JPH08509614A

JPH08509614A - エリスロポエチン類似体組成物および方法

Info

Publication number: JPH08509614A
Application number: JP6524574A
Authority: JP
Inventors: オカシンスキー，グレゴリー・エフ; デ・ブリーズ，ピーター・ジエイ; メロビツツ，バリー・エス; ムース，ジヨゼフ・エル; スキフアー，バーリン・ジイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-04-29
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1996-10-15
Also published as: NO954342D0; EP0744953A1; AU697453B2; FI955128A; KR960701650A; CZ286046B6; US5888772A; HUT73876A; HU9503088D0; EP0744953A4; FI955128A0; AU6778594A; CZ284495A3; WO1994025055A1; NO954342L; BR9406490A; CA2161651A1; CN1125401A

Abstract

(57)【要約】［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］および［Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］類似体を含むヒトエリスロポエチン類似体、並びに、このような類似体の製法及びそれを用いる方法及びそれを含有する医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】エリスロポエチン類似体組成物および方法技術分野本発明は、赤血球新生を誘導し且つ、赤血球もしくは網状赤血球数の低下に起因する、例えば貧血のような症状を治療するのに有用であることが公知の糖蛋白質、ヒトエリスロポエチンの類似体に関する。また、本発明は、その類似体を含有する組成物、その類似体を製造する方法および、赤血球新生を誘導し且つ、不適切な赤血球または網状赤血球数に起因する貧血のような症状を治療することへの、該類似体の使用方法に関する。発明の背景エリスロポエチンは、最初およそ３９，０００ダルトンであると報告された（ T．Miyaki等，J．Biol．Chem．252:5558-5564（1977））分子量を有する天然の糖蛋白質ホルモンである。成熟ホルモンは、１６６個のアミノ酸鎖長であり、そのリーダーペプチドを有する“プレプロ”型ホルモンは、１９３個のアミノ酸鎖長である（F．Lin，米国特許第４，７０３，００８号）。成熟ホルモンは、そのアミノ酸配列から算定した１８，３９９ダルトンの分子量を有する（K．Jacobs 等，Nature 313:806-810（1985）；J．K．Browne等，Cold Spring Harbor Syｍp．Quant．B iol．51:693-702（1986））。ヒト尿中のエリスロポエチンの構造特性研究により、成熟蛋白質のカルボキシル末端のＡｒｇ残基が特異的に除去されたｄｅｓ−Ａｒｇ１６６型が同定された（M．A．Recny等，J．Biol．Chem．262:17156-17163（1987））。Recny等（上掲）は、ヒト血漿中を循環するエリスロポエチンの生理学的に活性な型がｄｅｓ− Ａｒｇ１６６型であると提言している。ヒトエリスロポエチンは、３つのＮ‐結合炭水化物鎖を含有する（H．Sasaki 等，J．Biol．Chem．262:12059-12076（1987）；E．Tsuda等，Biochemistry 27: 5646-5654（1988）；およびM．Takeuchi等，J．Biol．Chem．263:3657-3663（19 88））。エリスロポエチンの炭水化物含量は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションされかつ該ホルモンのプレプロ型をコードするクローン化ＤＮＡを該培養細胞内で発現して産生されたホルモン、及び天然の尿エリスロポエチンのものと類似している。Ｎ‐結合グリコシレーション部位は、アミノ酸残基２４、３８および８３に位置する。尿および組み替えエリスロポエチンはともに、アミノ酸残基１２６にただ一つのＯ‐結合グリコシレーション部位を有する（Sasaki等（上掲）；E．Tsuda等（上掲）；M．Takeuchi等（上掲）；およびM．Goto等，Biotechnology 6:67-71（1988））。エリスロポエチンの炭水化物含量は、Ｎ‐アセチルラクトースアミン反復単位を有するフコシル化テトラアンテナリィ型鎖と該反復単位を有さないものとの複合（M．Takeuchi等（上掲））であり、エリスロポエチンの質量のおよそ４０％に寄与する。ヒトエリスロポエチンは、主として、成人の腎臓により糖蛋白質ホルモンとして産生される（H．P．KoefflerおよびE．Goldwasser，Ann．Intern．Med．97:44 -47（1981））。腎臓でエリスロポエチンを産生する細胞は、非常に少なく、腎細管間の間質内の腎実質の内部皮質に存在する（S．T．Koury等，Blood 71:524- 528（1988），およびC．Lacombe等，J．Clin．Invest．81:620-623（1988））。従って、腎不全で起こるような腎組織の破壊は、エリスロポエチン産生の減少および赤血球数の同時減少および貧血によって生じる。インビトロの胎児肝細胞は、エリスロポエチンを産生できる（A．Kurtz等，En docrinology 118:567-572（1986））が、ほとんどの末期腎不全患者には代償的なエリスロポエチン産生は起こらず、血清エリスロポエチンレベルは、成功した腎移植後にのみ正常に回復する（W．F．Denny等，J．Lab．Clin．Med．67:386（1966））。ほとんどの場合、後期赤血球新生は、ただ一つの組織で産生されたただ一つのグリコシル化ホルモンであるエリスロポエチンにより達成される。エリスロポエチンの稀な代替経路が、高ヘマトクリットをもつヒト無腎（anephric）患者について記載されている。この患者では、単離したエリスロトロピックな因子がヒトのインシュリン様成長因子Ｉ即ちＩＧＦ−Ｉであることが示されている（A．Bro x等，Exp．Hematol．17:769-773（1989），およびL．F．Congote等，J．Clin．E ndocrin．Metab．72:727-729）。ＩＧＦ−Ｉは、確かに、L．F．Congote（Bioch em．Biophys．Res．Comm．115:477-483（1983））によりインビボおよびインビトロ活性をともに有すると記載されたウシのエリスロトロピックな因子に対応するヒト因子である。ＩＧＦ−Ｉ受容体は、ヒト赤血球上に存在することが公知であり、これらの受容体は、ＩＧＦ−Ｉとその特異的受容体との相互作用を介して起こる後期赤血球新生のこの稀な代替経路を可能にする（T．Izami等，J．Clin ．Endocrinol．Metab．62: 1206-1212（1986），およびC．D．Costigan等，Clin．Invest．Med．11:4751（1 988））。しかしながら、上記エリスロポエチン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は公知であるが、ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体との配列相同性を示していない（A．D ，D′Andrea等，Cell 57:277-285（1989））ことから、ＩＧＦ−Ｉを介した赤血球新生の代替経路はエリスロポエチンが仲介する後期赤血球新生の経路と無関係であることを示している。後期赤血球新生の他の代替経路は知られていないが、エリスロポエチンの作用を強化することのできるいくつかの因子については記載されている。後期赤血球新生は、エリスロポエチンに依存するが、テストステロン、エストロゲンおよび赤血球強化因子によって影響され、一方、初期の赤血球新生は、エリスロポエチンに加え赤芽球コロニー群促進因子に依存性である（N．N．Iscove in Hematopo ietic Cell Differentiation，D．W．Golde編，M．J．ClineおよびC．F．Fox［A cademic印刷，New York］37-52頁）。ＩＬ−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−９のような因子は、赤芽球コロニー群形成活性を有することが知られている。しかしながら、これらの活性が赤血球新生に何らかの生理学的役割をもつかどうかは明確ではない（J．Suda等，Blood 67:1002-1006（1986）；C．A ．Sieff等，Scｉence 230:1171-1173（1985）；およびR．E．Donahoe等，Blood 75:2271-2275（1989））。近年、“赤血球分化因子”と命名された因子が、インビボおよびインビトロでのエリスロポエチンの活性を強化することが示された（ H．E．Broxmeyer等，Proc．Natl．Acad．Sci．85:9052-9056（1988）；J．Yu等，Nature 330:765-767（1987））。この因子は、アクチビンＡ（卵胞刺激ホルモン放出蛋白質）と同一であり、ホリスタチン、即ちアクチビンＡの特異的阻害物質により阻害されることが示されたが、しかしながらアクチビンＡの生理学的役割は、決定されないままである（M．Shiozaki等，Proc．Natl．Acad．Sci．89:1 553-1556（1992））。従って、２０年近い研究が行なわれているが、赤血球新生が、エリスロポエチン以外のホルモンにより制御されるという明確な指示は何もない。赤血球新生に影響を及ぼす代替ホルモンの非存在下、エリスロポエチン構造を調査する試み、部位特異的突然変異法によりエリスロポエチンの特性を顕著に改善する試みがともに文献に報告された。エリスロポエチンをコードするヒト遺伝子の分子クローニングによって、１９３個のアミノ酸のプレプロホルモンおよび１６６個のアミノ酸の成熟ホルモンをコードするＤＮＡ配列が明らかにされている。ホルモン及びその前駆体（即ちプレプロ型）をコードするクローン化ＤＮＡの入手が容易になったことから、分子生物学の標準方法を用いて突然変異誘発を実施する機会が提供された。米国特許第４，７０３，００８号（上掲）参照。アミノ酸置換および欠失により調製した最初の突然変異体エリスロポエチン（即ちエリスロポエチン類似体）は、減少した又は改善されない活性を示した。米国特許第４，７０３，００８号に記載されているように、１５、４９および１４５位のチロシン残基のフェニルアラニン残基での置換、７位のシステイン残基のヒスチジンでの置換、２位のプロリンのアスパラギンでの置換、残基２〜６の欠失、残基１６３〜１６６の欠失、および残基２７〜５５の欠失は、生物学的活性の明白な増加を生じさせない。ｃｙｓ⁷からＨｉｓ⁷への突然変異は、生物学的活性を喪失させる。２４、３８または８３位のアスパラギン残基にただ一つのアミノ酸置換を有する一連の変異体エリスロポエチンは、重大な活性低下（２４位での置換）を示すか又は、急速な細胞内分解および明らかな分泌欠如（残基３８または１８３での置換）を示す。セリン１２６の位置でのＯ−結合グリコシレーション部位の除去により、エリスロポエチン類似体の急速な分解または分泌欠如が生じする（S．Dube等，J ．Biol．Chem.33:17516-17521（1988））。これらの著者等は、残基３８、８３および１２６に位置するグリコシレーション部位が適正な分泌に必要であり、残基２４および３８に位置するグリコシレーション部位が成熟エリスロポエチンの生物学的活性に関連すると結論付けている。エリスロポエチンのグリコシレーションがインビトロの生物学的活性に必要であるという示唆は、脱グリコシル化エリスロポエチンがインビトロのバイオアッセイにおいて十分活性であるということを示す報告に反する（M．S．Dordal等， Endocrinology 116:2293-2299（1985）；j．K．Browne等，Cold Spring Harbor Symp．Quan．Biol．51:693-702（1986）；米国特許第４，７０３，００８号；E ．Tsuda等，Eur．J．Biochem．188405-411（1990）；およびK．Yamaguchi等，J ．Biol．Chem．266:20434-20439（1991））。上記Dube等により研究されたものと類似した１セットのエリスロポエチン類似体が、エリスロポイエチンの生合成および生物学的活性におけるグリコシレーション部位の役割を探るために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異法を用いて構築されている（上記K．Yamaguchi等（上掲））。これらの研究者等は、グリコシレーションは、エリスロポエチンの正しい生合成および分泌に重要であるが、この分子のインビトロ活性には何ら影響しないと結論付けている。しかしながら、グリコシレーション部位に変化を含むYamaguchi等により研究された全てのエリスロポエチン変異体は、インビボ生物学的活性を欠いていた。エリスロポエチンのグリコシレーションは、ホルモンのインビボ活性に重要な役割を果たすことが広く認められている（P．H．Lowy等，Nature 185:102-105（ 1960）；E．GoldwasserおよびC．K．H．Kung，Ann．N．Y．Acad．Science 149： 49-53（1968）；W．A．LukowskyおよびR．H．Painter，Can．J．Biochem．50:90 9-917（1972）；D，W．Brlggs等，Amer．J．Phys．201:1385-1388（1974）；J． C．Schooley，Exp．Hematol．13:994-998;N．Imai等，Eur．J．Biochem．194:45 7-462（1990）；M．S．Dordal等，Endocrinology 116：2293-2299（1985）；E． Tsuda等，Eur．J．Biochem．188:405-411（1990）；米国特許第４，７０３，００８号；J．K．Brown等，Cold Spring Harbor Sympos ia on Quant．Biol．51:693-702（1986）；およびK．Yamaguchi等，J．Biol．Ch em．266:20434-20439（1991））。エリスロポエチンの脱グリコシル化類似体のインビボでの生物学的活性の欠如は、治療を受けた動物の循環からの脱グリコシル化ホルモンの急速なクリアランスに起因する。この見解は、グリコシル化および脱グリコシル化エリスロポエチンの血漿半減期の直接比較により支持される（J．C．SpivakおよびB．B．Hoyans ，Blood 73:90-99（1989），およびM．N．Fukuda等，Blood 73:84-89（1989））。エリスロポエチンのグリコシレーション部位のオリゴヌクレオチド特異的突然変異法は、グリコシレーションの機能を効果的に精査したが、今のところ、治療応用のためのホルモンの特性を顕著に改善する効果的戦略に対する解答を提供していない。アミノ酸残基１５、２４、４９、７６、７８、８３、１４３、１４５、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５および１６６を含む一連の単一のアミノ酸置換または欠失突然変異体が構築された。これらの突然変異体は、エリスロポエチンのカルボキシ末端、グリコシレーション部位およびチロシン残基が変化している。これらの突然変異体は、動物に投与されると同時にヘモグロビン、ヘマトクリットおよび網状赤血球レベルが監視された（ヨーロッパ特許出願公開第０４０９１１３号）。これらの突然変異体の多くがインビボの生物学的活性を保持するとはいえ、天然のエリスロポエチンと比較した場合、いずれも、ヘモグロビン、ヘマトクリットまたは網状赤血球（赤血球の直接的前駆体）レベルを上昇させる能力の顕著な増加を示さない。別のセットの突然変異体が、残基９９〜１１９（ドメイン１）および残基１１１〜１２９（ドメイン２）の機能を探るために構築された（Y．Chern等，Eur．J ．Biochem．202:225-230（1991））。