JPWO2015099124A1 - 組換えフィブリノゲン高産生株及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現する動物細胞株である、組換えフィブリノゲン高産生株、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入し、該動物細胞中でフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現させることを含む、組換えフィブリノゲン高産生株の製造方法、並びに組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収することを含む、組換えフィブリノゲンの製造方法を提供する。

Description

本発明は、組換えフィブリノゲン高産生株及びその製造方法、並びに該産生株を用いた組換えフィブリノゲンの製造方法に関する。より詳細には、フィブリノゲン並びにα２プラスミンインヒビター（以下、α２ＰＩとも称す）及び／又はプラスミノーゲンアクチベータインヒビター２（以下、ＰＡＩ−２とも称す）を共発現する動物細胞株である、組換えフィブリノゲン高産生株、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入し、該動物細胞中でフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現させることを含む、組換えフィブリノゲン高産生株の製造方法、並びに組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収することを含む、組換えフィブリノゲンの製造方法に関する。

フィブリノゲンは、主に肝（実質）細胞により産生される血漿糖タンパク質の一つであって、Ａα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖と称される３種の異なるポリペプチド鎖を各２本ずつ、計６本有する巨大糖タンパク質である。各ポリペプチド鎖の分子量は、Ａα鎖が約６７，０００、Ｂβ鎖が約５６，０００、γ鎖が約４７，５００であり、ジスルフィド結合によってこれらが会合した完全なフィブリノゲン分子の分子量は、約３４０，０００にも達する（特許文献１）。

フィブリノゲンは、正常血漿中に２〜３ｇ／Ｌ存在し、組織が損傷した場合に血小板の傷口への粘着に引き続いて血液のゲル化を引き起こし、生体の防御・止血機能を果たす重要なタンパク質である。それゆえ、大量出血や重度の感染症などによって血液中のフィブリノゲン量が低下すると、止血機序が破綻して出血が抑制できず、すなわち出血傾向を来し、生命の危機をも引き起こすこととなる。

フィブリノゲン製剤は、静脈投与などを介して血液中のフィブリノゲン濃度を高めることにより重篤な出血を阻止するのに効果的であり、先天性及び後天性フィブリノゲン欠損症などの補充療法に広く適用されている。また、フィブリノゲンは、フィブリノゲン糊の主成分として、外科手術時における組織の接着・閉鎖のためにも広く使用されている。

現在、医薬品として用いられているフィブリノゲンは、主に、不特定多数（数千人以上）の供血者から集めたヒトプール血漿から調製されており、ＨＣＶなどの肝炎ウイルス、ＨＩＶなどの免疫不全ウイルス、異常プリオンなどの感染性病原体混入の危険性を排除するために、例えば、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）／ポリソルベート８０処理、ウイルス除去膜によるろ過処理、加熱処理など、様々な病原体不活化・除去方法が施されている。しかし、いかに安全対策を講じたとしても、血液を原料とすることに由来する感染症伝播のリスクを完全に排除することはできない。それゆえ、ヒトプール血漿に由来するフィブリノゲン製剤の使用にあたっては、その効果と感染症伝播等のリスクとを考量し、必要であるかを十分に検討した上で、必要最小限の量しか使用できず、投与後においても十分な経過観察が必要とされる。さらに、ヒトプール血漿は、主に献血によって供給されているため、フィブリノゲンの将来的な安定供給についても問題視されている。

これらの問題を解決するために、遺伝子組換え技術を利用したフィブリノゲンの製造が試みられている。しかし、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アルブミンなどの血漿タンパク質が組換え医薬品として上市されているのに対し、フィブリノゲンについては、未だ組換え医薬品として上市されているものはない。

開発が進まない原因の一つとして、フィブリノゲンは、６本のポリペプチド鎖が会合した巨大タンパク質分子であるために、大腸菌においては、フィブリノゲンＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖の３つのタンパク質を同時に発現させたとしても、機能的なフィブリノゲン分子を産生することが難しく、酵母及び動物細胞においては、機能的なフィブリノゲン分子を産生することはできるものの十分な産生量を得ることができず、製造コストの面から実用化に至っていないことが挙げられる（非特許文献１、特許文献１及び２）。

また、他の原因として、フィブリノゲンを動物細胞で発現させて培養した場合に、培養後期にフィブリノゲン分解が著しく進行することが挙げられる。一般に、培養細胞は、遅滞期、対数増殖期、定常期、死滅期の順に増殖し、培養細胞数と組換えタンパク質産生量とは相関関係にある。従って、組換えタンパク質の産生を行う場合には、培養細胞数がピークになる定常期、すなわち培養後期の期間延長が、組換えタンパク質産生量の増大につながると考えられており、培養後期におけるフィブリノゲンの著しい分解は、フィブリノゲンを大量生産する上で致命的な問題であり、これにより、組換えフィブリノゲンの高品質・高収量での製造がより困難なものとなっている。

プラスミンは、フィブリノゲン及びフィブリノゲンから産生されるフィブリンを加水分解（線維素溶解：線溶）するセリンプロテアーゼであり、線溶系においては、プラスミノーゲンがプラスミノーゲンアクチベータにより限定分解されて酵素活性を有するプラスミンとなり、主にフィブリン血栓を溶解する働きを担う。
α２プラスミンインヒビター（α２ＰＩ）は、線溶系を司るプラスミンの主たる阻害因子であり、プラスミンと１：１の割合で特異的に結合して、プラスミン−α２ＰＩ複合体（ＰＩＣ）を形成し、速やかにプラスミン活性を失活させるタンパク質である。
プラスミノーゲンアクチベータインヒビター（ＰＡＩ）−１及びＰＡＩ−２は、いずれもセリンプロテアーゼインヒビタースーパーファミリー（ＳＥＲＰＩＮ）に属する生体内に存在するインヒビターであり、プラスミノーゲンアクチベータを阻害することにより、プラスミノーゲンからのプラスミンの生成を抑制するタンパク質である。ＰＡＩ−１が、正常血漿中に約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する一方、ＰＡＩ−２は、非妊娠血漿中において、通常、検出可能なレベルにないことが報告されている（非特許文献２）。

しかしながら、α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と、組換えフィブリノゲン産生細胞におけるフィブリノゲン産生量増強効果との関連については何ら報告されておらず、その効果については不明であった。

米国特許第６０３７４５７号明細書 特開２００４−１６０５５号公報

Ｂｉｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１０７（１９９３） Ｗｒｉｇｈｔ ＪＧ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ６９，２５３（１９８８）

現在、医薬品として用いられているフィブリノゲンは、主にヒトプール血漿から調製されているため、十分な安全性を確保できておらず、安定供給についても問題視されている。これらの問題を解決するために、遺伝子組換え技術によるフィブリノゲンの製造が試みられているが、未だ十分な産生量を得ることができず、製造コストの面から実用化には至っていない。

従って、本発明の目的は、感染性病原体混入の危険がなく安全なフィブリノゲンを安定して十分な産生量で供給することのできる、組換えフィブリノゲン高産生株及びその製造方法、並びに本発明の組換えフィブリノゲン高産生株を用いた組換えフィブリノゲンの製造方法を提供することである。

