CZ291342B6 - Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci. Použití tohoto analogu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta a tento farmaceutický prostředek. Sekvence DNA kódující tento analog a eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná touto sekvencí DNA způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat výše uvedený analog.ŕ

Description

Analog humánního erythropoietinu a jeho použití, sekvence DNA, eukaryontní hostitelská buňka a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká analogů humánního erythropoietinu a jejich použití pro výrobu léčiv, sekvencí DNA, které kódují tyto analogy, eukaryontních hostitelských buněk transfekovaných těmito sekvencemi DNA a farmaceutického prostředku na bázi výše uvedených analogů erythropoietinu.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin (EPO) je glykoproteinový hormon, který se podílí na maturaci erythroidních progenitorových buněk na erythrocyty. Jedná se o důležitý hormon regulující hladinu červených krvinek v oběhovém systému. Přírodní erythropoietin je produkován v játrech během života plodu a v ledvinách dospělých, cirkuluje krví a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anémie je téměř vždy důsledkem selhání ledvin projevujícího se sníženou produkcí erythropoietinu v ledvinách. Zjistilo se, že rekombinantní erythropoietin vyrobený technikami genetického inženýrství, tj. expresí proteinového produktu z hostitelské buňky transformované genem kódujícím erythropoietin je účinný při léčbě anémie vyvolané chronickým selháním ledvin.

V moči člověka je normálně přítomna nízká koncentrace erythropoietinu, zatímco v moči pacientů trpících aplastickou anémií je hladina erythropoietinu zvýšena. Při purifíkaci humánního urinámího erythropoietinu (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5 558 (1977)) bylo jako výchozí látky použito moči pacientů trpících aplastickou anémií. Až dosud se však urinámí erythropoietin nestal užitečným z terapeutického hlediska.

Identifikace, klonování a exprese genů kódujících erythropoietin je popsána v patentu US 4 703 008 (Lin). Popis způsobu purifikace rekombinantního erythropoietinu z buněčného média je popsán v patentu US 4 667 016 (Lai et al.). Výše uvedené dvě citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Exprese a izolace biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantním plazmidu umožnila poprvé získat větší množství erythropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Kromě toho, znalost sekvence genu a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu vedla k lepšímu porozumění mechanismu účinku tohoto proteinu.

Mnohé buněčné povrchové proteiny a sekretorové proteiny produkované eukaryontními buňkami jsou modifikovány jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace, která je označována názvem glykosylace, může dramaticky ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může být také důležitá pro stabilitu, sekreci a subcelulární lokalizaci proteinu. Vhodná glykosylace může mít rozhodující význam pro biologickou účinnost. Je skutečností, že některé geny z eukaryontních organismů, pokud jsou exprimovány v bakteriích (například E. coli), kterým chybí buněčné procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které po izolaci vykazují jen malou účinnost nebojsou úplně neúčinné, v důsledku toho, že nejsou glykosylovány.

Ke glykosylaci dochází na specifických místech hlavního řetězce polypeptidu a obvykle se jedná o dva různé typy: O-vázané oligosacharidy jsou připojeny k serinovým nebo threoninovým zbytkům, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, kde jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde XY představuje jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků, které se vyskytují u obou typů, jsou různé. Jedním typem cukru, který se obvykle vyskytuje u obou těchto typů, je kyselina N-acetylneuraminová (dále označována názvem kyselina sialová). Kyselina

-1 CZ 291342 B6 sialová tvoří obvykle terminální zbytek jak N-vázaného, tak O-vázaného oligosacharidu a díky svému negativnímu náboji může propůjčovat glykoproteinu kyselé vlastnosti.

Jak humánní erythropoietin izolovaný z moči, tak rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích buňkách) a aminokyselinovou sekvencí 1-165 humánního erythropoietinu obsahuje tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, které dohromady činí asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace se vyskytuje u asparaginových zbytků umístěných v polohách, 24,38 a 83, zatímco O-vázaná glykosylace je umístěna na serinovém zbytku v poloze 126 [Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3 116 (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265, 329(1988)]. Bylo ukázáno, že oligosacharidové řetězce jsou modifikovány terminálními zbytky kyseliny sialové. Enzymatické zpracování glykosylovaného erythropoietinu za účelem odstranění všech zbytků kyseliny sialové, se projevuje ztrátou účinnosti in vivo, ale neovlivní účinnost in vitro [Lowy et al., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4 202 (1974)]. Toto chování bylo vysvětleno rychlým vymizením asialoerythropoietinu z oběhu při interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein [Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1 385 (1974); Ashwell et al., Methods Enzymol 50, 287 (1978)]. Erythropoietin vykazuje tedy biologickou účinnosti in vivo pouze v tom případě, když je sialylován, čímž se zabrání jeho vazbě na hepatický vazebný protein.

Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích erythropoietinu není dobře definována. Zjistilo se, že částečně deglykosylovaný erythropoietin vykazuje podstatně sníženou účinnosti in vivo ve srovnání s glykosylovanou formou, ale zachovává se svou účinnost in vitro [Dordal et al., Endocrinology 166, 2 293 (1985); Lin, výše citovaný patent]. V jiné studii však bylo konstatováno, že odštěpení N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců, jednotlivě nebo dohromady, mutagenezí asparaginových nebo serinových zbytků, které představují glykosylační místa, výrazně snižuje in vitro účinnost modifikovaného erythropoietinu produkovaného v savčích buňkách [Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17 516 (1988)].

Glykoproteiny, jako je erythropoietin, je možno rozdělovat na formy s různým nábojem za použití takových technik, jako je izoelektrická fokusace (IEF). Několik skupin vědců publikovalo IEF studie vztahující se k surovým nebo zčásti purifikovaným erythropoietinovým přípravkům [Lukowski et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)]. Pomocí IEF byly při těchto studiích identifikovány nejvýše tři nebo čtyři frakce s erythropoietinovou účinností a žádná z nich nebyla charakterizována, pokud se týče obsahu uhlohydrátů. Kromě nebyla provedena žádná korelace mezi izoelektrickými body těchto frakcí a jejich biologickou účinností.

Při purifikaci erythropoietinu izolovaného z humánní moči (Miyake et al., výše uvedená citace) bylo zjištěno, že dvě frakce erythropoietinu izolované pomocí chromatografie na hydroxylapatitu a označené symboly II a lila, vykazují podobnou specifickou účinnost. Následující analýza uhlohydrátů ve frakcích II a lila ukázala, že frakce II obsahuje vyšší průměrný obsah kyseliny sialové, než frakce lila (Dordal et al., výše uvedená citace).

Úkolem tohoto vynálezu je získat oddělené a izolované izoformy erythropoietinu s definovaným obsahem kyseliny sialové a s definovanou biologickou účinností. Tyto izoformy by měly být terapeuticky užitečné při použití ve formě farmaceutických prostředků.

-2CZ 291342 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci.

