JPH067174A - ヘルペスウイルスプロモーターとｖｐ１６トランスアクチベータを用いる組換え蛋白の産生 - Google Patents

ヘルペスウイルスプロモーターとｖｐ１６トランスアクチベータを用いる組換え蛋白の産生

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JPH067174A
JPH067174A JP5052589A JP5258993A JPH067174A JP H067174 A JPH067174 A JP H067174A JP 5052589 A JP5052589 A JP 5052589A JP 5258993 A JP5258993 A JP 5258993A JP H067174 A JPH067174 A JP H067174A
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cell
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キャサリン ハイキン モウリーン
Paul Jerome Hippenmeyer
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は遺伝子産物の高レベルの発現のため
の安定な細胞株を産生する方法に関する。 【構成】 本発明の方法は、細胞に単純ヘルペスウイル
スのトランス活性化蛋白ＶＰ１６を発現させる第１の作
成体と、第１の選択剤に対して選択可能な耐性遺伝子よ
りなる第２の作成体を、細胞に同時トランスフェクショ
ン（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、第１の選択剤
に対して耐性の細胞を選択し、第１の選択剤に対して耐
性の細胞をスクリーニングしてＶＰ１６を発現する細胞
を選び、単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白Ｖ
Ｐ１６を発現する細胞を第３および第４の作成体と同時
トランスフェクションし、第２の選択剤に対して耐性の
細胞を選択し、そして第２の選択剤に耐性の細胞をスク
リーニングして目的の遺伝子の遺伝子産物を発現する細
胞を選択する工程よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の技術背景】
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は組換え蛋白の産生、および
さらに詳しくは異種遺伝子トランス活性化（ｔｒａｎｓ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の方法に関する。
【０００２】
【関連する技術】哺乳動物の細胞培養において組換え蛋
白を効率的に産生する能力は、研究的および商業的製品
の製造に最も重要である。組換え蛋白の産生については
いくつかの方法や宿主ベクター系が、総説に記載されて
いる（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、遺伝子工学、原
理と方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第
９巻、セットロウ（Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ）編、プレナ
ムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク、１９８７年；ワレン（Ｗａｒｒｒｅｎ）ら、組換え
ＤＮＡ技術と応用（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）、プロコプ、バジパイおよびホー（Ａ．Ｐｒｏｋ
ｏｐ，Ｒ．Ｂａｊｐａｉ ａｎｄ Ｃ．Ｈｏ）編、マグ
ローヒル（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、
１９９０年）。これらの系では、ウシのパピローマウイ
ルス（ホウレイ（Ｈｏｗｌｅｙ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１巻、アカデミック
プレス（Ａｃａｄｅｍｉ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク、１９８３年）のようなエピソームウイルス、ジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子（カウフマン（Ｋａｕｆｍａ
ｎ）、同上）、アスパラギン合成酵素遺伝子（アンドル
リス（Ａｎｄｒｕｌｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅ
ｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７巻、１９８５年）、また
はオルニチン脱炭酸酵素遺伝子（マコンローグ（ＭｃＣ
ｏｎｌｏｇｕｅ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ
ｓ）、１９８７年）を含有するような増幅可能なベクタ
ー、またはサルのウイルス４０プロモーター（ムリガン
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻、
１４２２−１４２９頁、１９８０年）、ヒトサイトメガ
ロウイルスの主要初期プロモーター（ボシャルト（Ｂｏ
ｓｈａｒｔ）ら、Ｃｅｌｌ、４１巻、５２１−５３０
頁、１９８５年）のような強い構成性プロモーターを使
用している。これらの系は、発現ベクターの作成に使用
されるプロモーターの転写を刺激するのに、すべてある
特定の型の細胞の内因性トランスアクチベータのレベル
に依存している。
【０００３】高レベルの産生のための別の方法は、特定
の転写アクチベータまたはトランスアクチバータを有す
る細胞を操作することである。もしトランスアクチベー
タが特定の標的プロモーターを有する場合、標的プロモ
ーターは目的の遺伝子に結合していてもよいし、操作し
た細胞に挿入されてもよい。この細胞に産生される標的
プロモーターの量はいくつかの変数に依存する。まず、
トランスアクチベータの本質的な比活性は、標的プロモ
ーターからの転写の量の１つの因子であろう。さらに標
的細胞に産生されるトランスアクチベータの量はトラン
ス活性化の量に影響する。例えばチャイニーズハムスタ
ーの卵巣細胞（ＣＨＯ）では、低レベルの内因性グルコ
コルチコイドリセプター／トランスアクチベータが存在
している。グルココルチコイドリセプター／トランスア
クチベータを必要とするプラスミッドのトランスフェク
ションでは、このプラスミッドからはほとんど発現され
ない。しかし細胞をまず操作して高レベルのグルココル
チコイドリセプター／トランスアクチベータを発現する
ようにすれば、同じプラスミッドから高レベルの発現が
得られる（イスラエル（Ｉｓｒａｅｌ）ら、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７巻、４５８９−４６０６頁、
１９８９年）。従ってトランス活性化の量は細胞中のト
ランスアクチベータの量に依存する。トランスアクチベ
ータの量は、トランスアクチベータを発現するのに使用
されるプロモーターや宿主細胞中のカッセトの取り込み
部位に依存する。第３に特定の細胞の標的ベクターの量
は、いくつのコピーがトランス活性化されるかに影響す
る。標的プロモーターの取り込みの部位はまた、活性化
プロモーターの発現にある役割を果たす。
【０００４】別の重要な関心事はトランスアクチベータ
の特異性である。もしトランスアクチベータがいくつか
の内因性の細胞性プロモーターと相互作用する場合、こ
れらのプロモーターは操作された宿主細胞中でトランス
活性化されることが予想される。これは遺伝子によって
は好ましいかも知れないしそうでないかも知れない。多
反応性のプロモーターを使用する別の効果は、これがお
そらく標的プロモーターのトランス活性化に利用できる
量を減少させて、内因性のプロモーターに結合して細胞
中のその濃度を有効に低下させることである。
【０００５】一過性の条件下でプロモーターが高レベル
の発現を示すからといって、これが安定な条件下で有用
であるとは限らない。その１つの例は、一過性の発現条
件下で使用される最も強いプロモーターの１つであるヒ
トサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の極初期の（Ｉ
Ｅ）プロモーターである（フォッキング（Ｆｏｅｃｋｉ
ｎｇ）ら、Ｇｅｎｅ、４５巻、１０１−１４５頁、１９
８６年；ヒッペンマイアー（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒ）
ら、Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７０巻、９８２
−９９２頁、１９９１年）。さらにいくつかのウイルス
遺伝子は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジン
キナーゼ遺伝子のような細胞ゲノムにいったん取り込ま
れると、予想される調節機能を示さない（シルバー（Ｓ
ｉｌｖｅｒ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻、５１８−５２８
頁、１９８５年）。
【０００６】従って、ヨーロッパ特許出願８８０２１４
９．５号はＶＰ１６（Ｖｍｗ６５、ｖｆ６５またはアル
ファ−ＴＩＦとしても知られている）が産生される細胞
株は、一過性の条件下で標的プロモーターのトランス活
性化を起こすが、ポスト（Ｐｏｓｔ）ら（Ｃｅｌｌ、２
４巻、５５５−５６５頁、１９８１年）は極初期の（Ｉ
Ｅ）１７５プロモーター（ＩＣＰ４としても知られてい
る）は細胞のゲノム内に存在するとき、ウイルス感染に
よりトランス活性化されることを証明したが、いずれも
目的の遺伝子に機能的に結合したＶＰ１６と標的プロモ
ーターが同じ細胞に取り込むまれると、高レベルのトラ
ンス活性化が起き、高レベルの蛋白産生が起きることは
示していない。
【０００７】すなわち当該分野において、種々の遺伝子
とともに使用されて安定で高レベルの組換え蛋白産生を
する細胞株と系に対してニーズが存在する。
【０００８】
【発明の要約】本発明は遺伝子産物の高レベルの発現の
ための細胞株を産生する方法を包含する。本方法は、細
胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ１
６を発現させる第１の作成体と、第１の選択剤に対して
選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成体を、細胞に
同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ）し、第１の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、
第１の選択剤に対して耐性の細胞をスクリーニングして
ＶＰ１６を発現する細胞を選び、単純ヘルペスウイルス
のトランス活性化蛋白ＶＰ１６を発現する細胞を第３お
よび第４の作成体と同時トランスフェクションし、ここ
で第３の作成体は目的の遺伝子に機能的に結合した単純
ヘルペスウイルス遺伝子プロモーターよりなり、第４の
作成体は第２の選択剤に対して選択可能な耐性遺伝子よ
りなり、第２の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、そ
して第２の選択剤に耐性の細胞をスクリーニングして目
的の遺伝子の遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程
よりなる。
【０００９】本発明の別の実施態様において、高レベル
の遺伝子産物を発現する細胞株が与えられる。本細胞株
は、細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白
ＶＰ１６を発現させる第１の作成体と、第１の抗生物質
に対して選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成体
を、細胞に同時トランスフェクションし、第１の抗生物
質に対して耐性の細胞を選択し、第１の抗生物質に対し
て耐性の細胞をスクリーニングしてＶＰ１６を発現する
細胞を選び、単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋
白ＶＰ１６を発現する細胞を第３および第４の作成体と
同時トランスフェクションし、ここで第３の作成体は目
的の遺伝子に機能的に結合した単純ヘルペスウイルスＩ
Ｅ遺伝子プロモーターよりなり、第４の作成体は第２の
抗生物質に対して選択可能な耐性遺伝子よりなり、第２
の抗生物質に対して耐性の細胞を選択し、そして第２の
抗生物質に耐性の細胞をスクリーニングして目的の遺伝
子の遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程により作
成される。
【００１０】細胞株は高レベルの遺伝子産物を発現する
本発明の別の実施態様が与えられる。本細胞株は、細胞
に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ１６
を発現させる第１の作成体、目的の遺伝子に機能的に結
合した単純ヘルペスウイルスＩＥ遺伝子プロモーターよ
りなる第２の作成体、それぞれ抗生物質に対して選択可
能な耐性遺伝子よりなる第３および第４の作成体よりな
る。
【００１１】上記の実施態様においては、すべて型の単
純ヘルペスウイルスＩＥプロモーターが考えられ、単純