本発明者らは、上記目的に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、動物細胞において、フィブリノゲンをα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と共発現させることにより、一般にフィブリノゲン分解が進行する培養後期においてもフィブリノゲン分解を強力に抑制することができるばかりでなく、当該フィブリノゲン分解抑制効果とは独立してフィブリノゲン産生量を増大させることができ、これら相乗効果によって、組換えフィブリノゲン産生量が飛躍的に増大することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に関する。
［１］フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現する動物細胞株であることを特徴とする、組換えフィブリノゲン高産生株。
［２］フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２が、ヒトフィブリノゲン並びにヒトα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２であることを特徴とする、上記［１］記載の組換えフィブリノゲン高産生株。
［３］動物細胞株が、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする、上記［１］又は［２］に記載の組換えフィブリノゲン高産生株。
［４］フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入し、該動物細胞中でフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現させることを特徴とする、組換えフィブリノゲン高産生株の製造方法。
［５］フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子全てを有する単一の発現ベクターを用いて、フィブリノゲンを動物細胞に発現させることを特徴とする、上記［４］記載の方法。
［６］α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とを有する単一の発現ベクターを用いて、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２を動物細胞に発現させることを特徴とする、上記［４］又は［５］に記載の方法。
［７］フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子が、いずれもヒト遺伝子であることを特徴とする、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］動物細胞が、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の組換えフィブリノゲン高産生株又は上記［４］〜［８］のいずれかに記載の方法により得られる組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収することを含む、組換えフィブリノゲンの製造方法。

本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、一般にフィブリノゲン分解が進行する培養後期においてもフィブリノゲン分解を強力に抑制することにより、例えばフィブリノゲンのみを発現した場合に比べてＡα鎖の残存率を約２．５倍以上も増加させることができるばかりでなく、当該フィブリノゲン分解抑制効果とは独立してフィブリノゲン産生量を増大させることができるため、これら相乗効果によって、フィブリノゲンのみを発現させた細胞株と比較して、少なくとも約４倍以上のフィブリノゲン産生量を得ることができる。それゆえ、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株によれば、組換えフィブリノゲンを大量生産すること、ひいては実用的なレベルで組換えフィブリノゲンを製剤化することが可能となり、フィブリノゲンの市場への安定供給も確保できる。

さらに、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株により得られるフィブリノゲンは、遺伝子組換え技術によって製造されたものであるため、血液由来製剤特有の問題である感染性病原体混入の危険性を完全に排除することができ、十分な安全性を確保することができる。それゆえ、治療に十分な量のフィブリノゲンを長期に亘って安心・安全に使用することが可能となる。

図１は、フィブリノゲン発現ベクターｐＮＴ６０を示す図である。 図２は、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ｌａｃＺの発現ユニットの部位特異的変異を示す図である。 図３は、ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄの構築方法を示す図である。 図４は、α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄの構築方法を示す図である。 図５は、ｍ−ｐＥＥの構築方法を示す図である。 図６は、α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥの構築方法を示す図である。 図７は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を１０日間培養後、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２の発現をウエスタンブロットにより確認した図である。 図８は、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５並びに＃８及び＃６８における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現様式を示す図である。１反応当たり６７個の細胞を用いた。フィブリノゲンｍＲＮＡ発現量はフィブリノゲン発現ベクターｐＮＴ６０を１００ｐｇ／ｍＬから０．１ｐｇ／ｍＬまで１０倍希釈で４段階希釈したサンプルをコントロールとして、ｐＮＴ６０当たりの量として算出した。同様に、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２の発現量は発現ベクターα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄ（α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５）又はα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥ（α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８）当たりの量として算出した。各細胞間の値については、Ｔ２３３細胞におけるＧＡＰＤＨ発現量を１とした時の各細胞の値を算出し、その逆数で各サンプルの値を乗じて補正した。 図９は、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５における、フィブリノゲンの分解抑制を示す図である。図９Ａは、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を２日間、８日間及び１４日間培養後、培養上清を還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥし、泳動後のゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色液（フナコシ製、ＩＳＢ１Ｌ）で１５分間染色した図である。図９Ｂは、染色したゲルをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ−８００）でスキャンし、フィブリノゲンＡα鎖の変動を数値化した図である。ｐＦｂｇは血漿由来フィブリノゲン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４１５７６）を示す。ｐＦｂｇのγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖のＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す。 図１０は、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８における、フィブリノゲンの分解抑制を示す図である。フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３及び共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８をそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地に懸濁し、２０ｍＬを１２５ｍＬフラスコに播種して１２日間フラスコ振盪培養をした（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。４日目、８日目、１０日目及び１２日目の培養上清を解析した。図１０Ａは、５μＬの培養上清を還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥし、泳動後のゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色液（フナコシ製、ＩＳＢＩＬ）で１５分間染色した図である。図１０Ｂは、染色したゲルをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ−８００）でスキャンし、フィブリノゲンＡα鎖の変動を数値化した図である。付属ソフト「Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ」を用いてバンド体積（バンド濃度×面積）を計測した。ｐＦｂｇは血漿由来フィブリノゲン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４１５７６）を示す。ｐＦｂｇのγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖のＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す。 図１１は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を１４日間培養した後の培養上清中のプラスミン様プロテアーゼ活性を示す図である。フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の吸光度を１とした場合の共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５の吸光度を相対値として示す。 図１２は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を、フィブリノゲン分解抑制条件下で０〜１０日間培養した場合のフィブリノゲン産生量の経時変化を示す図である。 図１３は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８を、フィブリノゲン分解抑制条件下で０〜１０日間培養した場合の、生細胞数、細胞生存率及びフィブリノゲン産生量の経時変化を示す図である。 図１４は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を１０日間培養後、培養上清にα２ＰＩ、ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２をそれぞれ添加して３７℃で３日間静置した場合のフィブリノゲンＡα鎖の変動を数値化した図であり、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２添加によるフィブリノゲンの分解抑制効果を示す。培養１０日目のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３におけるγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖に対するＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す。

一実施態様において、本発明は、フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現する動物細胞株である、組換えフィブリノゲン高産生株を提供する。

本明細書において、「株」とは、「細胞株」と互換可能に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖又は維持された細胞を意味する。

本明細書において、「（共）発現する動物細胞株」とは、目的タンパク質をコードする遺伝子が動物細胞に導入されて発現している状態だけでなく、当該遺伝子が動物細胞のゲノムにインテグレートされて恒常的に目的タンパク質を発現している状態も包含する。

本明細書において、「遺伝子」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡには少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡが含まれ、ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡなどが含まれる。本明細書において、「遺伝子」とは、開始コドン及び終止コドンを含まない塩基配列を有する核酸断片でも、シグナル配列、非翻訳領域（ＵＴＲ）配列などを含んでもよい。好ましい実施態様において、「遺伝子」は、ｃＤＮＡである。

本明細書において、「フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現する動物細胞株」とは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入することによって得られる動物細胞株を意味する。

従って、別の実施態様において、本発明は、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入し、該動物細胞中でフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現させることを含む、組換えフィブリノゲン高産生株の製造方法を提供する。

本発明で用いられるフィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子としては、最終的に発現産物が機能的なフィブリノゲンを構成できる限り、それぞれ、その完全長の野生型フィブリノゲン鎖をコードする遺伝子のみならず、例えば、遺伝的多型、グリコシル化やリン酸化の違い、選択的スプライシングなどの天然に生じる変異体（例えば、αＥ鎖、γ’鎖など）、自体公知の方法により人工的に誘導される変異体など、任意の形態のフィブリノゲン鎖をコードする遺伝子も同様に使用することができる。また、フィブリノゲン遺伝子の動物種についても特に限定されず、任意の動物種のフィブリノゲン遺伝子を使用することができるが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトフィブリノゲンをコードする遺伝子が使用される。

本明細書において、「機能的なフィブリノゲン」とは、野生型フィブリノゲンが有する生理活性（例えば血液凝固能など）と定性的に同じ活性を有するフィブリノゲンを意味し、その活性の程度や分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

