JPH02502605A

JPH02502605A - 遺伝子発現の刺激方法

Info

Publication number: JPH02502605A
Application number: JP50421288A
Authority: JP
Inventors: ドレイパー，ケネス・ジー
Original assignee: シェリング・コーポレーション
Priority date: 1987-03-13
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1990-08-23
Also published as: WO1988007083A1; EP0282330A2; EP0282330A3; EP0349598A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】６、　ウィルスの転写活性化タンパク質はＶｍｗ６５．ＩＣＰ４゜ＩＣＰＯまたはＩＣＰ２７である、請求項５記載の方法および細胞。

７、　ウィルスの転写活性化タンパク質はＶｍｗ６５である、請求項６記載の方法および細胞。

８、　活性化応答ＤＮＡ配列はＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（ここでＲはＧまたはＡである）である、請求項７記載の方法および細胞。

９、　前記遺伝子は異種非ウィルス遺伝子である、請求項８記載の方法および細胞。

１０、　前記細胞はまたＶＭＷ６５をコードする遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換されており、それによりＶｍｗ６５を発現しうる、請求項９記載の方法および細胞。

１１、　　前記プロモーター領域はαＨ３Ｖ−１およびＨＳＶ−２プロモーター領域から選ばれる、請求項１Ｏ記載の方法および細胞。

１２、　前記遺伝子はα−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン１．２，３゜４または５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ− Ｃ３Ｆ、ＴＰＡ、ヒトインシュリン、ＥＰＯｌＨＧＨおよびＳＯＤをコードする遺伝子の中から選ばれる、請求項５記載の方法および細胞。

明　　　　細　　　　書遺伝子発現の刺激方法見肚へ１１本発明は、種々の高等生物の細胞中の遺伝子工学的に操作された遺伝子の発現を刺激する方法に関する０本発明はそれ故に、発現されるべき異種タンパク質の供給源に顕似した細胞によるタンパク質の誘導および制御可能な生産と可能にする。その結果として、生理学的により活性なタンパク質が製薬目的に足る量で生産される。従って、細菌、酵母および哺乳動物細胞のような通常の発現系での異種遺伝子（特に哺乳動物の遺伝子）の発現に伴う多くの問題を軽減することができる。これらの問題には細菌および酵母による不活性な（例えば、不適切にグリコジル化された、あるいは不適切に転写後修飾された）タンパク質の生産、並びに哺乳動物細胞による不十分な量の遺伝子発現が含まれる。

例えば、細菌細胞による真核生物タンパク質の発現はいろいろな目的遺伝子に対して行われている［Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、７７．３９８８（１９８０）コ、最も単純な場合では、対象の遺伝子が細菌のプラスミドベクター（これはひとたび細菌細胞に導入されると、染色体外エビソーム状態で保持される）にクローニングされる。真核生物の遺伝子が発現されるためには、それはそのコード領域中に正しく位置づけられた細菌の調節シグナルを含まなければならない。真核生物遺伝子を保有する岨換え体プラスミドベクターを構築することは複雑で面倒な作業であり、しかも細菌細胞による遺伝子の好結果の発現を保証しない、：ｔＢ菌中に存在しない酵素プロセスを必要とする遺伝子発現の場合（例えば、発現のために転写後ＲＮＡプロセッシングを必要とするウサギβ−グロビン遺伝子）、これらのコントロールに必要な酵素の微妙な相互作用に関する現在の知識は不十分であって、細菌発現系の実施を難しくしている。これらの理由のために、真核細胞発現系が差し当たり必要とされる。

増殖の容易性および異種ＤＮＡ配列による形質転換可能性ゆえに、酵母サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ核細胞系であり、それは細菌細胞系に比べていくつかの利点を有している。哺乳動物細胞中に存在する多数のｍＲＮＡおよびタンパク質プロセッシング系は酵母細胞中にも存在するが、酵素反応の特異性は異なるシグナルによって決定される［Ｎａｔｕｒｅ、２８３，８３５（１９８０）　、Ｇｅｎｅ、３３，２１５（１９８５）コ。より根本的には、酵母細胞は哺乳動物細胞と異なるコドン法則を利用することが知られており、この事実は異種ＤＮＡ鋳型からの生物学的に活性なタンパク質の正確な発現をさらに複雑なものにしている［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、２５ヱ、３０２６（１９８２）］、酵母細胞内で構造的に正しい哺乳動物タンパク質産物を発現できるならば、このタンパク質は存在する無数の細胞タンパク質からの精製を容易にするために、細胞から分泌されるのが往々にして好適である。