ヘルペスウイルス−１からのものが好ましく、ＩＥ１７
５（ＩＣＰ４としても知られている）またはＩＥ１１０
（ＩＣＰ０としても知られている）が好ましい。細胞株
は好ましくはベビーハムスターの腎（ＢＨＫ−２１）ま
たはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ−ＤＵＫＸ
−Ｂ１１またはＤＧ４４）由来のものが好ましい。
【００１２】本発明においては、すべての型のＶＰ１６
が含まれると考えられるが、単純ヘルペスウイルス１由
来のＶＰ１６が好ましい。ＶＰ１６遺伝子とＨＳＶ−２
の蛋白は、ＶＰ１６遺伝子とＨＳＶ−１の蛋白との間に
アミノ酸配列に強い類似性があるため、ＶＰ１６遺伝子
とＨＳＶ−１の蛋白と同様に働くと考えられる（グリー
ベス（Ｇｒｅａｖｅｓ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、６５巻、６７０５−６７１３頁、１９
９１年；クレス（Ｃｒｅｓｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１０３
巻、２３５−２３８頁、１９９１年）。
【００１３】ＶＰ１６分子によるＨＳＶのＩＥプロモー
ターのトランス活性化を妨害する化合物の発見にも本細
胞株の使用が考えられる。ＶＰ１６によるＩＥプロモー
ターのトランス活性化により組換え蛋白を安定に分泌す
る細胞株は、化学物質または天然の産物、または化学物
質や天然の産物の特定されない混合物とインキュベート
することができると考えられる。細胞をこれらの化合物
とインキュベートして細胞に産生される組換え蛋白の量
が減少する場合、化合物は組換え蛋白発現のＶＰ１６介
在トランス活性化工程で作用する可能性がある。従って
これらの化合物は、次に発現がＶＰ１６の制御下にある
細胞株からの組換え蛋白の発現を妨害するか否かを試験
されるであろう。ＶＰ１６介在トランス活性化の発現を
妨害するが他の系の発現を妨害しない化合物は、抗ＨＳ
Ｖ剤の可能性がある。
【００１４】ＶＰ１６を発現するように操作された細胞
株は、機能性ＶＰ１６の欠如しているＨＳＶの突然変異
体の継代や維持に有用であろう（ウェルスタック（Ｗｅ
ｒｓｔｕｃｋ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、６４巻、９８４−９９１頁）。機能性ＶＰ１６
遺伝子の欠如したＨＳＶのＤＮＡは、取り込まれたＤＮ
Ａ作成体からＶＰ１６を発現する細胞株にトランスフェ
クションすることができる。ＶＰ１６蛋白はＨＳＶのＤ
ＮＡのＩＥプロモーターをトランス活性化して、ウイル
ス粒子を産生させる。機能性ＶＰ１６の欠如したＨＳＶ
の突然変異体はワクチン株の有望な候補であろう。
【００１５】本発明は遺伝子産物を分泌する細胞も分泌
しない細胞も包含するが、遺伝子産物を分泌する細胞株
が好ましい。
【００１６】本発明の目的は遺伝子産物を高レベルで発
現する細胞株を産生する方法を与えることである。
【００１７】本発明の別の目的は、遺伝子産物を高レベ
ルに発現する細胞株を与えることである。
【００１８】本発明のさらに別の目的は、任意の目的の
遺伝子産物の大規模な産生に使用することができる、細
胞株を用いる技術を与えることである。
【００１９】本発明のさらに別の目的は、ＶＰ１６−マ
イナスヘルペスウイルス突然変異体を増殖させる方法を
与えることである。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、抗ウイルス性
化合物を発見するための測定法を与えることである。
【００２１】本発明の利点は、５カ月間を越える期間高
レベルの遺伝子産物を発現することができる安定な細胞
株を用いる技術を与えることである。
【００２２】本発明のさらに別の利点は、１日当り細胞
当りの遺伝子産物の発現レベルがより多い細胞株を単離
する方法が与えられ、細胞株は５カ月間を越える期間安
定であることである。本発明の多くの他の目的は、本発
明の以下の説明から明らかであろう。
【００２３】図面の簡単な説明 図１はＩＥ１７５発現ベクターの作成を示す。この発現
プラスミッドは、プロモーター配列とＳＶ４０後期ポリ
アデニル化配列の間にユニークなＢａｍＨＩ部位を有す
る。
【００２４】図２は、ＩＥ１１０発現ベクターの作成を
示す。この発現プラスミッドは、プロモーター配列とＳ
Ｖ４０後期ポリアデニル化配列の間にユニークなＢａｍ
ＨＩ部位を有する。
【００２５】図３は、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐ
ｅａｔ）（ＬＴＲ）発現ベクターの作成を示す。ＳＶ４
０後期ポリアデニル化シグナルは、このプラスミッドの
初期の方にある。
【００２６】図４。ＢＨＫ／ＶＰ１６／ＩＥ１７５−ｔ
ＰＡ株３４、３９、４７、４９は１：２０から１：４０
（容量）で週２回継代され、ｔＰＡについて測定した。
【００２７】
【好適な実施態様の詳細な説明】目的の遺伝子に結合し
た単純ヘルペスウイルストランス活性化蛋白（ＶＰ１
６）をコードする遺伝子と、目的の遺伝子に結合した単
純ヘルペスウイルス遺伝子プロモーター（ＩＥプロモー
ター）を有する哺乳動物細胞の安定なトランスフェクシ
ョン体が、目的の遺伝子を高レベルに発現できるという
ことは、本発明の発見である。特に興味深いのは、細胞
株を作成する特定の方法が予想外な結果を引き起こすと
いう事実である。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞での抗
生物質耐性が関与する選択は、成功の確率がより高い
が、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞でのジヒドロ葉酸還
元酵素の選択は目的の高レベルの細胞株を得るのに独得
の方法のようである。
【００２８】単純ヘルペスウイルスのトランスアクチベ
ータは、好ましくはＶＰ１６、ＶＦ６５、Ｖｍｗ６５ま
たはアルファ−Ｔ１Ｆとして知られている後期ウイルス
蛋白である。ＶＰ１６活性化の標的プロモーターは好ま
しくは、単純ヘルペスウイルスのＩＥ１７５（ＩＣＰ４
としても知られている）であるが、ＩＥ１１０プロモー
ター（ＩＣＰ０としても知られている）も使用すること
ができる。ＢＨＫ−２１細胞またはＣＨＯのｄｈｆｒ−
マイナス突然変異体（例えばＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１
またはＤＧ４４）は、本発明の実施のための好適な哺乳
動物細胞である。これらの細胞は当該分野で公知であ
り、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メ
アリーランド州）（ＢＨＫ−２１）、またはローレンス
チャシン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ）博士（コ
ロンビア大学、ニューヨーク）（ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ
１１またはＤＧ４４）から入手可能である。これらの細
胞は懸濁培養での増殖によく適応するか、および／また
は低濃度の血清条件下で増殖することができる。これら
の性質のためにこれらの細胞は細胞産物の大規模な生産
株として有用である（ベンヂッグ（Ｂｅｎｄｉｇ）、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻、リグビ
ー（Ｐ．Ｗ．Ｒｉｇｂｙ）編、アカデミックプレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、９１−１２７頁、１９８
８年）。
【００２９】本発明によれば、細胞株を同時トランスフ
ェクションするためにＤＮＡ作成体が使用される。同時
トランスフェクションは１つの細胞に少なくとも２つの
異なるＤＮＡ種を導入することである。これらは線状ま
たは環状ＤＮＡ分子でもよいし、他の大きな分子のウイ
ルスまたはプラスミッド分子の断片でもよい。トランス
フェクションは当該分野で公知の任意の方法で実施され
る。好適な方法は、リン酸カルシウム法（バンデルエブ
（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻、グロスとモルダブ（Ｇｒ
ｏｓｓ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ）編、アカデミックプ
レス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク、１９８０年）、および製造業者の指示による「リポ
フェクチン」（”ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ”）試薬（ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ）の使用がある。エレクトロポレーショ
ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ）のような他の方
法も適している（チュー（Ｃｈｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ｓ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻、１３１１
−１３２６頁、１９８７年）。
【００３０】後期ウイルス蛋白（ＶＰ１６）の発現は、
哺乳動物細胞（特にｄｈｆｒ−マイナス細胞およびＢＨ
Ｋ−２１細胞）中で転写を開始させる機能があることが
当該分野で公知である任意のプロモーターの制御下にあ
ってもよい。特に好適なプロモーターはＳＶ４０初期プ
ロモーターとＭＭＴＶ ＬＴＲである。
【００３１】選択可能な抗生物質耐性遺伝子は、哺乳動
物細胞において陽性の選択マーカーとして機能すること
ができる任意のものを含む。典型的にはこれらは細菌ま
たは酵母由来である。抗生物質（またはその類似体）
は、哺乳動物細胞に対して増殖阻害活性を示すことが必
要である。例えば「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩ
Ｎ”）（ＧＩＢＣＯ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）（これは抗生
物質Ｇ４１８である）、ヒグロマイシンＢ（ブロックリ
ンガー（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４
巻、２９２９−２９３１頁、１９８４年）、ブレオマイ
シン−フレオマイシン（ムルサント（Ｍｕｌｓａｎｔ）
ら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４巻、２４３−２５２頁、１９８
８年）およびプロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）（デ
ラルナ（ｄｅ ｌａ Ｌｕｎａ）ら、Ｇｅｎｅ、６２
巻、１２１−１２６頁、１９８８年）は、真核細胞の増
殖に対して阻害作用がある。耐性遺伝子は効率的に発現
されるために、適当な宿主細胞の制御下になければなら
ない。本発明の方法によれば、同時トランスフェクショ
ンされたＣＨＯ−ｄｈｆｒ−マイナス細胞またはＢＨＫ
−２１細胞を連続的に選択するために、２つの異なる抗
生物質が使用される。すなわち最初の抗生物質はＶＰ１
６を発現する同時トランスフェクション候補を選択する
ために使用され、第２の抗生物質は目的の遺伝子を発現
する同時トランスフェクション候補を選択するために使
用されなければならない。
【００３２】選択性抗生物質に対して耐性の細胞は同時
トランスフェクションの候補である。抗生物質耐性遺伝
子作成体を受け取った細胞は、抗生物質耐性遺伝子作成
体を受け取っていない細胞よりも、第２の作成体分子を
受け取った可能性が高い。当該分野で公知の任意の方法
により第２の作成体がスクリーニングされる。第２の作
成体にコードされる生成物の産生量は、種々の免疫測定
法により求められる（ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、抗
体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、５５３−６１２
頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）、１９８８年、例えばＥＬＩＳＡ、酵素的測定法ま
たは他の標準的方法）。
【００３３】抗生物質以外に他の型の選択性媒体も使用
できると考えられる（（マクドナアルド（ＭａｃＤｏｎ
ａｌｄ）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１５５−１７８
頁、１９９０年）、参考のため本明細書中に引用されて
いる）。しかし好適な媒体は抗生物質である。抗生物質
耐性遺伝子をコードするＤＮＡ作成体は、同時トランス
フェクションにより哺乳動物細胞に取り込まれるが、適
当な真核プロモーターの支配下の抗生物質耐性遺伝子は
ＩＥプロモーターまたはＶＰ１６作成体に結合されて同
時トランスフェクションが必要でないことも考えられ
る。これは通常のＤＮＡ技術を用いて実施することがで
きる。
【００３４】本発明の好適な実施態様によれば、ＤＮＡ
作成体は単純ヘルペスウイルスＶＰ１６をコードする。
同時トランスフェクション候補は、抗ＶＰ１６抗血清を
用いるウェスタンブロットにより、ＶＰ１６産生につい
てスクリーニングすることができる。以下に記載するよ
うに当該分野で公知の他の方法を使用することもる。
【００３５】任意の目的の遺伝子をＨＳＶ遺伝子プロモ
ーターＩＥ１７５またはＩＥ１１０の制御下に置くこと
ができる。もし遺伝子がプロモーターの下流に置かれ