本発明で用いられるα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子としては、それぞれ、その完全長の野生型α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子のみならず、その発現産物が野生型α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と実質的に同質の活性を有する限り、例えば、天然に生じる変異体、人工的に誘導される変異体など、任意の形態のα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子も同様に使用することができる。また、α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２遺伝子の動物種についても特に限定されず、任意の動物種のα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２遺伝子を使用することができるが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子が使用される。

本明細書において、「野生型α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と実質的に同質の活性を有する」とは、野生型α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２が有する生理活性（例えば、α２ＰＩの場合にはプラスミン阻害活性、ＰＡＩ−２の場合にはプラスミノーゲンアクチベータ阻害活性など）と定性的に同じ活性を有することを意味し、その活性の程度や分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

好ましい実施態様において、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子は、いずれもヒト遺伝子である。

フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子は、自体公知の方法により取得することができ、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫなどの既存の遺伝子データベースを利用してＰＣＲ用プライマーを作製し、目的タンパク質が発現している適当な細胞や組織由来の全長ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得することができる。ＰＣＲ用プライマーは、ベクターへのサブクローニングを容易にするために、両端に適切な制限酵素切断部位の配列を有していてもよく、また、発現効率を高めるために５’末端側にＫＯＺＡＫ配列を有していてもよい。適当な細胞や組織由来の全長ｃＤＮＡは、自体公知の方法により、例えば、ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍＲＮＡを精製して、ｃＤＮＡに変換することにより得てもよく、又は市販のｃＤＮＡライブラリーを利用してもよい。

あるいは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子は、所望の遺伝子配列のみをコードするｃＤＮＡクローンとして購入することもでき、例えば、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２のｃＤＮＡは、いずれもＰｒｏｍｅｇａ社により市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＯＲＳ０９３８０（α２ＰＩ）及びＯＲＳ０８６４１（ＰＡＩ−２））。

本発明において、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子の動物細胞への導入は、発現ベクターを用いることによって実施される。動物細胞を宿主とする発現ベクターについては、特に限定されず、プラスミドベクター、ウイルスベクターなど、自体公知の発現ベクターを目的に応じて適宜選択することができる。

フィブリノゲン発現ベクターに含まれるプロモーターとしては、使用する宿主動物細胞において効率よく機能し、最終的に機能的なフィブリノゲンが得られる限り、特に限定されず、例えば、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、βアクチンプロモーターなどを挙げることができる。また、プロモーターを適当なエンハンサーと組み合わせてもよい。
フィブリノゲン発現ベクターに含まれてよい選択マーカー遺伝子については、特に限定されず、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）遺伝子など、自体公知の選択マーカー遺伝子を目的に応じて適宜選択することができる。

フィブリノゲン発現ベクターに含まれてよい他のベクター構成要素（例えば、ターミネーターなど）についても特に限定されず、自体公知のものを適宜利用することができる。

一実施態様において、本発明のフィブリノゲン発現ベクターは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子全てを有する単一の発現ベクターである。別の実施態様において、本発明のフィブリノゲン発現ベクターは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子のうち２つ（例えば、Ａα鎖及びγ鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖など）を有する発現ベクターと、残り１つを有する発現ベクターとからなる。別の実施態様において、本発明のフィブリノゲン発現ベクターは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を各々１つずつ有する、３つの発現ベクターからなる。フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子の構成比についても、特に制限されず、例えば、１：１：１〜６など、目的に応じて適宜選択することができる。２つ以上の発現ベクターを使用してフィブリノゲンを発現させる場合、各発現ベクターは、同時に動物細胞に導入しても、あるいは別々の時期に、例えば選択マーカーを変えて、順次導入してもよく、導入順序は特に制限されない。好ましい実施態様において、本発明のフィブリノゲン発現ベクターは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖をコードする遺伝子全てを１：１：１の構成比で有する単一の発現ベクターである。

フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子全てを有する単一の発現ベクターの好適な例としては、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子のそれぞれが別個のプロモーターの制御下にある３つの発現カセットを有するものを挙げることができる。各遺伝子の発現を制御するプロモーターは同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）が用いられる。例えば、Ｌｏｎｚａ製発現ベクターｐＥＥ１４．１の発現ユニットを３重連化したベクターに、自体公知の方法によりフィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖のｃＤＮＡを挿入した、ｐＮＴ６０（改変ＣＭＶプロモーター／ＧＳ遺伝子を有する発現ベクター）（図１を参照されたい）を挙げることができるが、これに限定されない。
あるいは、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子の２以上が単一のプロモーターの制御下にあってもよい。この場合、単一のプロモーターの制御下にある各遺伝子の間に、ポリシストロニックな発現を可能にする配列、例えば、ＩＲＥＳ配列や口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列等が挿入される。

α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２発現ベクターに含まれるプロモーターとしては、使用する宿主動物細胞において効率よく機能する限り、特に限定されず、例えば、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、βアクチンプロモーターなどを挙げることができる。また、プロモーターは、適当なエンハンサーと組み合わせてもよい。
α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２発現ベクターに含まれてよい選択マーカー遺伝子については、特に限定されず、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）遺伝子など、自体公知の選択マーカー遺伝子を目的に応じて適宜選択することができる。
α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２発現ベクターに含まれてよい他のベクター構成要素（例えば、ターミネーターなど）についても特に限定されず、自体公知のものを適宜利用することができる。

α２ＰＩとＰＡＩ−２を共に発現させる場合、本発明のα２ＰＩ及びＰＡＩ−２発現ベクターは、α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とを有する単一の発現ベクターであってよく、あるいはα２ＰＩをコードする遺伝子を有する発現ベクターと、ＰＡＩ−２をコードする遺伝子を有する発現ベクターとの組合せであってもよい。２つの発現ベクターを使用してα２ＰＩとＰＡＩ−２を発現させる場合には、各発現ベクターは、同時に動物細胞に導入しても、あるいは別々の時期に、例えば選択マーカーを変えて、順次導入してもよく、導入順序は特に制限されない。α２ＰＩとＰＡＩ−２の両方を発現させる場合には、α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とを有する単一の発現ベクターを使用することが好ましい。

α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とを有する単一の発現ベクターの好適な例としては、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２をコードする遺伝子のそれぞれが別個のプロモーターの制御下にある２つの発現カセットを有するものを挙げることができる。各遺伝子の発現を制御するプロモーターは同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）が用いられる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｋ８３００−０１）の発現ユニットを２重連化し、自体公知の方法によりα２ＰＩ及びＰＡＩ−２のｃＤＮＡを挿入した、α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＣＭＶプロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子を有する発現ベクター）（図４）や、Ｌｏｎｚａ製発現ベクターｐＥＥ（例、ｐＥＥ１６．４、ｐＥＥ２１．４など）の発現ユニットを２重連化し、自体公知の方法によりα２ＰＩ及びＰＡＩ−２のｃＤＮＡを挿入した、α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥ（ＣＭＶプロモーター／ピューロマイシン耐性遺伝子を有する発現ベクター）（図６）を挙げることができるが、これに限定されない。
あるいは、α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とが単一のプロモーターの制御下にあってもよい。この場合、単一のプロモーターの制御下にある各遺伝子の間に、ポリシストロニックな発現を可能にする配列、例えば、ＩＲＥＳ配列や口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列等が挿入される。

フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子の発現ベクターと、α２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子の発現ベクターの導入時期や導入の順序については、特に制限されず、フィブリノゲンとα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２とが同じ細胞内で共発現できる限り、同時に導入しても、あるいは別々の時期に、例えば選択マーカーを変えて、順次導入してもよい。

フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２の発現ベクターを導入する宿主動物細胞としては、特に限定されず、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞など、あらゆる動物細胞を利用することができ、目的に応じて適宜選択することができる。好ましい実施態様において、本発明の動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。別の好ましい実施態様において、本発明の動物細胞は、浮遊培養細胞である。さらに別の好ましい実施態様において、本発明の動物細胞は、無血清培地に馴化されている。

宿主動物細胞を形質転換する方法については、自体公知の方法を使用すればよく、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチンやリポフェクタミンなどのリポソームを用いる方法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを挙げることができるが、これらに限定されない。

選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に導入した場合、形質転換細胞の選択には、自体公知の選択方法を利用することができ、例えば、ＣＤ−ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ製）などの無血清培地、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（和光純薬工業製）などの血清培地に、選択用添加物質（例えば、選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子の場合はＧ−４１８、ｄｈｆｒ遺伝子の場合はメトトレキセート、ピューロマイシン耐性遺伝子の場合はピューロマイシンなど）を添加して培養することにより、容易に形質転換細胞を選択することができる。

形質転換細胞を選択後、例えば、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法（ＷＢ）などを利用して目的タンパク質の検出・発現量の測定を行ってもよい。また、目的タンパク質が何らかの活性を有するならば、その活性を直接測定することもできる。

一実施態様において、本発明は、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収することを含む、組換えフィブリノゲンの製造方法を提供する。

本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、一般にフィブリノゲン分解の著しい進行が認められる、細胞密度の高い培養後期においてもフィブリノゲン分解を強力に抑制することができるばかりでなく、当該フィブリノゲン分解抑制効果とは独立してフィブリノゲン産生量を増大させることができるため、これら相乗効果によって、組換えフィブリノゲンを大量に産生することができる。従って、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、バッチ培養法などの通常の培養法のほか、高密度細胞培養法、例えば、フェドバッチ培養法、パーフュージョン培養法など、自体公知の培養法を限定されることなく使用することができる。また、その他の培養条件、例えば、培地のｐＨ、培養温度なども特に限定されることなく、動物細胞の増殖やフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２の産生に適した培養条件を適宜採用してよい。さらに培地についても、特に限定されず、血清含有培地であっても、無血清培地であってもよい。無血清培地で培養した場合には、血清のロット差を気にせずに再現性のある安定したタンパク質産生が得られること、血清由来タンパク質成分が含まれないことによって産生物の精製が容易になることなどから、好ましい実施態様において、無血清培地が使用される。

本発明の組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収する方法としては、培養物からフィブリノゲンを回収できる限り、特に限定されず、例えば、エタノール分画、グリシン分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿など自体公知の方法を挙げることができる。

本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、感染性病原体混入の危険がなく安全なフィブリノゲンを安定して十分な産生量で供給することができる。従って、一実施態様において、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、先天性及び後天性フィブリノゲン欠損症などの補充療法に使用するためのフィブリノゲンの製造のために使用される。別の実施態様において、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、外科手術時における組織の接着・閉鎖のために使用されるフィブリノゲンを製造するために使用される。別の実施態様において、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、フィブリンシーラントに使用されるフィブリノゲンを製造するために使用される。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら制限するものではない。

（実施例１：フィブリノゲン発現細胞株の樹立）
Ｌｏｎｚａ製発現ベクターｐＥＥ１４．１の発現ユニットを３重連化したベクターに、下記表１に示すＰＣＲプライマーを使用してヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ製、９５０５）より増幅した、フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖、γ鎖のｃＤＮＡを挿入し、フィブリノゲン発現ベクターｐＮＴ６０（改変ＣＭＶプロモーター／ＧＳ遺伝子を有する発現ベクター）を構築した（図１）。Ｌｏｎｚａ社によって樹立されたＣＨＯ−Ｋ１細胞にｐＮＴ６０を導入し、動物成分不含培地（表３記載のＥＸ−ＣＥＬＬ３０２ＧＳ培地）で培養して、フィブリノゲンＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖を発現している細胞を選択した。次いで、フィブリノゲン産生能の高い形質転換細胞をさらに選択することにより、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を樹立し、フィブリノゲン産生の再現性を確認した。

上記方法により得られたフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を２Ｌジャー培養により大量培養したところ、組換えフィブリノゲンとその分解産物が合わせて１．８ｇ／Ｌ産生されたが、その半分以上が分解産物であった。次いで、分解産物を除去し、精製した組換えフィブリノゲンを用いてブタ皮膚接着力試験を行ったところ、組換えフィブリノゲンは血漿由来フィブリノゲンと同等の接着効果を示した。以上の結果から、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３が、安定して、天然型と同等の生理活性を有するフィブリノゲンを発現できることが確認された。

（実施例２：α２ＰＩ／ＰＡＩ−２発現ベクター（α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）の構築１）
α２ＰＩとＰＡＩ−２を動物細胞で発現させるためのベクターの構築にあたり、動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｋ８３００−０１）の発現ユニットの２重連化を行った。

具体的には、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ｌａｃＺと２種類のプライマー（ＢａｍＨＩ−Ｆｗ：ＣＣＣＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びＢａｍＨＩ−Ｒｖ：ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８））を用いて、部位特異的変異導入法（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、東洋紡製、ＳＭＫ−１０１）により、ＢｇｌＩＩをＢａｍＨＩに変更し、改変したベクターをｍ−ｐｃＤＮＡ３．３とした（図２）。

ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３のＣＭＶプロモーターとＴＫ ｐｏｌｙ（Ａ）との間にα２ＰＩ又はＰＡＩ−２のｃＤＮＡを各々挿入するために、部位特異的変異導入法（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、東洋紡製、ＳＭＫ−１０１）を用いて、ＰＣＲにより制限酵素認識配列を付加した。α２ＰＩ用ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３には、特異的プライマー（Ｂａｓｅ ＲＶ ＫＰＮ：ＧＣＴＧＧＴＡＣＣＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及びＢａｓｅ ＦＷ ＮＳＰＶ：ＡＡＴＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＧＧＴＴＡＧＴＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０））を用いてＣＭＶプロモーターの下流にＫｐｎＩ認識配列及びＮｓｐＶ認識配列を付加した。ＰＡＩ−２用ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３には、特異的プライマー（Ｂａｓｅ ＲＶ ＸＨＯ：ＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）及びＢａｓｅ ＦＷ ＨＩＮＤ：ＧＣＴＡＡＧＣＴＴＴＡＣＣＧＧＴＴＡＧＴＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２））を用いてＣＭＶプロモーターの下流にＸｈｏＩ認識配列及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を導入した。構築した発現ベクターをそれぞれＫｐｎＩ／ＮｓｐＶ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３及びＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３とした。次いで、ＫｐｎＩ／ＮｓｐＶ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３をＢｇｌＩＩ（タカラバイオ製、１０２１Ａ）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ製、１０１０Ａ）で消化し、予めＢｇｌＩＩで消化したｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に断片を挿入した。これにより作製されたベクターをＫｐｎＩ／ＮｓｐＶ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯとした。次いで、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで処理し、予めＢｇｌＩＩで消化したＫｐｎＩ／ＮｓｐＶ−ｍ−ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯに断片を挿入した。これをｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄとした（図３）。

ＰＡＩ−２のｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＯＲＳ０８６４１）を鋳型として、特異的プライマー（ＰＡＩ−２ Ｆ ＸＨＯ：ＡＡＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）及びＰＡＩ−２ ＲＶ ＨＩＮＤ：ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４））により、ＰＡＩ−２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）部分をＰＣＲ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡製、ＫＯＤ−２０１）増幅し、Ｋｏｚａｋ配列とＸｈｏＩ認識配列及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した。増幅断片及びｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄをＸｈｏＩ（タカラバイオ製、１０９４Ａ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製、１０６０Ａ）で消化した後、断片をｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入した。これにより作製されたベクターをＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄとした。

