CZ291342B6 - Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents
Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291342B6 CZ291342B6 CZ2001462A CZ2001462A CZ291342B6 CZ 291342 B6 CZ291342 B6 CZ 291342B6 CZ 2001462 A CZ2001462 A CZ 2001462A CZ 2001462 A CZ2001462 A CZ 2001462A CZ 291342 B6 CZ291342 B6 CZ 291342B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- erythropoietin
- isoforms
- thr
- ser
- epo
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci. Použití tohoto analogu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta a tento farmaceutický prostředek. Sekvence DNA kódující tento analog a eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná touto sekvencí DNA způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat výše uvedený analog.ŕ
Description
Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Vynález se týká analogů humánního erythropoietinu a jejich použití pro výrobu léčiv, sekvencí DNA, které kódují tyto analogy, eukaryontních hostitelských buněk transfekovaných těmito sekvencemi DNA a farmaceutického prostředku na bázi výše uvedených analogů erythropoietinu.
Dosavadní stav techniky
Erythropoietin (EPO) je glykoproteinový hormon, který se podílí na maturaci erythroidních progenitorových buněk na erythrocyty. Jedná se o důležitý hormon regulující hladinu červených krvinek v oběhovém systému. Přírodní erythropoietin je produkován v játrech během života plodu a v ledvinách dospělých, cirkuluje krví a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anémie je téměř vždy důsledkem selhání ledvin projevujícího se sníženou produkcí erythropoietinu v ledvinách. Zjistilo se, že rekombinantní erythropoietin vyrobený technikami genetického inženýrství, tj. expresí proteinového produktu z hostitelské buňky transformované genem kódujícím erythropoietin je účinný při léčbě anémie vyvolané chronickým selháním ledvin.
V moči člověka je normálně přítomna nízká koncentrace erythropoietinu, zatímco v moči pacientů trpících aplastickou anémií je hladina erythropoietinu zvýšena. Při purifíkaci humánního urinámího erythropoietinu (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5 558 (1977)) bylo jako výchozí látky použito moči pacientů trpících aplastickou anémií. Až dosud se však urinámí erythropoietin nestal užitečným z terapeutického hlediska.
Identifikace, klonování a exprese genů kódujících erythropoietin je popsána v patentu US 4 703 008 (Lin). Popis způsobu purifikace rekombinantního erythropoietinu z buněčného média je popsán v patentu US 4 667 016 (Lai et al.). Výše uvedené dvě citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Exprese a izolace biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantním plazmidu umožnila poprvé získat větší množství erythropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Kromě toho, znalost sekvence genu a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu vedla k lepšímu porozumění mechanismu účinku tohoto proteinu.
Mnohé buněčné povrchové proteiny a sekretorové proteiny produkované eukaryontními buňkami jsou modifikovány jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace, která je označována názvem glykosylace, může dramaticky ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může být také důležitá pro stabilitu, sekreci a subcelulární lokalizaci proteinu. Vhodná glykosylace může mít rozhodující význam pro biologickou účinnost. Je skutečností, že některé geny z eukaryontních organismů, pokud jsou exprimovány v bakteriích (například E. coli), kterým chybí buněčné procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které po izolaci vykazují jen malou účinnost nebojsou úplně neúčinné, v důsledku toho, že nejsou glykosylovány.
Ke glykosylaci dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu a obvykle se jedná o dva různé typy: O-vázané oligosacharidy jsou připojeny k serinovým nebo threoninovým zbytkům, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, kde jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde XY představuje jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků, které se vyskytují u obou typů, jsou různé. Jedním typem cukru, který se obvykle vyskytuje u obou těchto typů, je kyselina N-acetylneuraminová (dále označována názvem kyselina sialová). Kyselina
-1 CZ 291342 B6 sialová tvoří obvykle terminální zbytek jak N-vázaného, tak O-vázaného oligosacharidu a díky svému negativnímu náboji může propůjčovat glykoproteinu kyselé vlastnosti.
Jak humánní erythropoietin izolovaný z moči, tak rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích buňkách) a aminokyselinovou sekvencí 1-165 humánního erythropoietinu obsahuje tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které dohromady činí asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace se vyskytuje u asparaginových zbytků umístěných v polohách, 24,38 a 83, zatímco O-vázaná glykosylace je umístěna na serinovém zbytku v poloze 126 [Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3 116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265, 329(1988)]. Bylo ukázáno, že oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky kyseliny sialové. Enzymatické zpracování glykosylovaného erythropoietinu za účelem odstranění všech zbytků kyseliny sialové, se projevuje ztrátou účinnosti in vivo, ale neovlivní účinnost in vitro [Lowy et al., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4 202 (1974)]. Toto chování bylo vysvětleno rychlým vymizením asialoerythropoietinu z oběhu při interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein [Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1 385 (1974); Ashwell et al., Methods Enzymol 50, 287 (1978)]. Erythropoietin vykazuje tedy biologickou účinnosti in vivo pouze v tom případě, když je sialylován, čímž se zabrání jeho vazbě na hepatický vazebný protein.
Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích erythropoietinu není dobře definována. Zjistilo se, že částečně deglykosylovaný erythropoietin vykazuje podstatně sníženou účinnosti in vivo ve srovnání s glykosylovanou formou, ale zachovává se svou účinnost in vitro [Dordal et al., Endocrinology 166, 2 293 (1985); Lin, výše citovaný patent]. V jiné studii však bylo konstatováno, že odštěpení N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců, jednotlivě nebo dohromady, mutagenezí asparaginových nebo serinových zbytků, které představují glykosylační místa, výrazně snižuje in vitro účinnost modifikovaného erythropoietinu produkovaného v savčích buňkách [Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17 516 (1988)].
Glykoproteiny, jako je erythropoietin, je možno rozdělovat na formy s různým nábojem za použití takových technik, jako je izoelektrická fokusace (IEF). Několik skupin vědců publikovalo IEF studie vztahující se k surovým nebo zčásti purifikovaným erythropoietinovým přípravkům [Lukowski et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)]. Pomocí IEF byly při těchto studiích identifikovány nejvýše tři nebo čtyři frakce s erythropoietinovou účinností a žádná z nich nebyla charakterizována, pokud se týče obsahu uhlohydrátů. Kromě nebyla provedena žádná korelace mezi izoelektrickými body těchto frakcí a jejich biologickou účinností.
Při purifikaci erythropoietinu izolovaného z humánní moči (Miyake et al., výše uvedená citace) bylo zjištěno, že dvě frakce erythropoietinu izolované pomocí chromatografie na hydroxylapatitu a označené symboly II a lila, vykazují podobnou specifickou účinnost. Následující analýza uhlohydrátů ve frakcích II a lila ukázala, že frakce II obsahuje vyšší průměrný obsah kyseliny sialové, než frakce lila (Dordal et al., výše uvedená citace).
Úkolem tohoto vynálezu je získat oddělené a izolované izoformy erythropoietinu s definovaným obsahem kyseliny sialové a s definovanou biologickou účinností. Tyto izoformy by měly být terapeuticky užitečné při použití ve formě farmaceutických prostředků.
-2CZ 291342 B6
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci.
Ve výhodném provedení v analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu přesmyk zahrnuje deleci, kteréhokoliv N-vazebného místa pro uhlohydrát v humánním erythropoietinu a adici N-vazebného uhlohydrátového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu.
Jako konkrétní provedení analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu je možno uvést provedení zvolená ze souboru sestávajícího z
Gln24Ser87Asn88Thr90EPO,
Gln38Ser87Asn88Thr90EPO a
Gln83Ser87Asn88Thr90EPO.
Předmětem vynálezu je také sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu popsaný výše.
Dalším předmětem vynálezu je eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA uvedeno výše způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.
Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množství výše uvedeného analogu erythropoietinu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.
Konečně je předmětem vynálezu také použití terapeuticky účinného množství výše uvedeného analogu erythropoietinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.
Přehled obr, na výkresech
Obr. 1 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel, na němž je provedena separace izoforem rekombinantního erythropoietinu. Gelové dráhy 1 až 11 ukazují izoformy od méně kyselých (vyšší hodnota pí) v dráze 1 ke kyselejším (nižší hodnota pí) v dráze 11. V drahách ležících u pravého a levého okraje je též obsažen purifíkovaný rekombinantním erythropoietin obsahující směs izoforem 9 až 14.
Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi počtem zbytků kyseliny sialové v izoformě erythropoietinu a specifickou účinností této izoformy in vivo vyjádřenou vjednotkách/mg eiythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A je znázorněna koncentrace každé izoformy erythropoietinu zjištěná Bradfordovým stanovením proteinů. Na obr. 2B je tato koncentrace stanovena měřením absorbance při 280 nm a na obr. 2C je tato koncentrace stanovena metodou RIA.
Obr. 3 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel s definovanými směsmi izoforem rekombinantního erythropoietinu připravenými chromatografií na anexu za různých podmínek. Gelové dráhy 1 až 6 představují (podle pořadí v jakém jsou uvedeny) erythropoietinové izoformy eluované vpromývací kapalině s vysokým obsahem solí po promytí sloupce Q-Sepharose rychlým proudem 150mM kyseliny octové o pH4,7, 150mM kyseliny octové, která není pufrována, 200mM kyseliny octové o pH 4,7, 300mM kyseliny octové o pH 4,7 nebo 300mM kyseliny octové, která není pufrována. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2
-3CZ 291342 B6 výše uvedené publikace Lai et al.. pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na O-Sepharose.
Obr. 4 ukazuje dělení izoforem erythropoietinu 8 až 12, které se provádí tak, že se upravené buněčné médium nanese na sloupec Q-Sepharose a eluuke gradientem s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Alikvoty sudých frakcí od frakce 2 do frakce 40 se podrobí analytické izoelektrické fokusaci. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem. získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.
Na obr. 5 je znázorněna sekvence aminokyselin humánního erythropoietinu. Čtverečky označují asparaginové zbytky, knimž jsou připojeny N-vázané uhlohydrátové řetězce a hvězdička označuje serinový zbytek, který je modifikován O-vázaným uhlohydrátovým řetězcem.
Na obr. 6A, 6B a 6C je znázorněna série klonovacích stupňů použitých pro vytvoření plazmidů pro konstrukci a analýzu analogů humánního erythropoietinu. Tyto analogy obsahují aminokyseliny modifikované způsobem znázorněným na obr. 5, který jim dodává přídavná glykosylační místa.
Na obr. 7 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a uvedených analogů erythropoietinu. Analogy [Asn9, Sern]EPO, [Asn69]EPO, [Asn125, Serl27]EPO a [Pro‘24, Thr125]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Pro125, Thr127]EPO a [Asn126, Ser128]EPO, které neobsahují přídavné uhlohydrátové řetězce.
Na obr. 8 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a charakterizovaných analogů erythropoietinu pro zpracování N-glykanázou. Analogy [Thr125]EPO a [Pro124, Thr125]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Val126[EPO, [Pro124]EPO [Pro125]EPO, [Thr127]EPO, [Pro125, Ser127]EPO a [Thr125, Ser127]EPO.
Obr. 9 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace frakcí 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Q-Sepharose s obrácenými fázemi (C4) za použití buněčného média podporujícího růst CHO buněk transfekovaných erythropoietinovou cDNA obsahující [Thr125]-mutaci. Na levé a pravé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.
Na obr. 10 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a zvolených analogů. Konstrukce těchto analogů je popsána v příkladu 6. Analogy N9, N14, N18, N19, N21, N24 a N39 obsahují přinejmenším jeden přídavný uhlohydrátový řetězec, což je dokumentováno nižší pohyblivostí na gelu.
Na obr. 11 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu a analogu EPON14 v průběhu štěpení N-glykanázou. Časové intervaly, v nichž bylo prováděno měření, jsou 0,4,12,45 minut a štěpení přes noc.
Obr. 12 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace přípravků obsahujících izoformy analogu EPON14. Směs označená jako nízké izoformy obsahuje analog EPON14 obsahující převážně 6 až 12 zbytků kyseliny sialové v molekule, směs označená jako střední izoformy obsahuje analog N14 obsahující převážně 10 až 15 zbytků kyseliny sialové v molekule a směs označená jako vysoké izoformy obsahuje analog NI4 obsahující převážně 12 až 17 zbytků kyseliny sialové v molekule.
-4CZ 291342 B6
Obr. 13 ukazuje farmakokinetiku rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14 a analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) po intravenosním injekčním podání krysám.
Na obr. 14 je znázorněna zkouška vytěsňování 125I-značeného rekombinantního humánního erythropoietinu z vazby k receptoru erythropoietinu prováděná za chladu za přítomnosti různého množství neznačeného rHuEPO. izolované izoformy 14 nebo analogu EPO NI4.
Obr. 15 ukazuje studii myšího hematokritu (poměr plazmy ke krvinkám), při níž se porovnává účinnost vysoké izoformy EPON14 (0,036 a 0,0712 pg), izolované izoformy 14 (0,036 a 0,0712 pg), nízké izoformy EPO 177 (0,0712 pg) a rHuEPO (0,071 pg).
Následuje podobný popis tohoto vynálezu.
Předmětem vynálezu jsou izoformy erythropoietinu. Specifické izoformy erythropoietinu získané podle vynálezu a jejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Tak například izoformy humánního erythropoietinu izolovaného z moči se liší od izoforem rekombinantního erythropoietinu. V přednostním provedení se vynález týká izoformy erythropoietinu se specifickým počtem (tj. s pevným počtem, který je vyšší než 0) zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, přičemž toto číslo je zvoleno ze souboru zahrnujícího čísla 1 až 14. S výhodou je tímto Číslem 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. Vjiném provedení je toto číslo vyšší než 14as výhodou leží v rozmezí od 16 do 23.
Pod označením „izoforma eiythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietinový přípravek vykazující jediný izoelektrický bod (pl) a mající stejnou sekvenci aminokyselin. Pod označením ..erythropoietin“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí přírodní erythropoietin, humánní erythropoietin izolovaný z moči, jakož i polypeptidy, které se nevyskytují v přírodě a které mají sekvenci aminokyselin a které jsou glykosylovány způsobem dostatečně kopírujícím přírodní erythropoietin, aby jim to udělilo in vivo biologické vlastnosti spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně pro zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek.
Zjistilo se, že oddělené izoformy rekombinantního erythropoietinu, které mají sekvenci aminokyselin humánního erythropoietinu izolovaného z moči, odpovídají molekulám erythropoietinu obsahujícím 1 až 14 zbytků ky seliny sialové, přičemž každá z izoforem přítomných v purifikovaném rekombinantním erythropoietinu vykazuje účinnost in vivo mající vztah k počtu zbytků kyseliny sialové, které tato izoforma obsahuje.
V přednostním provedení je erythropoietin produktem exprese exogenní sekvence DNA, která byla transfekována do nehumánní eukaryontní hostitelské buňky. V přednostním provedení je tedy erythropoietinem „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin se s výhodou produkuje postupy popsanými v patentu US 4 703 008 (Lin; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášky). Rekombinantní erythropoietin se může purifikovat obecnými postupy popsanými v příkladu 2 patentu US 4 667 016 (Lai et al.; stejný majitel vlastní i práva ktéto přihlášce) nebo alternativně způsobem popsaným v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., při němž se však místo chromatografie na DEAE-Agaróze použije chromatografie na Q-Sepharose.
Erythropoietin purifikovaný podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. obsahuje podle analýzy IEF převážně 6 izoforem. Za použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4 byla kromě toho zjištěna přinejmenším jedna další izoforma s vyšší kyselostí. (Tato kyselejší forma migrující na IEF gelu při obsahu zbytků sialové kyseliny nad 14 může obsahovat záporné náboje nepocházející z sialové kyseliny, což dokládá resistence některých nábojů ke štěpení sialidázou). Tyto izoformy se od sebe vzájemně liší obsahem kyseliny sialové. Tato skutečnost je
-5CZ 291342 B6 v příkladech demonstrována na izolaci 10 takových izoforem preparativní IEF a stanovením obsahu kyseliny sialové v 5 z nich. Zjistilo se, že v izoformách zkoušených na obsah kyseliny sialové, je počet zbytků kyseliny sialové 9, 10, 11, 12 nebo 13.
Existuje vztah mezi relativní specifickou účinností erythropoietinu in vivo a počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu z izoforem 5 až 11 (každá izoforma je zde označena počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu). Izoformy 11 až 14 vykazují přibližně stejnou relativní specifickou účinnost in vivo. Izoformy 5 až 14 byly zkoušeny na účinnost in vivo pomocí exhypoxického polycythemického biologického stanovení na myších. Množství každé z přítomných izoforem se zjistí Bradfordovým stanovením proteinů, měřením absorbance při 280 nm nebo radioimunoesejem (RIA) pro erythropoietin. Výsledky stanovení RIA vyjádřené v jednotkách/ml se dělí hodnotou 212 770 jednotek/mg erythropoietinového polypeptidu, průměrnou specifickou účinností purifikovaného erythropoietinu stanovenou metodou RIA, a tím se získají hodnoty koncentrace proteinu v izolovaných izoformách nebo směsích izoforem, které jsou vyjádřeny v miligramech erythropoietinového polypeptidu na mililitr. Jak je to ukázáno v příkladech, relativní specifická účinnost in vivo stupňovitě stoupá od izoformy 5 k izoformě 11 (viz tabulka 2).
Hodnoty specifické účinnosti in vivo, které jsou v tomto popisu uváděny, představují hodnoty získané měřením relativní specifické účinnosti in vivo a nikoliv měřením absolutní specifické účinnosti in vivo. Hodnot specifické účinnosti se v tomto popisu používá pouze pro srovnání relativní účinnosti izoforem zkoušených pomocí stejného stanovení za stejných podmínek, za použití stejného vnitřního standardu, stejného typu zvířete a za použití stejné analýzy dat použitých pro výpočet specifické účinnosti a za použití stejné zkoušky pro stanovení obsahu proteinu. Žádná z uvedených hodnot specifické účinnosti in vivo u kteréhokoliv z izoforem nepředstavuje inherentní nebo absolutní hodnotu charakteristickou pro tuto izoformu.
