JPH0372885A - ヒトエリスロポイエチンの変異体、それらの調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の利用分野〉 本発明ζよ、組換えＤＮＡ技術によって調製され、ヒト
野生型エリスロポイエチン（ＥＰＯ）と較べて有利な性
質を有する、ヒトエリスロポイエチンの変異体に関する
。

〈発明の背景〉 成熟ヒトエリスロポイエチンは、分子１１３４〜３８ｋ
Ｄを有する糖タンパク質である。成熟タンパク質は、１
６６個のアミノ酸からなり、分子量のグリコシル残基の
割合は約４０％である（　Ｊａｃｏｂｓら：　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３１３．８０６−８０９．１９８５、Ｄｏｒｄａ
ｔ　ら：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１６．２２９
３−２２９９．１９８５）。

ＥＰＯの生物学的機能は、赤血球の供給を保証すること
である。そのことによって、ＥＰＯは、赤血球前駆細胞
における分化過程および分裂過程を刺激する。

ヒトエリスロポイエチンの遺伝子は、胎児肝臓遺伝子バ
ンクから単離され、特徴づけされており、１９８５年以
来遺伝子工学における研究用に人手することができる（
　Ｊａｃｏｂｓら、前出）。エリスロポイエチンは、絹
換えＤＮＡ技術を利用して動物細胞において発現される
ことができ、とりわけ、腎性貧血の治療を可能にする。

野生型ＥＰＯを用いた最初の治療の試みでは、治療した
患者の成功率は確かに非常に高かったが、また、血圧や
血液粘性で限界に達する症例もいくつか認められた。し
たがって、ヘマトクリット、ヘモグロビンおよび前駆細
胞数（バースト形成単位赤血球細胞、ｂｕｒｓｔ−ｆｏ
ｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ　ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｃｅｌｌ
ｓ、　ＢＦＵ−Ｅ）の増加が何人かの患者ではきわめて
著しく、徐々の増加が望ましい。他の患者では、増加は
、少なすぎて、血液算定においてより顕著な増加が望ま
しい。応答が乏しい患者に非生理的な投与量の増加を行
うと、誘発されると思われる免疫反応のために禁忌が起
きる。そのために、長期の治療はより困難にまたは不可
能とさえなる。

患者の異なる反応は、各々の場合で、ＥＰＯ投与を調節
する個々の能力によ劣ものである可能性が高い。したが
って、異なる患者ではＥＰＯの治療には、各々異なるコ
ースがある。

タンパク質部分の構造に加えて、分子の糖側鎖の構造は
、ホルモンと生体の相互作用においてとくに重要である
。例えば、脱シアル化 （ｄｅｓｉａｌｙ！ａｔｅｄ）　Ｅ　Ｐ　Ｏは、投与後
、動物において作用しない。これにもかかわらず、これ
はりセブターに結合し、前駆細胞を刺激する。アシアロ
−ＥＰＯのインビボの活性の損失は、脱シアル化ＥＰＯ
に接近できるガラクトシル残基のための特異性を有する
リセブターによる肝臓におけるこれの除去によって、説
明づけることができる。完全に脱グリコシル化したＥＰ
Ｏさえも、インビトロで標的細胞との結合活性を示すが
、インビボでは未知の機序を介してより速く腎臓に排出
される。

リセブターとのＥＰＯ結合部位は、したがって、脱グリ
コシル化によっては変わらない。しかし、インビボにお
ける作用の低減は、完全なグリコシル化およびシアル化
は血液中の輸送、安定性および系（ｓｙｓｔｅｍ）から
の除去速度に重要であることを示す。

何人かの患者においては、今日までに治療に用いてきた
野生型ＥＰＯによって血圧の上昇が起き、これは治療で
は欠点となる。ＥＰＯは血圧の調節に関与すると考えら
れる。したがって、これらマイナスの性質を有せず、し
かし、前駆細胞の分化および赤血球への分裂の速度を刺
激するようなＥＰＯの生理的作用を有するタンパク質を
有することが望ましい。

巨核球（ｍａｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）を刺激して血小
板を形成するといった、さらなるＥＰＯの副作用があら
れれる患者もある。この場合、血栓の危険性は、ＥＰＯ
による治療中にもあり、治療は直ちに停止しなければな
らない。そこで、用いるエリスロポイエチンのより高い
特異性が望まれる。

〈発明の詳細な説明〉 本発明に基づく目的は、エリスロポイエチンの変異体を
提供することである。これら変異体は、患者の各々の治
療を可能にするために、増加したまたは減少した生物学
的活性（すなわち赤血球形成の刺激）を有する。血圧上
昇などの望ましくない副作用は起きないか、またはごく
限定されるべきである。