α２ＰＩのｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＯＲＳ０９３８０）を鋳型として、特異的プライマー（α２ＰＩ Ｆ ＫＰＮ：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）及びα２ＰＩ ＲＶ ＮＳＰ：ＣＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６））により、α２ＰＩのＯＲＦ部分をＰＣＲ増幅し、Ｋｏｚａｋ配列とＫｐｎＩ認識配列及びＮｓｐＶ認識配列を付加した。増幅断片及びＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄをＫｐｎＩ（タカラバイオ製、１０６８Ａ）及びＮｓｐＶ（タカラバイオ製、１２２５Ａ）で消化した後、断片をＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄとライゲーションした。これにより構築されたベクターをα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄとした（図４）。

構築されたα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄは、ＣＭＶプロモーターによって制御される２つの発現カセットを搭載し、それぞれ、α２ＰＩとＰＡＩ−２のＯＲＦが挿入されている。さらに、動物細胞において選択マーカーとして用いるネオマイシン耐性遺伝子が搭載されており、ＳＶ４０プロモーターの制御下に発現する。従って、Ｇ４１８を用いた選択により、恒常発現細胞株を構築することが可能である。

（実施例３：α２ＰＩ／ＰＡＩ−２発現ベクター（α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥ）の構築２）
α２ＰＩとＰＡＩ−２を動物細胞で発現させるためのベクターの構築にあたり、動物細胞用発現ベクターｐＥＥ（Ｌｏｎｚａ製）の発現ユニットの２重連化を行った。

具体的には、Ｌｏｎｚａ製ｐＥＥ１６．４とｐＥＥ２１．４を用いてベクターの改変を行った。ｐＥＥ２１．４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、２．９ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。ｐＥＥ１６．４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、６．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、これにｐＥＥ２１．４由来の上記ＤＮＡ断片を挿入した。改変したベクターをｍ−ｐＥＥとした（図５）。

ｍ−ｐＥＥのイントロンＡとｐｏｌｙ（Ａ）との間にα２ＰＩ又はＰＡＩ−２のｃＤＮＡを挿入するために、まずＰＡＩ−２のｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＯＲＳ０８６４１）を鋳型に特異的プライマー（ＰＡＩ−２ Ｆ ｈｉｎｄ：ＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＡＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）及びＰＡＩ−２ ＲＶ ｎｓｐ：ＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０））でＯＲＦ部分をＰＣＲ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡製、ＫＯＤ−２０１）増幅し、Ｋｏｚａｋ配列とＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＮｓｐＶ認識配列を付加した。増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製、１０６０Ａ）及びＢｓｐＴ１０４Ｉ（タカラバイオ製、１２２５Ａ）消化した後、ｍ−ｐＥＥのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｓｐＶ間に挿入した。これにより作製されたベクターをＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥとした。

次に、α２ＰＩのｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＯＲＳ０９３８０）を鋳型に特異的プライマー（ａ２ＰＩ Ｆ ｘｈｏ：ＡＡＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及びａ２ＰＩ ＲＶ ｋｐｎ：ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８））でＯＲＦ部分をＰＣＲにより増幅し、Ｋｏｚａｋ配列とＸｈｏＩ認識配列及びＫｐｎＩ認識配列を付加した。増幅断片をＸｈｏＩ（タカラバイオ製、１０９４Ａ）及びＫｐｎＩ（タカラバイオ製、１０６８Ａ）消化した後、ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥとライゲーションした。これにより構築されたベクターをα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥとした（図６）。下記表２に、本実施例で使用したＰＣＲプライマーの配列を示す。

構築されたα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥはＣＭＶプロモーターによって制御される２つの発現カセットを搭載し、それぞれ、α２ＰＩとＰＡＩ−２のＯＲＦが挿入されている。さらに動物細胞において選択マーカーとして用いるピューロマイシン耐性遺伝子が搭載されており、ＳＶ４０プロモーターの制御下に発現する。従って、ピューロマイシンを用いた選択により、恒常発現細胞株を構築することが可能である。

（実施例４：フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及びＰＡＩ−２共発現細胞株の樹立）
実施例１で得られたフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ製、ＳＨ３０８８）含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（和光純薬工業製、０４８−２９７８５）に０．５〜２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁後、６ウェルプレートに１ウェル当たり２ｍＬずつ播種した。次いで、３７℃、５％ＣＯ_２下で約１６時間インキュベートした。新鮮培地１ｍＬに交換した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１６６８）を用いて、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２遺伝子の導入を行った。具体的には、ＳｃａＩ（タカラバイオ製、１０８４４）消化により直鎖状にしたα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄ（４．０μｇ）又はα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥ（４．０μｇ）を８０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、３１９８５−０７０）に溶解したＡ液と、４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を８０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに添加したＢ液をそれぞれ室温で５分間静置した後、Ａ液とＢ液とを混合して室温で２０分間静置した。混合液を１ウェル当たり１６０μＬずつウェルに添加して３７℃、５％ＣＯ_２下で１６〜２４時間インキュベートした。α２ＰＩ及びＰＡＩ−２遺伝子を導入したフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３をＰＢＳ（−）で洗浄した後、トリプシン処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１２６０４）を行い、細胞を回収した。
α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄを用いてα２ＰＩ及びＰＡＩ−２遺伝子を導入したフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３については、８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４５８１２）を添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地に細胞を懸濁し、１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度で細胞を９６ウェルプレートに播種した。約２週間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）後、Ｇ４１８耐性細胞株を選択した（共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５）。
α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いてα２ＰＩ及びＰＡＩ−２遺伝子を導入したフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３については、１０μｇ/ｍＬのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製、ａｎｔ−ｐｒ−１）を添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地に細胞を懸濁し、１×１０^２ｃｅｌｌｓ／ウェル、１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ウェル、１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度で細胞を９６ウェルプレートに播種した。約２週間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）後、ピューロマイシン耐性細胞株を選択した（共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８）。

（実施例５：α２ＰＩ、ＰＡＩ−２及びフィブリノゲンＡα、Ｂβ、γ鎖の発現の確認）
１．α２ＰＩ及びＰＡＩ−２のタンパク質発現の確認
フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３及び共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５をＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地（表３）にそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに５ｍＬ播種して１０日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。１０μＬの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、泳動後のゲルをiＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、ＩＢ１００１）を用いてニトロセルロースフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、ＩＢ３０１００１）に転写した。フィルターをブロッキングバッファー（３％スキムミルク（ナカライテスク製）含有ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０））で３０分間ブロッキングした後、ブロッキングバッファーでそれぞれ２００倍希釈した抗α２ＰＩ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製、ＳＣ−７３６５８）又は抗ＰＡＩ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製、ＳＣ−２５７４５）を添加し、室温で２時間インキュベートした。フィルターを０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳで１０分間、３回洗浄した後、抗α２ＰＩ抗体処理フィルターについては、ブロッキングバッファーで１０，０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ［Ｈ＋Ｌ］（マウス）−ＨＲＰ複合体（ナカライテスク製、０１８０３−４４）を添加し、抗ＰＡＩ−２抗体処理フィルターについては、ブロッキングバッファーで１０，０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ［Ｈ＋Ｌ］（ヤギ）−ＨＲＰ複合体（ナカライテスク製、０１８２７−４４）を添加し、それぞれ室温で１時間インキュベートした。フィルターを０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳで１０分間、３回洗浄した後、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ製、３４０７５）を用いて、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２の発現を検出した。