Ve výhodném provedení v analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu přesmyk zahrnuje deleci, kteréhokoliv N-vazebného místa pro uhlohydrát v humánním erythropoietinu a adici N-vazebného uhlohydrátového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu.

Jako konkrétní provedení analogu humánního erythropoietinu podle vynálezu je možno uvést provedení zvolená ze souboru sestávajícího z

Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO,

Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO a

Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

Předmětem vynálezu je také sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu popsaný výše.

Dalším předmětem vynálezu je eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA uvedeno výše způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množství výše uvedeného analogu erythropoietinu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.

Konečně je předmětem vynálezu také použití terapeuticky účinného množství výše uvedeného analogu erythropoietinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.

Přehled obr, na výkresech

Obr. 1 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel, na němž je provedena separace izoforem rekombinantního erythropoietinu. Gelové dráhy 1 až 11 ukazují izoformy od méně kyselých (vyšší hodnota pí) v dráze 1 ke kyselejším (nižší hodnota pí) v dráze 11. V drahách ležících u pravého a levého okraje je též obsažen purifíkovaný rekombinantním erythropoietin obsahující směs izoforem 9 až 14.

Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi počtem zbytků kyseliny sialové v izoformě erythropoietinu a specifickou účinností této izoformy in vivo vyjádřenou vjednotkách/mg eiythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A je znázorněna koncentrace každé izoformy erythropoietinu zjištěná Bradfordovým stanovením proteinů. Na obr. 2B je tato koncentrace stanovena měřením absorbance při 280 nm a na obr. 2C je tato koncentrace stanovena metodou RIA.

Obr. 3 ukazuje analytický izoelektrický fokusační gel s definovanými směsmi izoforem rekombinantního erythropoietinu připravenými chromatografií na anexu za různých podmínek. Gelové dráhy 1 až 6 představují (podle pořadí v jakém jsou uvedeny) erythropoietinové izoformy eluované vpromývací kapalině s vysokým obsahem solí po promytí sloupce Q-Sepharose rychlým proudem 150mM kyseliny octové o pH4,7, 150mM kyseliny octové, která není pufrována, 200mM kyseliny octové o pH 4,7, 300mM kyseliny octové o pH 4,7 nebo 300mM kyseliny octové, která není pufrována. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2

-3CZ 291342 B6 výše uvedené publikace Lai et al.. pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na O-Sepharose.

Obr. 4 ukazuje dělení izoforem erythropoietinu 8 až 12, které se provádí tak, že se upravené buněčné médium nanese na sloupec Q-Sepharose a eluuke gradientem s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Alikvoty sudých frakcí od frakce 2 do frakce 40 se podrobí analytické izoelektrické fokusaci. Na levé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem. získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.

Na obr. 5 je znázorněna sekvence aminokyselin humánního erythropoietinu. Čtverečky označují asparaginové zbytky, knimž jsou připojeny N-vázané uhlohydrátové řetězce a hvězdička označuje serinový zbytek, který je modifikován O-vázaným uhlohydrátovým řetězcem.

Na obr. 6A, 6B a 6C je znázorněna série klonovacích stupňů použitých pro vytvoření plazmidů pro konstrukci a analýzu analogů humánního erythropoietinu. Tyto analogy obsahují aminokyseliny modifikované způsobem znázorněným na obr. 5, který jim dodává přídavná glykosylační místa.

Na obr. 7 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a uvedených analogů erythropoietinu. Analogy [Asn⁹, Serⁿ]EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁵, Ser^l27]EPO a [Pro‘²⁴, Thr¹²⁵]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO a [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸]EPO, které neobsahují přídavné uhlohydrátové řetězce.

Na obr. 8 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů erythropoietinu s humánní sekvencí a charakterizovaných analogů erythropoietinu pro zpracování N-glykanázou. Analogy [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO jsou zkonstruovány způsobem popsaným v příkladu 6. Pro srovnání jsou zde uvedeny též přídavné analogy [Val¹²⁶[EPO, [Pro¹²⁴]EPO [Pro¹²⁵]EPO, [Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO a [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO.

Obr. 9 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace frakcí 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Q-Sepharose s obrácenými fázemi (C4) za použití buněčného média podporujícího růst CHO buněk transfekovaných erythropoietinovou cDNA obsahující [Thr¹²⁵]-mutaci. Na levé a pravé krajní dráze gelu je také obsažen purifíkovaný rekombinantní erythropoietin obsahující směs izoforem, získaný postupy popsanými v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., pouze s tím rozdílem, že místo chromatografie na DEAE-Agaróze bylo použito chromatografie na Q-Sepharose.

Na obr. 10 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a zvolených analogů. Konstrukce těchto analogů je popsána v příkladu 6. Analogy N9, N14, N18, N19, N21, N24 a N39 obsahují přinejmenším jeden přídavný uhlohydrátový řetězec, což je dokumentováno nižší pohyblivostí na gelu.

Na obr. 11 je znázorněna analýza Western blot COS buněčných supematantů rekombinantního humánního erythropoietinu a analogu EPON14 v průběhu štěpení N-glykanázou. Časové intervaly, v nichž bylo prováděno měření, jsou 0,4,12,45 minut a štěpení přes noc.

Obr. 12 ukazuje izoelektrický fokusační gel z fokusace přípravků obsahujících izoformy analogu EPON14. Směs označená jako nízké izoformy obsahuje analog EPON14 obsahující převážně 6 až 12 zbytků kyseliny sialové v molekule, směs označená jako střední izoformy obsahuje analog N14 obsahující převážně 10 až 15 zbytků kyseliny sialové v molekule a směs označená jako vysoké izoformy obsahuje analog NI4 obsahující převážně 12 až 17 zbytků kyseliny sialové v molekule.

-4CZ 291342 B6

Obr. 13 ukazuje farmakokinetiku rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14 a analogu EPO N14 (izoformy 15 až 17) po intravenosním injekčním podání krysám.

Na obr. 14 je znázorněna zkouška vytěsňování ¹²⁵I-značeného rekombinantního humánního erythropoietinu z vazby k receptoru erythropoietinu prováděná za chladu za přítomnosti různého množství neznačeného rHuEPO. izolované izoformy 14 nebo analogu EPO NI4.

Obr. 15 ukazuje studii myšího hematokritu (poměr plazmy ke krvinkám), při níž se porovnává účinnost vysoké izoformy EPON14 (0,036 a 0,0712 pg), izolované izoformy 14 (0,036 a 0,0712 pg), nízké izoformy EPO 177 (0,0712 pg) a rHuEPO (0,071 pg).

Následuje podobný popis tohoto vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou izoformy erythropoietinu. Specifické izoformy erythropoietinu získané podle vynálezu a jejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Tak například izoformy humánního erythropoietinu izolovaného z moči se liší od izoforem rekombinantního erythropoietinu. V přednostním provedení se vynález týká izoformy erythropoietinu se specifickým počtem (tj. s pevným počtem, který je vyšší než 0) zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, přičemž toto číslo je zvoleno ze souboru zahrnujícího čísla 1 až 14. S výhodou je tímto Číslem 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. Vjiném provedení je toto číslo vyšší než 14as výhodou leží v rozmezí od 16 do 23.