て、間に転写停止シグナルがない場合、遺伝子は機能的
にプロモーターに結合しているといわれ、このプロモー
ターで転写が開始される時転写されるであろう。
【００３６】目的の遺伝子の高レベルの発現が本発明の
好ましい目標である。この発現は、ＶＰ１６またはＶＰ
１６で増強されるプロモーターの非存在下で得られるレ
ベルよりも高い発現である。できるだけ多くの高レベル
のトランスフェクション体を集めることが好ましい。こ
れらは引続き突然変異され、選択され、操作または化合
物で処理されて発現をさらに増強する。例えばトランス
フェクションされたＤＮＡの増幅が可能なように遺伝子
で発現作成体が同時トランスフェクションされるなら、
より高レベルの発現が得られるであろう（マクドナルド
（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）、同上）。このような増幅によ
り、しばしば同時増幅された遺伝子が過剰に発現され
る。
【００３７】ヌクレオチド配列は異なるがアミノ酸配列
は同一であるようにＶＰ１６コード領域を突然変異させ
ることができる（遺伝コードの縮重による）。またＶＰ
１６のアミノ酸配列に欠失や置換はあるが、ＶＰ１６は
その機能活性を維持するように作成することも可能であ
る。従って本発明は、ＶＰ１６遺伝子のすべての機能性
の型、およびその蛋白および誘導体を含むと考えられ
る。
【００３８】ＨＳＶのＩＥプロモーターにおいて、ＶＰ
１６によるＩＥ遺伝子の機能的トランス活性化にヌクレ
オチド配列（ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ、Ｒ＝プリン）が必要
であることは公知である。ＴＡＡＴＧＡＲＡＴのみを含
むプロモーターはトランス活性化されるが、ＩＥプロモ
ーターの残りの配列を含むプロモーターはトランス活性
化されないことは考えられる。ＶＰ１６の主要な標的は
ＨＳＶ−１または２のＩＥプロモーター（好ましくはＩ
Ｅ１７５またはＩＥ１１０プロモーター）である。しか
しＶＰ１６に応答する他の天然または合成プロモーター
も本発明の範囲に含まれると考えるべきである。
【００３９】さらに詳細に説明しなくても、これまでの
説明から当業者は本発明を最大限に利用することができ
る。従って以下の具体的な実施態様は本発明を例示する
ものであり、決してこれを限定するものではない。
【００４０】以下の例は本発明を例示するものであり、
その範囲を限定するものではない。以下の調製法の条件
や方法の公知の変更によりこれらの細胞株を調製するこ
とができることは、当業者には容易に理解できるであろ
う。
【００４１】細胞株 チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株（ＣＨ
Ｏ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１）はチャシン（Ｌ．Ｃｈａｓｉ
ｎ）より得（ウーラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．、７７巻、４２１６−
４２２０頁、１９８０年）、５％胎児牛血清（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２ｍＭのＬ−グルタミン
（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＨａｍ’ｓ
Ｆ１２中で培養した。この調製物をＣＨＯ増殖培地と
命名した。
【００４２】ＢＨＫ−２１細胞はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．（ロ
ックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メアリーランド州）
より得た。ＢＨＫ−２１細胞は、２ｍＭのｌ−グルタミ
ンと１０％の子牛血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、グランド
アイランド、ニューヨーク）と１ｍｌ当り１００単位の
ストレプトマイシンおよび１００μｇのペニシリンを補
足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高
グルコース濃度（ＪＲＨバイオサイエンシーズ（Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、レネクサ（Ｌｅｎｅｘａ）、カン
ザス州））で普通に培養した。この調製物をＢＨＫ−２
１増殖培地と命名した。ＢＨＫ／ＶＰ１６を単離するた
めに、牛血清の代わりに１０％の活性炭で処理した（ダ
ネッシュ（Ｄａｎｅｓｃｈ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６
巻、６２５−６３０頁、１９８７年）胎児牛血清を使用
した。ｐＳＶ２ｎｅｏ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）および／ま
たはｐＭＯＮ１１１８（ハイキン（Ｈｉｇｈｋｉｎ）
ら、Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７０巻、９７０
−９８１頁、１９９１年）でトランスフェクションした
ＢＨＫ−２１細胞を、それぞれ「ゲネチシン」（４００
μｇ／ｍｌ）および／またはヒグロマイシンＢ（カルビ
オケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、サンジエゴ、カリホ
ルニア州）（４５３単位／ｍｌ）で補足した培地中で培
養した。これらの培地を選択培地と命名した。「ゲネチ
シン」濃度は活性強度で示した。ｐＭＯＮ１１１８（ハ
イキン（Ｈｉｇｈｋｉｎ）ら、同上）はＳＶ４０プロモ
ーターからヒグロマイシンＢ耐性遺伝子を発現する。同
様のプラスミッド（ｐＳＶ２−ｈｐｈ）がＡ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．から入手できる。ｄｈｆｒ遺伝子を発現するプラス
ミッド（例えばＳＶ２−ｄｈｆｒ）もまたｐＳＶ２ｎｅ
ｏのようにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手できる。
【００４３】制限酵素消化物や他の分子クローニング技
術（例えば５’突出制限断片末端の充填）はマニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（分子クローニング：実験室マ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプ
リングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２
年）に従った。ベクターは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈ
ｅｉｍ）またはバイオラボズ（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバ
リー、マサチューセッツ州）で結合する前に、牛小腸ア
ルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）、インディアナ
ポリス、インディアナ州）で処理した。１％アガロース
ゲルからＤＥＡＥセルロースにエレクトロポレーション
して制限断片を単離した（Ｄ−Ｇｅｌ装置、コンテスサ
イエンティフィックグラスウェア／機器（Ｋｏｎｔｅｓ
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＧｌａｓｓｗａｒｅ／Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ）、ビンランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）、
ニュージャージー州）。
【００４４】ＩＥ１７５プロモーター領域の一部（−３
８０から＋２６）を含む発現ベクターをいくつかの工程
により作成した（図１）。−１０８から＋２６（転写の
開始部分に対して）からのＩＥ１７５プロモーター領域
を含むプラスミッドｐＰＯＨ２３（オヘア（Ｏ’Ｈａｒ
ｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ．、６１巻、１９０−１９９頁、１
９８７年）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した。−１
０８から＋２６プロモーター領域を含む１３４塩基対画
分を、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ウイ
ルスゲノムのヌクレオチド２５３３から２７７０）を含
むｐＵＣ１８誘導体であるｐＭＯＮ３３２７（ハイキン
（Ｈｉｇｈｋｉｎ）ら、前述）のＢａｍＨＩ部位にサブ
クローニングした。この新しいプラスミッドを−１０８
から＋２６ＩＥ１７５／ポリＡと呼んだ。上記のＨＳＶ
ＩＥ１７５プロモーター領域の部分の残りの配列を単
離するために、−３８０から＋２６のＩＥ１７５プロモ
ーター領域を含むｐＰＯＨ１３（オヘア（Ｏ’Ｈａｒ
ｅ）、前述）をＥｃｏＲＩで消化し、３０１塩基対断片
をＥｃｏＲＩ部位で−１０８から＋２６ＩＥ１７５／ポ
リＡにに結合させた。この新しいプラスミッドは、ユニ
ークなＢａｍＨＩ部位の上流にＩＥ１７５の−３８０か
ら＋２６領域を有し、この後にＳＶ４０後期ポリアデニ
ル化配列の一部が続いており、ＩＥ１７５／ポリＡと命
名した。
【００４５】ＩＥ１１０プロモーター領域を含む発現ベ
クターを以下のようにして作成した。ＨＳＶ ＩＥ１１
０（−８００から＋１２０）プロモーター領域と少量の
ｐＢＲ３２２配列を、ｐＧＨ８３（ロバーツ（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ．、６２巻、４３０７−４３２
０頁、１９８８年）からＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位の
消化により単離した。この９５１塩基対断片を単離し、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位で消化したｐＭＯＮ３３２
７に結合させた（図２）。この新しいプラスミッドをＩ
Ｅ−１１０／ポリＡと呼んだ。
【００４６】マウス乳ガンウイルス長末端反復（ＭＭＴ
Ｖ ＬＴＲ）を含有するベクターを、ＰｓｔI 消化によ
りｐ２０１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から１．４キロ塩基対
のＭＭＴＶ配列を単離し、ＰｓｔI 消化したｐＭＯＮ３
３２７に結合させて作成した。この新しいプラスミッド
をＭＭＴＶ／ポリＡと命名した（図３）。
【００４７】”ＧＥＮＥＡＭＰ”（パーキンエルマーシ
タス（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）、ノーウ
ォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）ＤＮＡ増
幅試薬キットと”ＡＭＰＬＩＴＡＱ”（パーキンエルマ
ーシタス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ））組
換えＴａｑポリメラーゼを製造業者の操作法に従って使
用してポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）により、ｐ
ＧＨ６２（アプリス（ＡｐＲｈｙｓ）ら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６３巻、２７９７−２８
１２頁、１９８９年）からＶＰ１６コード配列を単離し
た。このプラスミッドはＨＳＶ−１（ＭＰ株）からの
４．７キロ塩基対（Ｋｂｐ）のＢａｍＨＩ Ｆ断片を含
む。ＶＰ１６の配列はジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）
データベース（受け入れ番号Ｘ０３１４１）中にある。
この５’プライマーは、配列５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＣＣＴＣ３’（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含む。このプライマーはＰＣ
Ｒ生成物の５’末端にＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）部位
を取り込んでいる。イニシエーターのメチオニンには下
線が引いてある。３’アンチセンスプライマーは、配列
５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＴＡＣＣ
ＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する。
このプライマーはＰＣ生成物の３’末端にＢａｍＨＩ部
位を取り込んでいる。停止コドンは参考のため下線が引
いてある。ＶＰ１６コード領域はプラスミッドｐＭＳＶ
Ｐ１６（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社、マジソン（Ｍ
ａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）からの入手可能で
ある。このＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩで消化したｐＵ
Ｃ１８にサブクローニングされた。ｐＵＣ１８中のＶＰ
１６遺伝子はＢａｍＨＩ消化により単離し、ＳａｌＩで
消化しクレノウポリメラーゼで処理したＭＭＴＶ／ポリ