Předmětem vynálezu jsou také směsi obsahující dvě nebo více izoforem erythropoietinu. Pode jednoho provedení obsahují tyto směsi izoformy obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, než je předmětem určený počet, například vyšší počet než 11 nebo 12, a například se jedná o směs izoforem 12, 13 a 14. Podle jiného provedení obsahují tyto směsi izoformy s předem určeným počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, například s méně než 12, ale více než 8 zbytky kyseliny sialové v molekule, jako je tomu například v případě směsi izoforem 9, 10 a 11. Předmětem vynálezu jsou také směsi izoforem erythropoietinu, v nichž jsou vzájemná množství izoforem stejná nebo různá. Tak například směs izoforem 9, 10 a 11 může obsahovat jednotlivé izoformy v různých poměrech, jako například 1 :1 : 1,2 : 3 :1 nebo 20 :20:1.
S výhodou obsahují takové směsi méně než 4 izoformy a jedná se například o směsi izoforem 11, 12 a 13 nebo o směsi izoforem 12 a 14 nebo dále o směs izoforem 7 a 13.
Takové směsi izoforem erythropoietinu se podle vyrábějí podle vynálezu současnou izolací zvolených izoforem erythropoietinu. Tyto postupy zahrnují izolací jednotlivých izoforem takovými technikami, jako je preparativní izoelektrická fokusace nebo výrobu směsí izoforem obsahujících předem určený počet zbytků kyseliny sialové (například nad 11) takovými technikami, jako je ionexová chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na dělení proteinů podle náboje.
Ionexová chromatografie a chromatofokusace se obvykle provádí tak, že se buď surový humánní erythropoietin (médium zpracované buňkami), nebo purifikovaný materiál aplikuje na sloupec pryskyřice za podmínek umožňujících vazbu některých nebo všech izoforem erythropoietinu k pryskyřici. Pokud se používá surového erythropoietinu, přednostně se protein aplikuje na sloupec při hodnotě pH asi 7, zatímco purifikované proteinové přípravky se mohou aplikovat na sloupec při pH v rozmezí od 7 do asi 4. Po promytí sloupce pufrem o hodnotě pH asi 4 se izoformy erythropoietinu, které zůstanou navázány na sloupci ionexu, eluují zvýšením pH
-6CZ 291342 B6 a koncentrace soli vpromývacím pufru nebo aplikací gradientu se snižující se hodnotou pH a zvyšující se iontovou silou při pH asi 4. V případě chromatofokusace se izoformy eluují ze sloupce gradientem se snižující se hodnotou pH nebo promytím sloupce roztokem s vysokou koncentrací soli.
V přednostním provedení se jednotlivé izoformy izolují za použití ionexové chromatografie. Tak například izoforma 14 se izoluje za použití ionexové chromatografie způsobem popsaným v příkladu 8.
Do rozsahu vynálezu spadají také určité analogy humánního erythropoietinu. Pod označením „analog humánního erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietin zahrnující jednu nebo více změn aminokyselinové sekvence erythropoietinu, která má za následek zvýšení počtu míst připojení kyseliny sialové. Analogy se tvoří místně orientovanou mutagenezí zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, kterými se zvyšuje nebo mění počet míst, která jsou k dispozici pro glykosylaci. Takové analogy mohou obsahovat větší počet uhlohydrátových řetězců než humánní erythropoietin.
Analogy erythropoietinu podle vynálezu obsahují sekvenci aminokyselin, která zahrnuje přinejmenším jedno přídavné glykosylační místo. Analogy obsahující vyšší koncentraci kyseliny sialové než její obsah v humánním erythropoietinu se získávají zavedením glykosylačních míst, které nezpůsobí zmatení sekundární nebo terciární komformace potřebné pro biologickou účinnost. Analog humánního erythropoietinu s výhodou obsahuje 1, 2 nebo 3 přídavná místa pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci, což se projeví zavedením 1, 2 nebo 3 přídavných N-vázaných nebo O-vázaných uhlohydrátových řetězců. Tak například leucin v poloze 69 se nahradí asparaginem, za vzniku sekvence Asn-Leu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvykle dodat až čtyři přídavné zbytky kyseliny sialové do molekuly. Jako příklady změn, kterými lze vytvořit přídavná O-glykosylační místa, je výměna alaninu v poloze 125 za threonin a alaninů v polohách 124 a 125 za prolin (v poloze 124) athreonin (v poloze 125). Je možno sestrojit analogy obsahující jeden nebo více přídavných N-vázaných a O-vázaných řetězců, jako jsou například analogy NO1 a NO2 popsané v tabulce 5. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do rozsahu tohoto vynálezu spadá i mnoho dalších analogů humánního erythropoietinu obsahujících přídavná místa pro glykosylaci.
Analogy se zvýšenou četností připojení uhlohydrátů v glykosylačních místech rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Tyto analogy obvykle zahrnují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsném sousedství k N-vazebnému nebo O-vazebnému místu. Díky těmto změnám aminokyselin bude větší část erythropoietinových polypeptidů obsahovat uhlohydrátovou modifikaci. Glykosylační místa mohou být přirozená nebo mohou být vytvořena mutací. Tak například analog N13 neobsahuje přídavný uhlohydrátový řetězec, přestože do něj bylo zavedeno v poloze 88 glykosylační místo. Analogy N14 a N80, které obsahují v poloze 87 výměnu za serin (N14) nebo za valin (NI8), obsahují v poloze 88 přídavný uhlohydrátový řetězec.
Do rozsahu vynálezu spadají také analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin, kterými je nastaven karboxylový konec erythropoietinu, přičemž toto nastavení karboxylového konce zajišťuje zavedení alespoň jednoho přídavného uhlohydrátového místa. Při jednom provedení se zkonstruuje analog fúzí 28 karboxy-terminálních aminokyselin humánního chorionického gonadotropinu (HCG) k argininovému zbytku v poloze 166 humánního erythropoietinu. HCG karboxy-terminální fragment obsahuje čtyři místa pro O-glykosylaci (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254,7 907(1979)).
V tabulkách 3, 4 a 5 jsou uvedeny analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané uhlohydrátové řetězce. Tyto analogy obsahují sekvenci Asn-X-Ser/Thr zavedenou substitucí do různých poloh řetězce humánního erythropoietinového polypeptidu, za vzniku N-vazebných míst nebo obsahují zavedené zbytky šeřinu nebo threoninu, za účelem vytvoření O-vazebných míst.
-7CZ 291342 B6
V tabulce 6 jsou uvedeny analogy, umožňujícím zavedení přinejmenším jednoho přídavného N-vázaného nebo jednoho přídavného O-vázaného uhlohydrátového řetězce nebo zavedení přídavného N-vázaného a O-vázaného řetězce současně, jak je to dokumentováno migrací těchto glykoproteinů na SDS gelech (příklad 7). Jak je zřejmé z tabulek 3 a 6, analogy obsahující jedno nebo více přídavných míst pro připojení uhlohydrátu nemusí nutně vést ke vzniku molekul erythropoietinu obsahujících přídavné uhlohydrátové řetězce. Tak například zavedení threoninové substituce do polohy 123 a 125 má za následek připojení O-vázaného uhlohydrátového řetězce, zatímco zavedení serinové nebo threoninové substituce do jiných poloh nevede k získání analogů s přídavnými O-vázanými řetězci (viz tabulka 4). Zavedení asparaginových substitucí do poloh 30, 51,57,69,88,89,136 a 138 do sekvence humánního erythropoietinu se však projeví zavedením N-vázaného řetězce v těchto polohách. Fúze HCG polypeptidového fragmentu sargininovým zbytkem v poloze 166 humánního erythropoietinu vede ke vzniku fúzované molekuly erythropoietin-HCG obsahující přinejmenším dva přídavné O-vázané uhlohydrátová řetězce.
Analogy erythropoietinu podle vynálezu zahrnují též erythropoietin, jehož sekvence aminokyselin obsahuje přesmyk alespoň jednoho glykosylačního místa. Pod označením „přesmyk glykosylačního místa“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí delece jednoho nebo více glykosylačních míst v humánním erythropoietinu a zavedení jednoho nebo více nepřirozených glykosylačních míst. Jako příklady takových přesmyků je možno uvést analogy Rl, R2 a R3, které byly sestrojeny deleci N-vazebných míst v polohách 23 (Rl), 38 (R2) nebo 83 (R3) a zavedením N-vazebného místa do polohy 88. Jsou však možné i další četné typy přesmyků uhlohydrátových míst a vzniklé analogy mohou nebo nemusí mít vyšší počet glykosylačních míst ve srovnání s humánním erythropoietinem.
Analogy Rl, R2 a R3 byly analyzovány na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 7. Zavedení N-vázaného řetězce v poloze Asn88 vrátí biologickou účinnost erythropoietinu, z něhož bylo deleci vypuštěno kterékoliv za tří přirozených N-vazebných míst. Tyto výsledky ukazují, že polohy uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu se mohou měnit za účelem získání užitečných analogů, aniž by se podstatně ovlivnila jejich biologická účinnost.
Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také sekvence DNA kódující analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané řetězce, analogy obsahující přesmyk alespoň jednoho místa připojení pro uhlohydrátový řetězec a analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin prodlužujících karboxylový konec erythropoietinu. Postupy, kterých se používá pro zavádění změn o sekvence DNA kódující humánní erythropoietin za účelem vytvoření nebo změnu vazebných míst pro uhlohydrátové řetězce jsou uvedeny v příkladu 6.
Tyto analogy erythropoietinu mohou být produktem exprese exogenní sekvence DNA, tj. sekvence DNA vytvořené technologií rekombinance DNA nebo se může jednat o syntetické produkty. Exogenní sekvence DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA nebo chemicky syntetizovanou DNA kódující analog erythropoietinu.
Do rozsahu vynálezu spadají také rekombinantní DNA plazmidy a eukaryontní hostitelské buňky, které jsou užitečné pro expresi takových analogů. Expresní vektory zahrnují jakékoliv vektory, které jsou schopny exprimovat klonované sekvence DNA v eukaryotní hostitelské buňce, zejména vektory používané pro expresi v buňkách COS a CHO. Jako příklady takových vektorů je možno uvést plazmidy pEC a pDECdelta popsané v příkladu 6 dále. Kultivace hostitelských buněk COS a CHO exprimujících analogy erythropoietinu se provádí za použití postupů, které jsou odborníkům v tomto oboru známy.
Izolované izoformy a směsi izoforem odvozené od analogů erythropoietinu se získají výše popsanými metodami pro výrobu izoforem humánního erythropoietinu. Tyto metody mohou zahrnovat izoelektrickou fokusaci, ionexovou chromatografii a chromatofokusaci. Pro výrobu
-8CZ 291342 B6 jednotlivých izoforem a směsí izoforem analogů erythropoietinu se přednostně používá ionexové chromatografie.
Zvýšením počtu uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu, a tedy zvýšením počtu zbytků kyseliny sialové, vztaženého na molekulu erythropoietinu, se mohou výsledným produktům dodat výhodné vlastnosti, jako je zvýšená rozpustnost, vyšší odolnost vůči proteolýze, snížená imunogenicita, zvýšený poločas životnosti v séru a zvýšená biologická účinnost.
Média zpracovaná buňkami CHO exprimujícími analogy erythropoietinu byla analyzována na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Několik z těchto zkoušených analogů vykazuje účinnost, která je třikrát nebo vícekrát vyšší než účinnosti humánního erythropoietinu. Zejména analogy obsahující přídavný N-vázaný uhlohydráto\ý řetězec v některé z poloh 30 nebo 88 vykazují dvojnásobně až trojnásobně vyšší účinnost než humánní erythropoietin, zatímco analogy obsahující přídavné O-vázané řetězce díky fúzi humánního erythropoietinu s fragmentem HCG polypeptidu vykazují přinejmenším dvakrát vyšší účinnost.
Dva analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce byly purifikovány a byly izolovány směsi s různým obsahem kyseliny sialové (příklad 8). Analogy' Thr12’ a Ser Asn Thr (EPO NI4) byly rozděleny do tří separátních frakcí izoforem a byla stanovena biologická účinnost každé z těchto frakcí. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 8 ukazují, že izoformové frakce EPO N14 s vyšším obsahem kyseliny sialové vykazují vyšší účinnost in vivo.
Frakce izoforem s vyšším obsahem kyseliny sialové analogu EPON14 a rekombinantní humánní erythropoietin (izoformy 9 až 14) byly studovány za použití zkoušky vazby kreceptoru, farmakokinetických pokusů a pokusů zaměřených na stanovení zvýšení hematokritu u myší. Výsledky těchto zkoušek ukazují, že existuje přímý vztah mezi obsahem kyseliny sialové, poločasem životnosti a schopností zvýšit hematokrit ošetřených myší. Jak je zřejmé z obr. 13, 14 a 15, frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 vykazuje podstatně vyšší poločas in vivo a vyvolává vyšší nárůst hematokritu než izolovaná izoforma 14 nebo rekombinantní humánní erythropoietin přestože se frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 neváže k receptoru tak silně.
Předmětem vynálezu jsou také savčí hostitelské buňky [například buňky z ovarií čínského křečka (CHO)], které přednostně syntetizují izoformy humánního erythropoietinu nebo analogů erythropoietinu obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule, než je počet specifický, například nad 10 zbytků kyseliny sialové v molekule. Molekuly erythropoietinu obsahují N-vázané a O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou omezovat obsah kyseliny sialové v molekule. Tak například tetraantenámí (se čtyřmi rozvětveními) N-vázané oligosacharidy nejčastěji poskytují čtyři možná místa pro připojení kyseliny sialové, zatímco biantenámí a triantenámí oligosacharidové řetězce, kterými může být nahrazena tetraantenámí forma na asparaginových vazebných místech, obvykle obsahují nejvýše pouze 2 nebo 3 připojené zbytky kyseliny sialové. O-vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení kyseliny sialové. Molekuly erythropoietinu tedy mohou přijmout celkem 14 zbytků kyseliny sialové, za předpokladu, že jsou všechny tři N-vázané oligosacharidy tetraantenámí. Kultury savčích buněk se podrobí screeningu na buňky, které přednostně zavádějí tetraantenámí řetězce do rekombinantního erythropoietinu, což má za následek maximalizaci počtu míst pro připojení zbytků kyseliny sialové.
N-vázané oligosacharidy erythropoietinu izolovaného z moči obsahující kyselinu sialovou jak s vazbou a 2,3, tak s vazbou a 2,6 ke galaktóze (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3 657 (1988)). Kyselina sialová s vazbou a 2,3 se obvykle aduje na galaktózu na mannosové větvi a 1,6 a kyselina sialová s vazbou a 2,6 se aduje na galaktózu na mannosové větvi a 1,3. Pro zavádění kyseliny sialové do mannosové a 1,6 a mannosové a 1,3 větve jsou nejúčinnější
-9CZ 291342 B6 enzymy schopné vyvolávat adici sialové kyseliny (β-galaktosid a 2,3 sialyltransferáza a βgalaktosid a 2,6 sialyltransferáza).
Pro produkci rekombinantních glykoproteinů, včetně rekombinatního erythropoietinu, se jako hostitelských buněk obvykle používá buněk z ovarií čínského křečka (CHO), které jsou deficientní na dihydrofolát reduktázu (DHFR). Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a 2,6 sialyltransferasu, a proto neadují kyselinu sialovou s vazbou a 2,6 kN-vázaným oligosacharidům glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Tekeuchi et al.. J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). V důsledku toho rekombinantní erythropoietin produkovaný v buňkách CHO neobsahuje kyselinu sialovou s vazbou 2,6 ke galaktóze (Sasaki et al. (1987), výše uvedená citace; Takeuchi et al. (1987) výše uvedená citace)).
V dalším provedení tohoto vynálezu se humánní erythropoietin nebo analog erythropoietinu produkuje v buňkách CHO, které jsou transfekovány funkčním genem β-galaktosid a 2,6 sialyltransferázy, za účelem zavedení kyseliny sialové do galaktózy s vazbou a 2,6. Výsledné izoformy budou obsahovat kyselinu sialovou vázanou ke galaktóze jak vazbou a 2,3, tak vazbou a 2,6. Popis technik, kterými se vytvářejí modifikované buňky CHO nebo jiné hostitelské savčí buňky je uveden v Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13 848 (1989).
Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství specifické izoformy nebo směsi izoforem v kombinaci s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem užitečným při léčbě erythropoietinem. Do rozsahu vynálezu spadají též farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu spolu s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem. Pod označením „terapeuticky účinné množství, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí množství, s nímž se za daných podmínek a při daném režimu podávání dosáhne terapeutického účinku. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají parenterální cestou. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají ve formě prostředku obsahujícího vhodný nosič, jako je humánní sérový albumin, vhodné ředidlo, jako je pufrovaný roztok chloridu sodného a/nebo vhodný adjuvans. Za požadovanou dávku bude považována dávka postačující pro zvýšení hematokritu léčených pacientů. Tato dávka se bude měnit v závislosti na závažnosti léčené choroby, použitém způsobu podávání apod.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter, a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Jako erythropoietinového standardu se při biologických zkouškách in vivo popsaných v příkladech používá rekombinantního erythropoietinového standardu standardizovaného proti částečně purifikovanému erythropoietinovému standardu z moči. Měří se tedy pouze relativní specifická účinnost in vivo. Specifická účinnost in vivo je proto také vyjadřována v ,jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ ajednotkách/A28o a nikoliv v jednotkách „IU/ml“, „IU/mg“ a „IU/A28o“, poněvadž použitý erythropoietinový standard nebyl přímo korelován s žádným existujícím mezinárodním standardem.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace izoforem rekombinantního erythropoietinu
Rekombinantní erythropoietin se vyrobí způsobem popsaným v publikaci Lin, uvedené výše. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí látka pro první a třetí izolaci izoformy se
-10CZ 291342 B6 purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše. Výchozí látka pro druhou a pátou izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lai et al., který je modifikován tím, že se použije chromatografíe na Q-Sepharose. Tyto přípravky obsahují směsi izoforem rekombinantního erythropoietinu se stejnou aminokyselinovou sekvencí, jako má humánní erythropoietin získaný z moči a převážně obsahují izoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro čtvrtý preparativní postup pro získaní izoformy představuje materiál eluovaný během promývání sloupce anexu z příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. 5mM kyselinou octovou(lmM glycinem/óM močovinou. Tato frakce obsahuje izoformy s počtem zbytků sialové kyseliny 9 nebo nižším a dále se před použitím na preparativní izoelektrickou fokusaci purifikuje gelovou filtrační chromatografií popsanou v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. Při šesté přípravě izoformy se jako výchozího materiálu používá purifikovaného rekombinantního erythropoietinu s obsahem 4 až 13 zbytků kyseliny sialové. Tento materiál se purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše, pouze s tím rozdílem, že se modifikuje zpracování ionexového sloupce (eluce rekombinantního erythropoietinu se provádí gradientem chloridu sodného při pH 8,8 a vypustí se promývání kyselinou octovou/močovinou. Při tom se dosáhne retence většiny izoforem obsažených ve výchozím materiálu.
