏｔＩ断片（ヌクレオチド１３９５−３３９６）の内部枠内欠失により作成された。プラスミドｐｄ１０１及びｐｄ１０２は次のようにして構築された。プラスミドｐＳＰＩＣＰ８をＳｍａＩで部分消化して線状化し、そして１２ヌクレオチドのＢｇｌIIリンカー（ガオ(Gso)ら、1988、上掲）をそれに連結した。ＢｇｌIIで消化（ヌクレオチド６５２のＳｍａＩ部位から変換した）及びＢａｍＨＩ（ヌクレオチド２２９４）で消化することにより、１，６４２ｂｐを欠失させ、プラスミドｐｄ１０１を作成した。従って、ｐｄ１０１は１７〜５６３残基のコドンを欠いているが、ＢｇｌIIリンカー配列によりコードされる１個のＡｒｇコドンの挿入を有している。ＢｇｌIIで消化（ヌクレオチド６５２と１８４０のＳｍａＩから変換）することにより、１，１８８ｂｐを欠失させ、プラスミドｐｄ１０２を作成した。従って、ｐｄ１０２はＩＣＰ８コード配列の残基１７−４１１のコドンを欠いているが、ＢｇｌIIリンカー配列の３個の付加的アミノ酸、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコードしている。ｐｄ１０１とｐｄ１０２の両プラスミドともＩＣＰ８ポリ（Ａ）シグナルの下流の、ヌクレオチド４４１９に１４ヌクレオチドＸｂａＩリンカーを含んでいる。ヌクレオチド４０８４及び１８４０の付近には他のＳｍａＩ部位があるから、ｐｎ１０とｐｄ１０２は両方とも正確な突然変異部位を決定するために配列決定がなされた。図５を見よ。突然変異体ウイルスの構築。ＩＣＰ８の機能的ドメインを検討するため、ＩＣＰ８遺伝子のコード領域中に幾つかの異なる型の突然変異を導入した（図１２）。（ｉ）ノンセンス突然変異（ｐｎ１０及びｐｎ２）、（ii）内部欠失（ｐｄ３０１、ｐｄ１０１、及びｐｄ１０２）、そして(iii)部位特異的突然変異（ｐｍ１）(ガオ(Gao)ら、Virology，163，319(1988))。マーカー移転の後の組換えウイルススクリーニングを容易にするため、ＩＣＰ８コード領域中に挿入されたｌａｃＺ遺伝子を含む突然変異体ウイルスを、ＩＣＰ２７突然変異体の作成のため上述した方法と同様にして構築した。この組換え体ウイルスは、ＨＤ−２と命名したが、Ｘ−ｇａｌの存在下にＩＣＰ８発現細胞株中で青色のプラークを形成したが、ベロ細胞中では全くプラークを形成しなかった。ＩＣＰ８の種々の突然変異体型をコードするＤＮＡをこの親株中で組換えさせ、得られる子孫を白色プラークから単離した。白色プラークは２〜３９％の頻度で現れた。ＨＤ−２・ＤＮＡ及びｐｄ１０１又はｐｄ１０２でトランスフェクトした細胞における白色プラークの頻度はバックグラウンドを超えなかった。これは、おそらくｐｄ１０１又はｐｄ１０２とＨＤ−２・ＤＮＡとの組換えに利用可能なウイルス配列の量が限られていたためであろう。組換え体ウイルスがＩＣＰ８遺伝子内に適当な突然変異を含むことを確認するため、下記のタイプの分析を行った。ウイルスＤＮＡを単離し、適当な制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動で分析した。ウイルスＤＮＡ中の突然変異の存在を確認し、そして突然変異体ウイルス集団の純度を測定するため、サザンブロット分析を行った。例えば、野生型ＤＮＡの８．２ｋｂＢａｍＨＩＧ断片を、ＸｂａＩリンカーが存在するのでＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化することによりｎ２ＤＮＡ中で６．８ｋｂ断片と１．４ｋｂ断片とに分割した。ＢａｍＨＩＧとＶ（２．３ｋｂｐ）の結合領域をＨＤ−２内のｌａｃＺ遺伝子で置換した。従ってＨＤ−２・ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化すると１２．６ｋｂの断片が生成した。野生型ＤＮＡ、ＨＤ−２・ＤＮＡ、およびｎ２・ＤＮＡをＫｐｎＩで消化して比較すると、野生型ＤＮＡとｎ２・ＤＮＡは相互に類似しているが、ｌａｃＩ挿入のためＨＤ−２・ＤＮＡのそれとは異なっていた。ＩＣＰ８遺伝子に突然変異を含むウイルスの単離のための実験的詳細は以下に記載する。突然変異体ウイルスＨＤ−２は、ＩＣＰ８遺伝子にｌａｃＺ挿入を含むが、次のようにして単離した。ＩＣＰ８から７８０ｂｐのＸｈｏＩ断片を欠失させた後、このプラスミドをＢａｌ３１で短時間消化し、ＢｇｌIIリンカーをこのＤＮＡの両端に付加し、そしてｌａｃＺ遺伝子（ファルマシア，インク、ピスカタウエー、ＮＪ）を挿入した。ｐＭＣ１８７１のｌａｃＺ遺伝子は複製されるプロモーターを含まず、最初の８個の非本質的なアミノ末端コドンをも欠いている。ＩＣＰ８：ｌａｃＺプラスミドの混合物を野生型のウイルスＤＮＡと共にＢ１０細胞にトランスフェクトした。子孫ウイルスを単離し、培地１９９及びヒト免疫血清０．１％を含む１％子牛血清中のＢ１０又はＳ２細胞上にプレートし、３７℃で１〜２日間培養した。β−ガラクトシダーゼ活性を検出するため、次にこの培地を、ｍｌ当たり４００μｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含む培地１９９＋１．０％アガロースに交換し、そしてインキュベーションを８〜１６時間継続した。組換えウイルスは、青色プラークとして同定し、約０．１〜０．５％の頻度で単離した。一つの単離突然変異体をＨＤ−２と命名し、プラーク精製した。ＨＤ−２は、本研究においてｄ３０１を除くすべての突然変異体ウイルスの作成のための親ウイルスとして利用した。感染性ＨＤ−２・ＤＮＡを突然変異を受けたＩＣＰ８遺伝子をコードするプラスミドと共に共トランスフェクションを行った後、組換えウイルスをＸ−Ｇａｌの存在下に増殖させた白色プラークから単離した。ＩＣＰ８コード配列から２，００１ｂｐのＮｏｔＩ断片が欠失している、突然変異体ｄ３０１は、Ｂ１０細胞を感染性野生型ウイルスＤＮＡとプラスミドｐｄ３０１で共トランスフェクションさせることにより構築した（図１２）。このトランスフェクションから得られた子孫ウイルスをＢ１０細胞中では複製するがベロ細胞中では複製しないことを試験した。突然変異体ウイルスの生育特性。図１２に示した突然変異体のそれぞれは、ベロ細胞中では複製することができず、Ｂ１０又はＳ２細胞内に存在するＩＣＰ８の野生型コピーによる補完を必要とした。各突然変異体ウイルスはこれらのＩＣＰ８発現性細胞株中で野生型のレベルと同様なレベルまで複製した。突然変異体ウイルスにより生産されるブラークのサイズは野生型ウイルスにより形成されるプラークよりも僅かに小さかった。さらに、すべての場合、突然変異体ウイルスはＢ１０細胞かＳ２細胞中で増殖させると、それらの突然変異体表現型を維持した。突然変異体ウイルスによるＩＣＰ８の発現。突然変異体感染細胞におけるウイルス蛋白質の合成を、上述したようなウエスタンブロッティングにより検討した。ウサギポリクローナル血清３−８３(クニーペ(Knipe)ら、J．Virol.，61，276(1 987))又はマウスモノクローナル抗体１０Ｅ−３(ローズ(Rose)ら、J．Gen．Viro l.，67，1315(1986))を用いてＩＣＰ８を検出した。突然変異体ウイルスにより特定されたＩＣＰ８ポリペプチドのサイズは予想されたサイズと一致した。マウスモノクローナル抗体１０Ｅ−３は、突然変異体ｐｍ１、ｄ１０１、ｄ１０２、及びｄ３０１により発現されたＩＣＰ８ポリペプチドと反応したが、ｎ１０及びｎ２により発現されたものとは反応しなかった（表４）。このことは、この抗体がＩＣＰ８のカルボキシル末端の３６個のアミノ酸内に少なくとも一部は含まれる１個のエピトープと反応することを示唆する。これらの結果は、ｄ１０１、ｄ１０２、及びｄ３０１が枠内欠失を含むことを示すものでもある。突然変異体ウイルス感染細胞におけるウイルスＤＮＡの複製。