ドメイン２突然変異体は、最も良くてインビトロ活性を保持するが、ドメイン１突然変異体は、急速に分解しインビトロバイオアッセイにおいて不活性である。また、これらの突然変異体は、野性型ヒトエリスロポエチンに比較し何ら増強されたインビボ生物学的活性を示さない。これらの著者等は、残基９９〜１１９がエリスロポエチンの構造に重要な役割を果たしていると結論付けている。ヒトエリスロポエチン分子は、２つのジスルフィド架橋を含有し、１つは、７および１６１位のシステイン残基間の結合であり、他の１つは、２９および３３位のシステイン間の結合である（P.-H．Lai等，J．Biol．Chem．261:3116-3121 （1986））。オリゴヌクレオチド特異的突然変異法を用いて、ヒトエリスロポエチンの２９および３３位のシステインを結合させているジスルフィド架橋の機能が詳しく調べられた。３３位のシステインが、マウスエリスロポエチンの構造を模倣するプロリン残基に該残基位置で変換された。その結果生じた突然変異体は、インビトロ活性が大きく減少した。活性の損失が非常に激しいことから、著者等は、残基２９と残基３３との間のジスルフィド架橋がエリスロポエチン機能に必須であると結論付けている（F.-K．Lin，Molecular and Cellular Aspects of Erythropoietin and Erythropoiesis，23-36頁，I．N．Rich編，Springer-Verl ag，Berlin（1987））。ヒトエリスロポエチンの５４位のメチオニン残基の部位特異的オリゴヌクレオチド特異的突然変異によって、酸化の影響を受けにくいエリスロポエチン調製物を提供するという付加的利点を有しながら親（野性型）分子のインビボ生物学的活性を保持する分子が得られ（Shoemaker,米国特許第４，８３５，２６０号）。ヒトエリスロポエチン遺伝子の多数の突然変異体が、いくつかの科学的刊行物および特許出願公開公報に記載されてきた。これらの突然変異体は、分子の全長に変異が及ぶものであったり、部分的にもしくは完全に脱グリコシル化された分子の調製物であったり、分子内のジスルフィド架橋の構造を変化させたものであったり、あるいは分子の治療活性を改善するよう試みられたものであった。エリスロポエチンを変化させるこのような試みのいずれもが、増強したインビボ生物学的活性または治療応用のための他の改良された性質を有する分子を作製するのに成功していない。後期赤血球新生の自然界に存在する代替経路の同定の失敗、および増強したインビボ活性を有するエリスロポエチン類似体を作製する従来の不成功の試みは、改良されたエリスロトロピック分子を作製することのできる方法についてほとんど解答を提供していない。発明の概要３３位のシステインが別のアミノ酸で置換されるものを含むヒトエリスロポエチンおよびその類似体の１３９位のアルギニンをシステインで置換することによって、顕著に改良されたインビボエリスロポエチン活性をもつ糖ホルモンが得られ、並びに、赤血球新生の誘導および貧血の治療のような治療応用におけるその利用可能性に導くことが見い出された。更に、予期せぬことには、天然の野性型蛋白質のアミノ酸配列における（１番目の位置での）変化の結果としてインビトロまたはインビボの生物学的活性が顕著に減少した又は全くなくなった、哺乳類および特にヒトのエリスロポエチンの第１の類似体を、野性型蛋白質のアミノ酸配列における更に補償する（２番目の位置での）アミノ酸配列変化により更に顕著に活性な第２類似体に変換することができることを見い出した。この結果は、蛋白質の第１の配列中の前記２番目の位置がたとえ１番目の位置から離れていたとしても得られる。事実、このような第２類似体が、野性型のエリスロポエチンとほとんど同じか又はより一層高いインビボまたはインビトロ活性を有することを見い出した。この関連において、“ 離れて”とは、少なくとも１アミノ酸位置、更に一般的には少なくとも約１０アミノ酸位置、あるいは可能なものとして１００アミノ酸位置より更に大きい分離を意図する。一方の位置のアミノ酸の変化が、他方の離れた位置のアミノ酸の変化による活性の低下を補償する又は克服しさえするこのような二重突然変異体を同定することは、容易に可能である。本発明者らが発見し初めて開示するものは、プレプロ型の類似体、即ちそのアミノ末端に哺乳類のエリスロポエチンのリーダーペプチドが付加された類似体をコードするＤＮＡ配列を哺乳類細胞中で発現することによって本発明の改良されたエリスロポエチン類似体を製造するための方法および組成物である。驚くべきことには、本発明の類似体の多くは、貧血または貧血ではない哺乳類に投与した場合、天然のエリスロポエチンに比し赤血球新生において実質的により活性であり、所期の治療効果を達成するのに天然のエリスロポエチンに比し投与頻度が少なくてすむという意外で且つ顕著な更なる利点を有する。本発明の哺乳類（および特にヒト）のエリスロポエチンの類似体は、対応する天然のエリスロポエチンと同様の免疫学的特性またはインビトロ生物学的活性を保持することから、類似体の血中濃度、培養培地、医薬製剤等は、天然の糖ホルモンを用いた従来の方法により容易に測定およびモニターすることができる。図面の簡単な説明本発明を添付の図面と関連させて説明するが、その中で：図１は、その構築を実施例１で説明するプラスミドｐＥＰＯｗ５の説明図であり；図２は、天然のヒトエリスロポエチンを産生する培養中の哺乳類細胞を形質転換するのに用いることのできる発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯを、プラスミドｐＥＰＯｗ５（修正した）およびプラスミドＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏから作製するのに用いる、実施例１で説明する方法の説明図であり；図３は、天然型の“非組み替え”ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ標準）、発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯ（ｒＥＰＯ）で形質転換したｄｈｆｒ‐チャイニーズハムスター卵巣細胞により培養中で産生した天然型の“組み替え”ヒトエリスロポエチン、および天然型のヒトエリスロポエチンのプレプロ型よりむしろそのような類似体のプレプロ型をコードするＤＮＡを含む発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯの類似体で形質転換したｄｈｆｒ‐チャイニーズハムスター卵巣細胞により培養中で産生した残基３３がプロリンであり残基１３９（ｐｍ２５）がシステインである“ 組み替え”ヒトエリスロポエチン類似体ｐｍ２５（ｐｍ２５）の活性を示すグラフであり；図４は、天然型ヒトエリスロポエチンおよびｐｍ２５の説明図である。発明の詳細な説明その一つの態様において、本発明は、本来の糖ホルモンの１３９位のアルギニン残基がシステイン残基で置き換わったヒトエリスロポエチン類似体である。そのもう一つの態様において、本発明は、野性型のエリスロポエチンの３３位のシステイン残基が他の１９個の天然に存在するアミノ酸、好ましくはプロリン、のいずれか１つで置換された更に改変された類似体である。どの場合においても、本発明の類似体の好ましい例は、１６６位のアルギニン残基が欠けている（即ちｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶である）ものである。そのもう一つの態様において、本発明は、本発明のエリスロポエチン類似体をコードする４９８個から４９５個のヌクレオチドのセグメントを含む二重鎖ＤＮＡ配列である。更なる態様において、本発明は、一方のサブセグメントが上記の４９８個または４９５個のヌクレオチドのセグメントであり、他方のサブセグメントが哺乳類のプレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、この２つのサブセグメントが、それら隣接するサブセグメントによってコードされたただ一つのポリペプチド中でリーダーペプチドのカルボキシ末端がエリスロポエチン類似体のアミノ末端に隣接するように結合している２つの隣接したサブセグメントを含む二重鎖ＤＮＡ配列も包含する。好ましいリーダーペプチドは、マウス、サル、ハムスターおよびヒトのプレプロエリスロポエチンのそれであり、最も好ましいのは、ヒトのリーダーペプチドである。ヒトおよびサルのリーダーペプチドのアミノ酸配列を後述の配列番号：６および配列番号：７に示す。更なる態様において、本発明は、哺乳類の細胞培養中で本発明のプレプロエリスロポエチン類似体を発現するための真核生物発現ベクターである二重鎖ＤＮＡ配列を包含する。この目的のためにいずれの哺乳類細胞も用いることができるが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞が好ましい。当然のことながら、このような発現ベクターは、ベクターが、転写を開始するベクター上のシグナルおよび（挿入したｃＤＮＡに対応するセグメントを含む）ベクターから転写したＲＮＡ上のシグナルを認識するのに必要な蛋白質及び他の成分を提供する細胞（例えば、哺乳類の細胞）中に存在する場合、ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの翻訳および産生を達成するために、ｃＤＮＡが転写されるベクター内の位置に転写物の翻訳に必要なシグナルと目的の類似体をコードするｃＤＮＡ配列とを結合することにより作製する。発現ベクター内にｃＤＮＡを“発現作動可能に”配置するとは、ＲＮＡがベクターから転写し、最終的にはｃＤＮＡによりコードされた蛋白質を生産するためにベクターで形質転換した細胞内で翻訳できるように配置することを意味する。また、本発明は、本発明のプレプロエリスロポエチン類似体をコードするｃＤＮＡの哺乳類細胞中での発現用真核生物発現ベクターを含む培養哺乳類細胞も包含する。このような発現は、成熟グリコシル化類似体の培養培地中への分泌をもたらす。更に、本発明は、共に前駆体ポリペプチドをコードする２つの隣接するセグメントから成るＤＮＡ配列を哺乳類細胞中で発現するのに適する真核生物発現ベクターを含む哺乳類細胞を用いる方法を包含する。この前駆体ポリペプチドは、そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体のアミノ末端に結合した哺乳類のプレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドから成る。したがって、このセグメントの一方は、このリーダーペプチドをコードし、一方、このセグメントの他方は、４９８または４９５塩基対を有しかつ本発明のエリスロポエチン類似体をコードする。上記方法は、この細胞が培養培地中にこのエリスロポエチン類似体を分泌する条件下でこの細胞を培養培地中で培養することを含む。次いで、類似体を培養培地から単離し、精製し、哺乳類、好ましくはヒトヘ投与するための医薬組成物に処方することができる。本発明はまた、天然型ヒトエリスロポエチンに比し著しく低い赤血球新生の比活性を有する第１類似体に比べて顕著に高い赤血球新生の比活性を有する第２ヒトエリスロポエチン類似体も包含する。この第２類似体は、その配列中の第１および第２の位置に天然型ヒトエリスロポエチンの配列の同じ位置のアミノ酸と異なるアミノ酸を有することを除いては、天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数および配列のアミノ酸を有するものであり、一方、第１類似体のアミノ酸は、その第１又は第２の位置のいずれかで天然型ヒトエリスロポエチンの配列に見られるアミノ酸と同じであることを除いては、第２類似体と同じ数および配列のアミノ酸を有するものである。本発明のこれらの“第２類似体”の発見は、天然型糖蛋白質中の相当する位置に見られるアミノ酸と異なるアミノ酸が“第１類似体”に存在するために喪失した少なくともいくらかの活性を回復させる、アミノ酸配列中の補償的変化を実施可能にするという発見に基づいている。ある場合には、第２類似体は、天然型糖ホルモンに比しより活性である（即ち、赤血球新生を刺激するのにより高いインビボ比活性を有する）が、一方、第１類似体は、インビボで不活性であるということが予想される。また、本発明は、前述のパラグラフで述べたこのようなエリスロポエチンの第２類似体を生産する方法を提供し、この方法は、（ａ）（ｉ）天然型ヒトプレプロエリスロポエチンの二重突然変異体（即ち、天然型糖ホルモンに存在するアミノ酸がその２つの位置で変化している突然変異体）をコードする、（ｉｉ）赤血球新生を刺激するのに実質的な活性を持たず、かつ天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数のアミノ酸を有するが、天然型ヒトエリスロポエチンの相当する位置に見られるアミノ酸と異なるアミノ酸をその配列内の１つの位置に有する天然型ヒトエリスロポエチンの第１類似体の該非天然アミノ酸をコードするトリプレット（コドン）を含む、および（ｉｉｉ）天然型プレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドのいずれの部分もコードせず、かつ前記第１類似体のこの前記非天然のアミノ酸をコードする前記トリプレットを含まないｃＤＮＡセグメント内にランダム突然変異を含む、哺乳類細胞中での発現が作動的に可能になるように配置したｃＤＮＡ配列を含む真核生物発現ベクターライブラリーを調製し；（ｂ）発現ベクターライブラリーを発現用哺乳類細胞内へトランスフェクトし；及び（ｃ）所望の第２類似体を分泌する細胞を選択することを包含する。また、本発明は、赤血球新生を刺激するのに第２類似体より高いインビボ活性を有する第３類似体を作製するために、天然型糖ホルモンに対し相対的に減少した活性を有する単一の変異をもつ第１類似体と比較して増大した活性を有するこのような二重変異をもつ第２類似体を用いる方法を提供する。この方法は、第１類似体には見られるが天然型ヒトエリスロポエチンには見られない、前記第２類似体中のアミノ酸を、天然型ヒトエリスロポエチンの相当する位置に存在するアミノ酸に変化させることを含む。更に、本発明は、赤血球新生において天然型ヒトエリスロポエチンより高い活性を有し、並びにその配列中の１ヵ所の位置でのアミノ酸の相違を除いては天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数および配列のアミノ酸を有するヒトエリスロポエチン類似体を包含し、この類似体は、前述の方法、即ち赤血球新生を刺激するのに少なくとも天然型糖ホルモンと同じ位高いインビボ比活性をそれ自体有する第２類似体を用いることにより製造される。また、本発明は、医薬的に許容されうる担体と組み合わせて、治療に有効な量の本発明のヒトエリスロポエチン類似体を含有する赤血球新生を誘導しおよび／または哺乳類（好ましくはヒト）の貧血を治療するのに有用な医薬組成物も包含する。本発明の類似体のような医薬組成物は、その量または濃度が必要なレベルの赤血球新生を誘導するのに効果的であるように医師または獣医の指導下で投与されるべきである。用いる担体は、下記のものに限定されるべきではないが、注射（通常、静脈もしくは皮下）又はその他による投与に適した形態で糖ホルモンと組み合わせた、緩衝液、塩、安定化剤、保存剤または他のアジュバントを含む生理学的に許容されるいかなる賦形剤であってもよい。投与は、ヒトエリスロポエチンと比較した前記類似体のインビボ比活性に基づき、赤血球新生を誘導し、腎不全に罹患した患者の貧血を含むヒトにおける貧血のような種々の症状を治療するヒトエリスロポエチンの投与に関し現在当業者に公知であるものに基づき、当業者により容易に確認される薬剤投与レジメに準ずる。本発明の類似体の投与量は、特定の類似体及びそのインビボ比活性、投与経路、医学的症状、年齢、患者の体重または性別、類似体または賦形剤の成分に対する患者の感受性、並びに治療をする医師が容易に考慮に入れることのできる他の因子に依存して患者により多少変えることができる。本発明の類似体の治療用途に関しては、米国特許第４，７０３，００８号および第４，８３５，２６０号が参考される。また、Physicians′Desk Reference，46th Edition（Medical Ec onomics Data，Montvale，New Jersey（1992））の591-595頁の（recombinant）［des-Arg¹⁶⁶］human erythropoietinに関する章も参照のこと。商業的に入手可能な組み替え［ｄｅｓ− Ａｒｇ¹⁶⁶］ヒトエリスロポエチンの製剤は、２．