EA010650B1 - Защищающие ткань цитокины для лечения и профилактики сепсиса и образования спаек - Google Patents

Abstract

Способ лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения эффектов провоспалительных цитокинов при состояниях, включающих в себя, но ими не ограничиваясь, сепсис, образование спаек, раны, органную недостаточность, хроническое заболевание, состояния генерализованного воспаления в результате инфекции, рубцевание в результате повреждения и разрезов, и их сочетания.

Description

Настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения эффектов сепсиса и связанных с ним осложнений. В частности, настоящее изобретение относится к применению защищающих ткань цитокинов для лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения осложнений, связанных с сепсисом, образованием спаек и органной недостаточностью. Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению также рассматриваются для лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения осложнений состояний генерализованного воспаления, возникающих в результате инфекции.

Предпосылки изобретения

В организме-хозяине существует несколько способов ответа на инфекцию, иммунные раздражители, воспаление и травму. Один механизм, посредством которого организм-хозяин пытается отвечать на эти воздействия, работает через повышенную продукцию цитокинов, белков, которые не представляют собой антитела, действующих в качестве межклеточных регуляторов. Некоторые цитокины, известные в качестве провоспалительных цитокинов, противодействуют раздражителям, усугубляют течение заболевания в целях освобождения организма-хозяина от раздражителя и клеток хозяина, поврежденных под действием раздражителя. Провоспалительные цитокины включают в себя, но ими не ограничиваются, интерлейкины (1Ь), такие как 1Ь-1, 1Ь-6, 1Ь-8 и 1Ь-18, а также фактор некроза опухолей (ΤΝΡ).

При высвобождении провоспалительных цитокинов, они оказывают воздействие в участке повреждения, повышая продукцию антител и их комплементов, активацию Т- и В-клеток, адгезию тромбоцитов к стенкам кровеносных сосудов и экстраваскуляризацию лимфоцитов и макрофагов. В участке повреждения эти изменения приводят к формированию локализованных условий, включающих в себя повышение температуры, повреждение ткани, некроз опухоли, индукцию других цитокинов и иммунорегуляцию, а также апоптоз. Эта местная реакция токсична не только для источника раздражения на организмхозяин, но также и для клеток организма-хозяина в пределах прилегающей зоны действия провоспалительного цитокина. Таким образом, не удивительно, что на системном уровне, например, при генерализованной инфекции или тяжелой травме организма-хозяина, многие эти провоспалительные цитокины вредны для организма-хозяина, вызывая повышение температуры, воспаление, разрушение ткани и, в некоторых случаях, шок и гибель.

Характерное для различных провоспалительных цитокинов действие оказывает ΤΝΒ. ΤΝΒ представляет собой провоспалительный цитокин, который продуцируется многочисленными типами клеток, включая макрофаги, моноциты, лимфоциты и фибробласты, в ответ на воспаление, инфекцию и другие внешние раздражители. ΤΝΒ вызывает широкий спектр клеточных ответов, в том числе повышение температуры, шок, повреждение ткани, некроз опухоли, анорексию, индукцию других цитокинов и иммунорегуляторных молекул, клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. При высвобождении ΤΝΒ, он воздействует в участке повреждения, повышая продукцию антител и их комплементов, активацию Т- и В-клеток, адгезию тромбоцитов на стенках кровеносных сосудов и экстраваскуляризацию лимфоцитов и макрофагов. ΤΝΒ системно воздействует на гипоталамус и печень. ΤΝΒ стимулирует гипоталамус к высвобождению кортиколиберина, подавляет аппетит и вызывает повышение температуры. В ответ на ΤΝΒ в печени происходит реакция острой фазы, приводящая к синтезу некоторых белков, включая С-реактивный белок, факторы свертывания крови и факторы комплемента. Также ΤΝΡ индуцирует резистентность к инсулину. В указанной области повреждения или инфекции ΤΝΡ жизненно необходим для удаления конкретного инфекционного агента и адаптации иммунного ответа организма на конкретное повреждение.

Однако на системном уровне, на котором ΤΝΡ, также как и другие провоспалительные цитокины, может присутствовать в повышенных концентрациях или в течение длительных периодов времени, он может оказывать повреждающие воздействия на организм. При высоких концентрациях ΤΝΡ активирует каскад 1Ь-1 и 1Ь-6, что приводит к кахексии (истощению). Кроме того, ΤΝΡ может приводить к отеку организма, гипопротеинемии и нейтропении, которые могут приводить к диссеминированной экстраваскулярной коагуляции и, в итоге, к полиорганной недостаточности. При хронических заболеваниях, таких как рак, также ΤΝΡ может причинять вред жизненно важным функциям организма-хозяина. Например, ΤΝΡ может нарушать способность эндогенного эритропоэтина поддерживать гематокрит в организмехозяине, приводя к состоянию, называемому анемия хронических заболеваний (АСИ). Обычный курс лечения рекомбинантным эритропоэтином может не оказывать противодействия эффектам провоспалительного цитокина, создавая тем самым необходимость введения повышенных доз рекомбинантного эритропоэтина только для поддержания нормального гематокрита в организме-хозяине. Также, кроме дополнительных затрат, связанных с применением повышенных доз, существует риск побочных эффектов от повышенных доз эритропоэтина, таких как тромбоз. Кроме подробно описанных ниже состояний, провоспалительные цитокины, включая, но им не ограничиваясь, ΤΝΡ, связаны с такими заболеваниями, как хроническое воспаление, бактериальный септический шок, бактериальный токсический шок, реакция трансплантат против хозяина и ВИЧ-инфекция, и СПИД.

Сепсис

Сепсис представляет собой реакцию организма на любой вид инфекции, например, бактериальную,

- 1 010650 вирусную, паразитарную или грибковую. Очагами инфекции обычно являются легкие, мочевыводящие пути, брюшная полость и область таза. Однако в некоторых случаях истинный очаг инфекции не может быть обнаружен. Хотя в одно время сепсис рассматривали как системную воспалительную реакцию, в настоящее время считается, что сепсис также включает в себя протромботический диатез и нарушенный фибринолиз.

В момент начала сепсиса во всем организме происходит распространенное воспаление и свертывание крови. В то время как в здоровом организме происходит высвобождение иммуномодуляторов для борьбы с инфекцией и исцеления организма, при сепсисе иммуномодуляторы высвобождаются в избытке. Высвобождение таких провоспалительных цитокинов, как ΤΝΕ, интерлейкин-1 и интерлейкин-18, приводит к воспалению эндотелия, повышению внутренней температуры, потере аппетита и анемии. Кроме того, воспаление эндотелия кровеносных сосудов активирует процесс свертывания крови. Поскольку при сепсисе снижается естественная продукция организмом белка С, регулирующего свертывание крови и контролирующего воспаление, то происходит подавление способности организма разрушать сформировавшиеся тромбы крови. Это подавление приводит к свертыванию крови в жизненно важных органах, конечностях, пальцах кистей и стоп, что, в свою очередь, приводит к органной недостаточности или гангрене.

Сам по себе, сепсис может иметь различную степень выраженности. Например, в случаях тяжелого сепсиса, возникающего при острой органной дисфункции или недостаточности, наступает перегрузка нормальной защитной реакции организма, что запускает каскад событий, способных приводить к распространенному воспалению и свертыванию крови в мелких сосудах всего организма. В случае наступления сердечно-сосудистой недостаточности у пациента с тяжелым сепсисом происходит септический шок. Эта недостаточность вызывает снижение кровяного давления, что, в свою очередь, лишает жизненно важные органы адекватного снабжения обогащенной кислородом крови. Септицемия представляет собой сепсис, при котором инфекция находится в самом кровотоке. По существу, септицемия может вызывать ишемию, то есть недостаточное снабжение кровью по крайней мере одного органа. Например, при снижении притока крови к почкам до опасно низких уровней в течение значительного периода времени может развиваться острая ишемическая почечная недостаточность (АВЕ). Кроме того, сниженный приток крови приводит к некрозу или гибели ткани в подвергаемых воздействию органах.

Многие случаи сепсиса поддаются лечению в случае выявления источника сепсиса. После выявления проводят курс лечения, характерный для причины инфекции. Известные способы лечения включают в себя использование антибиотиков, хирургическое удаление инфицированных или некротизированных тканей, использование лекарственных средств, повышающих количество активированного белка, и стероидных препаратов (в случае септического шока). Например, обычный курс лечения сепсиса, до выявления причины инфекции, включает в себя введение широкого спектра антибиотиков. Однако в случаях сепсиса с неустановленной причиной и/или областью инфекции уровень смертности пациентов с сепсисом остается относительно высоким.

В зависимости от тяжести сепсиса курс лечения может включать применение противоинфекционных средств, дренирующих устройств, жидкостей, лекарственных средств, повышающих среднее артериальное давление (МАР), такие как норэпинефрин и фенилэфрин, лекарственных средств, улучшающих функцию почек, таких как допамин, лекарственных средств, повышающих доставку и поглощение кислорода, таких как добутамин и эпинефрин, аппаратов искусственной вентиляции легких для поддержания дыхания и диализ при почечной недостаточности. Кроме того, фармакологические средства при применении которых наблюдаются благоприятные эффекты на иммунные ответы вследствие шока и сепсиса, включают в себя АТР-МдСР. гепарин-неантикоагулянт, блокаторы кальциевых каналов, хлорохин, ингибиторы циклооксигеназы, антагонисты РАЕ, противовоспалительные цитокины, факторы роста, средства для диетических процедур, антитела к ΤΝΕ, активированный белок С (Χφήδ®, Εΐί Ы11у, Ιηάίηηаройк, Ιηάίαηα) и половые гормоны. Излечение от сепсиса более вероятно в случае быстрой диагностики и своевременного лечения этого состояния.

В последнее время для лечения различных связанных с сепсисом состояний также был разработан рекомбинантный эритропоэтин (гйи-ЕРО), коммерчески доступный под торговыми названиями РВОСВТ® (от Ог11ю Вю1се11 1пс., Вагйаи, N1), ΕРО6ΕN® (из Ашдеп, 1пс., Тйоикаиб Оакк, СА) и ΝΕΟΒΕί',ΌΡΜΟΝ (от Воске, Ваке1, 8\уЦ/ег1апб). Кроме того, в патенте США № 2003/0083251 представлено общее описание применения гйи-ЕРО для лечения пациентов с ишемической АВЕ, где применение способствует восстановлению клеток почечных канальцев и предотвращению апоптоза клеток почечных канальцев. Кроме того, в патенте США № 2002/0061849 представлено общее описание применения гйиЕРО при лечении воспаления при неишемическом состоянии в одном или нескольких органах. Однако вследствие эритропоэтических эффектов эритропоэтина, а именно повышенного гематокрита, сужения сосудов, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и повышенной продукции тромбоцитов, лечение с применением гйи-ЕРО сопряжено с дополнительным риском возникновения распространенного свертывания крови в жизненно важных органах, конечностях, пальцах кисти и стопы, что происходит при сепсисе.

- 2 010650

Спайки

Кроме сепсиса провоспалительные цитокины, такие как ΤΝΡ, также связаны с образованием спаек, патологических фиброзных тяжей или соединений между органами и другими структурами организма. Спайки могут представлять собой осложнение сепсиса или быть связанными с ним, а также могут возникать независимо. Например, спайки могут формироваться в результате хирургического вмешательства, травмы, инфекции, химиотерапии и облучения. По существу, спайки представляют собой практически неизбежное последствие хирургического вмешательства, то есть приблизительно 93% пациентов, подвергавшихся хирургическому вмешательству в области брюшной полости, в некоторой степени страдают от спаек (по сравнению с формированием спаек у приблизительно 10,4% пациентов, которые ранее никогда не переносили операцию на органах брюшной полости). См. Ό. МспхХ и Н. Ε11ίδ, ΙηΙοδΙίηαΙ ОЙ51гисίίοη Ггот Лб11С5ЮП5-Но\у Вщ 18 1йе РгоЬ1ет?, ΑΝΝ. В. СОЕЬ. 8ИВС. ΕΝΟΕ. 72:60-3 (1990).

Формирование спаек может вызывать сильную боль и создавать патологическое давление или напряжение на органы или другие структуры пациента. Например, спайки в области брюшной полости организма могут вызывать ущемление или сдавление кишечника пациента между органами или другими структурами организма. В некоторых случаях непроходимость или значительное затруднение проходимости кишечника могут быть вызваны расположенными поблизости спайками.

Образование этих патологических спаек между двумя частями организма приводит к множеству других состояний. Например, по мере того как кесарево сечение становится наиболее распространенным способом рождения ребенка, женщины, подвергающиеся этому обширному хирургическому вмешательству в области брюшной полости, подвержены образованию спаек и, как результат, испытывают хроническую боль в области таза. Кроме того, спайки, затрагивающие женские репродуктивные органы, могут приводить к бесплодию и диспареунии.

