JP3062583B2 - ヒトエリスロポイエチンの変異体、それらの調製および使用 - Google Patents

ヒトエリスロポイエチンの変異体、それらの調製および使用

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Description

【発明の詳細な説明】 ＜発明の利用分野＞ 本発明は、組換えDNA技術によって調製され、ヒト野
性型エリスロポイエチン（EPO）と較べて有利な性質を
有する、ヒトエリスロポイエチンの変異体に関する。
＜発明の背景＞ 成熟ヒトエリスロポイエチンは、分子量34〜38kDを有
する糖タンパク質である。成熟タンパク質は、166個の
アミノ酸からなり、分子量のグリコシル残基の割合は約
40％である（Jacobsら:Nature 313、806−809、1985、D
ordalら:Endocrinology 116、2293−2299、1985）。
EPOの生物学的機能は、赤血球の供給を保証すること
である。そのことによって、EPOは、赤血球前駆細胞に
おける分化過程および分裂過程を刺激する。
ヒトエリスロポイエチンの遺伝子は、胎児肝臓遺伝子
バンクから単離され、特徴づけされており、1985年以来
遺伝子工学における研究用に入手することができる（Ja
cobsら、前出）。エリスロポイエチンは、組換えDNA技
術を利用して動物細胞において発現されることができ、
とりわけ、腎性貧血の治療を可能にする。野性型EPOを
用いた最初の治療の試みでは、治療した患者の成功率は
確かに非常に高かったが、また、血圧や血液粘性で限界
に達する症例もいくつか認められた。したがって、ヘマ
トクリット、ヘモグロビンおよび前駆細胞数（バースト
形成単位赤血球細胞、burst−forming unit erythroid
cells,BFU−Ｅ）の増加が何人かの患者ではきわめて著
しく、徐々の増加が望ましい。他の患者では、増加は、
少なすぎて、血液算定においてより顕著な増加が望まし
い。応答が乏しい患者に非生理的な投与量の増加を行う
と、誘発されると思われる免疫反応のために禁忌が起き
る。そのために、長期の治療はより困難にまたは不可能
とさえなる。
患者の異なる反応は、各々の場合で、EPO投与を調節
する個々の能力によるものである可能性が高い。したが
って、異なる患者ではEPOの治療には、各々異なるコー
スがある。
タンパク質部分の構造に加えて、分子の糖側鎖の構造
は、ホルモンと生体の相互作用においてとくに重要であ
る。例えば、脱シアル化（desialylated）EPOは、投与
後、動物において作用しない。これにもかかわらず、こ
れはリセプターに結合し、前駆細胞を刺激する。アシア
ロ−EPOのインビボの活性の損失は、脱シアル化EPOに接
近できるガラクトシル残基のための特異性を有するリセ
プターによる肝臓におけるこれの除去によって、説明づ
けることができる。完全に脱グリコシル化したEPOさえ
も、インビトロで標的細胞との結合活性を示すが、イン
ビボでは、未知の機序を介してより速く腎臓に排出され
る。リセプターとのEPO結合部位は、したがって、脱ブ
リコシル化によっては変わらない。しかし、インビボに
おける作用の低減は、完全なグリコシル化およびシアル
化は血液中の輸送、安定性および系（system）からの除
去速度に重要であることを示す。
何人かの患者においては、今日までに治療に用いてき
た野性型EPOによって血圧の上昇が起き、これは治療で
は欠点となる。EPOは血圧の調節に関与すると考えられ
る。したがって、これらマイナスの性質を有せず、しか
し、前駆細胞の分化および赤血球への分裂の速度を刺激
するようなEPOの生理的作用を有するタンパク質を有す
ることが望ましい。
巨核球（magakaryocyte）を刺激して血小板を形成す
るといった、さらなるEPOの副作用があらわれる患者も
ある。この場合、血栓の危険性は、EPOによる治療中に
もあり、治療は直ちに停止しなければならない。そこ
で、用いるエリスロポイエチンのより高い特異性が望ま
れる。
＜発明の具体的説明＞ 本発明に基づく目的は、エリスロポイエチンの変異体
を提供することである。これら変異体タンパク質は、患
者の各々の治療を可能にするために、増加したまたは減
少した生物学的活性（すなわち赤血球形成の刺激）を有
する。血圧上昇などの望ましくない副作用は起きない
か、またはごく限定されるべきである。
本発明者らは、カルボキシル末端領域（アミノ酸130
〜アミノ酸166）がEPOリセプターとの結合部位を含むこ
とを見出した。この領域の除去は生物学的活性の減少さ
らにが欠失をももたらし、陽性に荷電したアミノ酸の挿
入は生物学的活性の増加（すなわち前駆細胞からの赤血
球の形成の刺激）をもたらす。さらに、本発明者らは、
アミノ酸130〜160の領域（より正確にはアミノ酸142〜1
49の領域）にアンギオテンシンIIとの相同性があること
を見出した。この領域における変化はEPOの昇圧活性に
影響を及ぼす。
さらに、グリコシル化の減少によって赤血球形成の遅
延刺激をもたらす。
