KR101747987B1 - 단순 헤르페스 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생식기 헤르페스에 대해 환자를 면혁화시키기 위한 백신에 사용될 수 있는 단순 헤르페스-2 바이러스에 대한 것이다.

Description

단순 헤르페스 바이러스 백신 {HERPES SIMPLEX VIRUS VACCINES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 12월 21일 출원된 미국 가출원 제61/288,836호에 우선권 및 이득을 주장한다. 상기 이전 출원은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 주로 만성 생식기 궤양과 연관된 제2형 단순 헤르페스 바이러스 (HSV-2) 감염에 대해 환자를 면역화시키기 위해 사용될 수 있는 백신에 관한 것이다. 백신은 높은 수준의 HSV-2 글리코단백질 D 항원 (gD2)을 발현하도록 유전자조작된 복제 결손 HSV-2 바이러스를 이용한다. 바람직한 실시양태에서, HSV-2 바이러스는 또한 하나 이상의 면역조정 유전자, 예를 들면 IL15 및/또는 HSV-1 또는 HSV-2 주요 항원, 예를 들면 gB 또는 gC를 발현한다.
발명의 배경
단순 헤르페스 바이러스 ( HSV ) 및 HSV 감염
단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2)는 생식기 궤양 질환의 주된 원인이다. 이는 급성, 증식성 감염 모두 및 예측할 수 없는 주기적 재발에 의해 특징지어지는 장기 잠복 감염을 야기할 수 있다 (66). 평생의, 재발성 생식기 궤양을 야기하는 것 외에, HSV 감염은 AIDS 환자에서 주요 우려이다. 생식기 HSV-2 감염은 성적으로 획득되는 HIV 감염에 대한 위험을 3배로 증가시키며 (20), 아프리카에서 이 위험의 증가는 25-35%의 우발적 HIV 감염의 원인이 될 수 있는 것으로 기록되었다 (1).
비록 대부분의 유증상 HSV 1차 감염의 중증도 및 지속기간은 어싸이클로비어, 발라싸이클로비어 또는 팜싸이클로비어로의 경구 또는 정맥내 치료에 의해 감소될 수 있지만, 항바이러스 요법은 1차 감염으로부터의 잠복 감염의 확립을 방지하지 않으며, 후속적인 재발을 감소시키지 않는다 (66). 미국에서의 지난 20년에 걸친 생식기 헤르페스의 계속된 확산 (19) 및 현재의 항바이러스 약제에 대해 내성인 HSV의 증가하는 발생률은 HSV 감염에 대한 안전하고 효과적인 백신에 대한 필요성이 있다는 것을 제시한다 (31, 60). 추가로, HSV 억제 요법이 HSV-2 및 HIV 모두 감염된 여성의 생식기 점막 및 혈장에서의 HIV의 수준의 유의한 감소를 야기한다는 발견은 (52) 효과적인 HSV 백신은 또한 HIV 감염의 조절에 주요 영향을 가질 수 있다는 것을 제시한다 (1, 31).
HSV -2 글리코단백질 D ( gD2 )
HSV 글리코단백질 D (gD)는 감염된 세포의 표면 (21) 및 바이러스 외피 (24) 상에 발현되는 가장 두드러진 바이러스 항원 중 하나이다. gD는 세포에의 바이러스의 진입을 위해 필수적이며, HSV 감염에 대한 중성화 항체에 대한 주요 표적이다 (12, 49, 53). 추가로, gD는 HSV 감염의 인간 및 뮤린 모델에서의 CD4+ T 세포 세포독성 및 CD8+ T 세포를 포함하는 CD4+ T 세포에 대한 두드러진 바이러스 표적이다 (27, 28, 30, 34, 47, 65, 75). 이들 이유 때문에, gD는 HSV 서브유닛 백신 개발을 위한 주요 초점이 되어왔다 (32, 60).
3상 임상 시험에서, 스탠베리 외 (Stanberry, et al.)는 HSV-2 (gD2)로부터의 재조합 gD로의 아쥬반트 AS04와 조합된 예방접종은 HSV-혈청반응음성 여성에서의 생식기 헤르페스 질환의 발병에 대한 보호에서 73-74% 효능을 제공하였다는 것을 나타냈다 (62). 그러나, 유의한 효능은 HSV-1에 대해 혈청반응양성인 남성 및 대상체에서 관찰되지 않았다. 비록 gD2-특이적 체액 및 CD4+ T 세포 반응이 면역화된 숙주에서 검출되었지만, gD2/AS04가 CD8+ T 세포 반응을 유발하는데 효과적인지는 명확하지 않다 (31, 32). 이 연구는 gD2 및 다른 HSV 바이러스 항원 모두에 대해 더 광범위한 체액 반응 및 CD4 및 CD8 T-세포 반응을 유발하는 HSV 백신에 대한 필요성이 있다는 것을 제시한다 (29, 31, 32).
바이러스 백신
숙주에서 면역원을 새로 합성할 수 있는 생 바이러스 백신은 펩티드 또는 단백질만으로 구성된 백신보다 더 광범위하고 더 지속된 면역 반응을 유도한다는 것이 잘 기록되었다. 다양한 형태의 복제-결손 HSV 및 신경약독화된, 복제-적격 돌연변이체가 개발되었고, HSV 감염에 대한 잠재적인 백신으로서 시험되었다 (미국 특허 제7,223,411호; (18)).
복제-결손 바이러스 및 신경약독화된 돌연변이체 모두는 야생형 바이러스로 동시-복제될 수 있거나 또는 야생형 바이러스에 대해 복제-적격이 될 수 있기 때문에, 인간에서, 특히 잠복 HSV 감염을 보유하는 개체에서 백신으로서의 그들의 사용은 안전 우려를 제기한다 (33). 복제-결손 HSV-1 돌연변이체가 설치류 뇌에서 잠복 HSV-1 극-초기 (immediate-early) 프로모터를 재활성화시킬 수 있는 관찰은 상기 재조합체가 잠복 감염된 개체에서의 증식성 바이러스 감염의 돌발을 유발하는 가능성에 대해 추가의 안전 우려를 제기하였다 (63). 따라서, 바람직한 복제-결손 재조합 HSV 백신은 바이러스-코딩된 항원의 광범위한 스펙트럼을 발현하는 능력을 보유해야할 뿐만 아니라, 또한 동일한 세포 내에서 접한 경우, 야생형 HSV의 용균성 감염을 방지할 수 있는 독특한 기능을 코딩해야 한다. 상기 안전성 기전은 숙주에서의 야생형 바이러스로의 백신 벡터의 재조합에 의해 야기된 백신 바이러스의 잠재적인 돌발을 최소화할 것이다.
발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 HSV-2 감염에 대해 안전하고 효과적인 재조합 바이러스 백신을 개발하기 위한 테트라시클린 유전자-스위치 (switch) 기술 (T-REx, Invitrogen) (73)의 사용 및 HSV-1 UL9 폴리펩티드, 예를 들면 UL9-C535C의 우성-음성 돌연변이체 형태를 기반으로 한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 복제-결손, 우성-음성 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 재조합 바이러스에 대한 것이다. 바이러스의 게놈은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 제1 HSV-2 글리코단백질 D (gD2)를 코딩하는 제1 서열, 및 바람직하게는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 HSV-2 gD2를 코딩하는 제2 서열을 갖는다. 프로모터(들)은 제1 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열 및 제2 tet-O 서열에 각각 작동가능하게 연결되며, 이들 각각은 tet 억제자가 없는 경우 전사가 진행되도록 하지만, 억제자에 의해 결합된 경우 전사를 차단한다. 게놈은 또한 적어도, 제3 프로모터에 연결된 HSV-1 또는 HSV-2 UL9 단백질의 제1 우성 음성 돌연변이체 형태를 코딩하는 제3 서열, 및 바람직하게는 제4 프로모터에 연결된 HSV-1 또는 HSV-2 UL9 단백질의 제2 우성 음성 형태를 코딩하는 제4 서열을 포함한다. 제1 및 제2 프로모터와 유사하게, 제3 및 제4 프로모터는 각각 tet-O 서열에 작동가능하게 연결되며, 이들은 tet 억제자에 의해 결합된 경우 전사를 차단한다. 추가로, 바이러스의 게놈은 기능적 ICP0 단백질을 코딩하는 서열의 부재에 의해 특징지어진다. 항원성을 증대시키기 위해, 게놈은 바람직하게는 또한 면역조정 유전자, 예를 들면 IL12 또는 IL15 및/또는 HSV-1 또는 HSV-2 주요 항원, 예를 들면 gB 또는 gC를 발현해야 한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 정상 기능을 수행할 수 있게 하는 방식으로 함께 연결된 유전적 요소를 지칭한다. 예를 들면, 유전자는 그의 전사가 프로모터의 조절하에 전사되는 경우 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 이 전사는 일반적으로 유전자에 의해 코딩되는 생성물의 생성을 야기한다. tet 작동자 서열은 작동자가 결합된 tet 억제자의 존재하에는 프로모터로부터 전사를 차단하지만, 억제자의 부재하에 전사가 되도록 하는 경우 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 용어 "재조합"은 언젠가, 핵산 서열 및 서열 요소의 재조합, 및 이들 재조합된 서열의 바이러스 또는 조상 바이러스로의 도입에 의해 형성된 핵산 서열을 갖는 바이러스를 지칭한다.
바람직하게는, 사용된 프로모터는 TATA 요소를 갖는 프로모터이며, 프로모터에 연결된 tet 작동자 서열은 2 내지 20개 연결 뉴클레오티드에 의해 함께 연결된 2개의 op2 억제자 결합 부위를 갖는다. 작동자 서열의 위치결정은 프로모터에 대한 효과적인 조절을 달성하기 위해 중요하다. 구체적으로, 작동자 서열에서의 제1 뉴클레오티드는 TATA 요소의 마지막 뉴클레오티드의 3'의 6 내지 24개 뉴클레오티드 사이에 위치해야 한다. 예를 들면, gD 또는 UL9의 우성-음성 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 구조적 서열은, 작동자의 3'에 위치할 것이다. 특히 바람직한 프로모터 중에는 hCMV 극초기 프로모터 및 HSV-1 또는 HSV-2 극초기 프로모터가 있다. HSV-1 또는 HSV-2 ICP4 프로모터가 특히 바람직하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HSV 발현에 대해 예방적 또는 치료적으로 사용될 수 있으며, 상기 기재된 재조합 바이러스 중 하나 이상을 단위 투여 형태로 포함하는 백신에 관한 것이다. 용어 "단위 투여 형태"는 단일 약물 투여 독립체, 예를 들면 정제 또는 캡슐을 지칭한다. 바람직하게는 "단위 투여 형태"는 선택된 부피 (단위 투여량)가 환자에게 주사에 의해 투여된 경우 약물이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하는 농도에서 용해된 용액일 것이며, 주사 바이알 내에서 발견될 것이다. 마우스에서 사용된 효과적인 투여량 (2 x 106 PFU)을 기반으로하여, 인간에서의 최소의 효과적인 투여량은 약 1 x 107 pfu이어야한다는 것으로 여겨진다. 따라서, 단위 투여량은 적어도 이 양, 전형적으로 1 x 107 - 1 x 109 pfu의 바이러스를 가져야 한다. 백신은 동결건조된 형태로 저장될 수 있으며, 투여 전에 제약상 허용되는 담체로 재구성될 수 있다.
