JP3265587B2 - 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、無血清培地で増殖継代
可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムス
ターオバリー細胞の形質転換体及びその製造方法、当該
形質転換体による異種蛋白質の製造方法に関する。
可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムス
ターオバリー細胞の形質転換体及びその製造方法、当該
形質転換体による異種蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】従来、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリ
ー細胞（以下、「ＣＨＯ dhfr- 細胞」という。）は、
種々の遺伝子発現の宿主として汎用されている。この細
胞株は、dhfr遺伝子とともに種々の遺伝子を形質導入し
た後、メソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地中で培養
することにより導入した遺伝子を増幅させることが可能
であり〔Kaufman,R.J.et.al,J.Mol.Biol.159,601(198
2)〕、そのため目的の遺伝子産物の産生分泌量は数１０
μｇ／mlのオーダーに達する〔Kaufman,R.J.et.al,Mol.
Cell.Biol.5(7),1750(1985) 、Kaufman,R.J.et.al,J.Bi
ol.Chem.261(21),9622(1986)〕。しかし、この細胞株は
培養において血清依存性が高く、一般には、ウシ胎児、
ウマまたはヒト等の血清を１〜１５％の濃度で使用しな
ければならなかった。
ドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリ
ー細胞（以下、「ＣＨＯ dhfr- 細胞」という。）は、
種々の遺伝子発現の宿主として汎用されている。この細
胞株は、dhfr遺伝子とともに種々の遺伝子を形質導入し
た後、メソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地中で培養
することにより導入した遺伝子を増幅させることが可能
であり〔Kaufman,R.J.et.al,J.Mol.Biol.159,601(198
2)〕、そのため目的の遺伝子産物の産生分泌量は数１０
μｇ／mlのオーダーに達する〔Kaufman,R.J.et.al,Mol.
Cell.Biol.5(7),1750(1985) 、Kaufman,R.J.et.al,J.Bi
ol.Chem.261(21),9622(1986)〕。しかし、この細胞株は
培養において血清依存性が高く、一般には、ウシ胎児、
ウマまたはヒト等の血清を１〜１５％の濃度で使用しな
ければならなかった。
【０００３】しかし、血清含有培地を使用する際には以
下の様な問題があった。 血清自体が高価なためコスト高となる。 血清にはロット差があり、再現性のある培養には不
利である。 産生物の培養上清からの精製が困難となる。 ウイルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがあ
る。
下の様な問題があった。 血清自体が高価なためコスト高となる。 血清にはロット差があり、再現性のある培養には不
利である。 産生物の培養上清からの精製が困難となる。 ウイルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがあ
る。
【０００４】このような現状に鑑みて、無血清培地で増
殖継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体の検索及
び異種蛋白質の製造方法の検討がなされているが、いず
れも満足した結果は得られていない。
殖継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体の検索及
び異種蛋白質の製造方法の検討がなされているが、いず
れも満足した結果は得られていない。
【０００５】本発明の第１の目的は、無血清培地で増殖
継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体を提供する
ことである。
継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体を提供する
ことである。
【０００６】本発明の第２の目的は、効率的な上記形質
転換体の製造方法を提供することである。
転換体の製造方法を提供することである。
【０００７】本発明の第３の目的は、上記形質転換体よ
り異種蛋白質を大量に製造する方法を提供することであ
る。
り異種蛋白質を大量に製造する方法を提供することであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため鋭意研究を重ねた結果、無血清培地で増殖
継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体を創製する
ことに成功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
達成するため鋭意研究を重ねた結果、無血清培地で増殖
継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体を創製する
ことに成功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
【０００９】即ち、第１番目の本発明は、無血清培地で
増殖継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体であ
る。
増殖継代可能なＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体であ
る。
【００１０】第２番目の発明は、ＣＨＯ dhfr- 細胞を
形質転換させた後、無血清培地にて培養することを特徴
とする上記第１番目の本発明形質転換体の製造方法であ
る。
形質転換させた後、無血清培地にて培養することを特徴
とする上記第１番目の本発明形質転換体の製造方法であ
る。
【００１１】第３番目の発明は、ＣＨＯ dhfr- 細胞を
無血清培地にて順化させた後、形質転換することを特徴
とする上記第１番目の本発明形質転換体の製造方法であ
る。
無血清培地にて順化させた後、形質転換することを特徴
とする上記第１番目の本発明形質転換体の製造方法であ
る。
【００１２】第４番目の発明は、上記第１番目の本発明
形質転換体を無血清培地で培養して異種蛋白質を発現さ
せることを特徴とする異種蛋白質の製造方法である。
形質転換体を無血清培地で培養して異種蛋白質を発現さ
せることを特徴とする異種蛋白質の製造方法である。
【００１３】本発明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞
の形質転換体は、ＣＨＯ dhfr- 細胞を、形質転換させ
た後、無血清培地にて培養することによって製造するこ
とができるほか、無血清培地にて順化させた後、形質転
換することによっても製造できる。
の形質転換体は、ＣＨＯ dhfr- 細胞を、形質転換させ
た後、無血清培地にて培養することによって製造するこ
とができるほか、無血清培地にて順化させた後、形質転
換することによっても製造できる。
【００１４】本発明の形質転換する方法は特に制限され
るものではなく、リン酸カルシウム法（M.Wiglerら、Ce
ll、１１巻、２２３頁、１９７７年）、マイクロインジ
ェクション法（W.F.Andersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、７７巻、５３９９頁、１９８０年）、細胞融合法
（W.Scheffaer ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻、
２１６３頁、１９８０年）、エレクトロポレーション
法、ＤＥＡＥデキストラン法等により、目的の構造遺伝
子を含むＤＮＡと、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする
遺伝子を宿主細胞に導入することができる。該構造遺伝
子は、プロウロキナーゼ、アンチトロンビン−III （Ａ
Ｔ−III)に限られるものではなく、その他ヒト血漿蛋白
質、各種蛋白質性ホルモン、成長因子、ウィルス抗原、
レセプター等の公知の種々の遺伝子発現にも使用するこ
とができる。ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子
は、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素のｃＤＮＡ以外に、
他の動物由来の遺伝子でも、染色体由来の遺伝子であっ
ても何らさしつかえない。遺伝子が導入された形質転換
細胞は、ヒポキサンチン、チミジン等の塩基（核酸類）
を含まない培地、例えば透析した１０％ウシ胎児血清を
含むＭＥＭ−αで選択可能であり、更に順次高濃度のメ
トトレキセートで処理することにより、細胞あたりの遺
伝子のコピー数を増幅させ、目的蛋白質の産生量を増加