非許容性条件下において突然変異体ウイルスのそれぞれで感染させた細胞におけるＤＮＡ複製を検討するために、ベロ細胞を各ウイルスで感染させ、そして感染後６から１０時間目にその培養に〔³Ｈ〕−チミジンを添加した。細胞を収穫し、ＤＮＡを単離した。ＤＮＡ試料それぞれをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけた。突然変異体はすべて、ＨＳＶ−１・ＤＮＡポリメラーゼを選択的に阻害する化合物であるホスホノ酢酸の存在下で生育させたときは、野生型ウイルスのようにはウイルスＤＮＡを複製することができなかった。ウイルスＤＮＡの分析の実験的詳細は以下に述べる。（ｉ）ＤＮＡの調製。プラスミドＤＮＡとウイルスＤＮＡをクニーペ(Knipe)ら、J．Virol.，29，698（1979）により記載されたように調製した。サザンブロット分析に用いられたウイルスＤＮＡは次のようにして精製した。感染後の遅い時期に感染細胞を凍結・融解し、ついで０〜４℃で３０秒間超音波処理した。４８０×ｇで遠心分離して細胞破砕物を除去した。得られた上清を２３，５００×ｇで遠心分離した。ペレットをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：２４：１）で３回抽出した。エタノール沈澱をした後、このＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に溶解した。（ii）ウイルスＤＮＡの合成の測定。細胞を適当なウイルスで感染させ、ｍｌ当たり２０μＣｉの〔³Ｈ〕−チミジンで６から１０時間まで標識し、そして総ＤＮＡをチャルベルグ(Challberg)(1986， Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，9094)の方法により単離した。このＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した。電気泳動の後、このゲルを１．０Ｍサリチル酸ナトリウムで処理し蛍光光度法にかけた(チャンベルライン(Chamberlain)、Anal.Biochem.，98，132(1979))。突然変異を受けたＩＣＰ８のＤＮＡ結合特性。突然変異体ＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を検討する前に、個々のポリペプチドの溶解性を検討し（表５）、顕著に異なることが分かった。ついで、突然変異を受けた可溶性のＩＣＰ８分子のＤＮＡ結合特性を一本鎖ＤＮＡ−セルロースによるクロマトグラフィーで検討した。感染細胞抽出物の一本鎖ＤＮＡ−セルロースクロマトグラフィーは、細胞を感染後４から６時間まで〔³⁵Ｓ〕メチオニンで標識したことを除き、文献記載（クニーペ(Knipe)ら、J．Virol.，44，736（1981）のとおり行った。蛋白質を一本鎖ＤＮＡ−セルロースを含むカラムに載せ、ＮａＣｌの濃度を増加させながら溶出した。野生型ウイルス感染細胞中で発現されたＩＣＰ８の大部分はこのカラムに結合し、ついで０．５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された。対照的に、ｐｍ１感染細胞中で発現されたＩＣＰ８は極めて僅かしかカラムに結合しなかった。カラムに結合しついで溶出されたＩＣＰ８の量を測定した。その結果を表５に示す。ｎ１０感染細胞中で発現したＩＣＰ８は、野生型ＩＣＰ８と同様に一本鎖ＤＮＡ− セルロースに効率的にかつ固く結合した。結合の最低レベル（２１％）は、ｄ３０１感染細胞中で発現したＩＣＰ８で観察された。アミノ末端欠失突然変異体であるｄ１０１及びｄ１０２によりコードされるＩＣＰ８は、それぞれ７２％及び７５％のレベルでＤＮＡセルロースに結合した。これらの結果に基づき、アミノ酸残基５６４から１１６０までのＩＣＰ８の部分はＤＮＡ結合に必要な領域を含んでいると結論できる。ウイルス突然変異体によりコードされるＩＣＰ８分子の核内局在。野生型ＩＣＰ８は感染細胞の核に効果的に局在する（フェンウィック(Fenwick)ら、J．Gen．V irol.，39，519(1978)、クニーペ(knipe)ら、J．Virol.，43，314（1982）、クインラン(Quinlan)ら、Mol．Cell．Biol．3，315（1983）、クインラン(Quinlan )ら、Mol．Cell．Biol．5，957（1985））。野生型ＩＣＰ８分子及び突然変異体ＩＣＰ８分子の細胞内分布を間接的免疫蛍光法で検討した。この方法はクインラン(Quinlan)ら、Mol．Cell．Biol．3，315(1983)に従い、ｎ２を除くすべての突然変異体ウイルスに対し１：１０希釈の７９３抗ＩＣＰ８モノクローナル抗体及び１：１００希釈のローダミン−結合ヤギ抗マウス抗体を用いて行った。ｎ２のＩＣＰ８の検出のためには、１：３０希釈の抗ＩＣＳＰ１１／１２ポリクローナル血清（パウエル(Powell)ら、J．Virol.，39，894（1981）及び１：２００希釈のフルオレセイン−結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを用いた。ｎ１０にコードされたＩＣＰ８ポリペプチドは、カルボキシル末端から最後の３６個のアミノ酸を欠いており、野生型ＩＣＰ８と同じ効率でＤＮＡに結合したが、感染細胞の核に局在せず、むしろ細胞質に留まっていた。対照的に、ＤＮＡには僅かしか結合しなかったｐｍ１のＩＣＰ８ポリペプチドは、核内に大部分が見出された。これらの結果から、ＩＣＰ８の核局在化シグナル（単数又は複数）はＤＮＡ結合機能とは分離していることが明らかに証明された。ｄ１０１によりコードされるＩＣＰ８は核に局在しておりＤＮＡに結合することが可能でもあった（表５）が、このウイルスはウイルスＤＮＡの複製をすることができなかった。この突然変異体の表現型は、ＩＣＰ８がＤＮＡへの結合以外の核の機能を持っていることの遺伝学的証拠を提供する。ＩＣＰ８突然変異体の表現型の特性の概要は、下記の表６に示されている。ＨＳＶ−１の複製欠陥突然変異体は、細胞性免疫を誘導し、致死的な感染から守る方法以下の実施例で、以下の物質と方法を用いた。マウス。メスのＢａｌｂ／ｃマウスは、タコニックラボラトリーズ社（ジャーマンタウン、ＮＹ）より購入し、６〜１２週齢で使用した。マウスは、０．５ｍｌのＰＢＳまたは０．５ｍｌのＰＢＳ中のウイルス懸濁液を腹腔内注射した。ウイルス。ＨＳＶ−１野生型ＫＯＳ１．１株及びｍＰ株を既報に従って、Ｖｅｒｏ細胞で増殖し、測定した（クウィンランら（Quinlan et al.）、Mol.Cell.Bio l.,5:957(1985)）。ＩＣＰ８をコードする遺伝子に突然変異を含むウイルスを、ｄ３０１と命名し、前述のガオら（Gao et al.）の方法に従って、産生した。ＩＣＰ２７遺伝子に突然変異を含むウイルスを、ｎ５０４Ｒと命名し、以下の方法に従って、産生させた。突然変異したＩＣＰ４遺伝子をコードするウイルス（ｄ１２０）を、デルカら(DeLuca et al.,J.Virol.,56:558(1985))の方法に従って、産生した。ＶＳＶは、ホーンら（Horn et al.,J.Virol.,63:4157(1989)）に記載の方法に従って、増殖させた。すべてのウイルスストックを−７０℃で保存し、各実験には各ストックから新しく溶解させた一部を使用した。ＵＶ照射したＨＳＶ−１及びＶＳＶの調製は、３０−ＷＵＶ源（Ｇ３０Ｔ８、ゼネラルエレクトリック社）を使用して０℃、４５分間、５ｃｍの距離で各ウイルスを照射することにより得られた。ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）不活化ウイルスの調製は、リーバイオモレキュラー社（サンディエゴ、ＣＡ）により産生された。Ｔ細胞活性の測定。野生型のＨＳＶ−１または、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７もしくはＩＣＰ８の遺伝子に突然変異を含むウイルス突然変異株を１０⁶Ｐｆｕで３〜４週間前に腹腔内接種したマウスから、免疫脾臓細胞を得た。負の対照としてＰＢＳを接種したマウスを供給した。該マウス由来の脾臓を、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）勾配沈殿法により赤血球と多形核白血球を除去した。脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）をＢリンパ球特異的抗体と４℃ で３０分間インキュベートすることにより、混合物からＢリンパ球を除いた。それから、細胞を洗浄し、ヤギ−ラット抗体をコートした磁気の核を含むラテックスポリマービーズ（アドバンストマグネティックス社、ケンブリッジ、ＭＡ）とインキュベートした。それから、磁気ビーズに結合したＪ１１−ｄ２陽性細胞を磁石（バイオマグセパレーター、アドバンストマグネティックス社）を使用して除いた。９５％を超えるＴ細胞からなる混合物中に残った細胞を、洗浄し、９６ウエルの丸底培養プレート（ヌンク社、ロスキルデ、デンマーク）中０．２ｍｌの全容積に１０⁵細胞／ウエルの濃度でインキュベートした。細胞の試料は、四連（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）に培養した。応答した細胞をＵＶ照射した野生型ＨＳＶ−１で刺激した。ウイルスを加えない対照細胞を並行して準備した。細胞は、ダルベッコの変法イーグル培地（ハーゼルトン社）に５％の仔牛血清（ハイクローンラブズ社、血清は５６℃で１時間不活化したもの）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ社）、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ギブコ社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ギブコ社）、１０^-4ｍＭの２−メルカプトエタノール（シグマ社）及び２ｍＭのグルタミン（ギブコ社）を添加した培地中でインキュベートした。細胞を３７℃で１０％ＣＯ₂存在下、３日間インキュベートした。［³Ｈ］−チミジン（ニューイングランドニュークレア社）を１μＣｉ／ウエルの濃度で添加し、６時間後、スクラトロンセルハーベスターを用いて細胞を集めた。各試料中の放射活性量は、液体シンチレーションカウンター（ベータトラック６８９５；ＴＭアナリティック社）を使用して測定した。抗体のアッセイ。感染マウスより得られた血清試料について、ＥＬＩＳＡを用いてＨＳＶ−１特異的抗体の存在を分析した。使用したプロトコールは、カーロンら(Kahlon et al.),J.Inf.Dis.,158:925(1988)が記載した方法と同様で、マウス血清に応用した。マイクロタイタープレート（リンブロ／タイターテック社）をＰＢＳに懸濁した１０⁷ｐｆｕのＨＳＶ−１の１：５０希釈液の０．１ｍｌを用いて一晩処理した。前述の各ウイルスで免疫したマウス由来の血清は、マウスの逆眼窩出血により得られた。ＨＳＶ−１で被覆したマイクロプレートを３回洗浄し、１：１００希釈の血清１００μｌと共にインキュベートし、つぎに同じ血清の１：３希釈液で一晩室温でインキュベートした。再び、マイクロプレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ₂アルカリフォスファターゼ（サザンバイオテクノロジー社）の１：２５０希釈液で３７℃で３時間インキュベートした。１ｍｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼ（シグマ１０４）の基質を添加して３０分後に、７５μｌの３ＮＮａＯＨを加えることにより反応を停止させた。実験結果は、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを使用して得られた。野生型ＨＳＶ−１免疫マウス由来のプール血清を陽性対照とし、未感染マウスのプール血清を陰性対照とした。マウス血清は、個々に操作し、データを平均と平均の標準誤差で表す。結果複製欠陥ウイルスの使用；病原性の欠除。複製欠陥ウイルス（例えば、ＩＣＰ８またはＩＣＰ２７をコードする遺伝子に突然変異を含むウイルス）をマウスに接種したとき致命的であるかどうかを調べるために、生の野生型ＨＳＶ−１または突然変異ウイルスｄ３０１もしくはｎ５０４をマウスに注射した。各突然変異体を１０⁸ｐｆｕ接種したマウスは、健康に見えウイルスに影響されなかった。野生型ＨＳＶ−１を１０⁷ｐｆｕ接種された同腹子は、すべて死亡した。突然変異ウイルスを接種したマウスにおけるＨＳＶ−１特異的抗体の誘導。突然変異ウイルスがマウスにＨＳＶ−１特異的抗体を誘導出来るかどうかを決定するために、接種（群当たり８匹、ｄ３０１、ｄ５０４及び野生型を１０⁶ｐｆｕ腹腔内投与）後２週間のマウスから血清を得て、ＨＳＶ−１特異的抗体の存在を調べた（ＥＬＩＳＡにより測定）。再現性よくＨＳＶ−１特異的抗体がこれらのマウスの血清中に検出できたが、抗体値は、野生型ウイルスを接種したマウスの血清中の抗体値よりも著しく低かった。ｎ５０４を接種したマウス由来の血清は、ｄ３０１を接種したマウス由来の血清に比べ高い抗体価であることが明らかになった（図１）。第２の別々の実験で、ＰＩ後２週間と４週間においても同様の結果が得られた。これらの抗体の誘導にＨＳＶ−１βタンパク質の発現が必要であるかどうかを決定するために、β及びγタンパク質のいずれも発現しないＩＣＰ４欠陥突然変異体ｄ１２０を、マウス（群当たり８匹）に１０⁶ｐｆｕ腹腔内接種した。これらのマウスの血清中に、対照値以上のＨＳＶ−１特異的抗体値が検出できたが、これらのレベルは、ＩＣＰ８またはＩＣＰ２７突然変異体を同様に接種したマウス由来の血清中で見られる抗体値よりも有意に低かった（図１）。ウイルス突然変異体接種のマウスにおけるＴ細胞応答の誘導。突然変異体（それぞれが後期ウイルス遺伝子産物の生成の欠陥）がＨＳＶ−１特異的Ｔ細胞応答を誘導する可能性を調ベるために、ウイルス抗原接種マウス由来の脾臓性Ｔ細胞の応答をイン・ビトロで測定した。マウスは、１０⁶ｐｆｕの生の野生型ウイルス（ＫＯＳ１．１）または複製欠陥ウイルスであるｄ１２０、ｄ３０１とｎ５０４を受け取った。３週間後、各群のマウス由来のＴ細胞をイン・ビトロで、ＵＶ照射のＨＳＶ株ｍＰ（１ｐｆｕ／細胞）存在下でインキュベートした。非特異的Ｔ細胞刺激の効果を制御するために、無関係のウイルスであるＶＳＶ（１ｐｆｕ／細胞）に対するＴ細胞応答も求めた。ＶＳＶで免疫したマウス由来の脾臓性Ｔ細胞は、ＨＳＶ−１に応答して増殖しなかったが、同じ細胞はＶＳＶに応答して増殖した。免疫しなかったマウス由来のＴ細胞を負の対照とした。バックグランド値を超えるＴ細胞の活性化の刺激は、各複製欠陥ウイルスを接種したマウス由来の脾臓性Ｔ細胞で見られた（図２）。結果は、突然変異ウイルスでのマウスの免疫によるＴ細胞刺激は、野生型ウイルスでの免疫後に誘導されるものよりも低いことを示す。それにもかかわらず、これらの突然変異ウイルスは、事実上Ｔ細胞反応を誘導した（図２）。複製欠陥ウイルスによる防御免疫の誘導。複製欠陥ウイルスが致死的なＨＳＶ− １に対して防御免疫の誘導ができるか評価するために、６匹のマウス群に各複製欠陥突然変異体、ｄ１２０、ｄ３０１、ｎ５０４を１０⁶ｐｆｕ、またはソラレンで失活した野生型ＨＳＶ−１を等用量（５匹のマウス）腹腔内に接種した。