별법으로, 제제는 비히클 그 자체에 저장될 수 있다. 백신의 단일 투여량의 부피는 변할 것이지만, 일반적으로 약 0.1 ml 내지 10 ml, 더 전형적으로, 약 0.2 ml 내지 5 ml이어야 한다.
본 발명은 또한 환자에의 상기 기재된 백신의 투여에 의한 HSV-1 또는 HSV-2 감염에 대한 환자의 면역화 방법 및 상기 감염으로부터 야기되는 상태 (예를 들면, 생식기 헤르페스 궤양)를 포함한다. 백신은 또한 바이러스의 돌발을 예방 또는 감소시키기 위해 감염된 환자에게 투여될 수 있다. 바이러스의 파괴를 야기하지 않는 환자에게 백신을 투여하기 위한 임의의 방법은 본 발명과 양립될 수 있다. 일반적으로, 투여는 비경구 수단, 예를 들면 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 투여일 것이다. 백신의 투여의 투여량 및 스케쥴링은 당업계의 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 제제는 단일 또는 다중 주사 중 하나로 투여될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B: 도 1A는 우성-음성 및 복제-결손 HSV-2 재조합체 N2-C535C 및 CJ2-gD2의 구축에 사용된 플라스미드의 도식을 나타낸다. 플라스미드 pHSV-2/ICP0는 HSV-2 ICP0 오픈 리딩 프레임의 268 bp 상류 (회색 박스) 내지 ICP0를 코딩하는 서열의 폴리 A 신호의 40 bp 하류를 포함하는 HSV-2 ICP0 서열을 함유하는 플라스미드이다. pHSV2.ICP0-V는 Xho I-ICP0 DNA 단편을 함유하는 서열을 Xho I-함유 다중 클로닝 서열 (MCS)로 대체함으로써 구축되었다. pHSV2.ICP0-lacZ는 LacZ 유전자 (줄무늬가 있는 박스)를 pHSV2.ICP0-V의 MCS 영역에 삽입함으로써 생성되었다. p02lacZ-TOC535C는 pHSV2.ICP0-lacZ의 나타낸 lacZ-함유 단편을 tetO-함유 hCMV 주요 극-초기 프로모터 (줄쳐진 박스, CMVTO)의 조절하에 UL9-C535C (검은색 박스)를 코딩하는 DNA 서열로 대체함으로써 구축되었다. p021acZTO-gD2.C535C는 p021acZTO-C535C의 나타낸 SnaB I/Pst I 단편을 tetO-함유 HSV-1 극-초기 ICP4 프로모터 (백색 박스, ICP4TO)의 조절하에 gD2 유전자 (구배가 있는 박스)를 코딩하는 DNA 서열로 대체함으로써 구축되었다.
도 1B는 야생형 HSV-2, HSV-2 ICP0 무효 돌연변이체 (N2-lacZ), N2-C535C 및 CJ2-gD2의 게놈의 도식을 나타낸다. UL 및 US는 각각 HSV-2 게놈의 독특한 긴 및 독특한 짧은 영역을 나타내며, 이들은 그들의 상응하는 역방위 반복 영역 (백색 박스)의 측면에 위치한다. ICP0 코딩 서열의 복사본 모두의 N2-lacZ에서의 lacZ 유전자 및 (1) N2-C535C에서의 tetO-보유 hCMV 주요 극-초기 프로모터의 조절하에 UL9-C535C를 코딩하는 DNA 서열, 및 (2) 나타낸 tetO-보유 프로모터하에 UL9-C535C 및 gD2 모두를 반대 방향으로 코딩하는 DNA 서열로의 대체는 HSV-2 게놈의 확장된 ICP0 코딩 서열 아래에 나타낸다.
도 2A 및 2B: 이들 도면은 베로 세포의 CJ2-gD2 감염 후 gD2 및 UL9-C535C의 높은-수준 발현을 나타낸다. 도 2A에서, 2벌의 베로 세포는 야생형 HSV-2, N2-lacZ, N2-C535C, 또는 CJ2-gD2로 10 PFU/세포의 MOI에서 모의-감염되거나 또는 감염되었다. 감염된 세포 추출물을 감염 후 9시간에서 제조하였다. 도 2B에서, 베로 세포는 야생형 HSV-1 균주 KOS, CJ9-gD, 야생형 HSV-2, 또는 CJ2-gD2로 10 PFU/세포의 MOI에서 감염되었다. 감염된 세포 추출물은 감염 후 9시간에서 제조되었다. 감염된 세포 추출물에서의 단백질을 SDS-PAGE 상에서 용해시키고, 이어서 ICP27 및 gB (Santa Cruz)에 대해 특이적인 HSV-1 gD (R45), UL9, 또는 모노클로날 항체에 대해 폴리클로날 항체로 면역블럿팅하였다.
도 3: 도 3은 CJ2-gD2-감염된 VCEP4R-28 세포에서 tetR에 의한 gD2 및 UL9-C535C 발현의 조절을 나타낸다. VCEP4R-28 세포는 60-mm 접시 당 5 x 105개 세포에서 시딩되었다. 시딩 후 40시간에서, 2벌의 세포는 테트라시클린의 존재 또는 부재하에 10 PFU/세포의 MOI에서 야생형 HSV-2 또는 CJ2-gD2로 모의-감염되거나 또는 감염되었다. 감염된 세포 추출물을 감염 후 9시간에서 제조하고 이어서 HSV gD 및 UL9에 대한 폴리클로날 항체, 및 ICP27에 대해 특이적인 모노클로날 항체로 면역블럿팅하였다.
도 4A 및 4B: 이들 도면은 야생형 HSV-2의 복제에 대한 CJ2-gD2의 트랜스-우성-음성 효과를 나타낸다. 도 4A에서, 3벌의 베로 세포는 2 PFU/세포의 MOI에서의 야생형 HSV-2 균주 186, 2 PFU/세포의 MOI에서의 186 및 5 PFU/세포의 MOI에서의 CJ2-gD2, 또는 2 PFU/세포의 MOI에서의 186 및 5 PFU/세포의 MOI에서의 N2-lacZ 중 하나로 감염되었다. 도 4B에서, 베로 세포는 5 PFU/세포의 MOI에서 야생형 HSV-2로 단일 감염되고, 두 바이러스 모두에 대해 5 PFU/세포의 MOI에서 186 및 CJ2-gD2로 동시-감염되거나, 또는 15 PFU/세포의 MOI에서 186으로 단일 감염되고, 15 PFU/세포의 MOI에서의 186 및 5 PFU/세포의 MOI에서의 CJ2-gD2로 공동-감염되었다. 감염된 세포는 감염 후 18시간에서 수거되고, 바이러스 역가는 베로 세포 단층 상에서 결정되었다. 바이러스 역가는 평균 +/- SD로서 표현된다. 그래프 위의 수는 단일 감염 및 동시-감염 사이의 야생형 바이러스 수율의 배수 감소를 나타낸다.
도 5A 및 5B: 이들 도면은 뇌내 접종 후 BALB/c 마우스에서의 야생형 HSV-2, 균주 186, N2-lacZ, N2-C535C, 및 CJ2-gD2의 신경독력 나타낸다. 4 내지 6주된 암컷 BALB/c 마우스는 무작위로 각각 8개 마우스의 5개 군으로 배정되었다. 마우스는 나트륨 펜토바비탈로 마취되고, DMEM, 25 PFU/마우스의 야생형 HSV-2 균주 186, 1 x 106 PFU/마우스의 N2-lacZ, 2.5 x 106 PFU/마우스의 CJ2-gD2 또는 N2-C535C 중 하나로 뇌내 주사를 통해 뇌의 좌측 전두엽에 20 μl의 부피로 4 mm의 깊이에 접종되었다. 마우스는 접종 35일 후 질환의 징후 및 증상에 대해 검사되었다. 도 5A는 주사 후 여러 일에서의 질환 점수를 나타내며, 도 5B는 생존한 마우스의 백분율을 나타낸다.
도 6A 및 6B: 도 6A 및 6B는 gD2-특이적 항체 및 HSV-2-중성화 반응의 유도에 관한 것이다. 4 내지 6주된 암컷 BALB/c 마우스는 DMEM (n = 7, 6, 8, 8)으로 허위-면역화되거나 또는 CJ2-gD2 (n= 7, 6, 8, 8), N2-C535C (n= 7, 8, 6), 또는 CJ9-gD (n= 6, 8, 6)로 2 x 106 PFU/마우스의 투여량으로 면역화되었고, 2주 후 추가접종되었다. 혈액은 1차 면역화 4-5주 후 마우스의 꼬리 정맥으로부터 수득되었다. 도 6A에서, 마우스의 개별 군으로부터의 혈청은 풀링되었고, 열-활성화되었다. HSV-2-특이적 중성화 항체 역가가 결정되었다. 결과는 평균 역가 ± SEM을 나타낸다. 도 6B에서, 허위-면역화된, CJ2-gD2-, N2-C535C-, 또는 CJ9-gD-면역화된 마우스로부터의 혈청은 gD2-발현 플라스미드 p02.4TO-gD2로 형질감된 U2OS 세포로부터 제조된 세포 추출물로 인큐베이션되었다. gD/마우스 IgG-특이적 복합체는 단백질 A로 침전되고, SDS-PAGE 상에서 용해되고, gD-특이적 폴리클로날 항체, R45로 프로빙되었다.