本発明者らは、カルボキシル末端領域（アミノ酸１３０
〜アミノ酸１６６）がＥＰＯリセブターとの結合部位を
含むことを見出した。この領域の除去は生物学的活性の
減少さらには欠失をももたらし、陽性に荷電したアミノ
酸の挿入は生物学的活性の増加（すなわち前駆細胞から
の赤血球の形成の刺激）をもたらす。さらに、本発明者
らは、アミノ酸１３０〜１６０の領域（より正確にはア
ミノ酸１４２〜１４９の領域）にアンギオテンシン■と
の相同性があることを見出した。この領域における変化
はＥＰＯの昇圧活性に影響を及ぼす。

さらに、グリコシル化の減少によって赤血球形成の遅延
刺激をもたらす。

したがって、本発明は次のようなヒトＥＰＯの変異体（
ｍｕｔｅｉｎｓ）に間する。

（１）野生型エリスロポイエチンと比較して、アミノ酸
１０〜５５．７０〜８５および１３０〜１６６の領域に
おいて少なくとも一つのアミノ酸の欠失および／または
一つのアミノ酸の挿入またはアミノ酸の置換、および／
または少なくとも一つのＮ−グリコシル化Ａｓｎのグリ
コシル化できないアミノ酸による置換および／またはＳ
ｅｒ１２６のＴｈｒまたはＧｌｙによる置換を示し、そ
の結果、野生型ＥＰＯと比較して次の点で一つまたはそ
れ以上の変化した性質を有するヒトエリスロビエイチン
の変異体。

（ａ）　　赤血球前駆細胞の刺激 （ｂ）　　インビボ半減期 （ｃ）　　血圧上昇 （ｄ）　　巨核細胞および非赤血球系（ｓｅｒｉｅｓ）
からの他の前駆細胞の刺激 （ｅ）　　副作用、例えば、頭痛の発生、および（ｆ）
エリスロポイエチンリセブターとの結合（２）とくに、
カルボキシル末端アミノ酸１３０〜１６６の領域に挿入
を有する変異体が含まれる。

さらに、Ａ　ｒ　ｇ　Ｈ６６がＧｌｙ＋ｅｅに置換され
た変異体またはカルボキシル末端に一つまたはそれ以上
の追加のアミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸、が位置
１６６に結合して含まれる変異体が好ましい。

（３）さらに、アミノ酸１３０〜１６６の領域に少なく
とも一つのアミノ酸置換を有する変異体がとくに好まし
い。

（４）さらに、（１）の変異体であって、位置１２６の
セリンがスレオニンまたはグリシンに置換されたもの、
またはグリコシル化できる少なくとも一つのアスパラギ
ン位置（ただしＡｓ　ｎ３８を除く）がグルタミンに置
換されたもの、が好ましい。

また、本発明は、既に説明されたように、上記の変異（
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）のいくつかまたは全部を同時に示
すＥＰＯ変異体に関する。

最後に、本発明は、上記変異体の少なくとも一つを含む
医薬物および、さらに、赤血球の数および質の上昇また
は減少を目的とする治療、とくに腎性貧血の治療、にお
けるそれらの使用、に関する。

最後に、本発明は諸例および特許請求の範囲に含まれる
通りである。

例 １、ＥＰ○変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）の調製（一般的方
法） １）ＥＰＯ特異性オリゴヌクレオチドの合成変異誘発性
（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）オリゴヌクレオチドおよび配列
決定のためのブライマーをホスフェートトリエステル法
（Ｌｅｔｓｉｎ３ｅｒ：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ
−５ｏｃ、　９７．３２７８．１９７５、同：　　Ｊ、
　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　９８．３６５５．１９７６）によって調製し
た。用いた変異誘発性オリゴヌクレオチドの例は表２に
示される通りである。

２）変異誘発性ベクター系へのＥＰＯｃ−ＤＮＡのクロ
ーニング エリスロポイエチンをコードする配列および、その３’
　　ＳＶ４０主要後期抗原のポリアデニル化（ｐｏｌｙ
ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナルを含む５Ｖ４０ＤＮ
Ａ断片を含む、１０２４ｂｐのＥ　ｃ　ｏＲＴ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を、ベクターｐＥＰＯ７８２ＭＴＢ　Ｐ　Ｖ　
（ｐＣＥ　Ｓ、　　ＥＰ−Ａ−２６７，６７８）から単
離した。