Для профилактики и лечения спаек рассматривали применение множества средств, например, декстрана, кортикостероидов, фосфатидилхолина, ингибиторов фосфолипаз, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, протеогликанов, гепарина и тканевого активатора плазминогена. См., например, С.Ь. 1<о\\'а1схук и М.Р. Ωίαιηοηά. Тйе МападетеШ оГ Абйе81уе Э18еа8е, ίη ΡΕΚ1ΤΟΝΕΑΕ ΑΌΗΕ8ΙΟΝ8 315-324 (К.Н. ТгеиШег и V. Зсйитрейск, еб8., 1997). Было сделано предположение, что некоторые из этих средств, но не все, вероятно могут быть эффективны при лечении спаек, поскольку они способны препятствовать свертыванию крови и фибринолизу. Однако клинический опыт применения большинства этих средств ограничен из-за их осложнений в виде кровотечения. Кроме того, было показано, что производные гиалуроновой кислоты могут предотвращать образование послеоперационных спаек, особенно во внутрибрюшинной области. См, например, ЕМ. Вескег е1 а1., РюгеиНом оГ Ро81орега11уе АЬботша1 Αά^δώηδ Ьу а 8обшт Ηуа1и^οηаΐе-Ьаδеά Вюге8огЬаЬ1е МетЬгане: А Рго8рес11уе, Ваηάοт^ζеά, ЭоиЫе-Ышб МиЙкеШег 81ибу, ίη 1. ΑΜ. СОБЬ. 8ИВС. 183 297-306 (1996). Кроме того, было показано, что бета-глюкан, который представляет собой полимер глюкозы и с высокой аффинностью связывается конкурирующим способом с рецепторами моноцитов и нейтрофилов, обладает эффектом снижения частоты образования спаек после экспериментально полученного внутрибрюшинного сепсиса у крыс \УБ1аг. Α. Веб1г11 е1 а1., Ρ^еνеηΐ^οη оГ Iηΐ^аре^^ΐοηеа1 Αά^δώη Рогта1юг1 И8шд Веΐа-С1исаη ЛГ1ег Пеосойс Α^δΦто818 ίη а Ва! Вас1епа1 Регйош118 Мобе1, ίη Αт. 1. 8ИВС. 185 339-343 (2003).

Также в качестве способа лечения спаек можно применять хирургическое вмешательство. Как правило, врач проводит хирургическую операцию для отделения спаек от органа или другой части организма. Однако, поскольку спайки часто представляют собой осложнение хирургической операции, то хирургическое вмешательство для удаления спаек часто приводит к формированию новых спаек. Хотя некоторые хирургические процедуры включают в себя помещение манжет на органы, прилегающие к подвергаемым хирургическому вмешательству областям, и, таким образом, способствуют предотвращению спаек, затрагивающих эти органы, результаты таких процедур противоречивы. Кроме того, манжеты органов также требуют дополнительного хирургического вмешательства для их удаления.

Таким образом, несмотря на повышенное внимание к образованию спаек, исследование способов лечения имело ограниченный успех. Многие врачи не хотят сосредоточить свое внимание на лечении спаек, а многие страховые компании не желают оплачивать лечение, которое, в лучшем случае, успешно лишь в небольшой степени.

Заживление ран

Заживление представляет собой жизненно важный процесс в организме, восстанавливающий целостность поврежденной ткани. Этот процесс часто рассматривают в отношении ран, язв или повреждений кожи, возникающих по различным причинам, таким как травма, хирургическое вмешательство, сдавление (пролежни), ожоги, диабет и тому подобное. Тяжесть ран характеризуется глубиной распространения раны в коже. Для ран Ι степени характерно покраснение или изменение цвета, ощущение тепла и припухлость или твердость. Раны ΙΙ степени, раны части слоев, проникают в эпидермис и поверхностную дерму кожи. Раны ΙΙΙ степени, раны, затрагивающие все слои кожи, проникают сквозь дерму кожи, но не затрагивают слой, отделяющую кожу от глубоко расположенных органов. Раны IV степени приводят к повреждению подлежащего мышечного слоя или кости.

Хотя процесс заживления всех ран один и тот же: воспаление, эпителизация, ангиогенез и накопле

- 3 010650 ние матрикса; легкость заживления раны в значительной степени основана на тяжести раны и здоровье раненого индивидуума. В целом, раны I степени и II степени заживают посредством регенерации эпителиальных клеток за счет расположенной ниже дермы. Между тем заживление ран III и IV степени приводит к образованию рубца. В заживлении ран играют роль такие провоспалительные цитокины, как ΤΝΡ, однако полагают, что ΤΝΡ может оказывать нежелательное воздействие на накопление коллагена в заживляемой ране и, в конечном итоге, на необходимое для заживления раны время и прочность восстановленной ткани.

Для обеспечения заживления ран было разработано несколько лекарственных средств, а также способов лечения. В качестве обладающих терапевтическим эффектом на заживление ран рассматривают несколько соединений, включая, но ими не ограничиваясь, факторы роста (эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста, гормон роста человека, фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов, интерлейкин-6 и интерлейкин-10), питательные добавки (аргинин, глутамин, витамин С, витамин В5, бромелин, куркумин, цинк, медь) и растительные добавки (алоэ вера, центелла). Кроме того, для облегчения заживления ран используют различные способы лечения, к которым относятся, но ими не ограничиваются, гипербарическая оксигенация, вихревая терапия, ультразвуковая терапия, электростимуляция и магнитная терапия.

Если рана не заживает надлежащим образом, или заживления вообще не происходит, то это может приводить к некоторым осложнениям, главными из которых являются образование рубцов и инфицирование. В зависимости от тяжести раны организм при заживлении раны может образовывать рубцовую ткань. Помимо эстетической проблемы, рубец в зависимости от своей тяжести может затруднять передвижение индивидуума. Кроме того, рана делает возможным попадание бактерии и других возбудителей инфекции в организм. В зависимости от своей тяжести инфекция может распространяться и становиться генерализованной, что приводит к сепсису или септицемии.

Также проводили исследования гйи-ΕΡΘ на предмет его возможных заживляющих эффектов на моделях произвольно выбранных ишемизированных кожных лоскутов на крысе. Например, для гйи-ΕΡΘ при ишемических повреждениях кожных лоскутов было показано снижение некроза, уменьшение инфильтрации нейтрофилами и предотвращение повышения температуры. См. М. Виеш1 е! а1., ВесотЬшап! Нитап ЕгуШгоройеш [пПиепсех Веуа5си1апха1юп апб Неайпд ίη а Ва! Мобе1 οί Вапбот Есйаетю Р1ар§, АСТА ΌΕΒΜ νΕΝΕΒΕΟΕ, 82: 411-417 (2002). Это открытие позволяет предположить, что введение гйиΕΡΟ способно улучшить процесс заживления раны, как на ранней, так и на поздней стадии повреждения, посредством снижения воспалительной реакции, повышения плотности капилляров в ишемизированных кожных лоскутах и возможности более раннего восстановления поврежденной области. Однако, как указано выше, поскольку гйи-ΕΡΟ обладает эритропоэтической активностью, то применение гйи-ΕΡΟ для лечения этих состояний может вызывать свертывание крови или большие осложнения, чем осложнения, вызванные процессом заживления.

В целом, ни одно средство или способ лечения не были достаточно эффективными для лечения случаев сепсиса, заболеваемости сепсисом, образования спаек, заживления ран или состояний генерализованного воспаления. По существу, смертность, обусловленная сепсисом и связанными с ним состояниями, остается высокой. Ежегодно приблизительно 215000 человек умирают от тяжелого сепсиса, а один из каждых трех пациентов, у которых развивается тяжелый сепсис, умирает в течение месяца. В будущем ожидают учащение случаев сепсиса, обусловленное повышенным вниманием к состоянию и чувствительностью диагностики, многочисленными пациентами с ослабленным иммунитетом, использованием инвазивных процедур, множеством резистентных микроорганизмов и увеличением в популяции пожилых людей. Кроме того, вследствие отсутствия успешного способа лечения часто не проводят лечение хронической боли, связанной со спайками и состояниями генерализованного воспаления.

Таким образом, в этой области существует необходимость в способе и лекарственных средствах для лечения, профилактики, задержки наступления и снижения эффектов провоспалительных цитокинов в целях ограничения прилегающей зоны их действия и дальнейшего воздействия на их системный эффект. В частности, существует необходимость в лечении, профилактике, задержке развития и снижении эффектов провоспалительных цитокинов при сепсисе, спайках, ранах, хронических заболеваний и состояниях генерализованного воспаления. Кроме того, могли иметь значение способы, которые способны восстанавливать или предотвращать повреждение ткани при ишемических состояниях.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения эффектов сепсиса, спаек, состояний генерализованного воспаления и их сочетаний посредством введения терапевтически эффективного количества по крайней мере одного защищающего ткань цитокина. Кроме того, настоящее изобретение относится к профилактике или уменьшению связанного с повреждением и разрезами рубцевания, используя по крайней мере один защищающий ткань цитокин. По крайней мере один защищающий ткань цитокин может представлять собой любой защищающий ткань цитокин, который обладает защищающей ткань функцией. Однако в одном из вариантов осуществления по крайней мере один защищающий ткань цитокин представляет собой химически модифицированный ЕРО. В другом варианте осуществления химически модифицированный ЕРО представляет собой

- 4 010650 карбамилированный ЕРО.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения, профилактики, задержки наступления или снижения эффектов провоспалительных цитокинов у млекопитающего. Другие варианты осуществления относятся к способам лечения, профилактики, задержки наступления состояния, связанного с эффектом провоспалительных цитокинов. Некоторые примеры состояний, связанных с эффектами провоспалительных цитокинов, включают в себя сепсис, спайки, раны, воспаление или хроническое заболевание. Такие способы могут предусматривать стадии введения терапевтически эффективного количества одного или нескольких защищающих ткань цитокинов в фармацевтическом носителе.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые можно использовать в указанных здесь способах. Например, один из вариантов осуществления относится к фармацевтической композиции, содержащей по крайней мере один защищающий ткань цитокин в количестве, эффективном для лечения, профилактики, задержки наступления или снижения эффектов провоспалительных цитокинов у млекопитающего. Другой вариант осуществления относится к фармацевтической композиции, содержащей по крайней мере один защищающий ткань цитокин в количестве, эффективном для лечения, профилактики, задержки наступления связанного с провоспалительными цитокинами состояния у млекопитающего.

Некоторые защищающие ткань цитокины, используемые по настоящему изобретению, могут представлять собой химически модифицированный эритропоэтин или измененный мутацией эритропоэтин.

В некоторых вариантах осуществления, когда применяют химически модифицированный эритропоэтин, химически модифицированный эритропоэтин может включать в себя одну или несколько следующих особенностей: ί) эритропоэтин, в котором не хватает молекул сиаловой кислоты; ίί) эритропоэтин, в котором по крайней мере нет молекул сиаловой кислоты; ίίί) эритропоэтин, в котором по крайней мере нет Ν-связанных или О-связанных углеводов; ίν) эритропоэтин, в котором по крайней мере снижено количество углеводов вследствие обработки природного эритропоэтина по крайней мере одной гликозидазой; ν) эритропоэтин, содержащий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов; νί) эритропоэтин, содержащий по крайней мере один или несколько окисленных углеводов, и который является химически восстановленным; νίί) эритропоэтин, содержащий по крайней мере один или несколько остатков модифицированного аргинина; νίίί) эритропоэтин, содержащий по крайней мере один или несколько остатков модифицированного лизина или у которого модифицирована Ν-концевая аминогруппа молекулы эритропоэтина; ίχ) эритропоэтин, содержащий по крайней мере остаток модифицированного тирозина; х) эритропоэтин, содержащий по крайней мере остаток модифицированной аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; χί) эритропоэтин, содержащий по крайней мере остаток модифицированного триптофана; χίί) эритропоэтин, у которого удалена по крайней мере одна аминогруппа; χίίί) эритропоэтин, содержащий по крайней мере одну свободную связь цистина в молекуле эритропоэтина; или χίν) укороченный эритропоэтин. В другом варианте осуществления у химически модифицированного эритропоэтина отсутствуют эритропоэтические эффекты эритропоэтина. Также химически модифицированный эритропоэтин может включать в себя карбамилированный эритропоэтин.

Сходным образом, в некоторых вариантах осуществления, включающих в себя измененный мутацией эритропоэтин, измененный мутацией эритропоэтин может быть выбран из одной или нескольких следующих мутаций: С78, Β10Ι, У118, Ь12А, Е13А, В14А, В14В, В14Е, В14О, Υ15Α, Υ15Ε, Υ15Ι, К20А, К20Е, Е21А, С298, С29^ С338, С33Υ, Ρ42Ν, Τ44Ι, К45А, Κ45Ό, У46А, Ν47Α, Е48А, Ε48Ι, Υ49Α, Υ498, А51Е, Α51Ν, Ο59Ν, Е62Т, Ь678, Ь70А, Ό96Β, Κ97Ό, 8100В, 8100Е, 8100 А, 8100Τ, 6101 А, 6101Ι, Б102А, В103А, 8104А, 8104Ι, Б105А, Т106А, Τ106Ι, Т107А, Т107Б, Б108К, Б108А, 8126А, Ε142Ι, В143А, 8146А, Ν147Κ, М47А, Ε148Υ, Б149А, В150А, 6151А, К152А, Б153А, Б155А, А1608, КА, С7А, В13А, Ν24Κ, А30^ Н32Т, Ν38Κ, Ν83Κ, Р42А, (Э43А, К52А, К97А, К116А, Т132А, П33А, Т134А, К140А, Е148А, В150В, 6151А, Κ152Α, К154А, 6158А, С161А или В162А. В другом варианте осуществления у измененного мутацией эритропоэтина отсутствуют эритропоэтические эффекты эритропоэтина.

