JPH08509614A - エリスロポエチン類似体組成物および方法 - Google Patents
エリスロポエチン類似体組成物および方法Info
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Abstract
(57)【要約】
[X33,Cys139,des−Arg166]および[Cys139,des−Arg166]類似体を含むヒトエリスロポエチン類似体、並びに、このような類似体の製法及びそれを用いる方法及びそれを含有する医薬組成物。
Description
【発明の詳細な説明】
エリスロポエチン類似体組成物および方法 技術分野
本発明は、赤血球新生を誘導し且つ、赤血球もしくは網状赤血球数の低下に起
因する、例えば貧血のような症状を治療するのに有用であることが公知の糖蛋白
質、ヒトエリスロポエチンの類似体に関する。また、本発明は、その類似体を含
有する組成物、その類似体を製造する方法および、赤血球新生を誘導し且つ、不
適切な赤血球または網状赤血球数に起因する貧血のような症状を治療することへ
の、該類似体の使用方法に関する。発明の背景
エリスロポエチンは、最初およそ39,000ダルトンであると報告された(
T.Miyaki等,J.Biol.Chem.252:5558-5564(1977))分子量を有する天然の
糖蛋白質ホルモンである。成熟ホルモンは、166個のアミノ酸鎖長であり、そ
のリーダーペプチドを有する“プレプロ”型ホルモンは、193個のアミノ酸鎖
長である(F.Lin,米国特許第4,703,008号)。成熟ホルモンは、その
アミノ酸配列から算定した18,399ダルトンの分子量を有する(K.Jacobs
等,Nature
313:806-810(1985);J.K.Browne等,Cold Spring Harbor Symp.Quant.B
iol.51:693-702(1986))。
ヒト尿中のエリスロポエチンの構造特性研究により、成熟蛋白質のカルボキシ
ル末端のArg残基が特異的に除去されたdes−Arg166型が同定された
(M.A.Recny等,J.Biol.Chem.262:17156-17163(1987))。Recny等(上掲
)は、ヒト血漿中を循環するエリスロポエチンの生理学的に活性な型がdes−
Arg166型であると提言している。
ヒトエリスロポエチンは、3つのN‐結合炭水化物鎖を含有する(H.Sasaki
等,J.Biol.Chem.262:12059-12076(1987);E.Tsuda等,Biochemistry 27:
5646-5654(1988);およびM.Takeuchi等,J.Biol.Chem.263:3657-3663(19
88))。エリスロポエチンの炭水化物含量は、哺乳動物細胞内にトランスフェク
ションされかつ該ホルモンのプレプロ型をコードするクローン化DNAを該培養
細胞内で発現して産生されたホルモン、及び天然の尿エリスロポエチンのものと
類似している。N‐結合グリコシレーション部位は、アミノ酸残基24、38お
よび83に位置する。尿および組み替えエリスロポエチンはともに、アミノ酸残
基126にただ一つのO‐結合グリコシレーション
部位を有する(Sasaki等(上掲);E.Tsuda等(上掲);M.Takeuchi等(上掲
);およびM.Goto等,Biotechnology 6:67-71(1988))。エリスロポエチンの
炭水化物含量は、N‐アセチルラクトースアミン反復単位を有するフコシル化テ
トラアンテナリィ型鎖と該反復単位を有さないものとの複合(M.Takeuchi等(
上掲))であり、エリスロポエチンの質量のおよそ40%に寄与する。
ヒトエリスロポエチンは、主として、成人の腎臓により糖蛋白質ホルモンとし
て産生される(H.P.KoefflerおよびE.Goldwasser,Ann.Intern.Med.97:44
-47(1981))。腎臓でエリスロポエチンを産生する細胞は、非常に少なく、腎
細管間の間質内の腎実質の内部皮質に存在する(S.T.Koury等,Blood 71:524-
528(1988),およびC.Lacombe等,J.Clin.Invest.81:620-623(1988))。
従って、腎不全で起こるような腎組織の破壊は、エリスロポエチン産生の減少お
よび赤血球数の同時減少および貧血によって生じる。
インビトロの胎児肝細胞は、エリスロポエチンを産生できる(A.Kurtz等,En
docrinology 118:567-572(1986))が、ほとんどの末期腎不全患者には代償的
なエリスロポエチン産生は
起こらず、血清エリスロポエチンレベルは、成功した腎移植後にのみ正常に回復
する(W.F.Denny等,J.Lab.Clin.Med.67:386(1966))。
ほとんどの場合、後期赤血球新生は、ただ一つの組織で産生されたただ一つの
グリコシル化ホルモンであるエリスロポエチンにより達成される。エリスロポエ
チンの稀な代替経路が、高ヘマトクリットをもつヒト無腎(anephric)患者につ
いて記載されている。この患者では、単離したエリスロトロピックな因子がヒト
のインシュリン様成長因子I即ちIGF−Iであることが示されている(A.Bro
x等,Exp.Hematol.17:769-773(1989),およびL.F.Congote等,J.Clin.E
ndocrin.Metab.72:727-729)。IGF−Iは、確かに、L.F.Congote(Bioch
em.Biophys.Res.Comm.115:477-483(1983))によりインビボおよびインビ
トロ活性をともに有すると記載されたウシのエリスロトロピックな因子に対応す
るヒト因子である。IGF−I受容体は、ヒト赤血球上に存在することが公知で
あり、これらの受容体は、IGF−Iとその特異的受容体との相互作用を介して
起こる後期赤血球新生のこの稀な代替経路を可能にする(T.Izami等,J.Clin
.Endocrinol.Metab.62:
1206-1212(1986),およびC.D.Costigan等,Clin.Invest.Med.11:4751(1
988))。しかしながら、上記エリスロポエチン受容体遺伝子のヌクレオチド配
列は公知であるが、ヒトIGF−I受容体との配列相同性を示していない(A.D
,D′Andrea等,Cell 57:277-285(1989))ことから、IGF−Iを介した赤血
球新生の代替経路はエリスロポエチンが仲介する後期赤血球新生の経路と無関係
であることを示している。
後期赤血球新生の他の代替経路は知られていないが、エリスロポエチンの作用
を強化することのできるいくつかの因子については記載されている。後期赤血球
新生は、エリスロポエチンに依存するが、テストステロン、エストロゲンおよび
赤血球強化因子によって影響され、一方、初期の赤血球新生は、エリスロポエチ
ンに加え赤芽球コロニー群促進因子に依存性である(N.N.Iscove in Hematopo
ietic Cell Differentiation,D.W.Golde編,M.J.ClineおよびC.F.Fox[A
cademic印刷,New York]37-52頁)。IL−3、顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子およびインターロイキン−9のような因子は、赤芽球コロニー群形成活
性を有することが知られている。しかしながら、これらの活性が赤血球新生に何
らかの生理学的役割を
もつかどうかは明確ではない(J.Suda等,Blood 67:1002-1006(1986);C.A
.Sieff等,Science 230:1171-1173(1985);およびR.E.Donahoe等,Blood
75:2271-2275(1989))。近年、“赤血球分化因子”と命名された因子が、イン
ビボおよびインビトロでのエリスロポエチンの活性を強化することが示された(
H.E.Broxmeyer等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9052-9056(1988);J.Yu等
,Nature 330:765-767(1987))。この因子は、アクチビンA(卵胞刺激ホルモ
ン放出蛋白質)と同一であり、ホリスタチン、即ちアクチビンAの特異的阻害物
質により阻害されることが示されたが、しかしながらアクチビンAの生理学的役
割は、決定されないままである(M.Shiozaki等,Proc.Natl.Acad.Sci.89:1
553-1556(1992))。従って、20年近い研究が行なわれているが、赤血球新生
が、エリスロポエチン以外のホルモンにより制御されるという明確な指示は何も
ない。
赤血球新生に影響を及ぼす代替ホルモンの非存在下、エリスロポエチン構造を
調査する試み、部位特異的突然変異法によりエリスロポエチンの特性を顕著に改
善する試みがともに文献に報告された。エリスロポエチンをコードするヒト遺伝
子の分子
クローニングによって、193個のアミノ酸のプレプロホルモンおよび166個
のアミノ酸の成熟ホルモンをコードするDNA配列が明らかにされている。ホル
モン及びその前駆体(即ちプレプロ型)をコードするクローン化DNAの入手が
容易になったことから、分子生物学の標準方法を用いて突然変異誘発を実施する
機会が提供された。米国特許第4,703,008号(上掲)参照。
アミノ酸置換および欠失により調製した最初の突然変異体エリスロポエチン(
即ちエリスロポエチン類似体)は、減少した又は改善されない活性を示した。米
国特許第4,703,008号に記載されているように、15、49および14
5位のチロシン残基のフェニルアラニン残基での置換、7位のシステイン残基の
ヒスチジンでの置換、2位のプロリンのアスパラギンでの置換、残基2〜6の欠
失、残基163〜166の欠失、および残基27〜55の欠失は、生物学的活性
の明白な増加を生じさせない。cys7からHis7への突然変異は、生物学的活
性を喪失させる。24、38または83位のアスパラギン残基にただ一つのアミ
ノ酸置換を有する一連の変異体エリスロポエチンは、重大な活性低下(24位で
の置換)を示すか又は、
急速な細胞内分解および明らかな分泌欠如(残基38または183での置換)を
示す。セリン126の位置でのO−結合グリコシレーション部位の除去により、
エリスロポエチン類似体の急速な分解または分泌欠如が生じする(S.Dube等,J
.Biol.Chem.33:17516-17521(1988))。これらの著者等は、残基38、83
および126に位置するグリコシレーション部位が適正な分泌に必要であり、残
基24および38に位置するグリコシレーション部位が成熟エリスロポエチンの
生物学的活性に関連すると結論付けている。
エリスロポエチンのグリコシレーションがインビトロの生物学的活性に必要で
あるという示唆は、脱グリコシル化エリスロポエチンがインビトロのバイオアッ
セイにおいて十分活性であるということを示す報告に反する(M.S.Dordal等,
Endocrinology 116:2293-2299(1985);j.K.Browne等,Cold Spring Harbor
Symp.Quan.Biol.51:693-702(1986);米国特許第4,703,008号;E
.Tsuda等,Eur.J.Biochem.188405-411(1990);およびK.Yamaguchi等,J
.Biol.Chem.266:20434-20439(1991))。上記Dube等により研究されたもの
と類似した1セットのエリスロポエチン類似体が、エリスロポ
イエチンの生合成および生物学的活性におけるグリコシレーション部位の役割を
探るために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異法を用いて構築されている(上
記K.Yamaguchi等(上掲))。これらの研究者等は、グリコシレーションは、エ
リスロポエチンの正しい生合成および分泌に重要であるが、この分子のインビト
ロ活性には何ら影響しないと結論付けている。しかしながら、グリコシレーショ
ン部位に変化を含むYamaguchi等により研究された全てのエリスロポエチン変異
体は、インビボ生物学的活性を欠いていた。
エリスロポエチンのグリコシレーションは、ホルモンのインビボ活性に重要な
役割を果たすことが広く認められている(P.H.Lowy等,Nature 185:102-105(
1960);E.GoldwasserおよびC.K.H.Kung,Ann.N.Y.Acad.Science 149:
49-53(1968);W.A.LukowskyおよびR.H.Painter,Can.J.Biochem.50:90
9-917(1972);D,W.Brlggs等,Amer.J.Phys.201:1385-1388(1974);J.
C.Schooley,Exp.Hematol.13:994-998;N.Imai等,Eur.J.Biochem.194:45
7-462(1990);M.S.Dordal等,Endocrinology 116:2293-2299(1985);E.