断片の単離は、プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩで切断して、平滑末端を得るために凹所末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を用いて埋填して
、行った。このように処理されたプラスミドを、次いで
制限酵素ＢａｍＨＩで切断して、アガロ−ゲルからの溶
出（Ｍａｎｉａｔｉｓら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、　１９８２）によって上記のＤＮＡ断片の
単離が可能となった。

次いで、断片を方向を定めて変異誘発性ベクターｐＭａ
ｃ５−８（第１図）のポリリンカーにクローニングした
。このポリリンカーはＳｍａｉＢａｍＨｌで切断してお
いた。このＥＰＯ野生型構築物をｐＭｃＥｌと称した。

３）変異誘発 変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）　’（表１）の調製において
、変異を含む合成オリゴヌクレオチド（表２）を変異誘
発性ベクター系に、いわゆる「ギヤップドデュブレック
ス（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）　Ｊ　Ｄ　ＮＡバイ
ブリド分子（Ｍｏｒｉｎａｇａら二Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　？、６３６−６３９．１９８４、Ｋｒａｍ
ｅｒら：　Ｎｕｃｌｔ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９Ｂ
、１２．９４４１−９４５６）を介して導入した。この
目的のために、大腸菌ＷＫ６株に形質転換によって導入
しておいた変異誘発性ベクターｐ　Ｍ　ｃ　Ｅ　１の一
本鎖ＤＮＡを標準法によって単離した。ｐＭａ５−８か
らのプラスミドＤＮＡをＥｃ　ｏＲｉＢａｍＨＩでボリ
ンカー内で切断して、直線状にしたＤＮＡ（３，８ｋｂ
）をアガロースゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）から
溶出した。

「ギャップドデュブレックスＪＤＮＡの調製のために、
０　、１　ｐｍｏｌの二本鎖断片（ｐＭＡ５−８から）
（第１図）および０．５　ｐｍｏｌの一本鎖ＤＮＡ（ｐ
ＭｃＥｌ）（第１図）を１２．５ｍＭ）リスーＨＣｌ　
（ｐＨ７，５）＋１９０ｍＭ　ＫＣＩ（最終容量４０μ
ｍ）中で１００℃で４分間加熱して、次いで、６５℃で
１０分間インキュベートした。８μｍの上記のハイブリ
ダイゼーション溶液を４〜８　ｐｍｏｌ（２μｍ）の酵
素的に燐酸化したオリゴヌクレオチドとともに６５℃で
５分間加熱して変異誘発性オリゴヌクレオチドを先ずハ
イブリダイズして、次いで、緩やかに室温まで冷却した
。２４μｍのＨ２Ｏ，４μ＋の１０×埋填緩衝液（６２
５ｍＭＫＣＩ、２７５ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
５）、１５０　ｍＭＭｇＣ１２，２０ｍＭ　ＤＴＴ、０
．５ｍＭＡＴＰおよび各０−２５ｍＭの四つのＮＴＰｓ
）、１μｍのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｍ）およ
び１μｍのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片（ＩＵ
／μｍ）を添加の後、室温で４５分間インキュベートし
た。次いで、５μｍの混合物を形質転換によってＷＫ６
ｍｕｔｓ　（ｍｕｔｓ２１５：Ｔｎ１０）に導入した。

全形質転換混合物をＬＢ培地＋５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン（１０ｍｌ）の攪拌培養で３７℃で一晩増殖させた
。プラスミドＤＮＡを、全混合物から標準法によって精
製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）。

約２０ｎｇの精製プラスミドを、形質転換によってＷＫ
６！ｓ菌に導入して、次いで、選択を５０μｇ１０＋Ｉ
のアンピシリンを含むＬＢプレート上で行った。これら
の変異体のいくつかを、適当な配列反応（Ｃ−１Ｔ−１
八−またはＧ−特異性）によって所望の変異についてお
おまかに先ず分析した。陽性のクローンを、変異誘発の
領域についての詳細な配列分析（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら
：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７．１９７
７　）によって確認した。変異したＥＰＯ配列を含むプ
ラスミドをｐ　Ｍ　ａ　Ｅ　２、ｐＭａＥ３．、、ｐＭ
ａＥｎ　（第１図）と称した。