Při šesti různých preparativních postupech pro získání jednotlivých izoforem se použije preparativní izoelektrické fokusace v granulovaném gelovém loži (Ultrodex LKB). Tyto postupy se provádějí v podstatě stejně jako je to uvedeno v poznámce LKB Application Notě 198. Používá se amfolytů Pharmalyte 2.5-5 (Pharmacia a použité gelové lože obsahuje 5M močovinu.
Při první přípravě se přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodném o pH 7,0 nanese na gel a přibližně 16 hodin fokusuje při výkonu 8 W. Po izoelektrické fokusaci se pásy izoforem na gelu vizualizují přetisknutím gelového lože na papír. Získaný otisk se fixuje máčením v fixačním roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% kyselina sulfosalicylová) při celkem třech výměnách fixační lázně, přičemž zpracování v každé lázni se provádí 10 minut při teplotě místnosti, potom se provede jedna výměna za roztok o složení 40% methanol/10% kyselina octová (zpracování se provádí při teplotě 30 až 60 °C po dobu přibližně 10 minut), pásy se 15 minut barví při 60 °C 0,125% roztokem modři Coomassie Blue R-250/4% methanol/10% kyselina octová, načež se provede odbarvení v 7,5% methanolu/10% kyselině octové, aby se zviditelnily oddělené izoformy. Oblast granulovaného gelového lože obsahující izoformy (asi 50% pryskyřice) se odstraní, smíchá s vodou (asi 16 ml) a suspenze se nalije na misku o rozměrech 14x62 cm a odpaří se na čistou hmotnost přibližně 40 g. Vzniklý přípravek se fokusuje podruhé a výše uvedeným způsobem se provede kontaktní otisk gelového lože. 4ást gelu obsahující každou ze 6 rozeznatelných izoforem se z gelového lože odstraní.
Eluce izoforem z gelu se provede přídavkem roztoku obsahujícího lOmM Tris-HCl o pH 7,0/5mM Chaps ke každé izoformě. Každá vzniklá suspenze se uvede do krátké kolony a eluuje pufrem Tris-Chaps. Eluáty se shromáždí a odděleně aplikují na krátké kolony (konfigurace s otevřenou kolonou) obsahující pryskyřici s obrácenou fází Vydac C4 ekvilibrovanou ve 20% ethanolu/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0,35% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a 65% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Frakce eluovaná 65% ethanolem/lOmM Tris se zředí v poměru 1 : 1 lOmM Tris-HCl o pH 7,0, zkoncentruje a potom se provede výměna pufru (lOmM Tris-HCl o pH 7,0) v mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Analytická izoelektrická fokusace tohoto přípravku se provádí v podstatě způsobem popsaným v poznámce LKB Technical Notě 250 za použití Servalyte 3-5 amfolinů (Serva) na polyakrylamidovém gelu obsahujícím 5M močovinu.
Při druhém preparativním postupu se přibližně 26 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody nanese na gel a fokusuje při 2,5 W po dobu 35 minut a při 10 W po dobu asi 17 hodin. Pásy fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odstraní, a tak se
-11 CZ 291342 B6 získá celkem 11 produktů. Objem každého z těchto produktů se upraví na 7,5 ml deionizovanou vodou a 20 ml každého z výsledných supematantů se podrobí analytické izoelektrické fokusaci popsané výše. Ke každému z produktů se přidá 5 ml 1,5M Tris-HCl o pH 8,8 a každá ze suspenzí se převede do malé kolony a sloupcem se nechá protéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně 3 objemy sloupce 0,5M Tris-HCl o pH 7 a promývací roztok se spojí s eluátem. Spojené eluáty zkoncentrují a provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Zkoncentrované roztoky (přibližně 0,5 ml) se potom nechají projít filtrem z acetátu celulózy s vylučovací mezí 0,22 pm. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že 5 produktů obsahuje převážně vždy jedinou izoformu 10, 11, 12, 13 a 14.
Při třetím preparativním postupu se přibližně 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody nanese na gel a provede se fokusace 25 minut při 2 W, 20 hodin při 10 W a 15 minut při 15 W. Pásy proteinu odpovídající jednotlivým izoformám se zjistí vizuálně a odstraní z gelového lože. K izoformám izolovaným na gelu se přidá destilovaná voda, čímž vznikne suspenze a výsledné supematanty se analyzují analytickou izoelektrickou fokusaci. Ke každé suspenzi se přidá stejný objem 1M Tris-HCl o pH 7,2, suspenze se převedou do separátních krátkých kolon a kapalná fáze se nechá protéci kolonou, aby se eluovaly izoformy. Každý eluát se zkoncentruje, provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití z ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že byly získány produkty obsahující převážně jednotlivé izoformy 9, 10, 11, 12, 13 a 14.
Při čtvrtém preparativním postupu pro získání izoforem se jako výchozího materiálu použije erythropoietinu obsahujícího izoformy 3 až 9 (vyrobeného výše popsaným způsobem). Před preparativním izoelektrickou fokusaci, která se provádí v podstatě způsobem popsaným v souvislosti s preparativními postupy 1 až 3, se amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionují v izoelektrické fokusační cele s kapalnou fází Rotofor (Bio-Rad, Richmond, Kalifornie, USA), aby se získalo amfolytové rozmezí vhodnější pro nižší izoelektrické body výchozího materiálu. Prefakcionace se provádí tak, že se 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 smíchá s 15 g močoviny a objemem směsi se purifikovanou vodou doplní na 50 ml. Vzniklá směs se frakcionuje v zařízení Rotofor při 10 W, teplotě 1 °C po dobu 5,5 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné, jako anolytu a 0,1 M hydroxidu sodného, jako katolytu. Amfolytové frakce s naměřenými hodnotami v rozmezí od 4,5 do asi 6 se použijí na izoelektrickou fokusaci v plochém loži.
Amfolyty se odstraní z izoforem za použití zařízení Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachuttses, USA) a za použití zařízení Centricon s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton (Amicon). přitom se pracuje za těchto podmínek: 0,18 Tris-pufr o pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3hodiny. U izoforem se provede výměna pufru (0,lM chlorid sodný) pomocí gelové filtrace za použití náplně Sepkadex G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusace 5 výsledných produktů ukazuje, že tyto produkty obsahují izoformy 4, 5,6, 7 a 8. Izoforma 4 přechází ve formě několika pásů, což ukazuje, že u ní mohla proběhnout v určitém rozsahu degradace.
Pátý preparativní postup pro získání izoforem se modifikuje zařazením prefokusačního stupně do izoelektrikého fokusačního postupu na plochém loži. Při této modifikaci se protein nepřidá ke směsi amfolytu, močoviny a gelu před elektroforézou, ale zavede se do izoelektrického fokusačního zařízení po vytvoření gradientu pH vgelovém loži. Po provedení prefokusace (75 minut, 1 500 Volt-hodin) se úsek gelového lože v rozmezí od 2,25 do 4,25 cm od katody vyjme, smíchá s roztokem erythropoietinu a vrátí zpět do gelového lože. Po izoelektrické fokusaci se z gelového lože izolují izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 a oddělí se od amfolytů ultrafiltraci za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).
Modifikace prefokusací se provádí z toho důvodu, aby se charakteristiky ultrafialové absorbance izoformových přípravků připodobnily charakteristikám výchozího rekombinantního erythro
-12CZ 291342 B6 poietinu. Toto zlepšení spektrálních charakteristik je zřejmé z poměru absorbance izolovaných izoforem při 280 a 260 nm. Průměrný poměr absorbance při 280 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) u izoforem z preparativních postupů 2 a 3 (bez prefokusace) se 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A28o/A26o u preparativních postupů 5 a 6 (s prefokusací) je 1,68 ± 0,20. Když se z výpočtu vyloučí izoforma č. 14, dosáhne se průměrného poměru A28o/A26o v případě preparativních postupů 2 a 3 hodiny 1,39 ± 0,11 a v případě preparativních postupů 5 a 6hodnoty 1,74 ±0,09 (izoforma 14 má možná nejvíce atypické spektrum, poněvadž je přítomna v nejmenším množství a je tedy náchylnější k interferencím stopovými nečistotami složek amfolytu nebo z toho důvodu, že je nejblíže elektrodě v průběhu izoelektrické fokusace na plochém loži). Průměrná hodnota poměru A28o/A26o pro rekombinantní erythropoietin vyrobený podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. (za použití modifikace popsané výše, která spočívá v tom, že se jako anoxové pryskyřice použije O-Sepharose) je 1,91 ± 0,04.
Jak již bylo uvedeno výše, výchozím materiálem pro šestý preparativní postup pro výrobu izoforem je rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující izoformy 4 až 13. Amfolyty se prefokusují v zařízení Rotofor, tak jako v případě čtvrtého přípravku. Frakce amfolytu s naměřenými hodnotami pH v rozmezí 3,7 až 4,8 se podrobí izoelektrické fokusaci na plochém loži. Ploché lože se prefokusuje tak, jako v případě pátého preparativního postupu a po ultrafiltraci (Centricon 10) pro odstranění nosičových amfolytů se získají izoformy č. 9,10,11,12 a 13.
Příklad 2
Obsah kyseliny sialové v izoformách rekombinantního erythropoietinu
U izoforem izolovaných způsobem popsaným v příkladu 1 a eiythropoietinu puntíkovaného způsoby popsanými ve výše uvedené publikaci Lai et al. (směs izoforem 9 a 14) se provede výměna pufru za použití 0,10 až 0,15M chloridu sodného a provede se analýza na obsah kyseliny sialové za použití modifikovaného postupu popsaného v Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky kyseliny sialové se odštěpí od glykoproteinů hydrolýzou pomocí 0,35M kyseliny sírové (80 °C, 30 minut) a vzniklé roztoky se neutralizují před analýzou hydroxidem sodným. Za účelem odhadu množství přítomného erythropoientinového proteinu se provede Bradfordovo stanovení proteinů (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976) za použití rekombinantního erythropoietinu s aminokyselinovou sekvencí humánního erythropoietinu, jako standardu. Použije se zkouškových činidel a mikrometody Bio-Rad. Výsledky vyjádřené v mol kyseliny sialové na mol erythropoietinu jsou zřejmé z tabulky 1. Izoformy se označí podle počtu zbytků sialové kyseliny v molekule a vykazují rozmezí od nejméně kyselých (izoforma 9) do nejkyselejších (izoforma 13). Izoformy 9 až 13 jsou přítomny vgelových drahách 6 až 10 (viz obr. 1). Množství izoformy 14 není dostatečné pro přesné změření obsahu kyseliny sialové. Obsah kyseliny sialové v této izoformě se dedukuje na základě migrace této izoformy na IEF gelech vzhledem k ostatním izoformám. Obsah kyseliny sialové v izoformách 5 až 8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, ale podobně se dedukuje na základě migrace na IEF gelech.
Tabulka 1
Izoforma erythropoietinu | Obsah kyseliny sialové [mol/mol erythropoietinu] |
izoforma 13 izoforma 12 izoforma 11 izoforma 10 izoforma 9 směs izoforem (9 až 14) | 12,9 ±0,5 11,8 ±0,2 11,0 ±0,2 9.8 ± 0,3 8.9 ± 0,6 11,3 ±0,2 |
- 13CZ 291342 B6
Příklad 3
Účinnost izoforem rekombinantního erythropoietinu
Izoformy izolované způsobem popsaným v příkladu 1 se zkoušejí postupem využívajícím absorbanci při 280 nm, Bradfordovým proteinů a metodou RIA pro erythropoietin, aby se zjistilo množství přítomného rekombinantního eiythropoietinu. Pro stanovení relativní biologické účinnosti in vivo se použije exhypoxického polycytohemického biostanovení a myších (Cotes etal., Nátuře, 191, 1 065 (1961)). Při kvantitativním stanovení množství přítomného erythropoietinového proteinu za použití radioimunoeseje pro erythropoietin se u některých izoforem naměří vyšší relativní specifické účinnosti in vivo v důsledku zjevně snížení imunoreativity imunoforem obsahujících velké množství kyseliny sialové, což vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu, a tedy nadhodnocení relativní specifické účinnosti in vivo u většiny negativních izoforem. Výsledky biostanovení na myších, vyjádřené v jednotkách/ml, se dělí odpovídajícími koncentracemi proteinu, přičemž se získají specifické účinnosti polypeptidu. Hodnoty specifické účinnosti jsou uvedeny v tabulce 2.
V tabulce 2 znamená index „n“ počet nezávislých izoformových přípravků jejichž výsledky přispívají k výsledné hodnotě specifické účinnosti. Ve většině případů bylo s každým izoformovým přípravkem provedeno několik stanovení in vivo. Stejná data in vivo přispívají k výpočtům specifické účinnosti ve všech tří sloupcích. Obsah erythropoietinového polypeptidu v jednotkách/mg se stanoví na základě absorbance při 280 nm, na základě potence při radioimunoeseji nebo z výsledků Bradfordova stanovení proteinu. Jako standardu pro Bradfordovo stanovení proteinů se používá purifíkovaného rekombinantního erythropoietinu obsahujícího izoformy 9 až 14. Hodnota indexu „n“ může být u výpočtů pořízených za použití dat z Bradfordova stanovení proteinů nižší, poněvadž některé přípravky již v době provádění Bradfordova stanovení nebyly k dispozici.
Jako standardu pro radioimunoeseje a pro stanovení in vivo se používá erythropoietinu purifíkovaného způsoby popsanými v Lai et al. (výše uvedená publikace), který obsahuje směs izoforem 9 až 14.
Hodnoty relativní specifické účinnosti, které jsou vyjádřeny v jednotkách/mg (U/mg) erythropoietinového polypeptidu, je možno provést na jednotky/A280 vynásobením hodnotou 0,807 mg erythropoietinového polypeptidu/A28o. Tento převodní faktor se získá vynásobením extrikčního koeficientu pro erythropoietin (1,345 mg/A28o) obsahem proteinu v eiythropoietinovém glykoproteinu (přibližně 60 % hmotnostních, Davis et al., Biochemistry, 26, 2 633 (1987)) a tím se získá hodnota v mg erythropoietinového polypeptidu/A280 (tj. 1,345 mg eiythropoietinu/A28o x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A280). Kromě toho je možno hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu vynásobit faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu, a tím se získají hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového glykoproteinu.
-14CZ 291342 B6
β | 04 | m | m | ^s· | m | 04 | rH | r4 | r—< |
>*s | O | o | o | o | o | O | |||
bfl | o | o | o | o | o | O | |||
p O | cn | OJ | kO | 0· | ve | ve | o | o | o |
o | o | o | |||||||
>_? t—4 O Pí >*4 | m | o | 04 | 04 | r-f | cn | tn | ve | |
tn | <β· | V | kO | m | tn | m | in | r-4 | |
XD Ό Ό *»h rtt | |||||||||
•H | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 | |
•W r-H | o | O | O | o | o | o | |||
o | o | o | o | o | o | o | o | o | |
β) -CJ N | Γ» | Ol | r* | <r | cn | ve | o o | O co | o LQ |
£ a | k0 | Γ- | o- | rH | rH | cn | 04 | m | |
0 c | ta | m | co | m | o- | fH | r-4 | ||
Ph O | m | rn | Ol | 04 | rH | kO | xr | t“H |
IX) LQ V r> CM
r-4
a £>
Λ
o | o | o | O | o | ||||
o | o | o | O | o | O | |||
r· | tn | o- | tn | tn | o | o | o | o |
Ο- | o | o | o | |||||
r* | <n | τ-< | t- | rH | cn | cn | ||
cn | LQ | v | ve | r> | νο | |||
a· | ve | t-t | ||||||
-H | 44 | 44 | 44 | 44 | +4 | 44 | 44 | +4 |
o | o | o | o | o | ||||
o | o | o | o | o | o | o | o | o |
CD | v | co | m | o | o | o | o | |
ve | ve | m | m | |||||
io | co | co | IQ | o | ||||
o | m | LQ | m | o- | ve | o | o | CD |
OJ | 04 | Ol | Ol | <-4 | cn | o- | m | r~1 |
oj «· ί· rn »-·
o | o | o | ||
O | o | o | o | O |
o | ve | ve | i—I | O |
»-H | o | LQ | r-l | cn |
cn | <n | rn | >«· | rM |
44 | 44 | 44 | 44 | 44 |
o | o | o | o | O |
o | o | o | o | o |
M- | ve | Ol | r- | o |
σ» | r- | tn | Ol | CD |
m | o | r- | co | 00 |
Ol | cn | Ol | 04 | H |
o o o o o o co co Γ* m in th •Η 44 44 o o o o 04 o)
ΙΟ VD
V0 sr
600
V | cn | CM | r-i | o o co r- to |
«-Ι | rM | rH | r4 | H |
- 15CZ 291342 B6
Data uvedená v tabulce 2 jsou také zpracována graficky na obr. 2A, 2B a 2C. Tato data ukazují, že relativní účinnost erythropoietinu in vivo stoupá v závislosti na obsahu kyseliny sialové až do izoformy č. 111. Izoformy 11 až 14 vykazují v podstatě stejnou relativní biologickou účinnost invivo (to je nejzjevnější, když se koncentrace izoformy 14 vyjádří za použití hodnoty z Bradfordova stanovení. Bradfordova hodnota může být pro izoformu 14 přesnější s ohledem na obecně nízkou dosaženou koncentraci a v důsledku toho na obtížnost stanovení A2S0 a nejzjevněji sníženou reaktivitu při RIA u velmi negativních forem, viz \ýše uvedená diskuse). Vyšší relativní specifická účinnost in vivo izoforem erythropoietinu s větším množstvím sialové kyseliny je nej pravděpodobněji způsobena delším poločasem životnosti těchto forem v oběhu. Izoformy 9 a 13 byly označeny radioaktivním jódem ('T) a byla změřena jejich rychlost clearance u krysy. Poločas životnosti v oběhu je v případě izoformy 13 podstatně delší než v případě izoformy 9.