Pod označením „izoforma eiythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietinový přípravek vykazující jediný izoelektrický bod (pl) a mající stejnou sekvenci aminokyselin. Pod označením ..erythropoietin“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí přírodní erythropoietin, humánní erythropoietin izolovaný z moči, jakož i polypeptidy, které se nevyskytují v přírodě a které mají sekvenci aminokyselin a které jsou glykosylovány způsobem dostatečně kopírujícím přírodní erythropoietin, aby jim to udělilo in vivo biologické vlastnosti spočívající ve stimulaci buněk kostní dřeně pro zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek.

Zjistilo se, že oddělené izoformy rekombinantního erythropoietinu, které mají sekvenci aminokyselin humánního erythropoietinu izolovaného z moči, odpovídají molekulám erythropoietinu obsahujícím 1 až 14 zbytků ky seliny sialové, přičemž každá z izoforem přítomných v purifikovaném rekombinantním erythropoietinu vykazuje účinnost in vivo mající vztah k počtu zbytků kyseliny sialové, které tato izoforma obsahuje.

V přednostním provedení je erythropoietin produktem exprese exogenní sekvence DNA, která byla transfekována do nehumánní eukaryontní hostitelské buňky. V přednostním provedení je tedy erythropoietinem „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin se s výhodou produkuje postupy popsanými v patentu US 4 703 008 (Lin; stejný majitel vlastní i práva k této přihlášky). Rekombinantní erythropoietin se může purifikovat obecnými postupy popsanými v příkladu 2 patentu US 4 667 016 (Lai et al.; stejný majitel vlastní i práva ktéto přihlášce) nebo alternativně způsobem popsaným v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al., při němž se však místo chromatografie na DEAE-Agaróze použije chromatografie na Q-Sepharose.

Erythropoietin purifikovaný podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. obsahuje podle analýzy IEF převážně 6 izoforem. Za použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4 byla kromě toho zjištěna přinejmenším jedna další izoforma s vyšší kyselostí. (Tato kyselejší forma migrující na IEF gelu při obsahu zbytků sialové kyseliny nad 14 může obsahovat záporné náboje nepocházející z sialové kyseliny, což dokládá resistence některých nábojů ke štěpení sialidázou). Tyto izoformy se od sebe vzájemně liší obsahem kyseliny sialové. Tato skutečnost je

-5CZ 291342 B6 v příkladech demonstrována na izolaci 10 takových izoforem preparativní IEF a stanovením obsahu kyseliny sialové v 5 z nich. Zjistilo se, že v izoformách zkoušených na obsah kyseliny sialové, je počet zbytků kyseliny sialové 9, 10, 11, 12 nebo 13.

Existuje vztah mezi relativní specifickou účinností erythropoietinu in vivo a počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu z izoforem 5 až 11 (každá izoforma je zde označena počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu). Izoformy 11 až 14 vykazují přibližně stejnou relativní specifickou účinnost in vivo. Izoformy 5 až 14 byly zkoušeny na účinnost in vivo pomocí exhypoxického polycythemického biologického stanovení na myších. Množství každé z přítomných izoforem se zjistí Bradfordovým stanovením proteinů, měřením absorbance při 280 nm nebo radioimunoesejem (RIA) pro erythropoietin. Výsledky stanovení RIA vyjádřené v jednotkách/ml se dělí hodnotou 212 770 jednotek/mg erythropoietinového polypeptidu, průměrnou specifickou účinností purifikovaného erythropoietinu stanovenou metodou RIA, a tím se získají hodnoty koncentrace proteinu v izolovaných izoformách nebo směsích izoforem, které jsou vyjádřeny v miligramech erythropoietinového polypeptidu na mililitr. Jak je to ukázáno v příkladech, relativní specifická účinnost in vivo stupňovitě stoupá od izoformy 5 k izoformě 11 (viz tabulka 2).

Hodnoty specifické účinnosti in vivo, které jsou v tomto popisu uváděny, představují hodnoty získané měřením relativní specifické účinnosti in vivo a nikoliv měřením absolutní specifické účinnosti in vivo. Hodnot specifické účinnosti se v tomto popisu používá pouze pro srovnání relativní účinnosti izoforem zkoušených pomocí stejného stanovení za stejných podmínek, za použití stejného vnitřního standardu, stejného typu zvířete a za použití stejné analýzy dat použitých pro výpočet specifické účinnosti a za použití stejné zkoušky pro stanovení obsahu proteinu. Žádná z uvedených hodnot specifické účinnosti in vivo u kteréhokoliv z izoforem nepředstavuje inherentní nebo absolutní hodnotu charakteristickou pro tuto izoformu.

Předmětem vynálezu jsou také směsi obsahující dvě nebo více izoforem erythropoietinu. Pode jednoho provedení obsahují tyto směsi izoformy obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, než je předmětem určený počet, například vyšší počet než 11 nebo 12, a například se jedná o směs izoforem 12, 13 a 14. Podle jiného provedení obsahují tyto směsi izoformy s předem určeným počtem zbytků kyseliny sialové v molekule erythropoietinu, například s méně než 12, ale více než 8 zbytky kyseliny sialové v molekule, jako je tomu například v případě směsi izoforem 9, 10 a 11. Předmětem vynálezu jsou také směsi izoforem erythropoietinu, v nichž jsou vzájemná množství izoforem stejná nebo různá. Tak například směs izoforem 9, 10 a 11 může obsahovat jednotlivé izoformy v různých poměrech, jako například 1 :1 : 1,2 : 3 :1 nebo 20 :20:1.

S výhodou obsahují takové směsi méně než 4 izoformy a jedná se například o směsi izoforem 11, 12 a 13 nebo o směsi izoforem 12 a 14 nebo dále o směs izoforem 7 a 13.

Takové směsi izoforem erythropoietinu se podle vyrábějí podle vynálezu současnou izolací zvolených izoforem erythropoietinu. Tyto postupy zahrnují izolací jednotlivých izoforem takovými technikami, jako je preparativní izoelektrická fokusace nebo výrobu směsí izoforem obsahujících předem určený počet zbytků kyseliny sialové (například nad 11) takovými technikami, jako je ionexová chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na dělení proteinů podle náboje.

Ionexová chromatografie a chromatofokusace se obvykle provádí tak, že se buď surový humánní erythropoietin (médium zpracované buňkami), nebo purifikovaný materiál aplikuje na sloupec pryskyřice za podmínek umožňujících vazbu některých nebo všech izoforem erythropoietinu k pryskyřici. Pokud se používá surového erythropoietinu, přednostně se protein aplikuje na sloupec při hodnotě pH asi 7, zatímco purifikované proteinové přípravky se mohou aplikovat na sloupec při pH v rozmezí od 7 do asi 4. Po promytí sloupce pufrem o hodnotě pH asi 4 se izoformy erythropoietinu, které zůstanou navázány na sloupci ionexu, eluují zvýšením pH

-6CZ 291342 B6 a koncentrace soli vpromývacím pufru nebo aplikací gradientu se snižující se hodnotou pH a zvyšující se iontovou silou při pH asi 4. V případě chromatofokusace se izoformy eluují ze sloupce gradientem se snižující se hodnotou pH nebo promytím sloupce roztokem s vysokou koncentrací soli.