させることもできる。
るものではなく、リン酸カルシウム法（M.Wiglerら、Ce
ll、１１巻、２２３頁、１９７７年）、マイクロインジ
ェクション法（W.F.Andersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、７７巻、５３９９頁、１９８０年）、細胞融合法
（W.Scheffaer ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻、
２１６３頁、１９８０年）、エレクトロポレーション
法、ＤＥＡＥデキストラン法等により、目的の構造遺伝
子を含むＤＮＡと、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする
遺伝子を宿主細胞に導入することができる。該構造遺伝
子は、プロウロキナーゼ、アンチトロンビン−III （Ａ
Ｔ−III)に限られるものではなく、その他ヒト血漿蛋白
質、各種蛋白質性ホルモン、成長因子、ウィルス抗原、
レセプター等の公知の種々の遺伝子発現にも使用するこ
とができる。ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子
は、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素のｃＤＮＡ以外に、
他の動物由来の遺伝子でも、染色体由来の遺伝子であっ
ても何らさしつかえない。遺伝子が導入された形質転換
細胞は、ヒポキサンチン、チミジン等の塩基（核酸類）
を含まない培地、例えば透析した１０％ウシ胎児血清を
含むＭＥＭ−αで選択可能であり、更に順次高濃度のメ
トトレキセートで処理することにより、細胞あたりの遺
伝子のコピー数を増幅させ、目的蛋白質の産生量を増加
させることもできる。
【００１５】ＣＨＯ dhfr- 細胞は、Urlaub及びChasi
n、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻、４２１６頁、１
９８０年に記載の方法で調製され、増殖される。無血清
培地として特に好ましいものは、本発明者らが初めて提
案する新規培地である。即ち、基礎培地にインスリン、
ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ば
れる少なくとも１つを含有させた培地であり、その最も
好ましいものは基礎培地にインスリン、ペプトン、トラ
ンスフェリンおよびアルブミンを全て添加した培地であ
る。
n、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻、４２１６頁、１
９８０年に記載の方法で調製され、増殖される。無血清
培地として特に好ましいものは、本発明者らが初めて提
案する新規培地である。即ち、基礎培地にインスリン、
ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ば
れる少なくとも１つを含有させた培地であり、その最も
好ましいものは基礎培地にインスリン、ペプトン、トラ
ンスフェリンおよびアルブミンを全て添加した培地であ
る。
【００１６】基礎培地としては、細胞培養のためのすべ
ての公知培地を使用することができ、例えばダルベッコ
ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ハムＦ１２培地およびＲＰＭ
Ｉ１６４０培地が例示され、就中ＲＰＭＩ１６４０培地
が好適である。
ての公知培地を使用することができ、例えばダルベッコ
ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ハムＦ１２培地およびＲＰＭ
Ｉ１６４０培地が例示され、就中ＲＰＭＩ１６４０培地
が好適である。
【００１７】上記新規無血清培地における各種添加物の
量は、インスリン0.０１〜５０mg/l、就中0.１〜２mg/
l、ペプトン0.１〜１００ｇ/l、就中４〜６ｇ/l、トラ
ンスフェリン0.１〜５０mg/l、就中９〜１１mg/l、アル
ブミン0.０１〜１０ｇ/l、就中0.１〜２ｇ/lである。
量は、インスリン0.０１〜５０mg/l、就中0.１〜２mg/
l、ペプトン0.１〜１００ｇ/l、就中４〜６ｇ/l、トラ
ンスフェリン0.１〜５０mg/l、就中９〜１１mg/l、アル
ブミン0.０１〜１０ｇ/l、就中0.１〜２ｇ/lである。
【００１８】本発明において使用されるインスリンは、
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒト又はウシ由来のものが使用される。本発明にお
いて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限は
なく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒト又はウシ由来のものが使用される。本発明にお
いて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限は
なく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
【００１９】上記の新規無血清培地には、必要により、
更にヒポキサンチン0.１〜１００mg/l、就中１０〜１５
mg/l、チミジン0.０１〜１００mg/l、就中２〜５mg/l、
セレン0.０１〜１００μｇ/l、就中２〜５μｇ/l、α−
トコフェロール（ビタミンＥ）0.００１〜１０mg/l、就
中0.１〜0.５mg/lを加えることができる。
更にヒポキサンチン0.１〜１００mg/l、就中１０〜１５
mg/l、チミジン0.０１〜１００mg/l、就中２〜５mg/l、
セレン0.０１〜１００μｇ/l、就中２〜５μｇ/l、α−
トコフェロール（ビタミンＥ）0.００１〜１０mg/l、就
中0.１〜0.５mg/lを加えることができる。
【００２０】耐性遺伝子を有するベクターがトランスフ
ェクションされた動物細胞を培養しようとする場合に
は、トランスフェクションされたプラスミドの安定性を
保つために該培地に更にベクター中に含有された耐性遺
伝子に相応する選択剤を加えることもある。選択剤とし
ては、当業者には周知のもの、例えばネオマイシン、ヒ
グロマイシン、マイコフェノール酸、ヒポキサンチン、
キサンチン、アミノブチリンまたはメトトレキセイト
（ＭＴＸ）及びその誘導体等が例示される。
ェクションされた動物細胞を培養しようとする場合に
は、トランスフェクションされたプラスミドの安定性を
保つために該培地に更にベクター中に含有された耐性遺
伝子に相応する選択剤を加えることもある。選択剤とし
ては、当業者には周知のもの、例えばネオマイシン、ヒ
グロマイシン、マイコフェノール酸、ヒポキサンチン、
キサンチン、アミノブチリンまたはメトトレキセイト
（ＭＴＸ）及びその誘導体等が例示される。
【００２１】本発明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞
の形質転換体は、公知の無血清培地においても増殖継代
可能であるが、特に、上記の新規無血清培地における増
殖継代性にすぐれている。
の形質転換体は、公知の無血清培地においても増殖継代
可能であるが、特に、上記の新規無血清培地における増
殖継代性にすぐれている。
【００２２】本発明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞
の形質転換体は、宿主となるＣＨＯdhfr- 細胞を形質転
換させた後、無血清培地にて培養することによって、好
ましくは当該細胞を低密度処理することよって製造する
ことができる。具体的には、ＣＨＯ dhfr- 細胞を自体
既知の手段にて形質転換させた後、無血清培地に懸濁
し、対数増殖期の細胞を10〜10,000細胞／ml程度、好ま
しくは１０〜１０００細胞／ml程度の濃度で適当な培養
容器（例えばウェルプレート、ディッシュ等）に植え込
み、１ヶ月程度培養する。この間、数日間隔、好ましく
は３から６日ごとに培地交換を行うことにより製造する
ことができる。
の形質転換体は、宿主となるＣＨＯdhfr- 細胞を形質転
換させた後、無血清培地にて培養することによって、好
ましくは当該細胞を低密度処理することよって製造する
ことができる。具体的には、ＣＨＯ dhfr- 細胞を自体
既知の手段にて形質転換させた後、無血清培地に懸濁
し、対数増殖期の細胞を10〜10,000細胞／ml程度、好ま
しくは１０〜１０００細胞／ml程度の濃度で適当な培養
容器（例えばウェルプレート、ディッシュ等）に植え込
み、１ヶ月程度培養する。この間、数日間隔、好ましく
は３から６日ごとに培地交換を行うことにより製造する
ことができる。
【００２３】上記低密度処理による取得法は単に例示に
すぎず、この他血清非要求性を目的とした変異原処理や
血清含有培地から無血清培地への徐々の適用によっても
取得できる。
すぎず、この他血清非要求性を目的とした変異原処理や
血清含有培地から無血清培地への徐々の適用によっても
取得できる。
【００２４】本発明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞
の形質転換体は、宿主となるＣＨＯdhfr- 細胞を無血清
培地にて順化させた後、好ましくは当該細胞を低密度処
理した後、形質転換させることによっても製造すること