Příklad 4
Selekce směsí izoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografií na Q-Sepharose
Média zpracovaná buňkami produkujícími rekombinantní erythropoietin (získaná postupy popsanými ve výše uvedené publikaci Lín) se zkoncentrují a diafíltrují proti lOmM Tris opH7,2. Koncentrace proteinus e stanoví Bradfordovým proteinovým mikrostanovením za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. K 19,6 ml roztoku obsahujícímu 40 mg celkového proteinu se přidá síran měďnatý do koncentrace 20μΜ, roztok se přefiltruje přes filtr s vylučovací mezí 0,45 pm a nanese na sloupec (1,05 cm-výška; 2,2 cm-průměr) obsahující 4ml lože náplně O Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrované s lOmM Tris o pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po nanesení vzorku se sloupec promyje dvěma objemy sloupce stejného pufru. Průtok sloupcem je přibližně 1 ml/min. Při tomto postupu se pro selekci definovaných směsí izoforem erythropoietinu použije 6 oddělených kolon.
Kolony se promyjí 6 až 9 objemy sloupce pufr s nízkým pH, který se v případě kolony 1 skládá z 150 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 2 z 200 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 4 z 300 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 5 z 150 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny a v případě kolony 6 z 300 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny. Hodnota pH v kolonách se zvýší na asi pH 7 promytím každé kolony 8 až 11 objemy sloupce 10 mM Tris-HCl, 55 mM chloridu sodného, 20 μΜ síranu měďnatého o pH 7. Definované směsi izoforem erythropoietinu se eluují ze sloupců promytím 10 mM Tris-HCl, 140 mM chloridem sodným a 20 μΜ síranem měďnatým o pH 7,0.
Eluované izoformové produkty z každé kolony se zkoncentrují a rozpouštědlo se vymění za vodu za použití mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Výsledky analytické izoelektrické fokusace těchto zkoncentrovaných produktů jsou uvedeny na obr. 3. V gelových drahách 1 až 6 jsou v uvedeném pořadí obsaženy definované směsi izoforem erythropoietinu eluované ze sloupců 1 až 6. Směs izoforem obsažená v gelové dráze u levého okraje obr. 3 představuje buněčné médium aplikované na sloupec Q-Sepharose popsaný výše, přičemž sloupec je promyt 5mM kyselinou octovou, lmM glycinem, 20μΜ síranem měďnatým, 6M močovinou a směs izoforem erythropoietinu je eluována ze sloupce za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs izoforem se dále purifikuje způsoby popsanými ve výše citované publikaci Lai et al. před prováděním analytické izoelektrické fokusace.
-16CZ 291342 B6
Příklad 5
Frakcionace izoforem rekombinantního erythropoietinu za použití gradientu s nízkou hodnotou pH na Q-Sepharose
Při dalším postupu se izoformy erythropoietinu dělí za použití gradientu s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Koncentrované diafiltrované médium obsahující erythropoietin se nanese na sloupec Q-Sepharose v přibližném poměru 40 mg celkového proteinu na ml gelu. Potom se sloupec promyje přibližně 2 objemy sloupce lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a následně přibližně 10 objemy sloupce 2mM kyseliny octové/lmM glycinu/20pM síranu měd’natého/6M močoviny (o pH přibližně 4,8), aby se odstranily kontaminační proteiny a izoformy erythropoietinu obsahující méně než 7 zbytků ky seliny sialové. Izoformy obsahující přibližně 8 až 12 zbytků kyseliny sialové se eluují ze sloupce za použití gradientu od přibližně 2mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatého do 40mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém (o pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů sloupce a sbírají se frakce o přibližném objemu jednoho sloupce do nádob obsahujícím Tris pufr v objemu postačujícím pro úpravu pH na hodnotu v rozmezí od 6 do 8,5, aby se zabránilo dlouhodobé expozici zachycených frakcí nízké hodnotě pH. Dělení se monitoruje analytickou izoelektrickou fokusací alikvotních vzorků frakcí. Na obr. 4 je znázorněno dělení izoforem 8 až 11, které lze tímto postupem provést. Izoformy 12 až 14, které zůstanou po skončení gradientově eluce vázány ke sloupci, se eluují promytím pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 140mM chlorid sodný a 20mM síran měďnatý (o pH 7,0). Izoformy (oddělené gradientovou elucí nebo eluované roztokem chloridu sodného) se zbaví kontaminačních proteinů chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií (viz příklad 2 výše uvedené publikace Lai et al.).
Příklad 6
Konstrukce analogů humánního erythropoietinu
Existující místa připojení uhlohydrátových zbytků v aminokyselinové sekvenci humánního erythropoietinu jsou uvedena na obr. 5 (SEQ ID. NO: 26). Postupy, kterými se vytvářejí přídavná glykosylační místa v erythropoietinu, jsou souhrnně uvedeny na obr. 6A až 6C a jsou popsány dále.
-17CZ 291342 B6
Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.
[Asn*, Ser^J EPO: 5’ CGCCCACCAAAQCTCAQQTGTGACAGCCGA 3' (SEQ ID NO: 1) (AsnS, Ser11] EPO: 5’ ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' (SEQ ID. NO: 2) [Asn69] EPO: 5' GGGCCTGGCCAAQCTGTCGGAAG 3' (SEQ ID. NO: 3) [Asnl24] epo: 5’ TCCCCTCCAGATfiATGCCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 4) [Asn125, Ser127] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCATQ^GCTCCAC 3’ (SEQ ID. NO: 5) [Asn1^, Ser1^] £PO: 5' AGGCCTGCAGGAŽZGGGaGSAGATGACCAGGTG 3’ (SEQ ID. NO: 6) [Thr125] EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3’ (SEQ ID. NO: 7) [Pro12*, Thr125] EPO: 5’ CCTCCAGATCCG&CCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 8)
Podtržené kodony ukazují párované oblasti, v nichž aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují aminokyseliny divokého typu.
Produkt [Asn4, Ser6]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N—glykosylačního místa do Asn 4. Produkt [Asn9, Sern]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 9. produkt [Asn69]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 69. Produkt [Asn125, Ser1 7]EPO se zkonstruuje za účelem 10 zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 125. Produkty [Thr125]EPO a [Pro124, Thr125]EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr125.
-18CZ 291342 B6
Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.
[Asn69, Thr71] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGC.TGTC. 3’ (SEQ ID. NO: 9) [Ser^8, Asn69, Thr71] EPO:
5’ CAGGGCCTGIQCAňQCTGaCAGAAGCTGTC 3' (SEQ ID. NO: 10) [Asnl25, Thr!27] EPO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 11) [Asnl25, Thr 127, Thr 131] EPO:
'ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' (SEQ ID. NO: 12) [Prol24, Asnl25, Serl27] EPO:
5' CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3' (SEQ ID. NO: 13) [Prol24, Asnl25, Tiirl27] EPO:
5’ CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 14) [Thrl25, Thrl26] EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3’ (SEQ ID. NO: 15) [Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]EPO
Pomocí [Pro124, Thr125]EPO cDNA, jako výchozí látky se oligonukleotidový primer 5-AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3'(SEQ ID. NO: 16) převede na [Pro124, Thr125, Thr126]EPO. Oligonukleotidového primerů 5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' (SEQ ID. NO: 17) se potom použije pro vytvoření [Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]EPO se potom použije pro vytvoření [Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]EPO.
Produkty [Asn69, Thr71]EPO a [Ser68, Asn69, Thr71]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 69 a pro zvýšení stupně N-glykosylace v tomto místě. Produkty [Asn125, Thr127]EPO, [Asn125, Thr127, Thr131]EPO, [Pro124, Asn125, Ser127]EPO a [Pro124, Asn125, Thr127]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 125 a pro zvýšení 15 stupně glykosylace v tomto místě. Produkty [Thr125, Thr126]EPO a [Pro124, Thr125, Thr126, Ser131]EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr125 a za účelem zvýšení glykosylace v tomto místě.
-19CZ 291342 B6
Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenezi je plazmid Hul3, což je klon humánní erythropoietinové cDNA vpUC8 (Law et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 6 920 (1986)). Plazmidová DNA získaná z Hul3 se štěpí restrikčními enzymy BstEII a BglII, vzniklé fragmenty DNA se podrobí elektrofotoréze na Agarózovém gelu a fragment erythropoietinové DNA o délce 810 bázových párů (bp) se izoluje z gelu za použití soupravy GeneClean(R) a postupů poskytnutých výrobcem (BIO 101, lne.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje genomový gen erythropoietinu, jakožto fragment BamHI vložený do derivátu pBR322 (použitý způsob je popsán ve výše citovaném patentu, původce Lin). pBRgHuEPO se také štěpí BstEII a BglII a izoluje se vektorový fragment o délce 6 517 bp. Ligací těchto dvou fragmentů se získá IGT1. Při konstrukci pEC-1 se pDSVL (který je popsán ve výše uvedeném Línově patentu a který je znázorněn na obr. 5B) štěpí BamHI a liguje se do něj izolovaný 2,8kb fragment BamHI z IGT1 obsahující erythropoietinovou cDNA.
Pro vytvoření jednořetězcové DNA pro in vitro mutagenezi se pEC-1 štěpí BamHI a BglII a izoluje se 820pb fragment erythropoietinové cDNA. Tento fragment se liguje do místa BamHI ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA se získá ze supematantů E. coli kmene RZI032, který byl infikován ml3-EC-l způsobem popsaným vKunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol 101, 20 (1983). Pro in vitro mutagenezi se přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše smíchá se 6 μΐ pufru (250mM Tris o pH 7,8, 50mM chlorid hořečnatý a 50mM dithiothreitol). Teplotní hybridizace primeru ktemplátu se provede tak, že se reakční objem doplní vodou do 10 μΐ, směs se 5 minut zahřívá na 65 °C a potom se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Prodlužovací reakce se provede přídavkem vždy 2,5 μΐ dTTP, dATP, dGTP, dCTP a ATP (vždy o koncentraci 10μΜ) a následným přídavkem 1 μΐ (1 jednotky) E. coli DNA polymerázy (Klenowův fragment) a 1 μΐ (1 jednotky) T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje přes noc při 14 °C a použije sejí pro transformaci E. coli kmene JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)) způsobem popsaným ve výše uvedené Messingově publikaci.
Pro identifikaci mutantních klonů deferenciální hybridizací se plaky na živném agaru přenesou na filtry Gene Screen (New England Nuclear). Filtry se usuší pod infralampou a potom jednu hodinu inkubují v 6x SSC s obsahem 1% SDS při 60 °C. Pro hybridizací se výše uvedený oligonukleotidový primer (8 pmol) označí na konci T4 polynukleotid kinázou a gemma 32P-značeným ATP a inkubuje s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a lOOmg/ml DNA lososího spermatu při 37 °C, za účelem mutace [Asn124], při 55 °C,za účelem mutace [Asn4, Ser6], při 65 °C za účelem mutací [Thr125] a [Pro124, Thr125] a při 70 °C za účelem mutací [Asn9, Ser11] a [Asn163, Ser165]. Následující den se filtry třikrát promyjí 6x SSC při teplotě místnosti a provede se autoradiografie. Je-li to zapotřebí, promyjí se filtráty 6x SSC při postupně se zvyšující teplotě, až již není pozorována žádná, nebo je pozorována jen malá hybridizace k plakům se sekvencí erythropoietinové cDNA divokého typu. Klony poskytující pozitivní hybridizační signály za těchto podmínek se identifikují a retransfekují do JMI09, za účelem izolace čistého klonu. Dideoxy-analýza terminace řetězců ukazuje, že jsou přítomny mutace na asparaginový, serinový, threoninový a prolinový zbytek.
Vyvařovací metodou (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)) se z transfekovaných buněk JMI09 získají dvouřetězcové ml3 EC-1 DNA obsahující změny [Asn4, Ser6], [Asn9, Ser11], [Asn69], [Asn124], [Asn125], [Ser127], [Asn163, Ser165], [Thr125] a [Pro124, Thr125]. Tyto DNA se štěpí BstEII a XhoII a izolují se 810bp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 se štěpí BstEII a potom částečně BglII a 5-konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosftasou v lOmM Tris o pH 8 při 60 °C v průběhu 60 minut. Vektorový fragment o délce 7 kb, který neobsahuje 810bp fragment BstEII-BglII, se izoluje a liguje kerythropoietinovým fragmentům popsaným výše. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X je číslo analogu) obsahují DNA kódující analogy erythropoietinu se změněnými aminokyselinovými zbytky v uvedených polohách.
-20CZ 291342 B6
Alternativně se zkonstruuje analog erythropoietinu (pEC34) in vitro metagenesí, při níž se deletují aminokyselinové zbytky 41 až 55. Přitom vznikne menší (775 bp) fragment BstEII-BglII obsahující EPO. Tento fragment se výše uvedeným způsobem vloží do pECl. Za účelem klonování analogů erythropoietinu se pEC34 štěpí BstEII, částečně štěpí BglII, defosforyluje 5 a vektor se izoluje (tento způsob je popsán výše). Vektorový fragment o délce 7 kb se potom liguje k fragmentům erythropoietinu, jak je to popsáno výše. Klonování s pEC34 umožňuje snadné rozlišení mezi rekombinanty a jednoduchým novým uzavřením. Pouhým novým uzavřením vzniká menší fragment BstEII-BglII než jsou analogy, což lze snadno rozlišit na Agarózovém gelu.
Těchto obecných postupů se použije pro konstrukci analogů erythropoietinu, které jsou uvedeny v tabulkách 3, 4 a 5. U každého analogu jsou uvedeny změny sekvence DNA; jinak mají oligonukleotidové primery použité na mutagenezi sekvenci, která je komplementární k humánnímu erythropoietinu.
