JPS6344898A - ヒトアンチトロンビン３（ａｔ３）の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 公開番号節０．０９０，５０．５号の欧州特許出願は、
ＡＴＩＩＩをコードするｃＤＮＡの製造及び特徴並、び
に大腸菌中でのヒトＡＴＩＩＩの製造に関して開示する
。この出願は、どのようにしてＡＴＩＩＩが哺乳動物細
胞培養物中で産生され得るかについても詳細に述べてい
る。適当なベクターは、大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｌ）の複製源と一緒に大腸菌における選択マ
ーカーを有するｐＢＲ３２２誘導体である、と述べられ
ている。ベクターは、（３４２ｂｐ　　ＰｖｕＩＩ−Ｈ
１ｎｄｍ断片から誘導される）ＳＶ４０複製源を有して
いるとも述べられている。

これとは異なり、本発明は、特に有利な方法、すなわち
使用される宿主細胞が全く又は不十分にしかジヒドロ葉
酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を産生じ得ない哺乳動物細
胞であって、かつこの宿主細胞が一方がＡＴＩＩＩＩ遺
伝子を有し他方がジヒドロ葉酸レダクターゼ産生を生じ
る２種の発現ベクターで共形質感染（ｃｏｔｒａｎｓｆ
ｅｅｔ）される、という方法、に関する。

このように、本発期はＡＴｎ［ｃＤＮＡを有する発現ベ
ク多−を用いた哺乳動物細胞培養物中におけるＡＴＩＩ
Ｉ［の製造方法に関するものであるが、この方法は上記
ベクターのみならずＤＨＦＲ遺伝子を有する別のベクタ
ーによっても共形質感染されるｄｈｆｒ−細胞を哺乳動
物細胞として使用することを特徴とするものである。本
発明の他の側面及びその好ましい態様は、以下で詳細に
説明されておりかつ特許請求の範囲において規定されて
いる。

本発明の共形質感染糸は２種の発現ベクターを使用する
ものであって、第一のベクターは例えばｐＢＲ３２２の
ようにいかなる望ましいベクターで゛あってもよく、こ
のベクターにおいてＡＴｎＩ遺伝子は自体公知の方法で
真核細胞中で活性なプロモーターの制御下に存在下し、
一方ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするとともに遺
伝子を増幅させることができる第二のベクターにおいて
は、ＤＨＦＲ遺伝子の発現はｐＢＲ３２２ｏ　ｒ　ｉ領
域のＤＮＡ配列によって制御されている。

ＡＴＩＩＩＩ遺伝子を有する第一ベクターのみならず、
ＤＨＦＲ遺伝子を有する第二ベクターも、ｐＢＲ３２２
誘導体を構成しているならば、好都合である。このタイ
プのベクターは、それらが大腸菌中において増幅され得
ると同時に、真核細胞中において“シャトルベクター”
として使用され得るという利点を有する。選択マーカー
としてｐＢＲ３２２Ｅｃ、ｏＲＩ　−Ｐｖｕｎ断片に含
まれるアンピシリン耐性遺伝を用いることは有利である
。勿論、自体公知の方法によって、別の又は追加のマー
カーを組込みかつ不必要な領域を修正又は切除すること
も可能である。

更に好ましい態様のベクターは、構造遺伝子の下流に位
置するｐＵＣ１２　ＳＴＯＰ由来翻訳停止配列ｆエム・
ブレーカ−及びイー・アマン、アプライド・マイクロバ
イオロジカル・バイオテクノロジー、第２３巻、第２９
４−２９６頁、１９８６年（Ｍ、　Ｂｒｏｅｋｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｅ、　Ａｍａｎｎ、　ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
　２３（１９８６）　２９４−２９６）］を有する。三
つのすべての読取り枠における翻訳停止コードンはこの
ＤＮＡ部分上に位置しており、自らの翻訳停止コードン
を有さない修正遺伝子の発現が可能となる。