ができる。当該形質転換体による異種蛋白質の発現は前
述の如く、自体既知の手段にて行えばよい。
の形質転換体は、宿主となるＣＨＯdhfr- 細胞を無血清
培地にて順化させた後、好ましくは当該細胞を低密度処
理した後、形質転換させることによっても製造すること
ができる。当該形質転換体による異種蛋白質の発現は前
述の如く、自体既知の手段にて行えばよい。
【００２５】本発明の異種蛋白質の製造方法によれば、
例えばアンチトロンビン−III 、プロウロキナーゼ、組
織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面抗原、
プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−γ、コ
ロニー形成刺激因子等の異種蛋白質を製造することがで
きる。
例えばアンチトロンビン−III 、プロウロキナーゼ、組
織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面抗原、
プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−γ、コ
ロニー形成刺激因子等の異種蛋白質を製造することがで
きる。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明を詳細に説明するため実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。
【００２７】実施例１ 形質転換した後、無血清培地で
培養する方法で得られた形質転換体によるＡｓｎ24−Ｐ
ＰＡの産生 無血清培地（ＧＣＭ００１培地）の作製 基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）
〔Goding,J.W(1980)J.Immunol.Methods 39,285,JAMA199
(1957) 〕１0.２ｇを用い、添加物としてインスリン１m
g、ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン
１０mg、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサ
ンチン１３mg、チミジン４mg、α−トコフェロール0.１
３mg及びセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「Ｇ
ＣＭ００１培地」という。）１リットルを作製した。
培養する方法で得られた形質転換体によるＡｓｎ24−Ｐ
ＰＡの産生 無血清培地（ＧＣＭ００１培地）の作製 基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）
〔Goding,J.W(1980)J.Immunol.Methods 39,285,JAMA199
(1957) 〕１0.２ｇを用い、添加物としてインスリン１m
g、ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン
１０mg、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサ
ンチン１３mg、チミジン４mg、α−トコフェロール0.１
３mg及びセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「Ｇ
ＣＭ００１培地」という。）１リットルを作製した。
【００２８】 培養容器 低密度処理には、９６ウェルプレート（costarR ,Data
Packing Corp) 、その後のスケールアップには、６ウェ
ルプレート（Falcon R,Becton Dickinson)を用いた。
Packing Corp) 、その後のスケールアップには、６ウェ
ルプレート（Falcon R,Becton Dickinson)を用いた。
【００２９】 形質転換体の製造 ヒトプロウロキナーゼ産生ｄｈｆｒ活性欠損ＣＨＯ細胞
（Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生４μＭ ＭＴＸ耐性細胞）を特
願平３−９３１０５号明細書に記載の方法に準じて製造
した。以下、Ａｓｎ24−ＰＰＡと称する。
（Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生４μＭ ＭＴＸ耐性細胞）を特
願平３−９３１０５号明細書に記載の方法に準じて製造
した。以下、Ａｓｎ24−ＰＰＡと称する。
【００３０】 Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞からの血清
非要求性株の分離 １０％ＦＣＳを添加したＭＥＭ−α培地で継代培養中の
細胞で、対数増殖期のものを用いた。0.１２５％トリプ
シンを含むＰＢＳ（−）で消化、分散させた細胞を、無
血清培地で洗浄した後、ＧＣＭ００１培地に浮遊させ細
胞数を調整した。９６ウェルプレートの各ウェルに１０
０個のＡｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞を播種しＧＣＭ００１
培地で培養を行った。ＰＡ活性の測定はフィブリン平板
法で行い、Urokinase reference standard（株式会社ミ
ドリ十字社製, Lot.S-004)を標準品として用いた。
非要求性株の分離 １０％ＦＣＳを添加したＭＥＭ−α培地で継代培養中の
細胞で、対数増殖期のものを用いた。0.１２５％トリプ
シンを含むＰＢＳ（−）で消化、分散させた細胞を、無
血清培地で洗浄した後、ＧＣＭ００１培地に浮遊させ細
胞数を調整した。９６ウェルプレートの各ウェルに１０
０個のＡｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞を播種しＧＣＭ００１
培地で培養を行った。ＰＡ活性の測定はフィブリン平板
法で行い、Urokinase reference standard（株式会社ミ
ドリ十字社製, Lot.S-004)を標準品として用いた。
【００３１】 結果 ９６ウェルプレートの各ウェルにＡｓｎ24−ＰＰＡ産生
細胞を１００細胞／ウェルの濃度で播種し、５〜６日毎
に培地半量交換を行い培養した結果、約３週間後より６
７９ウェル中６ウェルで細胞の増殖が浮遊状態で認めら
れた。これらの培養上精中のＰＡ活性を調べた結果、表
１に示したようにすべての血清非要求性株でＡｓｎ24−
ＰＰＡの産生が認められた。特にＡｓｎ24−ＰＰＡ産生
細胞−Ｂ株は５１8.７ＩＵ／mlの産生量を示した。この
細胞をスケールアップしさらに産生能を調べた結果、８
０×１０4 細胞／mlの植え込みでは培養３日目で２９６
2.１ＩＵ／mlのＡｓｎ24−ＰＰＡ産生を示し、１６０×
１０4 細胞／mlの植え込みでは、培養１日目ですでに１
０００ＩＵ／mlを越える産生量を示した。その結果を表
２に示した。
細胞を１００細胞／ウェルの濃度で播種し、５〜６日毎
に培地半量交換を行い培養した結果、約３週間後より６
７９ウェル中６ウェルで細胞の増殖が浮遊状態で認めら
れた。これらの培養上精中のＰＡ活性を調べた結果、表
１に示したようにすべての血清非要求性株でＡｓｎ24−
ＰＰＡの産生が認められた。特にＡｓｎ24−ＰＰＡ産生
細胞−Ｂ株は５１8.７ＩＵ／mlの産生量を示した。この
細胞をスケールアップしさらに産生能を調べた結果、８
０×１０4 細胞／mlの植え込みでは培養３日目で２９６
2.１ＩＵ／mlのＡｓｎ24−ＰＰＡ産生を示し、１６０×
１０4 細胞／mlの植え込みでは、培養１日目ですでに１
０００ＩＵ／mlを越える産生量を示した。その結果を表
２に示した。
【００３２】
【表１】血清非要求性Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞の96ウ
ェルプレート中でのＰＡ活性
ェルプレート中でのＰＡ活性
【００３３】
【表２】
【００３４】ａ）植え込み細胞数 ｂ）ＩＵ／ml ｃ）×１０4 cells/ml
【００３５】Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞−Ｂ株を表２に
示した播種濃度で６ウェルプレートの各ウェルに植え込
み、３日間培養した。生細胞数と上清中のＰＡ活性をそ
れぞれ血球計算盤とフィブリン平板法で毎日測定した。
数値は２ウェルの平均値である。
示した播種濃度で６ウェルプレートの各ウェルに植え込
み、３日間培養した。生細胞数と上清中のＰＡ活性をそ
れぞれ血球計算盤とフィブリン平板法で毎日測定した。
数値は２ウェルの平均値である。
【００３６】以上の結果より、ＣＨＯ dhfr- 細胞由来
異種タンパク産生細胞からの血清非要求性株の分離が確
認された。なお、本Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞−Ｂ株は
寄託番号ＩＦＯ ５０３３１，菌株名Ｔ８Ｍ−Ｂとして
寄託されている。
異種タンパク産生細胞からの血清非要求性株の分離が確
認された。なお、本Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞−Ｂ株は
寄託番号ＩＦＯ ５０３３１，菌株名Ｔ８Ｍ−Ｂとして
寄託されている。
【００３７】実施例２ 形質転換した後、無血清培地に
て培養する方法で得られた形質転換体によるＡＴ−III
の産生無血清培地の作製及び培養容器については実施例