V přednostním provedení se jednotlivé izoformy izolují za použití ionexové chromatografie. Tak například izoforma 14 se izoluje za použití ionexové chromatografie způsobem popsaným v příkladu 8.

Do rozsahu vynálezu spadají také určité analogy humánního erythropoietinu. Pod označením „analog humánního erythropoietinu“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí erythropoietin zahrnující jednu nebo více změn aminokyselinové sekvence erythropoietinu, která má za následek zvýšení počtu míst připojení kyseliny sialové. Analogy se tvoří místně orientovanou mutagenezí zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, kterými se zvyšuje nebo mění počet míst, která jsou k dispozici pro glykosylaci. Takové analogy mohou obsahovat větší počet uhlohydrátových řetězců než humánní erythropoietin.

Analogy erythropoietinu podle vynálezu obsahují sekvenci aminokyselin, která zahrnuje přinejmenším jedno přídavné glykosylační místo. Analogy obsahující vyšší koncentraci kyseliny sialové než její obsah v humánním erythropoietinu se získávají zavedením glykosylačních míst, které nezpůsobí zmatení sekundární nebo terciární komformace potřebné pro biologickou účinnost. Analog humánního erythropoietinu s výhodou obsahuje 1, 2 nebo 3 přídavná místa pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci, což se projeví zavedením 1, 2 nebo 3 přídavných N-vázaných nebo O-vázaných uhlohydrátových řetězců. Tak například leucin v poloze 69 se nahradí asparaginem, za vzniku sekvence Asn-Leu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvykle dodat až čtyři přídavné zbytky kyseliny sialové do molekuly. Jako příklady změn, kterými lze vytvořit přídavná O-glykosylační místa, je výměna alaninu v poloze 125 za threonin a alaninů v polohách 124 a 125 za prolin (v poloze 124) athreonin (v poloze 125). Je možno sestrojit analogy obsahující jeden nebo více přídavných N-vázaných a O-vázaných řetězců, jako jsou například analogy NO1 a NO2 popsané v tabulce 5. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do rozsahu tohoto vynálezu spadá i mnoho dalších analogů humánního erythropoietinu obsahujících přídavná místa pro glykosylaci.

Analogy se zvýšenou četností připojení uhlohydrátů v glykosylačních místech rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Tyto analogy obvykle zahrnují substituci jedné nebo více aminokyselin v těsném sousedství k N-vazebnému nebo O-vazebnému místu. Díky těmto změnám aminokyselin bude větší část erythropoietinových polypeptidů obsahovat uhlohydrátovou modifikaci. Glykosylační místa mohou být přirozená nebo mohou být vytvořena mutací. Tak například analog N13 neobsahuje přídavný uhlohydrátový řetězec, přestože do něj bylo zavedeno v poloze 88 glykosylační místo. Analogy N14 a N80, které obsahují v poloze 87 výměnu za serin (N14) nebo za valin (NI8), obsahují v poloze 88 přídavný uhlohydrátový řetězec.

Do rozsahu vynálezu spadají také analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin, kterými je nastaven karboxylový konec erythropoietinu, přičemž toto nastavení karboxylového konce zajišťuje zavedení alespoň jednoho přídavného uhlohydrátového místa. Při jednom provedení se zkonstruuje analog fúzí 28 karboxy-terminálních aminokyselin humánního chorionického gonadotropinu (HCG) k argininovému zbytku v poloze 166 humánního erythropoietinu. HCG karboxy-terminální fragment obsahuje čtyři místa pro O-glykosylaci (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254,7 907(1979)).

V tabulkách 3, 4 a 5 jsou uvedeny analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané uhlohydrátové řetězce. Tyto analogy obsahují sekvenci Asn-X-Ser/Thr zavedenou substitucí do různých poloh řetězce humánního erythropoietinového polypeptidu, za vzniku N-vazebných míst nebo obsahují zavedené zbytky šeřinu nebo threoninu, za účelem vytvoření O-vazebných míst.

-7CZ 291342 B6

V tabulce 6 jsou uvedeny analogy, umožňujícím zavedení přinejmenším jednoho přídavného N-vázaného nebo jednoho přídavného O-vázaného uhlohydrátového řetězce nebo zavedení přídavného N-vázaného a O-vázaného řetězce současně, jak je to dokumentováno migrací těchto glykoproteinů na SDS gelech (příklad 7). Jak je zřejmé z tabulek 3 a 6, analogy obsahující jedno nebo více přídavných míst pro připojení uhlohydrátu nemusí nutně vést ke vzniku molekul erythropoietinu obsahujících přídavné uhlohydrátové řetězce. Tak například zavedení threoninové substituce do polohy 123 a 125 má za následek připojení O-vázaného uhlohydrátového řetězce, zatímco zavedení serinové nebo threoninové substituce do jiných poloh nevede k získání analogů s přídavnými O-vázanými řetězci (viz tabulka 4). Zavedení asparaginových substitucí do poloh 30, 51,57,69,88,89,136 a 138 do sekvence humánního erythropoietinu se však projeví zavedením N-vázaného řetězce v těchto polohách. Fúze HCG polypeptidového fragmentu sargininovým zbytkem v poloze 166 humánního erythropoietinu vede ke vzniku fúzované molekuly erythropoietin-HCG obsahující přinejmenším dva přídavné O-vázané uhlohydrátová řetězce.

Analogy erythropoietinu podle vynálezu zahrnují též erythropoietin, jehož sekvence aminokyselin obsahuje přesmyk alespoň jednoho glykosylačního místa. Pod označením „přesmyk glykosylačního místa“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí delece jednoho nebo více glykosylačních míst v humánním erythropoietinu a zavedení jednoho nebo více nepřirozených glykosylačních míst. Jako příklady takových přesmyků je možno uvést analogy Rl, R2 a R3, které byly sestrojeny deleci N-vazebných míst v polohách 23 (Rl), 38 (R2) nebo 83 (R3) a zavedením N-vazebného místa do polohy 88. Jsou však možné i další četné typy přesmyků uhlohydrátových míst a vzniklé analogy mohou nebo nemusí mít vyšší počet glykosylačních míst ve srovnání s humánním erythropoietinem.