酵母細胞からのペプチドの分泌は、タンパク質の大きさ、グリコジル化、コンホメーションおよび溶解性に依存し、さらにこれらの細胞からの異種タンパク質の満足のゆく分泌を達成する際にこれらの要素の予め定められた制御登−緒になって混乱させる若干の未確認因子に左右される［Ｍａｃｋａｙ、“産業酵母に関する生物学的研究（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ｏｎ　　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＹｅａｓｔ）、Ｖｏ１．１：　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ａｓｐｅｃｔｓ、ＵｎｉｓｃｉｅｎｃｅＳｅｒｉｅｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ（１９８７）］、従って、酵母は細菌よりも哺乳動物タンパク質のより良い発現系を提供するが、治療上有効な哺乳動物タンパク質の発現にとって最適な系は哺乳動物細胞であると思われる。

発現系として哺乳動物細胞を使用する際に克服すべき主な障害は、薬理学的開発に必要とされる高レベルで異種遺伝子をこれらの細胞が発現し得ないことである。ＳＶ４０複製起点−エンハンサ−配列を特定遺伝子の上流に融合させ、続いてＣｏ５７Ｍ１胞内で発現させることにより、若干の成功を収めたが、ＣＯ３−７細胞による発現は異種ＲＮＡ分子の異常転写をもたらすことがある［Ｅｕｃａｒｏｔｉｃ　　Ｖｉｒａｌ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｅｄ、　Ｙ。

Ｇｌｕｚｍａｎ）ｐｐ、　　６１−６６、Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　Ｈａｒｂｏｒ　　　Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２）コ、ＨｅＬａ細胞のような他の細胞株への５Ｖ４０−エンハンサ−含有構築物の導入は、異種遺伝子の正しい転写およびプロセッシングをもたらすが、これらの構築物のＤＮＡは複製起点を欠いており、エビソームとして安定した状態で細胞株内に保持されない、これらの技術的問題の幾分かはＳＶ４０の限られた宿主域が原因している。より広い宿主域を示すウィルスからの遺伝子発現系の使用は確かにより望ましいであろう、単純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）は広範囲の細胞型内で複製し、その複製サイクルのいろいろな時期に遺伝子発現の明確に定められた制御を示すし旦至りセ徂と旦ｔｓ−ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｖｉｒｏｌｏ　　Ｖｏｌ、　Ｖ■　　　イルスｍＲＮＡ：ロセ・・シン　スプー　シ・ン　お　　　　　告（ｅｄ、Ｙ。

ＢｅＣｋｅｒ）、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　　Ｎ１ｊｈｏｆｆ：　　Ｔｈｅ　　Ｈａｇｕｅ、ｐｐ７９−９９（１９８５）］、ヘルペスウィルス遺伝子の転写発現は３つの時期：すなわち前初期（ｉ＠ｍｅｄｉａｔｅ　　ｅａｒｌｙ　　；　ａ　）、後初期（ｄｅｌａｙｅｄｅａｒｌｙ；　　β）および後期（ｌａｔｅ；γ）に起こる。主な発現制御は転写レベルで行われると考えられ、ごくわずかな調節が転写後プロセスによってもたらされる。

ＨＳＶ−１α期遺伝子転写の選択的開始に影響を及ぼす因子の１つは、転写活性化ピリオン成分（ｔｒａｎｓａｅｔｉｖａｔｉｎｇｖｉｒｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）のＶｍｗ６５タンパク質である［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　。