４）ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）のた
めの発現ベクターの構築 発現ベクターｐＡＢＬ１　（第２図）を、発現ベクター
ｐ　Ａ　Ｂ　３−１　（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ　ら：
　ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓｔ、　Ｍｉｔｔ、　８２．２６
−３４．１９８８）から抗トロンビン■をコードする断
片およびＳＶ４０の初期ポリアデニル化部位を含む断片
を制限酵素ＨｉｎｄｍおよびＢａｍＨＩを用いて切断し
て除去すること、および断片を次の配列のポリリンカで
で置き換えること、によって調製した。

５″ 次いで、同様にポリリンカーのＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩ切断部位を介して、変異誘発前（Ｅｌ、ＥＰＯ野生
型）または変異誘発後（Ｅ２−Ｅｎ、ＥＰＯ変異体）に
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩを用いて変異誘発性ベクター系
から切断しておいた発現ベクターｐＡＢＬ１断片へクロ
ーニングすることも可能となった。得られたＥＰＯ発現
プラスミドをｐＡＢＥｌ、ｐＡＢＥ２１、ｐＡＢＥｎ（
第２図）と称した。

５）動物細胞のトランスフェクションおよび二重選択 ＢＨＫ２１ｍ胞（幼若ハムスター！り　　（ＡＴＣＣＣ
ＣＬＩＯ）を、ＥＰＯ！−ド発現ヘクターｐＡＢＥ１゜
ｐＡＢＥ２．、、ｐＡＢＥｎ　（第２図）でトランスフ
ェクトさせた。トランスフェクションのために、細胞を
１０％胎児ウシ血清を含むダルベツコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。

修飾燐酸カルシウム法（Ｇｒａｈ’ａｍおよびｖａｎ　
ｄｅｒＥｂ：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４５６−４６
７．１９７３）　Ｃｍよッテ、細胞を５０〜７０％コン
フルエントにトランスフェクトさせた。

発現ベクターを、動物細胞中で発現され得るマウスジヒ
ドロフオレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む
プラスミドＤＮＡ２　　ｄｈｆｒ　（Ｌｅｅら：　Ｎａ
ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９４．２２８−２３２
．１９８１）と、動物細胞中で発現され得るゲネチシン （ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性を含むプラスミドル　ＲＭ
Ｈｌ　４０　（Ｈｕｄｚｉａｋら：　Ｃｅ１ｌ　３１．
１３７−１４６．１９８２）とで共トランスフェクト（
ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させた。この系によって、メ
トトレキサー）　（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔ）（１ｍＭ
）およびゲネチシン（Ｇ４１８．４００μｇ／ｍ　Ｉ　
）による二重選択ができ、細胞性ゲノム（Ｚｅｔｔｌｍ
ｅｉｓｓｌら：前出）に取り込まれたプラスミドＤＮＡ
の増殖が可能になる。

６）発現細胞の培養上清からのＥＰＯおよびＥＰＯ変異
体（ｍｕｔｅｉｎｓ）の免疫学的検出ＥＰＯに対する抗
血清の調製 精製ＥＰＯに対する抗体を、ウサギで産生させた。この
目的のために、ＥＰＯをゲルタールシアアルデヒドを用
いて鍵穴アオガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉ
ｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ、　Ｋ　Ｌ　Ｈ）と
結合させて、アジュバントとの乳濁液を調製して、免疫
化に用いた。血清は標準法によって得た。

エリスロポイエチン測定のためラジオイムノアッセイ この試験は、細胞培養上清中およびホルモンの異なる精
製段階からのサンプル中の組換えＥＰＯの定量的決定に
用いられる。これは、競合的ラジオイムノアッセイのニ
ー抗体変種（ｔｗｏ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｖａｒｉａ
ｎｔ）に基づ＜　（Ｃ，Ｎ、　ＨａｔｅｓおよびＰ、Ｊ
。

Ｒａｎｄｌｅ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、８８．１３
７．１９８３）。

サンプルまたは較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎＩｙ
ａｔｅｒｉａｌ）を、予め決定した量の’２５１　　Ｅ
ＰＯおよび抗−ＥＰＯウサギ抗血清とともに４℃で２４
時間インキュベートして、次いで、ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｇと４℃でさらに１８時間インキュベートして、抗体に
よって結合された１２５　Ｉ　　Ｅ　Ｐ　Ｏを分別した
。沈澱を、遠心分離によって分離して、各々５００μｍ
の緩衝液で２回洗浄して、自動ガンマ分光光度計のガン
マチャンネルで測定した。系は、沈澱を促進するために
プールしたウサギ正常血清を含んだ。評価は、較正物質
の一連の希釈物との比較を較正曲線を用いて行った。較
正曲線は、放飼能の結合（％）を較正物質の濃度の十進
（ｄｅｃｉｍａｌ）対数に対してプロットしたものであ
る。