したがって、本発明は次のようなヒトEPOの変異体タ
ンパク質（muteins）に関する。
（１）野性型エリスロポイエチンと比較して、アミノ酸
10〜55、70〜85および130〜166の領域において少なくと
一つのアミノ酸の欠失および／または一つのアミノ酸の
挿入またはアミノ酸の置換、および／または少なくとも
一つのＮ−グリコシル化Asnのグリコシル化できないア
ミノ酸による置換および／またはSer 126のThrまたはGl
yによる置換を示し、その結果、野性型EPOと比較して次
の点で一つまたはそれ以上の変化した性質を有するヒト
エリスロピエイチンの変異体タンパク質。
（ａ）赤血球前駆細胞の刺激 （ｂ）インビボ半減期 （ｃ）血圧上昇 （ｄ）巨核細胞および非赤血球系（series）からの他の
前駆細胞の刺激 （ｅ）副作用、例えば、頭痛の発生、および （ｆ）エリスロポイエチンリセプターとの結合 （２）とくに、カルボキシル末端アミノ酸130〜166の領
域に挿入を有する変異体が含まれる。さらに、Arg166が
Gly166に置換された変異体またはカルボキシル末端に一
つまたはそれ以上の追加のアミノ酸、好ましくは塩基性
アミノ酸、が位置166に結合して含まれる変異体が好ま
しい。
（３）さらに、アミノ酸130〜166の領域に少なくとも一
つのアミノ酸置換を有する変異体がとくに好ましい。
（４）さらに、（１）の変異体であって、位置126のセ
リンがスレオニンまたはグリシンに置換されたもの、ま
たはグリコシル化できる少なくとも一つのアスパラギン
位置（ただしAsn38を除く）がグルタミンに置換された
もの、が好ましい。
また、本発明は、既に説明されたように、上記の変異
（mutations）のいくつかまたは全部を同時に示すEPO変
異体に関する。
最後に、本発明は、上記変異体の少なくとも一つを含
む医薬物および、さらに、赤血球の数および質の上昇ま
たは減少を目的とする治療、とくに腎性貧血の治療、に
おけるそれらの使用、に関する。
最後に、本発明は諸例および特許請求の範囲に含まれ
る通りである。
例 I.EPO変異体（mutants）の調製（一般的方法） １）EPO特異性オリゴヌクレオチドの合成 変異誘発性（mutagenic）オリゴヌクレオチドおよび
配列決定のためのプライマーをホスフェートトリエステ
ル法（Letsinger:J.Amer.Chem.Soc.97、3278、1975、
同:J.Amer.Chem.Soc.98、3655、1976）によって調製し
た。用いた変異誘発性オリゴヌクレオチドの例は表２に
示される通りである。
２）変異誘発性ベクター系へのEPOc−DNAのクローニン
グ エリスロポイエチンをコードする配列および、その
３′、SV40主要後期抗原のポリアデニル化（polyadenyl
ation）シグナルを含むSV40DNA断片を含む、1024bpのEc
oR I−BamH I断片を、ベクターpEPO782MTBPV（pCES、EP
−Ａ−267,678）から単離した。断片の単離は、プラス
ミドを制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで切断して、平滑
末端を得るために凹所末端をDNAポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片を用いて埋填して、行った。このように処理さ
れたプラスミドを、次いで制限酵素BamH Iで切断して、
アガローゲルからの溶出（Maniatisら:Molecular Cloni
ng−A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New Y
ork、1982）によって上記のDNA断片の単離が可能となっ
た。
次いで、断片を方向を定めて変異誘発性ベクターpMac
5−８（第１図）のポリリンカーにクローニングした。
このポリリンカーはSma I−BamH Iで切断しておいた。
このEPO野性型構築物をpMcE1と称した。
３）変異誘発 変異体（mutants）（表１）の調製において、変異を
含む合成オリゴヌクレオチド（表２）を変異誘発性ベク
ター系に、いわゆる「ギャップドデュプレックス（gapp
ed duplex）」DNAハイブリド分子（Morinagaら:Bio Tec
hnology 7、636−639、1984、Kramerら:Nucl.Acids Re
s.198、12、9441−9456）を介して導入した。この目的
のために、大腸菌WK6株に形質転換によって導入してお
いた変異誘発性ベクターpMcE1の一本鎖DNAを標準法によ
って単離した。pMa5−８からのプラスミドDNAをEcoR I
−BamH Iでポリンカー内で切断して、直線状にしたDNA
（3.8kb）をアガロースゲル（Maniatisら：前出）から
溶出した。
「ギャップドデュプレックス」DNAの調製のために、
0.1pmolの二本鎖断片（pMA5−８から）（第１図）およ
び0.5pmolの一本鎖DNA（pMcE1）（第１図）を12.5mMト
リス−HC1（pH7.5）＋190mM KCl（最終容量40μｌ）中