도 7A-7D: 이들 도면은 CJ2-gD2-면역화된 마우스에서의 HSV-2-특이적 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응의 유도에 관한 것이다. 암컷 BALB/c 마우스는 허위-면역화되거나 또는 마우스 당 2 x 106 PFU로 CJ2-gD2로 2회 2주 간격으로 면역화되었다. 도 7A 및 7B에서, 허위-면역화된 및 면역화된 마우스는 모의-감염되거나 또는 야생형 HSV-2 s.c.로 1 x 104 PFU/마우스의 투여량으로 추가접종 면역화 (n=3) 후 9-10주에서 감염되었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 항원투여 후 5일차에 IFN-γ ELISPOT 검정에 의해 다이날 마우스 CD4- 및 CD8-음성 키트를 사용하여 마우스 비장로부터 단리된 개별적으로 정제된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 분석되었다. 도 7C 및 7D에서, 허위-면역화된 및 CJ2-gD2 면역화된 마우스는 모의-감염되거나 또는 야생형 HSV-2로 추가접종 면역화 후 5-6주에서 감염되었고, 이어서 감염 후 (n=3) 4일차에 IFN-γ ELISPOT 검정되었다. IFN-γ 점-형성 세포 (SFC)의 수는 백만 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 당 평균 ± SEM으로서 표현되었다.
도 8: 도 8은 CJ2-gD2로 면역화된 마우스에서의 항원투여 HSV-2 질 복제의 감소를 나타낸다. 4 내지 6주된 암컷 BALB/c 마우스는 무작위로 각각 10개 마우스의 4개 군으로 배정되었다. 마우스는 DMEM으로 모의-면역화되거나 또는 CJ2-gD2, N2-C535C, 또는 CJ9-gD으로 2 x 106 PFU/마우스의 투여량으로 면역화되었다. 마우스는 2주 후 추가접종되었다. 5주에서, 마우스는 메드록시프로게스테론으로 예비처리되고, 5 x 105 PFU의 HSV-2 균주 G로 질내로 항원투여되었다. 질 도말은 항원투여 후 1, 2, 3, 5, 및 7일차에 채취되었다. 도말 물질에서의 감염성 바이러스는 베로 세포 단층 상에서 표준 플라크 검정에 의해 평가되었다. 바이러스 역가는 개체 질 도말에서의 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 9A 및 9B: 이들 도면은 CJ2-gD2로 면역화된 마우스에서의 HSV-2 질환의 예방을 나타낸다. 야생형 HSV-2로의 항원투여 후, 도 8의 범례에 기재된 개별 마우스는 21일 추적 기간 동안 생식기 및 파종 HSV-2 질환의 발생률 (도 9A) 및 생존 (도 9B)에 대해 다음 등급을 사용하여 관찰되었다: 0= 징후가 없음, 1= 약간의 생식기 홍반 및 부종, 2= 보통의 생식기 염증, 3= 화농 생식기 병변 및/또는 전신성 질환, 4= 뒷다리 마비, 및 5= 사망.
도 10: 도 10은 HSV-1 UL9-C535C 코딩 서열 (서열 2)을 나타낸다. UL9-C535C는 UL9 아미노산 1-10, Thr-Met-Gly 트리펩티드, 및 UL9의 아미노산 535 내지 851로 구성된다 (문헌 [Yao, et al.] 참조 (69)).
발명의 상세한 설명
본 발명은 복제 결손이고 야생형 HSV 감염을 억제할 수 있는 (우성-음성) HSV 재조합 바이러스를 개발하기 위한 테트라시클린 유전자-스위치 기술 및 HSV-1 UL9의 우성-음성 돌연변이체 폴리펩티드를 사용하는 개념을 기반으로 한 것이다. CJ9-gD는 원형 우성-음성, 복제 결손 HSV-1 재조합 바이러스이고, HSV 바이러스 DNA 복제에 독립적으로 높은-수준의 HSV-1 주요 항원 글리코단백질 D (gD)를 발현한다 (7). 그의 가장 바람직한 형태에서, 본 발명은 tetO-보유 HSV-1 주요 극-초기 ICP4 프로모터에 의해 유도된 HSV-2 gD (gD2) 유전자의 2개 복사본을 코딩하는 우성-음성 및 복제-결손 HSV-2 재조합체 (CJ2-gD2)를 사용한다. CJ2-gD2는 gD2를 야생형 HSV-2만큼 효율적으로 발현하고, 동시-감염된 세포에서 야생형 HSV-2의 복제에 대해 강력한 트랜스-억제 효과를 가할 수 있다. CJ2-gD2로의 면역화는 효과적인 HSV-2-특이적 중성화 항체 및 T-세포 반응을 유발하고, 마우스에서 야생형 HSV-2에 의한 질내 감염에 대한 완전한 보호를 제공한다.
CJ2-gD2는 야생형 HSV-2 생식기 감염 및 질환에 대해 CJ9-gD보다 더 효과적인 백신이다. 추가로, CJ2-gD2의 높은 투여량의 뇌내 주사는 마우스에서 사망률 또는 이환율을 야기시키지 않는다. 총괄하여, 이들 관찰은 CJ2-gD2는 전통적인 복제-결손 바이러스 백신 및 HSV-2 서브유닛 백신보다 인간에서의 HSV-2 생식기 감염 및 질환에 대한 보호에 대해 이점을 갖는다는 것을 제시한다.
Tet 작동자 /억제자 스위치 및 재조합 DNA
본 발명은 특히, 발현이 테트라시클린 작동자 및 억제자 단백질에 의해 조절되는 유전자를 갖는 바이러스에 관한 것이다. 이들 요소 및 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법은 이전에 기재되었으며 (미국 특허 제6,444,871호; 제6,251,640호; 및 제5,972,650호 참조), 테트라시클린-유도가능한 전사 스위치를 함유하는 플라스미드는 시판된다 (T-RExTM, Invitrogen, CA).
본 발명의 DNA의 필수적인 특징은 프로모터에 실시 가능하게 연결된, 바람직하게는 TATA 요소를 갖는 유전자의 존재이다. tet 작동자 서열은 프로모터의 TATA 요소의 마지막 뉴클레오티드의 3' 및 유전자의 5'의 6 내지 24개 뉴클레오티드에 위치한다. 바이러스는 유전자 전사를 차단하고 바이러스 복제를 허락하기 위해 tet 억제자를 발현하는 세포에서 성장될 수 있다. 작동자 서열에 결합하는 tet 억제자의 강도는 2-20의 서열, 바람직하게는 1-3 또는 10-13 뉴클레오티드에 의해 연결된 2개의 op2 억제자 결합 부위 (각각 뉴클레오티드 서열: TCCCTATCAGTGATAGAGA (서열 1)를 갖는 상기 부위)를 함유하는 작동자의 형태를 사용함으로써 증대된다. 억제자가 이 작동자에 결합된 경우, 연관된 유전자의 매우 적은 전사가 발생하거나 또는 전사가 발생하지 않을 것이다. 또한 테트라시클린 억제자를 발현하는 이들 특징을 갖는 DNA가 세포에 존재하는 경우, 바이러스 감염을 예방할 수 있는 유전자의 전사는 억제자가 작동자에 결합함으로써 차단될 것이며, 바이러스의 복제가 발생할 것이다.
프로모터 및 유전자의 선택
증식성 감염 중, HSV 유전자 발현은 발현의 시간적 순서를 기반으로 하여 3개의 주요 클래스: 극-초기 (α), 초기 (β), 및 후기 (γ)로 나뉘며, 여기서 후기 유전자는 2개의 군, γ1 및 γ2로 더 나뉜다. 극-초기 유전자의 발현은 새로운 바이러스 단백질 합성을 요구하지 않으며, 바이러스 DNA가 핵에 진입하는 경우 세포 전사 인자와 함께 바이리온 (virion)-연관된 단백질 VP 16에 의해 활성화된다. 극-초기 유전자의 단백질 생성물은 감염된 세포 폴리펩티드 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, 및 ICP47로 지정되며, 바람직하게는 이들 유전자의 프로모터가 본원에 논의된 재조합 유전자의 발현을 지시하는데 사용된다.
ICP0는 잠복기로부터 HSV의 재활성화를 증대시키는데 주요 역할을 하고, 감염의 낮은 다중도에서의 바이러스에 대한 유의한 성장 이점을 부여한다. ICP4는 바이러스 초기 및 후기 유전자의 발현을 활성화시키는 HSV-1의 주요 전사 조절 단백질이다. ICP27은 증식성 바이러스 감염에 대해 필수적이고, 효율적인 바이러스 DNA 복제 및 바이러스 γ 유전자 및 바이러스 β 유전자의 부분집합의 최적의 발현을 위해 요구된다. HSV 감염 중의 ICP47의 기능은 감염된 세포의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I의 발현을 하향-조절하는 것으로 나타난다.
HSV-1 UL9-C535C의 코딩 영역의 HSV-1 게놈 서열의 전장 서열은 도 10 (서열 2)에 나타난다. 재조합 바이러스의 사용을 위해 기재된 다른 서열은 모두 당업계에 공지되어있다. 예를 들면, HSV-1에 대한 전장 게놈 서열은 젠뱅크 (GenBank) 서열 X14112로서 찾을 수 있다. HSV-1 ICP4 서열은 젠뱅크 수 X06461로서 찾을 수 있고; HSV-1 글리코단백질 D는 젠뱅크 서열 J02217로서 찾을 수 있고; HSV-2 글리코단백질 D는 젠뱅크 수 K01408로서 찾을 수 있으며; HSV-1 UL 9 유전자는 젠뱅크 서열 M19120으로서 찾을 수 있다 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
Tet 억제자의 포함 및 바이러스의 제조
HSV ICP0 및 ICP4 프로모터 및 이들이 내인적으로 조절하는 유전자에 대한 서열은 당업계에 (43, 44, 56) 공지되어있으며, 이들 요소를 함유하는 바이러스 벡터의 제조 절차는 이전에 기재되었다 (미국 발행된 출원 제2005-0266564호 참조). 이들 프로모터는 유전자 발현을 촉진시키는데 매우 활성을 가질 뿐 아니라, 이들은 또한 특히 HSV-1 또는 HSV-2가 세포를 감염하는 경우 방출되는 트랜스활성제, VP 16에 의해 유도된다.
적절한 DNA 구축물이 생성된 후, 이들은 HSV-2 바이러스에 당업계에 공지된 방법을 사용하여 도입될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Yao et al.] 참조 (68)).