全く又は不十分な程度でしかジヒドロ葉酸レダクターゼ
を産生じ得ない哺乳動物細胞 （ｄｈｆｒ−）及びこの欠陥を補い得る適当なベクター
は一般的に公知である〔エルンストーエル・ウィンナツ
カ−「遺伝子及びクローン、遺伝子操作概論Ｊ、ＶＣＨ
フエルラークスゲゼルシャフト・ワインハイム、１９８
４年、第２６７．２６８．２８２．２８９頁（Ｅｒｎｓ
ｔ−Ｌ、　Ｗｉ、ｎｎａｃｋｅｒ。

Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｒｏｎｅ、　ｅｉｎｅ　Ｅｉｎｆ
ｕｅｈｒｕｎｇ　ｉｎ　ｄｉｅ　Ｇｅｎ−ｔｅｅｈｎｏ
ｌｏｇｉｅ、　ＶＣＨＶｅｒｌａｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈ
ａｆｔ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ。

１９８４、　ｐａｇｅｓ　２８７／２６８．２８２．２
８９））　、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性が
欠乏したＣＨＯ細胞変異株の単離法に関しては、ジー・
ウルラウプ及びエル・ニー−チエ−シン、プロシーデイ
ングズ・オブψナショナル争アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ　ＵＳＡ、第７７巻、１９８０年、第４２１６
−４２２０頁（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、　Ａ
、Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７７（１９８０）　
４２１Ｂ−４２２０１に記載されている。

ｄｈｆｒ−型細胞系はこの方法によって得られる。

同様に、再現可能な方法で他の哺乳動物細胞系を製造す
ることもできる。変異株は三成分栄養要求株であって、
増殖のためにグリシン、ヒポキサンチン等のプリン系ヌ
クレオチド及びチミジンを必要とする。

ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を動物細胞中に挿入し
得るベクターは、例えばエフ・ジーら、ネーチャー、第
２９４巻、１９８１年、第２８８頁（Ｆ、　Ｌｅｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４　（１９８１）　
２８８）に記載されている。そのためには、マウスジヒ
ドロ葉酸レダクターゼをコードするｃＤＮＡの使用が必
要とされる〔ニー・シー・ワイ・チャン（Ａ、　Ｃ，Ｙ
、　Ｃｈａｎｇ）ら、ネーチャー、第２７５巻、１９７
８年、第６１７−６２４頁〕。同様の方法で、哺乳動物
細胞中で機能するジヒドロ葉酸レダクターゼの他の遺伝
子を用いることができる。

系はＣＨＯｄｈｆｒ−細胞及びマウス ＤＨＦＲ遺伝子であることが好ましい。

好ましいＡＴＩＩＩ用発現ベクターでは、ＳＶ、４’０
複製源ＤＮＡ領域由来の初期プロモーター、即ちヒトメ
タロチ穿ネイン■プロモーター〔エム・カリシ（Ｍ、　
Ｋａｒｉｎ）及びアール・アイΦリチャーズ（Ｒ，１，
Ｒｌｅｈａｒｄｓ）　、ネーチャー、第２９９巻、１９
８２年、第７９７−Ｓｃｉ２頁〕、ＨｃＭＶ〔ヒトサイ
トメガロウィルス、エム・ポジヤードら、セル、第４１
巻、１９８５年、第５２１−５３０頁（Ｍ、　Ｂｏｓｈ
ａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４１　（１９８５
）５２１−５３０））由来率初期（ｉＩＩｌｍｅｄｉａ
ｔｅ　ｅａｒｌｙ　）遺伝子のエンハンサー−プロモー
ター領域又はショウジヨウバエ熱シヨツクタンパク質７
０（ｈｓｐ７０）プロモーター〔ホルムグレン（Ｈｏｌ
ｍｇｒｅｎ）ら、セル、第１８巻、１９７９年、第１３
５９−１３７０頁〕を利用する。ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼの発現は、例えばＭＭＴＶ−ＬＴＲ［マウス乳がん
ウィルス−ＬＴＲ配列（ｌｏｎｇ　ｔｅｒＩＩｌｉｎａ
ｌｒｅｐｅａｔ）　、エフ・ジー（Ｐ、　Ｌｅｅ）ら、
同上〕のような哺乳動物細胞系において弱い活性を有す
るプロモーターの制御下で生じることができるが、真核
細胞プロモーターのない場合も本発明の一態様をなす。