Интерлейкин и ΤΝΕ представляют собой два примера провоспалительных цитокинов. Один или несколько эффектов провоспалительного цитокина могут включать в себя повышение температуры, истощение, апатичность, анемию, отек, ишемию, органную недостаточность и устойчивость к инсулину. Далее подробно описаны дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Дополнительные признаки и преимущества изобретения могут быть определены из последующего подробного описания, и связанных с ним рисунка(ов), описанных ниже.

На фиг. 1 представлено графическое отображение выживаемости крыс 8ргадие Эаи1су после наложения лигатуры на слепую кишку и прокалывания (СЕР), и последующей обработки физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином по изобретению;

На фиг. 2 представлено графическое отображение балльной оценки спаек для крыс 8ргадие Эаи1еу после СЬР и последующей обработки физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином по изобретению;

На фиг. 3 представлено графическое отображение балльной оценки заболевания для крыс 8ргадие

- 5 010650

Оа\\'1су. подвергаемых СЬР и последующей обработке физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином по изобретению;

На фиг. 4 представлено графическое отображение балльной оценки спаек для крыс 8ргадие Оа\\'1еу после СЬР. с получением сепсиса и без него. и последующей обработки физиологическим раствором и защищающим ткань цитокином по изобретению; и

На фиг. 5 представлено графическое отображение уровня ΤΝΡ в сыворотке для крыс 8ргадие Эа\\1еу после СЬР. с получением сепсиса и без него. и последующей обработки физиологическим раствором и защищающим ткань цитокином по изобретению.

На фиг. 6 представлен график. отражающий внутреннюю температуру организма в течение периода 24 часов для крыс 8ртадие Оа\\'1еу. обрабатываемых физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином после вызванного липополисахаридом (ЬР8) сепсиса.

На фиг. 7(а) и (Ь) представлены графики. отражающие уровень 1Ь-6 (фиг. 7а) или ΤΝΡ (фиг. 7Ь) в сыворотке крыс 8ргадие Оа\\'1еу. обрабатываемых физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином после вызванного ЬР8 сепсиса.

На фиг. 8(а) и (Ь) представлены графики. отражающие внутреннюю температуру организма крыс 8ргадие Оа\\'1еу. обрабатываемых защищающим ткань цитокином. периферически (фиг. 8а) или центрально (фиг. 8Ь). после вызванного ЬР8 сепсиса.

На фиг. 9 представлено графическое отображение процента заживленных повреждений у крыс 8ргадие Оа\\'1еу по истечении тридцати четырех (34) суток после подвергания тесту ишемизированных кожных лоскутов и последующей обработке физиологическим раствором или защищающим ткань цитокином.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым композициям для лечения. профилактики. задержки наступления или снижения эффектов таких провоспалительных цитокинов. как ΤΝΡ. при состояниях. включая. но ими не ограничиваясь. сепсис и связанные с сепсисом состояния. спайки. заживление ран и хроническое заболевание. Эффекты провоспалительных цитокинов. на которые воздействуют посредством защищающих ткань цитокинов. включают. но ими не ограничиваются. повышение температуры. истощение. апатичность. анемию. отек. ишемию. органную недостаточность и устойчивость к инсулину. Полагают. что композиции по изобретению также могут использоваться при лечении. профилактике. задержке наступления или снижении эффектов состояний воспаления в одном или нескольких органе(ах) или ткани(ях). возникающих вследствие инфекции. как в случае менингита. В частности. настоящее изобретение относится к композициям. содержащим защищающие ткань цитокины. которые эффективны при лечении эффектов провоспалительных цитокинов при состояниях. включающих в себя сепсис. спайки. заживление ран. хроническое заболевание и состояния воспаления.

Кроме того. композиции по изобретениям можно использовать при лечении. профилактике и/или снижении возникновения рубцев вследствие повреждения. Например. рубцевание можно значительно снизить. если в сочетании с хирургической операцией брюшной полости применять защищающий ткань цитокин по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению применяют для профилактики рубцевания после хирургических разрезов.

Композиции по изобретению

Для применения по настоящему изобретению рассматривают любой цитокин. способный защищать ткань. Композиции по изобретению могут содержать эритропоэтин. Например. приемлемый защищающий ткань цитокин по изобретению может представлять собой молекулу ЕРО. способную существовать в множестве форм. например. α. β. асиало- и других. Формы α и β обладают той же эффективностью. биологической активностью и молекулярной массой. но незначительно отличаются углеводными компонентами. тогда как форма асиало- представляет собой форму α или β с углеводными компонентами. лишенными концевых сиаловых кислот.

Кроме того. также в рамках изобретения рассматривают любой защищающий ткань цитокин. который может применяться при лечении. профилактике. задержке наступления и/или снижении эффекта сепсиса. связанных с сепсисом состояний и состояний генерализованного воспаления. В рамках настоящей заявки термин защищающие ткань цитокины относится к любому цитокину. который представляет собой производное эритропоэтина. обладающее защищающей ткань активностью эритропоэтина. Предпочтительно. у защищающего ткань цитокина отсутствуют по крайней мере один или несколько эритропоэтических эффектов эритропоэтина. Более предпочтительно у защищающего ткань цитокина отсутствуют все эритропоэтические эффекты эритропоэтина. Например. этого можно достичь. изменяя эритропоэтин посредством химических или мутационных процессов. воздействующих на его фармакологические свойства (снижение времени полужизни) или структурную способность связываться с гомодимером рецептора эритропоэтина. Неограничивающие примеры приемлемых защищающих ткань цитокинов. которые могут использоваться по настоящему изобретению. включают в себя защищающие ткань цитокины. описанные в международной публикации № ΑΘ/02053580 и патентах США №№

- 6 010650

2002/0086816 и 2003/0072737, которые приведены здесь в полном объеме.

Кроме того, для использования в качестве защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению также рассмаиривают защищающие ткань цитокины, которые могут включать в себя молекулы ЕРО с модификацией по крайней мере одного остатка аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина, или карбоксильных групп. Эти остатки могут быть химически модифицированы посредством гуанидирования, амидирования, карбамилирования, тринитрофенилирования, ацилирования (ацетилирования или сукцинилирования), нитрации или их сочетаний, как описано в международной публикации № №0/02053580.

Таким образом, защищающий ткань цитокин по настоящему изобретению может представлять собой карбамилированный ЕРО. Как указано в предпосылках изобретения, проводилось исследование гйиЕР0 для применения при лечении острой почечной недостаточности, которая является возможным осложнением при септицемии. Однако, поскольку гйи-ЕРО обладает эритропоэтической активностью, то есть способностью поддерживать уровень гематокрита в организме и гиперактивацию тромбоцитов, то после его введения повышается количество эритроцитов, и тромбоциты становятся гиперактивными, что приводит к сгущению крови и повышенному риску тромбоза. Таким образом, применение гйи-ЕРО скорей всего усилит распространенное свертывание крови, возникающее в результате сепсиса.

В отличие от гйи-ЕРО и других выбранных модифицированных молекул ЕРО, карбамилированный ЕРО не сохраняет эритропоэтическую активность и не способен связываться с классическим гомодимером рецептора эритропоэтина, как указано в заявке РСТ № РСТ/И804/013099, зарегистрированной 26 апреля 2004, приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме. Однако карбамилированный ЕРО преимущественно сохраняет защищающую ткань функцию эндогенного ЕРО. Предполагают, что сохраняющаяся функция защиты ткани карбамилированного ЕРО опосредована его взаимодействием с защищающим ткань рецепторным комплексом, как описано в заявке РСТ № РСТ/И804/013099. Таким образом, карбамилированный ЕРО можно применять для лечения, профилактики, задержки наступления и/или снижения эффектов таких провоспалительных цитокинов, как ΤΝΕ, при состояниях, включая, но ими не ограничиваясь, сепсис, спайки, заживление ран, хронические заболевания и состояния генерализованного воспаления, в отсутствие возникновения риска дополнительного свертывания крови, связанного с введением эритропоэтина. Кроме того, поскольку карбамилированные молекулы ЕРО по настоящему изобретению эффективны для защиты от некроза, то карбамилированные молекулы ЕРО по настоящему изобретению особенно эффективны при лечении, профилактике, задержке наступления и/или снижении эффектов сепсиса, спаек и состояний генерализованного воспаления у пациентов с риском инсульта, инфаркта миокарда, ухудшением умственных способностей и связанных с возрастом состояний.

Следовательно, защищающий ткань цитокин по изобретению может представлять собой измененный ЕРО с модификацией по крайней мере одного или нескольких остатков лизина или Ν-концевой группы молекулы ЕРО, которые для целей этой заявки также могут быть указаны как участки. Модификация может быть получена путем реакции остатка лизина или Ν-концевой аминогруппы со средством, модифицирующим аминогруппу. Например, на указанной ниже общей схеме реакции показан один из способов карбамилирования таких белков, как ЕРО:

О

II н—№С=О + Η₂ΝΛΛΛ --Η₂Ν—С—ΝΗΛΛΓ\

Изоциановая кислота | Карбамилированный белок

Концевая группа (или боковая цепь лизина или аргинина)

В другом варианте осуществления один или несколько остатков лизина в молекуле ЕРО могут быть карбамилированы с помощью реакции с ионом цианата. Например, один или несколько остатков лизина могут быть модифицированы инкубацией с 4-сульфофенилизотиоцианатом. В еще одном варианте осуществления один или несколько остатков лизина в молекуле ЕРО алкилкарбамилируют, арилкарбамилируют или арилтиокарбамилируют алкилизоцианатом, арилизоцианатом или арилтиоизоцианатом, соответственно. В еще одном варианте осуществления один или несколько остатков лизина алкилируют реакционноспособным производным алкилкарбоновой или арилкарбоновой кислоты, например, уксусным ангидридом, янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. Также модифицированный остаток лизина может быть восстановлен химически.

Также один или несколько остатков лизина могут быть карбамилированы посредством взаимодействия остатка(ов) с тринитробензолсульфоновой кислотой или ее солью. В еще одном варианте осуществления один или несколько остатков лизина могут быть модифицированы реакцией с глиоксалем или производным глиоксаля, например метилглиоксалем или 3-дезоксиглюкозоном, с образованием соответствующих альфа-карбоксиалкильных производных.

В настоящем изобретении можно использовать другие способы карбамилирования. Например, приемлемый способ получения карбамилированного ЕРО по настоящему изобретению представляет собой способ, описанный в Р1арр е! а1., 1.В1ОЬ. СНЕМ., 246:939-945 (1971). Другой пример способа карбамилирования приведен в 8а1аке е! а1, 1990, ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1038:125-9, где в эритропоэтине карбамили

- 7 010650 ровали шесть остатков лизина.

И, как указано выше, в настоящем изобретении можно использовать любую из форм ЕРО. Таким образом, в качестве примера: в одном варианте осуществления подвергаемая карбамилированию молекула ЕРО находится в форме α; в другом варианте осуществления подвергаемая карбамилированию молекула ЕРО находится в форме β; а в еще одном варианте осуществления подвергаемая карбамилированию молекула ЕРО находится в форме асиало-.

Предпочтительно процесс карбамилирования происходит в течение периода, достаточного для существенного снижения или полного устранения эритропоэтической активности. В одном из вариантов осуществления процесс карбамилирования проводят в течение периода, достаточного для удаления по крайней мере приблизительно 90% участков. В другом варианте осуществления процесс карбамилирования проводят в течение периода, достаточного для удаления по крайней мере приблизительно 95% участков. В еще одном варианте осуществления процесс карбамилирования проводят в течение периода, достаточного для удаления 100% участков. Альтернативно, это можно рассматривать, как карбамилирование эритропоэтина в течение периода, достаточного для карбамилирования по крайней мере шести остатков лизина в одном варианте осуществления, по крайней мере семи лизинов в другом варианте осуществления и по крайней мере восьми остатков лизина в еще одном варианте осуществления. Время, необходимое для прохождения достаточного карбамилирования, может различаться. Например, достаточное карбамилирование может проходить в течение периода приблизительно от 6 до 24 ч, приблизительно от 10 до 20 ч или до приблизительно 16 ч.