１８０、　：１−１９（１９８４）コ、Ｖｍｗ６５を含めた転写活性化ピリオン成分はウィルスの遺伝物質から宿主細胞によって生産され、そして新しいウィルス粒子に貯えられる。これらの新しいウィルス粒子が新しい宿主細胞に侵入し、ウィルス核酸配列が宿主ゲノムに組み込まれた後、転写活性化成分はウィルス配列のある領域と相互作用する。この相互作用は隣接する下流遺伝子（通常その複製サイクルの初期（α）にウィルスが必要とするタンパク質をコードする）の転写を刺激する。ＶＭＩ６５による最適活性化には特定のＤＮＡ構造要素（Ｖｍｗ６５タンパク質に対応し且つこのタンパク質によって認識される活性化応答ＤＮＡ配列を含む）が必要である。この活性化応答ＤＮＡは通常０期プロモーター上またはその近傍に位置づけられ、これにより転写活性化Ｖｍｗ６５タンパク質による活性化応答ＤＮＡ配列の認識は６期プロモーターから下流にある異種遺伝子の転写を刺激する。単純ヘルペスウィルスの数多くのタンパク質は、それらの対応する活性化応答ＤＮＡ配列が６期プロモーターより上流に位置する場合、同様の転写活性化能力を有する。これらのタンパク質には細胞内タンパク質ＩＣＰ４．ＩＣＰＯおよびＩＣＰ２７が含まれる。類似の転写活性化機構は、例えば仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ−ＩＥ遺伝子産物）、アデノウィルス（Ａｄ−ＥＩＡ）およびヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ−ＭＩＥタンパク質）にも存在する。

従って、我々は、ウィルス転写活性化タンパク質とこれらのタンパク質に対応し且つ影響される活性化応答ＤＮＡ配列との相互作用を利用するタンパク質発現系を提案する。この系は１）転写活性化タンパク質のレベルを研究者が操作可能である；２）＊１ｉｌ−写活性化に必要ないくつかの特定ＤＮＡ調節配列が同定され、これは他の系で用いられる転写活性化の一般的結果に左右されずに２特定遺伝子の活性化を制御するために使用できる；および３）この系は広範囲の組織培養細胞型に適用可能である；という点で他の哺乳動物発現系と異なっている。

見脈＠乱ｉ本発明は、ウィルス転写活性化タンパク質の遺伝子配列を含む組換えＤ　Ｎ　、４分子により安定した状態で形質転換され、これにより該ウィルス転写活性化因子を発現しうる安定した細胞株を提供する。

本発明はまた、細胞内にウィルス転写活性化タンパク質を供給することから成る遺伝子発現の刺激方法を提供し、前記細胞は組換えＤＮＡ分子を含み且つ安定した複製能力を有し、前記ＤＮＡ分子はａ）発現されるべき非ウィルス遺伝子；ｂ）　該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；およびＣ）　該遺伝子の上流にある対応する活性化応答ＤＮＡ配列を含んでいる。

遺伝子発現を刺激する好適な方法は、ＤＮＡ配列に単純ヘルペスウィルスＩ（ＨＳＶ−１）刺激因子Ｖ＋ｅｗ６５を供給することから成り、前記ＤＮＡ配列はａ）発現されるべき非ウィルス遺伝子；ｂ）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；Ｃ）該プロモーター領域の上流にあるヌクレオチド配列ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（ここでＲはＧまたはＡである）を含んでいる。

ＨＳＶ−１刺激因子Ｖｗ＋ｗ６５の存在は当分野で知られている［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、１３．１８７６（１９８５）コが、特定した細胞株に関連して記述されたことはない、従来技術において、それは一時的な細胞株に関連して利用されていたにすぎない。

ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ活性化応答ＤＮＡ配列（ＶＩＩ１１１６５に応答する）はＮｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｃｌｓ　　Ｒｅｓ、　、１４，９２９（１９８６）に記載されている。他のウィルス刺激因子も存在することが知られており、例えばＡｄ−Ｅ　ＩＡ　　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２，３８１（１９８５）コ、Ｐ　ＲＶ　−Ｉ　　Ｅ　［Ｃｅｌ　Ｉ　、３５，１３７（１９８３）コ、ＩＣＰＯ［Ｊ。

Ｖ　１ｒｏｌ　、　　、４９，１９０（１９８４）コ、Ｉ　　ＣＰ　４　［Ｎａｔｕｒｅ、ζ１１１５，３２９（１９８０）］およびＩ　ＣＰ　２７　［Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏ１．．５５，７９６＜１９８５）コなどがある。これらの刺激因子の活性化認識部位の構造、配列または正確な作用機構は十分に解明されていない。

本発明にとって好適なプロモーター領域はＨＳＶ−１のαプロモーターである。

これらのプロモーターはＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　５０゜７０８（１９８４）に記載されている。ＨｓＶ−２（７）α７Ｄモーターも有用である。