Ａに結合させる前にクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラ
ーゼを用いて５’突出末端を埋めた。このＶＰ１６ベク
ターはＭＭＴＶ−ＶＰ１６と命名する。
【００４８】プラスミッドｐＣＡ２１（ヘイワード
（Ｇ．はＹＷＡＲＤ）、ジョンズホプキンズ大学医学
部、ボルチモア、メリーランド州）は、ＳＶ４０ウイル
ス初期プロモーターの制御下でＶＰ１６コード領域を有
する。当業者に公知の方法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー
ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１９８２年）によ
り、ｐＭＳＶＰ１６（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社、
マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）から
ＶＰ１６コード領域を取り出し、これをプラスミッドｐ
ＳＶＫ３（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュ
ージャージー州）に挿入して、ＶＰ１６コード領域がＳ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下になるようにして、同
様のプラスミッドが作成できる。
【００４９】ウェスタンブロット 細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬから入手できる）で洗浄し、１．０ｍｌのＰＢ
Ｓ中に集め、マイクロフュージ中で３分間ペレットにし
た。細胞を１００μｌの１．５×試料緩衝液（３×＝
７．５ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ６．８、３０％グリセ
ロール、４％ＳＤＳ、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、４００μ
ｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーおよび６０ｍＭのジ
チオスレイトール）中で溶解し、７０℃で１０分加熱
し、３分沸騰させた。残基をペレットにしてから、上澄
液の１０から２０μｌを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ
ゲル（ダイイチ（Ｄａｉｉｃｈｉ）、インティグレーテ
ィッドセパレーションシステムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ
ｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ハイド
パーク（Ｈｙｄｅ Ｐａｒｋ）、マサチュセッツ州）に
のせた。電気泳動後セミドライブロッター（ジャンセン
（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＪＫＡバイオテク、デンマーク）
を用いて、蛋白をイモビロン−Ｐ（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ
−Ｐ）（インティグレーティッドセパレーションシステ
ムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍｓ））に移した。移動の後、膜の残りの非
結合の結合部位を、ブロッキング溶液（０．２５％ゼラ
チン、１００ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ９．０）で室温
で一晩インキュベートした。ブロッキング溶液を除去
し、膜をＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ
のＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．５）に
０．２５％ゼラチンと０．０５％ＮＰ４０を加えたもの
（ＶＰ１６のＣ−末端ペプチド（アミノ酸４７７−４９
０）に対するウサギ抗血清（１：２０００希釈）を含
む）中で３７℃で２時間インキュベートした。膜をＮＥ
Ｔ／ゼラチン／ＮＰ４０緩衝液（抗血清を含まない）で
室温で１時間インキュベートし、０．３ｍＣｉ／ｍｌの
125 Ｉ−プロテインＡ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）、アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅ
ｉｇｈｔｓ）、イリノイ州、０．１ｍＣｉ／μｌ）を含
むＮＥＴ／ゼラチン／ＮＰ４０緩衝液で室温で１時間イ
ンキュベートした。０．４％のサルコシル（ｓａｒｋｏ
ｓｙｌ）を含む高塩濃度のＮＥＴ（１ＭのＮａＣｌ）で
洗浄してアイソトープを除去した。水で洗浄し空気乾燥
した後、強化スクリーン”ＤＵＰＯＮＴ ＬＩＧＨＴＮ
ＩＧ ＰＬＵＳ”を用いてＸ線フィルム”ＫＯＤＡＫ、
Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ”にブロットを露光させた。
【００５０】安定なトランスフェクション条件 トランスフェクションの２４時間前に、細胞をシャーレ
１枚当り２−３×１０ 5 細胞で６０ｍｍの細胞培養シャ
ーレに接種した。ＣａＰＯ4 法（ファンデルエブ（ｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｅｂ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻、グロスマンとモルダブ（Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ）編、アカデミ
ックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニュー
ヨーク、１９８０年））でトランスフェクションし、ト
ランスフェクションの４時間後グリセロールショック
（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、９１
巻、５３９−５６０頁、１９７８年）を与えるか、また
は製造業者の勧めに従い”ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ”試薬
（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い、６０ｍｍのシャーレの
細胞当り３．０ｍｌの”ＯＰＴＩＭＥＭ”／ベータメル
カプトエタノール（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中の４０μｇ
の「リポフェクチン」”ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ”を用い
てトランスフェクションした。６時間後トランスフェク
ション培地を吸引し、増殖培地で置換した。２日後、細
胞を５から１０個の１００ｍｍのシャーレに移し、選択
培地を加えた。２−３週後、抗生物質耐性コロニーを単
離し、２４ウェルの組織クラスタープレートに移した。
ウェルが５０から１００％のコンフルエントになった
時、上澄液を目的の遺伝子の生成物についてスクリーニ
ングした。陽性株を拡張し、産生株と命名した。
【００５１】ｔＰＡとｂＧＨ産生の標準測定法 産生株を６ウェルの組織クラスターシャーレの２つのウ
ェルにウェル当り２．５から５．０×１０5 細胞で接種
し、３ｍｌの増殖培地を加えた（選択媒体は存在しな
い）。翌日培地を３ｍｌの新鮮な培地で置換し、２４時
間後上澄液を２重に採取して集め、測定するまで−２０
℃で保存した。最終的な細胞数を測定し、蛋白産生量は
１×１０6 細胞当り２４時間に産生された蛋白μｇにつ
いて標準化した。
【００５２】例１ ＢＨＫ−２１細胞中でＶＰ１６を発
現する安定な細胞株の作成と引き続くｔＰＡとｂＧＨの
発現 ＭＭＴＶ−ＶＰ１６（２０μｇ）とｐＳＶ２ｎｅｏ（２
μｇ）で同時トランスフェクションしたＢＨＫ−２１細
胞を、「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）耐性
について選択し、３４細胞株を単離した。ＶＰ１６のＣ
−末端ペプチド（アミノ酸４７７−４９０）に対するウ
サギ抗血清を用いて、まず細胞株をウェスタンブロット
でスクリーニングした。１つの株（＃２）では、ＶＰ１
６と一緒に移動するウェスタンブロットの薄いバンドが
あった（データは示されていない）。他の陽性と推定さ
れる株とともに、細胞株＃２を５μｇのＩＥ１７５−Ｃ
ＡＴ（ｐＰＯＨ１３）で一次的トランスフェクションし
た。同様のプラスミッドであるｐＩＣＰ４ＣＡＴはノバ
ゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）（マジソン（Ｍａ
ｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）から入手できる。ト
ランスフェクション後増殖培地を、１μＭのデキサメタ
ゾン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ
州）を補足した培地に変えた。翌日細胞を集め、ＣＡＴ
活性について測定した（ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）
ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５巻、４４４−４４
７頁、１９８７年）。ＶＰ１６発現細胞株を同定するた
めに、陽性と考えられる株のＣＡＴ活性を、ＢＨＫ−２
１親細胞のＣＡＴ活性と比較した。＃２株はＢＨＫ−２
１親細胞対照と比較したとき１２倍高いＣＡＴ活性を有
しており、ＢＨＫ／ＶＰ１６と命名した（データは示さ
れていない）。ウェスタンブロットはＢＨＫ／ＶＰ１６
株の単離の方法であるが、好適な方法はＩＥ１７５−ベ
ータガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａｌ）作成体を用いる機
能的測定法である。ラットのプロラクチンプロモーター
の制御下にＢ−ｇａｌ遺伝子を有するプラスミッドか
ら、大腸菌Ｂ−ｇａｌ遺伝子（ジーンバンク（ＧｅｎＢ
ａｎｋ）受け入れ番号Ｖ００２９６）をＢａｍＨＩ断片
（約３．３キロ塩基対）として単離した。同様のＢ−ｇ
ａｌカセットは市販されている（プロメガ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン
州；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）−ＬＫＢ、ピ
スタウェイ（Ｐｉｓｔａｗａｙ）、ニュージャージー
州）。ＢａｍＨＩ断片をＩＥ１７５／ポリＡにサブクロ
ーニングしてＩＥ１７５−Ｂ−ｇａｌを作成した。以下
のようにして細胞株をＶＰ１６についてスクリーニング
した。４８ウェルの組織クラスターシャーレのウェル当
り約１×１０4 細胞で細胞を接種し、「リポフェクチ
ン」”ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ”試薬を用いてＩＥ１７５
−Ｂ−ｇａｌでトランスフェクションした。約４０時間
後、リム（Ｌｉｍ）らの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、７巻、５７６−５７９頁、１９８９年）により、
Ｏ−ニトロフェニル−ベータ−ｄ−ガラクトシダーゼ
（ＯＮＰＧ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含むハンクス緩
衝化食塩水（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中の０．５％のＮＰ
４０を加えて原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）で溶解した。６
０分後２００μｌの試料を、９６ウェルの組織クラスタ
ープレートのウェルに移した。９６ウェルプレートを遠
心分離（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＪＳ５．２ロー
ター、５００×ｇ、１０分間）し、１００μｌを９６ウ
ェルの組織クラスタープレートの各ウェルに移した。プ
レートリーダー（ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）、
ＭＲ６００）を用いて４１０ｎｍでの光学密度を測定し
た。２００μｌのＢＣＡ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロ
ックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州））蛋
白試薬中の２０μｌの溶解液を測定して、蛋白の量を求
めた。
【００５３】ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔＰＡ）ｃＤＮＡを部位特異的突然変異誘発により修
飾して、５’と３’の非コード領域の末端を切断し、末
端にユニークなＢａｍＨＩ部位を入れた。修飾したｃＤ
ＮＡは１９塩基対の非翻訳配列を含み、停止コドンの４
塩基対後に停止し１．７キロ塩基対断片となる。この断
片をＢａｍＨＩで消化し、ＩＥ１７５／ポリＡのＢａｍ
ＨＩ部位に結合させてプラスミッドＩＥ１７５−ｔＰＡ
を作成し、ＩＥ１１０／ポリＡのＢａｍＨＩ部位に結合
させてプラスミッドＩＥ１１０−ｔＰＡを作成した。