Tsuda等,Eur.J.Biochem.188:405-411(1990);
米国特許第4,703,008号;J.K.Brown等,Cold Spring Harbor Sympos
ia on Quant.Biol.51:693-702(1986);およびK.Yamaguchi等,J.Biol.Ch
em.266:20434-20439(1991))。
エリスロポエチンの脱グリコシル化類似体のインビボでの生物学的活性の欠如
は、治療を受けた動物の循環からの脱グリコシル化ホルモンの急速なクリアラン
スに起因する。この見解は、グリコシル化および脱グリコシル化エリスロポエチ
ンの血漿半減期の直接比較により支持される(J.C.SpivakおよびB.B.Hoyans
,Blood 73:90-99(1989),およびM.N.Fukuda等,Blood 73:84-89(1989))
。
エリスロポエチンのグリコシレーション部位のオリゴヌクレオチド特異的突然
変異法は、グリコシレーションの機能を効果的に精査したが、今のところ、治療
応用のためのホルモンの特性を顕著に改善する効果的戦略に対する解答を提供し
ていない。
アミノ酸残基15、24、49、76、78、83、143、145、160
、161、162、163、164、165および166を含む一連の単一のア
ミノ酸置換または欠失突然変異体が構築された。これらの突然変異体は、エリス
ロポエチン
のカルボキシ末端、グリコシレーション部位およびチロシン残基が変化している
。これらの突然変異体は、動物に投与されると同時にヘモグロビン、ヘマトクリ
ットおよび網状赤血球レベルが監視された(ヨーロッパ特許出願公開第0 40
9113号)。これらの突然変異体の多くがインビボの生物学的活性を保持する
とはいえ、天然のエリスロポエチンと比較した場合、いずれも、ヘモグロビン、
ヘマトクリットまたは網状赤血球(赤血球の直接的前駆体)レベルを上昇させる
能力の顕著な増加を示さない。
別のセットの突然変異体が、残基99〜119(ドメイン1)および残基11
1〜129(ドメイン2)の機能を探るために構築された(Y.Chern等,Eur.J
.Biochem.202:225-230(1991))。ドメイン2突然変異体は、最も良くてイン
ビトロ活性を保持するが、ドメイン1突然変異体は、急速に分解しインビトロバ
イオアッセイにおいて不活性である。また、これらの突然変異体は、野性型ヒト
エリスロポエチンに比較し何ら増強されたインビボ生物学的活性を示さない。こ
れらの著者等は、残基99〜119がエリスロポエチンの構造に重要な役割を果
たしていると結論付けている。
ヒトエリスロポエチン分子は、2つのジスルフィド架橋を含有し、1つは、7
および161位のシステイン残基間の結合であり、他の1つは、29および33
位のシステイン間の結合である(P.-H.Lai等,J.Biol.Chem.261:3116-3121
(1986))。オリゴヌクレオチド特異的突然変異法を用いて、ヒトエリスロポエ
チンの29および33位のシステインを結合させているジスルフィド架橋の機能
が詳しく調べられた。33位のシステインが、マウスエリスロポエチンの構造を
模倣するプロリン残基に該残基位置で変換された。その結果生じた突然変異体は
、インビトロ活性が大きく減少した。活性の損失が非常に激しいことから、著者
等は、残基29と残基33との間のジスルフィド架橋がエリスロポエチン機能に
必須であると結論付けている(F.-K.Lin,Molecular and Cellular Aspects of
Erythropoietin and Erythropoiesis,23-36頁,I.N.Rich編,Springer-Verl
ag,Berlin(1987))。
ヒトエリスロポエチンの54位のメチオニン残基の部位特異的オリゴヌクレオ
チド特異的突然変異によって、酸化の影響を受けにくいエリスロポエチン調製物
を提供するという付加的利点を有しながら親(野性型)分子のインビボ生物学的
活性を保
持する分子が得られ(Shoemaker,米国特許第4,835,260号)。
ヒトエリスロポエチン遺伝子の多数の突然変異体が、いくつかの科学的刊行物
および特許出願公開公報に記載されてきた。これらの突然変異体は、分子の全長
に変異が及ぶものであったり、部分的にもしくは完全に脱グリコシル化された分
子の調製物であったり、分子内のジスルフィド架橋の構造を変化させたものであ
ったり、あるいは分子の治療活性を改善するよう試みられたものであった。エリ
スロポエチンを変化させるこのような試みのいずれもが、増強したインビボ生物
学的活性または治療応用のための他の改良された性質を有する分子を作製するの
に成功していない。
後期赤血球新生の自然界に存在する代替経路の同定の失敗、および増強したイ
ンビボ活性を有するエリスロポエチン類似体を作製する従来の不成功の試みは、
改良されたエリスロトロピック分子を作製することのできる方法についてほとん
ど解答を提供していない。発明の概要
33位のシステインが別のアミノ酸で置換されるものを含むヒトエリスロポエ
チンおよびその類似体の139位のアルギニ
ンをシステインで置換することによって、顕著に改良されたインビボエリスロポ
エチン活性をもつ糖ホルモンが得られ、並びに、赤血球新生の誘導および貧血の
治療のような治療応用におけるその利用可能性に導くことが見い出された。
更に、予期せぬことには、天然の野性型蛋白質のアミノ酸配列における(1番
目の位置での)変化の結果としてインビトロまたはインビボの生物学的活性が顕
著に減少した又は全くなくなった、哺乳類および特にヒトのエリスロポエチンの
第1の類似体を、野性型蛋白質のアミノ酸配列における更に補償する(2番目の
位置での)アミノ酸配列変化により更に顕著に活性な第2類似体に変換すること
ができることを見い出した。この結果は、蛋白質の第1の配列中の前記2番目の
位置がたとえ1番目の位置から離れていたとしても得られる。事実、このような
第2類似体が、野性型のエリスロポエチンとほとんど同じか又はより一層高いイ
ンビボまたはインビトロ活性を有することを見い出した。この関連において、“
離れて”とは、少なくとも1アミノ酸位置、更に一般的には少なくとも約10ア
ミノ酸位置、あるいは可能なものとして100アミノ酸位置より更に大きい分離
を意図する。一方の位置のアミノ酸の変化が、他方の
離れた位置のアミノ酸の変化による活性の低下を補償する又は克服しさえするこ
のような二重突然変異体を同定することは、容易に可能である。
本発明者らが発見し初めて開示するものは、プレプロ型の類似体、即ちそのア
ミノ末端に哺乳類のエリスロポエチンのリーダーペプチドが付加された類似体を
コードするDNA配列を哺乳類細胞中で発現することによって本発明の改良され
たエリスロポエチン類似体を製造するための方法および組成物である。驚くべき
ことには、本発明の類似体の多くは、貧血または貧血ではない哺乳類に投与した
場合、天然のエリスロポエチンに比し赤血球新生において実質的により活性であ
り、所期の治療効果を達成するのに天然のエリスロポエチンに比し投与頻度が少
なくてすむという意外で且つ顕著な更なる利点を有する。
本発明の哺乳類(および特にヒト)のエリスロポエチンの類似体は、対応する
天然のエリスロポエチンと同様の免疫学的特性またはインビトロ生物学的活性を
保持することから、類似体の血中濃度、培養培地、医薬製剤等は、天然の糖ホル
モンを用いた従来の方法により容易に測定およびモニターすることができる。図面の簡単な説明
本発明を添付の図面と関連させて説明するが、その中で:
図1は、その構築を実施例1で説明するプラスミドpEPOw5の説明図であ
り;
図2は、天然のヒトエリスロポエチンを産生する培養中の哺乳類細胞を形質転
換するのに用いることのできる発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJ
neoEPOを、プラスミドpEPOw5(修正した)およびプラスミドSV2
dhfrSVdeltaSJneoから作製するのに用いる、実施例1で説明す
る方法の説明図であり;
図3は、天然型の“非組み替え”ヒトエリスロポエチン(hEPO標準)、発
現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneoEPO(rEPO)で形質
転換したdhfr‐チャイニーズハムスター卵巣細胞により培養中で産生した天
然型の“組み替え”ヒトエリスロポエチン、および天然型のヒトエリスロポエチ
ンのプレプロ型よりむしろそのような類似体のプレプロ型をコードするDNAを
含む発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneoEPOの類似体で形
質転換したdhfr‐チャイニーズハムスター卵巣細胞により培養中で産
生した残基33がプロリンであり残基139(pm25)がシステインである“
組み替え”ヒトエリスロポエチン類似体pm25(pm25)の活性を示すグラ
フであり;
図4は、天然型ヒトエリスロポエチンおよびpm25の説明図である。発明の詳細な説明
その一つの態様において、本発明は、本来の糖ホルモンの139位のアルギニ
ン残基がシステイン残基で置き換わったヒトエリスロポエチン類似体である。
そのもう一つの態様において、本発明は、野性型のエリスロポエチンの33位
のシステイン残基が他の19個の天然に存在するアミノ酸、好ましくはプロリン
、のいずれか1つで置換された更に改変された類似体である。
どの場合においても、本発明の類似体の好ましい例は、166位のアルギニン
残基が欠けている(即ちdes−Arg166である)ものである。
そのもう一つの態様において、本発明は、本発明のエリスロポエチン類似体を
コードする498個から495個のヌクレオチドのセグメントを含む二重鎖DN
A配列である。
更なる態様において、本発明は、一方のサブセグメントが上記の498個また
は495個のヌクレオチドのセグメントであり、他方のサブセグメントが哺乳類
のプレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、この2つの
サブセグメントが、それら隣接するサブセグメントによってコードされたただ一
つのポリペプチド中でリーダーペプチドのカルボキシ末端がエリスロポエチン類
似体のアミノ末端に隣接するように結合している2つの隣接したサブセグメント
を含む二重鎖DNA配列も包含する。好ましいリーダーペプチドは、マウス、サ
ル、ハムスターおよびヒトのプレプロエリスロポエチンのそれであり、最も好ま
しいのは、ヒトのリーダーペプチドである。ヒトおよびサルのリーダーペプチド
のアミノ酸配列を後述の配列番号:6および配列番号:7に示す。
更なる態様において、本発明は、哺乳類の細胞培養中で本発明のプレプロエリ
スロポエチン類似体を発現するための真核生物発現ベクターである二重鎖DNA
配列を包含する。この目的のためにいずれの哺乳類細胞も用いることができるが
、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞が好ましい。当然のことながら、
このような発現ベクターは、ベクターが、転写を開始
するベクター上のシグナルおよび(挿入したcDNAに対応するセグメントを含
む)ベクターから転写したRNA上のシグナルを認識するのに必要な蛋白質及び
他の成分を提供する細胞(例えば、哺乳類の細胞)中に存在する場合、cDNA
によりコードされるポリペプチドの翻訳および産生を達成するために、cDNA
が転写されるベクター内の位置に転写物の翻訳に必要なシグナルと目的の類似体
をコードするcDNA配列とを結合することにより作製する。発現ベクター内に
cDNAを“発現作動可能に”配置するとは、RNAがベクターから転写し、最
終的にはcDNAによりコードされた蛋白質を生産するためにベクターで形質転
換した細胞内で翻訳できるように配置することを意味する。
また、本発明は、本発明のプレプロエリスロポエチン類似体をコードするcD
NAの哺乳類細胞中での発現用真核生物発現ベクターを含む培養哺乳類細胞も包
含する。このような発現は、成熟グリコシル化類似体の培養培地中への分泌をも
たらす。
更に、本発明は、共に前駆体ポリペプチドをコードする2つの隣接するセグメ
ントから成るDNA配列を哺乳類細胞中で発現するのに適する真核生物発現ベク
ターを含む哺乳類細胞を用
いる方法を包含する。この前駆体ポリペプチドは、そのカルボキシ末端でヒトエ
リスロポエチン類似体のアミノ末端に結合した哺乳類のプレプロエリスロポエチ
ンのリーダーペプチドから成る。したがって、このセグメントの一方は、このリ
ーダーペプチドをコードし、一方、このセグメントの他方は、498または49
5塩基対を有しかつ本発明のエリスロポエチン類似体をコードする。上記方法は
、この細胞が培養培地中にこのエリスロポエチン類似体を分泌する条件下でこの
細胞を培養培地中で培養することを含む。次いで、類似体を培養培地から単離し
、精製し、哺乳類、好ましくはヒトヘ投与するための医薬組成物に処方すること
ができる。
本発明はまた、天然型ヒトエリスロポエチンに比し著しく低い赤血球新生の比
活性を有する第1類似体に比べて顕著に高い赤血球新生の比活性を有する第2ヒ
トエリスロポエチン類似体も包含する。この第2類似体は、その配列中の第1お
よび第2の位置に天然型ヒトエリスロポエチンの配列の同じ位置のアミノ酸と異
なるアミノ酸を有することを除いては、天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数お
よび配列のアミノ酸を有するものであり、一方、第1類似体のアミノ酸は、その
第1又は第2
の位置のいずれかで天然型ヒトエリスロポエチンの配列に見られるアミノ酸と同
じであることを除いては、第2類似体と同じ数および配列のアミノ酸を有するも
のである。本発明のこれらの“第2類似体”の発見は、天然型糖蛋白質中の相当
する位置に見られるアミノ酸と異なるアミノ酸が“第1類似体”に存在するため
に喪失した少なくともいくらかの活性を回復させる、アミノ酸配列中の補償的変
化を実施可能にするという発見に基づいている。ある場合には、第2類似体は、
天然型糖ホルモンに比しより活性である(即ち、赤血球新生を刺激するのにより
高いインビボ比活性を有する)が、一方、第1類似体は、インビボで不活性であ
るということが予想される。
また、本発明は、前述のパラグラフで述べたこのようなエリスロポエチンの第
2類似体を生産する方法を提供し、この方法は、(a)(i)天然型ヒトプレプ
ロエリスロポエチンの二重突然変異体(即ち、天然型糖ホルモンに存在するアミ
ノ酸がその2つの位置で変化している突然変異体)をコードする、(ii)赤血
球新生を刺激するのに実質的な活性を持たず、かつ天然型ヒトエリスロポエチン
と同じ数のアミノ酸を有するが、天然型ヒトエリスロポエチンの相当する位置に
見られるアミノ
酸と異なるアミノ酸をその配列内の1つの位置に有する天然型ヒトエリスロポエ
チンの第1類似体の該非天然アミノ酸をコードするトリプレット(コドン)を含
む、および(iii)天然型プレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドのい
ずれの部分もコードせず、かつ前記第1類似体のこの前記非天然のアミノ酸をコ
ードする前記トリプレットを含まないcDNAセグメント内にランダム突然変異
を含む、哺乳類細胞中での発現が作動的に可能になるように配置したcDNA配
列を含む真核生物発現ベクターライブラリーを調製し;(b)発現ベクターライ
ブラリーを発現用哺乳類細胞内へトランスフェクトし;及び(c)所望の第2類
似体を分泌する細胞を選択することを包含する。
また、本発明は、赤血球新生を刺激するのに第2類似体より高いインビボ活性
を有する第3類似体を作製するために、天然型糖ホルモンに対し相対的に減少し
た活性を有する単一の変異をもつ第1類似体と比較して増大した活性を有するこ
のような二重変異をもつ第2類似体を用いる方法を提供する。この方法は、第1
類似体には見られるが天然型ヒトエリスロポエチンには見られない、前記第2類
似体中のアミノ酸を、天然型ヒトエ
リスロポエチンの相当する位置に存在するアミノ酸に変化させることを含む。
更に、本発明は、赤血球新生において天然型ヒトエリスロポエチンより高い活
性を有し、並びにその配列中の1ヵ所の位置でのアミノ酸の相違を除いては天然
型ヒトエリスロポエチンと同じ数および配列のアミノ酸を有するヒトエリスロポ
エチン類似体を包含し、この類似体は、前述の方法、即ち赤血球新生を刺激する
のに少なくとも天然型糖ホルモンと同じ位高いインビボ比活性をそれ自体有する
第2類似体を用いることにより製造される。
また、本発明は、医薬的に許容されうる担体と組み合わせて、治療に有効な量
の本発明のヒトエリスロポエチン類似体を含有する赤血球新生を誘導しおよび/
または哺乳類(好ましくはヒト)の貧血を治療するのに有用な医薬組成物も包含
する。本発明の類似体のような医薬組成物は、その量または濃度が必要なレベル
の赤血球新生を誘導するのに効果的であるように医師または獣医の指導下で投与
されるべきである。用いる担体は、下記のものに限定されるべきではないが、注
射(通常、静脈もしくは皮下)又はその他による投与に適した形態で糖ホルモン
と
組み合わせた、緩衝液、塩、安定化剤、保存剤または他のアジュバントを含む生
理学的に許容されるいかなる賦形剤であってもよい。
投与は、ヒトエリスロポエチンと比較した前記類似体のインビボ比活性に基づ
き、赤血球新生を誘導し、腎不全に罹患した患者の貧血を含むヒトにおける貧血
のような種々の症状を治療するヒトエリスロポエチンの投与に関し現在当業者に
公知であるものに基づき、当業者により容易に確認される薬剤投与レジメに準ず
る。本発明の類似体の投与量は、特定の類似体及びそのインビボ比活性、投与経
路、医学的症状、年齢、患者の体重または性別、類似体または賦形剤の成分に対