で100℃で４分間加熱して、次いで、65℃で10分間イン
キュベートした。８μｌの上記のハイブリダイゼーショ
ン溶液を４〜8pmol（２μｌ）の酵素的に燐酸化したオ
リゴヌクレオチドとともに65℃で５分間加熱して変異誘
発性オリゴヌクレオチドを先ずハイブリダイズして、次
いで、緩やかに室温まで冷却した。24μｌのH2O、４μ
ｌの10×埋填緩衝液（625mM KCl、275mMトリス−HCl（p
H7.5）、150mM MgCl2、20mM DTT、0.5mM ATPおよび各0.
25mMの四つのNTRs）、１μｌのT4 DNAリガーゼ（5U/μ
ｌ）および１μｌのDNAポリメラーッゼＩのクレノウ断
片（1U/μｌ）を添加の後、室温で45分間インキュベー
トした。次いで、５μｌの混合物を形質転換によってWK
6muts（mutS215:Tn10）に導入した。全形質転換混合物
をLB培地＋50μg/mlアンピシリン（10ml）の攪拌培養で
37℃で一晩増殖させた。プラスミドDNAを、全混合物か
ら標準法によって精製した（Maniatisら：前出）。
約20ngの精製プラスミドを、形質転換によってWK6細
菌に導入して、次いで、選択を50μg/mlのアンピシリン
を含むLBプレート上で行った。これらの変異体のいくつ
かを、適当な配列反応（Ｃ−、Ｔ−、Ａ−またはＧ−特
異性）によって所望の変異についておおまかに先ず分析
した。陽性のクローンを、変異誘発の領域についての詳
細な配列分析（F.Sangerら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
4、5463−5467、1977）によって確認した。変異したEPO
配列を含むプラスミドをpMaE2、pMaE3...pMaEn（第１
図）と称した。
４）EPOおよびEPO変異体（mutants）のための発現ベク
ターの構築 発現ベクターpABL1（第２図）を、発現ベクターpAB3
−１（Zettlmeisslら:Behring lnst.Mitt.82、26−34、
1988）から抗トロンビンIIIをコードする断片およびSV4
0の初期ポリアデニル化部位を含む断片を制限酵素Hind
IIIおよびBamH Iを用いて切断して除去すること、およ
び断片を次の配列のポリリンカーで置き換えること、に
よって調製した。
次いで、同様にポリリンカーのEcoR IおよびBamH I切
断部位を介して、変異誘発前（E1、EPO野生型）または
変異誘発後（E2−En、EPO変異体）にEcoR I−BamH Iを
用いて変異誘発性ベクター系から切断しておいた発現ベ
クターpABL1断片ヘクローニングすることも可能となっ
た。得られたEPO発現プラスミドをpABE1、pABE2、...pA
BEn（第２図）と称した。
５）動物細胞のトランスフェクションおよび二重選択 BHK21細胞（幼若ハムスター腎臓）（ATCCCCL10）を、
EPOコード発現ベクターpABE1、pABE2...pABEn（第２
図）でトランスフェクトさせた。トランスフェクション
のために、細胞を10％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改
変イーグル培地（DMEM）中で増殖させた。修飾燐酸カル
シウム法（Grahamおよびvan der Eb:Virology 52、456
−467、1973）によって、細胞を50〜70％コンフルエン
トにトランスフェクトさせた。
発現ベクターを、動物細胞中で発現され得るマウスジ
ヒドロフォレートレダクターゼ（dhfr）遺伝子を含むプ
ラスミドpSV2 dhfr（Leeら:Nature（London）294、228
−232、1981）と、動物細胞中で発現され得るグネチシ
ン（geneticin）耐性を含むプラスミドpRMH140（Hudzia
kら:Cell 31、137−146、1982）とで共トランスフェク
ト（cotransfect）させた。この系によって、メトトレ
キサート（methotrexat）（1mM）およびゲネチシン（G4
18、400μg/ml）による二重選択ができ、細胞性ゲノム
（Zettlmeisslら：前出）に取り込まれたプラスミドDNA
の増殖が可能になる。
６）発現細胞の培養上清からのEPOおよびEPO変異体（mu
teins）の免疫学的検出EPOに対する抗血清の調製 精製EPOに対する抗体を、ウサギで産生させた。この
目的のために、EPOをグルタールジアアルデヒドを用い
て鍵穴アオガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocya
nine、KLH）と結合させて、アジュバントとの乳濁液を
調製して、免疫化に用いた。血清は標準法によって得
た。エリスロポイエチン測定のためラジオイムノアッッ
セイ この試験は、細胞培養上清中およびホルモンの異なる
精製段階からのサンプル中の組換えEPOの定量的決定に
用いられる。これは、競合的ラジオイムノアッセイの二
−抗体変種（two−antibodiesvariant）に基づく（C.N.