１、に記載の方法に準じて行った。
て培養する方法で得られた形質転換体によるＡＴ−III
の産生無血清培地の作製及び培養容器については実施例
１、に記載の方法に準じて行った。
【００３８】 形質転換体の製造 (1) オリゴヌクレオチドの合成 自動ＤＮＡ合成機を用いて、２種類のプローブ（プロー
ブ−１、プローブ−２）及びプライマー（プライマー−
１）を作製した。各々の塩基配列をそれぞれ以下に示
す。
ブ−１、プローブ−２）及びプライマー（プライマー−
１）を作製した。各々の塩基配列をそれぞれ以下に示
す。
【００３９】プローブ−１（翻訳開始コドンからの５１
塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ
ＧＴＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴ
ＡＣＡＴ−３’
塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ
ＧＴＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＡＴＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴ
ＡＣＡＴ−３’
【００４０】プローブ−２（成熟ＡＴ−III の２４４番
目のグリシン残基のコドンからの５１塩基配列の相補鎖
ＤＮＡ） ５’−ＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＣ
ＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＡＴ
ＣＡＣＣ−３’
目のグリシン残基のコドンからの５１塩基配列の相補鎖
ＤＮＡ） ５’−ＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＣ
ＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＡＴ
ＣＡＣＣ−３’
【００４１】プライマー−１〔翻訳停止コドン（下線）
を含む３２塩基ＤＮＡ。４塩基（＊印）が置換されてい
る〕 ＊＊ ＊＊ ５’−ＧＴＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴ
ＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣ−３’
を含む３２塩基ＤＮＡ。４塩基（＊印）が置換されてい
る〕 ＊＊ ＊＊ ５’−ＧＴＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴ
ＴＣＴＴＴＧＣＡＣＣ−３’
【００４２】(2) ヒトＡＴ−III をコードするｃＤＮＡ
のクローニング ヒト肝臓細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をオ
リゴｄＴカラムを用いて単離し（Chirgwinら、Biochemi
stry 18 :5294-5299, 1979)、ショ糖密度勾配遠心法に
より、サイズ分画した（Schweinfest ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 79:4979,1982）。適切な大きさのｍＲＮＡ
（至２８Ｓ）を材料に、常法（Okayamaら、Mol.Cell.Bi
ol. 2 :161, 1982)に従って、λｇｔ１０（Huynthら、D
NA Cloning 1 : 49, 1985) をベクターとしてｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。報告されているＡＴ−III の
ｃＤＮＡの塩基配列をもとに作製した２種類のプローブ
（前記）を用いてプラークハイブリダイゼーション（Be
ntonら、Science196 : 181, 1977)を行った。陽性クロ
ーンを単離し、ファージＤＮＡを調製した。制限酵素Ec
oRＩで消化し、約１５００ｂｐのｃＤＮＡ挿入部を切り
出し、プラスミドｐＵＣ１１８（Vieiraら、Meth.in En
zymology 153 : 3, 1987) にリクローニングした。この
プラスミドをｐＥＡ００１と命名し、その挿入配列に関
してジデオキシ法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74 : 5463,1977)により塩基配列を確認した。
のクローニング ヒト肝臓細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をオ
リゴｄＴカラムを用いて単離し（Chirgwinら、Biochemi
stry 18 :5294-5299, 1979)、ショ糖密度勾配遠心法に
より、サイズ分画した（Schweinfest ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 79:4979,1982）。適切な大きさのｍＲＮＡ
（至２８Ｓ）を材料に、常法（Okayamaら、Mol.Cell.Bi
ol. 2 :161, 1982)に従って、λｇｔ１０（Huynthら、D
NA Cloning 1 : 49, 1985) をベクターとしてｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。報告されているＡＴ−III の
ｃＤＮＡの塩基配列をもとに作製した２種類のプローブ
（前記）を用いてプラークハイブリダイゼーション（Be
ntonら、Science196 : 181, 1977)を行った。陽性クロ
ーンを単離し、ファージＤＮＡを調製した。制限酵素Ec
oRＩで消化し、約１５００ｂｐのｃＤＮＡ挿入部を切り
出し、プラスミドｐＵＣ１１８（Vieiraら、Meth.in En
zymology 153 : 3, 1987) にリクローニングした。この
プラスミドをｐＥＡ００１と命名し、その挿入配列に関
してジデオキシ法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74 : 5463,1977)により塩基配列を確認した。
【００４３】(3) ＡＴ−III 発現用プラスミド（ｐＴＹ
００７）の作製 該プラスミドは、以下の３種のプラスミド（ｐＥＡ００
３、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒ、ｐＴＴ００６）を用いて作
製する。
００７）の作製 該プラスミドは、以下の３種のプラスミド（ｐＥＡ００
３、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒ、ｐＴＴ００６）を用いて作
製する。
【００４４】ｐＥＡ００３：ｐＵＣ１１８にＡＴ−III
ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドで、site-directed mu
tagenesisによりＡＴ−III ｃＤＮＡのｐｏｌｙＡ添加
配列の上流にEcoRＩサイトとHindIII サイトが導入され
ている。
ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドで、site-directed mu
tagenesisによりＡＴ−III ｃＤＮＡのｐｏｌｙＡ添加
配列の上流にEcoRＩサイトとHindIII サイトが導入され
ている。
【００４５】ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒ：ｐＳＶ１１−ｄｈ
ｆｒはｐＳＶ２−ｄｈｆｒのEcoRＩサイト近傍にXbaIサ
イトを導入したプラスミドで、ＳＶ４０由来の初期プロ
モーターとエンハンサー、マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡ、
ＳＶ４０由来のスプライシングジャンクションとｐｏｌ
ｙＡ添加配列を含んでいる。
ｆｒはｐＳＶ２−ｄｈｆｒのEcoRＩサイト近傍にXbaIサ
イトを導入したプラスミドで、ＳＶ４０由来の初期プロ
モーターとエンハンサー、マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡ、
ＳＶ４０由来のスプライシングジャンクションとｐｏｌ
ｙＡ添加配列を含んでいる。
【００４６】ｐＴＴ００６：特願平３−９３１０５号明
細書に記載の方法に準じて作製した。
細書に記載の方法に準じて作製した。
【００４７】ｐＥＡ００３の作製：部位特異的塩基置換
法（Sayersら、Nucl.Acids Res. 16 : 791, 1988) によ
り、プライマー（前記）を用いて、ｐＥＡ００１中のＡ
Ｔ−III のコード領域とポリアデニル酸テールの間にHi
ndIII 及び、EcoRＩサイト設けた。このプラスミドをｐ
ＥＡ００３（図１参照）と命名した。ｐＥＡ００３はEc
oRＩで消化することにより、約１４００ｂｐのポリアデ
ニル酸テールを含まないＡＴ−III のｃＤＮＡを取り出
すことが可能である。
法（Sayersら、Nucl.Acids Res. 16 : 791, 1988) によ
り、プライマー（前記）を用いて、ｐＥＡ００１中のＡ
Ｔ−III のコード領域とポリアデニル酸テールの間にHi
ndIII 及び、EcoRＩサイト設けた。このプラスミドをｐ