本発明の実施によって、活性化応答ＤＮＡ配列および対応する転写活性化刺激因子の不在下で通常得られるものよりも、増強された遺伝子発現が得られる０本発明の実施によって発現が刺激される代表的遺伝子はヒトタンパク質をコードし、例えばインターフェロン（α、βおよびγ）、インターロイキン（１，２゜３．４および５）、インシュリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー形成刺激因子、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、超過酸化物不均化酵素（ＳＯＤ）などをコードする。修飾されたヒト遺伝子および非ヒト遺伝子も本発明の実施において利用しうるが、いずれの場合にも、発現が刺激される遺伝子は常に非ウィルス遺伝子である。

本発明はまた、配列中に活性化応答ＤＮＡ配列、その下流にプロモーター配列、その下流に発現されるべき遺伝子を含む特異な組換えＤＮＡ１築物を包含する。

本発明はさらに、その好適な実施態様において、配列中にＴＡＡＴＧＡＲＡＴ配列、その下流にプロモーター配列、その下流に発現されるべき遺伝子を含む特異な組換えＤＮＡ構築物を包含する。

本発明は前記の組換えＤＮＡ構築物を含む安定した細胞株をも提供する。安定した細胞株はこの細胞株と共に複製しうるベクターを有している。こうして、我々は導入されたＤＮＡによってコードされるタンパク質を際限なく発現できる、永久的に形質ｌ！ｉｌ−換されたｍＢＦ１株を提供する０本発明はこのような安定した形質転換細胞株をつくることを包含する。

前記の組換えＤＮＡＩ築物を作製するために、そしてこの種の構築物を挿入すべく細胞を形質転換するために、標準方法が用いられる０例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ（１９８２）を参照されたい。

次の実施例は本発明を例示するためのものであって、制限するものではない。

Ｋ巨匠ＬプラスミドクローンＰ　Ｍ　Ｇ　Ｈ［Ｎ　ａｔｕｒｅ、３００，６１１　（１９８２）コは、確立された方法に従って、ＢｉｎｄｌＪおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、切り出したラット成長ホルモン遺伝子の断片を１％アガロースマトリックスでのゲル電気泳動によりプラスミドの残部から分離した。

ＰＭＧＨのベクタ一部分をアガロースから溶出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（Ｉａｃ　　Ｚ）遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル登含むプラスミドｐｏ　Ｎ　１　［Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏｌ　、　、５６，１３５（１９８５）］のＨ１ｎｄＩ［［−ＢＳＬＩＩＨＩ部分に連結させた。大腸菌ＨＢ１０１細胞にトランスフェクションし、アンピシリンで選別した後、プラスミドベクターＭＴＲＧＨβｇａｌを回収した。

ＭＴＲＧＨβｇｍｌベクターはＸｈｏＩおよびＨｉｎｄｌｌで消化して、残りのラットＤＮＡ配列を除いた。この切除領域は）（ＳＶ−１ピリオン刺激タンパク質（Ｖ論ｗ６５）のコード配列を含むプラスミドＨ１ｎｄＩ［Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｄ　Ｇ［Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏｌ　、　、４３，５９４＜１９８２）］由来の６．１キロ塩基のＸｈｏ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌ断片と置き換えた。トランスフェクションおよび選別後に、得られたプラスミドＭＴＸＨＡＤβｇａｌはマウスメタロチオネイン遺伝子の転写エンハンサ−／プロモーター領域の下流に配置されたＶｍｗ６５コード領域を含んでいた。