する患者の感受性、並びに治療をする医師が容易に考慮に入れることのできる他
の因子に依存して患者により多少変えることができる。本発明の類似体の治療用
途に関しては、米国特許第4,703,008号および第4,835,260号
が参考される。また、Physicians′Desk Reference,46th Edition(Medical Ec
onomics Data,Montvale,New Jersey(1992))の591-595頁の(recombinant)
[des-Arg166]human erythropoietinに関する章も参照のこと。商業的に入手可
能な組み替え[des−
Arg166]ヒトエリスロポエチンの製剤は、2.5mg/mlのヒト血清アル
ブミン、5.8mg/mlのクエン酸ナトリウム、5.8mg/mlのNaCl
、および0.06mg/mlのクエン酸、pH6.9(+/−0.3)を含有す
る、保存剤を含まない水溶液1ml当たり2,000、3,000、4,000
または10,000単位の糖ホルモンを有する。
特に限定しない限り、本明細書のエリスロポエチンは、リーダーペプチドおよ
び116位のアルギニンが存在しない“成熟”ヒト蛋白質に言及する。
“プレプロエリスロポエチン”とは、プレプロ型をコードするcDNAの哺乳類
細胞内での発現の際にプロセシングを受けてグリコシル化され、最終的には培養
培地中に成熟蛋白質が分泌される前のリーダーペプチドおよびArg166を含む
蛋白質を意味する。天然型ヒト蛋白質および天然型ヒトプレプロ蛋白質のアミノ
酸配列を、配列番号:1に示す。
本明細書で用いた“天然型(又は天然)”および“野性型”とは、同義である
ことを意図している。
本明細書で、20個の“天然に存在する”アミノ酸について以下のような標準
の略号を用いる:
L‐アラニン Ala
L‐アルギニン Arg
L‐アスパラギン Asn
L‐アスパラギン酸 Asp
L‐システイン Cys
L‐グルタミン酸 Glu
L‐グルタミン Gln
グリシン Gly
L‐ヒスチジン His
L‐イソロイシン Ile
L‐ロイシン Leu
L‐リシン Lys
L‐メチオニン Met
L‐フェニルアラニン PheL‐プロリン Pro
L‐セリン Ser
L‐スレオニン Thr
L‐トリプトファン Trp
L‐チロシン Tyr
L‐バリン Val
本明細書で、標準の一文字コード“A”、“C”、“G”および“T”を用い
て、各々、アデニレート、シチジレート、グアニレートおよびチミジレートのヌ
クレオチドを表わす。DNA配列においては、ヌクレオチドは、2′‐デオキシ
リボヌクレオチド‐5′‐燐酸(または5′‐末端の三燐酸)であるが、一方、
RNA配列においては、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド‐5′‐燐酸(また
は5′‐末端の三燐酸)であり、ウリジレート(U)がTの代わりに存在する。
“N”は、4つのヌクレオチドのいずれか1つを意味する。
本明細書の類似体蛋白質“蛋白質X”について言及すると、“[Xa,Yb,d
es−Zc]蛋白質X”とは、天然型蛋白質Xのaの位置のアミノ酸がアミノ酸
Xで置換され、天然型蛋白質Xのbの位置のアミノ酸がアミノ酸Yで置換され、
且つ、通常天然型蛋白質Xのcの位置に存在するアミノ酸Zが喪失した類似体を
意味する。
本明細書で用いた“SV2dhfrSVdeltaSJneo([X′,Yb
]hEPO)”とは、そのベクターでトランスフェクションされた培養哺乳類細
胞が成熟エリスロポエチン
の[Xa,Yb]類似体を分泌するようなcDNAで置換されたプレプロエリスロ
ポエチンをコードするcDNA(配列番号:1参照)を有する発現ベクターSV
2dhfrSVdeltaSJneoEPOを意味する。以下の実施例において
本発明をより詳細に具体的に説明するが、本発明は、それにより制限されるもの
ではない。
クローニング、cDNAの発現ベクター内への発現可能なように挿入、哺乳類
細胞中への真核または哺乳類発現ベクターのトランスフェクションおよびトラン
スフェクションした細胞の選択、培養培地中への分泌により所望の異種蛋白質を
得るための哺乳類細胞の培養、DNAの配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応法(P
CR)を用いた核酸増幅の実施、このような増幅を行うためのプライマーの合成
、蛋白質または核酸精製技術等、並びに、哺乳類発現ベクターのようなものの更
なる例、該ベクターからの発現の使用に適する細胞系、トランスフェクションし
た細胞系を培養するための培養培地、ヒトおよびサル以外の哺乳類プレプロエリ
スロポエチン用リーダーペプチド、核酸増幅法等のような本明細書で述べた種々
の手法の実施に関する更なる詳細及び更なる例は、容易に入手可能であり、当業
者に公知
である。例えば、Current Protocols in Molecular Bio1ogy,F.M.Ausubel等編
,Wiley Interscience,John Wiley and Sons,Inc.,New York(1993),Suppl
ement 21;the ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,7th Ed.,Amer
ican Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA(1992);及びthe
ATCC Media Handbook,American Type Culture Collection,Rockville,Maryla
nd(1984)参照。実施例1 プラスミド発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneoの調製 A. ヒトエリスロポエチンをコードする合成遺伝子の構築
配列番号:8〜15の配列を有する8つの二重鎖オリゴヌクレオチドを調製す
るために標準ホスホアミダイト化学を用い、次いで、8つのオリゴヌクレオチド
をMandeckiとBolling,Gene 68:101-108(1988)により記載されたFok−1遺
伝子合成法に供して、全長のヒトプレプロエリスロポエチンをコードするDNA
を作製した。配列番号:8〜14のオリゴ配列の各々を、その構築が上記Mandec
kiとBollingにより記載されたpWM500のSmaI部位中に連結し、次いで
、
そのベクター内にクローン化した。配列番号:15のオリゴ配列を、その構築が
やはり上記MandeckiとBollingにより記載されたpWM501のSmaI部位中
に連結し、次いで、そのベクター内にクローン化した。クローニング後、Fok
−1を有するベクターの消化および、ポリアクリルアミドゲルからの電気溶出に
よるオリゴの精製により、各オリゴを得た。次いで、プレプロエリスロポエチン
をコードするセグメントを構成する配列番号:1と同じである意図した配列を有
する625bpBamHI断片を含む640塩基対(“bp”)ポリヌクレオチ
ドを得るために、8つのオリゴを相互に連結した。640bp断片を、次のサブ
クローニングを容易にするために5′‐末端上のHindIII部位および3′
‐末端上の単一のEcoRI部位を有するように設計した。640bp断片を提
供するライゲーション後、その断片をEcoRIで消化し、HindIIIで部
分的に消化し、その結果できた640bp断片を同様に消化したpUC19中に
連結して、図1に具体的に示したプラスミドpEPOw5を得た。プレプロエリ
スロポエチンをコードする断片が、実際、ヒトプレプロエリスロポエチンをコー
ドするということを立証しようするために、pEPOw5中
の640bp断片の配列を決定した。B. オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発による合成間違いの修正
pEPOw5のプレプロエリスロポエチンをコードする断片は、ヒトエリスロ
ポエチンの残基84および95に存在するアミノ酸を別のアミノ酸へ変化させた
2つのヌクレオチドエラーを含む。84位および95位のアミノ酸がヒトエリス
ロポエチンと同じになるようにエラーを修正するには、配列番号:1の352位
に存在するCをTに変え;353位に存在するTをCに変え;385位に存在す
るCをGに変え;387位に存在するAをGに変える必要がある。そこで、pE
POw5を、EcoRIで完全にHindIIIで部分的に消化した。消化した
プラスミドを、0.7%アガロースゲル中で電気泳動にかけ、100ボルトで1
時間モデルUEAエレクトロエリューター(International Biotechnologies In
c.,New Haven,Connecticut,USA)を用いて、約640bpの断片をアガロー
スから7.5Mの酢酸アンモニウム塩架橋中に電気溶出した。M13mp18の
複製型をHindIIIおよびEcoRIで完全に消化し、溶出した断片に連結
した。連結したDNAを大腸
菌(菌株DH5alphaF′)中にトランスフェクションし、ファージプラー
クを2×YT培地に移した。ファージを予備的に大腸菌DH5alphaF′細
胞内で増殖させた。ファージを大腸菌CJ236細胞[dut−1、ung−1
]上で力価測定し、MutaGene突然変異誘発キットの製造元(Bio-Rad Laboratori
es,Richmond,California,USA)により推奨されたように0.2のM.O.I
.で感染させることにより同じ菌株から、ウラシルを含有するファージを調製し
た。製造元により推奨されるようにファージから鋳型DNAを抽出した。残基8
4および95の突然変異は、配列番号:2の配列を有するホスホリル化オリゴヌ
クレオチド-1および配列番号:3の配列を有するホスホリル化オリゴヌクレオ
チド‐2の鋳型DNAに対する同時アニーリングによって特定された。適切な配
列修正を有するDNAを、突然変異誘発キットの製造元により推奨された通りに
インビトロで合成した。変異した(修正した)DNAをDH5alphaF′細
胞中にトランスフェクションし、DNA配列決定のためにファージプラークを単
離した。配列確認後、変異した(配列修正した)プレプロエリスロポエチンをコ
ードするDNA断片を、下記の発現のためにサブクローン化
した。合成ヒトプレプロエリスロポエチンをコードするDNAのDNA配列を、
配列番号:1に示す。C. オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるプレプロ‐pm25をコー ドするDNAの構築
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるプレプロ‐pm25(即ち、[
Pro33,Cys139]ヒトプレプロエリスロポエチン)をコードするDNAの
構築を、修正した天然型ヒトプレプロエリスロポエチンをコードするDNAを提
供する上記方法により達成した。修正したプレプロエリスロポエチンをコードす
るDNAを、プレプロ‐pm25をコードするDNAを提供するための鋳型DN
A源として用いた。DNA突然変異誘発プライマーは、(i)配列番号:1の1
99位および200位の両方の位のヌクレオチドがC′に変化した配列番号:4
に特定した配列を有するオリゴヌクレオチド‐3、並びに(ii)配列番号:1
の517位のヌクレオチドがTに変化した配列番号:5に特定した配列を有する
オリゴヌクレオチド‐4である。D. プレプロエリスロポエチンおよびプレプロ‐pm25をコードするDNA の真核細胞発現ベクター中へのサブクローニング
真核細胞発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneoをXbaIで
2時間消化し、等量の緩衝液飽和フェノール/クロロホルム(1:1)、続いて
クロロホルムでDNAを抽出した。消化したDNAをエタノールで沈殿させ、乾
燥し、50マイクロリットルのTE(10mMのトリス、pH8.0、10mM
のEDTA)に再懸濁した。消化したベクターを仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼで37℃で1時間処理した。ホスファターゼ処理したベクターを、フェノール
:クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、乾燥し、REact2緩衝液(5
0mMトリス‐HCl、pH8.0、10mMのMgCl2、50mMのNaC
l)(Gibco‐BRL、Gaithersburg,Maryland,USA)に再懸濁した。X
baIで消化したベクターの突き出た5′‐末端を、室温で30分間のDNAポ
リメラーゼ1(クレノウ)の大断片と0.1mMの2′‐デオキシリボヌクレオ
シド三燐酸との充填反応により平滑にした。クレノウ断片をフェノール/クロロ
ホルム抽出によ
り取り出し、DNAをエタノールで沈殿させ、TE(50マイクロリットル)に
再懸濁した。
ヒトプレプロエリスロポエチンおよびプレプロ‐pm25をコードするDNA
断片を、やはり平滑処理したBamHI断片のような、XbaIで消化しクレノ
ウで平滑化した発現ベクター中にサブクローン化した。これらの断片を大腸菌菌
株HB‐101内でプラスミドの一部として増殖させた。pH8.0のSDSを
用いた溶菌および次の塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製プラスミドを1
リットルの培養物から調製した(T.Maniatis等,Molecular Cloning,89-94頁
,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York,1982)。プラス
ミドDNA濃度を260nmでの吸収により測定した。予備量を、BamHIで
消化し、トリス‐アセテート緩衝液中の0.7%アガロースゲル中で電気泳動に
かけた。約625bpのバンドを、100ボルトで1時間、モデルUEAエレク
トロエリューター(International Technologies Inc,)を用い、アガロースか
ら7.5Mの酢酸アンモニウム塩架橋中に電気溶出した。溶出したDNAをエタ
ノールで沈殿させ、TEに再懸濁した。発現ベクターのために上記で述べたよう
な酵素による
修復により5′‐突出末端を平滑にした。平滑化した発現ベクターおよび断片を
、15℃で16時間T4 DNAリガーゼで連結した。連結混合物を大腸菌内に
形質転換し、修正クローンを標準法により同定した。クローンを1リットル段階
で増殖させ、上記のようにドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いた溶解およ
び塩化セシウム密度勾配遠心分離によりプラスミドDNAを調製した。プラスミ
ド(発現ベクター)を4℃のTE中で貯蔵した。ヒトプレプロエリスロポエチン
用発現ベクターをSV2dhfrSVdeltaSJneoEPOと命名し、[
Pro33,Cys139]ヒトプレプロエリスロポエチン用の発現ベクターをSV
2dhfrSVdeltaSJneopm25と命名した。SV2dhfrSV
deltaSJneoEPOの構築およびサブクローニングの説明図を図2に示
す。
SV2dhfrSVdeltaSJneoを、ネオマイシン耐性遺伝子発現カ
セットおよびSVdeltaSJ発現カセットの公的に入手可能なプラスミドp
SV2−dhfr(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland
,USA,Accession No.37146;Berg等,Mol.Cell.Biol.1:854
-864(1981))への付加により構築した。プラスミドpSV2−dhfrは、p
BR322から誘導された2.3キロ塩基対(kbp)のPvuII〜EcoR
I断片(図2において“ori PBR amp”と称される)を有し、細菌の
複製起点(“ori”)および、プラスミドpBR322から得たβ‐ラクタマ
ーゼ遺伝子(アンピシリン耐性を提供する)(“amp”)を有する。プラスミ
ドpSV2−dhfrも、T‐抗原プロモーターを有するサルウィルス40(S
V40)DNAの0.34kbpのPvuII〜HindIII断片(図2にお
いて“SVE”と称される)、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする
cDNA配列を有する0.74kbpのHindIII〜Bg1II断片(図2
において“dhfr”と称される)、並びにSV40T‐抗原mRNAスプライ
シングおよびポリアデニル化シグナルを有する0.82kbp Bg1II〜B
amHI断片(図2において“sv40−A”と称される)および公知の機能を
持たない0.75kbp BamHI〜EcoRI断片(図2において“sv4
0−B”と称される)を含むSV40 DNAの1.6kbpのBg1II−E
CoRI断片を有する1.9
kbp発現カセットを含有する。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット(ベクタ
ーで形質転換した細胞にネオマイシン耐性を提供する)を、通常のサブクローニ
ング法(例えば、上記Maniatis等)によりプラスミドpSV2−dhfrのPv
uII部位に挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットは、チミジンキナ
ーゼプロモーターを有する単純ヘルペスウィルス‐1(“HSV1”)DNAの
0.25kbp PvuII〜SmaI断片、ネオマイシン耐性を提供する酵素
をコードするトランスポゾンTnSの1.0kbp Bg1II〜SmaI断片
、およびチミジンキナーゼmRNAポリアデニル化部位およびシグナルをコード
するHSV1 DNAの0.6kbpSmaI〜PvuII断片を含有する1.