면역화 방법
본원에 기재된 바이러스는 개체 및/또는 환자를, 전형적으로 백신으로서 주사에 의해 면역화시키기 위해 사용될 것이다. 백신은 HSV-1 또는 HSV-2 감염을 예방하기 위해 예방적으로 또는 이미 발생한 HSV-1 또는 HSV-2 감염의 중증도를 감소시키기 위해 치료적으로 모두 사용될 수 있다. 백신을 제조하기 위해, 바이러스는 무균 등장성 식염수, 물, 포스페이트 완충된 식염수, 1,2-프로필렌 글리콜, 물과 혼합된 폴리글리콜, 링거액 등을 포함하는 임의의 제약상 허용되는 용액 중에 현탁될 수 있다. 투여되는 바이러스의 정확한 수는 본 발명에 중요하지는 않지만, "효과적인 양," 즉 HSV 감염을 억제하기 위해 충분히 강력한 면역학적 반응을 야기하기 위해 충분한 양이어야 한다. 일반적으로, 초기에 투여된 바이러스의 수 (PFU)는 1 x 107 및 1 x 1010 사이일 것으로 예상된다.
투여량의 효과, 및 전체 치료의 효과는 HSV를 공격하는데 효과적인 항체의 존재에 대한 시험을 위한 표준 면역학적 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 면역학적 주사는 원하는 만큼 여러 차례 반복될 수 있다.
실시예
본 실시예는 HSV-2 재조합 바이러스의 생성 및 그의 면역학적 효과를 결정하기 위한 시험을 기재한다.
I. 재료 및 방법
세포
아프리카 녹색 원숭이 신장 (African Green Monkey Kidney)(베로 (Vero)) 세포 및 골육종 주 U2OS 세포를 성장시키고, 100 U/ml 페니실린 G 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 술페이트 (GIBCO, Carlsbad, CA) (71)의 존재하에 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum)(FBS)으로 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM; Sigma Aldrich) 중에 유지하였다. U2OS 세포는 HSV-1 ICP0 결실 (71)에 대해 기능적으로 보완할 수 있다. U2CEP4R11 세포는 50 μg/ml (73)에서 DMEM 및 10% FBS 및 히그로마이신 B 중에 유지된 tetR-발현 U2OS 세포이다. VCEP4R-28 세포는 50 μg/ml (73)에서 DMEM 및 10% FBS 및 히그로마이신 B 중에 유지된 tetR-발현 베로 세포이다.
플라스미드
플라스미드 pHSV2/ICP0는 HSV-2 ICP0 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 268 bp 상류 내지 ICP0 코딩하는 서열의 폴리 A 신호의 40 bp 하류를 포함하는 PCR 증폭된 HSV-2 ICP0 서열을 코딩하는 pUC19 유도된 플라스미드이다. pHSV2.ICP0-V는 ICP0의 개시 코돈의 25 bp 상류 서열 내지 ICP0 ORF의 정지 코돈의 397 bp 상류 서열을 함유하는 Xho I-ICP0 DNA 단편을 Xho I-함유 다중 클로닝 서열 (MCS)로 대체함으로써 플라스미드 pHSV-2/ICP0로부터 유도된 HSV-2 ICP0 클로닝 플라스미드이다. 플라스미드 pHSV2.ICP0-lacZ를 pcDNA3-lacZ의 Hind III-Not I-LacZ 유전자-함유 단편을 pHSV2.ICP0-V의 Hind III-Not I 부위에 삽입함으로써 생성하였다. pcmvtetO-UL9C535C는 tetO-함유 hCMV 극-초기 프로모터 (68)의 조절하에 UL9-C535C를 코딩하는 플라스미드이다. tetO-함유 hCMV 주요 극-초기 프로모터 (도 1A)에 의해 유도된 UL9-C535C를 발현하는 p02lacZ-TOC535C를 pHSV2.ICP0-lacZ의 EcoR I/Age I-lacZ 함유 단편을 pcmvtetOUL9-C535C (69)의 EcoR I/Hind III - hcmvtetO-UL9C535C 함유 단편으로 대체함으로써 구축하였다.
pAzgD-HSV-2는 파트리샤 스피어 박사 (Dr. Patricia Spear)(Northwestern University)로부터 제공된 HSV-2 gD2-코딩하는 플라스미드이다. pICP4TO-hEGF는 ICP4 유전자의 전사 출발 부위에 대해 -377 bp 내지 -19 bp의 HSV-1 ICP4 프로모터 서열로 구성된 tetO-보유 HSV-1 극-초기 ICP4 프로모터의 조절하에 인간 표피 성장 인자를 발현한다. 플라스미드 pcmvtetO-hEGF (73)에서의 tetO-보유 hCMV 주요 극-초기 프로모터와 유사하게, tetO-함유 ICP4 프로모터는 ICP4 TATA 요소, TATATGA의 10 bp 하류에서 tet 작동자의 2개의 탠덤 복사본을 함유한다. 따라서, pcmvtetO-hEGF와 유사하게, pICP4TO-hEGF로부터의 hEGF-발현은 tetR의 존재하에 테트라시클린에 의해 엄격하게 조절될 수 있으며, tetO의 삽입은 tetR의 부재하에 ICP4 프로모터 활성에 대해 아무런 효과를 갖지 않는다. pICP4TO-hEGF에서의 tetO-보유 ICP4 프로모터와 연관된 추가의 독특한 특징은 야생형 ICP4 프로모터에서의 ICP4 유전자 (51)의 전사 개시 부위를 포괄하는 ICP4 DNA 결합 서열 ATCGTCCACACGGAG (서열 3)의 부재이다. 따라서, ICP4 (16, 57)에 의한 자가-조절이 적용되는 야생형 ICP4 프로모터와는 달리, pICP4TO-hEGF에서의 tetO-보유 ICP4 프로모터는 HSV-1 주요-조절 단백질 ICP4에 의해 억제되지 않을 것이다.
tetO-함유 ICP4 프로모터의 조절하에 gD2를 클로닝하기 위해, 본 발명자들은 먼저 플라스미드 p02ICP4-TO를 pICP4TO-hEGF에서의 Sma I-Bam HI tetO-함유 ICP4 프로모터를 벡터 pHSV2.ICP0-V의 MCS 내에 클로닝함으로써 구축하였다. p02.4TO-gD2는 pAzgD-HSV-2의 gD2 유전자를 tetO-보유 ICP4 프로모터의 조절하에 코딩하는 p02ICP4-TO 유도된 플라스미드이다.
hCMV 프로모터의 -236 bp에서 5' 말단절단 및 tetO-ICP4 프로모터 (도 1A)의 조절하에 gD2 유전자를 갖는 tetO-보유 hCMV 극-초기 프로모터의 조절하에 UL9-C535C를 코딩하는 플라스미드 p021acZTO-gD2.C535C를 p021acZTO-C535C의 SnaB I/Pst I 단편을 p02.4TO-gD2의 Hind III/Pst I-gD2-함유 단편으로 대체함으로써 생성하였다. p021acZTO-gD2.C535C에서 UL9-C535C 유전자 및 gD2 유전자의 전사는 반대 방향이다.
바이러스
야생형 HSV-2, 균주 186 및 G를 증식시키고, 베로 세포 상에서 플라크-검정하였다. N2-lacZ는 U2OS 세포의 Nhe I-선형화된 pHSV2.ICP0-lacZ로의 형질감염에 의한 상동 재조합에 이어서 이전에 기재된 바와 같은 HSV-2 중복감염을 통해 ICP0 유전자의 복사본 모두가 pHSV2.ICP0-lacZ에서의 Lac Z 유전자에 의해 대체된 HSV-2 ICP0 프로모터의 조절하에 Lac Z 유전자를 코딩하는 HSV-2 ICP0 무효 돌연변이체이다 (74). ICP0 유전자의 ICP0 로커스에서의 Lac Z 유전자로의 대체를 lac Z 유전자에 대해 특이적인 ICP0 유전자 및 프라이머의 측면에 위치한 프라이머로 N2-lacZ 바이러스 DNA의 PCR 분석에 의해 확인하였다 (41, 74).
N2-C535C는 Lac Z 유전자의 2개 복사본 모두가 플라스미드 p02lacZ-TOC535C에서의 tetO-함유 hCMV 프로모터의 조절하에 UL9-C535C를 코딩하는 DNA 서열로 대체된 N2-lacZ의 유도체이다 (도 1B). 간략히 말하면, U2CEP4R11 세포를 선형화된 p02lacZ-TOC535C 및 감염성 N2-lacZ 바이러스 DNA로 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000에 의해 동시-형질감염시켰다. 형질감염의 자손을 N2-lacZ의 lacZ 유전자의 cmvtetOUL9-C535C를 함유하는 DNA 서열로의 재조합성 대체에 대해 표준 플라크 검정에 의해 스크리닝하였다. 플라크를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-D-갈락토피라노시드 (X-Gal)로 감염 후 96시간에서 염색하였다. lacZ 유전자의 두개 복사본 모두의 UL 9-C535C DNA-코딩하는 서열에 의한 대체를 나타내는 백색 플라크를 단리하였다. N2-C535C로 지정된 단리체 중 하나는 4회의 플라크 정제 후 균일한 백색 플라크를 수득하였다.
CJ2-gD2는 Lac Z 유전자의 두개 복사본 모두를 ICP4 유전자의 전사 출발 부위에 대해 -377 bp 내지 -19 bp의 HSV-1 ICP4 프로모터 서열로 구성된 tetO-함유 HSV-1 ICP4 프로모터 (도 1B)의 조절하에 UL9-C535C를 코딩하는 DNA 서열로 tetO-보유 hCMV 주요 극-초기 프로모터 및 gD2 하에 N2-lacZ에서의 ICP0 로커스에서 대체함으로써 구축하였다 (71).
SDS - PAGE 및 웨스턴 블럿 분석
60 mm 접시에서 7.5 x 105 세포/접시로 시딩된 베로 세포를 10 PFU/세포의 MOI로 모의-감염시키거나 또는 나타낸 바이러스로 감염시켰다. 세포 추출물을 감염 후 9시간 또는 16시간에서 제조하였다 (72). 세포 추출물에서의 단백질을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)(9% 아크릴아미드)에 의해 용해시키고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막으로 이동시키고, HSV-1 gD에 대한 폴리클로날 항체 (R45, 개리 에이치. 코헨 및 로셀린 제이 아이센버그 박사 (Drs. Gary H. Cohen and Roselyn J Eisenberg)의 선물), UL9 (마크 찰버그 (Mark Challberg)의 선물) 또는 ICP27 및 gB에 대해 특이적인 모노클로날 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 중 하나로 프로빙하였다.