対照マウス（９匹）はＰＢＳを接種（ｉ．ｐ．）した。３〜６週間後（実験に依存する）、すべてのマウスをＨＳＶ−１の悪性株（ｍＰ）の致死量（５×１０⁷ｐｆｕ）にチャレンジさせた（ｉ．ｐ）。３つの独立した実験で、突然変異体ｄ３０１またはｎ５０４を接種したマウスは、野生型ウイルスのチャレンジに対して防御され、それらの生存率は１００％であった。野生型ウイルスだけの感染を受けた対照マウスは、生存率が２０％未満であった。すべての３つの突然変異ウイルス（ｄ１２０、ｄ３０１及びｎ５０４）で行われた次の実験で、対照（ＰＢＳ接種）マウスは１／９だけ生存したが、ＩＣＰ２７またはＩＣＰ８突然変異体を予め接種したマウスは、野生型ウイルスのチャレンジ後、再現性良く１００％の生存という結果となった。即時型（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のみ発現するＩＣＰ４突然変異体（ｄ１２０）でさえ、大部分のマウスを防御した。それに比べ、ＵＶ照射したウイルスは、最小の防御効果を有し、ソラレン失活ウイルスは、致死的なチャレンジに対してマウスを防御しなかった（図３）。チャレンジ後４週間、生存率を記録した。死亡マウスの大半は、チャレンジ後７日〜１１日の間に死亡した。結論として、ＨＳＶ−１の複製欠陥突然変異体は、該ウイルスを接種したマウスの体液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導することができる。これらの突然変異体をマウスに接種することは、野生型ＨＳＶ−１の致死量のチャレンジに対して該マウスの防御に役立つ。細胞性免疫は、特に単純ヘルペスウイルスの感染に対する防御に重要であるので(ウィットリー(Whitley),1990 Virology中，フィールズとクニーペ（Fields and Knipe）編，ラーベンプレス，p.1843-1887)、そのような免疫を誘導する可能性のある作用剤は、潜在的なワクチン候補である。前述のようなワクチン候補も、それらが複製欠陥ウイルスよりなるものであるため、特に有効である。これらのウイルスは、新しいウイルス粒子を産生できないので、通常の弱毒生ウイルスワクチンよりも実質上安全である。前述のような突然変異ウイルスは、野生型の遺伝子を補うもの（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇｆｏｒｍ）を発現しない細胞では複製することができない。それ故に、それらは、最初の感染部位を超えて広がることができない。ヘルペスウイルスの病原性におけるこの知見の重要な含蓄は、それらの突然変異ウイルスが導入された宿主で潜伏感染を確立することができそうにないということである。ｄ３０１またはｎ５０４をそれぞれ角膜に接種したマウスで、これらのマウスから得た三叉神経節を、潜伏に付随する転写と発現のためのインサイチュハイブリダイゼーションで試験したときに、潜伏性感染の証拠が検出できなかったという事実は、この理論と矛盾しない。一般的には、コーエンらの既報(Coen et al.),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:4736(1989)を参照する。ＨＳＶ−１の複製欠陥突然変異体は、免疫調節効果を誘導する物質Ｂａｌｂ／ｃＢｙマウスは、ジャクソンラボラトリー社（バーハーバー、ＭＥ）より購入し、６〜８週齢で使用した。親の野生型ＨＳＶ−１（ＫＯＳ１．１）及び複製欠陥突然変異体のｄ３０１、ｎ５０４及びｄ１２０は前述の通りである。これらの突然変異体も前述のように、欠失した遺伝子産物を発現する細胞で増殖させ、滴定した。これらの突然変異ウイルスは、培養した霊長類細胞やマウス細胞で複製しない。これらの突然変異ウイルスのマウスの角膜への接種は、潜伏に付随する転写に特異的なプローブとハイブリダイズする陽性細胞が存在しないことで証明されるように、三叉神経節の潜伏感染を引き起こさない。さらに、角膜の切開（乱切り）後のマウスの感染は、三叉神経節に最小レベルのウイルスＤＮＡという結果となる。従って、感染マウスでのこれらの突然変異ウイルスの広がりという証拠はない。正常の宿主細胞の機能が、ＩＣＰ８またはＩＣＰ２７内のこれらの欠陥を補足できる、という証拠がないことから、マウス並びに培養細胞でこれらの突然変異体が複製欠陥であると結論することは、合理的である。野生型ＨＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞を使用して滴定した。ソラレン不活化ウイルスは、リーバイオモレキュラーリサーチラボラトリー社（サンディエゴ、ＣＡ）より入手し、プラークアッセイでは力価が検出されなかった。ＵＶ照射のＨＳＶは、３０−ＷＵＶ源（Ｇ３０ｔ８、ゼネラルエレクトリック社）を使用して０℃で１時間、５ｃｍの距離でウイルスを照射することにより得られた。ＵＶ照射は、ウイルスの力価を５〜６ｌｏｇ低下させる結果となった。精製したハムスターの抗ＴＮＦ抗体は、ロバートシュライバー博士（ワシントン大学、セントルイス、ＭＯ）より供与された。イン・ビボでの抗体処置モノクローナルラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｆ３）（アムゲン社、ボストン、ＭＡ）または無関係の精製ラットＩｇＧ（アムゲン社）を、−１、０及び１日目にマウスにｉ．ｐ．接種した。０日目に、また、マウスを１０⁶ｐｆｕのＨＳＶ −１（ｍＰ株）でチャレンジさせた。全アイソタイプのアッセイ標準ＥＬＩＳＡ法により、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの全サブクラスの濃度を決定した。要約すると、９６Ｕ底のマイクロタイタープレート（リンブロ／タイターテック社）を用いて、ヤギ抗マウスＩｇ（タゴ社）をＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。これを、室温で一晩または３７℃で２時間インキュベートした。それから、プレートをＰＢＳと０．１％のツゥイーン２０で洗浄した。血清の適当な希釈液を二重にアッセイした。モノクローナルマウスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａを、サブクラス特異的レベルの計算の標準として使用した。３回洗浄後、適当に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ（サザンバイオテクノロジー社、バーミンハム、ＡＬ）を１００μｌ加え、３７℃で３時間インキュベートし、洗浄した。ウエルを１００μｌのＤＥＡ緩衝液で室温で３０分間発色させた。７５μｌの３ＭＮａＯＨを添加して反応を停止させ、ＯＤをＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。ＨＳＶ特異的ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａのアッセイＨＳＶ特異的抗体のＥＬＩＳＡアッセイは、前述のカーロンら(Kahlon et al. )の方法からマウス血清の使用に応用した。ＨＳＶ特異的抗体の計算は、ゾーリンガーら(Zollinger et al.,J.Immunol.Methods,46:129(1981))の方法により行った。この方法は、細菌のタンパク質及びポリサッカライド並びにテタヌス（ｔｅｔａｎｕｓ）を含む種々のＡｇに対するＡｇ特異的抗体を定量する他のものにより利用されてきた。簡潔に述べると、ＩｇＧ２ａ−ＨＳＶ特異的アッセイを全マウスＩｇＧ２ａアッセイと並行して行った。