５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン、５．８ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、５．８ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、および０．０６ｍｇ／ｍｌのクエン酸、ｐＨ６．９（＋／−０．３）を含有する、保存剤を含まない水溶液１ｍｌ当たり２，０００、３，０００、４，０００または１０，０００単位の糖ホルモンを有する。特に限定しない限り、本明細書のエリスロポエチンは、リーダーペプチドおよび１１６位のアルギニンが存在しない“成熟”ヒト蛋白質に言及する。 “プレプロエリスロポエチン”とは、プレプロ型をコードするｃＤＮＡの哺乳類細胞内での発現の際にプロセシングを受けてグリコシル化され、最終的には培養培地中に成熟蛋白質が分泌される前のリーダーペプチドおよびＡｒｇ¹⁶⁶を含む蛋白質を意味する。天然型ヒト蛋白質および天然型ヒトプレプロ蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号：１に示す。本明細書で用いた“天然型（又は天然）”および“野性型”とは、同義であることを意図している。本明細書で、２０個の“天然に存在する”アミノ酸について以下のような標準の略号を用いる：Ｌ‐アラニンＡｌａＬ‐アルギニンＡｒｇＬ‐アスパラギンＡｓｎＬ‐アスパラギン酸ＡｓｐＬ‐システインＣｙｓＬ‐グルタミン酸ＧｌｕＬ‐グルタミンＧｌｎグリシンＧｌｙＬ‐ヒスチジンＨｉｓＬ‐イソロイシンＩｌｅＬ‐ロイシンＬｅｕＬ‐リシンＬｙｓＬ‐メチオニンＭｅｔＬ‐フェニルアラニンＰｈｅＬ‐プロリンＰｒｏＬ‐セリンＳｅｒＬ‐スレオニンＴｈｒＬ‐トリプトファンＴｒｐＬ‐チロシンＴｙｒＬ‐バリンＶａｌ本明細書で、標準の一文字コード“Ａ”、“Ｃ”、“Ｇ”および“Ｔ”を用いて、各々、アデニレート、シチジレート、グアニレートおよびチミジレートのヌクレオチドを表わす。ＤＮＡ配列においては、ヌクレオチドは、２′‐デオキシリボヌクレオチド‐５′‐燐酸（または５′‐末端の三燐酸）であるが、一方、ＲＮＡ配列においては、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド‐５′‐燐酸（または５′‐末端の三燐酸）であり、ウリジレート（Ｕ）がＴの代わりに存在する。 “Ｎ”は、４つのヌクレオチドのいずれか１つを意味する。本明細書の類似体蛋白質“蛋白質Ｘ”について言及すると、“［Ｘ^a，Ｙ^b，ｄｅｓ−Ｚ^c］蛋白質Ｘ”とは、天然型蛋白質Ｘのａの位置のアミノ酸がアミノ酸Ｘで置換され、天然型蛋白質Ｘのｂの位置のアミノ酸がアミノ酸Ｙで置換され、且つ、通常天然型蛋白質Ｘのｃの位置に存在するアミノ酸Ｚが喪失した類似体を意味する。本明細書で用いた“ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｘ′，Ｙｂ］ｈＥＰＯ）”とは、そのベクターでトランスフェクションされた培養哺乳類細胞が成熟エリスロポエチンの［Ｘ^a，Ｙ^b］類似体を分泌するようなｃＤＮＡで置換されたプレプロエリスロポエチンをコードするｃＤＮＡ（配列番号：１参照）を有する発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯを意味する。以下の実施例において本発明をより詳細に具体的に説明するが、本発明は、それにより制限されるものではない。クローニング、ｃＤＮＡの発現ベクター内への発現可能なように挿入、哺乳類細胞中への真核または哺乳類発現ベクターのトランスフェクションおよびトランスフェクションした細胞の選択、培養培地中への分泌により所望の異種蛋白質を得るための哺乳類細胞の培養、ＤＮＡの配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いた核酸増幅の実施、このような増幅を行うためのプライマーの合成、蛋白質または核酸精製技術等、並びに、哺乳類発現ベクターのようなものの更なる例、該ベクターからの発現の使用に適する細胞系、トランスフェクションした細胞系を培養するための培養培地、ヒトおよびサル以外の哺乳類プレプロエリスロポエチン用リーダーペプチド、核酸増幅法等のような本明細書で述べた種々の手法の実施に関する更なる詳細及び更なる例は、容易に入手可能であり、当業者に公知である。例えば、Current Protocols in Molecular Bio1ogy，F．M.Ausubel等編，Wiley Interscience，John Wiley and Sons，Inc.，New York（1993），Suppl ement 21；the ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，7th Ed.，Amer ican Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA（1992）；及びthe ATCC Media Handbook，American Type Culture Collection，Rockville，Maryla nd（1984）参照。実施例１プラスミド発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏの調製Ａ．ヒトエリスロポエチンをコードする合成遺伝子の構築配列番号：８〜１５の配列を有する８つの二重鎖オリゴヌクレオチドを調製するために標準ホスホアミダイト化学を用い、次いで、８つのオリゴヌクレオチドをMandeckiとBolling，Gene 68:101-108（1988）により記載されたＦｏｋ−１遺伝子合成法に供して、全長のヒトプレプロエリスロポエチンをコードするＤＮＡを作製した。配列番号：８〜１４のオリゴ配列の各々を、その構築が上記Mandec kiとBollingにより記載されたｐＷＭ５００のＳｍａＩ部位中に連結し、次いで、そのベクター内にクローン化した。配列番号：１５のオリゴ配列を、その構築がやはり上記MandeckiとBollingにより記載されたｐＷＭ５０１のＳｍａＩ部位中に連結し、次いで、そのベクター内にクローン化した。クローニング後、Ｆｏｋ −１を有するベクターの消化および、ポリアクリルアミドゲルからの電気溶出によるオリゴの精製により、各オリゴを得た。次いで、プレプロエリスロポエチンをコードするセグメントを構成する配列番号：１と同じである意図した配列を有する６２５ｂｐＢａｍＨＩ断片を含む６４０塩基対（“ｂｐ”）ポリヌクレオチドを得るために、８つのオリゴを相互に連結した。６４０ｂｐ断片を、次のサブクローニングを容易にするために５′‐末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３′ ‐末端上の単一のＥｃｏＲＩ部位を有するように設計した。６４０ｂｐ断片を提供するライゲーション後、その断片をＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化し、その結果できた６４０ｂｐ断片を同様に消化したｐＵＣ１９中に連結して、図１に具体的に示したプラスミドｐＥＰＯｗ５を得た。プレプロエリスロポエチンをコードする断片が、実際、ヒトプレプロエリスロポエチンをコードするということを立証しようするために、ｐＥＰＯｗ５中の６４０ｂｐ断片の配列を決定した。Ｂ．オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発による合成間違いの修正ｐＥＰＯｗ５のプレプロエリスロポエチンをコードする断片は、ヒトエリスロポエチンの残基８４および９５に存在するアミノ酸を別のアミノ酸へ変化させた２つのヌクレオチドエラーを含む。８４位および９５位のアミノ酸がヒトエリスロポエチンと同じになるようにエラーを修正するには、配列番号：１の３５２位に存在するＣをＴに変え；３５３位に存在するＴをＣに変え；３８５位に存在するＣをＧに変え；３８７位に存在するＡをＧに変える必要がある。そこで、ｐＥＰＯｗ５を、ＥｃｏＲＩで完全にＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化した。消化したプラスミドを、０．７％アガロースゲル中で電気泳動にかけ、１００ボルトで１時間モデルＵＥＡエレクトロエリューター（International Biotechnologies In c.，New Haven，Connecticut，USA）を用いて、約６４０ｂｐの断片をアガロースから７．５Ｍの酢酸アンモニウム塩架橋中に電気溶出した。Ｍ１３ｍｐ１８の複製型をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化し、溶出した断片に連結した。連結したＤＮＡを大腸菌（菌株ＤＨ５ａｌｐｈａＦ′）中にトランスフェクションし、ファージプラークを２×ＹＴ培地に移した。ファージを予備的に大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａＦ′細胞内で増殖させた。ファージを大腸菌ＣＪ２３６細胞［ｄｕｔ−１、ｕｎｇ−１］上で力価測定し、MutaGene突然変異誘発キットの製造元（Bio-Rad Laboratori es，Richmond，California，USA）により推奨されたように０．２のＭ．Ｏ．Ｉ．で感染させることにより同じ菌株から、ウラシルを含有するファージを調製した。製造元により推奨されるようにファージから鋳型ＤＮＡを抽出した。残基８４および９５の突然変異は、配列番号：２の配列を有するホスホリル化オリゴヌクレオチド-１および配列番号：３の配列を有するホスホリル化オリゴヌクレオチド‐２の鋳型ＤＮＡに対する同時アニーリングによって特定された。適切な配列修正を有するＤＮＡを、突然変異誘発キットの製造元により推奨された通りにインビトロで合成した。変異した（修正した）ＤＮＡをＤＨ５ａｌｐｈａＦ′細胞中にトランスフェクションし、ＤＮＡ配列決定のためにファージプラークを単離した。配列確認後、変異した（配列修正した）プレプロエリスロポエチンをコードするＤＮＡ断片を、下記の発現のためにサブクローン化した。合成ヒトプレプロエリスロポエチンをコードするＤＮＡのＤＮＡ配列を、配列番号：１に示す。Ｃ．オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるプレプロ‐ｐｍ２５をコードするＤＮＡの構築オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によるプレプロ‐ｐｍ２５（即ち、［Ｐｒｏ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］ヒトプレプロエリスロポエチン）をコードするＤＮＡの構築を、修正した天然型ヒトプレプロエリスロポエチンをコードするＤＮＡを提供する上記方法により達成した。修正したプレプロエリスロポエチンをコードするＤＮＡを、プレプロ‐ｐｍ２５をコードするＤＮＡを提供するための鋳型ＤＮＡ源として用いた。ＤＮＡ突然変異誘発プライマーは、（ｉ）配列番号：１の１９９位および２００位の両方の位のヌクレオチドがＣ′に変化した配列番号：４に特定した配列を有するオリゴヌクレオチド‐３、並びに（ｉｉ）配列番号：１の５１７位のヌクレオチドがＴに変化した配列番号：５に特定した配列を有するオリゴヌクレオチド‐４である。Ｄ．プレプロエリスロポエチンおよびプレプロ‐ｐｍ２５をコードするＤＮＡの真核細胞発現ベクター中へのサブクローニング真核細胞発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏをＸｂａＩで２時間消化し、等量の緩衝液飽和フェノール／クロロホルム（１：１）、続いてクロロホルムでＤＮＡを抽出した。消化したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、乾燥し、５０マイクロリットルのＴＥ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。消化したベクターを仔ウシアルカリ性ホスファターゼで３７℃で１時間処理した。ホスファターゼ処理したベクターを、フェノール：クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、乾燥し、ＲＥａｃｔ２緩衝液（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＮａＣｌ）（Ｇｉｂｃｏ‐ＢＲＬ、Gaithersburg，Maryland，USA）に再懸濁した。ＸｂａＩで消化したベクターの突き出た５′‐末端を、室温で３０分間のＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ）の大断片と０．１ｍＭの２′‐デオキシリボヌクレオシド三燐酸との充填反応により平滑にした。クレノウ断片をフェノール／クロロホルム抽出により取り出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ（５０マイクロリットル）に再懸濁した。ヒトプレプロエリスロポエチンおよびプレプロ‐ｐｍ２５をコードするＤＮＡ断片を、やはり平滑処理したＢａｍＨＩ断片のような、ＸｂａＩで消化しクレノウで平滑化した発現ベクター中にサブクローン化した。これらの断片を大腸菌菌株ＨＢ‐１０１内でプラスミドの一部として増殖させた。ｐＨ８．０のＳＤＳを用いた溶菌および次の塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製プラスミドを１リットルの培養物から調製した（T．Maniatis等，Molecular Cloning，89-94頁，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1982）。プラスミドＤＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸収により測定した。予備量を、ＢａｍＨＩで消化し、トリス‐アセテート緩衝液中の０．７％アガロースゲル中で電気泳動にかけた。約６２５ｂｐのバンドを、１００ボルトで１時間、モデルＵＥＡエレクトロエリューター（International Technologies Inc,）を用い、アガロースから７．５Ｍの酢酸アンモニウム塩架橋中に電気溶出した。溶出したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥに再懸濁した。発現ベクターのために上記で述べたような酵素による修復により５′‐突出末端を平滑にした。平滑化した発現ベクターおよび断片を、１５℃で１６時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。連結混合物を大腸菌内に形質転換し、修正クローンを標準法により同定した。クローンを１リットル段階で増殖させ、上記のようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた溶解および塩化セシウム密度勾配遠心分離によりプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミド（発現ベクター）を４℃のＴＥ中で貯蔵した。ヒトプレプロエリスロポエチン用発現ベクターをＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯと命名し、［Ｐｒｏ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］ヒトプレプロエリスロポエチン用の発現ベクターをＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏｐｍ２５と命名した。ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯの構築およびサブクローニングの説明図を図２に示す。ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏを、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットおよびＳＶｄｅｌｔａＳＪ発現カセットの公的に入手可能なプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（American Type Culture Collection，Rockville，Maryland ，USA，Accession No．