8kbp断片であり、これら全ての断片は、当業者等に容易に入手可能である。
SVdeltaSJ発現カセットは、T-抗原プロモーターを有するSV40
DNAの0.34kbpのPvuII〜HindIII断片(図2の“SVE”
)、SV40T‐抗原プロモーターの調節下で発現する異種DNAの挿入用Xb
aI部位、B型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子由来の3′‐エンハンサーを有する
B型肝炎ウィルス(サブタイプadw)DNA
の0.44kbp HpaI〜BamHI断片(図において“delta S”
と称される)、及びこのDNAのBamHI J断片由来のHSV1 DNAの
1.85kbpBamHI〜PvuII断片、を有する2.5kbp断片である
。SVdeltaSJカセットを予め組み立て、(クレノウで平滑化した後)S
V2−dhfrのBamHI部位中に挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カ
セットおよびSVdeltaSJ発現カセットのプラスミドpSV2−dhfr
中への挿入により、図2に示したプラスミド発現ベクターSV2dhfrSVd
eltaSJneoが生じた。実施例2 pm25をコードする合成遺伝子の別の構築法
上記SV2dhfrSVdeltaSJneopm25発現ベクターを調製す
る別の方法において、全長のpm25をコードするDNAを、標準ホスホアミダ
イ化学を用いることによりデノボ合成する。一連の二重鎖オリゴヌクレオチドを
、実施例1のアプローチとは異なるが実施例1で述べたものと同様の方法で、例
えば33位のプロリン残基および139位のシステイン残基をコードする変化の
ような天然型エリスロポエチン配列
中に突然変異を既に含む遺伝子から組み立てた場合のオリゴヌクレオチドを調製
する。上記MandeckiとBollingのFok−1遺伝子合成法を用いて又は遺伝子合
成の当業者等に公知の他の方法により、合成オリゴヌクレオチドを組み立てる。
その結果できた合成pm25遺伝子の配列を、組み立てたプレプロ‐pm25遺
伝子の標準DNA配列決定法により確認する。
組み立てたプレプロ‐pm25遺伝子を、次いで、合成プレプロ‐pm25遺
伝子の5’および3’末端の単一の制限部位の包含、次いで制限エンドヌクレア
ーゼ消化およびサブクローニングによるような前述の標準方法によりプラスミド
ベクター/発現ベクター中にサブクローン化する。実施例3 突然変異用RT−PCRによるプレプロ‐pm25遺伝子の別の構築法
プレプロ‐エリスロポエチン類似体遺伝子も、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法
を用いて調製することができる。このような手法の代表的なものは、天然型エリ
スロポエチンをコードする遺伝子の発現レベルを増強することが公知の方法(H
.Scholz等,Am,J.Physiol.263:474-479(1992))で100μMの塩
化コバルトを有する培養物中で48時間哺乳類細胞を処理する、プレプロ‐pm
25をコードするDNA配列調製である。次いで、細胞を、冷食塩水溶液で洗浄
し、遠心分離により培養物から回収する。細胞ペレットを、1%トリトンX‐1
00を含有する食塩水に再懸濁することにより溶解し、遠心分離して核を取り除
くことにより、その結果できた上澄は全mRNAを含有する。あるいは、細胞ペ
レットを、グアニジンイソチオシアネートで溶解して全RNAを調製することが
できる。
次いで、mRNAを、製造元(Dynal A/S,N-0212 Oslo,Norway)により推奨
されるように、Dynabeads Oligo dt25(デオキシチミジン)オリゴヌクレオチド
を担持したビーズへのアニーリングにより単離する。全RNAは、グアニジンイ
ソチオシアネートで溶解した細胞から標準法により調製する。ランダムヘキサマ
ープライマーおよび逆転写酵素を用い、約105細胞または約0.1μgの全R
NAから単離したオリゴdtで選択したmRNAから、相補的DNAを合成する
。cDNAは、突然変異用ポリメラーゼ連鎖反応法の鋳型として役立つ。3セッ
トの異なるプライマーを用いてPCR反応法を行い、プレプロ‐pm25遺伝子
を、各断片用プライマー1セットを有する
3つの異なる断片(アミノ、中間およびカルボキシ)として合成する。
アミノ断片の5’プライマーは、次の分子操作のための制限部位およびcDN
A鋳型の5’末端に相補的な配列を含有する。アミノ断片の3’プライマーは、
分子操作のための制限部位およびcDNA鋳型に相補的な配列を含有する。
中間断片の5’プライマーは、アミノ断片の3’制限部位をアニーリングする
ことのできる制限部位、プレプロ‐pm25の33位のプロリン残基をコードす
るコドン、およびcDNA鋳型に相補的な配列を含有する。中間断片の3’プラ
イマーは、プレプロ‐pm25の139位のシステイン残基をコードするコドン
、次の分子操作用制限部位、およびcDNA鋳型に相補的な配列を含有する。
カルボキシ断片の5’プライマーは、中間断片の3’プライマーの3’制限部
位にアニーリングすることのできる制限部位、およびcDNA鋳型に相補的な配
列を含有する。カルボキシ断片の3’プライマーは、cDNA鋳型に相補的な配
列および次の操作のための制限部位を含有する。
全プレプロ‐pm25遺伝子の最終的組み立てに先立ち、個
々の断片をサブクローン化し、配列を確認することができる。各プライマー中に
取り込んだ制限部位を用いた断片の制限酵素消化および、その結果できた相補的
末端のライゲーションにより、プレプロ‐pm25遺伝子を組み立てる。組み立
てたプレプロ‐pm25遺伝子は、エリスロポエチンをコードするメッセージに
もともと見い出された5’非翻訳および3’非翻訳の配列およびプレプロ‐pm
25遺伝子のコード配列を含有する。これらの非翻訳配列は、当業者等に公知の
方法を用い、プレプロ‐pm25遺伝子のコード配列に相補的なプライマーを用
いた次のPCR反応法を用いて取り出すことができる。次いで、プレプロ‐pm
25遺伝子をコードする全遺伝子を、既に述べたような適切な発現ベクター中に
サブクローン化する。実施例4 形質転換した細胞系による蛋白質の発現 A. ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞のトラン スフェクション
陽イオン性リポソームが仲介する手法(P.L.Felgner等,Proc.Natl.Acad
.Sci,84:7413-7414(1987))を用い、当業者に容易に入手可能であるCHO
/dhfr細胞[dxb−
111](Uriacio等,Proc.Nat.Acad.Sci.77:4461-4466(1980);America
n Type Culture Collection Accession No.CRL 9096)中にプラスミドSV2d
hfrSVdeltaSJneoEPOおよびSV2dhfrSVdeltaS
Jneopm25の各々をトランスフェクションした。B型肝炎ウィルス表面抗
原を発現する発現プラスミドを用いて同様のトランスフェクションを行い、その
結果できたトランスフェクション細胞を、下記のインビボバイオアッセイ実験用
の負の対照培養液源として役立てた。CHO/dhfr‐細胞を、10%仔ウシ
胎児血清、L‐グルタミン(1μM)を追加したHamのF−12培地中で培養し
、トランスフェクションの24時間前に、フラスコ当たり5−8×105細胞の
濃度で25cm2のフラスコ中に新たに接種した。10マイクログラムのプラス
ミドDNAを、2.4g/Lの重炭酸ナトリウムを有する1.5mlのOpti
−MEM I還元血清培地(Gibco-BRL)に加え、組織培養物内の細胞中へのリ
ポソームが仲介するDNAのトランスフェクション用の100マイクロリットル
のリポフェクチン試薬(Gibco-BRL)を、2番目の1.5mlのOpti−
MEM I培地に加えた。これら2つの溶液は、ポリスチレンの試験管内で調製
した。2つの溶液を混合し、室温で20分間インキュベートした。培養培地を細
胞から除去し、Opti−MEM I−リポフェクチン−DNA溶液で置き換え
た。細胞を37℃で3時間インキュベートした後、選択に先立ち更なる24時間
Opti−MEM I−リポフェクチン−DNA溶液を培養培地で置き換えた。B. 選択および増幅
トランスフェクション1日後、細胞を1:3で継代培養し、dhfr/G41
8選択培地(以後、“F−12マイナス培地G”と称する)と共にインキュベー
トした。選択培地は、透析仔ウシ胎児血清(JRH Biosciences,Lenexa,Kansas
,USA)およびml当たり300マイクログラムのG418(Gibco-BRL)を追加
したL‐グルタミン含有、ヒポキサンチン、チミジンまたはグリシン(Gibco-BR
L)非含有のHamのF−12である。
トランスフェクション細胞のF−12マイナス培地Gを用いたインキュベーシ
ョンの4−5日後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(Ringold等,J.Mol.Appl.Gen
et.1:165-174(1981)お
よびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(P.J.Southern and P.Berg
,J.Mol.Appl,Genet.1:327-341(1981))の存在を示すコロニーが出現した
。約2週間後、DHFR/G418細胞は、継代およびF−12マイナス培地G
中での継続維持を可能にするのに十分伸張した。
トランスフェクションしたエリスロポエチンまたはpm25遺伝子の増幅を、
メトトレキセート(R.Schimke,Cell 37:705-713(1984)により概説された)
を用いたDHFR+、G418+細胞の段階的選択により達成した。細胞を、耐
性コロニーが出現するまで約2週間、150nMのメトトレキセート(MTX)
を含有するF−12マイナス培地Gと共にインキュベートした。MTX耐性細胞
を継代培養し、適切な選択培地に維持した。更なる増幅を、5μMのMTXを用
いた選択により達成し、細胞を連続して適切な選択培地に維持した。C. 細胞系の維持および貯蔵
培養物中および種々の選択または増幅手法を受けている細胞は、週3回適切な
培養培地を繰り返し補給された。細胞を、標準法を用い、75cm2のフラスコ
中に適切な培地を用いて1:5で継代培養した。低温貯蔵は、5%DMSO(Si
gma,
St.Louis,Missouri,USA)を含有する1.8mlの適切な培養培地中への2−
4×106細胞の再懸濁および−80℃で24時間冷所貯蔵、次いで−135℃
で永久貯蔵によった。D. 無血清培地中でのエリスロポエチンおよびpm25の生産
エリスロポエチン‐(即ち、rEPO‐)またはpm25を発現するDNAの
いずれかでトランスフェクションした細胞を、300マイクログラム/mlのG
418を含有するF−12マイナス培地G中で集密になるまで生育させ、次いで
、培養培地を除去し、生産培地(5ml/25cm2の表面積)で置き換えた。
生産培地は、L-グルタミン、HEPES緩衝液含有、フェノールレッド(jRH B
iosciences)非含有のVAS培地(魚プロタミン硫酸塩を追加した無血清培養培
地)であった。細胞を37℃で3日間培養し、ならし培地をrEPOまたはpm
25源として用いた。
ならし培地から得たrEPOおよびpm25ポリペプチドは、両方共deS−
Arg166である。実施例5 発現した蛋白質のインビトロ生物学的活性 A.インビトロバイオアッセイ
エリスロポエチン活性を、フェニルヒドラジン処理したマウスの脾臓細胞内へ
の放射線標識したチミジンの取り込みにより測定した(G.Krystal,Exp.Hemat
ol.11:649-660(1983))。少なくとも10週齢のメスのC57/6マウスに、
頚部脱臼の72および96時間前に、フェニルヒドラジン(60mg/kg)を
2回腹腔内(ip)注射した。最も大きい脾臓を取り出し、0.2%ウシ血清ア
ルブミン(BSA)を追加したアルファMEM培養培地(ヌクレオチドを含まな
い)中にやさしく掻き裂いた。組織懸濁液を50mlのポリプロピレン試験管内
で1分間インキュベートし、脾臓細胞を、大きな組織凝集物から取り出した。脾
臓細胞を、臨床用遠心分離機内で1,500rpmで10分間遠心分離し、脾臓
培養培地(SCM)に再懸濁した。SCMは、抗生物質、0.4%BSA、2.