その結果、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５の培養上清中に、遺伝子導入したα２ＰＩ及びＰＡＩ−２の発現がそれぞれ確認された（図７）。ＰＡＩ−２については、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３においても宿主動物細胞（ＣＨＯ細胞）由来のＰＡＩ−２が発現していたが、ＰＡＩ−２遺伝子の導入によって発現量が増加していることが確認された。

２．α２ＰＩ、ＰＡＩ−２及びフィブリノゲンＡα、Ｂβ、γ鎖のｍＲＮＡ発現の確認
フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びにα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄを用いて樹立した共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５及びα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いて樹立した共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８をＢａｔｃｈ培地（表３）にそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに２０ｍＬ播種して６日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養した細胞中のｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲにより測定し、導入遺伝子が発現しているかどうかを確認した。

ＲＮＡの抽出及び逆転写反応は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴＴＭ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製、４３９９００２）を用いて付属プロトコルに従って以下のように行った。培養６日目の細胞を冷ＰＢＳ（−）で洗浄後、２．０×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬになるように冷ＰＢＳ（−）調製した。マイクロチューブに細胞懸濁液を５μＬ分取し、０．５μＬのＤＮａｓｅＩを含むＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ添加した。反応液をピペッティング後、室温で５分間インキュベートした。Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５μＬを添加し、室温で２分間インキュベートし、ＲＮＡ抽出液を調製した。４０μＬのＲＴ ｍａｓｔｅｒ ＭＩＸ（２×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ２５μＬ、２０×ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ ＭＩＸ ２．５μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １２．５μＬ）と１０μＬのＲＮＡ抽出液を混合し、逆転写反応（３７℃で３０分間インキュベート後、９５℃で５分間インキュベート）を行った。

定量ＰＣＲはＨＲＭリアルタイムＰＣＲ解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、１８５−５１９６−Ｊ４ＣＡＭ）を用いて、逆転写したＤＮＡ量を測定した。具体的には、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ製、４３０４４３７）とＴａｑＭａｎ Ｐｒｉｍｅｒ ＆ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ（×２０）（表４）を用い、付属プロトコルに従って以下のように行った。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ ＆ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ １μＬ、逆転写反応液２μＬ、滅菌蒸留水７μＬを混合した。ＰＣＲ反応は、５０℃、２分間のインキュベートと、それに続く９５℃、１０分間のインキュベートによる前処理後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返した。

培養６日目のｍＲＮＡの発現量は、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３細胞においてはα２ＰＩとＰＡＩ−２の発現が検出されないのに対して、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５、＃８及び＃６８では共に明確な発現が検出され、導入した発現ベクターが機能していることが明らかになった（図８）。α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いて樹立した共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８ではα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄを用いて樹立した共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５に比べ、ＰＡＩ−２ ｍＲＮＡ量が約１０倍多く検出され、ベクターによる発現量の違いが確認された。α２ＰＩのｍＲＮＡ量に関しては、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８と共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５は同等の発現が認められたが、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃６８では発現量は１／１０であり、細胞株間で発現量の違いが認められた。一方、フィブリノゲンについては、Ａα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖の発現がすべての細胞株で確認された。発現量はフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３細胞と共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃１５、＃８及び＃６８との間で差は認められなかった（図８）。

（実施例６：培養中におけるフィブリノゲンＡα鎖の分解抑制）
一般に、培養細胞は、遅滞期、対数増殖期、定常期、死滅期の順で増殖し、培養細胞数と組換えタンパク質産生量とは相関関係にある。従って、組換えタンパク質の産生を行う場合には、培養細胞数がピークになる定常期、すなわち培養後期の期間延長が、組換えタンパク質産生量の増大につながると考えられており、細胞密度の高い培養後期におけるフィブリノゲン分解の進行は、フィブリノゲンを大量生産する上で致命的な問題となる。そこで、細胞密度の高い培養条件下において、フィブリノゲン分解を抑制することができるかを調べた。

１．α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄを用いて樹立した共発現細胞株におけるフィブリノゲンＡα鎖の分解抑制
Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地（表３）にフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５をそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの高細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに５ｍＬ播種して２週間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養２日目、８日目及び１４日目における培養上清１０μＬを還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、泳動後のゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色液（フナコシ製、ＩＳＢ１Ｌ）で１５分間染色した。フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の培養上清中のフィブリノゲンは、フィブリノゲンＢβ鎖（５６ｋＤａ）及びγ鎖（４８ｋＤａ）に比べて、Ａα鎖（６７ｋＤａ）の割合が培養日数と共に低くなっており、培養期間が長くなるにつれてフィブリノゲンＡα鎖の分解が進行することが明らかとなった（図９Ａ）。一方、フィブリノゲンγ鎖は培養期間の多寡に関わらず殆ど分解されないことから、染色したゲルをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ−８００）でスキャンし、γ鎖に対するＡα鎖の変動を数値化した。具体的には、付属ソフト「Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ」を用いて、Ａα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖のバンド体積（バンド濃度×面積）をそれぞれ測定し、Ａα鎖のバンド体積をγ鎖のバンド体積で除算してＡα鎖の比を算出した（分子量：Ａα鎖６７ｋＤ、γ鎖４８ｋＤ）。各ゲルにおいてコントロールとして同時に泳動した血漿由来フィブリノゲン（ｐＦｂｇ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４１５７６）のγ鎖に対するＡα鎖の比を分解の指標とした。ｐＦｂｇのγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖に対するＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す（図９Ｂ）。

その結果、培養２日目においては、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５のＡα鎖残存率はいずれも、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率と同等であり、全ての細胞株においてフィブリノゲンＡα鎖の分解は認められなかった。しかし、培養８日目になると、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率が、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率に対して半分以下（４７％）にまで低下し、フィブリノゲンＡα鎖の著しい分解が認められたのに対し、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５のＡα鎖残存率は、培養２日目と同様、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率に対して同程度以上（９７〜１０６％）を維持しており、フィブリノゲンＡα鎖の分解は殆ど認められなかった。さらに、培養１４日目では、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率が、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率に対して約１／３（３３％）にまで低下し、培養８日目よりもさらにフィブリノゲンＡα鎖の分解が進行していたのに対し、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５のＡα鎖残存率は、培養８日目（９７〜１０６％）と比較すればわずかに低下（８０〜８５％）しているものの、依然として高いＡα鎖残存率を維持しており、これは、同条件のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率（３３％）と比較して、約２．５倍以上のＡα鎖残存率であった（図９Ｂ）。

以上の結果から、一般にフィブリノゲン分解の著しい進行が認められる、細胞密度の高い培養後期においても、フィブリノゲンをα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と共発現させることにより、フィブリノゲン単独で発現させた場合と比較して、培養中のフィブリノゲンＡα鎖の分解を強力に抑制することにより、フィブリノゲンのみを発現した場合に比べＡα鎖の残存率を約２．５倍以上増加させることが明らかになった。

２．α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いて樹立した共発現細胞株におけるフィブリノゲンＡα鎖の分解抑制
α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄとは異なる発現ベクターα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いて樹立した共発現細胞株についても、細胞密度の高い培養条件下において、フィブリノゲン分解を抑制することができるかを調べた。