37146；Berg等，Mol．Cell．Biol．1:854 -864（1981））への付加により構築した。プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒは、ｐＢＲ３２２から誘導された２．３キロ塩基対（ｋｂｐ）のＰｖｕＩＩ〜ＥｃｏＲＩ断片（図２において“ｏｒｉＰＢＲａｍｐ”と称される）を有し、細菌の複製起点（“ｏｒｉ”）および、プラスミドｐＢＲ３２２から得たβ‐ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を提供する）（“ａｍｐ”）を有する。プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒも、Ｔ‐抗原プロモーターを有するサルウィルス４０（ＳＶ４０）ＤＮＡの０．３４ｋｂｐのＰｖｕＩＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図２において“ＳＶＥ”と称される）、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするｃＤＮＡ配列を有する０．７４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ〜Ｂｇ１ＩＩ断片（図２において“ｄｈｆｒ”と称される）、並びにＳＶ４０Ｔ‐抗原ｍＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを有する０．８２ｋｂｐＢｇ１ＩＩ〜ＢａｍＨＩ断片（図２において“ｓｖ４０−Ａ”と称される）および公知の機能を持たない０．７５ｋｂｐＢａｍＨＩ〜ＥｃｏＲＩ断片（図２において“ｓｖ４０−Ｂ”と称される）を含むＳＶ４０ＤＮＡの１．６ｋｂｐのＢｇ１ＩＩ−ＥＣｏＲＩ断片を有する１．９ｋｂｐ発現カセットを含有する。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット（ベクターで形質転換した細胞にネオマイシン耐性を提供する）を、通常のサブクローニング法（例えば、上記Maniatis等）によりプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＰｖｕＩＩ部位に挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットは、チミジンキナーゼプロモーターを有する単純ヘルペスウィルス‐１（“ＨＳＶ１”）ＤＮＡの０．２５ｋｂｐＰｖｕＩＩ〜ＳｍａＩ断片、ネオマイシン耐性を提供する酵素をコードするトランスポゾンＴｎＳの１．０ｋｂｐＢｇ１ＩＩ〜ＳｍａＩ断片、およびチミジンキナーゼｍＲＮＡポリアデニル化部位およびシグナルをコードするＨＳＶ１ＤＮＡの０．６ｋｂｐＳｍａＩ〜ＰｖｕＩＩ断片を含有する１．８ｋｂｐ断片であり、これら全ての断片は、当業者等に容易に入手可能である。ＳＶｄｅｌｔａＳＪ発現カセットは、Ｔ-抗原プロモーターを有するＳＶ４０ＤＮＡの０．３４ｋｂｐのＰｖｕＩＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図２の“ＳＶＥ” ）、ＳＶ４０Ｔ‐抗原プロモーターの調節下で発現する異種ＤＮＡの挿入用ＸｂａＩ部位、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子由来の３′‐エンハンサーを有するＢ型肝炎ウィルス（サブタイプａｄｗ）ＤＮＡの０．４４ｋｂｐＨｐａＩ〜ＢａｍＨＩ断片（図において“ｄｅｌｔａＳ” と称される）、及びこのＤＮＡのＢａｍＨＩＪ断片由来のＨＳＶ１ＤＮＡの１．８５ｋｂｐＢａｍＨＩ〜ＰｖｕＩＩ断片、を有する２．５ｋｂｐ断片である。ＳＶｄｅｌｔａＳＪカセットを予め組み立て、（クレノウで平滑化した後）ＳＶ２−ｄｈｆｒのＢａｍＨＩ部位中に挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットおよびＳＶｄｅｌｔａＳＪ発現カセットのプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ中への挿入により、図２に示したプラスミド発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏが生じた。実施例２ｐｍ２５をコードする合成遺伝子の別の構築法上記ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏｐｍ２５発現ベクターを調製する別の方法において、全長のｐｍ２５をコードするＤＮＡを、標準ホスホアミダイ化学を用いることによりデノボ合成する。一連の二重鎖オリゴヌクレオチドを、実施例１のアプローチとは異なるが実施例１で述べたものと同様の方法で、例えば３３位のプロリン残基および１３９位のシステイン残基をコードする変化のような天然型エリスロポエチン配列中に突然変異を既に含む遺伝子から組み立てた場合のオリゴヌクレオチドを調製する。上記MandeckiとBollingのＦｏｋ−１遺伝子合成法を用いて又は遺伝子合成の当業者等に公知の他の方法により、合成オリゴヌクレオチドを組み立てる。その結果できた合成ｐｍ２５遺伝子の配列を、組み立てたプレプロ‐ｐｍ２５遺伝子の標準ＤＮＡ配列決定法により確認する。組み立てたプレプロ‐ｐｍ２５遺伝子を、次いで、合成プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子の５’および３’末端の単一の制限部位の包含、次いで制限エンドヌクレアーゼ消化およびサブクローニングによるような前述の標準方法によりプラスミドベクター／発現ベクター中にサブクローン化する。実施例３突然変異用ＲＴ−ＰＣＲによるプレプロ‐ｐｍ２５遺伝子の別の構築法プレプロ‐エリスロポエチン類似体遺伝子も、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて調製することができる。このような手法の代表的なものは、天然型エリスロポエチンをコードする遺伝子の発現レベルを増強することが公知の方法（H ．Scholz等，Am，J．Physiol．263:474-479（1992））で１００μＭの塩化コバルトを有する培養物中で４８時間哺乳類細胞を処理する、プレプロ‐pｍ２５をコードするＤＮＡ配列調製である。次いで、細胞を、冷食塩水溶液で洗浄し、遠心分離により培養物から回収する。細胞ペレットを、１％トリトンＸ‐１００を含有する食塩水に再懸濁することにより溶解し、遠心分離して核を取り除くことにより、その結果できた上澄は全ｍＲＮＡを含有する。あるいは、細胞ペレットを、グアニジンイソチオシアネートで溶解して全ＲＮＡを調製することができる。次いで、ｍＲＮＡを、製造元（Dynal A/S，N-0212 Oslo，Norway）により推奨されるように、Dynabeads Oligo dt25（デオキシチミジン）オリゴヌクレオチドを担持したビーズへのアニーリングにより単離する。全ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネートで溶解した細胞から標準法により調製する。ランダムヘキサマープライマーおよび逆転写酵素を用い、約１０⁵細胞または約０．１μｇの全ＲＮＡから単離したオリゴｄｔで選択したｍＲＮＡから、相補的ＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡは、突然変異用ポリメラーゼ連鎖反応法の鋳型として役立つ。３セットの異なるプライマーを用いてＰＣＲ反応法を行い、プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子を、各断片用プライマー１セットを有する３つの異なる断片（アミノ、中間およびカルボキシ）として合成する。アミノ断片の５’プライマーは、次の分子操作のための制限部位およびｃＤＮＡ鋳型の５’末端に相補的な配列を含有する。アミノ断片の３’プライマーは、分子操作のための制限部位およびｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列を含有する。中間断片の５’プライマーは、アミノ断片の３’制限部位をアニーリングすることのできる制限部位、プレプロ‐ｐｍ２５の３３位のプロリン残基をコードするコドン、およびｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列を含有する。中間断片の３’プライマーは、プレプロ‐ｐｍ２５の１３９位のシステイン残基をコードするコドン、次の分子操作用制限部位、およびｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列を含有する。カルボキシ断片の５’プライマーは、中間断片の３’プライマーの３’制限部位にアニーリングすることのできる制限部位、およびｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列を含有する。カルボキシ断片の３’プライマーは、ｃＤＮＡ鋳型に相補的な配列および次の操作のための制限部位を含有する。全プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子の最終的組み立てに先立ち、個々の断片をサブクローン化し、配列を確認することができる。各プライマー中に取り込んだ制限部位を用いた断片の制限酵素消化および、その結果できた相補的末端のライゲーションにより、プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子を組み立てる。組み立てたプレプロ‐ｐｍ２５遺伝子は、エリスロポエチンをコードするメッセージにもともと見い出された５’非翻訳および３’非翻訳の配列およびプレプロ‐ｐｍ２５遺伝子のコード配列を含有する。これらの非翻訳配列は、当業者等に公知の方法を用い、プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子のコード配列に相補的なプライマーを用いた次のＰＣＲ反応法を用いて取り出すことができる。次いで、プレプロ‐ｐｍ２５遺伝子をコードする全遺伝子を、既に述べたような適切な発現ベクター中にサブクローン化する。実施例４形質転換した細胞系による蛋白質の発現Ａ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞のトランスフェクション陽イオン性リポソームが仲介する手法（P．L．Felgner等，Proc．Natl．Acad ．Sci，84:7413-7414（1987））を用い、当業者に容易に入手可能であるＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞［ｄｘｂ− １１１］（Uriacio等，Proc．Nat．Acad．Sci．77:4461-4466（1980）；America n Type Culture Collection Accession No．CRL 9096）中にプラスミドＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯおよびＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏｐｍ２５の各々をトランスフェクションした。Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原を発現する発現プラスミドを用いて同様のトランスフェクションを行い、その結果できたトランスフェクション細胞を、下記のインビボバイオアッセイ実験用の負の対照培養液源として役立てた。ＣＨＯ／ｄｈｆｒ‐細胞を、１０％仔ウシ胎児血清、Ｌ‐グルタミン（１μＭ）を追加したHamのＦ−１２培地中で培養し、トランスフェクションの２４時間前に、フラスコ当たり５−８×１０⁵細胞の濃度で２５ｃｍ²のフラスコ中に新たに接種した。１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを、２．４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有する１．５ｍｌのＯｐｔｉ −ＭＥＭＩ還元血清培地（Gibco-BRL）に加え、組織培養物内の細胞中へのリポソームが仲介するＤＮＡのトランスフェクション用の１００マイクロリットルのリポフェクチン試薬（Gibco-BRL）を、２番目の１．５ｍｌのＯｐｔｉ− ＭＥＭＩ培地に加えた。これら２つの溶液は、ポリスチレンの試験管内で調製した。２つの溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートした。培養培地を細胞から除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液で置き換えた。細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、選択に先立ち更なる２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液を培養培地で置き換えた。Ｂ．選択および増幅トランスフェクション１日後、細胞を１：３で継代培養し、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選択培地（以後、“Ｆ−１２マイナス培地Ｇ”と称する）と共にインキュベートした。選択培地は、透析仔ウシ胎児血清（JRH Biosciences，Lenexa，Kansas ，USA）およびｍｌ当たり３００マイクログラムのＧ４１８（Gibco-BRL）を追加したＬ‐グルタミン含有、ヒポキサンチン、チミジンまたはグリシン（Gibco-BR L）非含有のHamのＦ−１２である。トランスフェクション細胞のＦ−１２マイナス培地Ｇを用いたインキュベーションの４−５日後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ringold等，J．Mol．Appl．Gen et．1:165-174（1981）およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（P．J．Southern and P．Berg ，J．Mol．Appl，Genet．1:327-341（1981））の存在を示すコロニーが出現した。約２週間後、ＤＨＦＲ／Ｇ４１８細胞は、継代およびＦ−１２マイナス培地Ｇ中での継続維持を可能にするのに十分伸張した。トランスフェクションしたエリスロポエチンまたはｐｍ２５遺伝子の増幅を、メトトレキセート（R．Schimke，Cell 37:705-713（1984）により概説された）を用いたＤＨＦＲ＋、Ｇ４１８＋細胞の段階的選択により達成した。細胞を、耐性コロニーが出現するまで約２週間、１５０ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含有するＦ−１２マイナス培地Ｇと共にインキュベートした。ＭＴＸ耐性細胞を継代培養し、適切な選択培地に維持した。更なる増幅を、５μＭのＭＴＸを用いた選択により達成し、細胞を連続して適切な選択培地に維持した。Ｃ．細胞系の維持および貯蔵培養物中および種々の選択または増幅手法を受けている細胞は、週３回適切な培養培地を繰り返し補給された。細胞を、標準法を用い、７５ｃｍ²のフラスコ中に適切な培地を用いて１：５で継代培養した。低温貯蔵は、５％ＤＭＳＯ（Si gma， St．Louis，Missouri，USA）を含有する１．８ｍｌの適切な培養培地中への２− ４×１０⁶細胞の再懸濁および−８０℃で２４時間冷所貯蔵、次いで−１３５℃ で永久貯蔵によった。Ｄ．無血清培地中でのエリスロポエチンおよびｐｍ２５の生産エリスロポエチン‐（即ち、ｒＥＰＯ‐）またはｐｍ２５を発現するＤＮＡのいずれかでトランスフェクションした細胞を、３００マイクログラム／ｍｌのＧ４１８を含有するＦ−１２マイナス培地Ｇ中で集密になるまで生育させ、次いで、培養培地を除去し、生産培地（５ｍｌ／２５ｃｍ²の表面積）で置き換えた。生産培地は、Ｌ-グルタミン、ＨＥＰＥＳ緩衝液含有、フェノールレッド（jRH B iosciences）非含有のＶＡＳ培地（魚プロタミン硫酸塩を追加した無血清培養培地）であった。細胞を３７℃で３日間培養し、ならし培地をｒＥＰＯまたはｐｍ２５源として用いた。ならし培地から得たｒＥＰＯおよびｐｍ２５ポリペプチドは、両方共ｄｅＳ− Ａｒｇ¹⁶⁶である。実施例５発現した蛋白質のインビトロ生物学的活性Ａ．