１つのマイクロタイタープレートを、感染Ｖｅｒｏ細胞から産生した細胞フリーのＨＳＶ−１で被覆した。ウイルスは、室温で一晩、２×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌの濃度にＰＢＳで希釈した。それから、プレートをＰＢＳ−ツゥイーンを使用して３回洗った。ＨＳＶ感染マウス由来のプール血清の連続希釈液を、室温で一晩、ＨＳＶ被覆プレートとインキュベートした。このプールマウス血清を次の実験のすべてのアッセイに参照標準として使用した。吸光単位を抗体のμｇに変換するために、以下の手段を利用した。９６ウエルプレートの半分のウエルを抗マウスＩｇＧ２ａ抗体で被覆し、他の半分は、ＨＳＶで被覆した。既知の濃度のＩｇＧ２ａｍＡｂ（タゴ社）の連続希釈液を抗マウスＩｇＧ２ａで被覆したウエルに添加し、抗ＨＳＶプール血清の希釈液をＨＳＶで被覆したウエルに添加した。次の日（ＰＢＳとツゥイーンを使用して３回洗った後）、適当に希釈したアルカリフォスファターゼヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（サザンバイオテクノロジー社）を１００μｌ、各ウエルに加え、再びプレートを３７℃で３時間インキュベートした。最終リンス後、ウエルを１００μｌのＤＥＡ緩衝液で発色させた。７５μｌの３ＮのＮａＯＨを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍでの吸光度を自動化ＥＬＩＳＡリーダーを使用して読んだ。ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａと既知の濃度のＩｇＧ２ａの相互作用から得られたＯＤと、ＨＳＶ特異的アッセイのＯＤをプロットすることにより、我々のプール血清の抗ＨＳＶＩｇＧ２ａの単位をＨＳＶ特異的ＩｇＧ２ａのμｇに変換した。ＯＤは、ＩｇＧ２ａの標準曲線とＨＳＶＡｇ−抗体曲線上の最適の点で読み、前述のゾーリンガーら（Zollinger et al.）及びパサチエンポら(Pasatiempo et al.,FASEB J.,4:25 18(1990))に記載の方法で、単位を計算した。同様の方法を用いて、ＨＳＶ特異的ＩｇＧ１を測定した。すべてのアッセイで、試料と標準液は、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行った。このアッセイを、培地または、無関係の対照ウイルスとしてＶＳＶで被覆したプレートを同時にスクリーニングすることによりその特異性を試験した。結果ウイルス誘導のサブクラスのシフトは、不活化ウイルスでのチャレンジ後には見られない免疫後のネズミＩｇサブクラスＩｇＧ２ａとＩｇＧ１のサブクラスの分布を調べるために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当たり４匹）を、１０⁶ｐｆｕの生のもしくはＵＶ不活化ＨＳＶ（ｍＰ株）または培地対照でチャレンジした。ＨＳＶ−１のｍＰ株は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの病原株であるので使用した。ｉ．ｐ．接種後２週間で、逆眼窩出血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｂｌｅｅｄｉｎｇ）により血清を得た。全ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、ＨＳＶ特異的ＩｇＧ２ａ及びＨＳＶ特異的ＩｇＧ１の血清レベルは、ＥＬＩＳＡ法により測定した。生のウイルスを接種したマウス群では、全ＩｇＧ２ａサブクラスの抗体の１５〜２０倍の上昇が見られたが、ＵＶ不活化ウイルスでチャレンジさせたマウスではこの著しい上昇は見られなかった（図６、本実験の典型）。全ＩｇＧ１レベルの上昇は、有意ではなかった（ｐ＝０．９６２、スチューデントのｔ−検定による）。同様の結果が、感染後３週間と４週間で得られた。生のウイルスによるチャレンジの結果、ＩｇＧ２ａの上昇の総量が１ｍｇ／ｍｌを超過したのに対し、ＨＳＶで被覆したプレートに結合するＩｇＧ２ａの量は、いくつか行ったアッセイにおいて１００μｇ未満であった（図６と７Ａ）。生のウイルス感染により誘導される全Ｉｇのこの上昇は、非特異的なポリクローナルな効果が支配的であった。生のウイルス並びに不活化ウイルスは両方ともウイルス特異的抗体を誘導できたが（図７と８）、生のウイルスだけが劇的なサブクラスシフトを誘導した（図６）。生対ＵＶ不活化ウイルスをチャレンジされたマウス由来のＨＳＶ特異的ＩｇＧ２ａ及びＨＳＶ特異的ＩｇＧ１のレベルの差異は、統計的に有意ではない（スチューデントのｔ−検定）。これらのデータは、サブクラスシフトの誘導への導入過程が、ウイルス特異的抗体の産生への導入過程とは異なっていることを示した。ソラレン不活化ウイルス及び即時型感染細胞タンパク質４（ＩＣＰ４）欠陥突然変異サブクラスウイルスは、シフト誘導に失敗した生のウイルスは、通常宿主で複製できるので、ウイルスを不活化したり、タンパク質を殺すことが容易でない組織を侵す恐れがある。本実験では、宿主で広がることのできないＨＳＶの複製欠陥突然変異株を使用した。ＵＶ不活化は、感染性をすべて失わせないかもしれないし、ウイルスがいくらか生きている可能性があったので、アイソタイププロフィールにはソラレン不活化ウイルスを試験した。マウス（群当り８匹）を１０⁶ｐｆｕの生のウイルス、ソラレン不活化ウイルスまたはＨＳＶ−１株ｄ１２０でチャレンジした。生のウイルスを用いたマウスの免疫は、ＩｇＧ２ａが支配的であることにより特徴付けられるＩｇ分散のパターンを誘導したが、ソラレン不活化ウイルスまたは複製欠陥ｄ１２０突然変異ウイルスでチャレンジしたマウスでは、有意なアイソタイプスィッチは見られなかった（図９）。後期複製ブロックをもつ２つの複製欠陥突然変異ウイルスはサブクラスシフトを誘導したウイルス複製過程のどの側面が注目される効果を誘導しているかをより詳細にするために、ウイルスのライフサイクルの２つの別々の個所をブロックされたウイルスを使用した。１０⁶ｐｆｕのＩＣＰ４−（ｄ１２０）、ＩＣＰ２７−（ｎ５０４）、ＩＣＰ８−（ｄ３０１）突然変異体または親ウイルスＨＳＶ−１（Ｋ０Ｓ１．１株）をチャレンジさせて２週間後、マウスを出血させた。対照マウスは、ＰＢＳを接種した。全イムノグロブリンＩｇＧ２ａレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。データを平均と平均の標準誤差で表した。この実験は３回の結果を表す。ＩＣＰ４欠陥突然変異体は、サブクラススィッチを誘導することに失敗したが、ＩＣＰ２７をコードする遺伝子にノンセンス突然変異を有する別のＨＳＶ− １突然変異体（ｎ５０４）は、野生型ウイルスと同様なサブクラスシフトを誘導することができた。このことは、それがＩＣＰ４突然変異ウイルスのように複製できなかったという事実にもかかわらずである。同じ効果が、機能的な初期タンパク質であるＩＣＰ８または主要ＤＮＡ結合タンパク質をコードできない別の複製欠陥突然変異体、突然変異体ｄ３０１によっても生じた（図１０）。従って、ウイルス複製サイクルの特殊な構成物及び感染性のプロジェニーウイルスを産生しないことが、サブクラスシフトの誘導に必須である。マウスＩＦＮ−γに対する精製ｍＡｂは、サブクラススィッチに影響するウイルス感染中にサブクラススィッチが生じるときのサイトカインＩＦＮ−γ の役割を評価するために、マウスＩＦＮ−γに対する精製ｍＡｂをマウスに接種し、そのイン・ビボでのＩｇＧ２ａ産生における効果を実験した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当り４匹）を、ｉ．ｐ．