上記実施例６の１．に記載の方法と同様に、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地（表３）にフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８をそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの高細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに２０ｍＬ播種して１２日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養４日目、８日目、１０日目及び１２日目における培養上清５μＬを還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、泳動後のゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ染色液（フナコシ製、ＩＳＢ１Ｌ）で１５分間染色した。その結果、上記１．の結果と同様に、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の培養上清中のフィブリノゲンは、フィブリノゲンＢβ鎖（５６ｋＤａ）及びγ鎖（４８ｋＤａ）に比べて、Ａα鎖（６７ｋＤａ）の割合が培養日数と共に低くなっており、培養期間が長くなるにつれてフィブリノゲンＡα鎖の分解が進行することが明らかとなった（図１０Ａ）。一方、フィブリノゲンγ鎖は培養期間の多寡に関わらず殆ど分解されないことから、染色したゲルをデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ−８００）でスキャンし、γ鎖に対するＡα鎖の変動を数値化した。具体的には、付属ソフト「Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ」を用いて、Ａα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖のバンド体積（バンド濃度×面積）をそれぞれ測定し、Ａα鎖のバンド体積をγ鎖のバンド体積で除算してＡα鎖の比を算出した。各ゲルにおいてコントロールとして同時に泳動した血漿由来フィブリノゲン（ｐＦｂｇ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４１５７６）のγ鎖に対するＡα鎖の比を分解の指標とした。ｐＦｂｇのγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖に対するＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す（図１０Ｂ）。

その結果、培養４日目及び８日目においては、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８のＡα鎖残存率はいずれも約８０％以上であり、全ての細胞株においてフィブリノゲンＡα鎖の分解はほとんど認められなかった。しかし、培養１０日目になると、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率が、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率に対して半分以下（４０％）にまで低下し、フィブリノゲンＡα鎖の著しい分解が認められたのに対し、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８のＡα鎖残存率は、コントロールｐＦｂｇのＡα鎖残存率に対して同程度以上（１００％以上）を維持しており、フィブリノゲンＡα鎖の分解は認められなかった。これは、同条件のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率と比較して、約２．５倍以上のＡα鎖残存率であった（図１０Ｂ）。

以上のα２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｍ−ｐＥＥを用いて樹立した共発現細胞株におけるフィブリノゲン分解抑制効果は、α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／ｐｃＤＮＡ３．３−ｍｏｄｉｆｉｅｄを用いて樹立した共発現細胞株における効果と一致した。

フィブリノゲンをα２ＰＩ及びＰＡＩ−２とともに共発現させると、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２遺伝子導入ベクターの相違により、或いは得られた細胞株の相違により、α２ＰＩ又はＰＡＩ−２のｍＲＮＡ発現量に差異が認められた（実施例５）。それにも関わらず、共発現細胞株におけるフィブリノゲンＡα鎖の残存率は、いずれのベクターを用いた場合であっても、またいずれの細胞株においても、同条件のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のＡα鎖残存率と比較して、同程度に高い（いずれも約２．５倍）ものであった。
これらの結果は、共発現細胞株におけるフィブリノゲンＡα鎖の分解抑制効果は、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２のｍＲＮＡ発現量の多寡に依らず、また発現ベクターや細胞株が異なっても有意な影響を受けないことを示している。

（実施例７：培養上清中のプラスミン様プロテアーゼ活性の抑制）
フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を実施例６と同一条件下で培養し、培養１４日目における培養上清中のプラスミン様活性をテストチーム（登録商標）ＰＬＧ・２キット（積水メディカル製、４３９−９０９１）を用いて測定した。具体的には、培養上清５０μＬと、プラスミンに対する発色性合成基質Ｓ−２２５１（プラスミン様活性物質に対して高特異性）５０μＬとを混合し、３７℃で２４時間静置した。反応停止液１ｍＬを添加後、分光光度計にて波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の吸光度を１とした場合の、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５の吸光度を相対値として示す（図１１）。

その結果、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の吸光度に対する、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５の相対的吸光度は、それぞれ０．５及び０．２となり、培養上清中のプラスミン様プロテアーゼ活性が、少なくとも半分以下にまで抑制されていることが明らかとなった。

共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５では、一般にフィブリノゲン分解の著しい進行が認められる、細胞密度の高い培養後期においても、フィブリノゲンＡα鎖の分解が強力に抑制されており（図９）、またプラスミン様活性も抑制されている（図１１）。従って、培養上清中に存在するプラスミンの生成や活性を、共発現させたα２ＰＩ及びＰＡＩ−２が阻害したことによってフィブリノゲンＡα鎖の分解が抑制された可能性が示唆された。

（実施例８：共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５におけるフィブリノゲンの産生）
上述のとおり、一般にフィブリノゲンの分解は、細胞密度の高い培養後期に著しく進行し、細胞密度の低い培養初期には殆ど進行しない。そこで、フィブリノゲン分解が起こり難い細胞密度の低い培養条件下でフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を培養し、フィブリノゲンとα２ＰＩ及びＰＡＩ−２との共発現が、フィブリノゲン分解抑制効果とは独立して、フィブリノゲン産生能に影響を及ぼすかを調べた。

Ｂａｔｃｈ培地（表３）にフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５を１．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの低細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに３０ｍＬ播種して、１０日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養上清を１日当たり０．４ｍＬずつサンプリングし、培養４日目にＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地を５％（ｖ／ｖ）添加した。次いで、培養上清中のフィブリノゲン量をＥＬＩＳＡ法により以下のように測定した。

抗ヒトフィブリノゲン・ウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ製、Ａ００８０）６ｍｇ／ｍｌをＣｏａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製、５０−８４−０１）で１，２００倍希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ製、３５９０）に１ウェル当たり１００μＬずつ添加して４℃で一晩静置した。次いで、ＢＳＡ Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製、５０−６１−０１）を１ウェル当たり３００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。血漿由来フィブリノゲン（ｐＦｂｇ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、３４１５７６）の希釈系列を作製し、スタンダード（４４０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、２７．５ｎｇ／ｍＬ、１３．７５ｎｇ／ｍＬ、６．８８ｎｇ／ｍＬ、３．４４ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬ）とした。スタンダード及び測定サンプルを１ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。次いで、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎでプレートを洗浄し（３００μＬ／ウェル、５回、プレートウォッシャー使用）、ＢＳＡ Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０，０００倍希釈した二次抗体液を１ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０、０．９％ＮａＣｌ）で洗浄後、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製、５０−６２−００）を１ウェル当たり１００μＬずつ添加した。室温で１０分間静置後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製、５０−８５−０１）を１ウェル当たり１００μＬずつ添加して、反応を停止した。波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、培養上清中のフィブリノゲン量は、培養５日目までは、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５のいずれにおいても同様の傾向を示し、培養４日目のフィブリノゲン量はいずれも約４０μｇ／ｍＬであった（図１２）。しかし、培養８日目になると、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のフィブリノゲン量が約８０μｇ／ｍＬであったのに対し、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５のフィブリノゲン量はいずれも約１５０μｇ／ｍＬにまで達し、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３と比較して約２倍のフィブリノゲン量を示した。本実施例の低細胞密度培養条件下ではフィブリノゲン分解は殆ど進行しないことから、この結果から、フィブリノゲンをα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２と共発現させることにより、フィブリノゲン分解抑制効果とは独立して、フィブリノゲン産生量が大幅に上昇（約２倍）することが明らかとなった。

（実施例９：共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８におけるフィブリノゲンの産生）
共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５とは異なるベクターを用いて樹立した共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８についても、フィブリノゲン分解が起こり難い細胞密度の低い培養条件下でフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８を培養し、フィブリノゲンとα２ＰＩ及びＰＡＩ−２との共発現が、フィブリノゲン分解抑制効果とは独立して、フィブリノゲン産生能に影響を及ぼすかを調べた。

Ｂａｔｃｈ培地（表３）にフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、並びに共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの低細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに２０ｍＬ播種して、８日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養上清を１日当たり０．４ｍＬずつサンプリングし、等量のＢａｔｃｈ培地を添加した。