-21 CZ 291342 B6
Tabulka 3
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
NI | Asn*Ser6 | CGC-4AAC ATC—»AGC |
N2 | Asn9Ser11 | AGC->AAC GTC—»AGC |
N3 | Asn19Thr21 | GCC—»AAC GAG—»ACG |
N4 | Asn3°Thr32 | GCT-4AAT CAC-»ACG |
N5 | Asn42 | CCA—» AAT |
N6 | Ser42Asn43Thr43 | CCA—»TCA GAC—>AAC AAA—»ACA |
N7 | Ser49 | TAT—»TCT |
N8 | Asn51Thr53 | TGG—»AAT AGG—»ACG |
N9 | Asn57Thr59 | GGG—»AAC CAG—»ACG |
N10 | Asn®9 | CTG—>AAC |
Nil | Asn69Thr71 | CTG—>AAC TCG—»ACA |
N12 | Ser63Asn69Thr71 | Nil plus GCC—»TCC |
N13 | Asn88Thr90 | TGG-4AAT CCC-JACC |
NI 4 | Ser87Asn88Thr90 | N13 plus CCG-žTCG |
N15 | Ser87Asn88ThrThr92 | NI4 plus CAG-4ACG |
-22CZ 291342 B6
Tabulka 3 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
NI 6 | Ser87Asn88Thr9°Alai-62 | N14 plus AGG—>GCG |
N17 | Asn88Ser80 | TGG—» AAT CCC—>TCC |
NI 8 | Val87Asn88Thr90 | CCG—>GTG TGG-+AAT CCC—>ACC |
NI 9 | SerS7Asn88Gly89Thr90 | CCG—>TCG TGG—»AAT GAG—»GGG CCC—>ACC |
N20 | AsnS9lie90Thr91 | GAG—»AAC CCC—»ATC CTG—>ACG |
N21 | Ser87Asn89lle90Thr9i | N20 plus CCG—>TCG |
N22 | Asnii3Thrii5 | GGA-+AAC CAG—»ACG |
N23 | Asnii8vali2i | GCC—>AAC CCT—>GTT |
N24 | Asnl2iSeri22Thri23 | CCT—>AAT CCA->TCA GAT—»ACT |
N25 | Asni24 | GCG—>AAT |
N26 | Serl22Asnl24 | CCA-»TCA GCG-žAAC |
N27 | Asnl25Serl27 | GCC—AAC GCT—>TCT |
N28 | Asnl25Thrl27 | GCC-+AAC GCT-JACG |
-23CZ 291342 B6
Tabulka 3 (pokračováni)
Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
nalog číslo | Substituce aminokyselin | Změny v sekvenci |
N29 | Leu121Seri22Asni25Thri27 | N28 plus CCT-+CTT CCA—>TCA |
N30 | Thri20Glyi22Leui23Asni25Thri27 | N28 plus TCC—>ACC CGC-4GGG GAT-žCTC |
N31 | Asnl26seri28 | TCA—>AAT GCT—>TCT |
N32 | Asnl26Thrl28Vall29 | TCA—>AAT GCT—>ACT CCA—>GTA |
N33 | Leu121Ser122Asni26Thr128val129 | N32 plus CCT-1CTT CCA—>TCA |
N34 | Thri2iGlyi23Seri25Asni26Thri28vali29 | N32 plus CCT-4ACG GAT-+GGG GCC—>TCC |
N35 | Serl29Asnl30 | CCA—»AGC CTC-4AAC |
N36 | Asni32 | ACA—)AAC |
N37 | Asnl34Thrl36 | ACT—>AAT GAC—>ACC |
N38 | Asn!35 | GCT-4AAT |
N39 | Asn136Thr138 | GAC—>AAC TTC-»ACC |
N40 | Asni37ihr139 | ACT—>AAT CGC—>ACC |
N41 | Asnl38Thrl40 | TTC-+AAC AAA-4ACA |
-24CZ 291342 B6
Analogy
Analog číslo
Tabulka 3 (pokračování) erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce
Substituce Změny aminokyselin v sekvenci
N42
N43
N44
N45
N46
N47
N48
Asn144
Ser143Thr149Val150
Glyl48Thri49
AsniSS
Asn163Ser165
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90
GTC—>AAC
TTC—»TCC
CTC—>ACC
CGG-+GTG
TTC-»GGC
CTC—»ACC
CTG—>AAT
ACA—>AAT
N4 a N18
Nil a NI 4
-25CZ 291342 B6
Tabulka 4
Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
01 | Ser6 | ATC—>AGC |
02 | Ser7 | TGT->TCC |
03 | Ser8 | GAC—>AGC |
04 | Serll | GTC-9TCT |
05 | Ser18 | GAG—»TCG |
06 | Ser23 | GAG—>TCG |
07 | Ser29 | TGT-*AGC |
08 | Ser29 | TGT—>TCT |
09 | Ser38 | GC.T—>TCT |
010 | Ser33 | TGC—>TCA |
011 | Ser37 | GAG—»TCG |
012 | Ser<9 | TAT—>TCT |
013 | Ser61 | GTA-4TCA |
014 | Ser63 | GTC-4TCC |
015 | Ser67 | CTG-4TCG |
016 | Ser68 | GCC-žTCC |
017 | Ser70 | CTG—>TCG |
018 | Ser73 | GCT—>TCT |
019 | Ser7« | GTC-»TCT |
020 | Ser73 | CTG->TCG |
021 | Ser79 | GCC—>TCC |
022 | Ser81 | TTG-žTCG |
023 | Ser86 | CAG—>TCG |
024 | Ser87 | CCG-+TCG |
025 | Ser93 | CTG-HCG |
026 | Ser98 | GCC—»TCC |
027 | Ser | GTC->TCC |
028 | Seri02 | CTT-»TCT |
029 | Ser183 | CGC—»AGT |
-26CZ 291342 B6
Tabulka 4 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro o-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
030 | Ser105 | CTC-4AGC |
031 | SeriOS | CTT-4TCT |
032 | Šerm | GCT-+TCT |
033 | Seriiz | CTG—>TCG |
034 | Ser**4 | GCC-+TCC |
035 | Ser128 | GCT-+TCT |
036 | Serosa | TCG-+GAG |
037 | Seriei | TGC-+TCC |
038 | Pro125Ser*27 | GCC—»CCC GCT—>TCT |
039 | Thr62 | GAA—»ACA |
040 | Thr64 | TGG—>ACG |
041 | Thr65 | CAG—>ACG |
042 | Thr 8 8 | TGG—>ACG |
043 | Thr 9° | CCC—$ACC |
044 | Thr92 | CAG—>ACG |
045 | ThrlW | AGT-4ACT |
046 | Thr**8 | CGG->ACG |
047 | Thr**5 | CAG—>ACG |
048 | Thrl23 | GAT—>ACT |
049 | Thr*24 | GCG-+ACG |
050 | Thr*25 | GCC—»ACC |
051 | Thr*25ser*27 | GCC—>ACC GCT->TCT |
052 | Thr*25Thr*26 | GCC—»ACA TCA—>ACA |
053 | Thr126 | TCA—»ACC |
054 | Thr*27 | GCT-+ACT |
055 | Thr130 | CTC—>ACC |
-27CZ 291342 B6
Tabulka 4 (pokračování)
Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo
Substituce aminokyselin
Změny v sekvenci
056 | Thri3i | CGA-4ACA |
057 | Thri36 | GAC-+ACC |
058 | Thr140 | AAA—»ACA |
059 | Pro124Thr125 | GCG—>CCG |
GCC-4ACC | ||
060 | Pro124Thr125Thr126 | 059 plus TCA—»ACC |
061 | Pro124Thr125Thr126Thr13i | 060 plus CGA—»ACA |
062 | HGG C-terminální prodloužení |
Tabulka 5
Analogy erythropoietinu s místy pro N- a O-vázané uhlohydrátové řetězce
Analog číslo__________ Substituce aminokyselin__________________Změny v sekvenci
NO1 Ser Asn Thr HCG C-terminální prodloužení N14 a 062
NO2 Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 HCG C-terminální prodloužení N47 a 062
Plazmidy označené pDEC-X (kde X představuje číslo analogu) se zkonstruují insercí erythro10 poietinové cDNA do pDECdelta, který je derivátem plazmidu pDSa2. Expresní vektor pDSa2 je obecně popsán v mezinárodní přihlášce PCT WO90/14363. pDECdelta se získá z pDSa2 následujícím sledem stupňů:
1) Místo HindlII v pDSa2 se deletuje štěpením pDSa2 DNA HindlII, na lepivé konce HindlII se působí E. coli DNA polymerázou (Klenowův fragment) a jednotlivými dNTP a provede se religace vektoru s tupými konci. Získá se plazmid pDSa2deltaH.
-28CZ 291342 B6
2) pDSa2deltaH se rozštěpí Sáli a liguje se k němu syntetický oligonukleotid obsahující sestřižený signál SV40 a Sáli linkerem připojeným k 3'-konci sestřiženého signálu. Syntetický oligonukleotid má následující sekvence (SEQ ID. NO: 18):
’ TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT
CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA
AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG
AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 ’
Výsledným plazmidem je sestřih pDSalIdeltaH.
3) Sestřih pDSadeltaH se štěpí Sáli a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí T4 DNA polymerázou a jednotlivými dNTP. Stejnou metodou se otupí konce 820 ligace k plazmidu. Získá se plazmid pDEC-1.
4) Plazmid pDEC se rozštěpí kpnl a PvuII a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí nukleasou z bobu „Mung“. Plazmid se religuje za účelem delece vyštípnutého fragmentu Kpnl-PvuII, čímž vznikne plazmid pDECdelta.
Plazmidy pDEC-Χ se získají z pDECdelta úplným rozštěpením BstEII a potom částečným rozštěpením BglII. Vektorový fragment neobsahující erythropoietinové kódující sekvence se izoluje a liguje k 810bp fragmentům BstEII-BglII obsahujícím požadovaný plazmid.
Podrobnosti konstrukce některých analogů obsahujících několik aminokyselinových změn jsou popsány dále.
Konstrukce pDEC(N47) a pDEC(N48) pDEC(N47), který obsahuje mutace Asn30 Thr32 Vall87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N18) a pDEC(N4). pDEC(N18) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEC(N4) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N47).
pDEC(N48), který obsahuje mutace Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N14) a pDEC(Nl 1). pDEC(N14) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEC(Nll) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N48).
Konstrukce pDEC(062) (fúze HCG-erythropoietin) pDEC (062) se složí zpECI a 107bp Stul—BglII linkeru se syntetické DNA, který obsahuje 28 karboxy-terminálních aminokyselin z humánního chorionického gonatropinu (Ser-Ser-SerSer-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-ThrPro-Ile-Leu-Pro-Gln) (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al. Ann. Rew. Biochem. 50, 465 (1981)). Tento linker má následující sekvenci
-29CZ 291342 B6 ’ CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3' GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG5 ’ CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA (SEQ ID. NO: 19)
31 gttcaggtagggctgagggccccgggagcctgtggggctaggagggtgttaczctag (SEQ ID. NO: 20) pECI se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se 610 bp fragment DNA. Tento syntetický linker se fosforyluje ATP a polynukleotidkinázou a liguje s fragmentem pECI do pDECdelta před tím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(N01) pDEC(NOl) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90). pDEC177 se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean<R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser87Asn88Thr °. pDEC(062) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(NO2) pDEC(NO2) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N47) (Asn30Thr32Val87Asn88Thr90). pDEC(N47) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean<R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Asn30Thr32Val87Asn88Thr90. pDEC(062) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
Konstrukce pDEC(NO16) Ser87Asn88Thr90Ala162 pDEC(N16) se zkonstruuje složením pDEC(N14) (Ser87Asn88Thr90) a pDEC258 (Ala162). pDEC258 se zkonstruuje za použití výše popsaných způsobů mutageneze in vitro a v poloze 162 se kodon AGG vymění za kodon GCG. pDEC(N14) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser87Asn88Thr90. pDEC(258) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 210 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.
-30CZ 291342 B6
Konstrukce pDEC(Rl), (R2) a (R3)
Pro odstranění glykosylačních míst zpDEC(N14) se ml3-EPO(N14) obsahující mutace Ser87, Asn88 a Thr90 podrobí in vitro mutagenezi popsané výše za použití následujících primerů
5 ’ GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3 ’ | GLN24 |
(SEQ ID. NO: 21) | |
5 ’ CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3 ’ | GLN38 |
(SEQ ID. NO: 22) | |
5 ’ CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' | GLN83 |
(SEQ ID. NO: 23) |
Výsledné plazmidy se označí pDEC(Rl) (Gln24Ser87Asn88Thr90, pDEC(R2) (Gln38Ser87Asn88Thr90) a pDEC(R3) mutagenezi za použití výše uvedených oligonukleotidových primerů, a získají se tak pEClO (Gin24) a pEC8 (Gin38). pEC9 (Gin83) se zkonstruuje za použití následujícího primeru ' CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3 ’ GLN8 3 (SEQ ID. NO: 24)
Klony cDNA humánního erythropoietinu a analogy odpovídající [Asn4, Ser6]EPO, [Asn9, Sern]EPO, [Asn69]EPO, [Asn124]EPO, [Asn,2\ Ser1Í7]EPO, [Asn163, Ser165]EPO, [Thr12:i]EPO a [Pro124, Thr1 5]EPO a klony cDNA analogů popsaných v tabulkách 3, 4 a 5 se elektroporací přenesou do buněk COS-1 (ATCC č. CRL-1650). Buňky COS-1 se sklidí z semi-konfluentních misek, promyjí médiem (Dulbeccovo modifikované esenciální médium obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % L-glutaminu/penicilinu/streptomycinu (Irvine Scientifíc) a resuspendují na koncentraci 4 x 105 buněk/ml. Jeden ml buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad). Elektroporace se provádí pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser při kapacitě 25 pF a napětí 1 600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosičové DNA a 2 až 20 pg plazmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporované buňky se přenesou do misek v množství 2 x 106 buněk na misku pro kultivaci tkání o průměru 60 mm s 5 ml média. 2 až 4 hodiny po přenesení do misek se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Médium upravené buňkami se oddělí 3 až 6 dnů po elektroporací.
Příklad 7
Charakterizace analogů erythropoietinu
A. Stanovení adice uhlohydrátu
Objem supematantu obsahující 5 až 21 jednotek z buněk COS tranfekovaných jednotlivými cDNA erythropoietinových analogů popsanými v příkladu 6 se přes noc při teplotě místnosti imunoprecipituje králičí protierythropoietinovou polyklonální protilátkou. 20 až 80 pl 1:1 Protein A-Sepharose v fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) se přidá k imunoprecipitátu a směs se 1 hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Vzorky se odstředí, promyjí PBS a tam, kde je to uvedeno, se peleta zpracuje N-glykanázou, aby se odstranily N-vázané uhlohydrátové řetězce. Vzorky se analyzují elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, provede se přenos na nitrocelulózu a analýza Western popsaná v Bumette et al., Anal.
-31 CZ 291342 B6
Biochem. 112, 195 až 203 (1981) a Elliott et al., Gene 79, 167 až 180 (1989) za použití směsi myších anti-erythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána v Elliott et al. (1989) Bood 74, Supp. 1, A.1228.
Analýza supematantů buněk COS transfekovaných [Asn69]EPO cDNA a [Asn125, Ser127]EPO cDNA ukazuje, že proteiny mají větší velikost než erythropoietin shumánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje na přítomnost přídavného N-vázaného uhlohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů buněk COS transfekovaných cDNA [Thr12i[EPO a cDNA [Pro124, Thr125]EPO N-glykanázou ukazuje, že proteiny mají větší velikost ve srovnání s erythropoietinem s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje, že je přítomen přídavný O-vázaný uhlohydrátový řetězec (obr. 8). Analýza Western blot jiných vybraných analogů je uvedena na obr. 10.
Pro stanovení počtu N-vázaných uhlohydrátových řetězců, které jsou připojen}' k EPO, se provede částečné rozštěpení N-glykanázou. Analogy rHuEPO se exprimují v buňkách CHO a oddělí se zpracované médium neobsahující sérum. Zkumavky obsahují 40 jednotek EPO (objem je nastaven vodou na 15 μΐ). Do každé zkumavky se přidá 10 μΐ 0,5% SDS a vzorky se 3 hodiny vaří. Potom se ke každému vzorku přidají tyto složky: 10,8 μΐ 0,5M fosforečnanu sodného o pH 8,6, 5 μΐ 7,5%Nonidetu P40 a 1,5 μΐ roztoku N-glykanázy (Genzyme) o koncentraci 250 jednotek/ml. Vzorky se inkubují uvedenou dobu při 37 °C. Reakce se zastaví přídavkem vzorkového pufru SDS-PAGE (viz výše) a potom podrobí analýze Western na SDS-PAGE (10% akrylamidu) za použití anti-EPO polyklonální protilátky a anti—králičí soupravy Wectastain<R) (Vector Laboratories) a 4-chlomaftolu, jako substrátu. Analýza N-vázaných řetězců za použití této metody je pro humánní erythropoietin a analog N14 znázorněna na obr. 11.
B. Stanovení účinnosti analogů erythropoietinu
Provedenou se radioimunoeseje (RIA) způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Egrie et al. Stanovení EIA se provádějí za použití soupravy EIA Clinigen(R) (Systémy R a D), přičemž se pracuje podle postupů dodaných výrobcem. Biologická účinnost in vivo analogů erythropoietinu se stanovuje na supematantech získaných z buněk CHO exprimujících analog erythropoietinu nebo na purifíkovaném erythropoietinu získaném z média zpracovaného buňkami CHO způsobem popsaným dále za použití exhypoxického polycythemického myšího biologického stanovení (Cotes et al., výše uvedená citace).
Účinnost erythropoietinu in vitro se stanoví zkouškou tvorby erythroidní kolonie, kterou popsali Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83, 309 až 320 (1974); zkouška je modifikována. Mononukleované buňky z buněk humánní kostní dřeně se částečně purifikují na „ficoll-paque cushion“, promyjí se Iscoveho médiem, aby se odstranily ulpělé buňky, a potom se nanesou na misky. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje žádný hovězí sérový albumin. Erythroidní kolonie se zjišťuje po 8 až 10 dnech kultivace.
Analogy erythropoietinu transfekované a exprimované v buňkách COS způsobem popsaným v příkladu 6 se analyzují v surových supematantech buněk COS za použití RIA, ELA a stanovení s tvorbou erythroidní kolonie. Purifikovaný erythropoietin s humánní sekvencí vykazuje in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA stanovenou při výše uvedených zkouškách. Analogy [Asn69]EPO, [Thr125]EPO a [Pro124, Thr125]EPO vykazují in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA a poskytují důkaz, že obsahují přídavné uhlohydrátové řetězce (podle stanovení uvedeného v části A). [Thr125]EPO a analogy N4, N11,N14, N16, N18, N47, N48, 062, NO1 a NO2 se dále analyzují tak, že se klon cDNA kódující analog erythropoietinu transfekuje do buněk CHO a supematanty buněk CHO se podrobí stanovení RIA nebo ELA a biologickému stanovení in vivo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Účinnosti in vivo analogů Rl, R2 a R3 exprimovaných v supematantech buněk CHO jsou uvedeny v tabulce 7.
-32CZ 291342 B6
Tabulka 6
Analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce
Sekvence EPO | N-vázané řetězcea | 0-vázané řetězce | Účinnost in vivo RIA nebo EIA |
3C | id | 0,8 | |
Asn30rhr32 | 3 až 4C | n.t. | 1,1 |
Asn51rhr53 | 4 | n.t. | n.t. |
Asn57Thr59 | 4 | n.t. | n.t. |
Asn 69 | 4 | .. e sniz.mn. | n.t. |
Asn^Thr7! | 4 | n.t. | 0,25-0,7 |
Ser^SAsnSSThr^l | 4 | n.t. | n.t. |
Val87Asn®®Thr90 | 4C | n.t. | 1,8 |
Ser87Asn88ihr90 | 3 až 4C | normální | 1,0 |
Ser87Asn88Giy89jhr90 | 4 | n.t. | n.t. |
Ser87Asn88Thr90Thr92 | 4 | snlž.mn/ | n.t. |
Asn89iie90Thr91 | 4 | n.t. | n.t. |
Ser87Asn89ne90Thx91 | 4 | n.t. | n.t. |
Ser87Asn88ihr90jQal62 | 4 | n.t. | 1,8 |
Asn*36Thr138 | 3 až 4 | n.t. | n.t. |
Asnl38jhr140 | 3 až 4 | n.t. | n.t. |
Asn69jhr7lser87A3n88Thr90 | 4 až 5 | n.t. | 0,025-0,25 |
Asn30Thr32val87Aan88Thr38 | 4 až 5C | normální | 1,8 |
Thrl23 | 3 | 1 a 2f | n.t. |
Thrl25 | 3 | 1 a 2f | 0,7 |
Prol24ihr125 | 3 | 1 a 2f | n.t. |
HCG c- terminální prodlouéení | 3 | alespoň 39 | 1,0-1,3 |
Ser87A3n88ihx;90 | |||
hcg prodloužení | 4 | alespoň 39 | |
Asn30Thr32val®7Asn88Thr98 | |||
hcg prodloužení | 4 až 5 | alespoň 39 | 0,8 |
-33CZ 291342 B6
Poznámky' k tabulce 6:
“Počet přídavných N-vázaných řetězců se odhaduje na základě mobility peptidových analogů v SDS gelech způsobem popsaným v příkladu 7A.
bPoměr účinnosti analogu in vivo k množství analogu erythropoietinu. Měření účinnosti se provádějí na supernatantech buněk CHO s analogy za použití myšího polycythemického biologického stanovení. Množství analogu erythropoietinu v supernatantech buněk CHO se stanovuje zkouška RIA nebo ELA popsanou v textu.
c
Počet přídavných uhlohydrátových řetězců se potvrdí zkouškou migrace glykoproteinu v SDS-gelech po částečném rozštěpení N-glykanázou způsobem popsaným v příkladu 7A.
dO-vázaný řetězec v Ser126 je přítomen na 70% molekul humánního erythrpoietinu.