１２５Ｉ　ＥＰＯを、二相（ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ）クロ
ラミン−Ｔ法（Ｆ、　ＴｅｊｅｄｏｒおよびＪ、Ｐ、Ｇ
、　Ｂａ１ｌｅｓｔａ：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　１２７．１４３−１４９．１９Ｂ２）を用いてヨウ素
放射性ラベルによって精製ＥＰＯから得て、取り込まれ
なかったヨウ素をゲルクロマアトグラフィーで除去した
。抗ＥＰＯ血清を１：３３００の割合で予め希釈して、
抗つサギＩｇＧ血清を１５０倍に希釈した。ＢＣＡ法（
Ｐ、に、　Ｓｍ１ｔｈ：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　１５０．７６−８５．１９８５）を用いてタンパク質
含有量を決定した精製組換えヒトＥＰＯからの研究用標
準物質を、較正物質として用いた。

全ＥＰＯ分子に対する抗血清の使用によって、ＥＰＯ変
異体の検出もまた保証された。

ＥＰＯ産生細胞クローンの同定のための酵素イムノアッ
セイ ＥＬＴＳＡ／ドツトプロット試験系を、ＥＰＯ産生細胞
系の迅速なスクリーニング（希釈を必要としない）のた
めに開発した。２００μｍの培養上清をニトロセルロー
スに吸わせる。フィルターを０．５％ＢＳＡのＰＢＳ　
（ｐＨ７，０）で３７℃で３０分間飽和させて、次いで
、１：１０００に希釈した抗ＥＰＯウサギ抗血清ととも
に一晩インキユベートした。フィルターをＰＢＳ−０，
０５％Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎで洗浄して、次いで、アルカ
リホスファターゼと結合させたヤギ抗つサギＩｇ抗血清
とともに２時間インキュベートした。さらに０．０５％
ＴｗｅｅｎのＰＢＳ　（ｐＨ７，０）および０．２Ｍト
リス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，５）およびさらにＩＭ）リス
−ＨＣｌ　　（ｐＨ９，５）で洗浄した後に、ｐ−ニト
ロブルーテトラゾリウムクロリド水和物および５−ブロ
モ−４−クロロインドリル燐酸のｐ−）ルイジン塩を基
質として加えた。２０分後、水を加えて反応を停止させ
る。試駆は、１００ｎ１００ｎ／ｍｌよりも多量のＥＰ
Ｏの検出に適している。Ｃ１２７縞胞（ＥＰ−Ａ−２６
７，６７８）からの精製組換えＥＰＯを、較正物質とし
て用いた。

７）トランスフェクトされた安定な発ｙｔ細胞の培養上
清からのＥＰＯおよびＥＰＯ変異体の生物学的活性の検
出 インビボバイオアッセイ Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ　（Ｍａｒｂｕｒｇ、
強国）の動物飼育からのＮＭＲＩマウスを無作為に群別
して、異なる投与量のＥＰＯまたはＥＰＯ変異体（ｍｕ
ｔｅｉｎ）を１日２回５日間続けて腹腔内に注射した。

対照動物を、ＰＢＳ、細胞培養培地またはＢＨＫ細胞の
細胞培養上清で処理した。Ｃ１２７細胞（ＥＰ−Ａ−２
６７、６７８）からの精ｉ１組換えＥＰＯを、較正物質
として用いた。血液学的試験を、最初のＥＰＯ投与の注
射後ＯＢから２２日までの数回行った。試験は、ヘマト
クリット、ヘモグロビン含有量および末梢血中の網状赤
血球の数を含む。

インビトロバイオアッセイ 雌ＮＭＲＩマウスに、フェニルヒドラジンハイポクロリ
ド（６０ｍｇ／ｍｌ）を２日続けて注射した。

最後の注射から４８時間後、ｎ臓を切開して、単一細胞
（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ）懸濁液を調製した。これら
細胞から赤血球前駆細胞をフィコール勾配（Ｄ＝１．０
７７）を介して濃厚富化した。勾配の界面を集めて、２
０ｍ１のＰＢＳで２回洗浄して、ＤＭＥＭに再懸濁させ
て、細胞を数えた。ＥＰＯおよびＥＰＯ変異体サンプル
を希釈して、２０Ｉｔ　ｌの各希釈物をマイクロタイタ
ープレート中の各々８０μｍの牌臓細胞懸濁液（３Ｘ１
０５細胞／ウエル）に加えた。加湿した５％ＣＯ２の雰
囲気下で２２時間インキヱベートした後、２０μｍのＤ
ＭＥＭに溶かしたｌμＣｉのメチル−３Ｈ−チミジンを
各々のウェルに加えた。、！Ａ胞を３時間ラベルして、
次いで、３Ｈの取り込みをＴＲＩ−ＣＡＲＢ６６６０液
体シンチレーションカウンター中で測定した（Ｋｒｙｓ
ｔａｌ　ら：　Ｊ、　ＥＸＰ、　ｔｌｅｍａｔｏｌ、　
１１゜６４９）　、較正物質は、ＰＢＳ、培地およびＣ
１２７縞胞（ＥＰ−Ａ−２６７，６７８）からの精製組
換えＥＰＯであった。