【００５４】ＢＨＫ／ＶＰ１６細胞株を用いて、高蛋白
産生細胞株を３セット作成した。最初のセットは、ＩＥ
１７５−ｔＰＡ（２０μｇ）とｐＭＯＮ１１１８（２μ
ｇ）プラスミッドでＢＨＫ／ＶＰ１６を同時トランスフ
ェクションすることにより作成した。「ゲネチシ
ン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）とヒグロマイシンＢに
耐性の５５の細胞株を単離し、ｔＰＡについてスクリー
ニングした結果４１株が陽性であった。
【００５５】組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
ＰＡ）は、トランスフェクションした細胞株の調整培地
中で粒子濃縮蛍光免疫測定法（ＰＦＣＩＡ）により測定
した（ジョリー（Ｊｏｌｌｙ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、６
７巻、２１−３５頁、１９８５年）。エピコン（Ｅｐｉ
ｃｏｎ）測定プレート、粒子濃縮アナライザー（ＰＣ
Ａ）およびポリスチレン粒子はＩＤＥＸＸラボラトリー
ズ社（ウェストブルーク（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ）、メイ
ン州）より購入した。精製ヒトｔＰＡとヤギ抗ヒトｔＰ
Ａ抗体はアメリカンダイアグノスチカ社（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）（グリニッ
ジ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ）、コネチカット州）から入手
した。試薬は供給業者の方法に従って調製し、基礎的Ｐ
ＦＣＩＡは製造業者の方法に従って確立した。簡単に
は、調整培地中のｔＰＡを捕捉するために、ポリスチレ
ン粒子はヤギ抗ヒトｔＰＡ抗体でコーティングした。調
整培地試料を、ヤギ抗ｔＰＡポリスチレン粒子とフルオ
レセイン標識ヤギ抗ｔＰＡ抗体でインキュベートした。
３０分後ポリスチレン粒子の上で複合体が形成された。
複合体を洗浄し、ＰＣＡにより蛍光を定量した。抗体を
フルオレセインイソチオシアネート（シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）、セントルイス、ミズーリ州）で標識した。別の方
法はアメリカンダイアグノスチカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）からｔＰＡの酵素結合免疫吸
着測定法（ＥＬＩＳＡ）キットを購入することである。
【００５６】最初のスクリーニングで得られた産生量の
最も多い１６個の細胞株を、標準的方法でｔＰＡの産生
を測定した。９個の株が陽性であり、５個は１μｇ／１
０6細胞／２４時間以上の濃度のｔＰＡを産生した（表
１）。対照として、ＶＰ１６を発現しない、ＩＥ１７５
−ｔＰＡとｐＭＯＮ１１１８とともに同時トランスフェ
クションされたＢＨＫ−２１細胞を、ｔＰＡ産生につい
てスクリーニングした。６４個のヒグロマイシン耐性株
のうちで、４１個は最初のスクリーニングでｔＰＡ産生
は陽性であった。標準的条件下で１５個の株を測定し、
６個はｔＰＡ産生が陽性であった。ｔＰＡ産生レベル
は、０．００７から０．１７μｇ／１０6細胞／２４時
間の範囲にあった（表１）。
【００５７】高レベルの蛋白産生がＩＥ１７５プロモー
ターのみに限定されるか否かを調べるために、トランス
活性化株ＢＨＫ／ＶＰ１６をＩＥ１１０−ｔＰＡとｐＭ
ＯＮ１１１８で同時トランスフェクションして第２のセ
ットの細胞株を作成した。１９個の「ゲネチシン」（”
ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）／ヒグロマイシン株のうち１４
個はｔＰＡ産生が陽性であった。これらの１４個株のう
ち３つの株は４から２１μｇ／１０6 細胞／２４時間の
範囲の高レベルのｔＰＡを産生した（表１）。ＶＰ１６
トランスアクチベータの非存在下でのｔＰＡ産生レベル
を求めるために、ＢＨＫ−２１親細胞をＩＥ１１０−ｔ
ＰＡとｐＭＯＮ１１１８でトランスフェクションした。
１８個のヒグロマイシン耐性株をｔＰＡ産生についてス
クリーニングした。産生量の最も多い３つの株は０．０
１４から０．０８μｇ／１０6 細胞／２４時間を産生し
た（表１）。この実験は、ＶＰ１６の存在下でのＢＨＫ
−２１細胞からのｔＰＡ発現の安定な高レベルは、ＩＥ
１７５プロモーターのトランス活性化に限定されるので
はなく、他のＨＳＶ ＩＥプロモーターにも適用される
ことを示している。
【００５８】高レベルの蛋白産生はｔＰＡ分子自身の関
数ではないことを証明するために、ウシ成長ホルモン
（ｂＧＨ）遺伝子を用いて第３のセットの実験を行っ
た。
【００５９】ｂＧＨのゲノム遺伝子（ジーンバンク（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｊ００００８）を、ＰＣＲ
によりｐＢＲ−ｂＧＨ（ラマバドラン（Ｒａｍａｂｈａ
ｄｒａｎ）ら、Ｇｅｎｅ、３８巻、１１１−１１８頁、
１９８５年）から得た。５’プライマーはイニシエータ
ーコドンの上流の約６０塩基対をアニーリングし、配列
５’−ＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＡ
ＣＣＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有
し、天然のＢａｍＨＩ部位を有する。３’アンチセンス
プライマーは停止コドンの下流約２０塩基対で停止し、
作成したＢａｍＨＩ部位を有する。このプライマーは、
配列５’ＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧ
ＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡ−３’（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４）を有する。このＰＣＲ生成物をＢａｍＨ
Ｉで消化し、プラスミッドＩＥ１７５／ポリＡのＢａｍ
ＨＩ部位に挿入してＩＥ１７５−ｂＧＨを作成した。
【００６０】トランスアクチベータ株のＢＨＫ／ＶＰ１
６をＩＥ１７５／ｂＧＨ（２０μｇ）とｐＭＯＮ１１１
８（２μｇ）で同時トランスフェクションした。４２個
の「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）／ヒグロ
マイシン耐性株をｂＧＨ産生についてスクリーニングし
た。これらの株のうちの４つは調整培地中でｂＧＨにつ
き陽性であった。ｂＧＨ検出法は、ｔＰＡ測定法のよう
にＰＣＦＩＡであった（前述）。この場合２つの異なる
アフィニティ精製したモノクローナル抗体を使用した。
１つの抗体はビーズのコーティングに使用し、別の抗体
はフルオレセインで標識し、ビーズ上の捕捉されたｂＧ
Ｈの検出に使用した。生物活性のあるｂＧＨを大腸菌か
ら精製し、標準物質として使用した。１５個の株の標準
的測定法により、これらは３から１９μｇｂＧＨ／１０
6 細胞／２４時間を産生していることが証明された（表
１）。対照としてＢＨＫ−２１親細胞をＩＥ１７５−ｂ
ＧＨとｐＭＯＮ１１１８で同時トランスフェクションし
た。５３個のヒグロマイシン耐性株をｂＧＨ産生につい
てスクリーニングし、５０個は陽性であった。スクリー
ニングしたもののうち最も産生量の多い１９個の産生株
は０．３３から５μｇｂＧＨ／１０6 細胞／２４時間を
産生していることが証明された。ＩＥ１７５−ｔＰＡと
ＩＥ１１０−ｔＰＡから予想された値は＜０．３μｇｔ
ＰＡ／１０6細胞／２４時間であったため、この結果は
驚くべきことである。しかしＶＰ１６トランスアクチベ
ータ株から産生されるｂＧＨの量は平均して、親のＢＨ
Ｋ−２１株より数倍多かった。しかし誘導のない他の系
で高レベルの構成的産生が見られるため、ｂＧＨは代表
的マーカー蛋白ではないかも知れない（ヘイワード
（Ｇ．Ｈａｙｕｗａｒｄ）、個人的情報）。
【００６１】従ってＶＰ１６トランスアクチベータ結合
哺乳動物発現系は、ＩＥ１１０またはＩＥ１７５プロモ
ーターを用いて大量の蛋白を産生する細胞株の効率的な
単離に使用することができる。これは、ＨＳＶ−１また
はＨＳＶ−２の他の極初期遺伝子のプロモーター領域は
トランス活性化がカプリングしたベクターの設計のため
の良好な標的であることを示している。
【００６２】発現の安定性 最も長い間連続培養された株は、ＩＥ１７５−ｔＰＡと
ｐＭＯＮ１１１８をＢＨＫ／ＶＰ１６に同時トランスフ
ェクションすることにより産生されたものである（図
４）。第３代の継代で初期の標準的測定法により、すべ
ての４つの細胞株で発現レベルは１０μｇｔＰＡ／１０
6 細胞／２４時間以下であった。継代６代目では３つの
株でｔＰＡ産生が驚く程増加しており、２７から４４μ
ｇ／１０6細胞／２４時間の範囲にあった。これらの３
つの株では６代目のあとはｔＰＡレベルは減少し、約１
０から１５μｇ／１０6 細胞／２４時間で安定している
ようであった。第６代目でｔＰＡ産生の大幅な上昇を示
さなかった４番目の株（＃４）では、時間に対してレベ
ルはもっと一定であった。約５２代までの測定ではＰＦ
ＣＩＡ法によるｔＰＡ産生レベルは５から２０μｇ／１
０6 細胞／２４時間の範囲であった。各継代は１週間に
つき３から５倍の増加を示す。ｔＰＡ産生は下記のよう
にアミド溶解法（ウン（Ｔ．Ｃ．Ｗｕｎ）、データは示
していない）により証明された。ｔＰＡ調整培地の一画
分を、１ＭのＮＨ4ＨＣＯ3プラス１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ
に希釈した。ディスポーザブルキュベット中の希釈ｔＰ
Ａ試料２０μｌに、０．２２５ｍｌの０．１Ｍのトリス
−塩酸、ｐＨ８．７プラス０．５％トリトンＸ−１００
を加えた。この混合物を３７℃で３分インキュベートし
た。５μｌの調整培地を加え、ギルフォード（Ｇｉｌｆ
ｏｒｄ）分光光度計で４０５ｎｍでの吸光度を測定し
た。１ＭのＮＨ4ＨＣＯ3プラス１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに
溶解した１本鎖ｔＰＡ活性標準物質（アメリカンダイア
グノスチカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ａ）、＃１１５）を標準物質として用いた。
【００６３】例２血管透過性因子（ＶＰＦ） 文献（ケック（Ｋｅｃｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６
巻、１３０９−１３１２頁、１９８９年）の方法に従
い、ＶＰＦコード領域を含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
を、ホルボールエステルで誘導したＵ９３７細胞のライ
ブラリーから単離した。このｃＤＮＡは１８９個のアミ
ノ酸の蛋白をコードし、ＶＰＦ１８９と命名した［ＥＭ
ＢＬ／ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｘ
１５９９７またはＭ２７２８１］。ＰＣＲ法を用いて他
の２つの型のＶＰＦｃＤＮＡを単離した。１つの型はＶ
ＰＦ１８９と同じ１６５個のアミノ酸の蛋白（ただし交
互スプライシングによりアミノ酸１１６から１３８は欠
失している）をコードし、ＶＰＦ１６５と命名した。別
の型は１２１個のアミノ酸の蛋白をコードし、交互スプ
ライシングによりアミノ酸１１６から１５８が欠失して
いる以外はＶＰＦ１８９と同じであり、ＶＰＦ１２１と
命名した。
【００６４】上記のすべてのＶＰＦ（ＶＰＦ１８９、Ｖ
ＰＦ１６５、およびＶＰＦ１２１）のｃＤＮＡはＩＥ１
７５／ポリＡのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングされ
た。さらにＶＰＦの３つのｃＤＮＡは、マウスのメタロ
チオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモ
ーター（ケック（Ｋｅｃｋ）ら、同上）の制御下の牛パ
ピローマウイルス（ＢＰＶ）ベクターのｐＭＯＮ１１２
３にサブクローニングされた。最後にラウス肉腫ウイル
ス長末端反復（ＲＳＶ ＬＴＲ）プロモーターの制御下
で、ＳＶ２−ｄｈｆｒ発現カセットも含むプラスミッド
にサブクローニングされた。ＩＥ１７５／ポリＡ誘導Ｖ
ＰＦ発現プラスミッドは、前述したようにｐＭＯＮ１１
１８とともにＢＨＫ／ＶＰ１６トランスアクチベータ株
に同時トランスフェクションされた。ＢＰＶ誘導ＶＰＦ
発現プラスミッドはＳＶ２ｎｅｏとともにマウスＣ１２
７細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）に同時トランスフェクショ
ンして、「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”TM）
耐性について選択した。ＲＳＶ ＬＴＲ／ＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ誘導ＶＰＦ発現プラスミッドはＣＨＯ−ＤＵＫＸ−
Ｂ１１細胞にトランスフェクションし、ＤＨＦＲの発現
について選択した（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５
巻、ゲデル（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、アカデミッ
クプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨ
ーク、５３７−５６６頁、１９９０年）。上記の各セッ
トのトランスフェクションからの細胞株を適当な選択法