ＥＡ００３（図１参照）と命名した。ｐＥＡ００３はEc
oRＩで消化することにより、約１４００ｂｐのポリアデ
ニル酸テールを含まないＡＴ−III のｃＤＮＡを取り出
すことが可能である。
【００４８】ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒの作製：ｐＳＶ２−
ｄｆｈｒ（前記）をEcoRＩで消化し、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて平滑末端とした後、
Xba ＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。このプラスミドをｐＳＶ１１−ｄｈｆｒと命名し
た。
ｄｆｈｒ（前記）をEcoRＩで消化し、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて平滑末端とした後、
Xba ＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。このプラスミドをｐＳＶ１１−ｄｈｆｒと命名し
た。
【００４９】ｐＴＴ００６の作製：特願平２−１２３５
７３号公報に記載の方法に準じて作製した。
７３号公報に記載の方法に準じて作製した。
【００５０】ｐＴＹ００７の作製：ＡＴ−III 発現用プ
ラスミド（ｐＴＹ００７）の作製方法を図１に示した。
まず、ｐＥＡ００３よりEcoRＩでＡＴ−III ｃＤＮＡを
切り出し、fill-in の後、BglII リンカーと結合した。
一方、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはHindIII 消化、fill-in
の後、BglII リンカーと結合し、さらにBglII で消化し
てマウスｄｈｆｒｃＤＮＡを取り除いた。これらをライ
ゲーションし、ＳＶ４０プロモーターの支配下にＡＴ−
III ｃＤＮＡを発現するプラスミド（ｐＴＹ００６）を
作製した。
ラスミド（ｐＴＹ００７）の作製方法を図１に示した。
まず、ｐＥＡ００３よりEcoRＩでＡＴ−III ｃＤＮＡを
切り出し、fill-in の後、BglII リンカーと結合した。
一方、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはHindIII 消化、fill-in
の後、BglII リンカーと結合し、さらにBglII で消化し
てマウスｄｈｆｒｃＤＮＡを取り除いた。これらをライ
ゲーションし、ＳＶ４０プロモーターの支配下にＡＴ−
III ｃＤＮＡを発現するプラスミド（ｐＴＹ００６）を
作製した。
【００５１】一方、ｐＴＴ００６を制限酵素で消化後、
fill-in し、ＵＫプロモーターの支配下にマウスｄｈｆ
ｒ ｃＤＮＡを発現するユニット(EcoRI/HindIIIフラグ
メント）を単離した。制限酵素処理の際には、ApaLＩを
用いて発現ユニット以外の部分を切断することにより、
目的のフラグメントの分離を容易にした。得られたdfhr
発現ユニットは、あらかじめXbaI消化とfill-in 処理を
行ったｐＴＹ００６とライゲーションし、E.coli HB101
に導入した。出現したコロニーをスクリーニングした結
果、目的のプラスミド（ｐＴＹ００７）を持つ株を得
た。ｐＴＹ００７の制限酵素地図と遺伝子の配置を図２
に示した。
fill-in し、ＵＫプロモーターの支配下にマウスｄｈｆ
ｒ ｃＤＮＡを発現するユニット(EcoRI/HindIIIフラグ
メント）を単離した。制限酵素処理の際には、ApaLＩを
用いて発現ユニット以外の部分を切断することにより、
目的のフラグメントの分離を容易にした。得られたdfhr
発現ユニットは、あらかじめXbaI消化とfill-in 処理を
行ったｐＴＹ００６とライゲーションし、E.coli HB101
に導入した。出現したコロニーをスクリーニングした結
果、目的のプラスミド（ｐＴＹ００７）を持つ株を得
た。ｐＴＹ００７の制限酵素地図と遺伝子の配置を図２
に示した。
【００５２】（４） 動物細胞への導入 （ａ） プラスミド：ｐＴＹ００７ プラスミドは調製後、塩化セシウム平衝密度勾配遠心法
で精製した。
で精製した。
【００５３】(b) 細胞：ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ｄｈｆ
ｒ欠損株 Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 77, 4216 (1980) に記載の方
法で調製、増殖させた。
ｒ欠損株 Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 77, 4216 (1980) に記載の方
法で調製、増殖させた。
【００５４】(c) メトトレキセート（ＭＴＸ） シグマ社製（＋）Amethopterinを0.８２％（w/v)塩化ナ
トリウム、0.０２％（w/v)リン酸水素二ナトリウム、0.
５６％（w/v)ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク）に溶解し、
２ｍＭストック液を調製した。これを培地に、目的の濃
度になるように添加し使用した。
トリウム、0.０２％（w/v)リン酸水素二ナトリウム、0.
５６％（w/v)ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク）に溶解し、
２ｍＭストック液を調製した。これを培地に、目的の濃
度になるように添加し使用した。
【００５５】(d) 培地と血清 MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
入り）(Gibco社製) MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
無し）(Gibco社製) それぞれ、MEM-α（w)、MEM-α（w/o)と略す。血清は牛
胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成ＨＭ０１）を非働化し使
用した。
入り）(Gibco社製) MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
無し）(Gibco社製) それぞれ、MEM-α（w)、MEM-α（w/o)と略す。血清は牛
胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成ＨＭ０１）を非働化し使
用した。
【００５６】(e) ＤＮＡ導入とトランスフェクタント
の選択 MEM-α（W), １０％ＦＣＳで継代しているＣＨＯ dhfr
- 細胞を0.２５％トリプシン処理により、ディッシュよ
りはがし、５×１０5 個の細胞を１０ｃｍディッシュに
植え込み、リン酸カルシウム法によりトランスフェクシ
ョンを行った。リン酸カルシウム沈澱は、Cell Phect T
ransfection Kit （ファルマシア社製）を用いて調製し
た。まず、１０μg 発現プラスミドを２４０μl の滅菌
水に溶解した。ここにキットのＡ液を２４０μl 添加
し、混合した後室温で１０分間放置した。ここに４８０
μl のＢ液を添加し、室温で１５分間放置した（全容９
６０μl ）。得られたリン酸カルシウム沈澱は、時間を
置かずに細胞に添加した。5.５時間培養した後、培地を
除去、洗浄後、３mlのグリセロール液（組成は以下の通
り）を添加した。
の選択 MEM-α（W), １０％ＦＣＳで継代しているＣＨＯ dhfr
- 細胞を0.２５％トリプシン処理により、ディッシュよ
りはがし、５×１０5 個の細胞を１０ｃｍディッシュに
植え込み、リン酸カルシウム法によりトランスフェクシ
ョンを行った。リン酸カルシウム沈澱は、Cell Phect T
ransfection Kit （ファルマシア社製）を用いて調製し
た。まず、１０μg 発現プラスミドを２４０μl の滅菌
水に溶解した。ここにキットのＡ液を２４０μl 添加
し、混合した後室温で１０分間放置した。ここに４８０
μl のＢ液を添加し、室温で１５分間放置した（全容９
６０μl ）。得られたリン酸カルシウム沈澱は、時間を
置かずに細胞に添加した。5.５時間培養した後、培地を
除去、洗浄後、３mlのグリセロール液（組成は以下の通
り）を添加した。
【００５７】５０％ グリセロール ３０ml ２×ＨＢＳ*) ５０ml 水 ２０ml*) ２×ＨＢＳ（ｐＨ7.１）：1.６３６％(w/v)塩化ナト
リウム, 1.１１８％(w/v) ＨＥＰＥＳ，0.０４％(w/v)
リン酸水素二ナトリウム
リウム, 1.１１８％(w/v) ＨＥＰＥＳ，0.０４％(w/v)
リン酸水素二ナトリウム
【００５８】３７℃で正確に２分間インキュベートした
後、グリセロール液を除去し、洗浄後、ＭＥＭ−α
（ｗ），１０％ＦＣＳで３日間培養後、選択培地である
ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳに交換した。２〜
３日毎に培地交換を行い、約２週間した後、トランスフ
ェクタントのコロニー形成が見られた。トランスフェク
タントを９６穴プレートに0.７細胞／ウェルの割合で植
え込んだ。各ウェルを検鏡し、１個のクローンのみが成
育しているウェルを選択した。そして上清のＡＴ−III
量を測定し高い活性を与えた細胞をスケールアップし、