Также защищающие ткань цитокины для применения по настоящему изобретению можно получать ограниченным протеолизом, удалением аминогрупп и/или мутационной заменой остатка аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина способами молекулярной биологии, как описано в 8а1аке с1 а1, 1990, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а 1038:125-9, которая приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Например, приемлемые защищающие ткань цитокины включают в себя по крайней мере один или более измененных мутацией ЕРО, содержащих мутацию в участке С78, Κ10Ι, У118, Ь12А, Е13А, Р14А. В14В, В14Е, ΚΤ4Ρ, Υ15Α, Υ15Ε, Υ15Ι, К20А, К20Е, Е21А, С298, С29У, С338, С33У, Ρ42Ν, Τ44Ι, К45А, Κ45Ό, У46А, Ν47Α, Е48А, Ε48Ι, У49А, Υ498, №51Е, №51Ν, Ρ59Ν, Е62Т, Ь678, Ь70А, Ό96Β, Κ97Ό, 8100В, 8100Е, 8100А, 8100Τ, 6101А, 6101Ι, Б102А, В103А, 8104А, 8104Ι, Б105А, Т106А, Τ106Ι, Т107А, Т107Б, Б108К, Б108А, 8126А, Ε142Ι, В143А, 8146А, Ν147Κ, Ν147Α, Ε148Υ, Б149А, В150А, 6151А, К152А, Б153А, Б155А, А1608, Ι6Α, С7А, В13А, Ν24Κ, Α30Ν, Н32Т, Ν38Κ, Ν83Κ, Р42А, Ό43Α, К52А, К97А, К116А, Т132А, Ι133Α, Т134А, К140А, Е148А, В150В, 6151А, Κ 152Ж, М54А, 6158А, С161А и/или В162А. Примеры указанных выше модификаций описаны в одновременно рассматриваемых патентах США №№ 2003/0104988, 2002/0086816 и 2003/0072737, которые приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме. В используемой здесь номенклатуре белков, появляющихся в результате мутации, первой обозначают заменяемую аминокислоту, применяя однобуквенный код для природных аминокислот, затем следует ее положение в молекуле ЕРО, затем следует обозначение однобуквенным кодом аминокислоты, на которую заменяют. Например, 8100Е относится к молекуле ЕРО человека, в которой аминокислоту серин в 100 положении, заменили на глутаминовую кислоту.

В другом варианте осуществления защищающий ткань цитокин может включать в себя одну или несколько из указанных выше мутаций в участках при условии, что мутации в участках не включают в себя Ι6Α, С7А, Κ20Ά, Р42А, Ό43Α, Κ45Ό, К45А, Е48А, Υ49Α, К52А, К49А, 8100В, В103А, К116А, Т132А, Ι133Α, Κ140А, Ν147Κ, Ν147Α, В150А, В150Е, 6151А, Κ152^ Κ154^ 6158А, С161А или В162А.

В еще одном варианте осуществления защищающие ткань цитокины могут включать в себя сочетания таких мутаций в участках, как Κ45Ό/8100Ε, Κ97Ό/8100Ε, Α30Ν/Η32Τ, Κ45Ό/Β150Ε, В103Е/Ш088, К140А/К52А, К140А/К52А/К45А, К97А/К152А, ^7^152^45^ Κ97А/Κ152Ά/Κ45Ά/Κ52А,

Κ97А/Κ152Ά/Κ45Ά/Κ52Ά/К140А, Κ97Ά/Κ152Ά/Κ45А/Κ52Ά/Κ140Ά/Κ154А, Ν24Κ/Ν38Κ/Ν83Κ и Ν24Κ/Υ15Α. В еще одном варианте осуществления защищающие ткань цитокины не включают в себя какое-либо из указанных выше сочетаний. В другом варианте осуществления защищающие ткань цитокины могут включать в себя любую из указанных выше мутаций в участках при условии, что мутации в участках не включают в себя какое-либо из следующих сочетаний замен: Ν24Κ/Ν38Κ/Ν83Κ и/или Α30Ν/Η32Τ.

Определенные модификации или сочетания модификаций могут воздействовать на гибкость осуществления способности появляющегося в результате мутации белка связываться со своим рецептором, таким как рецептор ЕРО или вторичный рецептор. Примеры таких модификаций или сочетаний модификаций включают в себя в качестве неограничивающих примеров Κ152^, Β14Α/Υ15Α, Ι6Α, С7А, Ό43Α, Р42А, Е48А, Υ49Α, Т132А, Ι133Α, Т134А, Ν147Α, Е148А, В150А, 6151А, 6158А, С161А и В162А. Специалистам в этой области известно, что соответствующие мутации в гормоне роста человека оказываются вредными. Таким образом, в одном из вариантов осуществления защищающий ткань цитокин не включает в себя одну или несколько модификаций или сочетаний модификаций, которые могут воздействовать на гибкость осуществления способности белка, появляющегося в результате мутации, связываться со своим рецептором. Дополнительное обсуждение таких защищающих ткань цитокинов включе

- 8 010650 но в одновременно рассматриваемую патентную заявку США № 10/612665, номер регистрации 10165022-999, поданную 1 июля 2003 г., озаглавленную Рекомбинантные защищающие ткань цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и стимулирования восприимчивых клеток, тканей и органов, полное описание которой приведено здесь в качестве ссылки.

Кроме того, приемлемые защищающие ткань цитокины для применения по настоящему изобретению включают в себя химически модифицированные молекулы ЕРО длительного действия, описанные в международной заявке № И803/028073, поданной под номером регистрации 20528.0006 9 сентября 2003 г., озаглавленной Эритропоэтины длительного действия, которые поддерживают защищающую ткань активность эндогенного эритропоэтина, приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме. Например, приемлемые защищающие ткань цитокины для применения по настоящему изобретению включают в себя ЕРО, который подвергали по крайней мере одной химической модификации по меньшей мере по одной из Ν-связанных олигосахаридных цепей или О-связанной олигосахаридной цепи, где химическая модификация включает в себя окисление, сульфатирование, фосфорилирование, пегилирование или их сочетание. В одном из вариантов осуществления подвергаемая химической модификации молекула ЕРО находится в форме α. В другом варианте осуществления подвергаемая химической модификации молекула ЕРО находится в форме β . В еще одном варианте осуществления подвергаемая химической модификации молекула ЕРО находится в форме асиало-. В другом варианте осуществления подвергаемая химической модификации молекула ЕРО может представлять собой ΑΡΛΝΕ8Ρ (Атдеп, Тйоикапб Оакк, СА) или СЕВА (Нойшапп-Ьа Воске 1пс., №11еу, N1).

Для получения защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению можно использовать множество векторных систем экспрессии в хозяине. Например, в случае защищающего ткань цитокина на основе молекулы ЕРО можно использовать различные системы экспрессии в хозяине. Такие системы для экспрессии в хозяине представляют собой носители, посредством которых можно получать и затем очищать ЕРО, а также представляют собой клетки, способные вырабатывать ш 8Йи продукт модифицированного гена эритропоэтина в случае трансформации или трансфекции соответствующими кодирующими последовательностями нуклеотидов. Эти системы включают в себя, но ими не ограничиваются, бактерии, насекомых, растения, млекопитающих, включая в себя такие системы человека-хозяина, как, не ограничиваясь ими, системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами для экспрессии (например, бакуловирус), содержащими кодирующие ЕРО последовательности; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами для экспрессии (например, вирус мозаики цветной капусты, СаМУ; вирус табачной мозаики, ТМУ) или трансформированных рекомбинантными плазмидными векторами для экспрессии (например, плазмида Т1), содержащими последовательности, которые кодируют родственную эритропоэтину молекулу; или системы клеток млекопитающих, включающие в себя системы клеток человека, например, НТ1080, СО8, СНО, ВНК, 293, ЗТЗ, которые несут рекомбинантные конструкты для экспрессии, содержащие промоторы, которые получают из генома клеток млекопитающих, например, промотор металлотионеина, или из вирусов млекопитающих, например, поздний промотор аденовируса; промотор 7.5К вируса коровьей оспы.

Кроме того, можно выбирать линию клеток-хозяев, которые регулируют экспрессию вставляемых последовательностей или модифицируют и процессируют продукт гена специфическим желаемым образом. Такие модификации и процессинг белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Как известно специалистам в этой области, различные клетки-хозяева имеют специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов генов. Для обеспечения правильных модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка можно выбрать соответствующие линии клеток или системы хозяев. В этих целях можно использовать эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточной системой для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева млекопитающих, включая клеткихозяева человека, включают в себя в качестве неограничивающих примеров НТ1080, СНО, УЕВО, ВНК, НеЬа, СО8, МЭСК, 293, 3Т3 и №138.

Для высокоэффективной продукции рекомбинантных белков в течение длительного периода времени предпочтительна стабильная экспрессия. Например, может быть сконструирована линия клеток, стабильно экспрессирующая продукт рекомбинантного гена молекулы, родственной защищающему ткань цитокину. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусные репликаторы, клетки-хозяева можно трансформировать, применяя ДНК, контролируемую соответствующими управляющими экспрессией элементами, например, промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, участками полиаденилирования и тому подобное, и селективный маркер. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно позволять расти в обогащенной среде в течение 1-2 суток, а затем переносить на селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде обеспечивает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно включать плазмиду в состав своих хромосом и расти, формируя колонии, которые, в свою очередь, можно клонировать и выращивать в клеточные линии. Преимущественно этот способ можно использовать для конструирования линий клеток, экспрессирующих продукт гена молекулы, родственной появляющемуся в результате мутации белку

- 9 010650

ЕРО. Такие линии сконструированных клеток могут быть особенно эффективны при скрининге и оценке соединений, воздействующих на функции продукта гена молекулы, родственной ЕРО.

Альтернативно, свойства экспрессии гена эндогенного ЕРО, появляющегося в результате мутации, в линии клеток или микроорганизме можно изменять вставкой регуляторного элемента гетерологичной ДНК в геном стабильной линии клеток или клонируемого микроорганизма таким образом, что вставляемый регуляторный элемент функционально связывается с геном эндогенного эритропоэтина, появляющегося в результате мутации. Например, транскрипционно молчащий в норме ген эндогенного ЕРО, появляющегося в результате мутации, то есть ген ЕРО, который в линии клеток в норме не экспрессируется или экспрессируется только на очень низком уровне, можно активировать вставкой регуляторного элемента, способного активировать экспрессию экспрессируемого продукта гена в этой линии клеток или микроорганизме. Альтернативно, транскрипционно молчащий ген эндогенного ЕРО можно активировать вставкой случайного регуляторного элемента, работающего в различных типах клеток.

Гетерологичный регуляторный элемент можно вставлять в стабильную линию клеток или клонируемый микроорганизм таким образом, чтобы он функционально связывался с геном эндогенного эритропоэтина, используя такие способы, как направленная гомологичная рекомбинация, которые хорошо известны специалистам в этой области, а также описаны в патенте Франции № 2646438, патентах США №№ 4215051 и 5578461, и международных публикациях \УО 93/09222 и \УО 91/06667, описания которых приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Фармацевтические композиции

Также настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению. Поскольку защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению преимущественно обладают способностью благоприятно воздействовать на эффекты таких провоспалительных цитокинов, как ΤΝΡ, а также способностью защищать ткани от гибели клеток, то цитокины можно использовать для лечения сепсиса, спаек, ран, хронического заболевания и состояний воспаления у индивидуумов, также подверженных риску таких повреждений ткани, как инсульт и инфаркт миокарда.

Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно использовать для лечения сепсиса, спаек, ран и состояний генерализованного воспаления у индивидуумов, а также у больных, страдающих таким ухудшением умственных способностей, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и тому подобное.

Фармацевтические композиции по изобретению содержат терапевтически эффективное количество защищающего ткань цитокина по настоящему изобретению, предпочтительно в очищенной форме. В рамках настоящей заявки термин терапевтически эффективное количество означает количество защищающего ткань цитокина, которое не токсично, но достаточно для обеспечения желаемых воздействия и эффекта при приемлемом соотношении польза/риск, свойственном любому медицинскому лечению.

Препарат должен соответствовать способу введения. Говоря иначе, фармацевтические композиции по изобретению содержат количество защищающих ткань цитокина(ов) по изобретению таким образом, чтобы определенные эффекты провоспалительных цитокинов, то есть повышение температуры, истощение, апатичность, анемия, отек, ишемия, органная недостаточность и резистентность к инсулину, или связанные с провоспалительными цитокинами состояния, то есть сепсис, спайки, заживление ран, хроническое заболевание или состояние воспаления, могли бы поддаваться лечению при обеспечении соответствующей дозы и способа применения. И, как более подробно описано ниже, фармацевтическую композицию следует вводить в нетоксичной дозе.

В одном из вариантов осуществления в фармацевтическую композицию по изобретению включают химически модифицированный или измененный мутацией эритропоэтин. В другом варианте осуществления химически модифицированный эритропоэтин представляет собой карбамилированный ЕРО. Карбамилированный ЕРО может представлять собой молекулу ЕРО по крайней мере с одним или несколькими остатками модифицированного лизина или модифицированной Ν-концевой группы. В другом варианте осуществления измененный мутацией ЕРО может представлять собой 8100Е. Кроме того, по настоящему изобретению предусмотрено применение в фармацевтических композициях по изобретению смеси защищающих ткань цитокинов, которые получают любым из описанных выше способов по настоящему изобретению. Например, фармацевтические композиции по изобретению могут содержать по крайней мере один карбамилированный ЕРО, полученный модифицированием одного или несколько остатков лизина, и по крайней мере один измененный мутацией ЕРО, полученный модифицированием аминогруппы в эритропоэтине, таком как 8100Е.

Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество защищающего ткань цитокина и соответствующее количество фармацевтически приемлемого носителя таким образом, чтобы обеспечить форму для соответствующего введения пациенту. В конкретном варианте осуществления термин фармацевтически приемлемый означает утвержденный контрольными органами федерального правительства или правительства штата, или указанный в фармакопее США или других общепризнанных иностранных фармакопеях для применения для животных и, более конкретно, для человека. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или на

- 10 010650 полнителю, вместе с которыми вводят лекарственное средство.

Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как солевые растворы в воде и масла, включающие в себя такие масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. При внутривенном введении фармацевтической композиции предпочтительным носителем является солевой раствор. Также в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов, можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Приемлемые фармацевтические эксципиенты включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное.

Также фармацевтические композиции по изобретению могут содержать незначительные количества увлажнителей или эмульгаторов, или рН буферных веществ. Эти композиции могут быть в виде растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, драже, капсул, порошков, препаратов длительного высвобождения и тому подобное.

Соединения по изобретению могут входить в состав композиции в нейтральном виде или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя такие образованные свободными аминогруппами соли, как производные хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и тому подобное, и такие образованные свободными карбоксильными группами соли, как производные изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина, гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа и т. д.

Способы лечения и введения

Указанные выше защищающие ткань цитокины и фармацевтические композиции, которые содержат защищающие ткань цитокины, могут использоваться для терапевтического или профилактического лечения, профилактики, задержки наступления и снижения эффектов провоспалительных цитокинов таких, как ΤΝΕ. Эти эффекты включают в себя повышенную температуру, истощение, апатичность, анемию, отек, ишемию, органную недостаточность и устойчивость к инсулину. Например, как показано ниже в примере 4, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению снижают повышенную температуру по сравнению с нормальной температурой организма, что связано с высвобождением провоспалительных цитокинов тела. Как показано на фиг. 6, введение защищающего ткань цитокина, карбамилированного эритропоэтина, приводит более чем к 50% снижению лихорадки, вызванной воздействием ЬР8 на крысу. Защищающие ткань цитокины можно применять для лечения, профилактики, задержки наступления или снижения таких связанных с провоспалительными цитокинами состояний, как сепсис и связанные с сепсисом состояния, такие как спайки.

Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению также могут использоваться для лечения и профилактики воспалительных состояний в одном или нескольких органе(ах) или ткани(ях). Органы включают в себя, но ими не ограничиваются, дыхательные пути и легкие, почки и систему мочевыводящих путей, а также предстательную железу. В рамках настоящей заявки термин воспалительное состояние относится к состоянию, при котором такие механизмы, как реакция специфических Т-лимфоцитов или антитела с антигеном, вызывают привлечение воспалительных клеток и эндогенных химических веществ-медиаторов. В некоторых случаях нормальная функция органа или ткани может быть нарушена в результате повышения проницаемости сосудов и/или сокращением висцеральной гладкой мускулатуры.

Таким образом, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики состояний воспаления, при которых нарушена нормальная функция органа(ов) или ткани(ей). Эти состояния могут включать в себя связанные с ишемией состояния, а также не связанные с ишемией состояния, такие как аллергия, ревматические заболевания и инфекционные заболевания, включающие в себя вирусные, грибковые и бактериальные инфекционные заболевания. Кроме того, повреждение или инфекция могут быть острыми или хроническими. В одном из вариантов осуществления защищающие ткань цитокины по изобретению могут быть использованы при лечении и/или профилактике воспалительных состояний при неишемических состояниях, то есть состояниях, при которых происходит, по существу, нормальное кровоснабжение рассматриваемых органа(ов) и/или ткани(ей).

Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно использовать для улучшения заживления ран. Такое улучшение заживления достигается при уменьшении времени, необходимого для заживления, снижении проявления или полном устранении рубцевания, снижении риска осложнений или улучшении качества заживления другим образом. Например, рубцевание после разрезов может быть значительно снижено, и даже полностью предупреждено в случае применения защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению перед, в ходе или после образования разреза. Кроме хирургических процедур, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению могут использоваться при воздействии на раны, полученные в результате состояний, которые включают в себя, но ими не ограничиваются, травму (от удара тупым предметом и от режущих воздействий), сдавление (пролежни), ожоги и заболевания, такие как диабет или сосудистые недостаточности.

- 11 010650

Кроме того, защищающие ткань цитокины и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для воздействия на эффекты таких провоспалительных цитокинов, как ΤΝΕ. Как показано на фиг. 7а и 7Ь, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению способны снижать повышенную в ответ на повреждение или возбудителя инфекции продукцию провоспалительных цитокинов, 1Ь-б и ΤΝΕ, соответственно. Защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить в терапевтических дозах для лечения, профилактики, снижения или устранения таких эффектов провоспалительных цитокинов, как лихорадка, истощение, апатичность, анемия, отек, ишемия, органная недостаточность и устойчивость к инсулину. Поскольку защищающие ткань цитокины препятствуют повышенной продукции провоспалительных цитокинов, то защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению способны восстанавливать внутренние функции организма, нарушенные провоспалительными цитокинами, без прямого воздействия на эти внутренние функции организма. Кроме того, для обеспечения синергетического эффекта защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с другими известными лекарственными средствами для лечения состояний, связанных с провоспалительными цитокинами. Например, лечение анемии, связанной с раком или другими хроническими заболеваниями, может включать в себя введение обычной терапевтической дозы рекомбинантного эритропоэтина для восстановления гематокрита пациента и терапевтической дозы защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению для противодействия эффектам провоспалительных цитокинов. При таком хроническом заболевании это позволяет использовать более низкие дозы рекомбинантного эритропоэтина, значительно снижая таким образом риск тромбоза.

Защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно использовать для систематического или длительного применения, неотложного лечения и/или дробного введения. В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции по изобретению применяют длительно для защиты или улучшения клеток-, ткани- или органа-мишени. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции по изобретению можно вводить в экстренном порядке, то есть для однократного действия в ходе повреждения. В еще одном варианте осуществления фармацевтические композиции по изобретению вводят периодическим образом.

Композиции по изобретению можно вводить до нанесения повреждения. Например, для профилактики сепсиса, задержки наступления сепсиса и/или снижения осложнений сепсиса защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить перед хирургической процедурой. Например, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить пациенту перед операцией на брюшной полости. И, как вкратце указано выше, введение защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению перед хирургическим вмешательством может не только оказывать эффект по отношению к сепсису, спайкам и состояниям генерализованного воспаления, но также цитокины могут снижать проявление или полностью устранять рубцевание после хирургического вмешательства.

Кроме того, композиции по изобретению можно вводить во время нанесения повреждения или вскоре после него. Таким образом, для профилактики, задержки наступления или снижения осложнений, обусловленных сепсисом, спайками или состояниями генерализованного воспаления, пациенту, подвергающемуся обширному хирургическому вмешательству в области брюшной полости, можно вводить защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению во время хирургической операции или вскоре после нее. Также, в случае введения в ходе или после нанесения повреждения, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению могут снижать проявление или полностью устранять рубцевание после хирургического вмешательства.

Например, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно использовать в целях промывания, например, в ходе промывания раны можно вводить физиологический раствор, который содержит защищающий ткань цитокин по настоящему изобретению, для лечения, профилактики, задержки наступления или снижения осложнений, обусловленных сепсисом, спайками или состояниями генерализованного воспаления. Кроме того, для профилактики, задержки наступления и/или снижения осложнений сепсиса, спаек или состояний генерализованного воспаления можно вводить защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению беременным женщинам, которым предстоит кесарево сечение. В качестве другого примера, для профилактики сепсиса, спаек или состояний генерализованного воспаления защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить пациенту в ходе химиотерапии.

В одном из вариантов осуществления для профилактики, задержки наступления или снижения осложнений, обусловленных сепсисом, спайками или состояниями генерализованного воспаления, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению вводят внутривенно во время нанесения повреждения, а затем подкожно в течение заранее определенного периода времени. Например, композиции по изобретению можно вводить в количестве приблизительно 10 мкг/кг внутривенно во время нанесения повреждения, с последующим введением 10 мкг/кг подкожно в течение определенного периода времени.

В случаях положительного диагноза сепсиса композиции по изобретению можно вводить ежесуточно для лечения сепсиса, стабилизации состояния пациента и профилактики прогрессирования сепсиса до более тяжелой формы, например, тяжелого сепсиса или септического шока. Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить вместе с известными антибиотиками, про

- 12 010650 тивогрибковыми, противовирусными средствами и тому подобное, в том числе вместе с антибиотиками, которые указаны в международной публикации νθ 2004/004 656, приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Введение композиции может быть парентеральным, то есть не через пищеварительный тракт. Например, парентеральное введение может включать в себя внутривенную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное или подкожное введение. Также композицию можно вводить ингаляцией или через слизистую оболочку, например, перорально, назально, ректально, внутривагинально, подъязычно, подслизисто и трансдермально. Кроме того, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно вводить местно в требующий лечения участок, например, посредством применения перфузата; местного применения, например, в сочетании с обработкой раны после хирургического вмешательства; посредством инъекции; посредством катетера; посредством суппозитория; или посредством имплантата, где указанный имплантат состоит из пористого, непористого или гелеобразного вещества, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна. В настоящем изобретении предлагают сочетания описанных выше способов введения.

В одном из вариантов осуществления введение фармацевтической композиции по изобретению представляет собой парентеральное введение. Такое введение можно осуществлять при количестве дозы приблизительно от 0,01 нг до приблизительно 5 мг, предпочтительно приблизительно от 1 нг до приблизительно 5 мг. В одном из вариантов осуществления количество дозы составляет приблизительно от 500 нг до приблизительно 5 мг. В другом варианте осуществления количество дозы составляет приблизительно от 1 нг до приблизительно 5 мг. В еще одном варианте осуществления количество дозы составляет приблизительно от 500 нг до приблизительно 5 мг. В другом варианте осуществления количество дозы составляет приблизительно от 1 мкг до приблизительно 5 мг. Например, количество дозы может составлять приблизительно от 500 мкг до приблизительно 5 мг. В другом варианте осуществления количество дозы может составлять приблизительно от 1 до приблизительно 5 мг. Такие композиции могут включать в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостатические вещества и растворенные вещества, приводящие композиции в состояние, в значительной степени, изотоничности с кровью предполагаемого реципиента. В этом аспекте изобретения фармацевтические композиции также могут включать в себя воду, спирты, полиолы, глицерин, растительные масла и их смеси.

Приспособленные для парентерального введения фармацевтические композиции могут находиться в контейнерах для однократной дозы или многократных доз, например герметичных ампулах и флаконах, и их можно хранить в лиофилизированном (высушенном сублимацией) состоянии, которое требует только добавления стерильного жидкого носителя, например, стерильного физиологического раствора для инъекций, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии для немедленного введения можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток. В одном из вариантов осуществления для неотложного применения в транспортных средствах скорой помощи, пунктах скорой помощи и в условиях боевых действий инъекционный раствор ЕРО длительного действия по изобретению может находиться в шприце для самоинъекции.

Внутривенное введение

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по изобретению входит в состав в соответствии с общепринятыми процедурами, в фармацевтическую композицию для внутривенного введения человеку. Например, фармацевтическая композиция может находиться в виде раствора в стерильном изотоническом водном буферном растворе. При необходимости, для облегчения боли в области инъекции, фармацевтическая композиция также может содержать растворитель и/или обезболивающее средство местного действия, такое как лидокаин. Ингредиенты могут доставляться либо по отдельности, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично запечатанном контейнере, таком как ампула или пакет-саше, с указанием количества активного вещества. Когда фармацевтические композиции по изобретению вводят инфузией, для дозирования композиции можно использовать сосуд для инфузии со стерильной водой или физиологическим раствором фармацевтической категории. А когда фармацевтическую композицию нужно вводить инъекцией для смешивания ингредиентов, которые можно смешивать перед введением, можно использовать ампулу стерильного физиологического раствора.

Пероральное введение

Специалисту в данной области будет понятно, что фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть подходящими для перорального введения в виде капсул или таблеток; порошков или гранул; растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях); съедобных пен или взбитых масс; эмульсий; или их сочетаний. Препарат для перорального введения может включать в себя приблизительно от 10% до приблизительно 95 мас.% активного вещества. В одном из вариантов осуществления в препарат для перорального введения вводят активное вещество в количестве приблизительно от 20% до приблизительно 80 мас.%. В еще одном варианте осуществления препарат для перорального введения включает в себя приблизительно от 25% до приблизительно 75 мас.% активного ве

- 13 010650 щества.

Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или его производные, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или ее соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые полиолы, жидкие полиолы или их смеси. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы, сахара или их смеси.

Кроме того, предназначенное для перорального введения активное вещество можно покрывать или смешивать с веществом, задерживающим разрушение и/или всасывание активного вещества в желудочно-кишечном тракте. Например, активное вещество можно смешивать или покрывать моностеаратом глицерина, дистеаратом глицерина или их сочетанием. Таким образом, может быть достигнуто длительное высвобождение активного вещества в течение многих часов, и, если необходимо, активное вещество можно защищать от разрушения в желудке. Также фармацевтические композиции для перорального введения могут быть составлены таким образом, чтобы способствовать высвобождению активного вещества в конкретном участке желудочно-кишечного тракта вследствие специфических условий рН или ферментативных условий.