後者の場合、ＤＨＦＲ遺伝子はｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列
のすぐ上流に位置するが、哺乳動物細胞においてはこの
配列は弱いプロモーターとして明らかに認識されている
〔ケー・デイ−・ランブナ−（Ｋ、　Ｄ、　ｌａｎｇｎ
ｅｒ　）ら、プロシーディングズ中オブ争ナショナルや
アカデミ−争オブ會サイエンシーズ　ＵＳＡ、第８３巻
、１９８６年、第１５９８−１６０２頁〕。

適当な発現系は、米国特許第 ４．３９９．２１６号及び第４，５７６．８２１号、並
びに公開第０．１００．５２１号及び第０．１１７．０
５８〜第０．１１７．０６０号の欧州特許出願の明細書
にも記載されている。

本発明の他の態様では、イントロン又はスプライス部位
を有さないベクターを用いる。このようなベクターが非
常に有効であるというのは驚くべきことである。という
のは、ＲＮＡスプライス部位が欧州特許出願第Ａ２．０
９０，５０５号明細書において細胞培養物中でのＡＴｍ
発現用ベクターには必要であると述べられているがらで
ある。

ジヒドロ葉酸レダクターゼはメソトレキセートで阻害さ
れることが知られている。このため、グリシン、ヒポキ
サンチン及びチミジン非含有培地中で増殖する細胞は、
メソトレキセートでそれらの増殖が阻害されるか又は殺
滅せしめられる。培地中のメソトレキセート濃度及び細
胞密度を変えることにより、メソトレキセート存在下で
増殖する細胞を選択することができる。これらの細胞は
、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅及びそれに関連したＤＨＦＲ酵
素の産生増加に起因して、選択されたメソトレキセート
濃度に対し耐性となる。生存細胞は再度より高いメソト
レキセート濃度に接触せしめられ、しかる後更に多数の
ＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞系に変わる。

遺伝子増幅は、下記の二つの異なる技術にょって行なう
ことができる。

１、　細胞を、これを漸増メソトレキセート濃度に単に
通すことにより増幅させる。その結果、異なる増幅度を
もつ細胞からなる遺伝的異種細胞群となる。

２、　各々のメソトレキセート濃度レベルにおいて遺伝
的均一細胞クローンが単離され、分析されるが、各レベ
ルで最大の発現性をもつ細胞系のみが次のより高いレベ
ルに移し替えられる。

本発明に従い共形質感染された細胞系において、メソト
レキセートによる遺伝子増幅の結果としてＤＨＦＲ遺伝
子が増加したのみならずＡＴＩＩＩ遺伝子も増幅した。

動物細胞を培養増殖させるためには、血清が増殖培地中
に存在することが通常要求される。ＡＴＩＩＩ産生細胞
系は血清含有培地及び無血清培地で交互に培養され得る
ことが見出されたが、その間にＡＴＩＩＩ発現速度の低
下は数回の移し替えに際してもみられなかった。本発明
の方法のこの態様は、価格的に血清を節約できることか
ら有利であるのみならず、最後の産生段階が血清非存在
下で行なわれる場合にはＡＴＩＩＩの回収量を著しく高
めることもできる。

本発明により得られる組換えＡＴｍは十分な生物学的活
性を有する。これは、ヒト血漿がら単離される天然産物
の場合と全く同様に、ヘパリンによって刺激される。し
たがって、天然産物と同様に、薬剤の製造にも適してい
る。

本発明は下記の語例において詳細に説明されている。ベ
クターの構築は第１〜３図で更に説明されているが、一
般に図面はスケール的に正確ではない。特に、小断片及
びポリリンカー配列の表示は原則として“伸長”されて
いる。