'Analogy se sníženým stupněm O-glykosylace, které obsahují uhlohydrátový řetězec v Ser126 na méně než 70 % molekul.
fThr123EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 60 % molekul. Thr125EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na přibližně 40 % molekul. Pro124Thr12’EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 80 % molekul.
8Tyto analogy obsahují alespoň tři O-vázané řetězce a mohou mít i čtyři nebo pět řetězců. O samotném HCG je známo, že obsahuje čtyři O-vázané řetězce.
n.t. znamená, že zkoušení nebylo prováděno.
Tabulka 7
Účinnost humánního erythropoietinu a analogů obsahujících přesmyky uhlohydrátových míst
Sekvence EPO | N-vázané řetězce | Účinnost in vivo RIA nebo EIA |
3 | 0,69 | |
Gin24 | 2 | 0,16 |
Gin38 | 2 | 0,16 |
Gin83 | 2 | 0,23 |
Gln24Ser87Asn88Thr90(R1) | 3 | 0,69 |
Gln38Ser87Asn88Thr90(R2j | 3 | 0,41 |
Gln83Ser87Asn88Thr90(R3' | 3 | 0,50 |
Ser87Asn88Thr90 | 3 až 4 | 1,48 |
Poměr účinnosti in vivo kRIA nebo EIA se stanovuje způsobem popsaným v poznámce a k tabulce 6.
C. Výroba izomorfních směsí získaných z analogů erythropoietinu [Thr125]EPO (EPO 050)
Analog erythropoietinu, [Thr125]EPO, se zkonstruuje způsobem popsaným v části A. příkladu 6. 810bp fragment eiythropoietinové cDNA nesoucí [Thrl25]mutaci se izoluje rozštěpením plazmidu pEC obsahujícího [Thr125] mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací vzniklého fragmentu k pDECdelta (derivát pDSa2) (viz příklad 6).
-34CZ 291342 B6
Plazmid pDECdelta obsahující [Thr125] erythropoietinovou cDNA se tranfekuje do DHFR-deficientních buněk CHO. 770 ml média zpracovaného buňkami CHO se zkoncentruje za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti lOOOOdalton a diafiltruje proti lOmM Tris-HCl o pH 8,6 do dosažení konečného objemu 34 ml. Alikvot vzniklého koncentrátu o objemu 17 ml se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (objem lože 5 ml), který je ekvilibrován ve stejném pufru. Eluce se provádí lineárním gradientem od 0 do 250mM chloridu sodného v lOmM Tris-HCl o pH 8,6. Alikvoty frakcí eluovaných ze sloupce, buď neupravené, nebo štěpené N-glykanázou se analyzují SDS-PAGE nebo IEF a spojí se příslušné frakce podle obsahu izoforem a/nebo uhlohydrátu, přičemž vzniklé směsi se označí čísly 2, 3 a 4. Každá směs se nanese na sloupec Vydac 24 (214TPB2030; průměr 1 cm; objem lože 1,8 až 2,5 ml; průtok 0,34 ml/min). Sloupec se promyje vždy 2 objemy sloupce 20% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se eluují lineárními gradienty 20 až 94% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Vyrobí se směsi 2, 3 a 4, tyto směsi se zředí lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a nanesou na sloupce Q-Sepharose s rychlým průtokem. Po promytí lOmM Tris-HCl o pH7,0 se vzorky eluují 20mM citranem sodným/250mM chloridem sodným o pH 7,0. Purifikované [Thr125] směsi se analyzují pomocí IEF (viz obr. 9). Tyto směsi se také analyzují výše uvedeným způsobem (Cotes et al.) na biologickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.
[Ser87Asn88Thr90]EPO (EPO NI4)
Preparativní postup 1
Analog EPON14 se purifikuje třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografíi, chromatografií na obrácených fázích a gelovou filtrační chromatografií. Během stupně ionexové chromatografíe se spojí vhodné frakce za účelem získání směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové. Dvě další se vyrobí při chromatografií na obrácených fázích s obsahem analogu s agregátem nebo bez něho. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.
1. Médium upravené buňkami CHO exprimujícími analog EPON14 se sklidí a přibližně 2,5násobně zkoncentruje za použití míchané kyvety s membránou YM10 (Amicon) a diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.
2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 12 A2g0/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.
3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.
4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se spojí takové frakce, aby vzniklá směs obsahovala převážně izoformy 11 až 18. K této směsi se přidá EDTA do lmM výsledné koncentrace.
5. Směs izoforem se nanese při asi A28o/ml pryskyřice na sloupec s obrácenými fázemi C4 (Vydac) ekvilibrovaný ve 20% ethanolu v lOmM Tris o pH7,0 při průtokové rychlosti 2,5 cm/min. Sloupec se promyje jedním objemem sloupec 20% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 a eluuje 30 objemy sloupce gradientu od 20 do 94% ethanolu v lOmM Tris o pH7,0 při průtokové rychlosti 1 cm/min. Sbírají se frakce o objemu odpovídajícím 0,2 objemu sloupce.
6. Vzorek každé frakce se analyzuje pomocí neredukujícího 12% SDS-PAGE. Na základě přítomnosti agregátu pozorovaného na SDS-gelu se vytvoří dvě oddělené směsi. Směs č. 1 obsahuje analog EPO, ale žádný agregát, a směs č. 2 obsahuje jak analog EPO, tak agregát.
-35CZ 291342 B6
7. Směs č. 1 se přibližně 65násobně zkoncentruje a směs č. 2 se přibližně 250násobně zkoncentruje za použití zařízení Centricon 10 (amicon). U každé směsi se provede výměna pufru za 20mM citran sodný/ lOOmM chlorid sodný o pH 7,0.
8. Každá směs se individuální purifikuje na sloupci HPLC BioSil SEC-250 (BioRad) ekvilibrovaném ve 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodného o pH 7,0. Směsi se nanesou při hodnotě nižší než 6 A28o/ml pryskyřice při průtokové rychlosti 2,26 cm/min. Při každé zkoušce se sbírají píkové frakce odpovídající monomerním analogům.
9. Měří se absorbance každé směsi a část každé směsi se zkoncentruje pro analýzu gelu SDS-PAGE a IEF. Směs č. 1 obsahuje izoformy 15 až 17 a použije seji pro farmakokinetické studie a studie vazby k receptoru.
Preparativní postup 2
Podobně se purifikuje analog EPO N14 třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografií, vysoce účinnou chromatografií na obrácených fázích a chromatografií na hydroxylapatitu. Během stupně ionexové chromatografie se analog rozdělí do tří směsí obsahujících podle obsahu izoforem. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.
1. Supematant buněk CHO exprimujících analog EPON14 se oddělí a přibližně lOx zkoncentruje za použití zařízení Filtron Mini-LJltrasette s tangenciálním tokem a potom diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.
2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 10 A2so/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.
3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.
4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se jednotlivé frakce rozdělí do tří směsí. Směs označená názvem „nízké izoformy“ obsahuje izoformy 4 až 12, směs označená názvem „střední izoformy“ obsahuje izoformy 5 až 15 a směs označená názvem „vysoké izoformy“ obsahuje izoformy 6 až 18.
5. Každá směs izoforem se individuálně purifikuje na sloupci pro HPLC s obrácenými fázemi C4 (Vydac). Sloupec se vyvíjí gradientem od 0,1% kyseliny trifluoroctové ve vodě do 0,1% kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu, přičemž zvyšování koncentrace acetonitrilu probíhá rychlostí 1 %/min.
6. Píková frakce analogu z každé směsi se shromáždí a zředí 4 objemy 80mM Tris-HCl/20mM Tris-báze a potom zkoncentruje. provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 3, která jsou odolná proti rozpouštědlům.
7. Každý vzorek se zředí na hodnotu 2 A2so/ml v lOmM Tris o pH 7,2 a přidá se stejný objem 4M hydrochloridu quanidinu (GuHCl, lOmM CHAPS, lOmM Tris o pH7,2 do koncentrace výsledného vzorku 1 Α280/Π1Ι). Každý vzorek se nanese na hydroxylapatitový minisloupec ekvilibrovaný 2M GuHCl, 5mM CHAPS, lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem a shromažďují se frakce o objemu jednoho sloupce.
8. Změří se absorbance frakcí, vyrobí se směsi a provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 10. Změří se absorbance každé směsi.
-36CZ 291342 B6
Výsledné směsi se analyzují na SDS-PAGE a IEF gelech. IEF gely jsou znázorněny na obr. 12. Zkoušky RIA a zkoušky účinnosti in vivo se provádějí způsoby popsaným v příkladu 7A. Účinnost výsledných směsí izoforem in vivo je uvedena v tabulce 8. Směs izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové se použije při experimentech zaměřených na zjištění zvýšení hematokritu u myší.
Tabulka 8
Účinnost izoforem analogů erythropoietinu
Sekvence EPO | Směs izoforem | Účinnost in vivo (U/mg peptidů)3 |
Thr125 | izoformy 8 až 12 | 147 000b |
izoformy 9 až 12 | 215 000b | |
Ser87Asn88Thr90 | izoformy 13 až 15 | 111 000b |
izoformy 7 až 12 | 132 000 ± 17 000 | |
izoformy 10 až 14 | 233 000 ± 39 000 | |
izoformy 12 až 12 | 272 000 ± 14 000 |
Množství erythropoietinového peptidů v mg se vypočítá z hodnot A2go směsí izoforem 87 88 90
Ser Asn Thr EPO s použitím extinkčního koeficientu 0,93 pro 1 mg/ml roztoku.
Směrodatná odchylka u směsí izoforem Thr125EPO není uvedena, poněvadž stanovení účinnosti bylo prováděno jednou nebo dvakrát.
Příklad 8
Biologické vlastnosti analogu EPO N14
Účinnosti směsí izoforem analogu EPONI4, rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a izolované izoformy rHuEPO 14 se srovnávají při i.v. farmakokinetických zkouškách, zkouškách vazby k receptorů a studiích hematokritu. Směsi izoforem EPO NI4 se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 7C. rHuEPO se vyrobí způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lei et al. Izoforma 14 rHuEPO se purifikuje následujícím způsobem: rHuEPO, který se skládá ze směsi izoforem 10, 11,12, 13,14 a 15 se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (průměr 2,2 cm, výška 3,4 cm) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH7,2. Sloupec s rHuEPO se ekvilibruje s 2mM kyselinou octovou/6mM močovinou (pufr A) a potom se provede eluce vícefázovým gradientem navrženým pro optimální purifikaci izoforem 13 a 14. Gradient zahrnuje 0 až 7,3 % 800mM kyseliny octové/6M močoviny (pufr B) v 750 ml, 7,3 až 11,4 % pufru B v 750 ml, 11,4 až 26,8 pufru B ve 1 250 ml, 26,8 až 62,4 % pufru B ve 1 250 ml a potom 62,4 až 100% pufru B v 700 ml. Sbírají se frakce o objemu 12,5 ml. Frakce se neutralizují hydroxidem amonným a zkouší izoelektrickou fokusací na polyakrylamidových gelech. Frakce obsahující čistou izoformu 14 se spojí, zkoncentrují vmíchané kyvetě Amicon vybavené membránou YM-10 a potom se provede výměna pufru za vodu.
A. i.v. farmakokinetické studie
Provedou se dvě oddělené studie pro srovnání farmakokinetických parametrů analogu EPON14 (izoformy 15 až 17) a izolované izoformy 14 s rHuEPO.
Při každé studii se 1 pCi buď 125I-izolované izoformy 14, analogu 125I-EPON14 nebo 125I-rekombinantního humánního erythropoietinu (Amersham) intravenosně vstříkne do kanyly zavedené do krční tepny samce krysy Sprague-Dawley o hmotnosti v rozmezí od 310 do 378 g. V různých dobách po podání se odebírají krevní vzorky o objemu 0,3 ml, které se centrifugací
-37CZ 291342 B6 zpracují na sérum. Každý vzorek séra o objemu 0,1 ml se inkubuje přes noc při 4 °C z 90% ethanolem a potom se v něm stanoví koncentrace 125I-EPO (buď rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14, nebo analogu EPON14). Ethanolem vysrážený 125I-EPO v každém vzorku séra se spočítá v počítači gamma-rozpadů. Výsledné 5 farmakokinetické křivky jsou uvedeny na obr. 13. Pro každou krysu se stanoví farmakokinetické parametry za použití nelineární regresní analýzy PCNONLIN 4.0 Statistical Consultants, 1992 a výsledky pro každou skupinu szprůměrují. Výsledky farmakokinetických studií získané za požití analogu EPO N14 a izolované izoformy 14 jsou souhrnně uvedeny v tabulce 9.
ío Jak je zřejmé z tabulky 9, existuje podstatný rozdíl mezi hodnotou sérové clearance analogu EPON14 a hodnotou vypočtenou pro rekombinantní humánní erythropoietin. Rekombinantní humánní erythropoietin vykazuje nejrychlejší beta poločas 3,10 hodiny ve srovnání s 3,97 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 4,36 hodiny pro analog EPON14. Skupina s rekombinantním humánním erythropoietinem vykazuje také nejrychlejší poločas clearance 1,78 hodiny ve 15 srovnání se 2,40 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 3,03 hodiny pro analog EPO N14.
-38CZ 291342 B6 to Λ >o o rH o P4
Φ O ti cS
O
00 | t- | o | 1O | co | t- |
fc- | CM | rH | O | CM | |
rH | O | CM | o | co | O |
Přehled farmakokinetických parametrů rHuEPO, isoformy 14 rHuEPO a EPO N14 (isoformy 15 až 17) po i.v. podání o ti «1
Φ i-H
O
Λ ώ Λί rH E
sr | CO | O | CM | fc- | fc- |
rH | co | 00 | rH | co | rH |
CO | rH | CO | O | CM | o |
o | o | 00 | o | o | rH |
o | co | 00 | CM | co | CM |
o | CM | O | CM | O | |
M | ** | * | ·> | Λ | |
o | o | o | o | o | O |
G5 | co | LO | CM | xť | 05 |
XT | 00 | co | CM | b- | rH |
AT | co | co |
rH | b- | σ> | 00 | rH | 1Λ |
O | 00 | CM | co | CO | m |
05 | rH | co | co | CM | co |
co | O> | co | co | CM | o |
O | CO | co | ΙΛ | 05 | KT |
co | CD |
I
4-» o > •r* >N
o | xr | o | to | CO | |
rH | in | o | co | co | |
CO | o | co | o | o |
OJ | ιΛ | 00 | co | OJ | tn |
co | in | 00 | co | co | CD |
co | iH | co | o | xjf | rH |
* | «» | * | |||
o | O | o | o | o | O |
Ό | • | Ό | « | Ό | |
Φ >IU | o | >ti | o | Φ | O |
4-» | • | 4J | • | 4-> | * |
ω | <Z) | m | ca | M | CQ |
Xř | |||||
r-4 | |||||
03 | xr | ||||
O | r-H | ||||
At | Z | ||||
M 3 | to II | <2 Λ | 0< 11 | O | xi· 11 |
ffi | c | CJ ω | ti | A« | ti |
Průměrná hodnota pro skupiny, kterým byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin při farmakokinetické studii s EPO N14 (n = 4, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánr erythropoietin) a při farmakokinetické studii s izolovanou isoformou 14 (n = 2, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin).
CQ
-39CZ 291342 B6
B. Stanovení vazby k receptoru
Interakce analogu EPON14 (izoformy 15 až 17) sreceptorem erythropoietinu se studují vytěsňovací zkouškou za chladu za použití erythroleukemických buněk 0CIM1 (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Zvyšující se koncentrace neznačeného EPON14 se inkubují s buňkami OCIM1 spolu s konstantní koncentrací 125I-rHuEPO, za účelem stanovení množství EPO NI4 potřebného pro soutěž s 12;>I rHuEPO o vazbu k receptoru. Pro srovnání se nechá s konstantní koncentrací 125I-rHuEPO soutěžit také postupně se zvyšující koncentrace neznačeného rHuEPO.
Neznačený EPON14 se zředí zkouškovým pufrem a přidá v množství 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10, ng a 30,0 ng (vztaženo na hmotnost peptidu). Do všech zkumavek se přidá 0,5 ng l25I-rekombinantního humánního EPO a potom se přidá vždy přibližně 0,5 x 106 buněk OCIM1. Zkumavky se inkubují při 37 °C ve třepané vodní lázni po dobu 2 hodin. Po inkubaci se roztoky odstředí přes dibutylftalátový/biftalátový olejový roztok, aby se oddělil nenavázaný 125I-rHuEPO od 125I-rHuEPO vázaného k buňkám OCIM1. Izolují se buněčné pelety a množství l25I-rHuEPO vázaného k buňkám se stanoví spočítáním gamma-rozpadů. Vypočítá se údaj charakterizující specifickou vazbu k buňkám a lineární regresní analýzou se stanoví koncentrace neznačeného proteinu, které je zapotřebí pro to, aby bylo 50 % 125l-rHuEPO vázaného za nepřítomnosti kompetitoru vyřazeno ze soutěže.