Трансдермальное введение

Подходящие для трансдермального введения фармацевтические композиции могут находиться в виде отдельных пластырей, предназначенных для плотного контакта с эпидермисом реципиента в течение продолжительного периода времени. Кроме того, подходящие для местного применения фармацевтические композиции могут находиться в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей, масел, глазных капель, лекарственных леденцов, пастилок и ополаскивателей для полости рта, и их сочетаний. При местном применении на кожу, в полости рта, глаза или другие наружные ткани, предпочтительно используют мазь или крем для местного нанесения. При получении композиции мази активное вещество, то есть ЕРО длительного действия, можно применять вместе с парафиновой или водорастворимой мазевой основой. Альтернативно, активное вещество может входить в состав композиции в виде крема с основой типа масло в воде или основой типа вода в масле. В случае местного применения в форме глазных капель фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно содержат активное вещество, растворенное или суспендированное в приемлемом носителе, например, в водном растворителе.

Назальное введение и введение в легкие

Подходящие для назального введения и введения в легкие фармацевтические композиции могут содержать такие твердые носители, как порошки (предпочтительно, с размером частиц приблизительно от 20 до приблизительно 500 мкм). Порошки можно вводить через нос быстрой ингаляцией из контейнера с порошком, удерживаемого близко к носу. В альтернативном варианте осуществления предполагаемые для назального введения по настоящему изобретению фармацевтические композиции могут содержать жидкие носители, например, спреи в нос или капли в нос. Предпочтительно, фармацевтические композиции по изобретению вводят непосредственно в полость носа.

Прямую ингаляцию в легкие можно выполнять посредством глубокой ингаляции через загубник в ротоглотку и посредством других специально приспособленных устройств, включающих в себя, но ими не ограничиваясь, аэрозоли под давлением, распылители или порошковдуватели, которые можно конструировать таким образом, чтобы обеспечить заранее определенные дозы активного вещества. Подходящие для ингаляции в легкие фармацевтические композиции могут включать в себя водные или масляные растворы активного вещества. Предпочтительно, фармацевтические композиции по изобретению вводят глубокой ингаляцией непосредственно в ротоглотку.

Ректальное и вагинальное введение

Подходящие для ректального введения фармацевтические композиции могут находиться в виде суппозиториев или клизм. В одном из вариантов осуществления суппозитории по изобретению содержат приблизительно от 0,5% до 10 мас.% активного вещества. В другом варианте осуществления суппозитории содержат приблизительно от 1% до приблизительно 8 мас.% активного вещества. В еще одном варианте осуществления активное вещество присутствует в суппозитории в количестве приблизительно от 2% до приблизительно 6 мас.%. В этом аспекте изобретения фармацевтические композиции по изобретению могут содержать общепринятые связывающие вещества и носитель, такой как триглицериды.

Подходящие для вагинального введения фармацевтические композиции могут находиться в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или препаратов спреев.

Перфузия

Также фармацевтические композиции по изобретению можно вводить, применяя перфузат, то есть накачивая жидкость в орган или ткань (особенно через кровеносные сосуды). В таких вариантах осуществления фармацевтическая композиция предпочтительно содержит приблизительно от 0,01 до приблизительно 30 пМ, предпочтительно приблизительно от 15 до приблизительно 30 пМ защищающего ткань цитокина по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления раствор для перфузии представляет собой разработанный в университете штата Висконсин раствор (И^) (с рН приблизительно от 7,4 до приблизительно 7,5 и осмоляльностью приблизительно 320 мОсм/л), который содержит приблизительно от 1 ед. (10 нг)/мл до приблизительно 25 ед.(250 нг)/мл соединения ЕРО по настоящему

- 14 010650 изобретению; 5-процентный гидроксиэтилированный крахмал (предпочтительно, с молекулярной массой приблизительно от 200000 до приблизительно 300000 и практически не содержащий этиленгликоль, этиленхлоргидрин, хлорид натрия и ацетон), 25 мМ КН₂РО₄, 3 мМ глутатион; 5 мМ. аденозин; 10 мМ глюкозу; 10 мМ буфер НЕРЕ8; 5 мМ глюконат магния; 1,5 мМ СаС1₂; 105 мМ глюконат натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона и 12 мг фенолового красного. Раствор υν подробно описан в патенте США № 4798824, приведенном здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Местное введение

Может быть желательным введение фармацевтических композиций по изобретению местно в требующий лечения участок. Такого введения можно достигать путем местной инфузии в ходе хирургического вмешательства; местным нанесением, например, при обработке раны после хирургического вмешательства; инъекцией; через катетер; посредством суппозитория; или посредством имплантата, где указанный имплантат состоит из пористого, непористого или гелеобразного вещества, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна.

Системы контролируемого высвобождения

Кроме того, как вкратце описано выше в отношении трансдермального введения, защищающие ткань цитокины по настоящему изобретению можно доставлять в системах контролируемого высвобождения. Например, защищающий ткань цитокин можно вводить, применяя внутривенную инфузию, имплантируемую осмотическую помпу, трансдермальный пластырь, липосомы или другие способы введения. Такие системы контролируемого высвобождения можно помещать вблизи мишени терапевтического воздействия, то есть клеток-, ткани- или органа-мишени, требуя, таким образом, только часть общей дозы.

Дозирование

Выбор предпочтительной эффективной и нетоксичной дозы для указанных выше способов может быть осуществлен специалистом в данной области на основе факторов, известных специалисту в данной области. Примеры этих факторов включают в себя конкретную форму защищающего ткань цитокина; такие фармакокинетические параметры защищающего ткань цитокина, как биодоступность, метаболизм, время полужизни и т.д. (предоставленные специалисту в данной области); состояние, которое следует лечить; пользу, которую следует принести индивидууму в нормальном состоянии; массу тела пациента; способ введения; частоту введения, то есть длительное, срочное, дробное; сопутствующие лекарственные средства; и другие факторы, для которых хорошо известно воздействие на эффективность вводимых фармацевтических средств. Таким образом, точную дозу следует определять в соответствии с решением практикующего врача и состоянием конкретного пациента.

Лекарственные наборы

Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению. В одном из вариантов осуществления эффективное количество защищающего ткань цитокина и фармацевтически приемлемый носитель можно упаковывать во флакон с однократной дозой или в другой контейнер.

Например, когда фармацевтическая композиция по изобретению предназначена для парентерального введения, композицию можно хранить в лиофилизированном состоянии. Таким образом, набор может содержать лиофилизированную композицию, стерильный жидкий носитель и шприц для инъекций.

В одном из вариантов осуществления набор содержит ампулу, содержащую достаточное для нескольких курсов лечения лиофилизированное вещество таким образом, чтобы индивидуум, осуществляющий введение, мог отвесить конкретное количество вещества и добавить конкретное количество носителя при каждом введении. В другом варианте осуществления набор может содержать множество ампул, каждая из которых содержит конкретное количество лиофилизированного вещества, и множество контейнеров, каждый из которых содержит конкретное количество носителя, таким образом, чтобы при каждом введении индивидууму, осуществляющему введение, нужно было бы только смешивать содержимое одной ампулы и одного контейнера с носителем без измерения или взвешивания. В еще одном варианте осуществления набор содержит шприц для самоинъекции, содержащий раствор для инъекции защищающего(их) ткань цитокина(ов) по изобретению. В другом же варианте осуществления набор содержит по крайней мере одну ампулу с лиофилизированной композицией, по крайней мере один контейнер с раствором носителя, по крайней мере один контейнер с обезболивающим средством местного действия и по крайней мере один шприц (или тому подобное). Предпочтительно ампулы и контейнеры герметично закрыты.

При введении фармацевтических композиций по изобретению путем инфузии набор предпочтительно содержит по крайней мере одну ампулу с фармацевтической композицией и по крайней мере один сосуд для инфузии со стерильными водой или физиологическим раствором фармацевтической категории.

Также набор по настоящему изобретению может включать в себя по крайней мере один загубник или такие специально приспособленные устройства для прямой ингаляции в легкие, как аэрозоли под давлением, распылители или порошковдуватели. В этом аспекте изобретения набор может содержать устройство для прямой ингаляции в легкие, содержащее фармацевтическую композицию, или устройство

- 15 010650 и по крайней мере одну ампулу водного или масляного растворов защищающего(их) ткань цитокина(ов) по настоящему изобретению.

Когда защищающий(е) ткань цитокин(ы) по изобретению предназначен(ы) для перорального введения, трансдермального, ректального, вагинального или назального введения, тогда набор предпочтительно содержит по крайней мере одну ампулу, содержащую активное вещество, и по крайней мере одно устройство для введения. Примеры устройств для введения включают в себя в качестве неограничивающих примеров мерные ложки (для перорального введения), стерильные чистящие салфетки (для трансдермального введения) и назальные аспираторы (для назального введения). Такие наборы могут содержать однократную дозу защищающего ткань цитокина (неотложное лечение) или множество доз (длительное лечение).

Кроме того, набор может содержать один или нескольких типов растворов. Например, защищающие ткань цитокины по изобретению можно получать в растворе альбумина и растворе полисорбата. Если набор включает в себя раствор полисорбата, то на ярлыках контейнера, а также на основных сторонах набора предпочтительно представлены слова не содержащий альбумина.

Более того, набор также может содержать уведомление в форме, установленной правительственным агентством по контролю над производством, применением или продажей фармацевтических или биологических продуктов, где уведомление отражает разрешение агентства на производство, применение или продажу для введения человеку.

Анализы для определения возможности лечения сепсиса/воспаления

Также в настоящем изобретении представлены исследования для определения способности защищающего ткань цитокина эффективно лечить, осуществлять профилактику, задерживать наступление или снижать осложнения сепсиса, спаек и воспаления в результате инфекции. По настоящему изобретению предлагают любой анализ, предусматривающий лабораторно-контролируемую индукцию сепсиса, индукцию спайки или индукцию воспалительной реакции.

Например, приемлемый анализ по изобретению может предусматривать слепое исследование, при котором слепую кишку крыс 8ргадие Эа\у1су подвергают воздействию и накладывают на нее лигатуру немного дистальнее илеоцекального клапана для предотвращения непроходимости кишечника. Затем слепую кишку прокалывают и осторожно сжимают для выдавливания незначительного количества фекалий, а затем возвращают в брюшную полость. Высвобождение фекалий в орган вызывает развитие инфекции, что, в свою очередь, индуцирует сепсис, спайки, воспаление или их сочетание. Затем брюшную полость зашивают. Предпочтительно крыс разделяют на группы, где по крайней мере одной группе вводят физиологический раствор и другой группе вводят защищающий ткань тестируемый цитокин. Во время наложения лигатуры различные группы животных получают заранее определенное количество физиологического раствора или защищающего ткань цитокина, предпочтительно внутривенно. Подкожное введение выбранного для обработки средства, то есть физиологического раствора или защищающего ткань цитокина, можно осуществлять в течение заранее определенного времени после наложения лигатуры. Кроме того, исследование можно проводить на группе крыс, которых подвергали вскрытию, но которые не были инфицированы.

Затем животных можно наблюдать для балльных оценок спаек и заболевания. В табл. 1 представлен способ балльной оценки животного на основе образования спаек.

Таблица 1. Шкала совокупной балльной оценки спаек

Баллы	0	Отсутствие спаек
	+1	Один спаечный тяж от сальника до органа-мишени
	+ 1	Один спаечный тяж от сальника до рубца
	+1	Один спаечный тяж от сальника до другого участка
	+ 1	Один спаечный тяж от жировых тел придатков яичка до органа-мишени
	+1	Один спаечный тяж от жировых тел придатков яичка до рубца
	+ 1	Один спаечный тяж от жировых тел придатков яичка до другого участка
	+ 1	Любой спаечный тяж, отличный от описанных выше (например, от печени до рубца)
	+ 1	Орган-мишень, сросшийся с брюшной стенкой
	+ 1	Орган-мишень, сросшийся с брюшным рубцом
	+1	Орган-мишень, сросшийся с кишечником

- 16 010650

	+ 1	Орган-мишень, сросшийся с печенью или селезенкой
	+ 1	Любой другой сросшийся орган
Общее количество баллов

Начисляют по одному баллу за каждую спайку и рассчитывают совокупную балльную оценку спаек. В одном из вариантов осуществления совокупная балльная оценка спаек предпочтительно составляет 8 или менее. В другом варианте осуществления совокупная балльная оценка спаек составляет приблизительно 5 или менее. В еще одном варианте осуществления совокупная балльная оценка спаек составляет приблизительно 3 или менее.