インビトロバイオアッセイエリスロポエチン活性を、フェニルヒドラジン処理したマウスの脾臓細胞内への放射線標識したチミジンの取り込みにより測定した（G．Krystal，Exp．Hemat ol．11:649-660（1983））。少なくとも１０週齢のメスのＣ５７／６マウスに、頚部脱臼の７２および９６時間前に、フェニルヒドラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）を２回腹腔内（ｉｐ）注射した。最も大きい脾臓を取り出し、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を追加したアルファＭＥＭ培養培地（ヌクレオチドを含まない）中にやさしく掻き裂いた。組織懸濁液を５０ｍｌのポリプロピレン試験管内で１分間インキュベートし、脾臓細胞を、大きな組織凝集物から取り出した。脾臓細胞を、臨床用遠心分離機内で１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、脾臓培養培地（ＳＣＭ）に再懸濁した。ＳＣＭは、抗生物質、０．４％ＢＳＡ、２．０％Nutridoma NS（Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，Indian a，USA）、赤血球細胞生育用に選択した３０％仔ウシ胎児血清（Hyclone，Logan ，Utah）および０．１ｍＭ２‐メルカプトエタノールを含有するａｌｐｈａＭＥＭ（ヌクレオチドを含まない）である。細胞懸濁液をナイロンメッシュ（２００）に通して残存する凝集物を取り除き、次いで、有核細胞を、血球計でカウントした。細胞を、ＳＣＭ中で室温で約３時間８×１０⁶細胞／ｍｌで時々撹拌しながらインキュベートした。９６個のＵ状ウェルを有するマイクロタイタープレートのウェルに５０マイクロリットルずっの細胞懸濁液を接種し、これにＳＣＭ中の試料同量を加えた。細胞を、ＣＯ₂インキュベーター（５％ＣＯ₂）内で３７℃で２２− ２４時間インキュベートし、次いで、０．６μＣｉのトリチウム化チミジンを各ウェルに加え、更に２時間インキュベーションを継続した。マイクロタイタープレートを氷上に置くことにより反応を停止させた。ＰＨＤ細胞回収器（Cambridg e Technology, Watertown，Massachusetts，USA）を用いグラスファイバーディスク上に細胞を回収し、少なくとも蒸留水で１０回、９５％エタノールで１回洗浄した。放射能を、シンチレーションカウンター（Beckman Instruments，Fulle rton，California，USA）を用いて測定した。天然のヒト非組換えエリスロポエチン（Toyobo New York，Inc.，New York，New York，USA）（ｈＥＰＯ）を、陽性の対照として全てのアッセイに０．２５−１６ミリ単位／ウェルで含めた。各データのポイントは、少なくとも３つのウェル／試料から得た３つの測定値の平均である。図３に示すように、ｈＥＰＯ（即ち、エリスロポエチン標準）、ｒＥＰＯ（即ち、ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏＥＰＯでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞から得た組換え天然型のエリスロポエチン）およびｐｍ２５をアッセイした場合、用量に依存した応答が得られた。記載した図３のデータは、ｐｍ２５では１５μｇ／ｍｌ、ｒＥＰＯでは１８μｇ／ｍｌで開始する一連の希釈にわたる精製ｐｍ２５およびｒＥＰＯのアッセイからの結果を示す。これらのデータは、明らかに、たとえ突然変異体エリスロポエチン、即ちｐｍ２５（［Ｐｒｏ³³ ，Ｃｙｓ¹³⁹］ヒトエリスロポエチン）が、３３の位置にシステイン残基を有さず、従って以前の研究者達がエリスロポエチン活性に必須であると考えた残基２９および３３間のジスルフィド結合を形成することができなくても、ｐｍ２５は、ヒトエリスロポエチンと同等のインビトロ活性を有することを示している。Ｂ．ラジオイムノアッセイおよびインビトロ比活性ｒＥＰＯおよびｐｍ２５の質量を、市販のラジオイムノアッセイキット（Incs tar，Stillwater，Minnesota，USA）を用い、標準曲線作製のため陽性の対照としてｈＥＰＯを含めたことを除いては製造元により説明された通りに測定した。ｒＥＰＯを、下記の通りに均質になるまで精製し、アミノ酸組成分析により質量を測定した。Pico Tag Work station（Waters，Milford，Massachusetts，USA）を用い、約５０−３００ピコモルの蛋白質を用い、真空下、１５５℃で２時間、標準加水分解を行った。精製した標準を−８０℃で貯蔵し、新鮮なその一部を各ラジオイムノアッセイの標準曲線のために用いた。精製した標準は、０．２５− ２．０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で用いた場合、直線応答（対数濃度対カウント）を生じさせた。２ｎｇ／ｍｌの標準で、約１０５０カウントを観察し；１ｎｇ／ｍｌで、約２０００カウントを観察し；０．５ｎｇ／ｍｌで、約３２００カウントを観察し；０．２５ｎｇ／ｍｌで、約４２５０カウントを観察した。従って、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の培養上澄から得たｒＥＰＯまたはｐｍ２５両方のインビトロ比活性を日常的に算定し、それは９０，０００から１３０，０００単位／ｍｇの範囲であった。実施例６発現蛋白質のインビボ生物学的活性Ａ．小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーｒＥＰＯ、ｐｍ２５およびＨｂＳＡｇ（負の対照として）で各々トランスフェクションした細胞から得たならし生産培地を、小麦胚芽凝集素‐セファロースカラムを通過させて部分的に精製（約１０倍）し、エリスロポエチン活性を濃縮した。予め燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した１ミリリットルの小麦胚芽凝集素‐セファロース（Sigma社）を充填した使い捨てミニカラム（Spectrum Me dical industris，Inc.，Houston，Texas，USA）に３０ミリリットルのならし培地を通過させた。通過液を集め、２回目もカラムを通過させ、次いで、カラムを９カラム容量のＰＢＳで洗浄し、エリスロポエチン活性を、１．５カラム容量のＮ，Ｎ‐ジアセチルキチビオースで溶出した（J．L．Spivak等，Blood 52:1178- 1188（1978））。溶出した物質を、インビボバイオアセイに用いるまで−８０℃ で貯蔵した。小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーにより得たｒＥＰＯまたはｐｍ２５のインビトロ活性は、ならし生産培地から得られた値と区別がつかなかった。Ｂ．ｒＥＰＯおよびｐｍ２５の飢餓ラットインビボバイオアッセイｒＥＰＯおよびｐｍ２５のインビボ活性を、改変した飢餓ラットバイオアッセイ（W．Fried等，Proc，Soc．Exp，Med，94237-241（1957））で測定した。このアッセイでは、放射性鉄の取り込みよりむしろ網状赤血球細胞カウントを監視した。４または５匹の動物群を、その各々を上記の通りの小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーにより部分的に精製したｒＥＰＯまたはｐｍ２５で処理した。負の対照動物を、ＨｂＳＡｇトランスフェクション細胞から得たならし生産培地から調製した小麦胚芽溶出液で処理した。代表的アッセイでは、ラットを月曜日から金曜日まで断食させ、火曜日、水曜日および木曜日にｒＥＰ０またはｐｍ２５を静脈注射した。月曜日および火曜日に網状赤血球カウントを測定（下記参照）し、２つの平均を出発網状赤血球カウントとした。網状赤血球カウントを金曜日に測定し、各動物の残存する網状赤血球のパーセンテージを算定し、各群の平均を算定した。負の対照のラットは、通常、約５０％の出発網状赤血球を保持した。ｒＥＰＯまたはｐｍ２５のいずれかで処理したラットの結果を、負の対照に対する治療群平均値の比率として表わしたところ、６０または１００ｎｇｓのｒＥＰ０またはｐｍ２５で処理したラットは、網状赤血球の用量に依存した増加を示した（表１参照）。同量（ラジオイムノアッセイにより測定して）のｐｍ２５で処理したラットは、ｒＥＰＯで見られるそれに比し顕著に大きい、用量に依存した応答を示す。ラットを、やはり、インビトロにより測定して同単位量のｐｍ２５またはｒＥＰＯで処理した。ｐｍ２５で処理した動物は、同量のｒＥＰＯで処理した動物と比較した場合、改良された応答を示した（表２参照）。ｐｍ２５の増加した効力は、１回量のｐｍ２５で処理した動物においても明白である。火曜日に投与した１回量のｐｍ２５で処理したラットは、３回量のｒＥＰＯで処理したラットのそれと実質的に等しい応答を示した（表３参照）。火曜日、水曜日または木曜日に１回量のｒＥＰＯで処理したラットは、３回量のｒＥＰＯで処理した動物と比較した場合（１日につき１回）、そのような等価を示さなかった（表４参照）。これらのデータは、ｐｍ２５が、増加したインビボ効力を有するのみならず、１回量投与により効果的なエリスロトロピックな薬剤である（即ち、複数回量を用いることなしに効果的である）ことを示している。Ｃ．網状赤血球のフローサイトメトリーな測定網状赤血球カウントを、チアゾールオレンジ染色（L．G．Lee等，Cytometry 7 :508-517（1986））を用い、抹梢血網状赤血球のフローサイトメトリー分析により測定した。製造元により推奨された通りにRetic-COUNTR（商標）チアゾールオレンジ染色（Becton Dickinson，San Jose，California，USA）を用い、フローサイトメトリーのためのヘパリン添加ラット全血を調製した。各々５マイクロリットルの試料血を１ｍｌのチアゾールオレンジ染色液と混合し、室温で４５分間暗所でインキュベートした。チアゾールオレンジを欠きＰＢＳを含有することを除いては同様の方法で未染色の対照を調製した。長時間染色は異常に高い値を生じさせることから、染色インキュベーション後９０分以内に分析を完了した。１５ＭＷの出力、４８８ｎｍでアルゴンイオンレーザーを装備したEPICS ELIT Eフローサイトメーター（Coulter Electronics，Hialeah，Florida，USA）を用いて試料を分析した。ログ（log）前方角光散乱、ログ側方散乱（９０度）、およびログ緑色蛍光パラメーターを集めた。標準ELITEフィルターを用いたが、前方光散乱については中性度１、側方散乱については４８８ジクロイックロングパス、および緑色蛍光については５２５バンドパスである。フローサイトメーターを、Immuno-Check fluorospheres（Coulter Eleclronic s社）を用いて毎日調整し、Immuno-Brlte Level II fluorospheres（Coulter El ectronics社）を用いて標準化した。標準化は、装置のセッティングにおける日々の変化を埋め合わせる。３つのヒストグラム、即ち、２つのパラメーターログ側方散乱対ログ前方散乱、ログ蛍光対ログ前方散乱、および単一のパラメーターログ緑色蛍光を集めてコンピュータープロトコールを樹立した。染色した試料を分析して赤血球のみの包含用ゲートを確立した。血小板および背景の破片を排除する、ログ前方散乱対ログ側方散乱のプロット上のリンパ球および赤血球を含有する集団の周辺に無定形のゲートを描いた。このゲートを記した集団を、次いで、ログ蛍光対ログ前方散乱ヒストグラムで表わした。高度に染色したリンパ球集団を除き、負の赤血球集団および陽性に染色した網状赤血球集団の周辺に長方形のゲートを描いた。このゲートを記した赤血球集団を、単一のパラメーターログ緑色蛍光ヒストグラムで表わした。未染色の対照試料を装置上で分析し、２５，０００の事象を集めた。カーソルを置いて０．１％のオートフルオレッシングセルを加え、染色した試料を分析した。網状赤血球を全赤血球のパーセンテージとして表わした。実施例７発現した蛋白質の精製Ａ．ｒＥＰＯの精製蛋白質ｒＥＰＯを、ならし生産培地からイオン交換、小麦胚芽レクチンおよび逆相クロマトグラフィーの組み合わせにより精製した。代表的には、１０リットルのならし培地を遠心分離により清澄にし、次いで、４℃で、１０，０００ダルトン分子量遮断膜を有するBenchmark回転式濃縮器（Membrex，Garfield，New Je rsey，USA）を用いて１０倍に濃縮した。濃縮した回収物を１５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、次いで、ミリリットル当たり２５ＫＩＵ（キロ国際単位）のアプロチニンを含有する同量の冷蒸留水で希釈し、この後、必要に応じて、ｐＨを７．３−７．４に調整した。希釈した濃縮物を、連結した２本のイオン交換カラムを通過させた。最初のカラムは、S-Sepharose Fast Flow樹脂（Pharmacia-LKB，Inc.，Piscatta way，New Jersey，USA）であり、２番目は、ＤＥＡＥ Sepharose Fast Flow樹脂（Pharmacia-LKB）である。カラムは、各々１．６×３３ｃｍであり、２０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。これらの条件下でｒＥＰＯはいずれのカラムにも結合しなかったが、しかしながら、多数の他の蛋白質が結合したことから、実質的精製を達成した。通過液および２００ｍｌの洗液を、予め２０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した２０ｍｌの小麦胚芽凝集素‐セファロースカラム（Sigma社）上に注ぎ入れ、１３５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で徹底的に洗浄した。ｒＥＰＯを、１０ｍＭのＮ，Ｎ‐ジアセチルキチビオースを含有する洗浄緩衝液で溶出した（上述のJ，L．Spivac等）。画分（３．５ｍｌ）を集め、各々を、ミリリットル当たり２５ＫＩＵのアプロチニンを含有するように調整し、各ｒＥＰＯを、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム‐ ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により検査した（U．K．Laemmli，Nature 22 7:680-685（1970）；H，Schagger and G．von Jagow，Anal．Biochem．166:368- 379（1987））。クマシーブルー３染色により測定して最も高い水準のｒＥＰＯを含有する画分をプールし、５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（３０μｌ／ｍｌ）で酸性にし、ＰＯＲＯＳＲ２／Ｈカラム（２．１×１００ｍｍ）（逆相カラム、PerSeptive Biosystems，Cambridge，Massachusetts，USA）上でクロマトグラフイーにかけた。平衡緩衝液は、５％ＣＨ₃ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであり、溶出緩衝液は、８０％ＣＨ₃ＣＮ中の０．０８％ＴＦＡであった。充填の６分後、１５分の勾配溶出（０％から１００％緩衝液）を行った。画分を手動で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度をアッセイした。ｒＥＰＯを−８０℃で貯蔵した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ｒＥＰＯは、３１，０００および４３，０００ダルトンのマーカー間に移動し、見かけの３６，０００ダルトンの分子量を有した。次のプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを用いた消化およびアミノ酸配列分析（下記参照）により、ｒＥＰＯの存在を確認したが、他の蛋白は判明しなかった。Ｂ．ｐｍ２５の精製ならし生産培地から得た蛋白質ｐｍ２５を、ｒＥＰＯのために説明したそれと同一の手法により精製した。しかしながら、ｒＥＰＯと異なり、精製したｐｍ２５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、ｐｍ２５と共精製された約６０，０００ダルトンの電気泳動移動度を有する高分子蛋白質の存在を示した。