Analogy Rl, R2 a R3 byly analyzovány na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 7. Zavedení N-vázaného řetězce v poloze Asn88 vrátí biologickou účinnost erythropoietinu, z něhož bylo deleci vypuštěno kterékoliv za tří přirozených N-vazebných míst. Tyto výsledky ukazují, že polohy uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu se mohou měnit za účelem získání užitečných analogů, aniž by se podstatně ovlivnila jejich biologická účinnost.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také sekvence DNA kódující analogy erythropoietinu obsahující přídavná místa pro N-vázané a/nebo O-vázané řetězce, analogy obsahující přesmyk alespoň jednoho místa připojení pro uhlohydrátový řetězec a analogy obsahující jednu nebo více aminokyselin prodlužujících karboxylový konec erythropoietinu. Postupy, kterých se používá pro zavádění změn o sekvence DNA kódující humánní erythropoietin za účelem vytvoření nebo změnu vazebných míst pro uhlohydrátové řetězce jsou uvedeny v příkladu 6.

Tyto analogy erythropoietinu mohou být produktem exprese exogenní sekvence DNA, tj. sekvence DNA vytvořené technologií rekombinance DNA nebo se může jednat o syntetické produkty. Exogenní sekvence DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA nebo chemicky syntetizovanou DNA kódující analog erythropoietinu.

Do rozsahu vynálezu spadají také rekombinantní DNA plazmidy a eukaryontní hostitelské buňky, které jsou užitečné pro expresi takových analogů. Expresní vektory zahrnují jakékoliv vektory, které jsou schopny exprimovat klonované sekvence DNA v eukaryotní hostitelské buňce, zejména vektory používané pro expresi v buňkách COS a CHO. Jako příklady takových vektorů je možno uvést plazmidy pEC a pDECdelta popsané v příkladu 6 dále. Kultivace hostitelských buněk COS a CHO exprimujících analogy erythropoietinu se provádí za použití postupů, které jsou odborníkům v tomto oboru známy.

Izolované izoformy a směsi izoforem odvozené od analogů erythropoietinu se získají výše popsanými metodami pro výrobu izoforem humánního erythropoietinu. Tyto metody mohou zahrnovat izoelektrickou fokusaci, ionexovou chromatografii a chromatofokusaci. Pro výrobu

-8CZ 291342 B6 jednotlivých izoforem a směsí izoforem analogů erythropoietinu se přednostně používá ionexové chromatografie.

Zvýšením počtu uhlohydrátových řetězců v erythropoietinu, a tedy zvýšením počtu zbytků kyseliny sialové, vztaženého na molekulu erythropoietinu, se mohou výsledným produktům dodat výhodné vlastnosti, jako je zvýšená rozpustnost, vyšší odolnost vůči proteolýze, snížená imunogenicita, zvýšený poločas životnosti v séru a zvýšená biologická účinnost.

Média zpracovaná buňkami CHO exprimujícími analogy erythropoietinu byla analyzována na biologickou účinnost in vivo a zjištěné výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Několik z těchto zkoušených analogů vykazuje účinnost, která je třikrát nebo vícekrát vyšší než účinnosti humánního erythropoietinu. Zejména analogy obsahující přídavný N-vázaný uhlohydráto\ý řetězec v některé z poloh 30 nebo 88 vykazují dvojnásobně až trojnásobně vyšší účinnost než humánní erythropoietin, zatímco analogy obsahující přídavné O-vázané řetězce díky fúzi humánního erythropoietinu s fragmentem HCG polypeptidu vykazují přinejmenším dvakrát vyšší účinnost.

Dva analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce byly purifikovány a byly izolovány směsi s různým obsahem kyseliny sialové (příklad 8). Analogy' Thr¹²’ a Ser Asn Thr (EPO NI4) byly rozděleny do tří separátních frakcí izoforem a byla stanovena biologická účinnost každé z těchto frakcí. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 8 ukazují, že izoformové frakce EPO N14 s vyšším obsahem kyseliny sialové vykazují vyšší účinnost in vivo.

Frakce izoforem s vyšším obsahem kyseliny sialové analogu EPON14 a rekombinantní humánní erythropoietin (izoformy 9 až 14) byly studovány za použití zkoušky vazby kreceptoru, farmakokinetických pokusů a pokusů zaměřených na stanovení zvýšení hematokritu u myší. Výsledky těchto zkoušek ukazují, že existuje přímý vztah mezi obsahem kyseliny sialové, poločasem životnosti a schopností zvýšit hematokrit ošetřených myší. Jak je zřejmé z obr. 13, 14 a 15, frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 vykazuje podstatně vyšší poločas in vivo a vyvolává vyšší nárůst hematokritu než izolovaná izoforma 14 nebo rekombinantní humánní erythropoietin přestože se frakce izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové z EPO N14 neváže k receptoru tak silně.

Předmětem vynálezu jsou také savčí hostitelské buňky [například buňky z ovarií čínského křečka (CHO)], které přednostně syntetizují izoformy humánního erythropoietinu nebo analogů erythropoietinu obsahující vyšší počet zbytků kyseliny sialové v molekule, než je počet specifický, například nad 10 zbytků kyseliny sialové v molekule. Molekuly erythropoietinu obsahují N-vázané a O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou omezovat obsah kyseliny sialové v molekule. Tak například tetraantenámí (se čtyřmi rozvětveními) N-vázané oligosacharidy nejčastěji poskytují čtyři možná místa pro připojení kyseliny sialové, zatímco biantenámí a triantenámí oligosacharidové řetězce, kterými může být nahrazena tetraantenámí forma na asparaginových vazebných místech, obvykle obsahují nejvýše pouze 2 nebo 3 připojené zbytky kyseliny sialové. O-vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení kyseliny sialové. Molekuly erythropoietinu tedy mohou přijmout celkem 14 zbytků kyseliny sialové, za předpokladu, že jsou všechny tři N-vázané oligosacharidy tetraantenámí. Kultury savčích buněk se podrobí screeningu na buňky, které přednostně zavádějí tetraantenámí řetězce do rekombinantního erythropoietinu, což má za následek maximalizaci počtu míst pro připojení zbytků kyseliny sialové.

N-vázané oligosacharidy erythropoietinu izolovaného z moči obsahující kyselinu sialovou jak s vazbou a 2,3, tak s vazbou a 2,6 ke galaktóze (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3 657 (1988)). Kyselina sialová s vazbou a 2,3 se obvykle aduje na galaktózu na mannosové větvi a 1,6 a kyselina sialová s vazbou a 2,6 se aduje na galaktózu na mannosové větvi a 1,3. Pro zavádění kyseliny sialové do mannosové a 1,6 a mannosové a 1,3 větve jsou nejúčinnější

-9CZ 291342 B6 enzymy schopné vyvolávat adici sialové kyseliny (β-galaktosid a 2,3 sialyltransferáza a βgalaktosid a 2,6 sialyltransferáza).