マウスＬ−Ｍ（ＴＫ−＞（ＡＴＣＣＣＣＬ　　１．３＞細胞は、リン酸カルシウム共沈法［ＶｉｒｏｌｏｇＦ、鼠、４５６（１９７３）］を用いて、それぞれ１ μｓずつのプラスミドＭ　Ｔ　Ｘ　ＨＡ　ＤβｇａｌおよびプラスミドｐＤＧ　５０４［Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、　、４６．１０４５（１９８３）ＩＤＮＡ、並びに１８μｓの剪断ウシ胸腺ＤＮＡで同時形質転換した。ＴＫ十細胞を選別し、増殖し、その後１０％ウシ胎児血清および１×ヒボキサンチン／アミノプテリン、／チミジン（ＨＡＴ）選択薬剤を含むイーグルの最少必須培地中に維持した［Ｃｅ１ｌ、旦、７２５（１９７９）ＩＪグＴＸＨＡＤβＨａｌＤＮＡを含むチミジンキナーゼ陽性細胞は、全細胞ＤＮＡのＤＮＡドツトプロット［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７．５２０１（１９８０）コおよびニックトランスレーションにより３２ｐで標識したＸＨＡＤ断片ＤＮＡへノハイフ！Ｊ　タイセージＢ　ン［Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　、０３，２３７＜１９７７）コにより検定した。Ｘ　ＨＡ　Ｄへのハイブリダイゼーションを示した細胞はすべてＸＨＡＤ＋であり、一方ＸＨＡＤ／＼のハイブリダイゼーションを示すのに失敗したものはＸＨＡＤ−の名称を与える。ＸＨＡＤ　　ＤＮＡを保有するＴＫ＋細胞（ＴＫ＋ＸＨＡＤ十細胞と呼ばれる）を増殖させ、そしてＶｍｗ６５タンパク質の生産は適当なりＮＡ調節配列からの遺伝子発現を活性化させるこれらの細胞の能力により検定した。

火見」」− 機能性Ｖ＋＋＋ｗ６５タンパク質を発現して異種遺伝子の転写を活性化させるＴＫ＋ＸＨＡＤ十細胞の能力は、Ｇｅｂａｌｌｅら［Ｃｅ１１．但、８６５　（１９８６）］によって開発された一時的遺伝子発現検定を用いて試験した。ＸＨＡＤ　　ＤＮＡプロセ・ツシング細胞クローンは９６ウエルマイクロタイタープレートにまき、培地全面（約３５００００個の細ｌａ＞に増殖させた。各ウェルはＤＥＡＥデキストラン法［Ｊ、　Ｍｏｂ　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　、２，１０１（１９８３）］により０．５μ２のｐＯＮ１０５　　ＤＮＡ（スタンフォード大学のＥ。

Ｍｏｃａｒｓｋｉより入手）でトランスフェクションした。ｐＯＮ１０５は機能性Ｖ＋＊ｗ６５により転写活性化されるＨＳＶ−ＩＩＣＰ４プロモーター配列の転写制御下にある細胞のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ　　Ｚ）遺伝子を含む、トランスフェクションの４８時間後、蛍光検定によりβ−ガラクトシダーゼ活性を定量化した。ＭＴＸ５と名づけな１つのサブドース（ｓｕｂｄｏｓｅ）におけるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、ｐＯＮ１０５プラスミドによるＴＫ＋ＸＨＡＤ−細胞の対比トランスフェクション、４８時間後の怒染多重度５でのＨＳＶ−２（ＭＳ株）重怒染、およびトランスフェクションの７２時間後の検定を用いて得られたレベルに近似していた。Ｖｓｗ６５　　ＩＣＰ４アクチベーター −プロモーター相互作用の特異性は、プラスミドｐＯＮ２４５　　ＤＮＡ（スタンフォード大学のＥ、　Ｍｏｃａｒｓｋｉより入手）でＸＨＡＤ＋ｌＢ胞をトランスフェクションすることにより確かめた。ｐＯＮ２４５はＨＳＶ−２チミジンキナーゼプロモーターの転写制御下にある１ａｃＺ遺伝子を含み、Ｖｍｗ６５反応性要素を含まない。ｐＯＮ２４５プラスミドな用いた検定はＶｍｗ６５による β−ガラクトシダーゼ活性の誘導を示さなかった。

重怒染ウィルスの存在下（表１中の＋Ｈ５Ｖ）でのｐＯＮ２４５における転写活性の誘導は、このプラスミドが完全（ｉｎｔａｃｔ）であって、転写能力をもつことを証明した。

火旌匠ＩＩＣＰ４以外の転写活性化ウィルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列から転写活性を誘導するＴＫ＋ＸＨＡＤ十細胞の能力は、同様の一時的発現系により試験した。７１１１ｗ６５タンパク質を発現する細胞は９６ウエルマイクロタイタープレートにまき、培地全面に増殖させた。各ウェルは０．５μ２のｐＯＮ２４９ＤＮＡ［Ｃｅ１１　４６，８６５．（１９８６）］で、Ｏ−５μ９のｐＯＮ２４９ＤＮＡと０．５μ、のＰＲＳ　Ｉ　　ＤＮＡ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　。