HalesおよびP.J.Randle:Biochem.J.、88、137、198
3）。
サンプルまたは較正物質（calibration material）
を、予め決定した量の125I EPOおよび抗−EPOウサギ抗
血清とともに４℃で24時間インキュベートして、次い
で、ヤギ抗−ウサギIgGと４℃でさらに18時間インキュ
ベートして、抗体によって結合された125I EPOを分別し
た。沈澱を、遠心分離によって分離して、各々500μｌ
の緩衝液で２回洗浄して、自動ガンマ分光光度計のガン
マチャンネルで測定した。系は、沈澱を促進するために
プールしたウサギ正常血清を含んだ。評価は、較正物質
の一連の希釈物との比較を較正曲線を用いて行った。較
正曲線は、放射能の結合（％）を較正物質の濃度の十進
（decimal）対数に対してプロットしたものである。125
I EPOを、二相（two−phase）クロラミン−Ｔ法（F.Tej
edorおよびJ.P.G.Ballesta:Anal.Biochem.127、143−14
9、1982）を用いてヨウ素放射性ラベルによって精製EPO
から得て、取り込まれなかったヨウ素をゲルクロマアト
グラフィーで除去した。抗EPO血清を1:3300の割合で予
め希釈して、抗ウサギ1gG血清を150倍に希釈した。BCA
法（P.K.Smith:Anal.Biochem.150、76−85、1985）を用
いてタンパク質含有量を決定した精製組換えヒトEPOか
らの研究用標準物質を、較正物質として用いた。全EPO
分子に対する抗血清の使用によって、EPO変異体の検出
もまた保証された。
EPO産生細胞クローンの同定のための酵素イムノアッセ
イ ELISA/ドットブロット試験系を、EPO産生細胞系の迅
速なスクリーニング（希釈を必要としない）のために開
発した。200μｌの培養上清をニトロセルロースに吸わ
せる。フィルターを0.5％BSAのPBS（pH7.0）で37℃で30
分間飽和させて、次いで、1:1000に希釈した抗EPOウサ
ギ抗血清とともに一晩インキュベートした。フィルター
をPBS−0.05％Tweenで洗浄して、次いで、アルカリホス
ファターゼと結合させたヤギ抗ウサギIg抗血清とともに
２時間イキュベートした。さらに0.05％TWeenのPBS（pH
7.0）および0.2Mトリス−HCl（pH9.5）およびさらに1M
トリス−HCl（pH9.5）で洗浄した後に、ｐ−ニトロブル
ーテトラゾリウムクロリド水和物および５−ブロモ−４
−クロロインドリル燐酸のｐ−トルイジン塩を基質とし
て加えた。20分後、水を加えて反応を停止させる。試験
は、100ng EPO/mlよりも多量のEPOの検出に適してい
る。C127細胞（EP−Ａ−267,678）からの精製組換えEPO
を、較正物質として用いた。
７）トランスフェクトされた安定な発現細胞の培養上清
からのEPOおよびEPO変異体の生物学的活性の検出 インビボバイオアッセイ Behringwerke AG（Marburg、独国）の動物飼育からの
NMRIマウスを無作為に群別して、異なる投与量のEPOま
たはEPO変異体（mutein）を１日２回５日間続けて腹腔
内に注射した。対照動物を、PBS、細胞培養培地またはB
HK細胞の細胞培養上清で処理した。C127細胞（EP−Ａ−
267,678）からの精製組換えEPOを、較正物質として用い
た。血液学的試験を、最初のEPO投与の注射後０日から2