餞１ ａ）動物細胞用発現ベクターの構築 プラスミド１）ＳＶ２ｄｈｆｒ　（第１図）（ジーら、
同上）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ
４０初期プロモーターを有する２、６５ｋｂベクタ一断
片を単離した。ｐＵＣ１２　ＳＴＯＰ由来の６７ｂｐ　
　Ｈｉｎｄ■−ＥｃｏＲＩ断片（ブレーカ−及びアマン
、同上）をこの方法で前処理されたベクターに組込み、
プラスミドｐＳＶ２　ＳＴＯＰを得た。翻訳停止コード
ンは、ｐＵＣ１２　ＳＴＯＰ由来６７ｂｐ断片の３種す
べての読取り枠に存在している。ｐＳＶ２ＳＴＯＰをＳ
ａｃ　Ｉで直鎖化し、得られる３′突出端をＤＮＡポリ
メラーゼＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を利用
して切除した。次いでＥｃｏＲＩ切断を行なった。初期
転写用のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するｐＢ
Ｂ３（第１ａ図）〔ビー・ブーラショら、ＥＭＢＯジャ
ーナル、第１巻、１９８２年、第８９５−９００頁（Ｂ
、　Ｂｏｕｒａｃｈｏｔ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ。

１　（１９８２）　８９５−９００　］の１３３ｂｐ　
　ＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片に結合させた後、発現ベク
ターｐＳＶＡ　　ＳＴＯＰＩを得た。

ポリアデニル化部位はベクターｐｌＧ６（ブーラショら
、同上）から単離することもできる。

ＢａｍＨＩ切断部位を埋填しかつＥｃｏＲＩリンカ−を
結合させるために、同様の方法でＳＶ４０ゲノムから１
３３ｂｐ　　ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片を単離すること
もできる。

このように、ｐＳＶＡ　　ＳＴＯＰ１は、ＳＶ４０初期
（ｅａｒｌｙ　）プロモーターと初期転写用ＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナルとの間に、三つの独特な制限部位
（ＨｉｎｄｌＩ［−５ａｌＩ−Ｘｂａｌ）をもつクロー
ニング用ポリリンカー及び３種すべての読取り枠の翻訳
停止コードンをもつ配列を有している。

ｂ）ＡＴＩＩＩ発現ベクターの構築 ＡＴＩＩＩｃＤＮＡは、欧州特許出 願節Ａ２　０，０９０．５’０５号（又は米国特許箱４
．５１７，２９４号）明細書に開示されており、そこの
記載通りに製造することも又は常法に従って合成するこ
ともできる。西独特許出願Ｐ３６１８６３８．４号明細
書は、プラスミドｐＵＣ１３のＳｍａＩ切断部位にＡ　
Ｔ　ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを有するプラスミドｐβＡＴ６
　（第１図）を提案している。

ＡＴＩＩＩｃＤＮＡのサブクローニング用ブラスミドｐ
βＡＴ６　（第２図）を唯一のＥｃｏＲＩ部位で切断す
ることにより直鎖化した。形成される５′突出末端は、
相補鎖をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）に埋填
することによりプラント末端化し、次いで５ａｌｌリン
カー： ５’　ｄ　（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ）３’と結合させた。

次のＸｂａｌ切断により、大きさが約１４００ｂｐであ
ってかつ単離されるべき完全プレＡＴＩＩＩをコードす
るＤＮＡ断片を得た。

ｐｓＶＡＩＩ［は、５ａｌＩ及びＸｂａｌで切断された
発現ベクターｐＳＶＡ　　ＳＴＯＰＩにこの断片を結合
させることにより得た。

ｐ　Ｓ　ＶＡＴＩＩＩ上のＡＴＩＩＩ転写単位はｍＲＮ
Ａスプライス部位を有していない。

Ｃ）共形質感集用ＤＨＦＲ発現ベクターの構築共形質感
染のために用いられるＤＨＦＲベクターの出発点はプラ
スミドｐＭＴＶｄｈ　ｆ　ｒ　（リ−ら、同上）であっ
た。ｐＭＴＶｃｊｈｆ　ｒ　（第３図）をＢａ１ｎで切
断し、ＤＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　
（フレノウ断片）で埋填した。