垣、９０５（１９８７）　］で、または０．５μｓのｐＯＮ２４９　ＤＮＡと０．５μｇのＰＥ５１２　ＤＮＡ（西バージニア大学のＲ、Ｓ　ｔｅｎｂｅｒｇより入手）でＤＥＡＥデキストラン法によりトランスフェクションした。ｐＯＮ２４９はヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）の主要前初期（ｍａｊｏｒ　　ｉｍ輸ｅｄｉａｔｅ　　ｅａｒｌｙ：Ｍ　Ｉ　Ｅ）プロモーター調節領域の転写制御下にある大腸菌のｌａｃ　　Ｚ遺伝子を含む。

ＰＨ１１はＨＳＶ　　Ｉ　　Ｖｍｗ６５転写活性化に応答することが知られている転写調節領域と共にＨＳＶ−Ｉ　　ＩＣＰＯ遺伝子を含む［Ｎｕｃｌｅｉｅ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　、１４，９２９（１９８６）コ、ＰＥ５１２はＨＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子およびＴＡＡＴＧＡＲＡＴ相同体を示さない対応プロモーター領域を含む［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

５ｅｉ−Ｕ　Ｓ　Ａ　、８１，６５９（１９８４）］、　Ｉ　ＣＰ　ＯおよびＨＣＭＶＭＩＥタンパク質は両方とも異種ウィルスプロモーター領域の転写活性な刺激することが知られている［、Ｌ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　。

６７．２５０７（１９８６）；　　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　　、４９，１９０＜１９８４ン］、ＨＣＭＶＭＩＥプロモーター中にＴＡＡＴＧＡＲＡＴ相同体が存在しないにもかかわらず、ｐＯＮ２４９　ＤＮＡでトランスフェクションした細胞にはβ−ガラクトシダーゼ活性の増加が観察された。

ｐＯＮ２４９とＰＲＳＬ　　ＤＮＡ、または９ＯＮ２４９とＰＥ５１２　　ＤＮＡで同時トランスフェクションした細胞では、β−ガラクトシダーゼのレベルがｐＯＮ２４９　ＤＮＡのみでトランスフェクションした細胞において観察されたレベルよりも一層増加した。

実施例ｍの結果は、１）非ＨＳＶプロモーター領域中に存在する配列および／またはＤＮＡＩ造がＶｓｗ６５転写活性化に応答しうる：　２）Ｖｍｗ６５転写活性化が見かけのＴＡＡＴＧＡＲＡＴ相同体を含まないＤＮＡ配列により媒介され得る；および３）Ｖ＋５ｗ６５転写活性化は、他の転写活性化遺伝子産物（異種プロモーター領域に対するＶｍｗ６５タンパク質の作用を増大させるか、または同一細胞内に存在する異種遺伝子の転写を活性化するために独立して作用する）の合成を誘導するために使用できる；ことを証明している。

実施例■および■の結果を表１に要約する。

退」− 一ンスフェ　ジョン　ｔ″１　にお４−”−）シ　−ゼ汚１ −−　トシ　−ゼレベルトランスフェクションされたプラスミドＤＮＡＬ　ＴＫ−ＭＴＸ５　　　ＭＴＸ５ −）ＩＳＶ　　　−ＨＳＶ　　　＋ＨｓＶｐＯＮ１０５　　　　　　　　　　　１　　　　６０　　　６０ｐＯＮ　２４５　　　　　　　　　　　１　　　　２　　　９０ｐＯＮ２４９　　　　　　　　　　　１　　　５．６　　　８０ｐＯＮ　　２４９．ＰＲＳＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　１６　　　　　　　　Ｎ丁ｐＯＮ　２４９．ＰＥ５１２　　　　　　　　１　　　２０　　　　ＮＴｘｒ＝＝せ上記検定は、１）　　ＨＳＶ−Ｉ　　Ｖｍｗ６５遺伝子が哺乳動物の組織培養物中に安定した状形で導入され得る；２）　組織培養により生産されるタンパク質は、他のＨＳＶプロモーターを転写活性化させるその能力において、生物学的に活性なＶＩ＊１１６５に似ている：３）　異種（非ウィルス）タンパク質の生産は、異種遺伝子のプロモーター配列がＨＳＶ１３ｆｉ伝子の自然発現の際に機能することが知られているＶ＋５ｗ６５応答性要素を含む場合、またはそれを含む場合だけ、これらの形質転換細胞において＊ａされ得る：および４）　転写活性の誘導レベルは天然ウィルス複製サイクルにおいて見られるものにほぼ等しい；ことを立証している。