８）トランスフェクトされたＢＨＫｍ胞の混合クローン
からの、ＥＰＯ−およびＥＰＯ−変異体−産生細胞クロ
ーンの単離 トランスフェクションおよび二重選択後の８０〜１００
個の単一クローンのプールに由来する混合ＢＨＫクロー
ンを、イムノアッセイおよびバイオアッセイを用いてＥ
ＰＯまたはＥＰＯ変異体の分泌について試験した。陽性
の混合クローンは、１１００ｎ〜ｌμｇのＥＰＯまたは
ＥＰＯ変異体を産生した。限定希釈工程によるクローニ
ングの後、１〜１０μｇのＥＰＯまたはＥＰＯ変異体を
産生ずる単一細胞クローンを得ることが可能であった。

より少ないＥＰＯまたはＥＰＯ変異体を産生ずる混合ク
ローンにおける匹敵できるＥＰＯ産生は、メトトレキサ
ートを用いる増幅選択によって達成することができた。

これら非精製調製物からのインビトロの生物学的活性（
ＲＩ　ＡまたはＥＬ　Ｉ　ＳＡで標準化）は、精製ＥＰ
Ｏ画分における活性（１００Ｕ／μｇ〜２００Ｕ／μｇ
）に匹敵する。

変異体は、ｒｈｕＥ　Ｐ　Ｏ−Ｗ　Ｔと比較して、異な
るインビボ生物学的活性を示す（第３および４図）。

より多量の細胞培養上清を調製するために、単一クロー
ンをローラー瓶で培養できるようになるまで広げた。細
胞の増殖は、血清を含む培地（ＤＭＥＭ）でコンフルエ
ントになるまで行った。

次いで、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ）に変えた。

無血清培地での培養の３日後に、培養上清を集めた。メ
トトレキサートを用いる増幅選択によってより少ないＥ
ＰＯまたはＥＰＯ変異体を産生ずる混合細胞クローンに
おいて匹敵するＥＰＯ産生を達成することが可能であっ
た。

■、特異的変異体（ｍｕｔｅｉｎｓ）　　（名称は表１
を参照されたい） ｌ。

僅かに変化したのみで、したがって野生型ＥＰＯと非常
に似た生物学的性質を有しているエリスロポイエチン変
異体（ｍｕｔｅｉｎ）を得るために、カルボキシル末端
アルギニン１６６をグリシンで置換した。詳細な構造分
析において、ともかく、組換えＥＰＯおよび尿から単離
された野生型ＥＰＯのいずれにおいてもアルギニン１６
６が欠失していることが示すことができた。したがって
、生理的に活性なＥＰＯはおそら＜ｄｅｓ−Ａｒｇ−１
６６Ｅ　Ｐ　Ｏ（Ｍ、Ａ、　Ｒｅｃｎｙら：　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６２、（３５）　１７１５６−６３、＋９８７）であ
る。変異体ＥＰＯ３は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
（ＳＤＳ−ＰＡゲル）で野生型ＥＰＯ（３４〜３８ｋＤ
）と同じ泳動的挙動を示し、インビボバイオアッセイに
おいて、野生型分子と識別できない機能的性質を示す（
第３および４図）。全ての混合クローンは、変異体を産
生して、単一クローンを単離することができ、産生は７
．５μｇ／＋＋ｌ／１０’細胞／２４時間であった。種
々の細胞クローンの発現率は、実質的には野生型ＥＰＯ
産生細胞クローンに比較して高かった。