ＥｃｏＲＩで切断後、４．４７ｋｂ断片を単離し、ｐＢ
Ｂ３　（ブーラショら、同上）の１３３ｂｐＥｃｏＲＩ
−Ｈｐａｌ断片と結合させた。新規プラスミドｐＭＴＶ
Ａｄｈ　ｆ　ｒは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲが外接したマウス
ＤＨＦＲｃＤＮＡ及び初期転写用ＳＶ４０ポリアデニル
化部位を有する。

ｐＳＶＯＡｄｈｆｒｌ：ｔ、大きさが１４５０ｂｐでＭ
ＭＴＶ−ＬＴＲを有するＨｉｎｄｌＩ［断片の切除によ
って、ｐＭＴＶＡｄｈｆｒから得た。

ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及びｐｓＶＯＡｄｈｆ　ｒは、いず
れもｍＲＮＡスプライス部位を有していない。

剋ｌ プラスミドｐｓＶＡＴＩｌびｐＭＴＶＡｄｈｆｒもしく
はｐＳＶＯＡｄｈｆｒをリン酸カルシウム沈降法〔グレ
アム及びフォン・デル・ニブ１．パイロロジー、第５２
巻、１９７３年、第４５６−４６７頁（Ｇｒａｈａｍ　
ａｎｄ　ｖｏｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　５２　（１９７３）　４５Ｂ−４
ｆ１７）：ｌ　ｌ、：Ｊ：すＣＨＯｄｈｆｒ−細胞に導
入した。このた込に、プラスミドｐｓｖＡ”ｒｍ　　２
０ｕｔをＤＨＦＲ発現ブラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ又は
ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ５μｇと混合し、共沈降させた。プ
ラスミド混合物の共沈降物を上記のようにＣＨＯｄｈｆ
ｒ−細胞中に形質感染させた（２５Ｃ−培養フラスコ中
０．５Ｘ１０　　細胞）。３日後、細胞をトリプシン処
理し、数個の６０１１Ｉ１１ベトリ皿に移し替え、これ
に選択培地（グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン不
含）を加えた。これらの条件下で生存する細胞のみが、
ＤＨＦＲ遺伝子により安定な形質感染をうけた細胞であ
る。

形質感染細胞からなるコロニーは、１〜３週間後にペト
リ皿中で目に見えるようになる。この場合に下記形質感
染率を達成することができた；ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ　　
５ｘｌＯ ｐｓＶＯＡｄｈ、ｆｒ　ｌＸｌ０−５ 単一のコロニーを単離し、グリシン、ヒポキサンチン及
びチミジン不含培地中で増殖させた。

これら新規細胞系（ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩ）の培養上澄
をヒトＡＴｎＩ検出のための特異的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に
より組換えＡＴＩＩＩ［に関して試験した。この試験に
より１、被験ＣＨＯｄｈｆｒ＋細胞系の２０％が培地中
にヒトＡＴＩＩＩを検出可能量分泌していることが判っ
た。ＡＴＩＩＩ産生糸の発現速度を定量するため、下記
標準試験操作を行い、細胞０．！５Ｘ１０６個を２５ｃ
ｄ培養フラスコ内の培地５ｍｌ中で培養した。培地を２
４時間後変更した（５ｍｌ）、更に２４時間後培地をＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ用に回収し、細胞をトリプシン処理し、計
数した。

報告した数値は少なくとも３回の移し替えの平均値を表
わしており、発現速度は±２５％の範囲内で一定であっ
た。以下で報告するすべての発現（μｇ７１０Ｂ細胞／
２４ｈｒ）に関し、試験の最後における２５ｃｍフラス
コ当りの細胞数は１±０．２５Ｘ１０６個の細胞であっ
た。下記表は、上記方法で試験された基本的クローンの
発現速度を示すものである。

ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩ−ＭＴＶＡｄｈｆｒクローン１：
　０．１４μｇ／’１０６細胞／２．４ｈｒクローン２
：０．１１μｇ／１０６細胞／２４ｈｒＣＨｏ　　５Ｖ
ＡＴＩＩＩ−８ＶＯＡｄｈｆｒクローンｌ：ｏ、０８μ
ｇ／１０　細胞／２４ｈｒクローン２　：　Ｏ，、，１
４μｇ／ｌ、０　　細胞／２４ｈｒ胆 ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩ−ＭＴＡｄｈｆｒ（クローン１及
び２）及びＣＩＯ５ＶＡＴＩＩＩ−９ＶＯＡｄｈｆｒ（
クローン１及び２）を漸増メソトレキセート（、Ｍｔｘ
　）濃度中に連続的に移し替えた。上記標準法で定量さ
れた発現速度（μｇ／１０　細胞／　２４　ｈｒ）は下
記のとおりであった。

Ｍｔｘ　　　ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩ［−ＣＨＯＳＶＡＴ
ＩＩＩ−ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ　　　　５ＶＯＡｄｈｆｒ
クローン１　クローン？　クローン１　クローン２０　
　　　０、’１４　　０．１１　　　ｏ、、ｏｓ　　　
Ｏ，１４０，０５０，３４０，５４−− ０，１５−０，６００，６４２，７ ０，３，０，５５１，１５，−３，３ ０、６１，１８，、２，９００，８６−１−−１，５− ５μＭ　　　　　−４，００−８，５ ｂ）個々のクローンを単離する増幅 用いられるＭｔｘ濃度レベルは０．　１〜１μＭであっ
た。０．１μＭ　　Ｍｔｘに耐性のクローンは、ＣＨＯ
ＳＶＡＴｍ−ＭＴＶＡｄｈｆｒ（クローン２）（第４図
中″Ｂ′）から出発した場合８個、ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩ
Ｉ”ＳＶＯ’Ａ’ｄｈｆｒ（クローン１）（第４図中“
Ａ”）から出発した場合１１個が単離され、それらの発
現速度に基づき特徴づけられた（第４図）。縦座標はＡ
ＴｎＩ収量μｇ／１０”細胞／２４ｈｒを示す。これら
すべてのクローンは、関連出発クローンの場合よりも多
量のＡＴＩＩＩＩを産生ずる（上記参照）。０，１ａＭ
Ｍｔｘ中で増殖するクローンの発現速度は、ＣＩＯ５Ｖ
ＡＴＩＩＩ−ＭＴＶＡｄｈｆ、ｒ　　（りｏ−ン２）か
ら出発した場合に０．１５〜０，８μｇ／１０６細胞／
２４ｈｒ　（１，４〜７倍の増量に相当する）及びＣＨ
Ｏ５ＶＡＴＩＩＩ−８ＶＯＡｄｈｆｒ（クローン１）か
ら出発した場合に０．３５〜３．２μｇ／１０Ｂ細胞／
２４ｈｒ（４〜４０倍の増量に相当する）であった。サ
ザーンプロット法〔サザーン、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー、第９８巻、１９７５年、第５
０３頁（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　　閃（１９７５
）　５０３））により、形質感染ＡＴｎＩｃＤＮＡの特
定の１４００・ｂｐ　　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片は０．１ａＭ　　Ｍｔｘ中で増殖するすべての”分析
クローンにおいて増殖せしめられていることが示された
。

１ａＭＭｔｘでの次の増殖過程は、０，１ａＭＭｔｘに
耐性である最大産生細胞系の一つ一’２３　− （ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩＩ−５ＶＯＡｄｈ　ｆ　ｒ、ク
ローンＩ　　Ａ２．２．１２ｃｚｇ／１０６細胞／２４
ｈｒ。

第４図ではＡ２″として示されている）において行なわ
れた。この場合に、順次９個のクローンを試験して、約
１０μｇ／１０６細胞／２４ｈｒを産生する細胞系（Ｃ
Ｈ’Ｏ５ＶＡＴＩＩＩ−３ＶＯＡｄｈｆｒ　　クローン
Ｉ　　Ａ２７）を単離することができた。