마우스
4-6주된 암컷 BALB/c 마우스를 찰스 리버 라보라토리즈 (Charles River Laboratories)(Wilmington, MA)로부터 로부터 구매하였다. 마우스를 케이지 당 4개 마우스로 금속 케이지 내에 보관하고, 12시간-명/암 주기를 유지하였다. 마우스를 실험 전에 1주 동안 보관 조건에 적응하도록 하였다. 모든 동물 실험을 동물에 대한 하버드 메디컬 에어리아 상임 위원회 (Harvard Medical Area Standing Committee on Animals) 및 미국 수의학 협회 (American Veterinary Medical Association)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
면역화 및 항원투여
BALB/c 마우스를 무작위로 다수의 군으로 나누고, 그들의 좌측 후부 옆구리의 털을 잘랐다. 마우스를 2 x 106 PFU/마우스의 CJ2-gD2, N2-C535C, CJ9-gD로 접종시키거나, 또는 30 μl s.c.의 부피의 DMEM으로 27-게이지 (gauge) 바늘로 장착된 1-ml 주사기를 사용하여 좌측 후부 옆구리에 모의-접종시켰다. 마우스를 2주 후 추가접종하고, 야생형 HSV-2 균주 G로 2차 면역화 3주 후 항원투여하였다. 항원투여 5일 전에, 마우스를 목 러프 (ruff)에 메드록시프로게스테론 (SICOR Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA)으로 마우스 당 3 mg으로 20 μl의 부피로 s.c. 주사하였다 (7, 50). 질내 항원투여를 위해, 모든 군의 마우스를 마취시키고, 칼슘 알기네이트 도말 (무균 요도-생식기 칼슘 알기네이트 티핑된 (tipped) 어플리케이터 (applicator), Puritan Medical Products company LLC, Guilford, Maine USA)로 예비도말하고, 5 x 105 PFU (50 LD50)의 HSV-2 균주 G를 함유하는 20 μl의 배양 배지로 질내 접종하였다 (50). 동물을 감염 후 30-45분 동안 마취의 영향하에 그들의 후부 부분이 상승된 채 눕혀 유지시켰다.
급성 감염 검정 및 임상적 관찰
항원투여 후 1, 2, 3, 5, 및 7일차에 질 점막을 칼슘 알기네이트로 도말하였다 (7). 면봉 물질의 감염성 바이러스를 베로 세포 단층 상에서 표준 플라크 검정에 의해 평가하였다. 야생형 HSV-2로의 항원투여 후, 마우스를 21일의 추적 기간 동안 생식기 병변 및 전신성 질환의 징후에 대해 매일 평가하였다. 질환의 중증도 점수를 다음과 같이 매겼다: 0= 헤르페스성 감염의 징후가 없음, 1= 약간의 생식기 홍반 및 부종, 2= 보통의 생식기 염증, 3= 화농 생식기 병변 및/또는 전신성 질환, 4= 뒷다리 마비, 및 5= 사망 (8, 50).
HSV -2-특이적 중성화 항체의 검출
혈액을 1차 면역화 4주 후 면역화된 및 모의-면역화된 마우스의 꼬리 정맥으로부터 수집하였다. 중성화 혈청 항체 역가를 이전에 기재된 바와 같이 상보체 (5-7)의 존재하에 250 PFU의 야생형 HSV-2 균주 186으로 결정하였다. 중성화 항체 역가를 배지 및 상보체 단독에서 수득된 HSV PFU에 비교하여 HSV PFU에서 50% 감소를 달성하기 위해 요구되는 최종 혈청 희석으로서 발현하였다.
면역침전
100-mm 접시 당 7.5 x 106 세포로 시딩된 U2OS 세포를 10 μg의 p02.4TO-gD로 리포펙타민 2000에 의해 시딩 후 24시간에서 모의-형질감염 또는 형질감염시켰다. 세포 추출물을 형질감염 후 48시간에서 제조하였다 (72). 면역침전을 모의-면역화된 및 면역화된 마우스로부터 수집된 10 μl의 풀링된 혈청을 상기 제조된 70 μl의 세포 추출물과 혼합함으로써 수행하였다. gD/마우스 IgG-특이적 복합체를 단백질 A로 침전시키고 (피어스 클래식 아이피 (Pierce Classic IP) 키트, Pierce Biotechnology, Rockford, IL), SDS-PAGE 상에서 용해시키고, 토끼 항-gD-특이적 폴리클로날 항체, R45로 프로빙하고, 이어서 HRP-접합된 염소-항-토끼 IgG와 반응시켰다 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
IFN -γELISPOT 검정
암컷 BALB/c 마우스를 DMEM으로 허위-면역화시키거나 또는 CJ2-gD2로 2 x 106 PFU/마우스의 투여량으로 2회 2주 간격으로 면역화시켰다. 2차 면역화 후 5 내지 10주에서, 허위-면역화된 및 CJ2-gD2-면역화된 마우스를 모의-항원투여하거나 또는 야생형 HSV-2 균주 186 s.c.로 1 x 104 PFU/마우스의 투여량으로 항원투여하였다. 비장세포를 마우스의 개체 군 (n = 3)으로부터 항원투여 후 4 또는 5일차에 단리하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 ELISPOT 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (42). 간략히 말하면, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 다이날 (Dynal) 마우스 CD4- 또는 CD8-음성 단리 키트를 사용하여 비장세포로부터 단리하고, 항-마우스 IFN-γ 특이적 모노클로날 항체 (AN18)로 예비-코팅된 96-웰 여과 플레이트에서 7.5 x 104 또는 1.5 x 105 세포/웰로 4벌로 시딩하였다. 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션 후 웰을 세척하고, 비오틴화된 IFN-γ 특이적 모노클로날 항체 (R4-6A2, Mabtech)와 실온에서 반응시키고, 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 (Mabtech)로 인큐베이션시켰다. IFN-γ 점-형성 세포를 BCIP/NBT 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 점을 해부 현미경에서 계수하고, IFN-γ 점-형성 세포 (SFC)의 수를 백만 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 당 평균 ± SEM으로서 나타냈다.
정량적 실시간 PCR
척수 및 후근절을 포함하는 척주의 아래 허리 및 천골 부분을 추가접종 면역화 16일 후 또는 CJ2-gD2 또는 CJ9-gD 중 하나로 면역화된 9 또는 10개 마우스로부터의 5 x 105 PFU의 HSV-2 균주 G로의 질내 항원투여 21일 후 수집하였다. 척주를 4개 조각으로 자르고, 각각 조각을 0.5 ml의 정상 성장 배지 중에 별도로 보관하였고, -80℃에서 추가의 처리를 위해 보관하였다. 총 DNA를 각각 후근절로부터 디엔이지 (DNeasy) 조직 키트 (Qiagen, Santa Clarita, CA)를 사용하여 단리하고, 400 μl AE 완충제 중에 현탁시켰다. HSV-2 DNA의 존재를 100 ng의 신경절 DNA 및 이전에 기재된 바와 같은 HSV DNA 폴리머라제 (전방향: 5' GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C (서열 4), 역방향: 5' CGG GGC GCT CGG CTA AC (서열 5))에 대해 특이적인 프라이머로의 실시간 PCR (Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System)에 의해 정량화하였다 (8). HSV-2 바이러스 DNA의 신뢰할만하게 검출될 수 있는 최소 복사본은 반응 당 1개 복사본이었다.
통계적 분석
통계적 분석을 위해 짝없는 (un-paired) 학생 t-시험 (Student's t-test)을 수행하였다. 결과는 P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 고려된다.
II. 결과
CJ2 - gD2 의 구축
gD2- 및 UL9-C535C-발현 우성-음성 및 복제-결손 HSV-2 재조합 바이러스를 생성하는 제1 단계로서, 본 발명자들은 HSV-2 균주 186에서의 ICP0 유전자의 2개 복사본 모두가 HSV-2 ICP0 프로모터 (도 1B)의 조절하에 LacZ 유전자에 의해 대체된 HSV-2 ICP0 결실 돌연변이체, N2-lacZ를 구축하였다. 본 발명자들은 HSV-1 ICP0 무효 돌연변이체 7314 (11)와 유사하게, 인간 골육종 주 U2OS 세포에 대한 N2-lacZ의 플라크-형성 효율이 베로 세포에서보다 425배 더 높은 것을 나타냈으며, 이는 U2OS 세포에서의 세포 활성은 또한 HSV-2 ICP0에 대해 기능적으로 치환할 수 있다는 것을 나타냈다. 야생형 HSV-2와 비교하여, 베로 세포에서의 N2-lacZ의 복제 효율은 0.1 PFU/세포의 MOI에서 600배 초과로 감소된다. 이 발견과 일관되게, 1 x 105 및 5 x 105 PFU/마우스에서의 N2-lacZ의 질내 접종은 국소 또는 전신성 질환을 야기하지 않았으며, 1 x 104 PFU/마우스의 야생형 HSV-2로 감염된 마우스에서는 심한 생식기 헤르페스가 발병하였으며, 이들 모두는 감염 후 11일 차까지 사망하였다. 추가로, N2-lacZ는 5 x 105 PFU/마우스의 투여량에서의 질내 감염 후 재활성화 가능한 잠복 감염을 확립하지 못한다. 이들 결과는 HSV-1 ICP0 (10, 11, 37, 64)와 유사하게, HSV-2 ICP0의 결실은 생체내에서 급성 및 재활성화 가능한 잠복 감염을 개시하는 바이러스의 능력을 유의하게 악화시키는 것을 나타낸다.
gD2 발현의 수준의 우성-음성 및 복제-결손 HSV-2 바이러스 재조합체에 의한 극대화를 목표하기 위해, 본 발명자들은 우성-음성 및 복제-결손 HSV-2 재조합체 (CJ2-gD2)를 N2-lacZ에서의 Lac Z 유전자의 두개 복사본 모두를 tetO-보유 HSV-1 주요 극-초기 ICP4 프로모터 및 UL9-C535C에 의해 유도된 gD2 유전자를 코딩하는 DNA 서열로 hCMV 극-초기 프로모터 (도 1B)의 전장의 -236 bp에서 말단절단을 갖는 tetO-함유 hCMV 주요 극-초기 프로모터의 조절하에 대체함으로써 구축하였다. 따라서, HSV-1 UL9 로커스에서의 tetO-함유 hCMV 프로모터에 의해 유도된 삽입된 HSV-1 gD 유전자의 단일 복사본을 코딩하는 CJ9-gD와 달리 (41), CJ2-gD2는 ICP4 유전자의 전사 출발 부위에 대해 -377 bp 내지 -19 bp의 HSV-1 ICP4 프로모터 서열로 구성된 tetO-보유 HSV-1 극-초기 ICP4 프로모터에 의해 조절되는 gD2 유전자의 2개 복사본을 함유한다. N2-C535C는 N2-lacZ에서의 Lac Z 유전자의 두개 복사본 모두가 전장 tetO-보유 hCMV 극-초기 프로모터의 조절하에 UL9-C535C에 의해 대체된 HSV-2 재조합체이다.