0%Nutridoma NS(Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,Indian
a,USA)、赤血球細胞生育用に選択した30%仔ウシ胎児血清(Hyclone,Logan
,Utah)
および0.1mM2‐メルカプトエタノールを含有するalphaMEM(ヌク
レオチドを含まない)である。細胞懸濁液をナイロンメッシュ(200)に通し
て残存する凝集物を取り除き、次いで、有核細胞を、血球計でカウントした。細
胞を、SCM中で室温で約3時間8×106細胞/mlで時々撹拌しながらイン
キュベートした。96個のU状ウェルを有するマイクロタイタープレートのウェ
ルに50マイクロリットルずっの細胞懸濁液を接種し、これにSCM中の試料同
量を加えた。細胞を、CO2インキュベーター(5%CO2)内で37℃で22−
24時間インキュベートし、次いで、0.6μCiのトリチウム化チミジンを各
ウェルに加え、更に2時間インキュベーションを継続した。マイクロタイタープ
レートを氷上に置くことにより反応を停止させた。PHD細胞回収器(Cambridg
e Technology, Watertown,Massachusetts,USA)を用いグラスファイバーディ
スク上に細胞を回収し、少なくとも蒸留水で10回、95%エタノールで1回洗
浄した。放射能を、シンチレーションカウンター(Beckman Instruments,Fulle
rton,California,USA)を用いて測定した。天然のヒト非組換えエリスロポエ
チン(Toyobo New York,Inc.,New York,New
York,USA)(hEPO)を、陽性の対照として全てのアッセイに0.25−1
6ミリ単位/ウェルで含めた。各データのポイントは、少なくとも3つのウェル
/試料から得た3つの測定値の平均である。
図3に示すように、hEPO(即ち、エリスロポエチン標準)、rEPO(即
ち、SV2dhfrSVdeltaSJneoEPOでトランスフェクションし
たCHO細胞から得た組換え天然型のエリスロポエチン)およびpm25をアッ
セイした場合、用量に依存した応答が得られた。記載した図3のデータは、pm
25では15μg/ml、rEPOでは18μg/mlで開始する一連の希釈に
わたる精製pm25およびrEPOのアッセイからの結果を示す。これらのデー
タは、明らかに、たとえ突然変異体エリスロポエチン、即ちpm25([Pro33
,Cys139]ヒトエリスロポエチン)が、33の位置にシステイン残基を有
さず、従って以前の研究者達がエリスロポエチン活性に必須であると考えた残基
29および33間のジスルフィド結合を形成することができなくても、pm25
は、ヒトエリスロポエチンと同等のインビトロ活性を有することを示している。B.ラジオイムノアッセイおよびインビトロ比活性
rEPOおよびpm25の質量を、市販のラジオイムノアッセイキット(Incs
tar,Stillwater,Minnesota,USA)を用い、標準曲線作製のため陽性の対照と
してhEPOを含めたことを除いては製造元により説明された通りに測定した。
rEPOを、下記の通りに均質になるまで精製し、アミノ酸組成分析により質量
を測定した。Pico Tag Work station(Waters,Milford,Massachusetts,USA)
を用い、約50−300ピコモルの蛋白質を用い、真空下、155℃で2時間、
標準加水分解を行った。精製した標準を−80℃で貯蔵し、新鮮なその一部を各
ラジオイムノアッセイの標準曲線のために用いた。精製した標準は、0.25−
2.0ng/mlの範囲の濃度で用いた場合、直線応答(対数濃度対カウント)
を生じさせた。2ng/mlの標準で、約1050カウントを観察し;1ng/
mlで、約2000カウントを観察し;0.5ng/mlで、約3200カウン
トを観察し;0.25ng/mlで、約4250カウントを観察した。従って、
トランスフェクションしたCHO細胞の培養上澄から得たrEPOまたはpm2
5両方のインビトロ比活性を日常的に算定し、それは90,000から
130,000単位/mgの範囲であった。実施例6 発現蛋白質のインビボ生物学的活性 A.小麦胚芽凝集素クロマトグラフィー
rEPO、pm25およびHbSAg(負の対照として)で各々トランスフェ
クションした細胞から得たならし生産培地を、小麦胚芽凝集素‐セファロースカ
ラムを通過させて部分的に精製(約10倍)し、エリスロポエチン活性を濃縮し
た。予め燐酸緩衝生理食塩水(PBS)で平衡化した1ミリリットルの小麦胚芽
凝集素‐セファロース(Sigma社)を充填した使い捨てミニカラム(Spectrum Me
dical industris,Inc.,Houston,Texas,USA)に30ミリリットルのならし培
地を通過させた。通過液を集め、2回目もカラムを通過させ、次いで、カラムを
9カラム容量のPBSで洗浄し、エリスロポエチン活性を、1.5カラム容量の
N,N‐ジアセチルキチビオースで溶出した(J.L.Spivak等,Blood 52:1178-
1188(1978))。溶出した物質を、インビボバイオアセイに用いるまで−80℃
で貯蔵した。小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーにより得たrEPOまたはpm
25のインビトロ活性は、ならし生産培地から得ら
れた値と区別がつかなかった。B. rEPOおよびpm25の飢餓ラットインビボバイオアッセイ
rEPOおよびpm25のインビボ活性を、改変した飢餓ラットバイオアッセ
イ(W.Fried等,Proc,Soc.Exp,Med,94237-241(1957))で測定した。この
アッセイでは、放射性鉄の取り込みよりむしろ網状赤血球細胞カウントを監視し
た。4または5匹の動物群を、その各々を上記の通りの小麦胚芽凝集素クロマト
グラフィーにより部分的に精製したrEPOまたはpm25で処理した。負の対
照動物を、HbSAgトランスフェクション細胞から得たならし生産培地から調
製した小麦胚芽溶出液で処理した。代表的アッセイでは、ラットを月曜日から金
曜日まで断食させ、火曜日、水曜日および木曜日にrEP0またはpm25を静
脈注射した。月曜日および火曜日に網状赤血球カウントを測定(下記参照)し、
2つの平均を出発網状赤血球カウントとした。網状赤血球カウントを金曜日に測
定し、各動物の残存する網状赤血球のパーセンテージを算定し、各群の平均を算
定した。負の対照のラットは、通常、約50%の出発網状赤血球を保持した。r
EPOまたはpm25のいずれかで
処理したラットの結果を、負の対照に対する治療群平均値の比率として表わした
ところ、60または100ngsのrEP0またはpm25で処理したラットは
、網状赤血球の用量に依存した増加を示した(表1参照)。
同量(ラジオイムノアッセイにより測定して)のpm25で処理したラットは
、rEPOで見られるそれに比し顕著に大きい、用量に依存した応答を示す。ラ
ットを、やはり、インビトロにより測定して同単位量のpm25またはrEPO
で処理した。pm25で処理した動物は、同量のrEPOで処理した動物と比較
した場合、改良された応答を示した(表2参照)。
pm25の増加した効力は、1回量のpm25で処理した動物においても明白
である。火曜日に投与した1回量のpm25で処理したラットは、3回量のrE
POで処理したラットのそれと実質的に等しい応答を示した(表3参照)。
火曜日、水曜日または木曜日に1回量のrEPOで処理したラットは、3回量
のrEPOで処理した動物と比較した場合(1日につき1回)、そのような等価
を示さなかった(表4参照)。
これらのデータは、pm25が、増加したインビボ効力を有するのみならず、
1回量投与により効果的なエリスロトロピックな薬剤である(即ち、複数回量を
用いることなしに効果的である)ことを示している。C. 網状赤血球のフローサイトメトリーな測定
網状赤血球カウントを、チアゾールオレンジ染色(L.G.Lee等,Cytometry 7
:508-517(1986))を用い、抹梢血網状赤血球のフローサイトメトリー分析によ
り測定した。製造元により推奨された通りにRetic-COUNTR(商標)チアゾールオ
レンジ染色(Becton Dickinson,San Jose,California,USA)を用い、フロー
サイトメトリーのためのヘパリン添加ラット全血を調製した。各々5マイクロリ
ットルの試料血を1mlのチアゾールオレンジ染色液と混合し、室温で45分間
暗所でインキュベートした。チアゾールオレンジを欠きPBSを含有することを
除いては同様の方法で未染色の対照を調製した。長時間染色は異常に高い値を生
じさせることから、染色インキュベーション後90分以内に分析を完了した。
15MWの出力、488nmでアルゴンイオンレーザーを装備したEPICS ELIT
Eフローサイトメーター(Coulter
Electronics,Hialeah,Florida,USA)を用いて試料を分析した。ログ(log)
前方角光散乱、ログ側方散乱(90度)、およびログ緑色蛍光パラメーターを集
めた。標準ELITEフィルターを用いたが、前方光散乱については中性度1、側方
散乱については488ジクロイックロングパス、および緑色蛍光については52
5バンドパスである。
フローサイトメーターを、Immuno-Check fluorospheres(Coulter Eleclronic
s社)を用いて毎日調整し、Immuno-Brlte Level II fluorospheres(Coulter El
ectronics社)を用いて標準化した。標準化は、装置のセッティングにおける日
々の変化を埋め合わせる。3つのヒストグラム、即ち、2つのパラメーターログ
側方散乱対ログ前方散乱、ログ蛍光対ログ前方散乱、および単一のパラメーター
ログ緑色蛍光を集めてコンピュータープロトコールを樹立した。
染色した試料を分析して赤血球のみの包含用ゲートを確立した。血小板および
背景の破片を排除する、ログ前方散乱対ログ側方散乱のプロット上のリンパ球お
よび赤血球を含有する集団の周辺に無定形のゲートを描いた。このゲートを記し
た集団を、次いで、ログ蛍光対ログ前方散乱ヒストグラムで表わした。高
度に染色したリンパ球集団を除き、負の赤血球集団および陽性に染色した網状赤
血球集団の周辺に長方形のゲートを描いた。このゲートを記した赤血球集団を、
単一のパラメーターログ緑色蛍光ヒストグラムで表わした。未染色の対照試料を
装置上で分析し、25,000の事象を集めた。カーソルを置いて0.1%のオ
ートフルオレッシングセルを加え、染色した試料を分析した。網状赤血球を全赤
血球のパーセンテージとして表わした。実施例7 発現した蛋白質の精製 A. rEPOの精製
蛋白質rEPOを、ならし生産培地からイオン交換、小麦胚芽レクチンおよび
逆相クロマトグラフィーの組み合わせにより精製した。代表的には、10リット
ルのならし培地を遠心分離により清澄にし、次いで、4℃で、10,000ダル
トン分子量遮断膜を有するBenchmark回転式濃縮器(Membrex,Garfield,New Je
rsey,USA)を用いて10倍に濃縮した。濃縮した回収物を15,000×gで
30分間遠心分離し、次いで、ミリリットル当たり25KIU(キロ国際単位)
のアプロチニンを含有
する同量の冷蒸留水で希釈し、この後、必要に応じて、pHを7.3−7.4に
調整した。希釈した濃縮物を、連結した2本のイオン交換カラムを通過させた。
最初のカラムは、S-Sepharose Fast Flow樹脂(Pharmacia-LKB,Inc.,Piscatta
way,New Jersey,USA)であり、2番目は、DEAE Sepharose Fast Flow樹
脂(Pharmacia-LKB)である。カラムは、各々1.6×33cmであり、20m
MのNaH2PO4、pH7.4、20mMのNaClで平衡化した。これらの条
件下でrEPOはいずれのカラムにも結合しなかったが、しかしながら、多数の
他の蛋白質が結合したことから、実質的精製を達成した。通過液および200m
lの洗液を、予め20mMのNaH2PO4、pH7.4、20mMのNaClで
平衡化した20mlの小麦胚芽凝集素‐セファロースカラム(Sigma社)上に注
ぎ入れ、135mMのNaClを含有する緩衝液で徹底的に洗浄した。rEPO
を、10mMのN,N‐ジアセチルキチビオースを含有する洗浄緩衝液で溶出し
た(上述のJ,L.Spivac等)。画分(3.5ml)を集め、各々を、ミリリット
ル当たり25KIUのアプロチニンを含有するように調整し、各rEPOを、S
DS‐PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム‐
ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により検査した(U.K.Laemmli,Nature 22
7:680-685(1970);H,Schagger and G.von Jagow,Anal.Biochem.166:368-
379(1987))。
クマシーブルー3染色により測定して最も高い水準のrEPOを含有する画分
をプールし、5%TFA(トリフルオロ酢酸)(30μl/ml)で酸性にし、
POROS R2/Hカラム(2.1×100mm)(逆相カラム、PerSeptive
Biosystems,Cambridge,Massachusetts,USA)上でクロマトグラフイーにかけ
た。平衡緩衝液は、5%CH3CN中の0.1%TFAであり、溶出緩衝液は、
80%CH3CN中の0.08%TFAであった。充填の6分後、15分の勾配
溶出(0%から100%緩衝液)を行った。画分を手動で集め、SDS−PAG
Eにより純度をアッセイした。rEPOを−80℃で貯蔵した。
SDS−PAGE上で、rEPOは、31,000および43,000ダルト
ンのマーカー間に移動し、見かけの36,000ダルトンの分子量を有した。次
のプロテアーゼLys−Cを用いた消化およびアミノ酸配列分析(下記参照)に
より、rEPOの存在を確認したが、他の蛋白は判明しなかった。B. pm25の精製
ならし生産培地から得た蛋白質pm25を、rEPOのために説明したそれと
同一の手法により精製した。しかしながら、rEPOと異なり、精製したpm2
5のSDS−PAGE電気泳動は、pm25と共精製された約60,000ダル
トンの電気泳動移動度を有する高分子蛋白質の存在を示した。この高分子量夾雑
物が存在することから、高分子量成分をpm25から分離するため別の精製手法
を実施した。前述の小麦胚芽凝集素‐セファロースクロマトグラフィー工程後、
溶出した物質を、5%CH3CN中の10%TFA(100μl/ml)で酸性
にした。Pharmacia URPC C2/C18カラム(2.1×100mm)を用い、1分当たり20
0マイクロリットルの流速で、吸収を監視することにより生成物含有画分収集を
自動化したSMART3高性能液体クロマトグラフィーシステム(Pharmacia社)
上で試量をクロマトグラフィーにかけた。初めの緩衝液は、5%CH3CN中の
0.1%TFAであり、溶出用緩衝液は、80%CH3CN中の0.08%TF
Aである。充填の5分後、溶出緩衝液の濃度は、1分後に0%から40%増大し
た。30分の40%から70%溶出緩衝液勾配を実施してpm25を溶出
した。SMARTシステムの“ピーク検出”能力を用いて画分を集め、SDS−
PAGEを用いてpm25を同定した。部分的に精製したpm25を乾燥し、1
00mMのCH3CO2NH4、pH4.1、6M尿素に再懸濁した。同じ緩衝液
中で平衡化したMono-S陽イオン交換カラム(Pharmacia社)(1.6×50mm
)上に試料を充填し、SMARTシステムを用い室温でクロマトグラフィーにか
けた。試料を1分当たり100マイクロリットルで充填し、1分当たり150マ
イクロリットルでクロマトグラフィーにかけた。充填の5分後、20分の0−5
0%溶出緩衝液(100mMのCH3CO2NH4、pH4.1、1MのNaCl
、6Mの尿素)勾配を実施した。SMARTシステムの“ピーク検出”能力を用
いて画分を集め、SDS−PAGEを用いてpm25を同定した。溶出したpm
25を、次いで、上述のようにURPC C2/C18カラム(2.1×100
mm)上で再度クロマトグラフィーにかけた。試料を5%TFAで酸性にし、1
分当たり200マイクロリットルでカラム上に充填した。初めの緩衝液は、5%
CH3CN中の0.1%TFAであり、溶出緩衝液は、80%CH3CN中の0.