この高分子量夾雑物が存在することから、高分子量成分をｐｍ２５から分離するため別の精製手法を実施した。前述の小麦胚芽凝集素‐セファロースクロマトグラフィー工程後、溶出した物質を、５％ＣＨ₃ＣＮ中の１０％ＴＦＡ（１００μｌ／ｍｌ）で酸性にした。Pharmacia URPC C2/C18カラム（2.1×100mm）を用い、１分当たり２００マイクロリットルの流速で、吸収を監視することにより生成物含有画分収集を自動化したＳＭＡＲＴ³高性能液体クロマトグラフィーシステム（Pharmacia社）上で試量をクロマトグラフィーにかけた。初めの緩衝液は、５％ＣＨ₃ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであり、溶出用緩衝液は、８０％ＣＨ₃ＣＮ中の０．０８％ＴＦＡである。充填の５分後、溶出緩衝液の濃度は、１分後に０％から４０％増大した。３０分の４０％から７０％溶出緩衝液勾配を実施してｐｍ２５を溶出した。ＳＭＡＲＴシステムの“ピーク検出”能力を用いて画分を集め、ＳＤＳ− ＰＡＧＥを用いてｐｍ２５を同定した。部分的に精製したｐｍ２５を乾燥し、１００ｍＭのＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄、ｐＨ４．１、６Ｍ尿素に再懸濁した。同じ緩衝液中で平衡化したMono-S陽イオン交換カラム（Pharmacia社）（１．６×５０ｍｍ）上に試料を充填し、ＳＭＡＲＴシステムを用い室温でクロマトグラフィーにかけた。試料を１分当たり１００マイクロリットルで充填し、１分当たり１５０マイクロリットルでクロマトグラフィーにかけた。充填の５分後、２０分の０−５０％溶出緩衝液（１００ｍＭのＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄、ｐＨ４．１、１ＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素）勾配を実施した。ＳＭＡＲＴシステムの“ピーク検出”能力を用いて画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてｐｍ２５を同定した。溶出したｐｍ２５を、次いで、上述のようにＵＲＰＣＣ２／Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ）上で再度クロマトグラフィーにかけた。試料を５％ＴＦＡで酸性にし、１分当たり２００マイクロリットルでカラム上に充填した。初めの緩衝液は、５％ＣＨ₃ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであり、溶出緩衝液は、８０％ＣＨ₃ＣＮ中の０．０８％ＴＦＡである。充填の５分後、２５分の勾配溶出（０から１００％緩衝液）を行った。ＳＭＡＲＴシステムの“ピーク検出”能力を用いて画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して位置を確認し純度を評価した。電気泳動分析は、２９，０００および４３，０００ダルトンのマーカー間に移動している単一のバンドを示し、見かけの約３６，０００ダルトンの分子量を示した。次のＬｙｓ−Ｃを用いたプロテアーゼ消化および配列分析は、ｐｍ２５の存在を示し、他の蛋白の存在を示さなかった。実施例８精製した蛋白質の生物学的活性Ａ．非貧血ラットモデルにおけるｒＥＰＯおよびｐｍ２５のインビボ活性精製したｒＥＰＯおよびｐｍ２５の生物学的活性を、処理した及び擬似処理したラットのヘマトクリットを測定することにより長期間非貧血ラットモデルで比較した。５匹のラット群を１週当たり３回計４週間、ｒＥＰＯまたはｐｍ２５で処理するかまたは賦形剤（０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）で擬似処理した。４つの群の動物を、静脈注射により賦形剤中の１５０、３００、４５０または６００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理し、２つの群を、同じ方法で賦形剤中の１５０または３００ｎｇｓのｐｍ２５で処理した。１つの群の動物は対照として役立て、１週当たり３回４週間賦形剤で静脈処理した。４週間の最後に各動物のヘマトクリットを測定し、各群の平均ヘマトクリット値を算定した。１５０ｎｇｓのｐｍ２５で処理した動物は、３００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した動物のそれと実質的に等しい応答を示した。同様に、３００ｎｇｓのｐｍ２５で処理した動物は、６００ｎｇｓのｒＥＰＯを投与した動物のそれと実質的に等しい応答を示した。従って、この長期モデルにおいては、ｐｍ２５は、天然型の組換えエリスロポエチンに比べ、処理した動物のヘマトクリットを上昇させるのに約２倍効果的であった（表５参照）。同様の実験で、ｐｍ２５の週に１回の投与を、ｒＥＰＯの週当たり３回の投与と比較した。１つの群の動物を週に３回４週間３００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した。２つの群の動物を週に１回４５０または６００ｎｇｓのいずれかのｐｍ２５で処理した。１つの群の動物は、週に３回賦形剤で処理し、擬似処理した対照として役立てた。４週間の処理計画の最後に各動物のヘマトクリットを測定し、各群の平均ヘマトクリット値を算定した。週１回ｐｍ２５で処理した動物は、週に３回３００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した動物と実質的に等しい応答を示した。これらのデータは、エリスロポエチンと比較した場合、ｐｍ２５が、減少した投与頻度という有利性を提供することを示している（表６参照）。更に別の関連実験で、週に１回ｒＥＰＯを長期間非貧血ラットモデルに投与し、擬似処理した及びｒＥＰＯ処理した動物のヘマトクリットを比較することにより、ｒＥＰＯの週１回投与を調査した。５匹の動物群を、週３回賦形剤（０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）で擬似処理する、ｒＥＰＯで処理する、または週１回ｒＥＰＯで計４週間処理した。１つの群の動物を、週３回４週間賦形剤のみで処理し、賦形剤対照として役立てた。３つの群の動物を、週３回４週間、賦形剤中の１５０、３００または４５０ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した。３つの更なる群の動物を、週１回４週間、賦形剤中の３００、６００または９００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した。週３回処理した動物は、５５．３％から６０．８％の範囲のヘマトクリット水準における用量に依存した増加を示した（表７参照）。週１回３００または６００ｎｇｓのｒＥＰＯで処理した動物は、賦形剤で処理した対照と比較してヘマトクリットの明らかな増加を示さなかったが、しかしながら、週１回９００ｎｇｓで処理した動物は、賦形剤処理した動物に比べヘマトクリットのささやかな増加のみ、および週３回投与した最も低いｒＥＰＯ投与量で処理した動物に見られるそれに比べ著しく低い増加を示した。これらのデータは、表６に示した通りのｐｍ２５の週１回投与で得られたものと比較した場合、本発明の類似体が、天然のエリスロポエチンと比較して週１回投与により、より大きいインビボエリスロポエチン効果を生み出すことを示唆している。Ｂ．非貧血アフリカみどりざるモデルにおけるｒＥＰＯおよびｐｍ２５のインビボ活性精製したｒＥＰＯおよびｐｍ２５の生物学的活性を、ｒＥＰＯで週３回またはｐｍ２５で週１回処理したアフリカみどりざるのヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を測定することにより長期間非貧血アフリカみどりざるモデルで比較した。オスの動物を５匹の２つの群に分割した。処理に先立ち、４８時間間隔で測定毎に０．５ｍｌの血液を採取することにより、その週に３回ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を測定した。各群の３回の測定値の平均を、各動物群の処理前値として用いた。１群の動物を、週３回計４週間、２μｇ／ｋｇのｒＥＰＯで処理した。第２群の動物を、週１回計４週間、４μｇ／ｋｇのｐｍ２５で処理した。エリスロポエチンを用いた処理は、血中鉄を枯渇させることが知られており、薬物の効能が利用可能な鉄により制限される（J．Eschbach等，New Eng．J．of Med．316:73-78 （1987））；従って、アフリカみどりざるの両方の処理群を、週２回１０ｍｇのペプトン化鉄（Rogenic，Forest Pharmaceuticals，St．Louis，Missouri，USA ）で処理してｒＥＰＯまたはｐｍ２５の効能に起因または効能を制限するかもしれない鉄欠乏を排除した。処理期間の最後に、ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を７２時間間隔で２回測定した。最終のヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度をこれらの値の平均値として算定したところ、ｒＥＰＯで週３回処理した動物のヘマトクリットおよびヘモグロビン値とｐｍ２５で週１回処理した動物のそれとは、実質的に同一であることが分かった（表８参照）。実施例９発現蛋白質の構造的特徴Ａ．精製したｒＥＰＯおよびｐｍ２５のプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ消化ｒＥＰＯおよびｐｍ２５をＬｙｓ−Ｃで消化し（K.L．Stone等，A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing，pp.31-471 ，ed．P．L．Maztsudaira，Academic Press（1989））、その結果できたペプチドを分析してこれらの分子内のジスルフィド結合の位置について地図を作製した。代表的には、１００マイクログラムの精製蛋白質をミクロ遠心チューブ中に乾燥させ、蛋白質を５０マイクロリットルの４００ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃、ｐＨ８．２、２ｍＭのＥＤＴＡ、８Ｍの尿素（脱イオン化）で溶解した。各々の２番目の試料を、Ｌｙｓ−Ｃ消化に先立ち還元した。還元は、窒素下、３７℃で３０分間４．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて行い、還元後、試料を室温に平衡化し、窒素下暗所で室温で１時間１０ｍＭのヨード酢酸でアルキル化した。還元化および非還元化試料を、尿素濃度が２Ｍになるように蒸留水で希釈した。蛋白質を、窒素下、３７℃で２−３時間、１．５マイクログラムのＬｙｓ−Ｃで消化し、次いで、更なる１．５マイクログラムの酵素を加え、消化を１５時間継続した。ＴＦＡを０．５％になるように加えることにより、消化を終了させた。ｕＲＰＣＣ２／Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ）およびＳＭＡＲＴシステム（Pharma cia社）を用いて逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチドを単離した。平衡緩衝液は、５％ＣＨ₃ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであり、溶出緩衝液は、８０％ＣＨ₃ＣＮ中の０．０８％ＴＦＡである。流速は、１分当たり２００マイクロリットルである。充填の５分後、５５分の勾配溶出（０％から１００％緩衝液）を実施した。ＳＭＡＲＴシステムの″ピーク検出″能力を用いて溶出したピークを集めた。画分は、アミノ酸配列に先立ち −２０℃で貯蔵した。Ｌｙｓ−Ｃペプチドの同定は、アミノ酸配列決定法（R．M ．Hewick等，J．Biol．Chem．256:7990-7997（1981））により、ＡＢＩモデル１２０ＡＰＴＨ分析器（Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California ，USA）を装備したＡＢＩモデル４７０Ａまたは４７７Ａシーケネーターを用いて測定した。データを集め、クロマトグラフィックデータマネージメント用ソフトウェアパッケージを有するアミノ酸配列分析用PE Nelsonソフトウェアシステム（Access* Chrom，Micro Vax 2000，Cupertino，California，USA）を用いて分析した。Ｂ．ｒＥＰＯおよびｐｍ２５におけるジスルフィド結合の同定エリスロポエチンの推論したアミノ酸配列は、分子内の８個のリシン残基を予言する。実施例１で述べたｐｍ２５の構築は、リシン残基の数または位置を変化させない。従って、これら両方の分子は、非常に類似したＬｙｓ−Ｃペプチドを有するはずであるが、ｐｍ２５の残基３３および１３９におけるアミノ酸の変化ゆえに違いが生じている。アミノ酸配列は、これらの分子をこのプロテアーゼで消化する場合、ｒＥＰＯまたはｐｍ２５のいずれかから生じるであろう９個のＬｙｓ−Ｃペプチドを予言する。両方の分子のＬｙｓ−Ｃ断片の位置を図４に示す。断片は、丸括弧で示した各ペプチド内に含有したエリスロポエチン残基を有するＫ１からＫ９までと命名される。エリスロポエチンに存在することが知られているジスルフィド結合の位置（P．H．Lai等，J．Biol．Chem．261:3116-3121（1986））は、残基２９および１３９のシステインをおそらく結合させる新規のジスルフィド同様ｐｍ２５に含まれる。ｒＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化の逆相クロマトグラフィーは、非組換えエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）について既に報告された（M．A．Recny等，J．Biol．Chem． 262:17156-17163（1967））ものと非常に類似したパターンを示しており、図４の図式表現と一致した。クロマトグラフィーからのペプチドの帰属は、ペプチド断片のアミノ酸配列決定に基づいた。還元および非還元ｒＥＰ０のペプチド地図の比較は、ペプチドＫ１およびＫ９が、未還元試料では共クロマトグラフし、還元試料では異なる保持時間で溶出することを示した。これは、ｒＥＰＯ（およびｈＥＰＯ）のペプチドＫ１およびＫ９間のジスルフィド結合の明白な証拠と考えられる。還元および非還元ｐｍ２５のペプチドプロフィールの調査は、ペプチドＫ１およびＫ９について同一のパターンを示した。しかしながら、ペプチドＫ２およびＫ６も、還元および非還元試料で変化した保持時間を示した。ペプチドＫ２は、非還元ｐｍ２５試料ではＫ６と共クロマトグラフし、還元ｐｍ２５試料では明らかに異なる保持時間を有した。これは、ペプチドＫ２およびＫ６が、図４に示したようなジスルフィド橋により結合しているという明白な証拠と考えられる。実施例１０エリスロポエチンの二重突然変異体の調製活性の著しい損失を引き起こす最初の位置の突然変異（アミノ酸の変化）が、蛋白質の一次構造の最初の位置から離れている２番目の位置での突然変異によって埋め合わされ、二重突然変異体の活性が、活性を減少させる最初の位置の突然変異を有する突然変異体のそれに比し顕著に高くなるような哺乳類エリスロポエチンの二重突然変異体を下記の通りに調製する。この実施例の文脈では、当業者には当然のこととして、特に断わらない限り、″活性″とはインビボの赤血球新生における比活性を指す。残基３３の最初の突然変異が、実質的にエリスロポエチン活性を失わせ、２番目の突然変異、即ち残基１３９のＡｒｇからＣｙｓへの変化が、エリスロポエチン活性を完全に修復、あるいは野性型糖ホルモンのそれ以上にエリスロポエチン活性を改良さえする最初のこのようなヒトエリスロポエチンの二重突然変異体は、ｐｍ２５である。分子内の代償突然変異が哺乳類エリスロポエチンで可能であるというこの証明は、エリスロポエチン活性が、実質的に、相当する野性型糖ホルモンのそれ以上に改良されるような二重突然変異体を含む、この糖ホルモンの種々の二重突然変異体を入手可能にする。