の−１、０及び＋１日目に２ｍｇの精製抗マウスＩＦＮ−γｍＡｂまたは２ｍｇの無関係のアイソタイプ適合対照を接種した。０日目にまた、マウスを１０⁶ｐｆｕの生のＨＳＶ−１（ｍＰ株）でチャレンジした。チャレンジの１日前に開始し２回連続投与した、ＩＦＮ−γに対するｍＡｂの接種は、ウイルスで誘導されるＩｇＧ２ａ産生を部分的にブロックした（図１１）。１週間後、マウスを逆眼窩出血させ、全ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１をＥＬＩＳＡで別々に測定した。全ＩｇＧ１レベルには、抗ＩＦＮ−γ抗体の効果がなかった。これは、非特異的効果ではないことを示した。抗体の投与は、ＨＳＶ特異的ＩｇＧ２ａには効果がなく、ＩＦＮ−γ抗体は、ポリクローナルな効果を排除するが、Ａｇ特異的応答ではないことを示した。図１１は、３回の結果を表す。ＩＣＰ８欠陥ＨＳＶ−β−ガラクトシダーゼ突然変異体を用いた免疫とＩｇＧ２Ａ／ＩｇＧ１サブクラスシフトＢａｌｂ／ｃマウスの免疫メスＢａｌｂ／ｃマウスをＩＣＰ８欠陥ＨＳＶ−β−ガラクトシダーゼ突然変異体（ＨＳＶ−β−ｇａｌ）で免疫した。一次免疫は、１０⁶ ｐｆｕを０．１ｍｌのｉ．ｐ．で行った。１１日後にマウスを採血して血清を取り、１０⁶ｐｆｕを０．１ｍｌのｓｃでブーストした。ブースター免疫後２８日目に再び血清を得た。また、マウスをβ−ガラクトシダーゼ（グレードVIII: 大腸菌由来、シグマケミカル社）で免疫した。不完全フロイントのアジュバント中１００μｇのタンパク質（０．２ｍｌｓｃ）の一次免疫後、１４日目に１００μｇの可溶化タンパク質（０．１ｍｌｓｃ）でブーストした。ブースター免疫後１１日目に、抗体決定のための血清を得た。ＥＬＩＳＡによるβ−ガラクトシダーゼに対する抗体の決定イミュンロン^R２マイクロタイタープレート（ダイナテックラボラトリーズ社）を、３７℃９０分間かけてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社）で被覆した。プレートを、ＰＢＳツゥイーン（ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、シグマ社）で３回洗浄した。血清試料をＰＢＳツゥイーンで希釈し、室温で２時間プレート上でインキュベートした。再び、プレートを洗浄し、アフィニティー精製したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧサブクラス抗体（サザンバイオテクノロジーアソシエート社）をＰＢＳで希釈した。ツゥイーンを加えて室温で２時間インキュベートした。すべての検出抗体をアッセイして、サブクラス特異性を保証した。プレートを洗浄して、ジエタノールアミン緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのシグマ１０４^Rフォスファターゼ基質を用いて、室温で発色させた。ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａのアッセイは、３０分間発色させ、ＩｇＧ２ｂとＩｇＧ３のアッセイは、６０分間発色させて、それからＶ_max ^R マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイシス社）上でＯＤ４０５ｎｍ値を読んだ。ＥＬＩＳＡの結果は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａのアッセイに対し、３０分後のＯＤが０．７５となる血清の希釈の逆数として記載される。ＩｇＧ２ｂとＩｇＧ３のアッセイの結果は、６０分後のＯＤが０．５となる希釈の逆数として記載される。この証拠は、体液性応答が複製欠陥ＨＳＶ株により発現される外来抗原により誘導されることを示し、この提案された研究の可能性に根拠を与える。さらに、抗体のアイソタイプは、０．００３〜０．０５３のＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比率を生じるβ−ガラクトシダーゼタンパク質の接種により誘導されるものとは異なっていた。高いＩｇＧ１レベルは、Ｔｈ２を介するタンパク質抗原への応答と関連し、高いＩｇＧ２ａ抗体は、Ｔｈ１を介する生のウイルス抗原への応答と関連している。これらの結果は、Ｔｈ１を介する応答もベクターから発現したヘテロな抗原に与えられることを示す。性器ヘルペスに対するＩＣＰ８遺伝子に突然変異を含むＨＳＶ−２ウイルスを用いる構築、特性決定及び予防免疫ＨＳＶ−１ＨＤ−２株からｐＩＣＰ８−ｌａｃＺの単離ＨＳＶ−１ＨＤ−２（ＩＣＰ８遺伝子内にｌａｃ２の挿入）ウイルスＤＮＡを、ＢａｍＨＩで完全消化し、０．７％の低融点アガロースゲルで電気泳動を行った。ＩＣＰ８−ｌａｃＺ融合遺伝子は、ＨＤ２に独自に得られた最大の断片（約１２．６ｋｂｐ）内に含まれると予想された。ＨＤ２親ウイルスのＫＯＳ１．１と比較した制限分析は、これがそうであると明らかにした。このバンドをゲルから切り出し、プラスミドｐＮＥＢ１９３（ニューイングランドバイオラブズ社）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。形質転換後、β−ガラクトシダーゼの色素性基質であるＸ−ｇａｌを含むＬＢプレート上の白コロニーを選択し、正確な挿入をスクリーニングした。制限消化分析で確認し同定した。ＨＳＶ−２組換え体の単離マーカーとして、ＨＳＶ−２にＩＣＰ８−ｌａｃＺ融合配列を移すために、ｐＩＣＰ８−ｌａｃＺをＫｐｎＩで消化し、最大の断片（約６．４ｋｂｐ）を次にアガロースゲル電気泳動を行って精製した。この断片の５’末端は、開始コドンの７６コドン下流であり、３’末端は、ｇＢプロモーターの約１．３ｋｂｐ上流であった。リン酸カルシウム法を用いて、精製断片を１μｇのＨＳＶ−２株１８６ｓｙｎ⁺−１ｗｔウイルスＤＮＡといくつかのモル比率で、Ｓ−２細胞（ウイルス感染時にＩＣＰ８を発現）にコトランスフェクトした。プラークの出現後、滅菌ミルクを半容量加えて感染細胞を集め、２回凍結融解してソニケートし、希釈液を６ウエルのプレート中のＳ−２単層上で培養した。感染した単層に０．１％の免疫血清を含む１９９培地−１％子牛血清（１９９Ｖ）を重層し、３７℃でインキュベートした。組換え体のスクリーニングプラークの形成は、通常Ｓ−２単層上に培養してから２日以内に観察された。それから、細胞の単層を２回１９９Ｖ培地で洗浄し、０．５％アガロースと、β −ガラクトシダーゼの色素性基質であり該酵素で代謝されると青色を産生するＸ −ｇａｌを３００μｇ／ｍｌで含む１９９Ｖ培地を重層した。ＩＣＰ８−ｌａｃＺインサートを含む組換えウイルスは、Ｘ−ｇａｌの存在下、青色のプラークを生じると予想された。青色のプラークを拾い、希釈物をＳ− ２及びＶｅｒｏの両単層上においた。Ｓ−２単層上で青色のプラークを形成するが、Ｖｅｒｏ単層上では形成しないそれらの単離物は、Ｓ−２細胞でさらに精製するために考慮された。一旦精製されると、その単離物をＶｅｒｏ細胞での成育の試験を行った。ウイルスの低希釈液で観察された一般的な細胞変性効果（ＣＰＥ）を除いて、何も観察されなかった。ウイルスの組換え体は、約０．１％の頻度で得られた。２つの別々に単離した突然変異体である５ＢｌａｃＺ及び２０ＢｌａｃＺをさらに特性決定した。ＨＳＶ−２組換えウイルスの分析１．異なる細胞株での複製５ＢｌａｃＺ突然変異ウイルスの複製を、プラーク形成法により異なる細胞株でアッセイした。５ＢｌａｃＺは、ＨＳＶ感染時にＩＣＰ８を発現するＳ−２細胞で効率良くプラークを形成した（表８）が、Ｖｅｒｏ細胞ではプラーク形成が検出されなかった（表８）。これに比べ、ｗｔの親ウイルスであるＨＳＶ−２株１８６は、両細胞株に同等に効率良くプラークを形成した。