08%TFAである。充填の5分後、25分の勾配溶
出(0から100%緩衝液)を行った。SMARTシステムの“ピーク検出”能
力を用いて画分を集め、SDS−PAGEを実施して位置を確認し純度を評価し
た。電気泳動分析は、29,000および43,000ダルトンのマーカー間に
移動している単一のバンドを示し、見かけの約36,000ダルトンの分子量を
示した。次のLys−Cを用いたプロテアーゼ消化および配列分析は、pm25
の存在を示し、他の蛋白の存在を示さなかった。実施例8 精製した蛋白質の生物学的活性 A. 非貧血ラットモデルにおけるrEPOおよびpm25のインビボ活性
精製したrEPOおよびpm25の生物学的活性を、処理した及び擬似処理し
たラットのヘマトクリットを測定することにより長期間非貧血ラットモデルで比
較した。5匹のラット群を1週当たり3回計4週間、rEPOまたはpm25で
処理するかまたは賦形剤(0.2%のBSAを含有するPBS)で擬似処理した
。4つの群の動物を、静脈注射により賦形剤中の150、300、450または
600ngsのrEPOで処理
し、2つの群を、同じ方法で賦形剤中の150または300ngsのpm25で
処理した。1つの群の動物は対照として役立て、1週当たり3回4週間賦形剤で
静脈処理した。4週間の最後に各動物のヘマトクリットを測定し、各群の平均ヘ
マトクリット値を算定した。150ngsのpm25で処理した動物は、300
ngsのrEPOで処理した動物のそれと実質的に等しい応答を示した。同様に
、300ngsのpm25で処理した動物は、600ngsのrEPOを投与し
た動物のそれと実質的に等しい応答を示した。従って、この長期モデルにおいて
は、pm25は、天然型の組換えエリスロポエチンに比べ、処理した動物のヘマ
トクリットを上昇させるのに約2倍効果的であった(表5参照)。
同様の実験で、pm25の週に1回の投与を、rEPOの週当たり3回の投与
と比較した。1つの群の動物を週に3回4週間300ngsのrEPOで処理し
た。2つの群の動物を週に1回450または600ngsのいずれかのpm25
で処理した。1つの群の動物は、週に3回賦形剤で処理し、擬似処理した対照と
して役立てた。4週間の処理計画の最後に各動物のヘマトクリットを測定し、各
群の平均ヘマトクリット値を算定した。週1回pm25で処理した動物は、週に
3回300ngsのrEPOで処理した動物と実質的に等しい応答を示した。こ
れらのデータは、エリスロポエチンと比較した場合、pm25が、減少した投与
頻度という有利性を提供することを示している(表6参照)。
更に別の関連実験で、週に1回rEPOを長期間非貧血ラットモデルに投与し
、擬似処理した及びrEPO処理した動物のヘマトクリットを比較することによ
り、rEPOの週1回投与を調査した。5匹の動物群を、週3回賦形剤(0.2
%のBSAを含有するPBS)で擬似処理する、rEPOで処理する、または週
1回rEPOで計4週間処理した。
1つの群の動物を、週3回4週間賦形剤のみで処理し、賦形剤対照として役立
てた。3つの群の動物を、週3回4週間、賦形剤中の150、300または45
0ngsのrEPOで処理した。3つの更なる群の動物を、週1回4週間、賦形
剤中の300、600または900ngsのrEPOで処理した。
週3回処理した動物は、55.3%から60.8%の範囲のヘマトクリット水
準における用量に依存した増加を示した(表7参照)。週1回300または60
0ngsのrEPOで処理した動物は、賦形剤で処理した対照と比較してヘマト
クリットの明らかな増加を示さなかったが、しかしながら、週1回900ngs
で処理した動物は、賦形剤処理した動物に比べヘマトクリットのささやかな増加
のみ、および週3回投与した最も低いrEPO投与量で処理した動物に見られる
それに比べ著しく低い増加を示した。これらのデータは、表6に示した通りのp
m25の週1回投与で得られたものと比較した場合、本発明の類似体が、天然の
エリスロポエチンと比較して週1回投与により、より大きいインビボエリスロポ
エチン効果を生み出すことを示唆している。
B. 非貧血アフリカみどりざるモデルにおけるrEPOおよびpm25のイン ビボ活性
精製したrEPOおよびpm25の生物学的活性を、rEPOで週3回または
pm25で週1回処理したアフリカみどりざるのヘマトクリットおよびヘモグロ
ビン濃度を測定することにより長期間非貧血アフリカみどりざるモデルで比較し
た。オスの動物を5匹の2つの群に分割した。処理に先立ち、48時間間隔で測
定毎に0.5mlの血液を採取することにより、その
週に3回ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を測定した。各群の3回の測定
値の平均を、各動物群の処理前値として用いた。
1群の動物を、週3回計4週間、2μg/kgのrEPOで処理した。第2群
の動物を、週1回計4週間、4μg/kgのpm25で処理した。エリスロポエ
チンを用いた処理は、血中鉄を枯渇させることが知られており、薬物の効能が利
用可能な鉄により制限される(J.Eschbach等,New Eng.J.of Med.316:73-78
(1987));従って、アフリカみどりざるの両方の処理群を、週2回10mgの
ペプトン化鉄(Rogenic,Forest Pharmaceuticals,St.Louis,Missouri,USA
)で処理してrEPOまたはpm25の効能に起因または効能を制限するかもし
れない鉄欠乏を排除した。
処理期間の最後に、ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を72時間間隔で
2回測定した。最終のヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度をこれらの値の平
均値として算定したところ、rEPOで週3回処理した動物のヘマトクリットお
よびヘモグロビン値とpm25で週1回処理した動物のそれとは、実質的に同一
であることが分かった(表8参照)。
実施例9 発現蛋白質の構造的特徴 A.精製したrEPOおよびpm25のプロテアーゼLys−C消化
rEPOおよびpm25をLys−Cで消化し(K.L.Stone等,A Practical
Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing,pp.31-471
,ed.P.L.Maztsudaira,Academic Press(1989))、その結果できたペプチ
ドを分析してこれらの分子内のジスルフィド結合の位置について地図を作製した
。代表的には、100マイクログラムの精製蛋白質をミクロ遠心チューブ中に乾
燥させ、蛋白質を50マイクロリットルの400mMのNH4HCO3、pH8.
2、2mMの
EDTA、8Mの尿素(脱イオン化)で溶解した。各々の2番目の試料を、Ly
s−C消化に先立ち還元した。還元は、窒素下、37℃で30分間4.5mMの
ジチオトレイトール(DTT)を用いて行い、還元後、試料を室温に平衡化し、
窒素下暗所で室温で1時間10mMのヨード酢酸でアルキル化した。還元化およ
び非還元化試料を、尿素濃度が2Mになるように蒸留水で希釈した。蛋白質を、
窒素下、37℃で2−3時間、1.5マイクログラムのLys−Cで消化し、次
いで、更なる1.5マイクログラムの酵素を加え、消化を15時間継続した。T
FAを0.5%になるように加えることにより、消化を終了させた。uRPC
C2/C18カラム(2.1×100mm)およびSMARTシステム(Pharma
cia社)を用いて逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によりペプチ
ドを単離した。平衡緩衝液は、5%CH3CN中の0.1%TFAであり、溶出
緩衝液は、80%CH3CN中の0.08%TFAである。流速は、1分当たり
200マイクロリットルである。充填の5分後、55分の勾配溶出(0%から1
00%緩衝液)を実施した。SMARTシステムの″ピーク検出″能力を用いて
溶出したピークを集めた。画分は、アミノ酸配列に先立ち
−20℃で貯蔵した。Lys−Cペプチドの同定は、アミノ酸配列決定法(R.M
.Hewick等,J.Biol.Chem.256:7990-7997(1981))により、ABIモデル1
20A PTH分析器(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,California
,USA)を装備したABIモデル470Aまたは477Aシーケネーターを用い
て測定した。データを集め、クロマトグラフィックデータマネージメント用ソフ
トウェアパッケージを有するアミノ酸配列分析用PE Nelsonソフトウェアシステ
ム(Access* Chrom,Micro Vax 2000,Cupertino,California,USA)を用いて
分析した。B.rEPOおよびpm25におけるジスルフィド結合の同定
エリスロポエチンの推論したアミノ酸配列は、分子内の8個のリシン残基を予
言する。実施例1で述べたpm25の構築は、リシン残基の数または位置を変化
させない。従って、これら両方の分子は、非常に類似したLys−Cペプチドを
有するはずであるが、pm25の残基33および139におけるアミノ酸の変化
ゆえに違いが生じている。アミノ酸配列は、これらの分子をこのプロテアーゼで
消化する場合、rEPOまたはpm25のいずれかから生じるであろう9個のL
ys−Cペプチド
を予言する。両方の分子のLys−C断片の位置を図4に示す。断片は、丸括弧
で示した各ペプチド内に含有したエリスロポエチン残基を有するK1からK9ま
でと命名される。エリスロポエチンに存在することが知られているジスルフィド
結合の位置(P.H.Lai等,J.Biol.Chem.261:3116-3121(1986))は、残基
29および139のシステインをおそらく結合させる新規のジスルフィド同様p
m25に含まれる。
rEPOのLys−C消化の逆相クロマトグラフィーは、非組換えエリスロポ
エチン(hEPO)について既に報告された(M.A.Recny等,J.Biol.Chem.