例４ 無血清培地中でのＡＴＩＩＩ［の合 成ＣＨＯ５ＶＡＴＩＩＩ［−５ＶＯＡｄｈｆｒクローン
Ｌ　　Ａ２７（１ａＭＭｔｘ）を１０％（ｖ／■）ウシ
胎児血清存在下１７５ｃＪ培養フラスコ中のＨａｍＦ１
２選択培地（グリシン、チミジン及びヒボキサンチン不
含）中において集密率（ｃｏｎｆ　Ｉ　ｕｅｎｃｅ）約
８０％まで培養し、しかる後無血清イスコブズ（Ｉｓｋ
ｏｖｅｓ　）培地で洗浄し、次いでＡＴＩＩＩ［を産生
させるためにこの培地中で４８時間培養した。培養後に
おける培地中のＡＴＩＩＩ濃度は５〜６μｇ　／　ｍｌ
であった。次いで細胞を、別の４８時間産生過程が無血
清培地中で開始されるまで、血清含有培地中で２４〜４
８時間培養し、ＡＴＩＩＩ発現速度の低下を招（ことな
く数回にわたり上記産生サイクルを繰返すことができた
。

餞旦 動物細胞由来ＡＴＩＩＩの精製及び特徴ＡＴＩＩＩをヘ
パリン−セファロース（ＳＥＰ１ｊＡＲＯ８ＥＲ）アフ
ィニティークロマトグラフィーにより血清含有及び無血
清培地の双方から回収した〔ミラー−アンダーセンら、
トロンボシス・リサーチ、第５巻、１９７４年、第４３
９−４５２頁（Ｍｉｌｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｓｅｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅｅａｒ
ｃｈ、　５（１９７４）　４３９−４５２）　）。回収
された物質は、オフテルロ二−免疫拡散試験法〔プログ
レス・オブ・アレルギー、第５巻、１９５８年、第１頁
（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ、　５　（
１９５ｇ）　１））によるとヒト血清から得られたＡＴ
ｍと免疫学的に同一であることを示した。ＡＴＩＩＩ特
異的抗体とのウェスターンプロット法でも、ヒト血漿由
来ＡＴＩＩＩとＣＨＯ細胞由来組換えＡＴＩＩＩとの同
一性を示した。