Pro produkci rekombinantních glykoproteinů, včetně rekombinatního erythropoietinu, se jako hostitelských buněk obvykle používá buněk z ovarií čínského křečka (CHO), které jsou deficientní na dihydrofolát reduktázu (DHFR). Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a 2,6 sialyltransferasu, a proto neadují kyselinu sialovou s vazbou a 2,6 kN-vázaným oligosacharidům glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Tekeuchi et al.. J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). V důsledku toho rekombinantní erythropoietin produkovaný v buňkách CHO neobsahuje kyselinu sialovou s vazbou 2,6 ke galaktóze (Sasaki et al. (1987), výše uvedená citace; Takeuchi et al. (1987) výše uvedená citace)).

V dalším provedení tohoto vynálezu se humánní erythropoietin nebo analog erythropoietinu produkuje v buňkách CHO, které jsou transfekovány funkčním genem β-galaktosid a 2,6 sialyltransferázy, za účelem zavedení kyseliny sialové do galaktózy s vazbou a 2,6. Výsledné izoformy budou obsahovat kyselinu sialovou vázanou ke galaktóze jak vazbou a 2,3, tak vazbou a 2,6. Popis technik, kterými se vytvářejí modifikované buňky CHO nebo jiné hostitelské savčí buňky je uveden v Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13 848 (1989).

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství specifické izoformy nebo směsi izoforem v kombinaci s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem užitečným při léčbě erythropoietinem. Do rozsahu vynálezu spadají též farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu spolu s vhodným ředidlem, pomocnou látkou a/nebo nosičem. Pod označením „terapeuticky účinné množství, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí množství, s nímž se za daných podmínek a při daném režimu podávání dosáhne terapeutického účinku. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají parenterální cestou. Izoformy humánního erythropoietinu nebo analogy erythropoietinu se přednostně podávají ve formě prostředku obsahujícího vhodný nosič, jako je humánní sérový albumin, vhodné ředidlo, jako je pufrovaný roztok chloridu sodného a/nebo vhodný adjuvans. Za požadovanou dávku bude považována dávka postačující pro zvýšení hematokritu léčených pacientů. Tato dávka se bude měnit v závislosti na závažnosti léčené choroby, použitém způsobu podávání apod.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter, a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Jako erythropoietinového standardu se při biologických zkouškách in vivo popsaných v příkladech používá rekombinantního erythropoietinového standardu standardizovaného proti částečně purifikovanému erythropoietinovému standardu z moči. Měří se tedy pouze relativní specifická účinnost in vivo. Specifická účinnost in vivo je proto také vyjadřována v ,jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ ajednotkách/A₂8o a nikoliv v jednotkách „IU/ml“, „IU/mg“ a „IU/A₂8o“, poněvadž použitý erythropoietinový standard nebyl přímo korelován s žádným existujícím mezinárodním standardem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace izoforem rekombinantního erythropoietinu

Rekombinantní erythropoietin se vyrobí způsobem popsaným v publikaci Lin, uvedené výše. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí látka pro první a třetí izolaci izoformy se

-10CZ 291342 B6 purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše. Výchozí látka pro druhou a pátou izolaci izoformy se purifikuje způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lai et al., který je modifikován tím, že se použije chromatografíe na Q-Sepharose. Tyto přípravky obsahují směsi izoforem rekombinantního erythropoietinu se stejnou aminokyselinovou sekvencí, jako má humánní erythropoietin získaný z moči a převážně obsahují izoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro čtvrtý preparativní postup pro získaní izoformy představuje materiál eluovaný během promývání sloupce anexu z příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. 5mM kyselinou octovou(lmM glycinem/óM močovinou. Tato frakce obsahuje izoformy s počtem zbytků sialové kyseliny 9 nebo nižším a dále se před použitím na preparativní izoelektrickou fokusaci purifikuje gelovou filtrační chromatografií popsanou v příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. Při šesté přípravě izoformy se jako výchozího materiálu používá purifikovaného rekombinantního erythropoietinu s obsahem 4 až 13 zbytků kyseliny sialové. Tento materiál se purifikuje způsobem popsaným v příkladu 2 publikace Lai et al., uvedené výše, pouze s tím rozdílem, že se modifikuje zpracování ionexového sloupce (eluce rekombinantního erythropoietinu se provádí gradientem chloridu sodného při pH 8,8 a vypustí se promývání kyselinou octovou/močovinou. Při tom se dosáhne retence většiny izoforem obsažených ve výchozím materiálu.

Při šesti různých preparativních postupech pro získání jednotlivých izoforem se použije preparativní izoelektrické fokusace v granulovaném gelovém loži (Ultrodex LKB). Tyto postupy se provádějí v podstatě stejně jako je to uvedeno v poznámce LKB Application Notě 198. Používá se amfolytů Pharmalyte 2.5-5 (Pharmacia a použité gelové lože obsahuje 5M močovinu.

Při první přípravě se přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodném o pH 7,0 nanese na gel a přibližně 16 hodin fokusuje při výkonu 8 W. Po izoelektrické fokusaci se pásy izoforem na gelu vizualizují přetisknutím gelového lože na papír. Získaný otisk se fixuje máčením v fixačním roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% kyselina sulfosalicylová) při celkem třech výměnách fixační lázně, přičemž zpracování v každé lázni se provádí 10 minut při teplotě místnosti, potom se provede jedna výměna za roztok o složení 40% methanol/10% kyselina octová (zpracování se provádí při teplotě 30 až 60 °C po dobu přibližně 10 minut), pásy se 15 minut barví při 60 °C 0,125% roztokem modři Coomassie Blue R-250/4% methanol/10% kyselina octová, načež se provede odbarvení v 7,5% methanolu/10% kyselině octové, aby se zviditelnily oddělené izoformy. Oblast granulovaného gelového lože obsahující izoformy (asi 50% pryskyřice) se odstraní, smíchá s vodou (asi 16 ml) a suspenze se nalije na misku o rozměrech 14x62 cm a odpaří se na čistou hmotnost přibližně 40 g. Vzniklý přípravek se fokusuje podruhé a výše uvedeným způsobem se provede kontaktní otisk gelového lože. 4ást gelu obsahující každou ze 6 rozeznatelných izoforem se z gelového lože odstraní.

Eluce izoforem z gelu se provede přídavkem roztoku obsahujícího lOmM Tris-HCl o pH 7,0/5mM Chaps ke každé izoformě. Každá vzniklá suspenze se uvede do krátké kolony a eluuje pufrem Tris-Chaps. Eluáty se shromáždí a odděleně aplikují na krátké kolony (konfigurace s otevřenou kolonou) obsahující pryskyřici s obrácenou fází Vydac C4 ekvilibrovanou ve 20% ethanolu/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0,35% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a 65% ethanolem/lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Frakce eluovaná 65% ethanolem/lOmM Tris se zředí v poměru 1 : 1 lOmM Tris-HCl o pH 7,0, zkoncentruje a potom se provede výměna pufru (lOmM Tris-HCl o pH 7,0) v mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Analytická izoelektrická fokusace tohoto přípravku se provádí v podstatě způsobem popsaným v poznámce LKB Technical Notě 250 za použití Servalyte 3-5 amfolinů (Serva) na polyakrylamidovém gelu obsahujícím 5M močovinu.