262:17156-17163(1967))ものと非常に類似したパターンを示しており、図4
の図式表現と一致した。クロマトグラフィーからのペプチドの帰属は、ペプチド
断片のアミノ酸配列決定に基づいた。還元および非還元rEP0のペプチド地図
の比較は、ペプチドK1およびK9が、未還元試料では共クロマトグラフし、還
元試料では異なる保持時間で溶出することを示した。これは、rEPO(および
hEPO)のペプチドK1およびK9間のジスルフィド結合の明白な証拠と考え
られる。還元および非還元pm25のペプチドプロフィールの調査は、ペプチド
K1およびK9について同一のパターンを示した。しかしながら、ペプチドK2
および
K6も、還元および非還元試料で変化した保持時間を示した。ペプチドK2は、
非還元pm25試料ではK6と共クロマトグラフし、還元pm25試料では明ら
かに異なる保持時間を有した。これは、ペプチドK2およびK6が、図4に示し
たようなジスルフィド橋により結合しているという明白な証拠と考えられる。実施例10 エリスロポエチンの二重突然変異体の調製
活性の著しい損失を引き起こす最初の位置の突然変異(アミノ酸の変化)が、
蛋白質の一次構造の最初の位置から離れている2番目の位置での突然変異によっ
て埋め合わされ、二重突然変異体の活性が、活性を減少させる最初の位置の突然
変異を有する突然変異体のそれに比し顕著に高くなるような哺乳類エリスロポエ
チンの二重突然変異体を下記の通りに調製する。この実施例の文脈では、当業者
には当然のこととして、特に断わらない限り、″活性″とはインビボの赤血球新
生における比活性を指す。
残基33の最初の突然変異が、実質的にエリスロポエチン活性を失わせ、2番
目の突然変異、即ち残基139のArgから
Cysへの変化が、エリスロポエチン活性を完全に修復、あるいは野性型糖ホル
モンのそれ以上にエリスロポエチン活性を改良さえする最初のこのようなヒトエ
リスロポエチンの二重突然変異体は、pm25である。分子内の代償突然変異が
哺乳類エリスロポエチンで可能であるというこの証明は、エリスロポエチン活性
が、実質的に、相当する野性型糖ホルモンのそれ以上に改良されるような二重突
然変異体を含む、この糖ホルモンの種々の二重突然変異体を入手可能にする。
熟練した研究者は、一つの位置のアミノ酸の変化ゆえに活性が減少した(およ
び、典型的には実質的に活性がなくなった)最初の突然変異体をコードする最初
のcDNAから開始して、2番目又はその次の位置に1つ以上のアミノ酸の変化
を有することで最初のものと異なる非常に多数の2番目の突然変異体を容易に生
じさせることができ、所望の水準のエリスロポエチン活性を有するこれらの突然
変異体について2番目の突然変異体をコードする2番目のcDNAを発現により
スクリーニングすることができる。
ヒトエリスロポエチンを用いて、方法を具体的に説明するが、典型的なケース
では、最初の突然変異体は、インビトロのエリ
スロポエチン活性がない。しかしながら、この方法は、いずれの哺乳類エリスロ
ポエチンも供することができ、その場合、最初の突然変異体は、野性型と比較し
て減少してはいるがなくなってはいない活性を有することは、容易に明らかであ
る。
この方法は、ヒトエリスロポエチンのプレプロ最初の突然変異体をコードする
最初のcDNAから開始して4つの工程を伴う。代表的には、リーダーペプチド
をコードするcDNAのセグメントは、プレプロ‐ヒトエリスロポエチンのリー
ダーペプチドをコードする。最初の工程において、最初のcDNA内の多数のラ
ンダム突然変異は、その結果できたアミノ酸の変化が、成熟糖蛋白質の1次配列
に於いて、最初の突然変異体においてアミノ酸が変化した位置から離れている位
置にあるような部位に生じる。突然変異が、プレプロ‐最初の突然変異体をコー
ドする全cDNAに沿って実質的にランダムに分布している場合でさえ、それら
のほとんどは、最初のcDNAのリーダーペプチドをコードするセグメントの外
側にあり、かつ成熟蛋白質の1次配列に於いて、最初の不活性な突然変異体糖ホ
ルモンのアミノ酸が変化した位置から離れている位置のアミノ酸に対応するヌク
レオチドトリプレット(コドン)中にある。“離
れて”とは、少なくとも1、更に代表的には少なくとも10アミノ酸の分離を意
味する。
二番目に、最初の工程からランダムに突然変異した2番目のcDNAのレパー
トリーをクローニングのため真核細胞発現ベクター中にライゲートし、その結果
できた、ランダムに突然変異した2番目のcDNAを包含するベクターのライブ
ラリー(“ランダムライブラリー”)を、適切な宿主内にクローンして都合のい
い量のベクターのライブラリーを調製する。
3番目に、発現ベクターライブラリー内のランダムに突然変異した2番目のc
DNAが、発現およびプロセスして成熟した、2番目の突然変異体を分泌するこ
とのできる真核細胞(例えば、CHO細胞または他の適切な哺乳類細胞)中にラ
ンダムライブラリーをトランスフェクションする。次いで、細胞を培養し、その
結果できた細胞集団をスクリーニングして、エリスロポエチン活性用インビトロ
アッセイでこのような活性を生み出す単一の細胞クローンを単離する。このよう
な活性を有するクローンは、最初の突然変異体における活性の欠乏を2番目の突
然変異が代償する2番目の突然変異体であるエリスロポエチン類似体を産生する
ものである。
4番目に、それを産生するクローンから得たエリスロポエチンの2番目の突然
変異体をコードする2番目のcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応法(“PCR”
)または他のいずれかの核酸増幅技法により増幅し、増幅した核酸を配列決定し
て2番目の代償突然変異の位置およびアミノ酸の変化を決定する。たった今述べ
たようなプレプロ‐最初の突然変異体をコードするcDNAをランダムに突然変
異する過程で生じる“代償突然変異”が、1つ以上の位置のアミノ酸の変化また
は、アミノ酸の付加もしくは欠失を伴うといえども、このような突然変異は、た
だ1つの位置でのアミノ酸の変化を伴うこともあろう。
次いで、その結果できた新規に同定した二重突然変異体エリスロポエチンをコ
ードするcDNAを、適切な真核細胞発現ベクター内で用いて、ベクターで形質
転換した哺乳類細胞を培養することにより、二重突然変異糖ホルモンを産生させ
、このように産生した二重突然変異体のインビボ比活性を、上記pm25のため
に述べたような適切な動物モデルで試験する。
PCRによる変異誘発の方法は、代償的アミノ酸の変化をもたらす2番目の突
然変異を、本来の蛋白質の最初の突然変異の部位から離れた部位に誘導すること
のできる1つの手法である。
このような方法では、2つのPCRプライマーの3′‐末端が2番目の突然変異
を誘導することを意図するcDNAのセグメントをくくり、PCRプライマーの
ーつが最初の突然変異を含むセグメントにアニーリングし、その結果、PCR法
における更なる突然変異から最初の突然変異を保護する。プライマー伸長のため
プライマーがその1本鎖にアニーリングする、最初のcDNAのセグメントは、
変異誘発から保護される。突然変異は、プライマーの3′‐末端によりくくられ
ている最初のcDNAのセグメント中にランダムに誘導される。プライマー間の
距離が離れているほど、糖ホルモンのアミノ酸の分子内代償突然変異を誘導する
突然変異にさらされる最初のcDNA(不活性または減少した活性の最初の突然
変異体をコードする)の領域は広くなる。各々のプライマーは、エリスロポエチ
ンのプレプロ‐二重突然変異体の発現用ベクター内へのPCR法で増幅した断片
の導入を容易にするため、1本鎖の制限部位を含むか又は1本鎖の制限部位を含
む最初のcDNAのセグメントにアニーリングするかのいずれかである。PCR
法は、ヌクレオチド取り込みにおける誤りを容易にする条件下で行う。このよう
な条件には、PCR増幅反応混合物中の2′‐デオキシリ
ボヌクレオシド‐5′‐三燐酸の内3つは1mM濃度、4番目は200μM濃度
、0.5mMのMn+2、6mMのMg+2、およびTaqポリメラーゼの使用が含
まれる。
更に詳しくは、この方法は、二重突然変異体pm25に関して以下の通りに行
う:33の位置のCysからProへの突然変異を有するもののような不活性な
または減少した活性のエリスロポエチン類似体をコードする最初のcDNAを、
PCR法を用いた変異誘発を開始するための鋳型として用いる。このような1つ
の最初のcDNAは、199および200の位置にCCを有することのみが配列
番号:1に示されるそれと異なる配列を有する。具体的に説明するのにこの最初
のcDNAを用いると、配列番号:1に示される配列を有する(199−200
の位置を除く)cDNAの鎖の199および200の位置のCCを含むセグメン
トにハイブリダイズする最初のPCRプライマーを用いる。また、最初のプライ
マーがアニーリングしないcDNAの鎖にハイブリダイズする2番目のプライマ
ーを用いる。2番目のプライマーは、配列番号:1で具体的に説明したような5
17の塩基の3′にある位置にある塩基対とその3′‐末端の塩基が対になるこ
の鎖のセグメントにアニーリ
ングする。従って、PCR変異誘発法において、配列番号:1の517の塩基に
対応する最初のcDNAの塩基対が、トリプレット517−519を、Cysを
コードするものに変換するTへと変異誘発されることは可能である。
増幅した生成物の末端を規定するプライマー間のランダム突然変異を有する配
列を含むPCR変異誘発された生成物を、次いで、上記で示唆したようにPCR
生成物中に取り込まれた部位を用い、制限酵素で消化する。ランダム突然変異を
有するものを含むサイズである、消化物から得た断片を、次いで、二重に突然変
異したエリスロポエチン類似体の培養中での発現および哺乳類細胞からの分泌が
可能なように適切な真核細胞発現ベクターにライゲートする。このような発現ベ
クターは、グリコシル化および分泌を提供する、成熟二重突然変異体のアミノ末
端で哺乳類(この場合、好ましくはヒト)エリスロポエチンリーダーペプチドを
提供し、当然のことながら、転写および、哺乳類細胞のプレプロエリスロポエチ
ン二重突然変異体の発現に必要な他の工程のための適切なシグナルを提供する。
また、このベクターは、哺乳類細胞のトランスフェクションおよび他の用途に十
分な質のベクターを提供するクローニングにも好適
である。例えば、PCR法で増幅した断片は、まず、プレプロエリスロポエチン
の一部をコードする断片にライゲートして、全鎖長のプレプロエリスロポエチン
ニ重突然変異体をコードするcDNAを有する断片を提供することができる。全
鎖長の蛋白質をコードするこれらの断片は、次いで、SV2dhfrSVdel
taSJneoのようなベクター中にライゲートして二重突然変異体に好適な発
現ベクターを提供することができる。
その結果できた、二重に突然変異した取り込まれたcDNAを有する発現ベク
ターのライブラリーは、次いで、大腸菌のような適切な宿主にクローンして更な
る研究のために十分な量のライブラリーを得る。
二重に突然変異したcDNAを有する発現ベクターのライブラリーを、上記実
施例2で述べたように哺乳類細胞(例えば、CHO細胞)中にトランスフェクシ
ョンする。細胞を、単一細胞のクローンまたは、少数(例えば、約10個)の細
胞のコロニーとして培養する。各培養物を、インビトロエリスロポエチン活性に
ついてスクリーニングする。陽性(このようなインビトロ活性について)として
スクリーニングする唯一の培養物
は、最初の(例えば、cys33からpro33)突然変異により引き起こされた活
性の衰退を代償する2番目のランダム突然変異を有するエリスロポエチン類似体
が発現するものである。活性を示すが1個を超える細胞から生育した培養物は、
単一の細胞のクローンとしてサブカルチャーして、二重に突然変異した活性な類
似体を産生する細胞を単離することができる。
類似体をコードするcDNAを、生物学的に活性な糖ホルモンを産生する細胞
から単離し、次いで、標準技法により配列決定してこのような細胞から得たエリ
スロポエチンにおける2番目の代償的突然変異を確認することができる。
生物学的に活性な糖ホルモンを産生する細胞を培養することができ、糖ホルモ
ンを、培養培地から単離精製し、次いで、上記のように適切な動物モデルでイン
ビボエリスロポエチン活性を試験することができる。このように、増加した効力
、延長した半減期等のために増強した薬学上の効用を有する二重突然変異体類似
体を見い出すことができる。
最初の不活性な突然変異体に対しインビボエリスロポエチン活性を修復する代
償的突然変異を有する、エリスロポエチンの二重突然変異体は、最初の不活性化
突然変異の排除により、
更に活性な突然変異体に変換することができることが認められるであろう。従っ
て、本発明は、インビボエリスロポエチン活性を有する哺乳類(好ましくはヒト
)エリスロポエチンの、突然変異が一つの類似体も提供する。本発明のこのよう
な、突然変異が一つの類似体は、成熟野性型糖ホルモンの配列からの一つの最初
のアミノ酸の変化を有しており、この最初の変化が、野性型糖ホルモンの配列か
らの一つの2番目のアミノ酸の変化を有する類似体および野性型糖ホルモンのそ
れに比し減少したインビボエリスロポエチン活性を有する類似体で引き起こされ
た場合、一つの2番目のアミノ酸の変化を有する、突然変異が一つの類似体のイ
ンビボエリスロポエチン活性を増加させる。本発明のこのような、突然変異が一
つの類似体の例は、ヒトエリスロポエチンの[Cys139]類似体である。
本発明の実施例を上記で詳細に述べてきたが、具体的に述べてきたものの改変
および変形は、当業者等に容易に明らかであるが、以下の特許請求の範囲によっ
てのみ明確にする本発明の精神内および従ってその範囲内にあることを意図する
ものである。
【手続補正書】特許法第184条の8
【提出日】1995年6月20日
【補正内容】
請求の範囲
1. ヒトエリスロポエチン類似体であって、X33が20個の通常存在するアミ
ノ酸から成る群から選ばれる、[X33,Cys139]‐ヒトエリスロポエチンお
よび[X33,Cys139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチンの配列か
ら成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する前記類似体。
2. des−Arg166である請求項1に記載の類似体。
3. X33がProである請求項2に記載の類似体。
4. X33がCysである請求項2に記載の類似体。
5. 二重鎖DNAであって、X33が20個の通常存在するアミノ酸から成る群
から選ばれる、[X33,Cys139]‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群
から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチンの類似体をコードする
配列中の498ヌクレオチドのセグメントまたは、[X33,Cys139,des
−Arg166]‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸
配列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする配列中の495ヌクレオ
チドのセグメントを含む前記二重鎖DNA。
6. X33がProである請求項5に記載の二重鎖DNA。
7. X33がCysである請求項5に記載の二重鎖DNA。
8. セグメントが498個のヌクレオチドから成る請求項6に記載の二重鎖D
NA。
9. セグメントが498個のヌクレオチドから成る請求項7に記載の二重鎖D
NA。
10. 498または495個のヌクレオチドのセグメントが、2つの隣接する
サブセグメントの1つであり、他方のサブセグメントは、哺乳類プレプロエリス
ロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、隣接するサブセグメントによ
りコードされるポリペプチド内のリーダーペプチドのカルボキシ末端が、エリス
ロポエチン類似体のアミノ末端に隣接しているような498‐ヌクレオチドまた
は495‐ヌクレオチドサブセグメントに結合している、請求項5〜9のいずれ
かつに記載の二重鎖DNA。
11. リーダーペプチドをコードするサブセグメントによりコードされるリー
ダーペプチドが、配列Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu
Leu Ser Leu X3 Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val X4 Gly(ここで、X3は、
Leuお
よびValから成る群から選ばれ、X4は、LeuおよびProから成る群から選ばれる)
を有する、請求項10に記載の二重鎖DNA。
12. X3およびX4が、各々Leuである、請求項11に記載の二重鎖DNA。
13. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端
に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ
エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請
求項10に記載の二重鎖DNA。
14. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端
に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ
エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請
求項11に記載の二重鎖DNA。
15. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端
に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ
エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請
求項12
に記載の二重鎖DNA。
16. プレプロエリスロポエチン類似体をコードするセグメントを含む二重鎖
DNAを、プレプロエリスロポエチン類似体の発現が作動可能なようにベクター
のXbaI部位に挿入したSV2dhfrSVdeltaSJneoから成る、