さらに再クローニングを行った後、ＭＴＸによるＤＮＡ
増幅に供した。
後、グリセロール液を除去し、洗浄後、ＭＥＭ−α
（ｗ），１０％ＦＣＳで３日間培養後、選択培地である
ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳに交換した。２〜
３日毎に培地交換を行い、約２週間した後、トランスフ
ェクタントのコロニー形成が見られた。トランスフェク
タントを９６穴プレートに0.７細胞／ウェルの割合で植
え込んだ。各ウェルを検鏡し、１個のクローンのみが成
育しているウェルを選択した。そして上清のＡＴ−III
量を測定し高い活性を与えた細胞をスケールアップし、
さらに再クローニングを行った後、ＭＴＸによるＤＮＡ
増幅に供した。
【００５９】(f) ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 上記(e) で得られたＡＴ−III 産生細胞をＭＥＭ−α
（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ，５ｎＭ ＭＴＸを培地とし
て２×１０5 細胞／ウェルの濃度で６穴プレートに植え
込んだ。３日毎に培地交換を続けていると耐性株の出現
が見られた。２〜４週間で充分な細胞数になるので、次
の段階のＭＴＸ濃度の培地に継代した。このように５ｎ
ＭのＭＴＸ濃度からスタートして５〜２０μＭのＭＴＸ
濃度まで順次２〜４倍づつＭＴＸ濃度を上げていった。
各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれぞれ６穴プレートにて培
養した。
（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ，５ｎＭ ＭＴＸを培地とし
て２×１０5 細胞／ウェルの濃度で６穴プレートに植え
込んだ。３日毎に培地交換を続けていると耐性株の出現
が見られた。２〜４週間で充分な細胞数になるので、次
の段階のＭＴＸ濃度の培地に継代した。このように５ｎ
ＭのＭＴＸ濃度からスタートして５〜２０μＭのＭＴＸ
濃度まで順次２〜４倍づつＭＴＸ濃度を上げていった。
各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれぞれ６穴プレートにて培
養した。
【００６０】(g) ＡＴ−III 産生量の検出 ＡＴ−III の遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を１０％ＦＣ
Ｓを加えたＭＥＭ−α（ギブコ社製）に懸濁し、６ウェ
ルプレートまたは直径１０cmのペトリ皿で培養した。３
日毎に培地を交換し、細胞が飽和密度（約１×１０6 個
／ml）に達した後、培地を交換し、更に３日間培養を行
った。培養上清を回収し、上清中のＡＴ−III をＥＬＩ
ＳＡ法（stephensら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84 : 3
886, 1987)により測定した。また、細胞を0.２５％トリ
プシン（シグマ社製）処理で回収し、細胞数を計測し
た。
Ｓを加えたＭＥＭ−α（ギブコ社製）に懸濁し、６ウェ
ルプレートまたは直径１０cmのペトリ皿で培養した。３
日毎に培地を交換し、細胞が飽和密度（約１×１０6 個
／ml）に達した後、培地を交換し、更に３日間培養を行
った。培養上清を回収し、上清中のＡＴ−III をＥＬＩ
ＳＡ法（stephensら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84 : 3
886, 1987)により測定した。また、細胞を0.２５％トリ
プシン（シグマ社製）処理で回収し、細胞数を計測し
た。
【００６１】 ＡＴ−III 産生細胞からの血清非要求
性株の分離 実施例１に記載の方法に準じて行った。
性株の分離 実施例１に記載の方法に準じて行った。
【００６２】 結果 ＡＴ−ＩＩＩの遺伝子を導入し、ＡＴ−ＩＩＩを産生し
ている血清要求性細胞株（親株）５株について無血清培
地（ＧＣＭ００１）への順化を試みた。９６ウェルプレ
ートに１００細胞／ウェルの密度でまきこんだところ、
細胞株によって異なった頻度（９〜８４％）で増殖陽性
ウェルが観察された。順化した細胞株は細胞魂を形成し
浮遊して増殖するものであった。
ている血清要求性細胞株（親株）５株について無血清培
地（ＧＣＭ００１）への順化を試みた。９６ウェルプレ
ートに１００細胞／ウェルの密度でまきこんだところ、
細胞株によって異なった頻度（９〜８４％）で増殖陽性
ウェルが観察された。順化した細胞株は細胞魂を形成し
浮遊して増殖するものであった。
【００６３】取得した無血清培地で増殖可能な形質転換
細胞株はサブコンフルエント（約0.５×１０6 細胞／m
l）な状態で３日間培養することにより、ＡＴ−III の
産生量を調べた。５株のうち３株においては、高濃度
（４〜５μｇ／ml）のＡＴ−IIIを産生していた。これ
らの高産生細胞株については、より高濃度（初濃度２×
１０6 細胞／ml）で培養した時の産生量を調べた。その
結果、細胞密度に依存してＡＴ−III 産生量も増加し、
親株と同等な量のＡＴ−III を産生しうることが確認さ
れた。
細胞株はサブコンフルエント（約0.５×１０6 細胞／m
l）な状態で３日間培養することにより、ＡＴ−III の
産生量を調べた。５株のうち３株においては、高濃度
（４〜５μｇ／ml）のＡＴ−IIIを産生していた。これ
らの高産生細胞株については、より高濃度（初濃度２×
１０6 細胞／ml）で培養した時の産生量を調べた。その
結果、細胞密度に依存してＡＴ−III 産生量も増加し、
親株と同等な量のＡＴ−III を産生しうることが確認さ
れた。
【００６４】
【表３】
【００６５】ＡＴ−III 産生ＣＨＯ細胞株５株をＧＣＭ
００１培地にて懸濁し、１００細胞／ウェルでそれぞれ
２枚のプレートにまきこんだ。１ヶ月後、増殖陽性ウェ
ルをカウントした。数値は２枚での平均値である。
００１培地にて懸濁し、１００細胞／ウェルでそれぞれ
２枚のプレートにまきこんだ。１ヶ月後、増殖陽性ウェ
ルをカウントした。数値は２枚での平均値である。
【００６６】
【表４】
【００６７】無血清培地中で増殖してきたＡＴ−III 産
生細胞に関して、サブコンフルエントな状態（細胞密度
約0.５×１０6 cells/ml）で３日間培養を行った。培養
上清中のＡＴ−III 濃度を測定した。
生細胞に関して、サブコンフルエントな状態（細胞密度
約0.５×１０6 cells/ml）で３日間培養を行った。培養
上清中のＡＴ−III 濃度を測定した。
【００６８】
【表５】
【００６９】無血清培地中で増殖してきたＡＴ−III 産
生細胞に関して、２×１０6 cells/mlで１２ウェルプレ
ートに植え込み３日間培養を行った。親株の数値はコン
フルエント（２〜３×１０6 cells/ml）に達してから３
日間の血清培地での培養時のものである。なお、細胞株
Ａ−ａは寄託番号ＩＦＯ ５０３３０，菌株名１８−１
３として寄託されている。
生細胞に関して、２×１０6 cells/mlで１２ウェルプレ
ートに植え込み３日間培養を行った。親株の数値はコン
フルエント（２〜３×１０6 cells/ml）に達してから３
日間の血清培地での培養時のものである。なお、細胞株
Ａ−ａは寄託番号ＩＦＯ ５０３３０，菌株名１８−１
３として寄託されている。
【００７０】実施例３ 宿主細胞を無血清培地にて順化
させた後、形質転換して得られた形質転換体によるＡｓ
ｎ24−ＰＰＡの産生無血清培地の作製については、実施
例１に準じて作製した。 宿主細胞の無血清培地へ
の順化 (1) 培養容器 培養容器については実施例１に準じた。
させた後、形質転換して得られた形質転換体によるＡｓ
ｎ24−ＰＰＡの産生無血清培地の作製については、実施
例１に準じて作製した。 宿主細胞の無血清培地へ
の順化 (1) 培養容器 培養容器については実施例１に準じた。
【００７１】(2) ＧＣＭ００１培地におけるＣＨＯ dh
fr-細胞の低密度処理 血清含有培地で増殖させたＣＨＯ dhfr- 細胞をＧＣＭ
００１培地に懸濁し、対数増殖期の細胞を１００、１
０、１細胞／ウェルの各濃度でそれぞれ４枚の９６ウェ
ルプレートに植え込んだ。３日〜４日ごとに培地交換を
行い、１ヶ月培養し、コロニー陽性ウェルを計測し、コ
ロニー出現率（％）を平均値±標準偏差で表６に表し
た。対照として0.１％非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(B
oehringer Mannhaim Gmbh,Lot.698071 02)を加えたＧＣ
Ｍ００１培地を用い、上記と同様の操作を行った。
fr-細胞の低密度処理 血清含有培地で増殖させたＣＨＯ dhfr- 細胞をＧＣＭ
００１培地に懸濁し、対数増殖期の細胞を１００、１
０、１細胞／ウェルの各濃度でそれぞれ４枚の９６ウェ
ルプレートに植え込んだ。３日〜４日ごとに培地交換を
行い、１ヶ月培養し、コロニー陽性ウェルを計測し、コ
ロニー出現率（％）を平均値±標準偏差で表６に表し
た。対照として0.１％非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(B
oehringer Mannhaim Gmbh,Lot.698071 02)を加えたＧＣ
Ｍ００１培地を用い、上記と同様の操作を行った。