Также для любого животного можно на основе различных факторов рассчитать балльную оценку заболевания. Используемые для этой балльной оценки факторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров такие поведенческие факторы, как положение тела при передвижении, способность висеть на канате, исследовательское поведение по отношению к окружающей среде, лазание вверх по мату на ограждение; такие реакции организма, как выпрямление положения шерсти, и оксигенацию, и количество образованных спаек. Например, когда крыса больна, животное горбится при передвижении и не исследует окружающую его/ее среду. Кроме того, у больной крысы частота пульса неправильна, тогда как здоровая крыса обычно имеет частоту пульса приблизительно 300 ударов/мин. Табл. 2 обеспечивает способ балльной оценки каждого животного в отношении заболевания для оценки эффективности защищающего ткань цитокина, который используют для лечения.

Таблица 2. Совокупная балльная оценка заболевания

Поведенческие тесты
+1	Пилоэрекция (выпрямление положения шерсти)
+ 1	Неподвижность
+ 1	Утрата равновесия на брусе
+1	Неспособность к хвату или лазанию
+1	Не использование когтей
+1	Возникновения горба
+1	Отклоняющееся от нормы передвижение
+1	Отсутствие исследования окружающей среды
+ 1	Отсутствие захвата веревки в течение 30 секунд
+ 1	Сниженные рефлексы
+1	Отсутствие аппетита (к пище и питью)
+ 1	Потеря массы тела _
+1	Агония
+ 1	Отклоняющаяся от нормы частота сердечных сокращений (< или >50% от нормы)
+1	Самопроизвольное кровотечение
+1	Пониженное насыщение кислородом
Общее количество баллов

В диапазоне баллов совокупная балльная оценка заболевания от 14 и выше обозначает гибель животного, тогда как значительно более низкая балльная оценка указывает на то, что животное относительно здоровое. В одном из вариантов осуществления животное с индуцированным сепсисом после 8 суток обработки по крайней мере одним защищающим ткань цитокином по изобретению имеет балльную оценку заболевания приблизительно 5 или менее. В другом варианте осуществления животное после обработки имеет балльную оценку заболевания приблизительно 4 или менее. В еще одном варианте осуществления животное после обработки имеет балльную оценку заболевания приблизительно 2 или менее. В другом же варианте осуществления животное после обработки имеет балльную оценку заболевания приблизительно 1 или менее.

Примеры

Следующие неограничивающие примеры предназначены для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобрете

- 17 010650 ния. который определен прилагаемой формулой изобретения. Части представляют собой массовые части. если не указано иначе.

Пример 1. Слепое исследование с использованием модели сепсиса брюшной полости на крысе

Слепую кишку крыс 8ртадие Оа\\'1еу подвергали воздействию. накладывали на нее лигатуру немного дистальнее илеоцекального клапана для предотвращения непроходимости кишечника. дважды прокалывали иглой 18-номера. осторожно сжимали для выдавливания незначительного количества фекалий. а затем возвращали в брюшную полость (фекалии вводили в брюшную полость. что вызывало инфицирование). Брюшную полость зашивали шелковой хирургической нитью 3-0.

Животных подразделяли на две группы:

Группа 1: С индуцированным сепсисом. обрабатываемые физиологическим раствором (п=8). Во время наложения лигатуры животным из группы 1 внутривенно вводили 100 мкл физиологического раствора. Затем проводили ежесуточное введение подкожно физиологического раствора (100 мкл) в течение 8 суток или до гибели.

Группа 2: С индуцированным сепсисом. обрабатываемые карбамилированным ЕРО (п=8). Во время наложения лигатуры животным внутривенно вводили 10 мкг/кг карбамилированного ЕРО (получаемого таким образом. что эритропоэтическая активность эффективно устранена) в 100 мкл физиологического раствора. Затем в течение 8 суток (или до гибели) проводили ежесуточную обработку подкожно в количестве дозы 10 мкг/кг в 100 мкл физиологического раствора.

Заболеваемость и смертность

В группе 1 после 8 суток выживало менее чем приблизительно 50% животных. Однако в группе 2 выживаемость составляла более чем приблизительно 50%. что проиллюстрировано графически на фиг. 1. В частности. через одни сутки после обработки выживаемость животных в группе 1 составляла приблизительно 60% по сравнению с 80% выживаемости животных в группе 2. Однако через 3 суток выживаемость в группе 1 значительно снижалась до приблизительно 25% выживаемости. тогда как выживаемость животных в группе 2 составляла более чем приблизительно 60%. Таким образом. выживаемость животных. получавших карбамилированный ЕРО по настоящему изобретению. была значительно выше. чем животных. получавших физиологический раствор.

Совокупная балльная оценка спаек

Для аэробной и анаэробной культур образцы получали из жидкости брюшной полости и абсцессов. Для аэробной культуры образцы инкубировали на кровяном агаре ЕМВ в течение 24 ч при 37°С. Для анаэробной культуры образцы наслаивали на анаэробный кровяной агар и инкубировали в контейнере Сак-Рак в течение 24 ч при 37°С. Выраставшие колонии определяли общепринятыми бактериологическими способами.

В пределах 4 ч проводили вскрытие погибших животных и регистрировали причины смерти. Используя описанную ранее в заявке таблицу 1. для каждого животного через 24 ч после повреждения рассчитывали совокупную балльную оценку спаек. а затем вычисляли среднюю величину для группы (представлено графически на фиг. 2). В частности. средняя общая балльная оценка для группы 1 составляла приблизительно 10. тогда как средняя общая балльная оценка для группы 2 составляла приблизительно

6. В целом. животные. получавшие карбамилированный ЕРО по настоящему изобретению. имели меньше спаек. чем животные. получавшие физиологический раствор.

Балльная оценка заболевания

Балльную оценку заболевания рассчитывали. как описано ранее в заявке в табл. 2. а результаты представлены графически на фиг. 3. В частности. через одни сутки после обработки средняя балльная оценка заболевания для животных группы 1 составляла приблизительно 9 по сравнению со средней балльной оценкой для животных группы 2. составлявшей приблизительно 3. Через 5 суток средняя балльная оценка заболевания для животных группы 1 составляла приблизительно 12. тогда как для животных группы 2 средняя балльная оценка заболевания составляла приблизительно 5 или менее.

Рубцевание

Также крыс зрительно проверяли на предмет рубцевания после разрезов. Рубцевание у крыс группы 2 было меньшим. чем у крыс группы 1.

Пример 2. Слепое исследование с использованием модели сепсиса брюшной полости на крысе

Слепую кишку крыс 8ртадие Оа\\'1еу подвергали воздействию. накладывали на нее лигатуру немного дистальнее илеоцекального клапана для предотвращения непроходимости кишечника. дважды прокалывали иглой 18-номера. осторожно сжимали для выдавливания незначительного количества фекалий. а затем возвращали в брюшную полость (фекалии вводили в брюшную полость. что вызывало инфицирование). Брюшную полость зашивали шелковой хирургической нитью 3-0.

Животных подразделяли на три группы:

Группа 1. Подвергаемые вскрытию. как описано выше. но без индуцированного сепсиса (п=6).

Группа 2. С индуцированным сепсисом. обрабатываемые физиологическим раствором (п=8). Во время наложения лигатуры животным из группы 2 внутривенно вводили 100 мкл физиологического раствора. Затем в течение 8 суток (или до гибели) проводили ежесуточное введение подкожно физиологического раствора (100 мкл).

- 18 010650

Группа 3. С индуцированным сепсисом, обрабатываемые карбамилированным ЕРО (п=8). Во время наложения лигатуры животным внутривенно вводили 10 мкг/кг карбамилированного ЕРО в 100 мкл физиологического раствора. Затем в течение 8 суток (или до гибели) проводили ежесуточную обработку подкожно в количестве дозы 10 мкг/кг в 100 мкл физиологического раствора.

Совокупная балльная оценка спаек

Для аэробной и анаэробной культур образцы получали из жидкости брюшной полости и абсцессов. Для аэробной культуры образцы инкубировали на кровяном агаре ЕМВ в течение 24 ч при 37°С. Для анаэробной культуры образцы наслаивали на анаэробный кровяной агар и инкубировали в контейнере Сах-Бак в течение 24 ч при 37°С. Выраставшие колонии определяли общепринятыми бактериологическими способами.

В пределах 4 ч проводили вскрытие погибших животных и регистрировали причины смерти. Используя описанную ранее в заявке табл. 1, для каждого животного через 24 ч после повреждения рассчитывали совокупную балльную оценку спаек, а затем вычисляли среднюю величину для группы (представлено графически на фиг. 4). В частности, средняя общая балльная оценка для групп 1, 2 и 3 составляла менее чем приблизительно 2, приблизительно 10 и приблизительно 6, соответственно. Таким образом, животные, получавшие карбамилированный ЕРО по настоящему изобретению, имели меньше спаек, чем животные, получавшие физиологический раствор.

Исследование фактора некроза опухолей

В целях определения принципа действия, лежащего в основе способности карбамилированного ЕРО снижать образование спаек, для каждой группы исследовали присутствующий в крови животных после периода времени уровень фактора некроза опухолей (ΤΝΡ), используя ΕΠ8Α из Β&Ό ЗуЧетх (#ВТА00), способный регистрировать ΤΝΡ-альфа крысы. Как показано на фиг. 5, разница в количестве ΤΝΡ после 24 ч достоверно не отличалась между тремя группами. Через три часа (пик воспаления) количество ΤΝΡ в системе снижалось для всех трех групп. Эти результаты позволяют предположить, что принятый механизм, лежащий в основе образования спаек, то есть воспалительная реакция, может не представлять собой правильный механизм. На самом деле, исследование ΤΝΡ позволяет предположить, что лежащий в основе образования спаек механизм может быть обусловлен гибелью клеток, и, поскольку карбамилированный ЕРО по настоящему изобретению обладает защищающей ткань функцией, то после введения образование спаек может снижаться вследствие снижения некроза клеток.

Рубцевание

По зрительному наблюдению рубцевание у крыс в группе 3 было значительно меньшим, чем в группах 1 и 2.

Пример 3. Слепое исследование с использованием модели сепсиса брюшной полости

Слепую кишку крыс 8ргадие Оа\\'1еу подвергали воздействию, накладывали на нее лигатуру немного дистальнее илеоцекального клапана для предотвращения непроходимости кишечника, дважды прокалывали иглой 18-номера, осторожно сжимали для выдавливания незначительного количества фекалий, а затем возвращали в брюшную полость (фекалии вводили в брюшную полость, что вызывало инфицирование). Брюшную полость зашивали шелковой хирургической нитью 3-0.

Животных подразделяли на четыре группы:

Группа 1. Подвергаемые вскрытию, как описано выше, но без индуцированного сепсиса (п=6).

Группа 2. С индуцированным сепсисом, обрабатываемые физиологическим раствором (п=8). Во время наложения лигатуры животным из группы 2 внутривенно вводили 100 мкл физиологического раствора. Затем проводили ежесуточное введение подкожно физиологического раствора (100 мкл) в течение 8 суток (или до гибели).

Группа 3. С индуцированным сепсисом, обрабатываемые гйи-ЕРО (п=8). Во время наложения лигатуры животным внутривенно вводили 10 мкг/кг ιΊπι-ΕΡΟ в 100 мкл физиологического раствора. Затем в течение 8 суток (или до гибели) проводили ежесуточную обработку подкожно в количестве дозы 10 мкг/кг в 100 мкл физиологического раствора.

Группа 4. С индуцированным сепсисом, обрабатываемые карбамилированным ЕРО (п=8). Во время наложения лигатуры животным внутривенно вводили 10 мкг/кг карбамилированного ЕРО в 100 мкл физиологического раствора. Затем в течение 8 суток (или до гибели) проводили ежесуточную обработку подкожно в количестве дозы 10 мкг/кг в 100 мкл физиологического раствора.

Заболеваемость и смертность

Через одни сутки после наложения лигатуры в группе 1 (плацебо) выживали все животные, тогда как в группе 2 не выживало ни одно животное. В группе 3 (гйи-ΕΡΟ) выживали только 2 животных по сравнению с 5 животными в группе 4. Таким образом, выживаемость животных, получавших карбамилированный ЕРО по настоящему изобретению, была значительно выше, чем животных, получавших физиологический раствор или гйи-ΕΡΟ.

Рубцевание

По зрительному наблюдению рубцевание у крыс в группе 4 было значительно меньшим, чем в группах 1-3.

- 19 010650

Пример 4. Вызываемая липополисахаридом реакция у крыс

Цель этого примера состояла в определении эффективности карбамилированного эритропоэтина при сходных с сепсисом симптомах, вызванных липополисахаридом (ЬР8). ЬР8 представляет собой эндотоксин, присутствующий на поверхности бактерии, который вызывает у животных сходную с сепсисом реакцию (повышение внутренней температуры и индукцию цитокинов). Самцам крыс 8ргадис/Оа\\'1су (300-350 г) вводили внутрибрюшинно 240 мкг/кг. Затем животных обрабатывали физиологическим раствором (п=6) или карбамилированным эритропоэтином (п=6) в количестве 10 мкг/кг внутривенно. Затем определяли зависящее от концентрации воздействие ЬР8 на внутреннюю температуру организма. Альтернативно, для определения, дифференцированно ли изменяет внутреннюю температуру способ введения, осуществляли прямое внутрижелудочковое введение (8ее1еу е! а1, (1996) Ногт Ме!аЬ Век. 28:664-8.) карбамилированного эритропоэтина (5 мкг/кг в 2 мкл). Внутреннюю температуру наблюдают в течение первых 24 ч. В некоторых случаях удаляли кровь для последующего анализа цитокина (например, ΤΝΡ, 1Ь-6). 8ее1еу е! а1, (1996) Ногт Ме!аЬ Век. 28:664-8.