CJ2 - gD2 는 감염된 베로 세포에서 높은 수준의 gD2 및 UL9 - C535C 를 발현한다
tetO-보유 HSV-1 극-초기 ICP4 프로모터 및 hCMV 극-초기 프로모터로부터의 gD2 및 UL9-C535C의 발현을 각각 검사하기 위해, 베로 세포를 야생형 HSV-2, N2-lacZ, N2-C535C, 및 CJ2-gD2로 10 PFU/세포의 MOI에서 감염시키고, 감염 후 9시간에서 수거하였다. 감염된 세포 단백질을 HSV-1/2 ICP27 모노클로날 항체, UL9 폴리클로날 항체, 및 gD1 폴리클로날 항체 (R45)로의 웨스턴 블럿 검정에 의해 분석하였다. gD2와 유사하게, gB2가 중성화 항체 및 T-세포 반응에 대한 주요 표적이라는 것 및 γ1 생성물이라는 것을 고려하여, 감염된 세포 단백질을 또한 gB-특이적 모노클로날 항체로 프로빙하였다. 도 2A는 CJ2-gD2 및 N2-C535C가 야생형 HSV-2 및 N2-lacZ에 의해 발현된 수준과 유사한 수준의 HSV-2 극-초기 단백질 ICP27을 발현한다는 것을 나타낸다. CJ2-gD2- 및 N2-C535C-감염된 세포에서 UL9-C535C의 유의한 양을 검출한 반면, N2-C535C-감염된 세포에서 적은 gD2 또는 gB2를 검출하였다. 그러나, N2-C535C 감염과 대조하여, 베로 세포의 CJ2-gD2로의 감염은 야생형 HSV-2에 의해 감염된 세포에서의 수준과 유사한 수준으로 gD2의 높은-수준 발현을 야기하며, gD2 발현은 gB2 발현에 대해 아무런 효과를 갖지 않는다. 결과는 또한 HSV-1 ICP0 무효 돌연변이체 7134 (71)와 유사하게, N2-lacZ에서의 HSV-2 ICP0의 결실은 gD2 발현을 크게 감소시킨다는 것을 나타낸다. UL9의 진정 HSV 초기 프로모터 (68)로부터의 UL9의 매우 낮은-수준 발현으로 인해, 야생형 UL9는 이들 4개의 상이한 바이러스에 의해 감염된 세포 사이에서 검출되지 않았다. 추가로, 본 발명자들은 CJ2-gD2-감염된 세포에서 발현된 UL9-C535C의 수준은 N2-C535C에 의해 감염된 세포보다 지속적으로 더 높다는 것을 관찰하였으며, 이는 HSV-1 ICP4 프로모터 (71)에 존재하는 HSV VP16 반응성 요소, TAATGARAT는 기재된 혼성 ICP4/hCMV 프로모터 시스템의 hCMV-극-초기 프로모터로부터 UL9-C535C의 증대된 발현을 야기할 수 있다는 것을 제시한다.
도 2B에 제시된 gD1 폴리클로날 항체 (R45)로의 웨스턴 블럿 분석은 gD의 훨씬 더 높은 수준이 야생형 HSV-2로 감염된 세포에서보다 야생형 HSV-1-감염된 세포에서 검출되었지만, CJ9-gD-감염된 세포에서 검출된 gD의 수준은 CJ2-gD2에 의해 감염된 세포에서보다 현저하게 더 낮은 것을 나타낸다. 이 발견은 CJ2-gD2는 CJ9-gD에 의해 발현된 gD1보다 gD2를 더 효율적으로 발현한다는 것을 입증한다.
CJ2-gD2-감염된 베로 세포에서 발현된 UL9-C535C 및 gD2가 정말 tetO-보유 프로모터의 조절하에 발현된 것인지 입증하기 위해, 본 발명자들은 이어서 안정된 tetR-발현 베로 세포주, VCEP4R-28 세포를 테트라시클린의 부재 또는 존재하에 야생형 HSV-2 및 CJ2-gD2로 10 PFU/세포의 MOI에서 감염시켰다. 감염된 세포로부터의 단백질을 감염 후 9시간에서 수거하고, 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 나타낸 바와 같이 (도 3), 비록 ICP27의 유사한 수준이 테트라시클린의 부재 및 존재 모두 하에 야생형 HSV-2- 및 CJ2-gD2-감염된 VCEP4R-28 세포에서 검출되었지만, UL9-C535C를 테트라시클린이 존재한 경우 CJ2-gD2-감염된 VCEP4R-28 세포에서만 검출하였으며, gD2의 유의하게 더 높은 수준을 테트라시클린의 부재하에서 보다 테트라시클린의 존재하에 검출하였다.
CJ2 - gD2 는 베로 세포에서 복제되지 않는다
tetO-보유 hCMV 주요 극-초기 프로모터로부터의 ICP0 및 UL9-C535C의 높은-수준 발현의 부족때문에, CJ2-gD2는 구축되어야 했으며, tetR-발현 ICP0 상보적 U2OS 세포주 U2CEP4R11에서 증식되어야 했다 (68). 본 발명자들은 베로 세포 단층 상의 6.65 x 107 PFU의 CJ2-gD2를 플라크-검정하였고, 감염성 바이러스를 검출하지 않았으며, 이는 베로 세포에서의 CJ2-gD2의 플라크-형성 효율은 그의 상보적 U2CEP4R11 세포와 비교하여 적어도 6.65 x 107배 감소하였다는 것을 입증하였다.
CJ2 - gD2 에 의한 야생형 HSV -2 복제의 억제
본 발명자들은 이어서 야생형 HSV-2 바이러스 복제의 복제에 대한 CJ2-gD2에 의한 UL9-C535C 발현의 높은-수준의 우성-음성 효과를 동시-감염 검정에 의해 시험하였다 (도 4). 도 4A는 5 PFU/세포의 MOI에서의 CJ2-gD2 및 2 PFU/세포의 MOI에서의 야생형 HSV-2로의 베로 세포의 동시-감염은 베로 세포 또는 U2CEP4R11 세포에서 바이러스 역가가 결정되었는지 여부에 관계없이 동일한 MOI에서의 야생형 HSV-2에 의해 단일 감염된 세포와 비교하여 야생형 HSV-2 생성의 거의 500배 감소를 야기한다는 것을 나타낸다. 야생형 바이러스 수율의 적은 감소를 N2-lacZ로의 유사한 동시-감염 실험이 수행된 경우 검출하였다.
야생형 HSV-2의 복제를 억제하는 CJ2-gD2의 효능을 추가로 검사하기 위해, 본 발명자들은 각각 1:1 및 3:1의 MOI 비율로 야생형 HSV-2 및 CJ2-gD2로의 동시-감염 실험을 수행하였다. 도 4B의 결과는 CJ2-gD2는 두 조건 모두에서 야생형 HSV-2 감염을 예방하는데 효과적이라는 것을 나타내며, 각각 5 PFU/세포 및 15 PFU/세포의 MOI에서 야생형 HSV-2로 단일 감염된 세포와 비교하여 나타낸 동시-감염 비율에서의 야생형 바이러스 합성의 약 151 및 94배 감소로 이어졌다.
CJ2 - gD2 는 마우스에서의 뇌내 주사 후 비병원성이다
신경독력은 HSV 감염의 특징 중 하나이다. CJ2-gD2 및 N2-C535C의 CNS에서 복제하는 능력을 결정하기 위해, 5 내지 6주된 암컷 BALB/c 마우스를 무작위로 각각 8개 마우스의 5개 군으로 배정하였다. CJ2-gD2 및 N2-C535C를 각각 마우스의 뇌에 좌측 전두엽에 마우스 당 2.5 x 106 PFU에서 20 μl 부피로 28-게이지 인슐린 바늘로 4 mm의 깊이에 직접 접종하였다 (74). 이환율 및 사망률을 35일 동안 모니터링하였다. 야생형 HSV-2 균주 186의 LD50이 유리체내 주사 후 암컷 BALB/c 마우스에서 약 10 PFU인 것을 고려하여 (38), 마우스의 군을 또한 25 PFU/마우스에서 야생형 HSV-2로 접종하였다. 추가의 대조군으로서, 제5 군의 마우스를 N2-lacZ로 1 x 106 PFU/마우스로 접종하였다. 도 5는 DMEM으로 접종된 마우스와 유사하게, CJ2-gD2 및 N2-C535C로 2.5 x 106 PFU의 투여량으로 뇌내 접종된 마우스는 35-일 추적 동안 신경독력의 징후를 나타내지 않은 반면, 야생형 HSV-2로 25 PFU/마우스의 투여량 (CJ2-gD2로 접종된 마우스에 투여된 투여량보다 100,000배 더 낮은 투여량)으로 접종된 모든 마우스는 접종 후 10일차 까지 사망하였으며, 모든 접종된 마우스는 거칠어진 털, 구부러진 자세, 실조, 및 식욕부진을 포함하는 흔히 HSV-2 감염과 연관된 CNS 질환의 징후를 나타냈다는 것을 나타낸다. 비록 N2-lacZ로 접종된 100%의 마우스가 생존하였지만, 모든 마우스는 뇌염의 징후를 나타냈다.
HSV -2-특이적 중성화 항체의 유도 및 CJ2 - gD2 로 면역화된 마우스에서의 gD2 -특이적 항체 반응
항-HSV-2-특이적 중성화 항체를 유발하는 CJ2-gD2의 능력을 2 x 106 PFU의 투여량으로 CJ2-gD2로 면역화된 마우스에서 결정하였다. 대조군으로서, 마우스의 군을 또한 N2-C535C 또는 CJ9-gD로 동일한 투여량으로 면역화시켰다. 나타낸 바와 같이 (도 6A), CJ2-gD2로 면역화된 마우스의 HSV-2-특이적 중성화 항체 역가의 평균은 평균적으로 500이었으며, 이는 N2-C535C로 면역화된 마우스의 HSV-2-특이적 중성화 항체 역가 (p = 0.015)보다 3배 더 높았고, CJ9-gD 면역화된 마우스에서 유도된 중성화 항체 역가 (p = 0.28)에 필적하였다. HSV-2에 대한 특이적인 항체 역가는 1:10 희석으로 모의-접종된 마우스에서 검출되지 않았다.