請求項15に記載の発現ベクター。
17. 発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro33,
Cys139]hEPO)。
18. 発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys139]
hEPO)。
19. 培養哺乳類細胞であって、共に、そのカルボキシ末端でヒトエリスロポ
エチン類似体のアミノ末端に結合している哺乳類のプレプロエリスロポエチンの
リーダーペプチドから成る前駆体ポリペプチドをコードする2つの隣接するセグ
メントからなるDNAを前記細胞中で発現させるための発現ベクターを含有し、
該セグメントの1つが該リーダーペプチドをコードし、該セグメントの他方が4
98塩基対を有しかつ[X33,Cys139]‐ヒトエリスロポエチン(X33は2
0個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれ
る)の配列から成る群から選ばれる配列を有する該エリスロポエチン類似体をコ
ードすることを特徴とする前記哺乳類細胞。
20. dhfr‐でありかつ、発現ベクターが、2つの隣接するセグメントか
ら成る前記DNAをプレプロエリスロポエチンの発現が作動可能なようにそのベ
クターのXbaI部位に挿入したSV2dhfrSVdeltaSJneoから
成る請求項19に記載の哺乳類細胞。
21. 発現ベクターがSV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro33
,Cys139]hEPO)およびSV2dhfrSVdeltaSJneo([
Cys139]hEPO)から成る群から選ばれ、及びチャイニーズハムスター卵
巣細胞である請求項20に記載の哺乳類細胞。
22. 赤血球新生を誘導するのに有用な医薬組成物であって、(a)[X33,
Cys139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20
個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ば
れるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、
(b)医薬上許容されうる担体と組み合わせて含むことを特徴とする前記医薬組
成物。
23. X33がProである請求項22に記載の医薬組成物。
24. X33がCysである請求項22に記載の医薬組成物。
25. 貧血を治療するのに有用な医薬組成物であって、(a)[X33,Cys139
,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20個の通
常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ばれるア
ミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、(b)
医薬上許容されうる担体と組み合わせて含む前記医薬組成物。
26. X33がProである請求項25に記載の医薬組成物。
27. X33がCysである請求項25に記載の医薬組成物。
28. 哺乳類における赤血球新生を誘導する方法であって、[X33,Cys13 9
,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20個の通常
存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ばれるアミ
ノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導するのに有効な量のエリスロポエチン類似
体を該哺乳類に投与することからなる前記方法。
29. X33がProまたはCysである請求項28に記載の方法。
30. 前記類似体を、週に3回未満行う静脈注射により投与する請求項28に
記載の方法。
31. 貧血症に罹患した哺乳類の貧血を治療する方法であって、[X33,Cy
s139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20個の
通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ばれる
アミノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導するのに有効な量のヒトエリスロポエ
チン類似体を該哺乳類に投与することからなる前記方法。
32. X33がProまたはCysである請求項31に記載の方法。
33. 前記類似体を、週に3回未満静脈注射により投与する請求項31に記載
の方法。
34. ヘマトクリットまたはヘモグロビン含量の値が低い哺乳類のヘマトクリ
ットまたはヘモグロビン含量又はその両方を増加させる方法であって、[X33,
Cys139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20
個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ば
れるアミノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導
するのに有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を該哺乳類に投与することから
なる前記方法。
35. X33がProまたはCysである請求項34に記載の方法。
36. 前記類似体を、週に3回未満静脈注射により投与する請求項34に記載
の方法。
37. 赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項25に記載のヒトエリスロ
ポエチンの第2類似体を哺乳類に投与することからなる哺乳類の治療方法。
38. 赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項25に記載の医薬組成物を
哺乳類に投与することからなる、哺乳類の貧血を治療する。
39. 赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項22に記載の医薬組成物を
哺乳類に投与することからなる、哺乳類において赤血球新生を誘導する方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12N 5/10 9281−4B C12N 5/00 B
C12P 21/02 9455−4C A61K 37/24 ACC
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12P 21/02
C12R 1:91)
(72)発明者 デ・ブリーズ,ピーター・ジエイ
アメリカ合衆国、イリノイ・60016、デ
ス・プレインズ、ダブリユ・グラント・ド
ライブ・1083
(72)発明者 メロビツツ,バリー・エス
アメリカ合衆国、イリノイ・60659、シカ
ゴ、ノース・セントラル・パーク・6244
(72)発明者 ムース,ジヨゼフ・エル
アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ
テイビル、ジユニパー・パークウエイ・
1003
(72)発明者 スキフアー,バーリン・ジイ
アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ
テイビル、ハーバード・レーン・607
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. ヒトエリスロポエチン類似体であって、X33が20個の天然に存在するア ミノ酸から成る群から選ばれる、[X33,Cys139]‐ヒトエリスロポエチン および[X33,Cys139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチンの配列 から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する前記類似体。 2. des−Arg166である請求項1に記載の類似体。 3. X33がProである請求項2に記載の類似体。 4. X33がCysである請求項2に記載の類似体。 5. 二重鎖DNAであって、X33が20個の天然に存在するアミノ酸から成る 群から選ばれる、[X33,cys139]‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る 群から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする 配列中の498ヌクレオチドのセグメントまたは、[X33,cys139,des −Arg166]-ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配 列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする配列の495ヌクレオチド のセグメントを含む前記二重鎖DNA。 6. X33がProである請求項5に記載の二重鎖DNA。 7. X33がCysである請求項5に記載の二重鎖DNA。 8. セグメントが498個のヌクレオチドから成る請求項6に記載の二重鎖D NA。 9. セグメントが498個のヌクレオチドから成る請求項7に記載の二重鎖D NA。 10. 498または495個のヌクレオチドのセグメントが、2つの隣接する サブセグメントの1つであり、他方のサブセグメントは、哺乳類プレプロエリス ロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、隣接するサブセグメントによ りコードされるポリペプチド内のリーダーペプチドのカルボキシ末端が、エリス ロポエチン類似体のアミノ末端に隣接しているように498‐ヌクレオチドまた は495‐ヌクレオチドサブセグメントに結合している、請求項5〜9のいずれ かに記載の二重鎖DNA。 11. リーダーペプチドをコードするサブセグメントによりコードされるリー ダーペプチドが、配列Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X3 Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val X4 Gly(ここで、X3は、L euお よびValから成る群から選ばれ、X4は、Leuおよびproから成る群から選ばれる) を有する、請求項10に記載の二重鎖DNA。 12. X3およびX4が、各々Leuである、請求項11に記載の二重鎖DNA。 13. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端 に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請 求項10に記載の二重鎖DNA。 14. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端 に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請 求項11に記載の二重鎖DNA。 15. そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端 に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポ エチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請 求項12 に記載の二重鎖DNA。 16. プレプロエリスロポエチン類似体をコードするセグメントを含む二重鎖 DNAを、プレプロエリスロポエチン類似体の発現が作動可能なようにベクター のXbaI部位に挿入したSV2dhfrSVdeltaSJneoから成る、 請求項15に記載の発現ベクター。 17. 発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro33, Cys139]hEPO)。 18. 発現ベクターSV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys139 ]hEPO)。 19. 培養哺乳類細胞であって、共に、そのカルボキシ末端でヒトエリスロポ エチン類似体のアミノ末端に結合している哺乳類のプレプロエリスロポエチンの リーダーペプチドから成る前駆体ポリペプチドをコードする2つの隣接するセグ メントからなるDNAを前記細胞中で発現させるための発現ベクターを含有し、 該セグメントの1つが該リーダーペプチドをコードし、該セグメントの他方が4 98塩基対を有しかつ[X33,cys139]‐ヒトエリスロポエチン(X33は2 0個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ば れる)の配列から成る群から選ばれる配列を有する該エリスロポエチン類似体を コードすることを特徴とする前記哺乳類細胞。 20. dhfr‐でありかつ、発現ベクターが、2つの隣接するセグメントか ら成る前記DNAをプレプロエリスロポエチンの発現が作動可能なようにそのベ クターのXbaI部位に挿入したSV2dhfrSVdeltaSJneoから 成る請求項19に記載の哺乳類細胞。 21. 発現ベクターがSV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro33 ,Cys139]hEPO)およびSV2dhfrSVdeltaSJneo([ Cys139]hEPO)から成る群から選ばれ、及びチャイニーズハムスター卵 巣細胞である請求項20に記載の哺乳類細胞。 22. 赤血球新生を誘導するのに有用な医薬組成物であって、(a)[X33, Cys139,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20 個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選 ばれるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を 、(b)医薬上許容されうる担体と組み合わせて含むことを特徴とする前記医薬 組成物。 23. X33がProである請求項22に記載の医薬組成物。 24. X33がCysである請求項22に記載の医薬組成物。 25. 貧血を治療するのに有用な医薬組成物であって、(a)[X33,Cys139 ,des−Arg166]‐ヒトエリスロポエチン(ここで、X33は20個の天 然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる)の配列から成る群から選ばれる アミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、(b )医薬上許容されうる担体と組み合わせて含む前記医薬組成物。 26. X33がProである請求項25に記載の医薬組成物。 27. X33がCysである請求項25に記載の医薬組成物。 28. ヒトエリスロポエチンの第2類似体であって、天然型ヒトエリスロポエ チンに比し顕著に低い赤血球新生比活性を有する第1類似体と比べて顕著に高い 赤血球新生比活性を有するものであり、ここで該第2類似体は、その配列中の第 1および第2の位置に、天然型ヒトエリスロポエチンの配列中の同じ位置のアミ ノ酸と異なるアミノ酸を有することを除いては、天然型ヒトエリスロポエチンと 同じ数および配列のアミノ酸を有し、該第1類似体は、該第1または該第2の位 置のいずれか のアミノ酸が天然型ヒトエリスロポエチンの配列中のアミノ酸と同じであること を除いては該第2類似体と同じ数および配列のアミノ酸を有することを特徴とす る前記第2類似体。 29. 第1類似体がエリスロポエチン活性を全く有しないか又は実質的に減少 したものであるのに対し、天然型ヒトエリスロポエチンに比し実質的に同等もし くはそれ以上のエリスロポエチン活性を有する請求項28に記載の第2類似体。 30. 請求項29に記載のエリスロポエチンの第2類似体の製法であって、そ の方法が: (a)(i)天然型ヒトプレプロエリスロポエチンの二重突然変異体をコード し、(ii)第1類似体は、エリスロポエチン活性が全くないか又は減少してお り、天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数のアミノ酸を有するが、天然型ヒトエ リスロポエチンの相当する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸をその配列内の1つ の位置に有するヒトエリスロポエチンの第1類似体のアミノ酸をコードするトリ プレットを含み、および(iii)天然型プレプロエリスロポエチンのリーダー ペプチドのいずれの部分もコードせず、該第1類似体の該アミノ酸をコードする 該トリプレットを含まないセグメント内にランダム突然変異を 含むcDNA配列を、哺乳類細胞中での発現が作動可能なように含む各真核生物 発現ベクターのライブラリーを調製し;(b)発現ベクターライブラリーを発現 用哺乳類細胞内にトランスフェクとし;並びに(c)第2類似体を分泌する細胞 を選択する工程を包含することを特徴とする前記方法。 31. 天然型トエリスロポエチンより高いインビボエリスロポエチン活性を有 する第3のエリスロポエチン類似体を製造するために請求項29に記載の第2類 似体を使用する方法であって、該方法が、第1類似体には存在するが天然型ヒト エリスロポエチンには存在しない第2類似体中のアミノ酸を天然型ヒトエリスロ ポエチンの相当する位置のアミノ酸に変えることを特徴とする前記方法。 32. ヒトエリスロポエチンの第3類似体であって、その配列中の1つの位置 の1個のアミノ酸の相違を除いては天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数および 配列のアミノ酸を有し、天然型ヒトエリスロポエチンより高いエリスロポエチン 活性を有し、請求項31に記載の方法により請求項29に記載の第2類似体を用 いて作製されることを特徴とする前記第3類似体。
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