ＨＳＶ　　ＩＣＰ４遺伝子発現の際に観察された高レベルの転写活性を考慮すると、薬理学的に重要なタンパク質の生産へのこの応用は、細胞培養系で異種タンパク質を生産する現在の方法に取って代わるべき重要な手段となるであろう。

転写活性化ウィルスタンパク質のクローン化遺伝子またはその遺伝子の生物学的に活性な部分は、もしも　１）　活性化応答ＤＮＡ配列が同定され、且つ２）　もとのリーディングフレームを異種タンパク質のコード配列と置き換える場合、応答遺伝子のプロモーター要素に対するこれらの配列の相対的方向が維持されるならば、この系において利用可能である。

転写活性化タンパク質に応答するＤＮＡ配列は、天然であろうと合成であろうと、クローン化ＤＮＡからの異種ポリペプチドの発現を活性化させるために使用できる。

リン酸カルシウム法またはウィルスベクターを用いて形質転換され得るａ胞はｉｎ　　ｖｉｔｒｏで培養し得るものであり、例えばヒト包皮ｉｌ維芽細胞、ヒトＨｅＬａ［胞、マウスＬＨ胞、ヒトＫＢ細胞、ＣＯ３−７細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、酵母細胞などでありうる。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　元年　９月７３日り隘１特許庁長官　　吉　１）文毅　殿１、特許８願の表示ＰＣＴ／ＵＳ８８１００６８０２、発明の名称遺伝子発現の刺激方法３、特許出願人住　所　　アメリカ合衆国ニューシャーシー州０７０３３．ケニルヮース。

ギヤロッピング・ヒル・ロード　２０００名　称　　シエリング・コーポレーション４、代理人住所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区電話（２７０）　６６４１〜６６４６氏名（２７７０）弁理士湯浅恭三 −・の１．　ヘルペスウィルスの転写活性化タンパク質の遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子により安定した状態で形質転換され、それにより前記転写活性化因子を発現しうる安定細胞株。

２、　細胞内にヘルペスウィルスの転写活性化タンパク質を供給することから成る遺伝子発現の刺激方法であって、前記、ＩＢ胞は組換えＤＮＡ分子を含み且つ安定した複製能力を有し、前記組換えＤＮＡ分子は、ａ）　発現を希望する遺伝子；ｂ）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；Ｃ）該遺伝子の上流にある対応する活性化応答ＤＮＡ配列を含む、上記方法。

３、　ヘルペスウィルスの転写活性化タンパク質の存在下で、組換えＤＮＡ分子により形質転換された細胞を培養することから成るポリペプチドの生産方法であって、前記ＤＮＡ分子は、ａ）前記ポリペプチドをコードする非ウィルス遺伝子：ｂ）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；およびＣ）該遺伝子の上流にある活性化応答ＤＮＡ配列を含む、上記方法。

４、ａ）ヘルペスウィルスの転写活性化タンパク質の遺伝子配列を含む第一の組換えＤＮＡ分子（これにより下記細胞は該ウィルス転写活性化タンパク質を発現しうる）；およびｂ）１〉　　目的タンパク質をコードする非ウィルス遺伝子；２）　該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；および３）゛該遺伝子の上流にある対応する活性化応答ＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ分子。

により安定した状態で形質転換された安定細胞株。

５、　対応する活性化応答ＤＮＡ配列は前記プロモーター領域の上流にある、請求項２または３記載の方法。

６、　（削除）７、　ウィルスの転写活性化タンパク質はＶ＋＊ｗ６５である、請求項６記載の方法。

８、　活性化応答ＤＮＡ配列はＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（ここでＲはＧまたはＡである）である、請求項７記載の方法。

９、　前記遺伝子は異種非ウィルス遺伝子である、請求項８記載の方法。

１０、　　前記細胞はまたＶｍｗ６５をコードする遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子により形質転換されており、それにより前記細胞はＶｍｗ６５を発現しうる、請求項９記載の方法。