により単離し、株からの調整培地をＶＰＦの存在につい
て試験した。試験にはもともとはマイルズ（Ｍｉｌｅ
ｓ）測定法（コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、２６４巻、２００１７−２００２４頁、１９８
９年）を用いたが、以下のように酵素結合免疫吸着測定
法（ＥＬＩＳＡ）が好ましい。
【００６５】塩化ビニルマイクロタイタープレートの各
ウェルを、ＰＢＳで希釈した抗体の２０μｇ／ｍｌの溶
液５０μｌで、室温で２から３時間インキュベートする
ことにより、ヤギ抗ＶＰＦＩｇＧをマイクロタイタープ
レートに結合させた。抗体溶液を除去し、ＰＢＳで希釈
した脂肪を含まない１％の乾燥ミルク（カゼイン）で室
温で３０分ウェルをインキュベートして、残りの非結合
部位をブロックした。ウェルに調整培地を加え、室温で
一晩インキュベートした。ウェルをＮａＣｌ／ツイーン
２０溶液で４回洗浄した。５０μｌの２．５μｇ／ｍｌ
ビオチン化ヤギ抗ＶＰＦＩｇＧを加え、室温で２から３
時間インキュベートした。ウェルを４回洗浄し、１／１
６００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ−ストレプト
アビジン（ＫＰＬ、ゲテルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ）、メリーランド州）の５０μｌで室温で９０
分インキュベートした。ウェルを洗浄し、１００μｌの
西洋ワサビペルオキシダーゼ基質を加え、製造業者の指
示に従い測定した。ＶＰＦ濃度は、０．０５％のツイー
ン２０と脂肪を含まない１％の乾燥ミルクを含むＰＢＳ
で希釈したＵ９３７細胞誘導ＶＰＦを用いて作成した標
準曲線から求めた。表２は、ＢＨＫ／ＶＰ１６株は３つ
の型のＶＰＦを産生するのにＣ１２７細胞（ＢＰＶベク
ターは典型的に１０から２００コピー／細胞に増幅され
ている細胞株）（ステフェンズ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２４８
巻、１−１１頁、１９８７年）と同様に効率的であり、
増幅前はＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１よりはるかに効率的
であることを示している。さらにＢＨＫ−２１細胞は、
スケールアップ時にＣ１２７細胞が有する欠点を有して
いない（マクキリップ（ＭｃＫｉｌｌｉｐ）ら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、８０５−８１０頁、１
９９１年）。培地中での蛋白の変性のため、試験したす
べての細胞系でＶＰＦ１８９の産生は低かった（＜０．
１μｇ／ｍｌ）（データは示されていない）。細胞中の
ＶＰＦ１８９ｍＲＮＡのレベルは、各細胞株のＶＰＦ１
６５とＶＰＦ１２１のレベルと同様に高く（データは示
されていない）、トランスアクチベータのレベルはＶＰ
Ｆ１８９蛋白産生の見かけの低下には関係がないことを
示していた。
【００６６】例３ヒト細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ） ＩＣＡＭのアミノ末端細胞外ドメイン、トランスメンブ
ラン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインおよびカ
ルボキシ末端細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ（ジ
ーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号Ｊ０３１３
２）を、以下のようにＰＣＲにより単離した。ＩＣＡＭ
ｃＤＮＡのヌクレオチド１６４６から１６６９に相補的
な３’アンチセンスプライマーである５’−ＧＣＴＡＧ
ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣ
Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を用いて、ＳＫ−
ヘパトーマ細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）を特異的プライム
第１ストランド合成の鋳型として使用した。２０μｌの
反応物は、１０μｇのＲＮＡ、２０ピコモルのプライマ
ー、２０単位の「ルナシン」（”ＲＮＡＳＩＮ”）（プ
ロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏ
ｎ）、ウィスコンシン州））、２．５ｍＭのｄＮＴＰ、
および２００単位の逆転写酵素を含有していた。合成は
３７℃で３０分行い、次に製造業者の指示に従いＰＣＲ
による増幅のために使用した。この５’プライマーは、
配列５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＣ
ＴＡＴＧＧＣＴＣＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６）を有し、ＩＣＡＭｃＤＮＡのヌクレオチド４５から
６６に相補的である（スタウントン（Ｓｔａｕｎｔｏ
ｎ）ら、Ｃｅｌｌ、５２巻、９２５−９３３頁、１９８
８年）。さらにこのプライマーは、作成したＢａｍＨＩ
制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含む。得られる約１．６キ
ロ塩基対の断片を次のＰＣＲ反応の鋳型として用いた
（同じ５’プライマーと新しい３’プライマーを用い
て、３’プライマーはアミノ酸４５３で分子の末端が切
断されて、分子のトランスメンブランドメインと細胞質
ドメインが排除されるようにする）（マーリン（Ｍａｒ
ｌｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４４巻、７０−７２頁、
１９９０年）。第２の３’アンチセンスプライマーの配
列は、５’−ＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣ
ＡＴＡＣＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７）を有し、ＩＣＡＭｃＤＮＡのヌクレオチド
１４８０から１４９７に相補的であり、グルタミン酸コ
ドン（アミノ酸４３５）のすぐ３’にＢａｍＨＩ部位を
有する。プラスミッドＩＥ１７５／ポリＡをＢａｍＨＩ
部位で消化して、５’にＢａｍＨＩ部位、デカペプチド
（ＹＰＴＤＶＰＤＹＡＳ）（ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５−１２８１頁、１
９８９年、単一文字コード）をコードする配列、３’に
停止コドンおよびＢｇｌII部位を有するＤＮＡ断片に結
合させた。この断片は２つのオリゴヌクレオチド、５’
−ＧＡＴＣＣＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＧＧ
ＡＣＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣ−３’（Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ：８）と、５’−ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣ
ＴＴＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧ
ＴＡＣＧＧＧＴＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
をアニーリングすることにより作成した。この修飾した
ＩＥ１７５／ポリＡプラスミッドはＩＥ１７５／デカ−
ポリＡと命名し、ＢａｍＨＩで消化して、ＢａｍＨＩで
消化してあった末端を切断したＩＣＡＭｃＤＮＡに結合
させて、プラスミッドＩＥ１７５−ｓＩＣＡＭ453−デ
カ−ポリＡを得た。このｓＩＣＡＭ453発現ベクターは
前述したようにｐＭＯＮ１１１８とともにＢＨＫ／ＶＰ
１６に同時トランスフェクションし、ｓＩＣＡＭ453デ
カペプチドの高産生株を選択した。イムノブロット解析
により融合蛋白のデカペプチド部分をスクリーニングす
ることにより、ｓＩＣＡＭ453−デカペプチドの発現に
ついて、「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）／
ヒグロマイシンＢ耐性細胞株をスクリーニングした。コ
ンフルーエンシーに達した時、細胞を無血清ＤＭＥＭ中
で２４時間インキュベートした。調製培地１００μｌを
集め、マルチチェンバースロットブロット装置（シュレ
イチャーとシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ））を用いてニトロセルロース濾紙で
濾過した。次にニトロセルロースを、デカペプチドに対
するウサギポリクローナル抗血清で以下のようにプロー
ブさせた（ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、同上）。ＴＮＴ緩
衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−塩
酸、ｐＨ８．０、０．０５％ツイーン２０）中のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）の５％溶液中で、ニトロセルロ
ースを３７℃で１時間インキュベートして、非特異的抗
体結合部位をブロックした。ＴＮＴ緩衝液で洗浄した
後、ニトロセルロース紙を、１％ＢＳＡ／ＴＮＴで１：
４０００希釈したウサギ−抗デカペプチド抗体で、室温
で１．５時間インキュベートした。紙をＴＮＴ緩衝液中
で２０分の洗浄を３回行い、結合しない抗体を除去し
た。製造業者の指示に従い、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）（マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン
州）から入手できるようなヤギ抗ＩｇＧアルカリ性ホス
ファターゼ検出系を用いて、ウサギ抗体を検出した。デ
カペプチドに対するポリクローナル抗血清を結合したプ
レートから125 Ｉ標識ｓＩＣＡＭ453−デカペプチドを
排除することにより、調整培地中のｓＩＣＡＭ453−デ
カペプチドを定量した。ウサギの抗デカペプチドＩｇＧ
を、デカペプチドの結合した「アフィゲル１５」（”Ａ
ｆｆｉ−Ｇｅｌ１５”）（バイオレッド（ＢｉｏＲｅ
ｄ）の登録商標）樹脂（バイオレッド（ＢｉｏＲｅ
ｄ）、リッチモンド、カリホルニア州）で精製した。９
６ウェルのマイクロタイタープレートに抗デカペプチド
ＩｇＧを結合させ、非特異的結合部位をＢＳＡでブロッ
クし、次にウェルを産生株からの２５μｌの調整培地と
２５μｌ（５０，０００ｃｐｍ）の125 Ｉ標識ｓＩＣＡ
Ｍ453−デカペプチドででインキュベートした。洗浄後
ウェルに結合した放射能の量を計測し、既知量の非標識
ｓＩＣＡＭ453−デカペプチドで競合させて結合した放
射能の量と比較した。表２は、最も産生量の多い株は、
１ｍｌ当り１００μｇの分泌されたＩＣＡＭを合成し、
これはハイブリドーマが達成するレベルに匹敵すること
を示している（ベンヂッヒ（Ｂｅｎｄｉｇ）、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻、９０−１２７
頁、１９８８年）。
【００６７】例４分泌されたフコシルトランスフェラーゼ フコシルトランスフェラーゼの分泌型の発現ベクター
（受け入れ番号Ｘ５３５７８、クコウスカ−ラタロ（Ｋ
ｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ）ら、Ｇｅｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、４巻、１２８８−１３
０３頁、１９９０年）を、数工程で作成した。プラスミ
ッドＩＥ１１０／ポリＡ（図２）をＢａｍＨＩで消化し
た。このＢａｍＨＩ部位に、作成した相補的ＢａｍＨＩ
末端５’−ＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴ
ＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣ
ＴＧＧＴＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＴＧＧＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を有
するヒトＩＬ３シグナル配列（下線）をコードし、作成
したＮｃｏI （ＣＣＡＴＧＧ）と作成したＨｉｎｄIII
（ＡＡＧＣＴＴ）部位をシグナルペプチドコード配列の
３’末端当りに含む、２本鎖ＤＮＡの断片をクローニン
グした。得られるプラスミッド（ＩＥ１１０−ＩＬ３／
ポリＡ）をＮｃｏI とＨｉｎｄIII で消化した。この部
位に、５’末端にＮｃｏI 部位をそして３’末端にＨｉ
ｎｄIII 部位を有する、デカペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤ
ＹＡＳ、一文字コード、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
１））をコードするＤＮＡ断片を結合させた。この断片
は、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＧＡＣＣＡＴＧ
ＧＣＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＧ
ＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＴ−３’（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２）にその相補的オリゴヌクレオチド
をアニーリングさせることにより得られた。得られたプ
ラスミッドはＩＥ１１０−ＩＬ３−デカ／ポリＡと命名
した。フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコー
ドするＤＮＡ断片をＰＣＲによりＡ４３１（Ａ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．）細胞ＲＮＡから単離し、ＨｉｎｄIII 末端を
作成した。この断片のフコシルトランスフェラーゼコー
ド配列はアミノ酸４４（セリン）で始まり、天然の停止
コドンの４塩基対後に終る。この断片を、ＩＥ１１０−
ＩＬ３−デカ／ポリＡのデカペプチド配列の後ろに位置
するＨｉｎｄIII 部位に結合させた。得られた融合遺伝
子はＩＬ３シグナル配列（最初の１９個のアミノ酸）、
合成デカペプチドコード領域およびアミノ酸４４で始ま
るフコシルトランスフェラーゼコード領域を有し、ＩＥ
１１０−ＩＬ３−デカ−ＦＴ−ポリＡと命名した。
【００６８】ＢＨＫ／ＶＰ１６細胞を、前述したように
ＩＥ１１０−ＩＬ３−デカ−ＦＴ−ポリＡとｐＭＯＮ１
１１８で同時トランスフェクションした。プリールズ
（Ｐｒｉｅｅｌｓ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５６巻、１０
４５６−１０４６３頁、１９８１年）の方法に従い、分
泌されたフコシルトランスフェラーゼ活性について細胞
株を測定した。μｇ／ｍｌに換算した時、最も産生量の
多い株は７０μｇ／ｍｌ産生した（表２）。
【００６９】例５ 本例は、ｔＰＡの高産生株であるＣＨＯ細胞株の作成を
示す。
【００７０】本例は、ヘルペスウイルスＶＰ１６の存在
下でのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の選択によ
り、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞において少数の高レ
ベルｔＰＡ産生株が得られたことを証明する。抗生物質
耐性マーカーの選択により、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１
細胞で高率に高レベル産生株が得られる。
【００７１】細胞をｐＣＡ２１またはＭＭＴＶ−ＶＰ１
６およびｐＳＶ２ｎｅｏで同時トランスフェクションし
た。「ゲネチシン」（”ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ”）に耐性
の形質転換体を選択し、前述したようにＩＥ１７５−Ｂ
−ｇａｌでトランスフェクションしてＶＰ１６発現につ
いてスクリーニングした。
【００７２】ＶＰ１６を発現した細胞を、ＩＥ１７５−
ｔＰＡまたはＩＥ１１０−ｔＰＡ；そしてｐＭＯＮ１１
１８またはｐＳＶ２ｎｅｏで同時トランスフェクション
した。結果を表３に示す。
【００７３】データは、ＤＨＦＲ発現について選択され
た３／１２７ＣＨＯ／ＶＰ１６／１７５−ｔＰＡ細胞株
のみが高レベル（すなわち１．０μｇ／１０6 細胞／２
４時間以上）のｔＰＡを発現することを示している。こ
れに対してヒグロマイシンを選択剤として用いた場合、
６％の細胞株が１．０μｇ／１０6 細胞／２４時間以上
のｔＰＡを発現した。
【００７４】ＶＰ１６を発現しない親ＣＨＯ−ＤＵＫＸ
−Ｂ１１への対照トランスフェクションは変則的であ
る。ヒグロマイシンを用いると、予想されたように０／
８７細胞株は高産生体であった。しかしＤＨＦＲ選択で
は、ＶＰ１６の存在しない場合、７／１１２細胞株が高
産生体であった。高レベルの産生体が高率に見られるこ
とは、メソトレキセートの非存在下でＤＨＦＲおよびｔ
ＰＡ遺伝子のあるレベルの増幅があることを反映してい
る。しかしこれを指示するデータを我々は持っていな
い。
【００７５】さらなる応用 上記の細胞株はＶＰ１６を発現し、ＨＳＶ ＩＥプロモ
ーター（ＶＰ１６のトランス活性化の標的）に機能的に
結合した遺伝子から相当量の分泌蛋白を産生する。これ
らの分泌された蛋白は容易に定量され、従ってこれらの
細胞株はＶＰ１６介在トランス活性化を阻害する化合物
の発見に有用であることが考えられる。具体的には、天
然の生成物、化学物質または他の物質が上記の細胞株に
加えられ、産生される蛋白生成物の量への効果が測定さ
れる。蛋白生成物の産生を減少させるこれらの化学物
質、天然の生成物または他の物質は、ＶＰ１６介在トラ
ンス活性化を妨害する化合物の同定の主役である。蛋白
産生の減少がＶＰ１６株に特異的であるか否かを試験す
るために、他のプロモーターの制御下で蛋白を分泌する
対照の細胞培養も試験されるであろう。ＶＰ１６株で特
異的に蛋白産生を減少させる化合物はさらに解析して、
抗ウイルス活性について試験される。一過性測定法にも
同じ方法が使用される。しかし一過性測定法は、各測定
についてＤＮＡトランスフェクションが必要なためはる
かに手間がかかる。上記の細胞株は蛋白生成物を安定的
に産生するため、多くの測定法ではるかに均一な細胞の
供給が可能である。これにより時間が節約され、測定の
再現性が向上する。最近このような安定な細胞株を用い
る方法が、ｔａｔトランスアクチベータによるＨＩＶＬ
ＴＲのトランスアクチベータを阻害するかも知れない化
合物の発見に使用された（スー（Ｈｓｕ）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５４巻、１７９９−１８０２頁、１９９１
年）。同様の方法が出願ＷＯ９１／０１３７９（国際出
願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０４０２１）に記載されてい
る。
【００７６】ＢＨＫ／ＶＰ１６とＣＨＯ／ＶＰ１６株
は、機能性ＶＰ１６遺伝子の欠如したＨＳＶの突然変異
体の産生に有用であることが期待される。ウェルスタッ
ク（Ｗｅｒｓｔｕｃｋ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、６４巻、９８４−９９１頁、１９９０
年）が証明したように、ＶＰ１６を発現する細胞株はＨ
ＳＶＤＮＡの感染性を上昇させる。ＨＳＶのＶＰ１６マ
イナス突然変異体とｎａｋｅｄのＨＳＶＤＮＡはＨＳＶ
複製の極初期の過程をトランス活性化する能力が欠如し
ているため、宿主細胞株によりトランス（ｔｒａｎｓ）
でＶＰ１６を供給することによりＨＳＶのＶＰ１６マイ
ナス突然変異体の効率的な複製が可能になりｎａｋｅｄ
のＨＳＶＤＮＡの感染性が上昇するであろう。このよう
なＶＰ１６発現細胞株の有用性は、ＶＰ１６遺伝子の突
然変異のために非感染性になったＨＳＶの生きたワクチ
ン型のＨＳＶが継代できることであろう。ＶＰ１６発現
株はまた、欠陥のあるＨＳＶウイルスの必要な遺伝子を
ひとまとめに提供するために、ＶＰ１６発現株は、トラ
ンス（ｔｒａｎｓ）で追加のＨＳＶ突然変異体を補足す
る他のＨＳＶ遺伝子とともに操作されることが予想され
る。
【００７７】前記の説明より当業者は本発明の基本的特
質を容易に確認することができ、本発明の精神と範囲を
逸脱することなく、本発明の種々の変更や修飾により種
々の用途や状況に適用できるであろう。従って本発明の
範囲は記載されまたは示唆された特定の実施態様に限定
されるものではなく、特許請求の範囲によって限定され
るものである。
【表１】
【表２】
【表３】
【００７８】配列リスト （１）一般的情報： １）出願人： （Ａ）名前：モンサント社（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃ
ｏ．） （Ｂ）番地：８００Ｎ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇｈ （Ｃ）市：セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ） （Ｄ）州：ミズーリ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ） （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：６３１６７ （Ｇ）電話番号：（３１４）６９４−５４０２ （Ｈ）ファックス番号：（３１４）６９４−９００９ ２）発明の名称：ヘルペスウイルスプロモーターとＶＰ
１６トランスアクチベータを用いる組換え蛋白の産生 ３）配列の数：１２ ４）コンピュータで読める型： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ＃１．０、＃１．２５版（ＥＰＯ） （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： GATCGGATCC AACCCCACCC AATGGACCTC ３０ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： GATCGGATCC GCGCCCCCTA CCCACC ２６ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： GACCAATTCC AGGATCCCAG GACCCAGT ２８ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： GATCGGTACC GCAAACAACA GATGGCTGGC AACTAGA ３７ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： GCTAGGATCC CGGGATAGGT TCAGGGAGGC G ３１ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： GATCGGATCC TCAGCCTCGC TATGGCTCCC ３０ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： GATCGATCAT GGATCCCTCA TACCGGGGGG AGAG ３４ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：４４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： GATCCTACCC GTACGACGTT CCGGACTACG CTTCTTAAGA GCTC ．４ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：４４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： GATCGAGCTC TTAAGAAGCG TAGTCCGGAA CGTCGTACGG GTAG ４４ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：７６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： GATCCACCAT GAGCCGCCGT CCCGTCCTGC TCCTGCTCCA ACTCCTGGTC GGCCCCGCCA ６０ TGGCTAAGCT TGGATC ７６ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ペプチド １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser １ ５ １０ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の情報： １）配列特性： （Ａ）長さ：５４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）らせん構造：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） １１）配列説明：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： GATCGACCAT GGCTGCCATA CCCGTACGAC GTTCCGGACT ACGCTTCTAA GCTT ５４
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＥ１７５発現ベクターの作成を示す。この発
現プラスミッドは、プロモーター配列とＳＶ４０後期ポ
リアデニル化配列の間にユニークなＢａｍＨＩ部位を有
する。
【図２】ＩＥ１１０発現ベクターの作成を示す。この発
現プラスミッドは、プロモーター配列とＳＶ４０後期ポ
リアデニル化配列の間にユニークなＢａｍＨＩ部位を有
する。
【図３】マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）長末端反復
（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）（ＬＴ
Ｒ）発現ベクターの作成を示す。ＳＶ４０後期ポリアデ
ニル化シグナルは、このプラスミッドの初期の方にあ
る。
【図４】ＢＨＫ／ＶＰ１６／ＩＥ１７５−ｔＰＡ株３
４、３９、４７、４９の継代によるｔＰＡ産生量の変化
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/38 15/54 15/58 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子産物の発現のための細胞株の産生