ＣＨＯ細胞から分泌されるＡＴＩＩＩＩは、十分な程度
にまで、ヘパリンコファクター〔ヘンセン及びレーリガ
ー、トロンボシス・エト・ジアセシス・ヘモラギカ、第
９巻、１９６３年、増刊第１号、第１８−１９頁（Ｈｅ
ｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｌｏｅｌｉｇｅｒ、　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏ−ｓｉｓ　ｅｔ　Ｄｉａｔｈｅｓｌｓ　Ｈａｅｍｏｒ
ｒｈａｇｉｅａ、　９　（１９６３）ＳｕｐＩ）１．１
．１８−２９））及び進行性インヒビター活性〔シュラ
ダーら、Ａｅｒｚｔｌ、　Ｌａｂ、、　　第２９巻、１
９８３年、第３５−３９頁〕の双方を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図及びその続きの第１ａ図は、ｐＢＲ３２２Ｅｃｏ
ＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片、複製源のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｖ
ｕｌｌ断片及び初期・後期転写用プロモーター、並びに
ＳＶ４０ゲノムＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片のポリアデニ
ル化部位及びプラスミドｐＵＣ１２　ＳＴＯＰの翻訳停
止コードンを有するベクターｐＳＶＡ　　ＳＴＯＰＩの
構築を示す説明図である。 第２図は、ＡＴＩＩＩ［をコードするＤＮＡ配列のべフ
タ−ｐＳＶＡ　　ＳＴＯ，Ｐｌへの組込み方を示す説明
図である。 第３図は、ベクターｐＭＴＶＡｄｈｆｒ（ＭＭＴＶ−Ｌ
ＴＲプロモーターを有する）及びｐｓＶＯＡｄｈｆ　ｒ
　（真核細胞又はウィルスのプロモーターを有していな
い）の構築を示す説明図である。 第４図は、最後に述べた二つのベクターのうちの一つを
各々有しかつメソトレキセート存在下遺伝子増幅により
得られた細胞系のＡＴＩＩＩ［発現速庫を示す説明図で
ある。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）ｃＤＮＡを含有す
   る発現ベクターを用いた哺乳動物細胞培養物中における
   ヒトＡＴIIIの製造法であって、ＤＨＦＲ遺伝子を有す
   る別のベクターで共形質感染されたｄｈｆｒ＾−細胞を
   該哺乳動物細胞として使用することを特徴とするヒトＡ
   ＴIIIの製造法。 ２、真核細胞又はウィルスのプロモーターがＤＨＦＲ遺
   伝子の上流に位置していない、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、ＤＨＦＲ遺伝子がｐＢＲ３２２ｏｒｉ領域に下流で
   結合せしめられている、特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の方法。 ４、ＤＨＦＲ遺伝子が選択マーカーを有するｐＢＲ３２
   ２部分のｏｒｉ領域に下流で結合せしめられている、特
   許請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載された方
   法。 ５、選択マーカーがアンピシリン耐性遺伝子である、特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、ＥｃｏＲ I −ＰｖｕII断片が ｐＢＲ３２２部分として用いられる、特許請求の範囲第
   ４項又は第５項記載の方法。 ７、ＡＴIII遺伝子がウイルスプロモーターの制御下に
   ある、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に
   記載の方法。 ８、ベクターがスプライス部位を有していない、特許請
   求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９、ＤＨＦＲ遺伝子をメソトレキセートを用いてＡＴI
   II遺伝子と一緒に増幅させる、特許請求の範囲第１項〜
   第８項のいずれか１項に記載の方法。 １０、ＡＴIII産生を無血清培地中で行なう、特許請求
   の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の方法。 １１、ＳＶ４０プロモーター配列及び ＳＶ４０ポリアデニル化部位を有しかつスプライス部分
   を有さないｐＢＲ３２２配列及びＡＴIIIｃＤＮＡ含有
   発現ベクター。 １２、ポリアデニル化部位が実質的に１３３ｂｐＢａｍ
   Ｈ I −Ｈｐａ I 断片である、特許請求の範囲第１１項
   記載のベクター。 １３、ｐＵＣ１２ＳＴＯＰ由来の翻訳停止 配列を有する、特許請求の範囲第１１項又は第１２項記
   載のベクター。 １４、プラスミドｐＳＶ２ＳＴＯＰ（第１ 図）及びｐＳＶＡＳＴＯＰ１（第２図）。 １５、プラスミドｐＳＶＡＴIII（第２図）。 １６、ＤＨＦＲ遺伝子がｐＢＲ３２２ｏｒｉ領域に下流
   で結合せしめられている、マウスＤＨＦＲ遺伝子含有ベ
   クター。 １７、ＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する、特許請求
   の範囲第１６項記載のベクター。 １８、スプライス部位を有さない、特許請求の範囲第１
   ６項又は第１７項記載のベクター。 １９、プラスミドｐＭＴＶＡｄｈｆｒ及び ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ（第３図）。 ２０、一方では特許請求の範囲第１１項〜第１５項のい
   ずれか１項に記載されたベクターでかつ他方では特許請
   求の範囲第１６項〜第１９項のいずれか１項に記載され
   たベクターで共形質感染された哺乳動物細胞。 ２１、メソトレキセートを用いて選択された、特許請求
   の範囲第２０項記載の細胞。 ２２、進行性インヒビター活性を有しかつヘパリンで刺
   激される、哺乳動物細胞中での ｃＤＮＡ発現により得れるＡＴIII。 ２３、進行性インヒビター活性を有しかつヘパリンで刺
   激される、特許請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか
   １項に記載された方法により得られるＡＴIII。 ２４、特許請求の範囲第２２項又は第２３項に記載され
   たＡＴIIIを含有する薬剤。