２．ゲノムの分析ウイルス突然変異体を、まず制限消化とサザンハイブリダイゼーション法で分析した。ウイルスＤＮＡをヨウ化ナトリウム勾配遠心分離により精製し、数種の酵素を用いる制限分析にかけた。サザンブロットに使用したプローブは、ランダムプライマー法により³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした直鎖状のｐＩＣＰ８−ｌａｃＺであった。この分析は、２つの組換えＨＳＶ−２ウイルスの期待された位置にＩＣＰ８−ｌａｃＺ遺伝子の存在を確認した（図２）。５ＢｌａｃＺだけを用いて、さらに分析を行った。３．遺伝子の発現５ＢｌａｃＺとｗｔウイルスによる遺伝子発現を比較するために、５ＢｌａｃＺまたはＨＳＶ−２１８６ｓｙｎ⁺−１ウイルスを、感染多重度（ＭＯＩ）＝２０でＶｅｒｏ細胞に感染させた。感染後種々の時間で、³⁵Ｓ−メチオニンを用いてその培養物をラベルした。細胞の溶解産物を調製し、９．２５％ＳＤＳゲルの電気泳動にかけた。ＩＣＰ５やＩＣＰ２５のような後期タンパク質の、突然変異ウイルスによる発現量が、野生型ウイルスに比べいくらか少ないことを除いて、５ＢｌａｃＺウイルスは、ｗｔウイルスと同じタンパク質を発現した。これらの抽出物のウエスタンブロット分析では、突然変異体感染細胞中で、ウイルスの糖タンパク質であるｇＢやｇＤの発現が、ｗｔウイルス感染細胞中での約半分であった。従って、５ＢｌａｃＺ突然変異ウイルスは、正常細胞におけるですべてのキネティッククラスのウイルスタンパク質を発現し、接種した宿主で免疫応答を誘導すると予想される。４．ＤＮＡ複製５ＢｌａｃＺがそのＤＮＡを複製する能力があるかを試験するために、野生型株１８６ｓｙｎ⁺−１またはＩＣＰ８突然変異体の５ＢｌａｃＺを、ＭＯＩ＝２０またはモックでＶｅｒｏ細胞に感染させた。感染後、細胞を３時間１９９Ｖ培地で重層してから、２５μＣｉ／ｍｌの³Ｈ−チミジンを含む１９９Ｖ培地に置き換え、さらに４時間インキュベーションを続けた。細胞を溶解してＲＮアーゼＡ処理後、全ＤＮＡを回収した。それから、等量のＤＮＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロース電気泳動にかけた。それから、エンテンシファイ^TM（ニューイングランドニュークレア社）でゲルをフルオログラフィーに付して、乾燥させ、コダックＸＡＲフィルムに−８０℃で３日間曝した。５ＢｌａｃＺは、そのＤＮＡを複製できないことがオートラジオグラムにより明らかになった。５．細胞の殺傷性５ＢｌａｃＺが感染Ｖｅｒｏ細胞を殺す能力があるか、Ｔ２５フラスコ中のコンフルエントな単層をＭＯＩ＝５で感染し、感染後２４、４８及び７２時間目に集めることにより決定した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水中０．５％（ｗ／ｖ）のトリパンブルー溶液に再懸濁し、血球計算板で数えた。全細胞数を決定し、死細胞と生細胞をトリパンブルーの色素の取り込みにより区別した（図１２）。従って、５ＢｌａｃＺは複製欠陥であるけれども、感染細胞を殺し、それ自体は存続しない、つまりワクチンウイルスの所望される性質である。６．モルモットの性器ヘルペスに対するＨＳＶ−２５Ｂ１ａｃＺ複製欠陥突然変異体の免疫実験のデザイン３６匹のメスのＨａｒｔｌｅｙモルモット（チャールスリバーブリーディングラボラトリーズ社、ウィルミントン、ＭＡ）を３つの群にランダム化した。１群（Ｎ＝１２）は、非免疫対照であった。２群（Ｎ＝１２）は、背中への皮下注射により、１×１０⁷ＰＦＵの５ＢｌａｃＺウイルスを含む０．５ｍｌの懸濁液を受け取った。３群（Ｎ＝１２）は、２本の後ろ足への注射により、１×１０⁷ＰＦＵの５ＢｌａｃＺウイルスを含む０．５ｍｌの懸濁液を受け取った。免疫後３３日目に、ウイルスのチャレンジを行った。アルギン酸カルシウムで湿らせた消毒綿棒（ｔｉｐｐｅｄｓｗａｂ）（カルギスワブ＃３、スペクトラムラブズ社、ロサンジェルス、ＣＡ）で膣の閉鎖膜を破り、プラスチックカテーテル（アボッカス、アボットラブズ社、ノースシカゴ、ＩＬ）を用いて５．７ｌｏｇ₁₀ＰＦＵのＨＳＶ−２ＭＳ株を含む０．１ｍｌのウイルス懸濁液を膣円蓋にしみ込ませることにより、チャレンジウイルスを動物に接種した。感染動物の数を最大にするために、３０分後に接種を繰り返した。接種後（ＰＩ）１、２、３、５、７及び１０日目に膣の綿棒試料を集め、凍結保存し（−７０℃）、ラビットのプライマリー腎細胞で滴定することによりウイルスの存在をアッセイした。モルモットを毎日評価し、既報の病変スコア−スケールを用いて原発性の性器の皮膚疾患の重症度を定量した(スタンベリーＬＲ、ＥＲケルン、ＴＭアボット及びＪＣオーバーオール 1982、モルモットの性器ヘルペス：一次感染の病原性と再発疾患の記述、J.Inf.Dis.146:399-404)。原発性の性器の皮膚疾患を、ＰＩ１０日前に始まる臨床疾患の一次エピソードとして定義した。一次感染からの回復後、Ｐ１１５〜４２日まで毎日、自発性再発ヘルペス疾患の証拠のために動物を調べた。これらの結果は、特に足への接種によるモルモットの免疫は、ＨＳＶ−２の毒性の野生株を動物の膣内に接種したときに、性器の病変を減少させ、生殖管でのＨＳＶ−２の複製を低下させる防御免疫を導くことを示す。これらの結果は、ＨＳＶ−２の複製欠陥突然変異株は、性器ヘルペスに対する予防免疫を提供できるという証拠を提供する。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。このようなそして他のすべての均等物は下記クレームの範晴に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１月９日【補正内容】請求の範囲１．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫病理学的疾病、免疫調節的（immunomodulatory）疾病、又は免疫制御的（immunoregulatory）疾病の治療のための医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、哺乳動物にイン・ビボ投与されるとＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。２．このヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６又はＨＨＶ−７からなる群より選択されるものである、請求項１記載の使用。３．このヘルペスウイルスがＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である請求項２記載の使用。４．この突然変異が蛋白質ＩＣＰ８又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子または遺伝子群中に存在するものである請求項３記載の使用。５．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、ヘルペス性支質角膜炎（herpet ic stromal keratitis）又はヘルペスウイルスの潜伏性感染の治療用の医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、哺乳動物にイン・ビボ投与されるとＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。６．