Z výsledků tří zkoušek vyplývá, že v průměru je zapotřebí 2,67 ± 0,73 ng neznačeného peptidu EPON14 pro snížení vazby l25I-rHuEPO k buňkám OCIM1 o 50%. Při stejných třech zkouškách je zapotřebí v průměru 0,51 ±0,15ng neznačeného rHuEPO pro soutěž s vazbou 0,5 ng 125I-rHuEPO. Na základě těchto výsledků je zapotřebí 5,25násobného nadbytku EPON14 pro soutěž s vazbou 125I-rHuEPO k receptoru EPO ve srovnání s neznačeným rHuEPO (p<0,01).
Také se provede přídavný experiment přímého srovnání vazby analogu EPO NI4, izolované izoformy 14 a rekombinantního erythropoietinu k receptoru erythropoietinu. Výsledky tohoto experimentu ukazují, že analog EPO N14 má k receptoru nižší afinitu než izolovaná izoforma 14. Ve srovnání s neznačenou izoformou 14 je při soutěži s 125I-rHuEPO o vazbu k receptoru zapotřebí přibližně dvojnásobného nadbytku analogu EPO N14 (obr. 14).
C. Studie hematokritu
Provede se in vivo studie pro srovnání schopnosti vysokých a nízkých izoforem EPON14 (z preparativního postupu 2 popsaného v příkladu 7C), izolované izoformy 14 a rekombinantního humánního EPO zvýšit hematokrit ošetřených myší. Rozdělení izoforem ve směsích izoforem EPO NI4 označených názvy „vysoké izoformy“ a „nízké izoformy“, kterých se používá při této studii, je uvedeno na obr. 12.
Myším CD1 (o hmotnosti asi 30 g) se po dobu celkem 6 týdnů 3 x za týden intraperitoneálně injikuje jeden z výše uvedených přípravků v 0,25% myším sérovém albuminu nebo placebo (PBS s 0,25% myším sérovým albuminem). Dávkování erythropoietinových přípravků je vztaženo na hmotnost peptidu a je upraveno tak, aby 30gmyš obdržela 0,71 pg peptidu/dávka, a to buď vysokých frakcí EPO NI4, nízkých frakcí EPO NI4, izoformy 14, nebo standardního rHuEPO. Při zkoušení vysokých frakcí EPO N14 a izoformy N14 se použije též přídavné skupiny, které se podává 0,036 pg peptidu/dávka. Hematokrity všech myší se stanoví před zahájením pokusu a potom se zjišťují dvakrát týdně retroorbitálním odběrem krve. Na závěr pokusu se shromáždí sérum všech zvířat a zkouší se na protilátky proti vstříknutému produktu. Dat získaných u zvířat, která jsou charakterizována jako negativní s ohledem na neutralizaci protilátek, se použije při následné analýze.
-40CZ 291342 B6
Jak ukazuje obr. 15, zvířata, kterým byly podaný vysoké izoformy EPON14, vykazují nejvyšší průměrnou hodnotu hematokritu ve skupině ve srovnání se zvířaty kterým byly podány ostatní přípravky. Izoforma 14, rekombinantního humánního EPO a nízké izoformy EPON 14 zvyšují hematokrit v menším rozsahu.
Za účelem porovnání různých erythropoietinových přípravků kvantitativnějším způsobem se vypočítá průměrná počáteční rychlost vzrůstu hematokritu (0 až 11 dnů), změří se plocha pod křivkou (0 až 39 dnů) a vypočítá se celkové zvýšení hematokritu (tabulka 10). Ať již se použije kteréhokoliv z těchto kritérií, zdá se být směs „vysoké izoformy“ EPON 14 účinnější (vztaženo 10 na hmotnost peptidu) než kterýkoliv z ostatních zkoušených přípravků. Jak směs vysoké izoformy“ EPO NI4, tak izoforma 14 je účinnější než rekombinatní humánní EPO. Směs „nízké izoformy“ EPO N14 vykazuje nejnižší účinnost při srovnání za použití kterékoliv z těchto analýz.
-41 CZ 291342 B6 činek EPO N14 (směsi vysoké isoformy a nízké isoformy) isoformy 14 a rHuEPO na hematokrit myší m
1 | β |
Φ | +J |
>w | •H |
54 34 — | |
N | 0 >i +> Ό |
XV | Φ O |
> | g Λ |
O | Φ |
34 | X! |
rd | |
Φ | M |
O | β |
M β '«j }> O xn >ΤΗ tn β
Φ 34 > XŮ Q
<D | t—1 | r- | in | CO | |
K | *» | ||||
in | CM | cn | o | r* | σχ |
CM | CM | rd | c-d | r4 |
σ> | kO | CO | ’Τ | Ol | |
CM | 00 | CM | r—1 | ||
in | OJ | Ol |
4J tn O rH
X! O β +> r-. •Η C
Φ
Φ «J k α VI >14 P4
kD | σι | co | \0 | ||
r-4 | Ol | o | tn | ||
rd | rd | o | o | r-< | o |
<-4 | rd | ko | ko | rd | i-d |
r- | Γ* | o | co | r* | r- |
o | o | o | o | o | o |
«» | ·. | *» | |||
o | o | o | o | o | o |
1 | 1 | |||||
0 | Γ1 | o | rd | 1 | ||
tn 'ř | 0 | 'Φ | ||||
•rl rd | φ | -r| fd | ti | η | r4 | |
53 | a | 25 | e | •ď | ||
XV | M | XV | fi | O | ||
34 >i | O | 34 >i | 0 | Λ | XV | |
o Č | 04 | o e | Od | W | 34 | Ε |
Φ β | 0 | tn β | 0 | β | Ν | Μ |
>ιθ | m | >i 0 | tn | Μ | VI | 0 |
> 04 | H | > 04 | H | $4 | S3 | <Η |
Počáteční rychlost zvyšování hematokritu se vypočítá metodou lineární regrese z výsledků od dne 0 do dne 11.
Plocha pod křivkou se vypočítá trapezoidní sumací z výsledků od dne 0 do dne 39.
Celkové zvýšení hematokritu se vypočítá jako rozdíl průměrné hodnoty hematokritu u skupiny v den 39 a průměrné hodnoty hernatokrytu u skupiny při zahájení pokusu.
-42CZ 291342 B6
Vynález byl sice za použití přednostních provedení, odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že jej lze různým způsobem obměňovat a modifikovat, přičemž všechny takové variace spadají do rozsahu tohoto vynálezu, pokud jsou kryty následujícími patentovými nároky. Tyto patentové nároky je třeba vykládat na podkladě ekvivalentů.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Elliott, Steven G. Byme, Thomas E.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Analogy erythropoietinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 26 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Amgen lne. U.S. Patent Operations/rbw (B) ULICE: 1840 DeHavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 91320-1798 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/108,016 (B) DATUM PODÁNÍ: 17. srpna 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 30
-43CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT 27 (2) IFORMACE O SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY. CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 bázových pár“ (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:4:
TCCCCTCCAG ATAATGCCTG AGCTGC 26
-44CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová ky selina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:5:
CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG 33 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:7:
TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC 23
-45CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:8:
CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:9:
GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC 30
-46CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:
CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT 35 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:
CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC
-47CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:
CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:
CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 23
-48CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:
TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 184 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:
TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC 60
AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCCTTT 120 ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTGGTC 130 GACC 134 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 107 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAGTC
CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA
107
-49CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 108 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:20:
GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGGAA 60
GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG 108 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:21:
GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:22:
CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 23
-50CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:23:
CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:24:
CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:25:
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 15 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin
25 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 193 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:26:
Met Gly 1 | Val His | Glu 5 | Cys Pro | Ala | Trp | Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu | |||||||||
10 | 15 | ||||||||||||||
Leu | Ser | Leu | Pro 20 | Leu | Gly | Leu | Pro | Val 25 | Leu | Gly | Ala | Pro | Pro 30 | Arg | Leu |
lle | Cys | Asp 35 | Ser | Arg | Val | Leu | Glu 40 | Arg | Tyr | Leu | Leu | Glu 45 | Ala | Lys | Glu |
Ala | Glu 50 | Asn | lle | Thr | Thr | Gly 55 | Cys | Ala | Glu | His | Cys 60 | Ser | Leu | Asn | Glu |
Asn 65 | lle | Thr | Val | Pro | Asp 70 | Thr | Lys | Val | Asn | Phe 75 | Tyr | Ala | Trp | Lys | Arg 80 |
Met | Glu | Val | Gly | Gin 85 | Gin | Ala | Val | Glu | Val 90 | Trp | Gin | Gly | Leu | Ala 95 | Leu |
Leu | Ser | Glu | Ala 100 | Val | Leu | Arg | Gly | Gin 105 | Ala | Leu | Leu | Val | Asn 110 | Ser | Ser |
Gin | Pro | Trp 115 | Glu | Pro | Leu | Gin | Leu 120 | His | Val | Asp | Lys | Ala 125 | Val | Ser | Gly |
Leu | Arg 130 | Ser | Leu | Thr | Thr | Leu 135 | Leu | Arg | Ala | Leu | Gly 140 | Ala | Gin | Lys | Glu |
Ala 145 | lle | Ser | Pro | Pro | Asp 150 | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala 155 | Pro | Leu | Arg | Thr | lle 160 |
Thr | Ala | Asp | Thr | Phe 165 | Arg | Lys | Leu | Phe | Arg 170 | Val | Tyr | Ser | Asn | Phe 175 | Leu |
Arg | Gly | Lys | Leu 180 | Lys | Leu | Tyr | Thr | Gly 185 | Glu | Ala | Cys | Arg | Thr 190 | Gly | Asp |
Arg
Claims (8)
1. Analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci.
2. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 1, v němž přesmyk zahrnuje deleci kteréhokoliv N-vazebného místa pro uhlohydrát v humánním erythropoietinu a adici N-vazebného uhlohydrátového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu.
3. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 2 zvolený ze souboru sestávajícího z
Gln24Ser87Asn88Thr90EPO,
Gln38Ser87Asn88Thr90EPO a
Gln83Ser87Asn88Thr90EPO.
4. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 1.
5. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 3.
6. Eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 4 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.
7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 3 spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.
8. Použití terapeuticky účinného množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10801693A | 1993-08-17 | 1993-08-17 | |
CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ291342B6 true CZ291342B6 (cs) | 2003-02-12 |
Family
ID=22319789
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
CZ2001463A CZ291343B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
CZ2001462A CZ291342B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ1995917A CZ291229B6 (cs) | 1993-08-17 | 1994-08-16 | Analog humánního erythropoietinu a jeho pouľití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
CZ2001463A CZ291343B6 (cs) | 1993-08-17 | 2001-02-06 | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0640619B2 (cs) |
JP (3) | JP2938572B2 (cs) |
KR (2) | KR100328769B1 (cs) |
CN (1) | CN1057534C (cs) |
AT (1) | ATE155796T1 (cs) |
AU (1) | AU677097B2 (cs) |
CA (1) | CA2147124C (cs) |
CZ (3) | CZ291229B6 (cs) |
DE (2) | DE10199059I2 (cs) |
DK (1) | DK0640619T4 (cs) |
ES (1) | ES2105442T5 (cs) |
FI (1) | FI117136B (cs) |
GR (1) | GR3024815T3 (cs) |
HK (1) | HK1001589A1 (cs) |
HU (1) | HU220334B (cs) |
IL (4) | IL110669A (cs) |
LU (1) | LU90850I2 (cs) |
LV (1) | LV10972B (cs) |
NL (1) | NL300075I2 (cs) |
NO (2) | NO323104B1 (cs) |
NZ (1) | NZ273134A (cs) |
RU (1) | RU2159814C2 (cs) |
SI (1) | SI0640619T2 (cs) |
SK (1) | SK282003B6 (cs) |
UA (1) | UA49793C2 (cs) |
WO (1) | WO1995005465A1 (cs) |
ZA (1) | ZA946122B (cs) |
Families Citing this family (234)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
US5696250A (en) * | 1995-02-15 | 1997-12-09 | Amgen Inc. | DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs |
US5989538A (en) * | 1995-02-15 | 1999-11-23 | Amgen Inc. | Mpl ligand analogs |
WO1997013783A1 (en) * | 1995-10-09 | 1997-04-17 | Pharmacia & Upjohn Company | An acceptor polypeptide for an n-acetylgalactosaminyltransferase |
KR100400637B1 (ko) * | 1996-02-06 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 생물학적으로유용한펩타이드 |
PT888385E (pt) | 1996-03-14 | 2004-01-30 | Genentech Inc | Utilizacoes de gdnf e de receptores de gdnf |
US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
DE69726571T2 (de) * | 1997-09-01 | 2004-11-04 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Rekombinantes humanes Erythropoietin mit vorteilhaftem Glykosylierungsmuster |
AU763719B2 (en) | 1997-12-08 | 2003-07-31 | Merck Patent Gmbh | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
DK1088084T3 (da) | 1998-06-15 | 2007-01-29 | Gtc Biotherapeutics Inc | Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein |
US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
AR020848A1 (es) * | 1998-10-23 | 2002-05-29 | Amgen Inc | Metodos y composiciones para la prevencion y el tratamiento de anemia |
DE19857609A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Hannelore Ehrenreich | Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen |
ATE323766T1 (de) * | 1999-02-12 | 2006-05-15 | Amgen Inc | Glykosylierte leptinzusammensetzungen und zugehörige verfahren |
US7345019B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
US7410941B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-08-12 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Methods for treatment of neurodegenerative conditions by peripherally administered erythropoietin |
US8236561B2 (en) | 1999-04-15 | 2012-08-07 | Crucell Holland B.V. | Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells |
US7604960B2 (en) | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
US6855544B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
US7297680B2 (en) | 1999-04-15 | 2007-11-20 | Crucell Holland B.V. | Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content |
US6555343B1 (en) | 1999-05-07 | 2003-04-29 | Genentech Inc. | Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
JP3660880B2 (ja) * | 1999-05-07 | 2005-06-15 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 新規なチンパンジーエリスロポエチン(chepo)ポリペプチドおよびこれをコードする核酸 |
US6831060B2 (en) | 1999-05-07 | 2004-12-14 | Genentech, Inc. | Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
PE20010288A1 (es) * | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
CA2391080A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
US7192759B1 (en) | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
US7527961B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-05-05 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
US7521220B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-04-21 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
CA2399832C (en) | 2000-02-11 | 2011-09-20 | Stephen D. Gillies | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
PT1274728E (pt) * | 2000-04-21 | 2008-06-20 | Amgen Inc | Métodos e composições para a prevenção e tratamento de anemia |
PT1311285E (pt) * | 2000-05-15 | 2005-06-30 | Hoffmann La Roche | Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina |
US7259146B2 (en) | 2000-05-26 | 2007-08-21 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Neuroprotective peptides |
EP1336410A4 (en) | 2000-08-04 | 2005-10-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | PROTEIN INJECTION PREPARATIONS |
AU2001277781A1 (en) | 2000-08-11 | 2002-02-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilized antibody-containing preparations |
KR101229995B1 (ko) * | 2000-12-11 | 2013-02-06 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
JP3946638B2 (ja) * | 2000-12-11 | 2007-07-18 | シージェイ コーポレーション | 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 |
BR0116381A (pt) | 2000-12-20 | 2004-02-25 | Hoffmann La Roche | Conjugado, composição farmacêutica que compreende o mesmo e sua utilização, processo para o tratamento profilático e/ou terapêutico de distúrbios, processo para a preparação de um conjugado, compostos e glicoproteìnas de eritropoetina |
US6531121B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
US20030072737A1 (en) | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
PA8536201A1 (es) | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
JP2005501801A (ja) | 2001-02-02 | 2005-01-20 | オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド | フラクトピラノーススルファメートとエリスロポイエチンを含んで成る神経学的機能不全治療 |
KR20090010127A (ko) | 2001-03-07 | 2009-01-28 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술 |
EP2336149A1 (en) | 2001-03-09 | 2011-06-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein purification method |
DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
FR2823220B1 (fr) * | 2001-04-04 | 2003-12-12 | Genodyssee | Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo) |
US7531358B2 (en) | 2001-04-17 | 2009-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of quantifying surfactant |
DE60239454D1 (de) | 2001-05-03 | 2011-04-28 | Merck Patent Gmbh | Rekombinanter, tumorspezifischer antikörper und dessen verwendung |
US6930086B2 (en) | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
CA2468499A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Erythropoietin dosing regimen for treating anemia |
KR100467750B1 (ko) * | 2001-11-29 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
KR100467751B1 (ko) | 2001-12-03 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
PT1454138E (pt) | 2001-12-04 | 2012-03-28 | Merck Patent Gmbh | Imunocitoquinas com seletividade modulada |
ES2297028T3 (es) | 2001-12-07 | 2008-05-01 | Crucell Holland B.V. | Produccion de virus, aislados virales y vacunas. |
ES2545090T3 (es) | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
US7129267B2 (en) | 2002-03-11 | 2006-10-31 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Methods for SHP1 mediated neuroprotection |
US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
KR20060019501A (ko) * | 2002-07-01 | 2006-03-03 | 더 케네쓰 에스. 워렌 인스티튜트 인코포레이티드 | 응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산 |
AU2003246486A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-02-09 | Cangene Corporation | Pegylated erythropoietic compounds |
DE10234192B4 (de) | 2002-07-26 | 2009-11-26 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Verwendung von Erythropoetin |
AU2003257536A1 (en) | 2002-08-27 | 2004-03-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of stabilizing protein solution preparation |
US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
DE60332358D1 (de) | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
HUE027134T2 (en) | 2002-09-11 | 2016-10-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for protein purification |
DE20321793U1 (de) | 2002-09-11 | 2010-06-02 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hydroxyalkylstärke-Derivate |
EP1681303B1 (en) | 2002-09-11 | 2013-09-04 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
CA2496317C (en) | 2002-09-11 | 2014-02-18 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives |
AU2003273413A1 (en) | 2002-10-08 | 2004-05-04 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates |
EP1551987A1 (en) * | 2002-10-17 | 2005-07-13 | Pharming Intellectual Property B.V. | Protein modification |
US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
RU2366664C2 (ru) | 2002-12-17 | 2009-09-10 | Мерк Патент Гмбх | Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2 |
EP1615945B1 (en) | 2003-04-09 | 2011-09-28 | BioGeneriX AG | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