Při druhém preparativním postupu se přibližně 26 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody nanese na gel a fokusuje při 2,5 W po dobu 35 minut a při 10 W po dobu asi 17 hodin. Pásy fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odstraní, a tak se

-11 CZ 291342 B6 získá celkem 11 produktů. Objem každého z těchto produktů se upraví na 7,5 ml deionizovanou vodou a 20 ml každého z výsledných supematantů se podrobí analytické izoelektrické fokusaci popsané výše. Ke každému z produktů se přidá 5 ml 1,5M Tris-HCl o pH 8,8 a každá ze suspenzí se převede do malé kolony a sloupcem se nechá protéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně 3 objemy sloupce 0,5M Tris-HCl o pH 7 a promývací roztok se spojí s eluátem. Spojené eluáty zkoncentrují a provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Zkoncentrované roztoky (přibližně 0,5 ml) se potom nechají projít filtrem z acetátu celulózy s vylučovací mezí 0,22 pm. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že 5 produktů obsahuje převážně vždy jedinou izoformu 10, 11, 12, 13 a 14.

Při třetím preparativním postupu se přibližně 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody nanese na gel a provede se fokusace 25 minut při 2 W, 20 hodin při 10 W a 15 minut při 15 W. Pásy proteinu odpovídající jednotlivým izoformám se zjistí vizuálně a odstraní z gelového lože. K izoformám izolovaným na gelu se přidá destilovaná voda, čímž vznikne suspenze a výsledné supematanty se analyzují analytickou izoelektrickou fokusaci. Ke každé suspenzi se přidá stejný objem 1M Tris-HCl o pH 7,2, suspenze se převedou do separátních krátkých kolon a kapalná fáze se nechá protéci kolonou, aby se eluovaly izoformy. Každý eluát se zkoncentruje, provede se výměna pufru za 20mM citran sodný/lOOmM chlorid sodný o pH 7,0 za použití z ultrafiltračního zařízení pro jedno použití (Amicon) s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton. Pomocí analytické izoelektrické fokusace se zjistí, že byly získány produkty obsahující převážně jednotlivé izoformy 9, 10, 11, 12, 13 a 14.

Při čtvrtém preparativním postupu pro získání izoforem se jako výchozího materiálu použije erythropoietinu obsahujícího izoformy 3 až 9 (vyrobeného výše popsaným způsobem). Před preparativním izoelektrickou fokusaci, která se provádí v podstatě způsobem popsaným v souvislosti s preparativními postupy 1 až 3, se amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionují v izoelektrické fokusační cele s kapalnou fází Rotofor (Bio-Rad, Richmond, Kalifornie, USA), aby se získalo amfolytové rozmezí vhodnější pro nižší izoelektrické body výchozího materiálu. Prefakcionace se provádí tak, že se 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5 smíchá s 15 g močoviny a objemem směsi se purifikovanou vodou doplní na 50 ml. Vzniklá směs se frakcionuje v zařízení Rotofor při 10 W, teplotě 1 °C po dobu 5,5 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné, jako anolytu a 0,1 M hydroxidu sodného, jako katolytu. Amfolytové frakce s naměřenými hodnotami v rozmezí od 4,5 do asi 6 se použijí na izoelektrickou fokusaci v plochém loži.

Amfolyty se odstraní z izoforem za použití zařízení Centrieluter (Amicon, Danvers, Massachuttses, USA) a za použití zařízení Centricon s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 dalton (Amicon). přitom se pracuje za těchto podmínek: 0,18 Tris-pufr o pH 8,8, 100 V, 25 až 30 mA, 3hodiny. U izoforem se provede výměna pufru (0,lM chlorid sodný) pomocí gelové filtrace za použití náplně Sepkadex G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusace 5 výsledných produktů ukazuje, že tyto produkty obsahují izoformy 4, 5,6, 7 a 8. Izoforma 4 přechází ve formě několika pásů, což ukazuje, že u ní mohla proběhnout v určitém rozsahu degradace.

Pátý preparativní postup pro získání izoforem se modifikuje zařazením prefokusačního stupně do izoelektrikého fokusačního postupu na plochém loži. Při této modifikaci se protein nepřidá ke směsi amfolytu, močoviny a gelu před elektroforézou, ale zavede se do izoelektrického fokusačního zařízení po vytvoření gradientu pH vgelovém loži. Po provedení prefokusace (75 minut, 1 500 Volt-hodin) se úsek gelového lože v rozmezí od 2,25 do 4,25 cm od katody vyjme, smíchá s roztokem erythropoietinu a vrátí zpět do gelového lože. Po izoelektrické fokusaci se z gelového lože izolují izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 a oddělí se od amfolytů ultrafiltraci za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).

Modifikace prefokusací se provádí z toho důvodu, aby se charakteristiky ultrafialové absorbance izoformových přípravků připodobnily charakteristikám výchozího rekombinantního erythro

-12CZ 291342 B6 poietinu. Toto zlepšení spektrálních charakteristik je zřejmé z poměru absorbance izolovaných izoforem při 280 a 260 nm. Průměrný poměr absorbance při 280 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) u izoforem z preparativních postupů 2 a 3 (bez prefokusace) se 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A₂8o/A₂6o u preparativních postupů 5 a 6 (s prefokusací) je 1,68 ± 0,20. Když se z výpočtu vyloučí izoforma č. 14, dosáhne se průměrného poměru A₂8o/A₂6o v případě preparativních postupů 2 a 3 hodiny 1,39 ± 0,11 a v případě preparativních postupů 5 a 6hodnoty 1,74 ±0,09 (izoforma 14 má možná nejvíce atypické spektrum, poněvadž je přítomna v nejmenším množství a je tedy náchylnější k interferencím stopovými nečistotami složek amfolytu nebo z toho důvodu, že je nejblíže elektrodě v průběhu izoelektrické fokusace na plochém loži). Průměrná hodnota poměru A₂8o/A₂₆o pro rekombinantní erythropoietin vyrobený podle příkladu 2 výše uvedené publikace Lai et al. (za použití modifikace popsané výše, která spočívá v tom, že se jako anoxové pryskyřice použije O-Sepharose) je 1,91 ± 0,04.

Jak již bylo uvedeno výše, výchozím materiálem pro šestý preparativní postup pro výrobu izoforem je rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující izoformy 4 až 13. Amfolyty se prefokusují v zařízení Rotofor, tak jako v případě čtvrtého přípravku. Frakce amfolytu s naměřenými hodnotami pH v rozmezí 3,7 až 4,8 se podrobí izoelektrické fokusaci na plochém loži. Ploché lože se prefokusuje tak, jako v případě pátého preparativního postupu a po ultrafiltraci (Centricon 10) pro odstranění nosičových amfolytů se získají izoformy č. 9,10,11,12 a 13.