도 6B는 CJ2-gD2 및 CJ9-gD로 면역화된 마우스 사이에서 유사한 수준의 gD-특이적 항체 반응이 검출되었지만, 각각의 면역 침전된 gD2 복합체를 항-gD1 항체, R45로 프로빙한 경우, CJ2-gD2로 면역화된 마우스에서의 항-gD-특이적 항체의 수준은 N2-C535C로 면역화된 마우스 및 모의-면역화된 대조군보다 유의하게 더 높았다는 것을 나타낸다. 종합하면, 도 6에 제시된 결과는 CJ2-gD2에 의한 gD2의 높은-수준 발현은 N2-C535C와 비교하여 항-gD2 항체 및 항-HSV-2-특이적 중성화 항체 반응을 유발하는 증가된 효능을 야기한다는 것을 나타낸다.
CJ2 - gD2 로 면역화된 마우스에서의 HSV -2-특이적 T-세포 반응의 유도
HSV-2-특이적 T-세포 반응을 유발하는 CJ2-gD2 면역화의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 야생형 HSV-2로의 항원투여 후 면역화된 마우스에서 기억 T-세포 반응을 검사하기 위해 회상 실험을 수행하였다. 먼저, 허위-접종된 및 CJ2-gD2-접종된 마우스를 추가접종 면역화 후 9-10주에서 야생형 HSV-2로 모의-항원투여하거나 또는 항원투여하고, 이어서 마우스의 개별 군 (n = 3)의 비장으로부터 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 항원투여 후 5일차에 IFN-γ ELISPOT 검정하였다 (도 7A). 야생형 HSV-2로 항원투여된 CJ2-gD2-접종된 마우스는 모의-감염된 CJ2-gD2-면역 마우스와 비교하여 IFN-γ-양성 CD4+ T 세포의 4.8배 증가를 가졌다 (p < 0.0001). 더 유의하게, CJ2-gD2로 이전에 접종된 HSV-2-감염된 마우스에서 검출된 IFN-γ-분비 CD4+ T 세포의 수는 허위-접종된 HSV-2-감염된 마우스보다 18배 더 높았다 (p < 0.0001). IFN-γ-양성 CD4+ T 세포는 동일한 조건하에 허위-접종된 모의-감염된 대조군 마우스에서 검출되지 않았다. 이들 결과는 CJ2-gD2로의 면역화는 강한 기억 CD4+ T 세포 반응을 유발하다는 것을 나타낸다.
CJ2-gD2-접종된 마우스에서 허위-접종된 대조군과 비교하여 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포의 2배 초과의 증가가 있었지만, HSV-2-감염된 허위-접종된 마우스 및 HSV-2-감염된 CJ2-gD2-접종된 마우스의 비장에서 유사한 수의 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포를 검출하였다 (도 7B). 본 발명자들은 따라서 허위-접종된 및 CJ2-gD2-접종된 마우스가 야생형 HSV-2 (n = 3)로 2차 접종 후 5-6주에서 모의-항원투여되거나 또는 항원투여된 제2 세트의 회상 실험을 수행하였다. CD4+ 및 CD8+ ELISPOT 검정을 감염 후 4일차에 수행하였다 (도 7C 및 7D). 모의-감염된 CJ2-gD2 면역 마우스 (CD4+ T 세포: p = 0.035; CD8+ T 세포: p = 0.01)와 비교하여 각각 IFN-γ-분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 8.6 및 5.7배 증가를 CJ2-gD2 면역 마우스에서 HSV-2 감염 후 검출하였다. 추가로, HSV-2로의 항원투여 후, IFN-γ-분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 허위-접종된 마우스 (CD4+ T 세포: p = 0.036; CD8+ T 세포: p = 0.01)와 비교하여 CJ2-gD2 접종된 마우스에서 각각 8 및 9.5배 더 높았다. 총괄하여, 이들 연구는 CJ2-gD2로의 면역화는 HSV-2 감염 중 효율적으로 회상될 수 있는 강력한 HSV-2-특이적 기억 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응을 유발할 수 있다는 것을 입증한다.
면역화된 마우스에서의 HSV -2 생식기 감염 및 질환에 대한 보호
초기 면역화 5 내지 6주 후, 마우스를 50 LD50 (5 x 105 PFU/마우스)에서 HSV-2 균주 G로 질내 항원투여하였다. 질 도말을 항원투여 후 1, 2, 3, 5, 및 7일차에 채취하였다. 마우스를 생식기 및 파종 HSV-2 질환의 발생률에 대한 21-일 추적 기간 동안 관찰하였다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 항원투여 바이러스의 수율은 모의-면역화된 대조군의 마우스 (n=10)와 비교하여 CJ2-gD2로 면역화된 마우스 (n=9)에서 1일차에 200배 초과로 감소되었으며 (p < 0.001), 2일차에 130배 감소되었다 (p <0.0001). 비록 항원투여 후 1, 2, 및 3일차에 항원투여 바이러스 흘림의 감소의 유의한 차이는 CJ2-gD2 및 N2-C535C로 면역화된 마우스 (n=10)의 군 사이에 없었지만, CJ2-gD2로의 면역화는 CJ9-gD보다 1 (p=0.03), 2 (p=0.025), 및 3 (p<0.007)일차에 항원투여 바이러스 흘림을 감소시키는데 더 효과적이었다. 적은 항원투여 바이러스가 항원투여 후 5일차에 CJ2-gD2, N2-C535C, 또는 CJ9-gD로 면역화된 마우스에서 검출되거나 또는 검출되지 않은 반면, 모든 모의-접종된 마우스는 계속해서 5 x 103 PFU/ml 초과의 평균 수율에서 바이러스를 흘렸다. 항원투여 바이러스는 마우스의 3개 면역화된 군에서 항원투여 후 7일차에 수집된 질 도말 물질에 존재하지 않았다. 별도의 실험에서, 본 발명자들은 항원투여 후 5일차에 CJ2-gD2-면역화된 마우스에서 바이러스 흘림이 없었던 반면, 야생형 HSV-2의 존재는 7개 N2-C535C-면역화된 마우스 중 5개 및 7개 CJ9-gD-면역화된 마우스 중 4개에서 검출된 것을 관찰하였다.
도 9의 결과는 CJ2-gD2로 면역화된 마우스는 국소 생식기 병변의 발생으로부터 완전하게 보호되었으며, 야생형 HSV-2로의 항원투여 후 전신성 질환의 징후를 나타내지 않았다는 것을 나타낸다 (도 9A). 모든 모의-면역화된 마우스에서 심한 생식기 병변이 발생하였으며, 항원투여 후 11일차 까지 야생형 HSV-2 감염이 발생하였다 (도 9B). 비록 N2-C535C 및 CJ9-gD로의 면역화는 마우스를 야생형 HSV-2로의 치명적인 항원투여에 대해 보호하였지만, 마우스의 20% 및 30%는 각각 N2-C535C- 및 CJ9-gD-면역화된 마우스에서 국소 생식기 질환 (점수 1)의 일과성 낮은 정도를 경험하였다 (표 1). 유사한 실험 (표 1)에서, CJ9-gD로 면역화된 마우스 (n=7) 중 2개 마우스는 낮은 정도의 국소 생식기 질환을 경험하였으며, 1개 마우스는 전신성 질환의 징후를 나타냈고, 항원투여 후 14일차에 사망하였으며, 7개 N2-C535C-면역화된 마우스 중 3개 (43%)는 낮은 정도의 국소 생식기 질환 (점수 = 1)을 나타낸 것을 관찰하였다. 다시, CJ2-gD2-면역화된 마우스 (n=7)에서 국소 및 전신성 헤르페스성 질환의 징후는 나타나지 않았다. 총괄하여, 이들 연구는 CJ2-gD2가 N2-C535C 및 CJ9-gD보다 야생형 HSV-2로의 질내 항원투여 후 생식기 질환에 대해 마우스를 보호하는데 더 효과적인 백신이라는 것을 입증한다.