熟練した研究者は、一つの位置のアミノ酸の変化ゆえに活性が減少した（および、典型的には実質的に活性がなくなった）最初の突然変異体をコードする最初のｃＤＮＡから開始して、２番目又はその次の位置に１つ以上のアミノ酸の変化を有することで最初のものと異なる非常に多数の２番目の突然変異体を容易に生じさせることができ、所望の水準のエリスロポエチン活性を有するこれらの突然変異体について２番目の突然変異体をコードする２番目のｃＤＮＡを発現によりスクリーニングすることができる。ヒトエリスロポエチンを用いて、方法を具体的に説明するが、典型的なケースでは、最初の突然変異体は、インビトロのエリスロポエチン活性がない。しかしながら、この方法は、いずれの哺乳類エリスロポエチンも供することができ、その場合、最初の突然変異体は、野性型と比較して減少してはいるがなくなってはいない活性を有することは、容易に明らかである。この方法は、ヒトエリスロポエチンのプレプロ最初の突然変異体をコードする最初のｃＤＮＡから開始して４つの工程を伴う。代表的には、リーダーペプチドをコードするｃＤＮＡのセグメントは、プレプロ‐ヒトエリスロポエチンのリーダーペプチドをコードする。最初の工程において、最初のｃＤＮＡ内の多数のランダム突然変異は、その結果できたアミノ酸の変化が、成熟糖蛋白質の１次配列に於いて、最初の突然変異体においてアミノ酸が変化した位置から離れている位置にあるような部位に生じる。突然変異が、プレプロ‐最初の突然変異体をコードする全ｃＤＮＡに沿って実質的にランダムに分布している場合でさえ、それらのほとんどは、最初のｃＤＮＡのリーダーペプチドをコードするセグメントの外側にあり、かつ成熟蛋白質の１次配列に於いて、最初の不活性な突然変異体糖ホルモンのアミノ酸が変化した位置から離れている位置のアミノ酸に対応するヌクレオチドトリプレット（コドン）中にある。“離れて”とは、少なくとも１、更に代表的には少なくとも１０アミノ酸の分離を意味する。二番目に、最初の工程からランダムに突然変異した２番目のｃＤＮＡのレパートリーをクローニングのため真核細胞発現ベクター中にライゲートし、その結果できた、ランダムに突然変異した２番目のｃＤＮＡを包含するベクターのライブラリー（“ランダムライブラリー”）を、適切な宿主内にクローンして都合のいい量のベクターのライブラリーを調製する。３番目に、発現ベクターライブラリー内のランダムに突然変異した２番目のｃＤＮＡが、発現およびプロセスして成熟した、２番目の突然変異体を分泌することのできる真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または他の適切な哺乳類細胞）中にランダムライブラリーをトランスフェクションする。次いで、細胞を培養し、その結果できた細胞集団をスクリーニングして、エリスロポエチン活性用インビトロアッセイでこのような活性を生み出す単一の細胞クローンを単離する。このような活性を有するクローンは、最初の突然変異体における活性の欠乏を２番目の突然変異が代償する２番目の突然変異体であるエリスロポエチン類似体を産生するものである。４番目に、それを産生するクローンから得たエリスロポエチンの２番目の突然変異体をコードする２番目のｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（“ＰＣＲ” ）または他のいずれかの核酸増幅技法により増幅し、増幅した核酸を配列決定して２番目の代償突然変異の位置およびアミノ酸の変化を決定する。たった今述べたようなプレプロ‐最初の突然変異体をコードするｃＤＮＡをランダムに突然変異する過程で生じる“代償突然変異”が、１つ以上の位置のアミノ酸の変化または、アミノ酸の付加もしくは欠失を伴うといえども、このような突然変異は、ただ１つの位置でのアミノ酸の変化を伴うこともあろう。次いで、その結果できた新規に同定した二重突然変異体エリスロポエチンをコードするｃＤＮＡを、適切な真核細胞発現ベクター内で用いて、ベクターで形質転換した哺乳類細胞を培養することにより、二重突然変異糖ホルモンを産生させ、このように産生した二重突然変異体のインビボ比活性を、上記ｐｍ２５のために述べたような適切な動物モデルで試験する。ＰＣＲによる変異誘発の方法は、代償的アミノ酸の変化をもたらす２番目の突然変異を、本来の蛋白質の最初の突然変異の部位から離れた部位に誘導することのできる１つの手法である。このような方法では、２つのＰＣＲプライマーの３′‐末端が２番目の突然変異を誘導することを意図するｃＤＮＡのセグメントをくくり、ＰＣＲプライマーのーつが最初の突然変異を含むセグメントにアニーリングし、その結果、ＰＣＲ法における更なる突然変異から最初の突然変異を保護する。プライマー伸長のためプライマーがその１本鎖にアニーリングする、最初のｃＤＮＡのセグメントは、変異誘発から保護される。突然変異は、プライマーの３′‐末端によりくくられている最初のｃＤＮＡのセグメント中にランダムに誘導される。プライマー間の距離が離れているほど、糖ホルモンのアミノ酸の分子内代償突然変異を誘導する突然変異にさらされる最初のｃＤＮＡ（不活性または減少した活性の最初の突然変異体をコードする）の領域は広くなる。各々のプライマーは、エリスロポエチンのプレプロ‐二重突然変異体の発現用ベクター内へのＰＣＲ法で増幅した断片の導入を容易にするため、１本鎖の制限部位を含むか又は１本鎖の制限部位を含む最初のｃＤＮＡのセグメントにアニーリングするかのいずれかである。ＰＣＲ法は、ヌクレオチド取り込みにおける誤りを容易にする条件下で行う。このような条件には、ＰＣＲ増幅反応混合物中の２′‐デオキシリボヌクレオシド‐５′‐三燐酸の内３つは１ｍＭ濃度、４番目は２００μＭ濃度、０．５ｍＭのＭｎ⁺²、６ｍＭのＭｇ⁺²、およびＴａｑポリメラーゼの使用が含まれる。更に詳しくは、この方法は、二重突然変異体ｐｍ２５に関して以下の通りに行う：３３の位置のＣｙｓからＰｒｏへの突然変異を有するもののような不活性なまたは減少した活性のエリスロポエチン類似体をコードする最初のｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いた変異誘発を開始するための鋳型として用いる。このような１つの最初のｃＤＮＡは、１９９および２００の位置にＣＣを有することのみが配列番号：１に示されるそれと異なる配列を有する。具体的に説明するのにこの最初のｃＤＮＡを用いると、配列番号：１に示される配列を有する（１９９−２００の位置を除く）ｃＤＮＡの鎖の１９９および２００の位置のＣＣを含むセグメントにハイブリダイズする最初のＰＣＲプライマーを用いる。また、最初のプライマーがアニーリングしないｃＤＮＡの鎖にハイブリダイズする２番目のプライマーを用いる。２番目のプライマーは、配列番号：１で具体的に説明したような５１７の塩基の３′にある位置にある塩基対とその３′‐末端の塩基が対になるこの鎖のセグメントにアニーリングする。従って、ＰＣＲ変異誘発法において、配列番号：１の５１７の塩基に対応する最初のｃＤＮＡの塩基対が、トリプレット５１７−５１９を、Ｃｙｓをコードするものに変換するＴへと変異誘発されることは可能である。増幅した生成物の末端を規定するプライマー間のランダム突然変異を有する配列を含むＰＣＲ変異誘発された生成物を、次いで、上記で示唆したようにＰＣＲ生成物中に取り込まれた部位を用い、制限酵素で消化する。ランダム突然変異を有するものを含むサイズである、消化物から得た断片を、次いで、二重に突然変異したエリスロポエチン類似体の培養中での発現および哺乳類細胞からの分泌が可能なように適切な真核細胞発現ベクターにライゲートする。このような発現ベクターは、グリコシル化および分泌を提供する、成熟二重突然変異体のアミノ末端で哺乳類（この場合、好ましくはヒト）エリスロポエチンリーダーペプチドを提供し、当然のことながら、転写および、哺乳類細胞のプレプロエリスロポエチン二重突然変異体の発現に必要な他の工程のための適切なシグナルを提供する。また、このベクターは、哺乳類細胞のトランスフェクションおよび他の用途に十分な質のベクターを提供するクローニングにも好適である。例えば、ＰＣＲ法で増幅した断片は、まず、プレプロエリスロポエチンの一部をコードする断片にライゲートして、全鎖長のプレプロエリスロポエチンニ重突然変異体をコードするｃＤＮＡを有する断片を提供することができる。全鎖長の蛋白質をコードするこれらの断片は、次いで、ＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏのようなベクター中にライゲートして二重突然変異体に好適な発現ベクターを提供することができる。その結果できた、二重に突然変異した取り込まれたｃＤＮＡを有する発現ベクターのライブラリーは、次いで、大腸菌のような適切な宿主にクローンして更なる研究のために十分な量のライブラリーを得る。二重に突然変異したｃＤＮＡを有する発現ベクターのライブラリーを、上記実施例２で述べたように哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中にトランスフェクションする。細胞を、単一細胞のクローンまたは、少数（例えば、約１０個）の細胞のコロニーとして培養する。各培養物を、インビトロエリスロポエチン活性についてスクリーニングする。陽性（このようなインビトロ活性について）としてスクリーニングする唯一の培養物は、最初の（例えば、ｃｙｓ³³からｐｒｏ³³）突然変異により引き起こされた活性の衰退を代償する２番目のランダム突然変異を有するエリスロポエチン類似体が発現するものである。活性を示すが１個を超える細胞から生育した培養物は、単一の細胞のクローンとしてサブカルチャーして、二重に突然変異した活性な類似体を産生する細胞を単離することができる。類似体をコードするｃＤＮＡを、生物学的に活性な糖ホルモンを産生する細胞から単離し、次いで、標準技法により配列決定してこのような細胞から得たエリスロポエチンにおける２番目の代償的突然変異を確認することができる。生物学的に活性な糖ホルモンを産生する細胞を培養することができ、糖ホルモンを、培養培地から単離精製し、次いで、上記のように適切な動物モデルでインビボエリスロポエチン活性を試験することができる。このように、増加した効力、延長した半減期等のために増強した薬学上の効用を有する二重突然変異体類似体を見い出すことができる。最初の不活性な突然変異体に対しインビボエリスロポエチン活性を修復する代償的突然変異を有する、エリスロポエチンの二重突然変異体は、最初の不活性化突然変異の排除により、更に活性な突然変異体に変換することができることが認められるであろう。従って、本発明は、インビボエリスロポエチン活性を有する哺乳類（好ましくはヒト）エリスロポエチンの、突然変異が一つの類似体も提供する。本発明のこのような、突然変異が一つの類似体は、成熟野性型糖ホルモンの配列からの一つの最初のアミノ酸の変化を有しており、この最初の変化が、野性型糖ホルモンの配列からの一つの２番目のアミノ酸の変化を有する類似体および野性型糖ホルモンのそれに比し減少したインビボエリスロポエチン活性を有する類似体で引き起こされた場合、一つの２番目のアミノ酸の変化を有する、突然変異が一つの類似体のインビボエリスロポエチン活性を増加させる。本発明のこのような、突然変異が一つの類似体の例は、ヒトエリスロポエチンの［Ｃｙｓ¹³⁹］類似体である。本発明の実施例を上記で詳細に述べてきたが、具体的に述べてきたものの改変および変形は、当業者等に容易に明らかであるが、以下の特許請求の範囲によってのみ明確にする本発明の精神内および従ってその範囲内にあることを意図するものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２０日【補正内容】請求の範囲１．ヒトエリスロポエチン類似体であって、Ｘ³³が２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチンおよび［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する前記類似体。２．ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶である請求項１に記載の類似体。３．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２に記載の類似体。４．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２に記載の類似体。５．二重鎖ＤＮＡであって、Ｘ³³が２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチンの類似体をコードする配列中の４９８ヌクレオチドのセグメントまたは、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ −Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする配列中の４９５ヌクレオチドのセグメントを含む前記二重鎖ＤＮＡ。６．Ｘ³³がＰｒｏである請求項５に記載の二重鎖ＤＮＡ。７．Ｘ³³がＣｙｓである請求項５に記載の二重鎖ＤＮＡ。８．セグメントが４９８個のヌクレオチドから成る請求項６に記載の二重鎖ＤＮＡ。９．セグメントが４９８個のヌクレオチドから成る請求項７に記載の二重鎖ＤＮＡ。１０．４９８または４９５個のヌクレオチドのセグメントが、２つの隣接するサブセグメントの１つであり、他方のサブセグメントは、哺乳類プレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、隣接するサブセグメントによりコードされるポリペプチド内のリーダーペプチドのカルボキシ末端が、エリスロポエチン類似体のアミノ末端に隣接しているような４９８‐ヌクレオチドまたは４９５‐ヌクレオチドサブセグメントに結合している、請求項５〜９のいずれかつに記載の二重鎖ＤＮＡ。１１．リーダーペプチドをコードするサブセグメントによりコードされるリーダーペプチドが、配列Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Ｘ³ Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Ｘ⁴ Gly（ここで、Ｘ³は、 LeuおよびValから成る群から選ばれ、Ｘ⁴は、LeuおよびProから成る群から選ばれる）を有する、請求項１０に記載の二重鎖ＤＮＡ。１２．Ｘ³およびＸ⁴が、各々Leuである、請求項１１に記載の二重鎖ＤＮＡ。１３．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１０に記載の二重鎖ＤＮＡ。１４．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１１に記載の二重鎖ＤＮＡ。１５．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１２に記載の二重鎖ＤＮＡ。１６．プレプロエリスロポエチン類似体をコードするセグメントを含む二重鎖ＤＮＡを、プレプロエリスロポエチン類似体の発現が作動可能なようにベクターのＸｂａＩ部位に挿入したＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏから成る、請求項１５に記載の発現ベクター。１７．発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｐｒｏ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）。１８．発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅo（［Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）。１９．培養哺乳類細胞であって、共に、そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体のアミノ末端に結合している哺乳類のプレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドから成る前駆体ポリペプチドをコードする２つの隣接するセグメントからなるＤＮＡを前記細胞中で発現させるための発現ベクターを含有し、該セグメントの１つが該リーダーペプチドをコードし、該セグメントの他方が４９８塩基対を有しかつ［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチン（Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれる配列を有する該エリスロポエチン類似体をコードすることを特徴とする前記哺乳類細胞。