2日までの数回行った。試験は、ヘマトクリット、ヘモ
グロビン含有量および末稍血中の網状赤血球の数を含
む。
インビトロバイオアッセイ 雌NMRIマウスに、フェニルヒドラジンハイポクロリド
（60mg/ml）を２日続けて注射した。最後の注射から48
時間後、脾臓を切開して、単一細胞（single−cell）懸
濁液を調製した。これら細胞から赤血球前駆細胞をフィ
コール勾配（Ｄ＝1.077）を介して濃厚富化した。勾配
の界面を集めて、20mlのPBSで２回洗浄して、DMEMに再
懸濁させて、細胞を数えた。EPOおよびEPO変異体サンプ
ルを希釈して、20μｌの各希釈物をマイクロタイタープ
レート中の各々80μｌの脾臓細胞懸濁液（３×105細胞
／ウエル）に加えた。加湿した５％CO2の雰囲気下で22
時間インキュベートした後、20μｌのDMEMに溶かした１
μCiのメチル−3H−チミジンを各々のウェルに加えた。
細胞を３時間ラベルして、次いで、3Hの取り込みをTRI
−CARB6660液体シンチレーションカウンター中で測定し
た（Krystalら:J.Exp.Hematol.11、649）。較正物質
は、PBS、培地およびC127細胞（EP−Ａ−267,678）から
の精製組換えEPOであった。
８）トランスフェクトされたBHK細胞の混合クローンか
らの、EPO−およびEPO−変異体−産生細胞クローンの単
離 トランスフェクションおよび二重選択後の80〜100個
の単一クローンのプールに由来する混合BHKクローン
を、イムノアッセイおよびバイオアッセイを用いてEPO
またはEPO変異体の分泌について試験した。陽性の混合
クローンは、100ng〜１μｇのEPOまたはEPO変異体を産
生した。限定希釈工程によるクローニングの後、１〜10
μｇのEPOまたはEPO変異体を産生する単一細胞クローン
を得ることが可能であった。より少ないEPOまたはEPO変
異体を産生する混合クローンにおける匹敵できるEPO産
生は、メトトレキサートを用いる増幅選択によって達成
することができた。これら非精製調製物からのインビト
ロの生物学的活性（RIAまたはELISAで標準化）は、精製
EPO画分における活性（100U/μｇ〜200U/μｇ）に匹敵
する。変異体は、rhuEPO−WTと比較して、異なるインビ
ボ生物学的活性を示す（第３および４図）。より多量の
細胞培養上清を調製するために、単一クローンをローラ
ー瓶で培養できるようになるまで広げた。細胞の増殖
は、血清を含む培地（DMEM）でコンフルエントになるま
で行った。次いで、培地を無血清培地（DMEM）に変え
た。無血清培地での培養の３日後に、培養上清を集め
た。メトトレキサートを用いる増幅選択によってより少
ないEPOまたはEPO変異体を産生する混合細胞クローンに
おいて匹敵するEPO産生を達成することが可能であっ
た。
II.特異的変異体（muteins）（名称は表１を参照された
い） 1.変異体（Mutein）EPO3 僅かに変化したのみで、したがって野性型EPOと非常
に似た生物学的性質を有しているエリスロボイエチン変
異体（mutein）を得るために、カルボキシル末端アルギ
ニン166をグリシンで置換した。詳細な構造分析におい
て、ともかく、組換えEPOおよび尿から単離された野性
型EPOのいずれにおいてもアルギニン166が欠失している
ことが示すことができた。したがって、生理的に活性な
EPOはおそらくdes−Arg−166EPO（M.A.Recnyら:J.Biol.