生細胞数および生存率の推移に関しては、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８に大きな違いは認められなかった（図１３）。

次いで、実施例８と同様の方法により、培養上清中のフィブリノゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定したところ、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８及び＃６８における培養上清中のフィブリノゲン量は、生細胞数の推移とは異なり、培養３日目以降、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３と比較して、高いフィブリノゲン量で推移した。培養８日目になると、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３のフィブリノゲン量が約１００μｇ／ｍＬであったのに対し、共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃８では約１５０μｇ／ｍＬ、＃６８では約２００μｇ／ｍＬのフィブリノゲン量が認められ、フィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３と比較して約１．５倍〜２倍のフィブリノゲン量を示した。

これらの結果は、フィブリノゲンをα２ＰＩ及びＰＡＩ−２と共発現させることにより、フィブリノゲン分解抑制効果とは独立して、フィブリノゲン産生能を高めることができることを示している。さらに、この効果はベクターや細胞株の違いによる影響を受けないことが明らかとなった。

以上より、本発明の方法により製造される組換えフィブリノゲン高産生株は、一般にフィブリノゲン分解が進行する培養後期においてもフィブリノゲン分解を強力に抑制することにより、例えばフィブリノゲンのみを発現させた細胞株と比較してフィブリノゲンＡα鎖の残存率を約２．５倍以上に増加させることができるばかりでなく、当該フィブリノゲン分解抑制効果とは独立してフィブリノゲン産生量を増大（約１．５倍〜２倍）させることができるため、これら相乗効果によって、フィブリノゲンのみを発現させた細胞株と比較して、少なくとも約４倍以上のフィブリノゲン産生量を得ることができることが示された。

（実施例１０：α２ＰＩ、ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２添加によるフィブリノゲン分解抑制効果）
実施例６の結果から、フィブリノゲンをα２ＰＩ及びＰＡＩ−２と共発現させることにより、培養後期におけるフィブリノゲン分解を強力に抑制できることが明らかになった。共発現させた２種類のタンパク質がともに分解抑制効果を奏するのかどうか、ＰＡＩ−２と同様の作用メカニズムを有するＰＡＩ−１を用いてもフィブリノゲン分解抑制効果が認められるのかどうかを確認するために、培養後期のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３の培養上清にα２ＰＩ、ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２をそれぞれ添加し、フィブリノゲンγ鎖に対するＡα鎖の比の変動を調べた。

Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培地（表３）にフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの高細胞密度で懸濁し、１２５ｍＬフラスコに５ｍＬ播種して１０日間フラスコを振盪培養した（３７℃、５％ＣＯ_２、１２０〜１４０ｒｐｍ）。培養１０日目の培養上清１００μＬに、α２ＰＩ（Ａｂｃａｍ製、ａｂ９０９２１）、ＰＡＩ−１（Ｐｅｐｒｏ ｔｅｃｈ製、１４０−０４）若しくはＰＡＩ−２（Ｐｅｐｒｏ ｔｅｃｈ製、１４０−０６）を添加し、又は無添加で、さらに３７℃で３日間静置した。α２ＰＩ及びＰＡＩ−２の添加量は、培養１０日目の共発現細胞株α２ＰＩ／ＰＡＩ−２／Ｔ２３３ ＃９及び＃１５の培養上清中に発現している量と同等量とした。ＰＡＩ−１の添加量は、ＰＡＩ−２の添加量に準じた。培養１０日目のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３におけるγ鎖に対するＡα鎖の比を１００％とした場合の各培養サンプルにおけるγ鎖に対するＡα鎖の比の相対値をＡα鎖残存率として示す（図１４）。

その結果、培養１０日目のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３を、無添加条件下、３７℃で３日間静置すると分解が進行し、Ａα鎖残存率は４８％になった。培養１０日目のフィブリノゲン発現細胞株Ｔ２３３にα２ＰＩ又はＰＡＩ−２を添加して３７℃で３日間静置した場合、Ａα鎖残存率は７２〜８４％となり、無添加の場合（４８％）と比較して、いずれもフィブリノゲン分解を抑制した。α２ＰＩとＰＡＩ−２がともにフィブリノゲン分解を抑制したことから、それぞれにフィブリノゲンＡα鎖の分解を抑制する効果が存することが明らかとなった。一方、ＰＡＩ−２の類似タンパク質であるＰＡＩ−１を添加して３７℃で３日間静置した場合のＡα鎖残存率は、無添加の場合（４８％）と同程度（４４〜４８％）であり、ＰＡＩ−１にはフィブリノゲン分解抑制効果は全く認められなかった（図１４）。

ＰＡＩ−１及びＰＡＩ−２は、いずれもＳＥＲＰＩＮに属する生体内に存在するインヒビターであり、プラスミノーゲンアクチベータを阻害することにより、プラスミノーゲンからのプラスミン生成を抑制するタンパク質である。ＰＡＩ−１とＰＡＩ−２という同様の作用メカニズムを持つプロテアーゼ阻害タンパク質の添加効果に大きな違いが認められたことは、フィブリノゲンＡα鎖の分解に関わるメカニズムに厳密な特異性があることを示すものである。

本発明の組換えフィブリノゲン高産生株は、一般にフィブリノゲン分解が進行する培養後期においてもフィブリノゲン分解を強力に抑制することにより、例えばフィブリノゲンのみを発現させた細胞株と比較してフィブリノゲンＡα鎖の残存率を約２．５倍以上に増加させることができるばかりでなく、当該フィブリノゲン分解抑制効果とは独立してフィブリノゲン産生量を増大（約１．５〜２倍）させることができるため、これら相乗効果によって、フィブリノゲンのみを発現させた細胞株と比較して、少なくとも約４倍以上のフィブリノゲン産生量を得ることができる。それゆえ、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株によれば、組換えフィブリノゲンを大量生産すること、ひいては実用的なレベルで組換えフィブリノゲンを製剤化することが可能となり、フィブリノゲンの市場への安定供給も確保できる。

さらに、本発明の組換えフィブリノゲン高産生株により得られるフィブリノゲンは、遺伝子組換え技術によって製造されたものであるため、血液由来製剤特有の問題である感染性病原体混入の危険性を完全に排除することができ、十分な安全性を確保することができる。それゆえ、治療に十分な量のフィブリノゲンを長期に亘って安心・安全に使用することが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２０１３‐２７３１４５（出願日：２０１３年１２月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (9)

1. フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現する動物細胞株であることを特徴とする、組換えフィブリノゲン高産生株。
2. フィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２が、ヒトフィブリノゲン並びにヒトα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２であることを特徴とする、請求項１記載の組換えフィブリノゲン高産生株。
3. 動物細胞株が、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組換えフィブリノゲン高産生株。
4. フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子を動物細胞に導入し、該動物細胞中でフィブリノゲン並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２を共発現させることを特徴とする、組換えフィブリノゲン高産生株の製造方法。
5. フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子全てを有する単一の発現ベクターを用いて、フィブリノゲンを動物細胞に発現させることを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. α２ＰＩをコードする遺伝子とＰＡＩ−２をコードする遺伝子とを有する単一の発現ベクターを用いて、α２ＰＩ及びＰＡＩ−２を動物細胞に発現させることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
7. フィブリノゲンのＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子、並びにα２ＰＩ及び／又はＰＡＩ−２をコードする遺伝子が、いずれもヒト遺伝子であることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 動物細胞が、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えフィブリノゲン高産生株又は請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法により得られる組換えフィブリノゲン高産生株を培地中で培養し、得られた培養物からフィブリノゲンを回収することを含む、組換えフィブリノゲンの製造方法。