【００７２】
【表６】
【００７３】１００細胞／ウェルで植え込んだプレート
においてはほとんど全ウェル（９０％）において、１０
細胞／ウェルでは約１０％のウェルにおいて、１細胞／
ウェルでは約１％のウェルにおいて細胞の増殖が観察さ
れた。このことから、約１００細胞に１細胞の割合でＧ
ＣＭ００１培地中で増殖しうる細胞が取得できることが
確認できた。
においてはほとんど全ウェル（９０％）において、１０
細胞／ウェルでは約１０％のウェルにおいて、１細胞／
ウェルでは約１％のウェルにおいて細胞の増殖が観察さ
れた。このことから、約１００細胞に１細胞の割合でＧ
ＣＭ００１培地中で増殖しうる細胞が取得できることが
確認できた。
【００７４】(3) 血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞の増
殖 上記(2) の方法で取得した血清非要求性ＣＨＯ dhfr-
細胞を１０cmディッシュまでスケールアップし、初濃度
２×１０5 細胞／ml（２ml）で６ウェルプレートに植え
込み、２、４、６日目の細胞数をマイクロセルカウンタ
ー(Sysmex F300,(株）日本医化器械製作所）で計測し
た。細胞のクローンにより多少の差が認められたが、概
ね倍加時間は１〜２日で、最も良好な増殖性を示した。
クローンの培養開始後、２〜４日の間の平均倍加時間は
1.１日となった。また、増殖飽和時間の細胞密度は２×
１０6 細胞／ml以上であった。こうして取得した血清非
要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞（寄託番号ＩＦＯ ５０３２
９、菌株名ＧＡＵ−３２）を用いて形質転換を行った。
殖 上記(2) の方法で取得した血清非要求性ＣＨＯ dhfr-
細胞を１０cmディッシュまでスケールアップし、初濃度
２×１０5 細胞／ml（２ml）で６ウェルプレートに植え
込み、２、４、６日目の細胞数をマイクロセルカウンタ
ー(Sysmex F300,(株）日本医化器械製作所）で計測し
た。細胞のクローンにより多少の差が認められたが、概
ね倍加時間は１〜２日で、最も良好な増殖性を示した。
クローンの培養開始後、２〜４日の間の平均倍加時間は
1.１日となった。また、増殖飽和時間の細胞密度は２×
１０6 細胞／ml以上であった。こうして取得した血清非
要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞（寄託番号ＩＦＯ ５０３２
９、菌株名ＧＡＵ−３２）を用いて形質転換を行った。
【００７５】 ＤＮＡ導入とトランスフェクタントの
選択 使用プラスミド ｐＴＴ０９：Ａｓｎ24−ＰＰＡ発現ユニットとＤＨＦＲ
発現ユニットを有する（特願平３−９３１０５号明細書
参照）。ｐＳＶ−Ｇｌ−ｎｅｏ：選択マーカーとしてＧ
４１８耐性を与える（特開昭６０−１８０５９１号公報
参照）。ＧＣＭ００１培地で継代中で、対数増殖期にあ
る上記細胞を遠心洗浄後、１０7 細胞／mlとなるようHa
nks 液に懸濁した。この懸濁液0.５ml，５×１０6 個の
細胞に５μｇのｐＴＴ０９及び0.０５μｇのｐＳＶ−Ｇ
ｌ−ｎｅｏをエレクトロポレーション法によりCo-trans
fectした。この細胞を５枚の４８ウェルプレートに播
き、２日間、ＧＣＭ００１培地で培養した。その後、選
択培地である４００μｇ／mlのＧ４１８（シグマ社製，
ジェネティシン）を含むＧＣＭ００１培地で３日毎に培
地交換を行った。細胞増殖の見られた各ウェルの培養上
清中のＰＡ活性を測定し、高い活性を与えたいくつかの
細胞を、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。
選択 使用プラスミド ｐＴＴ０９：Ａｓｎ24−ＰＰＡ発現ユニットとＤＨＦＲ
発現ユニットを有する（特願平３−９３１０５号明細書
参照）。ｐＳＶ−Ｇｌ−ｎｅｏ：選択マーカーとしてＧ
４１８耐性を与える（特開昭６０−１８０５９１号公報
参照）。ＧＣＭ００１培地で継代中で、対数増殖期にあ
る上記細胞を遠心洗浄後、１０7 細胞／mlとなるようHa
nks 液に懸濁した。この懸濁液0.５ml，５×１０6 個の
細胞に５μｇのｐＴＴ０９及び0.０５μｇのｐＳＶ−Ｇ
ｌ−ｎｅｏをエレクトロポレーション法によりCo-trans
fectした。この細胞を５枚の４８ウェルプレートに播
き、２日間、ＧＣＭ００１培地で培養した。その後、選
択培地である４００μｇ／mlのＧ４１８（シグマ社製，
ジェネティシン）を含むＧＣＭ００１培地で３日毎に培
地交換を行った。細胞増殖の見られた各ウェルの培養上
清中のＰＡ活性を測定し、高い活性を与えたいくつかの
細胞を、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。
【００７６】 ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 メトトレキセート（ＭＴＸ） シグマ社製（＋）Amethopterinを0.１４Ｍ塩化ナトリウ
ム、0.０２Ｍ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク）に溶解
し、２ｍＭストック液を調製した。これを培地に、目的
の濃度になるように添加し使用した。上記で得られた
Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞のＭＴＸによるＤＮＡ増幅に
は、チミジンとヒポキサンチンを除いたＧＣＭ００１培
地（増幅培地）にＭＴＸを加えて行った。増幅培地を用
いて細胞を１０4 細胞／mlの濃度で１０cm径の培養用デ
ィッシュ(Falcon, 3003)に１０ml植え込み終濃度１０ｎ
ＭのＭＴＸを添加し、遺伝子増幅を開始した。培養３−
４日でかなりの細胞が死滅するが、３日毎に培地交換を
続けていると細胞の成長が見られた。２−４週間で充分
な細胞数になるので、次に二倍の濃度のＭＴＸを含む増
幅培地に継代した。このように１０ｎＭのＭＴＸ濃度か
らスタートして順次、ＭＴＸ濃度を上げていった。
ム、0.０２Ｍ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク）に溶解
し、２ｍＭストック液を調製した。これを培地に、目的
の濃度になるように添加し使用した。上記で得られた
Ａｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞のＭＴＸによるＤＮＡ増幅に
は、チミジンとヒポキサンチンを除いたＧＣＭ００１培
地（増幅培地）にＭＴＸを加えて行った。増幅培地を用
いて細胞を１０4 細胞／mlの濃度で１０cm径の培養用デ
ィッシュ(Falcon, 3003)に１０ml植え込み終濃度１０ｎ
ＭのＭＴＸを添加し、遺伝子増幅を開始した。培養３−
４日でかなりの細胞が死滅するが、３日毎に培地交換を
続けていると細胞の成長が見られた。２−４週間で充分
な細胞数になるので、次に二倍の濃度のＭＴＸを含む増
幅培地に継代した。このように１０ｎＭのＭＴＸ濃度か
らスタートして順次、ＭＴＸ濃度を上げていった。
【００７７】 培養上清中のＰＡ活性測定 各濃度のＭＴＸ耐性細胞の培養上清中のＡｓｎ24−ＰＰ
Ａの活性測定は、フィブリン平板法により行った。ＭＴ
Ｘを含まないＧＣＭ００１培地に１０6 細胞／mlの濃度
で細胞を培養用ディッシュ（１０cm径）に１０ml播き、
４８時間培養した。培養後、遠心分離により細胞を除い
た上清をＰＡ活性の測定に供した。測定の標準品として
Urokinase reference standard（株式会社ミドリ十字社
製, Lot.S-004)を用いた。
Ａの活性測定は、フィブリン平板法により行った。ＭＴ
Ｘを含まないＧＣＭ００１培地に１０6 細胞／mlの濃度
で細胞を培養用ディッシュ（１０cm径）に１０ml播き、
４８時間培養した。培養後、遠心分離により細胞を除い
た上清をＰＡ活性の測定に供した。測定の標準品として
Urokinase reference standard（株式会社ミドリ十字社
製, Lot.S-004)を用いた。
【００７８】 結果 ｐＴＴ０９とｐＳＶ−Ｇｌ−ｎｅｏをトランスフェクト
した上記細胞より１１ウェルで細胞の増殖が見られた。
これら１１ウェルの培養上清中のＰＡ活性をフィブリン
平板法で測定したところ、８ウェルでＰＡ活性が認めら
れた。これらのＡｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞をスケールア
ップし、ＭＴＸにより遺伝子増幅をかけ、Ａｓｎ24−Ｐ
ＰＡ産生量の増加をはかった。その結果を表７に示す。
１０ｎＭのＭＴＸ処理後、Ｅ２−Ｂ細胞は９２ IU/mlと
ＰＡ活性の上昇を示した。その後も、ＭＴＸ濃度の増加
と共にＡｓｎ24−ＰＰＡ産生量も増大し、１μＭ ＭＴ
Ｘ耐性で２６８ IU/mlのＰＡ活性を示すようになった。
これらの結果は、上記細胞を用いることにより遺伝子導
入と遺伝子増幅までのすべてを無血清培地で行える事を
示すものであり、いままでに報告を見ない動物細胞への
画期的な遺伝子導入系と考えられる。
した上記細胞より１１ウェルで細胞の増殖が見られた。
これら１１ウェルの培養上清中のＰＡ活性をフィブリン
平板法で測定したところ、８ウェルでＰＡ活性が認めら
れた。これらのＡｓｎ24−ＰＰＡ産生細胞をスケールア
ップし、ＭＴＸにより遺伝子増幅をかけ、Ａｓｎ24−Ｐ
ＰＡ産生量の増加をはかった。その結果を表７に示す。