Figure 112012048949416-pct00001
Figure 112012048949416-pct00002
Figure 112012048949416-pct00003
Figure 112012048949416-pct00004
Figure 112012048949416-pct00005
본원에 인용된 모든 참조 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 발명을 완전히 기재하였으며, 본 발명은 본 발명 또는 임의의 그의 실시양태의 목적 또는 범주에 영향을 주지 않고 넓고 동등한 범위의 조건, 파라미터 등 내에서 실시될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Brigham and Women's Hospital, Inc. Yao, Feng <120> Herpes Simplex Virus Vaccines <130> 7570/22100PC <150> 61/288,836 <151> 2009-12-21 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 tccctatcag tgatagaga 19 <210> 2 <211> 953 <212> DNA <213> human herpesvirus 1 <400> 2 atgggagagg cgtcgctgcc ggcccaggcc gccgagacgg aggaggtggg tcttttgtcg 60 aaaaatacct ccggtccgat gtcgcgccgg cggaaattgt cgcgctcatg cgcaacctca 120 acagcctgat gggacgcacg cggtttattt acctggcgtt gctggaggcc tgtctccgcg 180 ttcccatggc cacccgcagc agcgccatat ttcggcggat ctatgaccac tacgccacgg 240 gcgtcatccc cacgatcaac gtcaccggag agctggagct cgtggccctg ccccccaccc 300 tgaacgtaac ccccgtctgg gagctgttgt gcctgtgcag caccatggcc gcgcgcctgc 360 attgggactc ggcggccggg ggatctggga ggaccttcgg ccccgatgac gtgctggacc 420 tactgacccc ccactacgac cgctacatgc agctggtgtt cgaactgggc cactgtaacg 480 taaccgacgg acttctgctc tcggaggaag ccgtcaagcg cgtcgccgac gccctaagcg 540 gctgtccccc gcgcgggtcc gttagcgaga cggaccacgc ggtggcgctg ttcaagataa 600 tctggggcga actgtttggc gtgcagatgg ccaaaagcac gcagacgttt cccggggcgg 660 ggcgcgttaa aaacctcacc aaacagacaa tcgtggggtt gttggacgcc caccacatcg 720 accacagcgc ctgccggacc cacaggcagc tgtacgccct gcttatggcc cacaagcggg 780 agtttgcggg cgcgcgcttc aagctacgcg tgcccgcgtg ggggcgctgt ttgcgcacgc 840 actcatccag cgccaacccc aacgctgaca tcatcctgga ggcggcgctg tcggagctcc 900 ccaccgaggc ctggcccatg atgcaggggg cggtgaactt tagcacccta taa 953 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> human herpesvirus 1 <400> 3 atcgtccaca cggag 15 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> human herpesvirus 2 <400> 4 gctcgagtgc gaaaaaacgt tc 22 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> human herpesvirus 2 <400> 5 cggggcgctc ggctaac 17

Claims (26)

  1. a) 제1 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제1 ICP0 단백질 오픈 리딩 프레임에 삽입된, 제1 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 글리코단백질 D (gD2)를 코딩하는 제1 서열;
    b) 제2 tet-O 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 ICP0 단백질 오픈 리딩 프레임에 삽입된, 제2 HSV-2 gD2를 코딩하는 제2 서열;
    c) 제3 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열 2에 의해 코딩되는 HSV-1 UL9-C535C 단백질을 코딩하는 제3 서열이며, 여기서 상기 제3 프로모터는 hCMV 극초기(immediate early) 프로모터인 제3 서열; 및
    d) 제4 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 제4 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열 2에 의해 코딩되는 HSV-1 UL9-C535C 단백질을 코딩하는 제4 서열이며, 여기서 상기 제4 프로모터는 hCMV 극초기 프로모터인 제4 서열
    을 게놈 내에 포함하는, 복제-결손 우성-음성 HSV-2 재조합 바이러스이며, 여기서
    i) 상기 제1 및 제2 프로모터는 HSV-1 또는 HSV-2 ICP4 극초기 프로모터이고;
    ii) 상기 제3 및 제4 프로모터는 VP16에 대한 반응에서 유도되고;
    iii) 상기 재조합 바이러스는 ICP0 단백질을 코딩하는 서열을 포함하지 않으며;
    iv) 상기 제3 또는 제4 hCMV 극초기 프로모터 중 적어도 하나는 전장 프로모터의 -236 bp에서 말단절단된 것인
    재조합 바이러스.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 ICP4 프로모터가 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 것이고, 여기서 기능적 ICP4 DNA 결합 서열은 서열 3의 서열인 재조합 바이러스.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터 둘 다가, 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 ICP4 프로모터이고, 여기서 기능적 ICP4 DNA 결합 서열은 서열 3의 서열인 재조합 바이러스.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    a) 상기 제1 및 제2 프로모터 중 적어도 하나가, 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 ICP4 프로모터이고, 여기서 기능적 ICP4 DNA 결합 서열은 서열 3의 서열이고;
    b) 상기 제3 또는 제4 프로모터 중 적어도 하나가, 전장 hCMV 프로모터의 -236 bp에서 말단절단된 후 상기 변형된 ICP4 프로모터에 결합됨으로써 하이브리드 프로모터를 형성하는 hCMV 극초기 프로모터이며, 여기서 hCMV 극초기 프로모터 및 변형된 ICP4 프로모터는 서로 반대 방향이고, hCMV 극초기 프로모터는 상기 하이브리드 프로모터 내에 VP16에 대해 반응성이도록 위치된 것인
    재조합 바이러스.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, IL12, IL15, gB 및 gC로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 재조합 유전자를 또한 발현하는 재조합 바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제3 및 제4 프로모터가, 전장 hCMV 프로모터의 -236 bp에서 말단절단된 후 상기 제1 및/또는 제2 ICP4 프로모터에 결합됨으로써 하이브리드를 형성하는 hCMV 극초기 프로모터이며, 여기서 hCMV 및 ICP4 프로모터는 서로 반대 방향인 재조합 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 ICP4 프로모터가 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 것이고, 여기서 기능적 ICP4 DNA 결합 서열은 서열 3의 서열인 재조합 바이러스.
  16. 제1항에 있어서, IL12, IL15, gB 및 gC로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 재조합 유전자를 또한 발현하는 재조합 바이러스.
  17. 제1항에 있어서, IL15를 발현하는 재조합 바이러스.
  18. 제1항에 있어서, tet-O 보유 HSV 극초기 프로모터 또는 tet-O 보유 hCMV 극초기 프로모터의 조절하에 HSV-2 글리코단백질 B (gB) 또는 HSV-2 글리코단백질 C (gC)를 또한 발현하는 재조합 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, tet-O 보유 HSV 극초기 프로모터 또는 tet-O 보유 hCMV 극초기 프로모터의 조절하에 HSV-2 gB를 발현하는 재조합 바이러스.
  20. a) 서열 3의 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 제1 ICP4 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제1 ICP0 단백질 오픈 리딩 프레임에 삽입된, 제1 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 글리코단백질 D (gD2)를 코딩하는 제1 서열이며, 여기서 상기 제1 ICP4 프로모터는 제1 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 것인 제1 서열;
    b) 서열 3의 기능적 ICP4 DNA 결합 서열이 제거되도록 변형된 제2 ICP4 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 ICP0 단백질 오픈 리딩 프레임에 삽입된, 제2 HSV-2 gD2를 코딩하는 제2 서열이며, 여기서 상기 제2 ICP4 프로모터는 제2 tet-O 서열에 작동가능하게 연결된 것인 제2 서열;
    c) 제3 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열 2에 의해 코딩되는 HSV-1 UL9-C535C 단백질을 코딩하는 제3 서열이며, 여기서 상기 제3 프로모터는 전장 hCMV 프로모터의 -236 bp에서 말단절단된 hCMV 극초기 프로모터인 제3 서열; 및
    d) 제4 테트라시클린 작동자 (tet-O) 서열에 작동가능하게 연결된 제4 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열 2에 의해 코딩되는 HSV-1 UL9-C535C 단백질을 코딩하는 제4 서열이며, 여기서 상기 제4 프로모터는 전장 hCMV 프로모터의 -236 bp에서 말단절단된 hCMV 극초기 프로모터인 제4 서열
    을 게놈 내에 포함하는, 복제-결손 우성-음성 HSV-2 재조합 바이러스이며, 여기서
    i) 상기 제3 및 제4 프로모터는 VP16에 대한 반응에서 유도되고;
    ii) 상기 재조합 바이러스는 ICP0 단백질을 코딩하는 서열을 포함하지 않는 것인
    재조합 바이러스.
  21. 제1항의 재조합 바이러스를 단위 투여 형태로 포함하는 면역원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 단위 투여량당 최소 1 x 107 플라크 형성 단위 (pfu)로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
  23. 제21항에 있어서, HSV-1 또는 HSV-2 감염 환자에서 증상을 치료적으로 감소시키기 위한 면역원성 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 환자가 HSV-1 또는 HSV-2에 대해 혈청반응양성인 면역원성 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 환자에서 HSV-1 또는 HSV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 환자가 HSV-1 또는 HSV-2에 대해 혈청반응양성인 면역원성 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US9273326B2 (en) 2004-04-30 2016-03-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors
US20080008686A1 (en) 2006-07-10 2008-01-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline repressor regulated oncolytic viruses
US8796440B2 (en) 2009-08-31 2014-08-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Promote system for regulatable gene expression in mammalian cells
PT2516629T (pt) 2009-12-21 2016-07-07 The Brigham And Women`S Hospital Inc Vacinas de vírus herpes simplex
US10478486B2 (en) * 2014-08-26 2019-11-19 Hsf Pharmaceuticals Sa Immunization agents and methods of use
BR112019018630A2 (pt) * 2017-03-09 2020-04-28 Xiamen University vírus hsv recombinante, vetor viral, célula hospedeira, método para obter o vírus hsv recombinante, composição farmacêutica, método para tratar um tumor e uso do vírus hsv recombinante
US20200172928A1 (en) 2017-06-05 2020-06-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Vero cell lines stably expressing hsv icp0 protein
US11390650B2 (en) 2018-02-05 2022-07-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Recombinant Herpes Simplex Virus-2 expressing glycoprotein B and D antigens
WO2020081415A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Regenxbio Inc. Method for measuring the infectivity of replication defective viral vectors and viruses

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JPH067174A (ja) * 1992-03-13 1994-01-18 Monsanto Co ヘルペスウイルスプロモーターとｖｐ１６トランスアクチベータを用いる組換え蛋白の産生
US6183753B1 (en) * 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
US7223411B1 (en) 1992-07-31 2007-05-29 Dana-Farber Cancer Institute Herpesvirus replication defective mutants
AU683227B2 (en) 1992-08-26 1997-11-06 Bioscience 2002 Llc Tetracycline repressor-mediated binary regulation system for control of gene expression in transgenic animals
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5763217A (en) * 1993-11-10 1998-06-09 University Of British Columbia Method of using, process of preparing and composition comprising recombinant herpesvirus vectors
US5965440A (en) 1995-12-07 1999-10-12 The General Hospital Corporation Controlled gene product delivery from a regulatable retroviral vector
US5770414A (en) 1996-02-20 1998-06-23 The Regents Of The University Of California Regulatable retrovirus system for genetic modification of cells
US6261552B1 (en) 1997-05-22 2001-07-17 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus vectors
US5972650A (en) * 1997-06-26 1999-10-26 Brigham And Women's Hospital Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch
US20040063094A1 (en) 1998-05-20 2004-04-01 Biovex Limited Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
ES2233600T5 (es) 2000-01-21 2009-06-22 Biovex Limited Cepas de virus del herpes.
EP1178111A1 (en) 2000-08-03 2002-02-06 Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG Vaccination against host cell-associated herpesviruses
CA2430341A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 The University Of Chicago Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
US20040029229A1 (en) 2002-05-20 2004-02-12 Reeves Philip J. High level protein expression system
US20080299140A1 (en) * 2002-05-24 2008-12-04 The Regents Of The University Of California, Immunogenic Composition and Peptide Sequences for Prevention and Treatment of an Hsv Condition
CN1701120A (zh) * 2002-09-27 2005-11-23 磨粉机械研究有限公司 用于基因表达的核酸构建体
US7335763B2 (en) 2003-03-25 2008-02-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Herpesvirus ribozymes and vectors
US20040229362A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-18 Alberto Epstein Method for producing non-pathogenic helper virus-free preparations of herpes virus amplicon vectors, the helper virus & the cells used in this method, the corresponding genetic tools, as well as the applications of these non-pathogenic amplicon vectors
US9273326B2 (en) * 2004-04-30 2016-03-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors
US20080008686A1 (en) * 2006-07-10 2008-01-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tetracycline repressor regulated oncolytic viruses
US8796440B2 (en) * 2009-08-31 2014-08-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Promote system for regulatable gene expression in mammalian cells
PT2516629T (pt) 2009-12-21 2016-07-07 The Brigham And Women`S Hospital Inc Vacinas de vírus herpes simplex

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTIVIRAL RES. 2002, vol. 55, pp. 127-133.
HUM. GENE THER. 1999, vol. 70, pp. 1811-1818.
JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY. 2009.05., vol. 129, pp. 1174-1184.
JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY. 2009.10., vol. 129, pp. 2470-2479.

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