ATE414144T1 (de) | 2003-05-09 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | Kulturen von e1-immortalisierten zellen und verfahren zu deren kultivierung zur erhöhung der produktausbeuten davon |
US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
EA010650B1 (ru) | 2003-09-29 | 2008-10-30 | Уоррен Фармасьютикалз, Инк. | Защищающие ткань цитокины для лечения и профилактики сепсиса и образования спаек |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
DK1699915T3 (da) | 2003-12-30 | 2010-09-13 | Augustinus Bader | Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering |
DE102004004509B4 (de) | 2004-01-23 | 2010-07-01 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden |
EP2336192A1 (en) | 2004-03-11 | 2011-06-22 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination |
US20080300173A1 (en) | 2004-07-13 | 2008-12-04 | Defrees Shawn | Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1] |
US7597884B2 (en) | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
HUE026826T2 (en) | 2004-10-29 | 2016-07-28 | Ratiopharm Gmbh | Modeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF) |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US9988427B2 (en) | 2005-05-13 | 2018-06-05 | Charite Universitaetsmedizen-Berlin | Erythropoietin variants |
EP1736481A1 (en) | 2005-05-13 | 2006-12-27 | Charite Universitätsmedizin-Berlin | Erythropoietin variants |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
CN100432107C (zh) * | 2005-10-25 | 2008-11-12 | 北京大学 | 具有促红细胞生长因子活性的蛋白质及其用途 |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
WO2007070315A2 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
EP1957637B1 (en) | 2005-12-08 | 2013-08-14 | Amgen, Inc. | Improved host cells and culture methods |
DE102006004008A1 (de) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich | Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose |
WO2007108505A1 (ja) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
CN101062407A (zh) | 2006-04-29 | 2007-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途 |
RU2008150314A (ru) | 2006-05-19 | 2010-06-27 | Гликофи, Инк. (Us) | Композиции эритропоэтина |
ES2516694T3 (es) | 2006-07-21 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O |
EP2057472B1 (en) | 2006-07-21 | 2013-11-13 | Amgen Inc. | Method of detecting and/ or measuring hepcidin in a sample |
WO2008023725A1 (fr) | 2006-08-22 | 2008-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agent préventif et/ou thérapeutique pour une neuropathie périphérique |
US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
CN101337988B (zh) * | 2006-10-31 | 2013-01-09 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 一种新的促红细胞生成素类似物 |
US8895303B2 (en) | 2006-11-13 | 2014-11-25 | Charite-Universitatsmedizin Berlin | Method of cell culture and method of treatment comprising a vEPO protein variant |
EP2120998B1 (en) | 2006-11-28 | 2013-08-07 | HanAll Biopharma Co., Ltd. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
AR065613A1 (es) | 2007-03-09 | 2009-06-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes de proteccion para organos transplantados |
PL2144923T3 (pl) | 2007-04-03 | 2013-12-31 | Biogenerix Ag | Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF |
US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
US20100172919A1 (en) * | 2007-06-15 | 2010-07-08 | Jan Grimm | Noveltreatment for neurological disorders |
CN103073631A (zh) * | 2007-07-02 | 2013-05-01 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 一种促红细胞生成素类似物 |
CN103113464B (zh) * | 2007-07-02 | 2014-08-20 | 沈阳三生制药有限责任公司 | 天然人促红细胞生成素类似物 |
WO2009010107A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hannelore Ehrenreich | Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis |
US8383114B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-02-26 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
EP3381445B1 (en) | 2007-11-15 | 2023-10-25 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration |
EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
US9175078B2 (en) | 2008-01-25 | 2015-11-03 | Amgen Inc. | Ferroportin antibodies and methods of use |
CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
EP2095829A1 (en) | 2008-02-27 | 2009-09-02 | LEK Pharmaceuticals D.D. | Selenium containing modifying agents and conjugates |
WO2009108806A1 (en) | 2008-02-27 | 2009-09-03 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor viii molecules |
EP2268807A2 (en) | 2008-04-21 | 2011-01-05 | Novo Nordisk A/S | Hyperglycosylated human coagulation factor ix |
ES2487846T3 (es) | 2008-05-01 | 2014-08-25 | Amgen, Inc. | Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso |
EP2334699B1 (en) | 2008-09-23 | 2013-09-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Purification of erythropoietin |
CA2737026C (en) | 2008-09-26 | 2019-12-24 | Ambrx, Inc. | Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses |
WO2010056981A2 (en) | 2008-11-13 | 2010-05-20 | Massachusetts General Hospital | Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6 |
SI2398817T2 (sl) * | 2009-02-19 | 2021-09-30 | Xellia Pharmaceuticals Aps | Postopek čiščenja lipopeptidov |
US20100272816A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-10-28 | Wolfgang Rudinger | Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient |
EP3009447B1 (en) | 2009-07-24 | 2018-06-06 | Dr. Reddy's Laboratories, Ltd. | Production of erythropoiesis stimulating protein using metal ions |
WO2011024025A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Avesthagen Limited | An erythropoietin analogue and a method thereof |
WO2011050333A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
ES2545411T5 (es) | 2010-06-07 | 2024-04-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármaco |
US20120115637A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-05-10 | Nike, Inc. | Golf Balls Including A Crosslinked Thermoplastic Polyurethane Cover Layer Having Improved Scuff Resistance |
US8193296B2 (en) | 2010-06-30 | 2012-06-05 | Nike, Inc. | Golf balls including crosslinked thermoplastic polyurethane |
RU2451071C1 (ru) * | 2010-12-10 | 2012-05-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину человека (варианты) |
MX341790B (es) | 2011-03-31 | 2016-09-02 | Amgen Inc | Adaptador de viales y sistema. |
AU2012245231B2 (en) | 2011-04-20 | 2016-10-13 | Amgen Inc. | Autoinjector apparatus |
US9089739B2 (en) | 2011-08-23 | 2015-07-28 | Nike, Inc. | Multi-core golf ball having increased initial velocity |
US8979676B2 (en) | 2011-08-23 | 2015-03-17 | Nike, Inc. | Multi-core golf ball having increased initial velocity at high swing speeds relative to low swing speeds |
CN103930142B (zh) | 2011-10-14 | 2016-12-14 | 安姆根有限公司 | 注射器和装配方法 |
KR101443257B1 (ko) * | 2011-10-18 | 2014-09-19 | 주식회사 종근당 | 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법 |
CN102788720B (zh) * | 2012-06-05 | 2016-01-06 | 西北大学 | 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全n-连接糖链及其鉴别方法 |
SI3081249T1 (sl) | 2012-11-21 | 2021-03-31 | Amgen Inc. | Naprava za dajanje zdravila |
CN103864913A (zh) * | 2012-12-18 | 2014-06-18 | 联亚生技开发股份有限公司 | 重组蛋白 |
JP6768501B2 (ja) | 2013-03-15 | 2020-10-14 | アムゲン・インコーポレーテッド | 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム |
DK2968503T3 (en) | 2013-03-15 | 2018-12-03 | Intrinsic Lifesciences Llc | ANTI-HEPCIDIN ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF |
CA2904725C (en) | 2013-03-15 | 2022-04-12 | Amgen Inc. | Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system |
WO2014149357A1 (en) | 2013-03-22 | 2014-09-25 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
PL3060275T3 (pl) | 2013-10-24 | 2019-12-31 | Amgen Inc. | Wstrzykiwacz i sposób montażu |
EP3060281B1 (en) | 2013-10-24 | 2019-01-30 | Amgen Inc. | Drug delivery system with temperature-sensitive control |
KR101414897B1 (ko) | 2013-11-29 | 2014-07-04 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 다베포에틴 알파의 정제 방법 |
WO2015119906A1 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
AU2015256082C1 (en) | 2014-05-07 | 2020-09-10 | Amgen Inc. | Autoinjector with shock reducing elements |
CN112237662B (zh) | 2014-06-03 | 2022-10-21 | 安姆根有限公司 | 药物递送系统和使用方法 |
EP3194429A4 (en) * | 2014-09-18 | 2018-06-13 | Askgene Pharma, Inc. | Novel feline erythropoietin receptor agonists |
NZ730186A (en) | 2014-09-22 | 2020-04-24 | Intrinsic Lifesciences Llc | Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
AU2015332557B2 (en) | 2014-10-14 | 2020-05-14 | Amgen Inc. | Drug injection device with visual and audio indicators |
JP6716566B2 (ja) | 2014-12-19 | 2020-07-01 | アムジエン・インコーポレーテツド | 近接センサ付き薬物送達装置 |
ES2785311T3 (es) | 2014-12-19 | 2020-10-06 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario |
CA2976935C (en) | 2015-02-17 | 2020-03-10 | Amgen Inc. | Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback |
ES2905870T3 (es) | 2015-02-27 | 2022-04-12 | Amgen Inc | Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja |
WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
WO2017100501A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling cap |
WO2017120178A1 (en) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
JP6906497B2 (ja) * | 2016-03-09 | 2021-07-21 | Jcrファーマ株式会社 | 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
EP3429663B1 (en) | 2016-03-15 | 2020-07-15 | Amgen Inc. | Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices |
WO2017189089A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
WO2017192287A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
MX2018013616A (es) | 2016-05-13 | 2019-02-21 | Amgen Inc | Montaje de cubierta protectora de vial. |
US11238150B2 (en) | 2016-05-16 | 2022-02-01 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
GB2550418A (en) | 2016-05-20 | 2017-11-22 | Laing Peter | An improved vaccine against flaviviruses avoiding elicitation or stimulation of infection-enhancing antibodies |
WO2017209899A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Amgen Inc. | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
WO2018004842A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Amgen Inc. | Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events |
US20190328965A1 (en) | 2016-08-17 | 2019-10-31 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
EP3532127A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Amgen Inc. | On-body injector |
AU2018210301A1 (en) | 2017-01-17 | 2019-08-01 | Amgen Inc. | Injection devices and related methods of use and assembly |
WO2018151890A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
MX2019009755A (es) | 2017-02-17 | 2019-10-07 | Amgen Inc | Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos. |
JP6258536B1 (ja) * | 2017-03-03 | 2018-01-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 |
EP3592403A1 (en) | 2017-03-06 | 2020-01-15 | Amgen Inc. | Drug delivery device with activation prevention feature |
IL268478B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-10-01 | Amgen Inc | Inserting a needle using super pressure |
IL268386B2 (en) | 2017-03-09 | 2023-11-01 | Amgen Inc | Insertion mechanism for a drug delivery device |
CN110446499A (zh) | 2017-03-20 | 2019-11-12 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 一种体外糖基工程化红细胞生成刺激蛋白的方法 |
EP4241807A3 (en) | 2017-03-28 | 2023-10-11 | Amgen Inc. | Plunger rod and syringe assembly system and method |
AU2018281334A1 (en) | 2017-06-06 | 2019-12-19 | Kindred Biosciences, Inc. | Erythropoietin and analogs for veterinary use |
AU2018280054B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-07-13 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
AU2018282077B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-11-23 | Amgen Inc. | Torque driven drug delivery device |
US11541183B2 (en) | 2017-06-22 | 2023-01-03 | Amgen Inc. | Device activation impact/shock reduction |
JP7475860B2 (ja) | 2017-06-23 | 2024-04-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス |
ES2972207T3 (es) | 2017-07-14 | 2024-06-11 | Amgen Inc | Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble |
MA49626A (fr) | 2017-07-21 | 2020-05-27 | Amgen Inc | Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage |
EP4085942A1 (en) | 2017-07-25 | 2022-11-09 | Amgen Inc. | Drug delivery device with gear module and related method of assembly |
EP3658206A1 (en) | 2017-07-25 | 2020-06-03 | Amgen Inc. | Drug delivery device with container access system and related method of assembly |
EP3664863A2 (en) | 2017-08-09 | 2020-06-17 | Amgen Inc. | Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system |
EP3668567A1 (en) | 2017-08-18 | 2020-06-24 | Amgen Inc. | Wearable injector with sterile adhesive patch |
US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
WO2019070472A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Amgen Inc. | FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE |
IL272636B1 (en) | 2017-10-06 | 2024-06-01 | Amgen Inc | Drug delivery device with combination assembly and related assembly method |
WO2019074579A1 (en) | 2017-10-09 | 2019-04-18 | Amgen Inc. | DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF |
EP3703778A1 (en) | 2017-11-03 | 2020-09-09 | Amgen Inc. | System and approaches for sterilizing a drug delivery device |
WO2019089178A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement and flow sensing |
WO2019090303A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Amgen Inc. | Fill-finish assemblies and related methods |
SG11202002966QA (en) | 2017-11-10 | 2020-05-28 | Amgen Inc | Plungers for drug delivery devices |
SG11202002772VA (en) | 2017-11-16 | 2020-04-29 | Amgen Inc | Autoinjector with stall and end point detection |
IL273638B1 (en) | 2017-11-16 | 2024-06-01 | Amgen Inc | Door lock mechanism for drug delivery device |
US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
WO2020023220A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation |
US12042645B2 (en) | 2018-07-24 | 2024-07-23 | Amgen Inc. | Delivery devices for administering drugs |
WO2020023336A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
MX2021000749A (es) | 2018-07-24 | 2021-03-29 | Amgen Inc | Dispositivos de suministro para administrar farmacos. |
WO2020028009A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Amgen Inc. | Fluid path assembly for a drug delivery device |
US20210346601A1 (en) | 2018-09-24 | 2021-11-11 | Amgen Inc. | Interventional dosing systems and methods |
AR113091A1 (es) | 2018-09-27 | 2020-01-22 | Univ Nacional Del Litoral | Eritropoyetina humana modificada |
CA3110371A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Amgen Inc. | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
EP3860685A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
EP3860686A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Amgen Inc. | Drug delivery device having dose indicator |
CA3109988A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Amgen Inc. | Platform assembly process for drug delivery device |
MA53912A (fr) | 2018-10-15 | 2022-01-19 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement |
CA3113076A1 (en) | 2018-11-01 | 2020-05-07 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
US11213620B2 (en) | 2018-11-01 | 2022-01-04 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
TWI831847B (zh) | 2018-11-01 | 2024-02-11 | 美商安進公司 | 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法 |
MX2021012557A (es) | 2019-04-24 | 2021-11-12 | Amgen Inc | Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas. |
MX2022002149A (es) | 2019-08-23 | 2022-03-17 | Amgen Inc | Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados. |
WO2022159414A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-28 | University Of Rochester | Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction |
US20240208680A1 (en) | 2021-05-21 | 2024-06-27 | Amgen Inc. | Method of optimizing a filling recipe for a drug container |
WO2023209074A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing |
WO2024094457A1 (en) | 2022-11-02 | 2024-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing glycoprotein compositions |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
KR100221066B1 (ko) * | 1989-10-13 | 1999-10-01 | 스튜어트 엘.왓트 | 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물 |
-
1994
- 1994-08-15 ZA ZA946122A patent/ZA946122B/xx unknown
- 1994-08-15 IL IL110669A patent/IL110669A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-08-15 CN CN94109128A patent/CN1057534C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-15 IL IL192290A patent/IL192290A0/en unknown
- 1994-08-16 UA UA95058432A patent/UA49793C2/uk unknown
- 1994-08-16 SK SK502-95A patent/SK282003B6/sk unknown
- 1994-08-16 HU HU9501435A patent/HU220334B/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1994-08-16 KR KR1019950701453A patent/KR100328769B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-08-16 DK DK94112732T patent/DK0640619T4/da active
- 1994-08-16 SI SI9430078T patent/SI0640619T2/xx unknown
- 1994-08-16 WO PCT/US1994/009257 patent/WO1995005465A1/en active IP Right Grant
- 1994-08-16 AU AU76327/94A patent/AU677097B2/en not_active Expired
- 1994-08-16 DE DE2001199059 patent/DE10199059I2/de active Active
- 1994-08-16 CA CA002147124A patent/CA2147124C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 DE DE69404401T patent/DE69404401T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 EP EP94112732A patent/EP0640619B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 AT AT94112732T patent/ATE155796T1/de active
- 1994-08-16 JP JP7507153A patent/JP2938572B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 ES ES94112732T patent/ES2105442T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-16 NZ NZ273134A patent/NZ273134A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-08-16 RU RU95115239/14A patent/RU2159814C2/ru active
- 1994-08-16 CZ CZ1995917A patent/CZ291229B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-04-12 NO NO19951445A patent/NO323104B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-04-13 FI FI951792A patent/FI117136B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-04-15 KR KR1019957001453A patent/KR960701994A/ko unknown
- 1995-04-17 LV LVP-95-99A patent/LV10972B/en unknown
-
1997
- 1997-09-22 GR GR970402449T patent/GR3024815T3/el unknown
-
1998
- 1998-01-21 HK HK98100522A patent/HK1001589A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-08-24 JP JP25324498A patent/JP3664590B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-05-16 IL IL13618800A patent/IL136188A0/xx unknown
- 2000-05-16 IL IL13618900A patent/IL136189A0/xx unknown
-
2001
- 2001-02-06 CZ CZ2001463A patent/CZ291343B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-06 CZ CZ2001462A patent/CZ291342B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-11-07 LU LU90850C patent/LU90850I2/fr unknown
- 2001-12-06 NL NL300075C patent/NL300075I2/nl unknown
-
2004
- 2004-06-25 JP JP2004188815A patent/JP3664723B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-29 NO NO2007008C patent/NO2007008I2/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ291342B6 (cs) | Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek | |
US7217689B1 (en) | Glycosylation analogs of erythropoietin | |
KR0183981B1 (ko) | 사람 에리트로포이에틴의 뮤테인 | |
KR100263845B1 (ko) | 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물 | |
US5856298A (en) | Erythropoietin isoforms | |
JP3375614B2 (ja) | ヒトエリスロポエチン産生哺乳動物細胞の作製方法。 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20140816 |