２、Ｌ見毀且旦Ωヱ Ａ　ｓ　ｎ　２４のＮ−グリコシル化部位をＧ１ｎ２４
による置換で除去した。変異体（ｍｕｔａｎｔ）は、野
生型ＥＰＯと５ＤＳ−ＰＡゲルで３４ｋＯと３８ｋＤと
の間で同じ泳動的挙動を示す。生物学的インビボ試験に
おいて網状赤血球の増殖の遅延刺激が認められる（第３
および４図〉。全ての混合ＥＰＯ７クローンは、変異体
（ｍｕｔｅｉｎ）を産生して、単一クローンを単離する
ことができ、産生は３．１７１ｇ／ｉｆ／１０８細胞／
２４時間であった。

３゜ ＥＰＯはまた、Ｏ−グリコシル化部位をアミノ酸５ｅｔ
１２６に含む。Ｓｅｒ１２６がＴｈｒ１２６で置換され
ると、５ＤＳ−ＰＡゲルで数個のバンドが形成される。

その全ては本来のＥＰＯよりも低い分子量（３０ｋＤ〜
２５ｋＤ）を有している。

これは異種の（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）グリコシ
ル化パターンによるものかも知れない。スレオニンもま
たＯ−グリコシル化され得るが、しかし、この例では本
来のエリスロポイエチンにおけるセリンと異なる形で０
−グリコシル化されているようである。網状赤血球増殖
のインビボ刺激およびヘマトクリットおよびヘモグロビ
ン含有量の増加は、上記の例のように遅延する（第３お
よび４図）。しかし、動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の研
究によれば、あたかも網状赤血球貯蔵がＥＰＯまたは他
の変異体よりも速やかに枯渇するようである。全ての混
合形質転換体クローンは、変異体ＥＰＯＩＯを産生じて
、単一クローンを単離することができ、培地への分泌は
２．８μｇ／ｍｌ／１０’細胞／２４時間であった。

４゜ ＥＰＯは、アミノ酸１４２〜１４９の領域においてアン
ギオテンシン■との相同性を有する。アンギオテンシン
は、レニンーアンギオテンシン系を介して体内で形成さ
れ、血圧上昇をもたらす血管収縮作用を生じさせる。高
血圧を起こさない、したがって、また高血圧症の患者に
用い得る変異体は、この領域のアミノ酸を置換すること
によって調製される。さらに、血圧上昇によって起きる
頭痛などの副作用が起きない。

る（インビボでの網状赤血球の形成の増加、網状赤血球
貯蔵の増進）、欠失はＥＰＯの活性を低減させる。

カルボキシル末端領域における塩基性アミノ酸の添加に
よって、ＥＰＯの生物学的活性は上昇す一、！！！ａｇ
；！ｆｆ１．！！！：　　Ｆｔ　　５４！、９５．：表
２しｋ ＥＰＯ７ ＥＰＯ９ ＥＰＯ４２ａ ＥＰＯ４２ｂ ＥＰＯ４コａ ＥＰＯ４コｂ ＥＰＯ４４ａ ＥＰＯ４４ｂ ＥＰＯ４５ａ ＥＰＯ４５ｂ ＥＰＯ４６ ＥＰＯ４７ ＥＰＯ４８ Ｅｒ’Ｏ４９ ５’ｇｃｃｃｇｔｃｇｔｇａヒｃｔｇｃｔｃｇｇｃｃｔ
ｃｃ　　３’５　’　ｃｇｇｃセｇｇｇａａｇａｃｔｇ
ｇａｃｃｃａｃａｇｇｇｃｃ　３’５’ｃｃｔｃｃａａ
ｑａｇａａａｃｃｔｃｔｃｃ　３’５’ｃｃｔｃｃａａ
ｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃ　３’ｓ’ｃｃａｇｇｃａ
ａａｇａａａｔｔａａｃ　　３’５’ｃｃａｇｇｃｇｃ
ｃｇａａａｔｔａａｃ　３”５’ｇｇａａａＬ七ｇｇａ
ａａａｇａｃｔｃｇｇ　　３”５’ｇｇａａａ七七ｇｇ
ａｇｃｃｇａｃｔｃｇｇ　　３’５’ｇｃｃｔｃｃｅｃ
ｔｇｔａａａｃａｇｃｔｔｃａｇｃ　３’５’ｇｇｃ七
ＣＣＣＣ七ｇｔｇｃｃｃａｇｃｔｔｃａｇｃ　　３’５
’ｇｇａｇｔａｇａｃヒｇｃｇａａｇａｇ　　３’５’
ｃａｇｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃａｇｇａｃ　３’５
’ｇｇｃｃｔｇｇｃｃ９ｇｃｃａｇｇａｃ　３”５’ｃ
ａｇｇｇｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃａｇｇ　３’