２０．ｄｈｆｒ‐でありかつ、発現ベクターが、２つの隣接するセグメントから成る前記ＤＮＡをプレプロエリスロポエチンの発現が作動可能なようにそのベクターのＸｂａＩ部位に挿入したＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎeｏから成る請求項１９に記載の哺乳類細胞。２１．発現ベクターがＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Pｒｏ³³ ，Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）およびＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）から成る群から選ばれ、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２０に記載の哺乳類細胞。２２．赤血球新生を誘導するのに有用な医薬組成物であって、（ａ）［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、（ｂ）医薬上許容されうる担体と組み合わせて含むことを特徴とする前記医薬組成物。２３．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２２に記載の医薬組成物。２４．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２２に記載の医薬組成物。２５．貧血を治療するのに有用な医薬組成物であって、（ａ）［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹ ，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、（ｂ）医薬上許容されうる担体と組み合わせて含む前記医薬組成物。２６．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２５に記載の医薬組成物。２７．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２５に記載の医薬組成物。２８．哺乳類における赤血球新生を誘導する方法であって、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³ ⁹ ，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導するのに有効な量のエリスロポエチン類似体を該哺乳類に投与することからなる前記方法。２９．Ｘ³³がＰｒｏまたはＣｙｓである請求項２８に記載の方法。３０．前記類似体を、週に３回未満行う静脈注射により投与する請求項２８に記載の方法。３１．貧血症に罹患した哺乳類の貧血を治療する方法であって、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導するのに有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を該哺乳類に投与することからなる前記方法。３２．Ｘ³³がＰｒｏまたはＣｙｓである請求項３１に記載の方法。３３．前記類似体を、週に３回未満静脈注射により投与する請求項３１に記載の方法。３４．ヘマトクリットまたはヘモグロビン含量の値が低い哺乳類のヘマトクリットまたはヘモグロビン含量又はその両方を増加させる方法であって、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の通常存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、赤血球新生を誘導するのに有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を該哺乳類に投与することからなる前記方法。３５．Ｘ³³がＰｒｏまたはＣｙｓである請求項３４に記載の方法。３６．前記類似体を、週に３回未満静脈注射により投与する請求項３４に記載の方法。３７．赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項２５に記載のヒトエリスロポエチンの第２類似体を哺乳類に投与することからなる哺乳類の治療方法。３８．赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項２５に記載の医薬組成物を哺乳類に投与することからなる、哺乳類の貧血を治療する。３９．赤血球新生を誘導するのに有効な量の請求項２２に記載の医薬組成物を哺乳類に投与することからなる、哺乳類において赤血球新生を誘導する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 ＡＣＣ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者デ・ブリーズ，ピーター・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60016、デス・プレインズ、ダブリユ・グラント・ドライブ・1083 (72)発明者メロビツツ，バリー・エスアメリカ合衆国、イリノイ・60659、シカゴ、ノース・セントラル・パーク・6244 (72)発明者ムース，ジヨゼフ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、ジユニパー・パークウエイ・ 1003 (72)発明者スキフアー，バーリン・ジイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、ハーバード・レーン・607

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトエリスロポエチン類似体であって、Ｘ³³が２０個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる、［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチンおよび［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する前記類似体。２．ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶である請求項１に記載の類似体。３．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２に記載の類似体。４．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２に記載の類似体。５．二重鎖ＤＮＡであって、Ｘ³³が２０個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる、［Ｘ³³，ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする配列中の４９８ヌクレオチドのセグメントまたは、［Ｘ³³，ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ −Ａｒｇ¹⁶⁶］-ヒトエリスロポエチンの配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有するヒトエリスロポエチン類似体をコードする配列の４９５ヌクレオチドのセグメントを含む前記二重鎖ＤＮＡ。６．Ｘ³³がＰｒｏである請求項５に記載の二重鎖ＤＮＡ。７．Ｘ³³がＣｙｓである請求項５に記載の二重鎖ＤＮＡ。８．セグメントが４９８個のヌクレオチドから成る請求項６に記載の二重鎖ＤＮＡ。９．セグメントが４９８個のヌクレオチドから成る請求項７に記載の二重鎖ＤＮＡ。１０．４９８または４９５個のヌクレオチドのセグメントが、２つの隣接するサブセグメントの１つであり、他方のサブセグメントは、哺乳類プレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドをコードしており、隣接するサブセグメントによりコードされるポリペプチド内のリーダーペプチドのカルボキシ末端が、エリスロポエチン類似体のアミノ末端に隣接しているように４９８‐ヌクレオチドまたは４９５‐ヌクレオチドサブセグメントに結合している、請求項５〜９のいずれかに記載の二重鎖ＤＮＡ。１１．リーダーペプチドをコードするサブセグメントによりコードされるリーダーペプチドが、配列Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X³ Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Ｘ⁴ Gly（ここで、Ｘ³は、L euおよびValから成る群から選ばれ、Ｘ⁴は、Leuおよびproから成る群から選ばれる）を有する、請求項１０に記載の二重鎖ＤＮＡ。１２．Ｘ³およびＸ⁴が、各々Leuである、請求項１１に記載の二重鎖ＤＮＡ。１３．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１０に記載の二重鎖ＤＮＡ。１４．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１１に記載の二重鎖ＤＮＡ。１５．そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体の配列のアミノ末端に結合しているリーダーペプチド配列から成る配列を有するプレプロエリスロポエチン類似体を、培養哺乳類細胞内で発現させるための発現ベクターである、請求項１２に記載の二重鎖ＤＮＡ。１６．プレプロエリスロポエチン類似体をコードするセグメントを含む二重鎖ＤＮＡを、プレプロエリスロポエチン類似体の発現が作動可能なようにベクターのＸｂａＩ部位に挿入したＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏから成る、請求項１５に記載の発現ベクター。１７．発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｐｒｏ³³，Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）。１８．発現ベクターＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｃｙｓ¹³⁹ ］ｈＥＰＯ）。１９．培養哺乳類細胞であって、共に、そのカルボキシ末端でヒトエリスロポエチン類似体のアミノ末端に結合している哺乳類のプレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドから成る前駆体ポリペプチドをコードする２つの隣接するセグメントからなるＤＮＡを前記細胞中で発現させるための発現ベクターを含有し、該セグメントの１つが該リーダーペプチドをコードし、該セグメントの他方が４９８塩基対を有しかつ［Ｘ³³，ｃｙｓ¹³⁹］‐ヒトエリスロポエチン（Ｘ³³は２０個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれる配列を有する該エリスロポエチン類似体をコードすることを特徴とする前記哺乳類細胞。２０．ｄｈｆｒ‐でありかつ、発現ベクターが、２つの隣接するセグメントから成る前記ＤＮＡをプレプロエリスロポエチンの発現が作動可能なようにそのベクターのＸｂａＩ部位に挿入したＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏから成る請求項１９に記載の哺乳類細胞。２１．発現ベクターがＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｐｒｏ³³ ，Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）およびＳＶ２ｄｈｆｒＳＶｄｅｌｔａＳＪｎｅｏ（［Ｃｙｓ¹³⁹］ｈＥＰＯ）から成る群から選ばれ、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２０に記載の哺乳類細胞。２２．赤血球新生を誘導するのに有用な医薬組成物であって、（ａ）［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、（ｂ）医薬上許容されうる担体と組み合わせて含むことを特徴とする前記医薬組成物。２３．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２２に記載の医薬組成物。２４．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２２に記載の医薬組成物。２５．貧血を治療するのに有用な医薬組成物であって、（ａ）［Ｘ³³，Ｃｙｓ¹³⁹ ，ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁶⁶］‐ヒトエリスロポエチン（ここで、Ｘ³³は２０個の天然に存在するアミノ酸から成る群から選ばれる）の配列から成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、治療に有効な量のヒトエリスロポエチン類似体を、（ｂ）医薬上許容されうる担体と組み合わせて含む前記医薬組成物。２６．Ｘ³³がＰｒｏである請求項２５に記載の医薬組成物。２７．Ｘ³³がＣｙｓである請求項２５に記載の医薬組成物。２８．ヒトエリスロポエチンの第２類似体であって、天然型ヒトエリスロポエチンに比し顕著に低い赤血球新生比活性を有する第１類似体と比べて顕著に高い赤血球新生比活性を有するものであり、ここで該第２類似体は、その配列中の第１および第２の位置に、天然型ヒトエリスロポエチンの配列中の同じ位置のアミノ酸と異なるアミノ酸を有することを除いては、天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数および配列のアミノ酸を有し、該第１類似体は、該第１または該第２の位置のいずれかのアミノ酸が天然型ヒトエリスロポエチンの配列中のアミノ酸と同じであることを除いては該第２類似体と同じ数および配列のアミノ酸を有することを特徴とする前記第２類似体。２９．第１類似体がエリスロポエチン活性を全く有しないか又は実質的に減少したものであるのに対し、天然型ヒトエリスロポエチンに比し実質的に同等もしくはそれ以上のエリスロポエチン活性を有する請求項２８に記載の第２類似体。３０．請求項２９に記載のエリスロポエチンの第２類似体の製法であって、その方法が：（ａ）（ｉ）天然型ヒトプレプロエリスロポエチンの二重突然変異体をコードし、（ｉｉ）第１類似体は、エリスロポエチン活性が全くないか又は減少しており、天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数のアミノ酸を有するが、天然型ヒトエリスロポエチンの相当する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸をその配列内の１つの位置に有するヒトエリスロポエチンの第１類似体のアミノ酸をコードするトリプレットを含み、および（ｉｉｉ）天然型プレプロエリスロポエチンのリーダーペプチドのいずれの部分もコードせず、該第１類似体の該アミノ酸をコードする該トリプレットを含まないセグメント内にランダム突然変異を含むｃＤＮＡ配列を、哺乳類細胞中での発現が作動可能なように含む各真核生物発現ベクターのライブラリーを調製し；（ｂ）発現ベクターライブラリーを発現用哺乳類細胞内にトランスフェクとし；並びに（ｃ）第２類似体を分泌する細胞を選択する工程を包含することを特徴とする前記方法。３１．天然型トエリスロポエチンより高いインビボエリスロポエチン活性を有する第３のエリスロポエチン類似体を製造するために請求項２９に記載の第２類似体を使用する方法であって、該方法が、第１類似体には存在するが天然型ヒトエリスロポエチンには存在しない第２類似体中のアミノ酸を天然型ヒトエリスロポエチンの相当する位置のアミノ酸に変えることを特徴とする前記方法。３２．ヒトエリスロポエチンの第３類似体であって、その配列中の１つの位置の１個のアミノ酸の相違を除いては天然型ヒトエリスロポエチンと同じ数および配列のアミノ酸を有し、天然型ヒトエリスロポエチンより高いエリスロポエチン活性を有し、請求項３１に記載の方法により請求項２９に記載の第２類似体を用いて作製されることを特徴とする前記第３類似体。