Внутренняя температура

Животные, которым вводят ЬР8, испытывают двухфазную лихорадку как звено сходных с сепсисом состояний, вызываемых ЬР8. Первая фаза лихорадки характеризуется четко выраженным повышением температуры, сопровождающимся повышением кровяного давления и бессонницей у пораженного заболеванием индивидуума. Тогда как вторая фаза лихорадки выражена менее четко и сопровождается или нормотензией, или гипотензией, а также апатичностью и сонливостью. Теоретически предполагают, что фазы лихорадки представляют собой смену стратегии, применяемой организмом для борьбы с заболеванием. (Вотапоукку е! а1., Ат. 1. Ркукю1, 271:В244-В253, 1996). В настоящем примере введение карбамилированного ЕРО животным, обработанным ЬР8, приводило к ослаблению обоих фаз лихорадки, как показано на фиг. 6.

Уровни ΤΝΕ и 1Ь-6 в сыворотке

Способность карбамилированного эритропоэтина опосредовать температурную реакцию на ЬР8 дополнительно согласовывалась с его способностью подавлять наличие таких пирогенных цитокинов, как ΤΝΕ и 1Ь-6, как показано на фиг. 7(а) и фиг. 7(Ь). Для определения наличия ΤΝΕ и 1Ь-6 в образцах сыворотки крыс использовали ЕЫ8А. На обеих фиг. 7(а) и 7(Ь) показано, что обработка карбамилированным эритропоэтином значительно снижала наличие провоспалительных цитокинов 1Ь-6 и ΤΝΕ.

Периферическое введение карбамилированного эритропоэтина по сравнению с центральным

Для исключения прямого воздействия карбамилированного эритропоэтина на гипоталамус карбамилированный эритропоэтин вводили внутрижелудочково указанным выше способом. Как показано на фиг. 8(а) и фиг. 8(Ь), не наблюдали взаимосвязи в отношении снижения внутренней температуры между периферическим и центральным введением карбамилированного эритропоэтина. Учитывая эти результаты, а также эффекты карбамилированного эритропоэтина на пирогенные цитокины, предполагают, что карбамилированный эритропоэтин воздействует на внутреннюю температуру через подавление пирогенных цитокинов. Это позволяет предположить, что такие защищающие ткань цитокины, как карбамилированный эритропоэтин, пригодны для опосредования, благоприятного воздействия или предотвращения эффектов этих цитокинов при хронических заболеваниях (истощение, апатичность, анемия и т.д.)

Пример 5. Влияние аналогов эритропоэтина на ишемическое повреждение кожного лоскута у крыс

Для определения влияния карбамилированного эритропоэтина на заживление раны ишемизированного кожного лоскута получали модель раны ишемизированного кожного лоскута. Самцов крыс 8ргащ.1е/Оа\\'1еу (300-350 г) обезболивали, используя изофлуран. На спине у крысы вырезали лоскут кожи длиной 9 см и шириной 3 см. Лоскут включал в себя кожу, подкожный слой и поверхностную кожную мускулатуру. После разреза лоскут поднимали, а затем немедленно зашивали обратно в его ложе, как описано (Виет1, М., е! а1., (2002) Ас!а Эегт. Уепегео1. 82:411-417; 8агаи, А., е! а1., (2003) Ьагупдоксоре. 113:85-89). Животные получали дозы (0,3 мкг/кг, подкожно) аналога эритропоэтина, карбамилированного ЕРО, непосредственно после хирургического вмешательства, 1-х, 2-х суток, а затем дважды в неделю в течение анализа. Еженедельно животных взвешивали и фотографировали рану. Виет1, М., е! а1., (2002) Ас!а Эегт. Уепегео1. 82:411-417. Затем проводили количественную оценку заживленной площади раны на основе фотографий животных, полученных по истечении 34 суток после процедуры. Как показано на фиг. 9, крысы, получавшие карбамилированный эритропоэтин, имели больший процент заживления раны, чем крысы, обрабатываемые физиологическим раствором в течение того же периода времени.

Описанные здесь конкретные варианты осуществления не ограничивают объем описанного и заявленного здесь изобретения, поскольку эти варианты осуществления предложены в качестве иллюстраций нескольких аспектов изобретения. В частности, специалист в этой области понимает, что, хотя указанные выше примеры выполняли, применяя карбамилированный ЕРО, сходных результатов ожидают от любого из защищающих ткань цитокинов по настоящему изобретению. Подразумевают, что любые эквивалентные варианты осуществления входят в объем этого изобретения. Фактически, различные варианты изобретения, кроме представленных и описанных здесь, будут очевидны специалисту в этой области из указанного выше описания. Подразумевают, что такие варианты также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все патенты и патентные заявки, которые цитируют в приведенном выше тексте,

- 20 010650 в явной форме приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Claims (30)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения, профилактики, задержки наступления или снижения сепсиса у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества по крайней мере одного химически модифицированного или мутированного эритропоэтина и фармацевтического носителя.
2. 2. Способ по п.1, где указанный сепсис не распространился до септического шока.
3. 3. Способ ускорения заживления раны у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтического эффективного количества по крайней мере одного химически модифицированного или мутированного эритропоэтина и фармацевтического носителя.
4. 4. Способ по п.3, где рана возникла в результате одного или нескольких следующих состояний: травмы, хирургической операции, сдавления, ожога, диабета или сосудистой недостаточности.
5. 5. Способ лечения, профилактики, задержки наступления или снижения абдоминального сепсиса, образования спаек, патологических фиброзных тяжей, образования соединений между органами, рубцевания; воспалительных состояний простаты, мочеполового тракта или висцеральной гладкой мускулатуры в результате грибковой инфекции; лихорадки, истощения, апатичности, отека, резистентности к инсулину или состояния, связанного с повышением ГБ-6, у млекопитающих, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного эритропоэтина, который необязательно химически модифицирован или мутирован, и фармацевтического носителя.
6. 6. Способ по п.5, где спайка возникла в результате хирургической операции, травмы, инфекции, химиотерапии, радиации или кесаревого сечения.
7. 7. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где у указанного эритропоэтина отсутствуют или снижены по крайней мере один или несколько эритропоэтических эффектов эритропоэтина.
8. 8. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где химически модифицированный или мутированный эритропоэтин обладает по крайней мере одной из следующих модификаций по сравнению с природной молекулой эритропоэтина:

   ί) имеет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 молекул сиаловой кислоты;

   ίί) имеет сниженное число Ν-связанных или О-связанных углеводов;

   ϊϊΐ) имеет пониженное количество углеводов;

   ίν) имеет один или несколько окисленных углеводов;

   ν) имеет один или несколько окисленных углеводов, и который также является химически восстановленным;

   νί) имеет один или несколько остатков модифицированного аргинина;

   νίί) имеет один или несколько остатков модифицированного лизина или у которого модифицирована Ν-концевая аминогруппа;

   νίίί) имеет один или несколько остатков модифицированного тирозина;

   ίχ) имеет один или несколько остатков модифицированной аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты;

   х) имеет один или несколько остатков модифицированного триптофана;

   χί) удалена одна или несколько аминогрупп;

   χίί) имеет одну или несколько свободных связей цистина;

   χίίί) укорочена.
9. 9. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где химически модифицированный или мутированный эритропоэтин имеет одну или несколько следующих мутаций: С78, В101, У118, Ь12А, Е13А, В14А, В14В, В14Е, В14ф, У15А, Υ15Ρ, Υ15Ι, К20А, К20Е, Е21А, С298, С29У, С338, С33У, Ρ42Ν, Т441, К45А, Κ45Ό, У46А, №7А, Р48А, Ρ48Ι, У49А, Υ498, №51Р, №51Ν, φ59Ν, Е62Т, Ь678, Ь70А, И96В, К97И, 8100В, 8100Е, 8100А, 8100Т, 6101А, 6101Ι, Б102А, В103А, 8104А, 8104Ι, Б105А, Т106А, Т1061, Т107А, Т107Б, Б108К, Б108А, 8126А, Ρ142Ι, В143А, 8146А, М47К, Ш47А, Ρ148Υ, Б149А, В150А, 6151А, К152А, Б153А, Б155А, А1608, КА, С7А, В13А, №4К, А30Н Н32Т, №8К ^3К, Р42А, И43А, К52А, К97А, К116А, Т132А, И33А, Т134А, К140А, Р148А, В150В, 6151А, К152№, К154А, 6158А, С161А и/или В162А.
10. 10. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где химически модифицированный или мутированный эритропоэтин содержит по крайней мере одну из следующих мутаций: В14ф, 8100Е, В103А и/или В150Е.
11. 11. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где химически модифицированный или мутированный эритропоэтин содержит по крайней мере одну из следующих комбинаций мутаций: К49И/8100Е или К49И/К150Е или В103Е/Б1088.
12. 12. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где химически модифицированный или мутированный эритропоэтин не имеет эритропоэтических эффектов.
13. 13. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, где указанный эритропоэтин является карбамилированным.
14. 14. Способ по п.13, причем указанный карбамилированный эритропоэтин представляет собой альфа-№карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин.

    - 21 010650
15. 15. Способ по п.13, причем указанный карбамилированный эритропоэтин имеет по меньшей мере 90% карбамилированных сайтов, 95% карбамилированных сайтов или 100% карбамилированных сайтов.
16. 16. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, причем к указанному эритропоэтину присоединена по крайней мере одна полиэтиленгликолевая группа.
17. 17. Способ лечения, профилактики, задержки наступления или снижения тяжести состояния, связанного с эффектами противоспалительных цитокинов или с противовоспалительными цитокинами, у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества по крайней мере одного химически модифицированного или мутированного эритропоэтина, причем к указанному эритропоэтину присоединена по крайней мере одна полиэтиленгликолевая группа, и фармацевтического носителя.
18. 18. Способ по п.17, где указанный эритропоэтин также карбамилирован.
19. 19. Способ по п.18, где указанный карбамилированный эритопоэтин представляет собой альфа-Νкабамоил, Ν-эписилон-карбамоилэритропоэтин.
20. 20. Способ по п.18, причем указанный карбамилированный эритропоэтин имеет по меньшей мере 90% карбамилированных сайтов, 95% карбамилированных сайтов или 100% карбамилированных сайтов.
21. 21. Способ по любому из пп.1, 3, 5 или 17, где карбамилированный эритропоэтин имеет по меньшей мере шесть карбамилированных остатков лизина, по меньшей мере семь карбамилированных остатков лизина или по меньшей мере восемь карбамилированных остатков лизина.
22. 22. Способ по п.17, где противовоспалительный цитокин включает по меньшей мере интерлейкин или ΤΝΡ.
23. 23. Способ по п.17, где состоянием, связанным с противовоспалительными цитокинами, является ишемическое заболевание, аллергия, ревматическое заболевание или инфекция.
24. 24. Способ лечения состояния, связанного с противовоспалительными цитокинами, у млекопитающего со сниженными уровнями гематокрита, включающий введение терапевтической дозы эритропоэтина, где указанная доза является достаточной для восстановления гематокрита у указанного млекопитающего, и введение терапевтической дозы химически модифицированного или мутированного эритропоэтина.
25. 25. Способ по п.24, где указанным состоянием является анемия.
26. 26. Способ по п.25, где указанная анемия связана с раком или другим хроническим заболеванием.
27. 27. Фармацевтическая композиция, содержащая количество по крайней мере одного эритропоэтина, химически модифицированного или мутированного эритропоэтина, эффективного для применения в способе по любому из пп.1 или 5.
28. 28. Фармацевтическая композиция по п.27, в которой (ί) у эритропоэтина отсутствует или снижен по меньшей мере один эритропоэтиновый эффект эритропоэтина;

    (ίί) к эритропоэтину присоединена по меньшей мере одна полиэтиленгликолевая молекула или (ίίί) эритропоэтин является карбамилированным.
29. 29. Фармацевтическая композиция по п.27, где указанный эритропоэтин представляет собой альфаΝ-карбамоил, Ν-эпсилон-карбамоилэритропоэтин.
30. 30. Способ тестирования химически модифицированного или мутированного эритропоэтина на возможность лечения, профилактики, задержки наступления или снижения осложнений после сепсиса, спаечного процесса или воспаления в результате инфекции, включающий:

    (ί) индукцию сепсиса, спаечного процесса и воспаления, или их сочетаний, у млекопитающего;

    (ίί) введение указанному млекопитающему тестируемого эритропоэтина и (ίίί) определение баллов спаечного процесса или баллов заболевания у млекопитающего, где в случае, если баллы спаечного процесса или баллы заболевания, определяемые на стадии (ίίί), меньше баллов спаечного процесса или баллов заболевания в отсутствии эритропоэтина, то указанный эритропоэтин считают эффективным для лечения, профилактики, задержки наступления или снижения осложнений после сепсиса, спаечного процесса или воспаления в результате инфекции.