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、変異誘発性ベクターｐＭａｃ５−８の構築
を図示する、説明図である。 第１ｂ図は、変異したＥＰＯ配列を含むプラスミドの構
築を図示する、説明図である。 第２ａおよび２ｂ図は、ＥＰＯ発現プラスミドの構築を
図示する、説明図である。 第３　ａ　−ｃ図は、ＥＰＯ変異体の作用のインビボ試
験の結果を図示する、グラフ図である。 ＥＰＯ変異体を含む濃縮細胞培養上清で処理しておいた
ＮＭＲＩマウスにおけるヘモグロビンおよびヘマトクリ
ット値および網状赤血球数を、測定した。測定は、処理
後１０日目に行った。 Ｃｌ２７ｉマウス細胞からの精製野生型ＥＰＯ（ＥＰＯ
ｐｕ　ｒ）を対照として使用した。 Ｈｂ＝ヘモグロビン、Ｈｋ＝ヘマトクリット、Ｒｅ＝網
状赤血球数 第４　ａ　−ｃおよび５　ａ　−ｃ図は、ＥＰＯおよび
ＥＰＯ変異体で処理した後のＮＭＲＩマウスのヘモグロ
ビンおよびヘマトクリット値および網状赤血球数のパタ
ーンを示す、グラフ図である。精製ＥＰＯ（ＥＰＯｐ　
ｕ　ｒ）または等量のＥＰＯ変異体を含む濃縮培養上清
を、処理していないＮＭＲＩマウスに第０日に注射して
、ヘモグロビンおよびヘマトクリット値および網状赤血
球数を測定した。処理後第５日〜第１６日までは、異な
る測定を異なる時間に行った。 Ｈｂ＝ヘモグロビン、Ｈｋ＝ヘマトクリット、Ｒｅ＝網
状赤血球数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、野生型エリスロポイエチンと比較して、アミノ酸１
   ０〜５５および／または７０〜８５および／または１３
   ０〜１６６の領域における少なくとも一つのアミノ酸の
   欠失および／または一つのアミノ酸の挿入および／また
   はアミノ酸の置換、および／または少なくとも一つのＮ
   −グリコシル化Ａｓｎ（ただしＡｓｎ３８を除く）のグ
   リコシル化できないアミノ酸による置換および／または
   Ｓｅｒ１２６のＴｈｒまたはＧｌｙによる置換を示し、
   その結果、野生型エリスロポイエチンと比較して次の点
   で一つまたはそれ以上の変化した性質を有する、ヒトエ
   リスロポイエチンの変異体。 （ａ）赤血球前駆細胞の刺激 （ｂ）インビボ半減期 （ｃ）血圧上昇 （ｄ）巨核細胞および非赤血球系からの他の前駆細胞の
   刺激 （ｅ）頭痛の発生、および （ｆ）エリスロポイエチンリセプターとの結合２、野生
   型エリスロポイエチンのアミノ酸１０〜５５および／ま
   たは７０〜８５および／または１３０〜１６２の領域に
   おいて少なくとも一つのアミノ酸が欠失している、請求
   項１に記載の変異体。 ３、少なくとも一つのアミノ酸置換またはアミノ酸挿入
   がアミノ酸１０〜５５および／または７０〜８５および
   ／または１３０〜１６６の領域において行われた、請求
   項１に記載の変異体。 ４、カルボキシル末端アミノ酸Ａｒｇ１６６がＧｌｙ１
   ６６で置換された、請求項３に記載の変異体。 ５、カルボキシル末端に結合した少なくとも一つの追加
   アミノ酸を含む、請求項１に記載の変異体。 ６、結合したアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項
   ５に記載の変異体。 ７、変異体が野生型分子よりも多くのアミノ酸を含むよ
   うに、少なくとも一つのアミノ酸挿入を含む、請求項１
   に記載の変異体。 ８、Ｓｅｒ＾１＾２＾６がＴｈｒまたはＧｌｙで置換さ
   れているかまたはＮ−グリコシル化Ａｓｎ（ただしＡｓ
   ｎ３８を除く）の少なくとも一つがＧｌｎで置換されて
   いる、請求項１に記載の変異体。 ９、請求項２〜８に記載の欠失、挿入または置換の組合
   せを示す、請求項１に記載の変異体。 １０、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異体をコ
   ードする、ＤＮＡ配列。 １１、請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも
   一つの変異体および、適宜、生理学的に許容される賦形
   剤、を含む、医薬物。 １２、腎性貧血の治療および赤血球数の増加または減少
   および／または赤血球の質の増進を目的とする治療にお
   ける、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異体の使
   用。