１１、　前記フロモーター領域はαＨｓＶ−１およびＨＳＶ−２プロモーター領域から選ばれる、請求項１０記載の方法。

１２、　　前記遺伝子はα−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン１，２，３．４または５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ −ＣＳＦ、ＴＰＡ、ヒトインシュリン、ＥＰＯ，ＨＧＨおよびＳＯＤをコードする遺伝子の中から選ばれる、請求項５記載の細胞。

１３、（追加）　対応する活性化応答ＤＮＡ配列は前記プロモーター領域の上流にある、請求項１または４記載の細胞。

１４、（追加）　ウィルス転写活性化タンパク質はＶｍｗ６５である、請求項６記載の細胞。

１５、（追加）　活性化応答ＤＮＡ配列はＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（ここでＲはＧまたはＡである）である、請求項７記載の細胞。

１６、（追加）　前記遺伝子は異種非ウィルス遺伝子である、請求項８記載の細胞。

１７、（追加）　前記細胞はまたＶｍｗ６５をコードする遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子により形質転換されており、それにより前記細胞はＶ＋ｍｗ６５を発現しうる、請求項９記載の細胞。

１８、（追加）前記プロモーター領域はαＨ３Ｖ−１およびＨＳＶ−２プロモーター領域から選ばれる、請求項１０記載の細胞。

１９、（追加）　前記遺伝子はα−インターフェロン、β−インターフェロン、 γ−インターフェロン、インターロイキン１゜２．３．４または５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＡ、ヒトインシュリン、ＥＰＯｌＨＧＨおよびＳＯＤをコードする遺伝子の中から選ばれる。請求項５記載の細胞。

国際調査報告１＊＋ｙ＋−崗−＾−””””　？Ｃ：／”ＪＳ　ａＢ１００６２０国際調査報告ＵＳ　８８００６８０

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウィルスの転写活性化タンパク質の遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子により安定した状態で形質転換され、それにより前記のウィルス転写活性化因子を発現しうる安定した細胞株。
２．細胞内にウィルス転写活性化タンパク質を供給することから成る遺伝子発現を刺激する方法であって、前記細胞は組換えＤＮＡ分子を含み且つ安定した複製能力を有し、前記組換えＤＮＡ分子は、ａ）発現を希望する遺伝子；ｂ）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；ｃ）該遺伝子の上流にある対応する活性化応答ＤＮＡ配列を含む、上記方法。
３．転写活性化タンパク質の存在下に、組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養することから成るポリペプチドの生産方法であって、前記ＤＮＡ分子は、ａ）前記ポリペプチドをコードする非ウィルス遺伝子；ｂ）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；およびｃ）該遺伝子の上流にある活性化応答ＤＮＡ配列を含む、上記方法。
４．ａ）ウィルスの転写活性化タンパク質の遺伝子配列を含む第一の組換えＤＮＡ分子（これにより下記細胞は該ウィルス転写活性化タンパク質を発現しうる）；およびｂ）１）目的タンパク質をコードする非ウィルス遺伝子；２）該遺伝子の上流にあるプロモーター領域；および３）該遺伝子の上流にある対応する活性化応答ＤＮＡ配列を含む第二の組換えＤＮＡ分子。により安定した状態で形質転換された安定細胞様。
５．対応する活性化応答ＤＮＡ配列は前記プロモーター領域の上流にある、請求の範囲１，２，３および４記載の方法および細胞。
６．ウィルスの転写活性化タンパク質はＶｍｗ６５，ＩＣＰ４，ＩＣＰＯまたはＩＣＰ２７である、請求項５記載の方法および細胞。
７．ウィルスの転写活性化タンパク質はＶｍｗ６５である、請求項６記載の方法および細胞。
８．活性化応答ＤＮＡ配列はＴＡＡＴＧＡＲＡＴ（ここでＲはＧまたはＡである）である、請求項７記載の方法および細胞。
９．前記遺伝子は異種非ウィルス遺伝子である、請求項８記載の方法および細胞。
１０．前記細胞はまたＶｍｗ６５をコードする遺伝子配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換されており、それによりＶｍｗ６５を発現しうる、請求項９記載の方法および細胞。
１１．前記プロモーター領域はαＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２プロモーター領域から選ばれる、請求項１０記載の方法および細胞。
１２．前記遺伝子はα−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン１，２，３，４または５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＡ、ヒトインシュリン、ＥＰＯ、ＨＧＨおよびＳＯＤをコードする遺伝子の中から選ばれる、請求項５記載の方法および細胞。