    方法であって、 細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ
    １６を発現させる第１の作成体と、第１の選択剤に対し
    て選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成体を、細胞
    に同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ
    ｉｏｎ）し、 第１の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、 第１の選択剤に対して耐性の細胞をスクリーニングして
    ＶＰ１６を発現する細胞を選び、 単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ１６を
    発現する細胞を第３および第４の作成体と同時トランス
    フェクションし、ここで第３の作成体は目的の遺伝子に
    機能的に結合した単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターよりなり、第４の作成体は第２の選択剤に対して選
    択可能な耐性遺伝子よりなり、 第２の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、そして第２
    の選択剤に耐性の細胞をスクリーニングして目的の遺伝
    子の遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程よりな
    る、上記方法。
  2. 【請求項２】 細胞はＢＨＫ−２１細胞またはＣＨＯの
    ｄｈｆｒ−マイナス突然変異体由来である、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモータ
    ーはＩＥ１７５またはＩＥ１１０領域由来である、請求
    項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 第１の選択剤は抗生物質である、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】 第２の選択剤は抗生物質である、請求項
    １に記載の方法。
  6. 【請求項６】 選択剤耐性遺伝子は、ヒグロマイシンホ
    スホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトラ
    ンスフェラーゼ３’−Ｈ、プロマイシンアセチルトラン
    スフェラーゼおよびブレオマイシン−フレオマイシン結
    合蛋白よりなる群から選択される、請求項１に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 目的の遺伝子は分泌された蛋白をコード
    する、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 目的の遺伝子はｔＰＡ、分泌されたＩＣ
    ＡＭ、分泌されたフコシルトランスフェラーゼ、または
    分泌された血管透過性因子をコードする、請求項１に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 遺伝子産物を発現する細胞株であって、
    該細胞株は細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性
    化蛋白ＶＰ１６を発現させる第１の作成体と、第１の選
    択剤に対して選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成
    体を、細胞に同時トランスフェクションし、 第１の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、 第１の選択剤に対して耐性の細胞をスクリーニングして
    ＶＰ１６を発現する細胞を選び、 単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ１６を
    発現する細胞を第３および第４の作成体と同時トランス
    フェクションし、ここで第３の作成体は目的の遺伝子に
    機能的に結合した単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターよりなり、第４の作成体は第２の選択剤に対して選
    択可能な耐性遺伝子よりなり、 第２の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、そして第２
    の選択剤に耐性の細胞をスクリーニングして目的の遺伝
    子の遺伝子産物を発現する細胞を選択する工程より作成
    される、上記細胞株。
  10. 【請求項１０】 細胞はＢＨＫ−２１またはＣＨＯのｄ
    ｈｆｒ−マイナス突然変異体由来である、請求項９に記
    載の細胞株。
  11. 【請求項１１】 単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターはＩＥ１７５またはＩＥ１１０領域由来である、請
    求項９に記載の細胞株。
  12. 【請求項１２】 第１の選択剤は抗生物質である、請求
    項９に記載の細胞株。
  13. 【請求項１３】 第２の選択剤は抗生物質である、請求
    項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 選択剤耐性遺伝子は、ヒグロマイシン
    ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼ３’−Ｈ、プロマイシンアセチルトラ
    ンスフェラーゼおよびブレオマイシン−フレオマイシン
    結合蛋白よりなる群から選択される、請求項９に記載の
    細胞株。
  15. 【請求項１５】 目的の遺伝子は分泌された蛋白をコー
    ドする、請求項９に記載の細胞株。
  16. 【請求項１６】 目的の遺伝子はｔＰＡ、分泌されたＩ
    ＣＡＭ、分泌されたフコシルトランスフェラーゼ、また
    は分泌された血管透過性因子をコードする、請求項９に
    記載の細胞株。
  17. 【請求項１７】 遺伝子産物を発現する細胞株であっ
    て、細胞株は細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活
    性化蛋白ＶＰ１６を発現させる第１の作成体；目的の遺
    伝子に機能的に結合した単純ヘルペスウイルス遺伝子プ
    ロモーターよりなる第２の作成体；そしてそれぞれ選択
    剤に対して選択可能な耐性遺伝子よりなる第３および第
    ４の作成体よりなる、上記細胞株。
  18. 【請求項１８】 細胞はＢＨＫ−２１細胞由来である、
    請求項１７に記載の細胞株。
  19. 【請求項１９】 細胞はＣＨＯのｄｈｆｒ−マイナス突
    然変異体由来である、請求項１７に記載の細胞株。
  20. 【請求項２０】 細胞株はジヒドロ葉酸還元酵素につい
    て選択することなく得られる、請求項１９に記載の細胞
    株。
  21. 【請求項２１】 単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターはＩＥ１７５またはＩＥ１１０領域由来である、請
    求項１７に記載の細胞株。
  22. 【請求項２２】 選択剤耐性遺伝子は、ヒグロマイシン
    ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼ３’−Ｈ、プロマイシンアセチルトラ
    ンスフェラーゼおよびブレオマイシン−フレオマイシン
    結合蛋白よりなる群から選択される、請求項２０に記載
    の細胞株。
  23. 【請求項２３】 目的の遺伝子は分泌された蛋白をコー
    ドする、請求項１７に記載の細胞株。
  24. 【請求項２４】 目的の遺伝子はｔＰＡ、分泌されたＩ
    ＣＡＭ、分泌されたフコシルトランスフェラーゼ、また
    は分泌された血管透過性因子をコードする、請求項１７
    に記載の細胞株。
  25. 【請求項２５】 抗ウイルス剤を発見する方法であっ
    て、 細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ
    １６を発現させる第１の作成体と、第１の選択剤に対し
    て選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成体を、細胞
    に同時トランスフェクションし、 第１の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、 第１の選択剤に対して耐性の細胞をスクリーニングして
    ＶＰ１６を発現する細胞を選び、 単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ１６を
    発現する細胞を第３および第４の作成体と同時トランス
    フェクションし、ここで第３の作成体は目的の遺伝子に
    機能的に結合した単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターよりなり、第４の作成体は第２の選択剤に対して選
    択可能な耐性遺伝子よりなり、 第２の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、 第２の選択剤に耐性の細胞をスクリーニングして目的の
    遺伝子の遺伝子産物を発現する細胞を選択し、 細胞を試験すべき物質とインキュベートし、 該物質に接触させた後に、細胞に産生される目的の遺伝
    子の遺伝子産物の量を決定し、 通常のウイルス測定法によりウイルスの複製を阻害する
    目的の遺伝子の遺伝子産物の量を減少させる物質を試験
    する工程よりなる、上記方法。
  26. 【請求項２６】 細胞はＢＨＫ−２１またはＣＨＯのｄ
    ｈｆｒ−マイナス突然変異体由来である、請求項２５に
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 単純ヘルペスウイルス遺伝子プロモー
    ターはＩＥ１７５またはＩＥ１１０領域由来である、請
    求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 第１の選択剤は抗生物質である、請求
    項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 第２の選択剤は抗生物質である、請求
    項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 選択剤耐性遺伝子は、ヒグロマイシン
    ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼ３’−Ｈ、プロマイシンアセチルトラ
    ンスフェラーゼおよびブレオマイシン−フレオマイシン
    結合蛋白よりなる群から選択される、請求項２５に記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 ウイルスは単純ヘルペスウイルスであ
    る、請求項２５に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 目的の遺伝子は分泌された蛋白をコー
    ドする、請求項２５に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 目的の遺伝子はｔＰＡ、分泌されたＩ
    ＣＡＭ、分泌されたフコシルトランスフェラーゼ、また
    は分泌された血管透過性因子をコードする、請求項２５
    に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 試験すべき物質は植物、動物または微
    生物由来の合成または天然の化合物である、請求項２５
    に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ＶＰ１６マイナスウイルス突然変異体
    を増殖させる方法であって、 細胞に単純ヘルペスウイルスのトランス活性化蛋白ＶＰ
    １６を発現させる第１の作成体と、第１の選択剤に対し
    て選択可能な耐性遺伝子よりなる第２の作成体を同時ト
    ランスフェクションし、 第１の選択剤に対して耐性の細胞を選択し、 第１の選択剤に対して耐性の細胞をスクリーニングして
    ＶＰ１６を発現する細胞を選び、 ＶＰ１６を発現する細胞をＶＰ１６マイナスウイルスで
    感染させ、 標準的方法により感染した細胞から子孫のウイルスを集
    める工程よりなる、上記方法。
  36. 【請求項３６】 細胞はＢＨＫ−２１またはＣＨＯのｄ
    ｈｆｒ−マイナス突然変異体由来である、請求項３５に
    記載の方法。
  37. 【請求項３７】 第１の選択剤は抗生物質である、請求
    項３５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 選択剤耐性遺伝子は、ヒグロマイシン
    ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼ３’−Ｈ、プロマイシンアセチルトラ
    ンスフェラーゼおよびブレオマイシン−フレオマイシン
    結合蛋白よりなる群から選択される、請求項３５に記載
    の方法。
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