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫病理学的疾病、免疫調節的疾病、又は免疫制御的疾病の治療のための医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ −γの産生を誘導する能力を有するものである該ヘルペスウイルスの使用。７．このヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６及びＨＨＶ−７からなる群より選択されるものである、請求項７記載の使用。８．このヘルペスウイルスがＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である請求項８記載の使用。９．この突然変異が蛋白質ＩＣＰ８又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子又は遺伝子群中に存在するものである、請求項９記載の使用。１０．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、ヘルペス性支質角膜炎（herpetic stromal keratitis）又はヘルペスウイルスの潜伏性感染の治療用の医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ−γの産生を誘導する能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。１１．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫病理学的疾病、免疫調節的疾病、又は免疫制御的疾病の治療のための医薬の製造において、ヘルペスウイルスが、ｄ３０１、ｎ５０４又はｇＨ欠失突然変異体ではないことを前提として、該ヘルペスウイルス突然変異体が哺乳動物に投与されるとＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。１２．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウィルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫病理学的疾病、免疫調節的疾病、又は免疫制御的疾病の治療のための医薬の製造において、ヘルペスウイルスが、ｄ３０１、ｎ５０４又はｇＨ欠失突然変異体ではないことを前提として、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ−γの産生を誘導する能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者クニーペ，デイヴィッドアメリカ合衆国マサチューセッツ 02166，オーバーンデイル，オーバーンストリート 58 (72)発明者フィンバーグ，ロバートアメリカ合衆国マサチューセッツ 02021，カントン，スプリングレーン 48 (72)発明者サイバー，ジョージアメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックリン，コリーロード 37

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫調節物質（immunomodulant）の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、該哺乳動物にイン・ビボ投与されるとＩｇＧ２ａからＩｇＧ１への抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。２．このヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６又はＨＨＶ−７からなる群より選択されるものである、請求項１記載の使用。３．このヘルペスウイルスがＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である請求項２記載の使用。４．この突然変異が蛋白質ＩＣＰ８又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子または遺伝子群中に存在するものである請求項３記載の使用。５．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、ヘルペス性支質角膜炎（herpetic stromal keratitis）治療用の医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、該哺乳動物にイン・ビボ投与されるとＩｇＧ２ａからＩｇＧ１への抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。６．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫調節物質の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩｇＧ２ａからＩｇＧ１への抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有しかつ免疫学的防御効果を誘導する能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。７．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫調節物質の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ−γの産生を誘導する能力を有するものである該ヘルペスウイルスの使用。８．このヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６及びＨＨＶ−７からなる群より選択されるものである、請求項７記載の使用。９．このヘルペスウイルスがＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である請求項８記載の使用。１０．この突然変異が蛋白質ＩＣＰ８又はＩＣＰ２７をコードする遺伝子又は遺伝子群中に存在するものである、請求項９記載の使用。１１．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、ヘルペス性支質角膜炎（herpetic stromal keratitis）治療用の医薬の製造において、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ−γの産生を誘導する能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。１２．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫調節物質（immunomodulant）の製造において、ヘルペスウイルスが、ｄ３０１、ｎ５０４又はｇＨ欠失突然変異体ではないことを前提として、該ヘルペスウイルス突然変異体が、哺乳動物に投与されるとＩｇＧ２ａからＩｇＧ１への抗体サブクラスシフトをもたらす能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。１３．ウイルス複製に必須の蛋白質をコードする遺伝子の１種以上に突然変異を有するためヘルペスウイルスの複製に欠陥を有する該ヘルペスウイルスの使用であって、免疫調節物質（immunomodulant）の製造において、ヘルペスウイルスが、ｄ３０１、ｎ５０４又はｇＨ欠失突然変異体ではないことを前提として、該ヘルペスウイルス突然変異体が、投与されるとＩＦＮ−γの産生を誘導する能力を有するものであるヘルペスウイルスの使用。