１０ｎＭのＭＴＸ処理後、Ｅ２−Ｂ細胞は９２ IU/mlと
ＰＡ活性の上昇を示した。その後も、ＭＴＸ濃度の増加
と共にＡｓｎ24−ＰＰＡ産生量も増大し、１μＭ ＭＴ
Ｘ耐性で２６８ IU/mlのＰＡ活性を示すようになった。
これらの結果は、上記細胞を用いることにより遺伝子導
入と遺伝子増幅までのすべてを無血清培地で行える事を
示すものであり、いままでに報告を見ない動物細胞への
画期的な遺伝子導入系と考えられる。
【００７９】
【表７】
【００８０】ａ）ＭＴＸ（μＭ）
【００８１】
【発明の効果】本発明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細
胞の形質転換体は、無血清培養が可能な異種蛋白質産生
に有用な細胞であり、その蛋白質産生効率は、血清を必
要とするＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体のそれとほぼ
同等である。また、本来ＣＨＯdhfr- 細胞は、その成育
（増殖）に支持体を必要とする付着細胞であるが、本発
明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体は支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能である。従
って、本発明は遺伝子工学分野におけるＣＨＯdhfr- 細
胞の形質転換体を用いての異種蛋白質の大量生産に極め
て有用である。
胞の形質転換体は、無血清培養が可能な異種蛋白質産生
に有用な細胞であり、その蛋白質産生効率は、血清を必
要とするＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体のそれとほぼ
同等である。また、本来ＣＨＯdhfr- 細胞は、その成育
（増殖）に支持体を必要とする付着細胞であるが、本発
明の血清非要求性ＣＨＯ dhfr- 細胞の形質転換体は支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能である。従
って、本発明は遺伝子工学分野におけるＣＨＯdhfr- 細
胞の形質転換体を用いての異種蛋白質の大量生産に極め
て有用である。
【図１】ｐＴＹ００７を導入したＣＨＯ細胞におけるＡ
Ｔ−III 産生クローンの分布を示した図である。
Ｔ−III 産生クローンの分布を示した図である。
【図２】ｐＴＹ００７の制限酵素地図及び遺伝子の配置
を示した図である。
を示した図である。
１ ＳＶ４０起源エンハンサー／プロモーター ２ ヒトＡＴIII ｃＤＮＡ ３ ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポリア
デニレーションシグナル ４ ヒトウロキナーゼプロモーター ５ マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡ ６ ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポリア
デニレーションシグナル７ Ａｍｐr
デニレーションシグナル ４ ヒトウロキナーゼプロモーター ５ マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡ ６ ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポリア
デニレーションシグナル７ Ａｍｐr
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田辺 利住 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 宇野 修正 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭60−6190（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−273481（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．８, （1985）ｐ．275 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ
Claims (6)
- 【請求項１】 ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ
・ハムスターオバリー細胞を目的の構造遺伝子を含むＤ
ＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡとを導入することにより形質転換させた後、１０
〜１００００個／ｍｌの細胞密度で、インスリン、ペプ
トン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清
培地にて培養することを特徴とする、無血清培地で増殖
継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハ
ムスターオバリー細胞の形質転換体の製造方法。 - 【請求項２】 ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ
・ハムスターオバリー細胞を１０〜１００００個／ｍｌ
の細胞密度で、インスリン、ペプトン、トランスフェリ
ンおよびアルブミンを含む無血清培地にて順化させた
後、目的の構造遺伝子を含むＤＮＡとジヒドロ葉酸還元
酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡとを導入すること
により形質転換することを特徴とする、無血清培地で増
殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・
ハムスターオバリー細胞の形質転換体の製造方法。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の製造方法
により得られた無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉
酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞
の形質転換体。 - 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を無血清培地
で培養して異種蛋白質を発現させることを特徴とする異
種蛋白質の製造方法。 - 【請求項５】 形質転換が、ＳＶ４０プロモーター、目
的構造遺伝子およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡ添加配列を含む
ＤＮＡと、ウロキナーゼプロモーター、ジヒドロ葉酸還
元酵素をコードする遺伝子およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡ添
加配列を含むＤＮＡとを導入することにより行われ、か
つ目的の構造遺伝子がプロウロキナーゼ遺伝子またはア
ンチトロンビン−ＩＩＩ遺伝子である、請求項１記載の
製造方法。 - 【請求項６】 形質転換が、ＳＶ４０プロモーター、目
的構造遺伝子およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡ添加配列を含む
ＤＮＡと、ウロキナーゼプロモーター、ジヒドロ葉酸還
元酵素をコードする遺伝子およびＳＶ４０ｐｏｌｙＡ添
加配列を含むＤ ＮＡとを導入することにより行われ、か
つ目的の構造遺伝子がプロウロキナーゼ遺伝子またはア
ンチトロンビン−ＩＩＩ遺伝子である、請求項２記載の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15244991A JP3265587B2 (ja) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15244991A JP3265587B2 (ja) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349880A JPH04349880A (ja) | 1992-12-04 |
| JP3265587B2 true JP3265587B2 (ja) | 2002-03-11 |
Family
ID=15540770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15244991A Expired - Fee Related JP3265587B2 (ja) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3265587B2 (ja) |
-
1991
- 1991-05-27 JP JP15244991A patent/JP3265587B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．８，（１９８５）ｐ．２７５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04349880A (ja) | 1992-12-04 |
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