Chem.262、（35）17156−63、1987）である。変異体EPO
3は、SDSポリアクリルアミドゲル（SDS−PAゲル）で野
性型EPO（34〜38kD）と同じ永動的挙動を示し、インビ
ボバイオアッセイにおいて、野性型分子と識別できない
機能的性質を示す（第３および４図）。全ての混合クロ
ーンは、変異体を産生して、単一クローンを単離するこ
とができ、産生は7.5μg/ml106細胞/24時間であった。
種々の細胞クローンの発現率は、実質的には野性型EPO
産生細胞クローンに比較して高かった。
2.変異体EPO7 Asn24のＮ−グリコシル化部位をGln24による置換で除
去した。変異体（mutant）は、野性型EPOとSDS−PAゲル
で34kDと38kDとの間で同じ泳動的挙動を示す。生物学的
インビボ試験において網状赤血球の増殖の遅延刺激が認
められる（第３および４図）。全ての混合EPO7クローン
は、変異体（mutein）を産生して、単一クローンを単離
することができ、産生は3.1μg/ml/106細胞/24時間であ
った。
3.変異体EPO10 EPOはまた、Ｏ−グリコシル化部位をアミノ酸Ser126
に含む。Ser126がThR126で置換されると、SDS−PAゲル
で数個のバンドが形成される。その全ては本来のEPOよ
りも低い分子量（30kD〜25kD）を有している。これは異
種の（heterogeneous）グリコシル化パターンによるも
のかも知れない。スレオニンもまたＯ−グリコシル化さ
れ得るが、しかし、この例では本来のエリスロポイエチ
ンにおけるセリンと異なる形でＯ−グリコシル化されて
いるようである。網状赤血球増殖のインビボ刺激および
ヘマトクリットおよびヘモグロビン含有量の増加は、上
記の例のように遅延する（第３および４図）。しかし、
動力学（kinetics）の研究によれば、あたかも網状赤血
球貯蔵がEPOまたは他の変異体よりも速やかに枯渇する
ようである。全ての混合形質転換体クローンは、変異体
EPO10を産生して、単一クローンを単離することがで
き、培地への分泌は2.8μg/ml/106細胞/24時間であっ
た。
4.変異体EPO44a、44bおよび45 EPOは、アミノ酸142〜149の領域においてアンギオテ
ンシンIIとの相同性を有する。アンギオテンシンは、レ
ニン−アンギオテンシン系を介して体内で形成され、血
圧上昇をもたらす血管収縮作用を生じさせる。高血圧を
起こさない、したがって、また高血圧症の患者に用い得
る変異体は、この領域のアミノ酸を置換することによっ
て調製される。さらに、血圧上昇によって起きる頭痛な
どの副作用が起きない。
5.変異体2b、2c、2d1、2d2,2e、2f、4a、4b、5a、5b、6
aおよび6b カルボキシル末端領域における塩基性アミノ酸の添加
によって、EPOの生物学的活性は上昇する（インビボで
の網状赤血球の形成の増加、網状赤血球貯蔵の増進）。
欠失はEPOの活性を低減させる。
【図面の簡単な説明】
第1a図は、変異誘発性ベクターpMac5−８の構築を図示
する、説明図である。 第1b図は、変異したEPO配列を含むプラスミドの構築を
図示する、説明図である。 第2aおよび2b図は、EPO発現プラスミドの構築を図示す
る、説明図である。 第3a〜ｃ図は、EPO変異体の作用のインビボ試験の結果
を図示する、グラフ図である。 EPO変異体を含む濃縮細胞培養上清で処理しておいたNMR
Iマウスにおけるヘモグロビンおよびヘマトクリット値
および網状赤血球数を、測定した。測定は、処理後10日
目に行った。 C127iマウス細胞からの精製野生型EPO（EPOpur）を対照
として使用した。 Hb＝ヘモグロビン、Hk＝ヘマトクリット、 Re＝網状赤血球数 第4a〜ｃおよび5a〜ｃ図は、EPOおよびEPO変異体で処理
した後のNMRIマウスのヘモグロビンおよびヘマトクリッ
ト値および網状赤血球数のパターンを示す、グラフ図で
ある。精製EPO（EPOpur）または等量のEPO変異体を含む
濃縮培養上清を、処理していないNMRIマウスに第０日に
注射して、ヘモグロビンおよびヘマトクリット値および
網状赤血球数を測定した。処理後第５日〜第16日まで
は、異なる測定を異なる時間に行った。 Hb＝ヘモグロビン、Hk＝ヘマトクリット、 Re＝網状赤血球数
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特表 昭61−501627（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．263（33) ｐ．17516−17521（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】腎性貧血の治療用医薬物であって、Asn24
    がGln24で置換されたヒトエリスロポイエチンの変異体
    タンパク質を含んでなる医薬物。
  2. 【請求項２】赤血球数の増加および赤血球の質を増進す
    るための、請求項１に記載の腎性貧血の治療用医薬物。
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