Příklad 2

Obsah kyseliny sialové v izoformách rekombinantního erythropoietinu

U izoforem izolovaných způsobem popsaným v příkladu 1 a eiythropoietinu puntíkovaného způsoby popsanými ve výše uvedené publikaci Lai et al. (směs izoforem 9 a 14) se provede výměna pufru za použití 0,10 až 0,15M chloridu sodného a provede se analýza na obsah kyseliny sialové za použití modifikovaného postupu popsaného v Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky kyseliny sialové se odštěpí od glykoproteinů hydrolýzou pomocí 0,35M kyseliny sírové (80 °C, 30 minut) a vzniklé roztoky se neutralizují před analýzou hydroxidem sodným. Za účelem odhadu množství přítomného erythropoientinového proteinu se provede Bradfordovo stanovení proteinů (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976) za použití rekombinantního erythropoietinu s aminokyselinovou sekvencí humánního erythropoietinu, jako standardu. Použije se zkouškových činidel a mikrometody Bio-Rad. Výsledky vyjádřené v mol kyseliny sialové na mol erythropoietinu jsou zřejmé z tabulky 1. Izoformy se označí podle počtu zbytků sialové kyseliny v molekule a vykazují rozmezí od nejméně kyselých (izoforma 9) do nejkyselejších (izoforma 13). Izoformy 9 až 13 jsou přítomny vgelových drahách 6 až 10 (viz obr. 1). Množství izoformy 14 není dostatečné pro přesné změření obsahu kyseliny sialové. Obsah kyseliny sialové v této izoformě se dedukuje na základě migrace této izoformy na IEF gelech vzhledem k ostatním izoformám. Obsah kyseliny sialové v izoformách 5 až 8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, ale podobně se dedukuje na základě migrace na IEF gelech.

Tabulka 1

Izoforma erythropoietinu	Obsah kyseliny sialové [mol/mol erythropoietinu]
izoforma 13 izoforma 12 izoforma 11 izoforma 10 izoforma 9 směs izoforem (9 až 14)	12,9 ±0,5 11,8 ±0,2 11,0 ±0,2 9.8 ± 0,3 8.9 ± 0,6 11,3 ±0,2

- 13CZ 291342 B6

Příklad 3

Účinnost izoforem rekombinantního erythropoietinu

Izoformy izolované způsobem popsaným v příkladu 1 se zkoušejí postupem využívajícím absorbanci při 280 nm, Bradfordovým proteinů a metodou RIA pro erythropoietin, aby se zjistilo množství přítomného rekombinantního eiythropoietinu. Pro stanovení relativní biologické účinnosti in vivo se použije exhypoxického polycytohemického biostanovení a myších (Cotes etal., Nátuře, 191, 1 065 (1961)). Při kvantitativním stanovení množství přítomného erythropoietinového proteinu za použití radioimunoeseje pro erythropoietin se u některých izoforem naměří vyšší relativní specifické účinnosti in vivo v důsledku zjevně snížení imunoreativity imunoforem obsahujících velké množství kyseliny sialové, což vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu, a tedy nadhodnocení relativní specifické účinnosti in vivo u většiny negativních izoforem. Výsledky biostanovení na myších, vyjádřené v jednotkách/ml, se dělí odpovídajícími koncentracemi proteinu, přičemž se získají specifické účinnosti polypeptidu. Hodnoty specifické účinnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

V tabulce 2 znamená index „n“ počet nezávislých izoformových přípravků jejichž výsledky přispívají k výsledné hodnotě specifické účinnosti. Ve většině případů bylo s každým izoformovým přípravkem provedeno několik stanovení in vivo. Stejná data in vivo přispívají k výpočtům specifické účinnosti ve všech tří sloupcích. Obsah erythropoietinového polypeptidu v jednotkách/mg se stanoví na základě absorbance při 280 nm, na základě potence při radioimunoeseji nebo z výsledků Bradfordova stanovení proteinu. Jako standardu pro Bradfordovo stanovení proteinů se používá purifíkovaného rekombinantního erythropoietinu obsahujícího izoformy 9 až 14. Hodnota indexu „n“ může být u výpočtů pořízených za použití dat z Bradfordova stanovení proteinů nižší, poněvadž některé přípravky již v době provádění Bradfordova stanovení nebyly k dispozici.

Jako standardu pro radioimunoeseje a pro stanovení in vivo se používá erythropoietinu purifíkovaného způsoby popsanými v Lai et al. (výše uvedená publikace), který obsahuje směs izoforem 9 až 14.

Hodnoty relativní specifické účinnosti, které jsou vyjádřeny v jednotkách/mg (U/mg) erythropoietinového polypeptidu, je možno provést na jednotky/A₂₈₀ vynásobením hodnotou 0,807 mg erythropoietinového polypeptidu/A₂₈o. Tento převodní faktor se získá vynásobením extrikčního koeficientu pro erythropoietin (1,345 mg/A₂₈o) obsahem proteinu v eiythropoietinovém glykoproteinu (přibližně 60 % hmotnostních, Davis et al., Biochemistry, 26, 2 633 (1987)) a tím se získá hodnota v mg erythropoietinového polypeptidu/A₂₈₀ (tj. 1,345 mg eiythropoietinu/A₂₈o x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A₂₈₀). Kromě toho je možno hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového polypeptidu vynásobit faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu, a tím se získají hodnoty specifické účinnosti vyjádřené v jednotkách/mg erythropoietinového glykoproteinu.

-14CZ 291342 B6

β	04	m	m	^s·	m	04	rH	r4	r—<
>*s	O	o	o	o	o	O
bfl	o	o	o	o	o	O
p O	cn	OJ	kO	0·	ve	ve	o	o	o
					o	o	o
>_? t—4 O Pí >*4	m	o	04	04	r-f	cn	tn		ve
tn	<β·	V	kO	m	tn	m	in	r-4
XD Ό Ό *»h rtt
•H	44	44	44	44	44	44	44	44
•W r-H	o	O	O	o	o	o
	o	o	o	o	o	o	o	o	o
β) -CJ N	Γ»	Ol	r*	<r	cn	ve	o o	O co	o LQ
£ a	k0	Γ-	o-	rH	rH	cn		04	m
0 c	ta	m	co	m	o-	fH	r-4
Ph O	m	rn	Ol	04		rH	kO	xr	t“H

IX) LQ V r> CM

r-4

a £>

Λ

o	o	o	O	o
o	o	o	O	o	O
r·	tn	o-	tn	tn	o	o	o	o
					Ο-	o	o	o
r*	<n	τ-<	t-			rH	cn	cn
cn	LQ	v	ve	r>	νο
					a·		ve	t-t
-H	44	44	44	44	+4	44	44	+4
o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o	o	o
CD		v	co	m	o	o	o	o
					ve	ve	m	m
io	co	co	IQ	o
o	m	LQ	m	o-	ve	o	o	CD
OJ	04	Ol	Ol	<-4	cn	o-	m	r~1

oj «· ί· rn »-·

	o	o	o
O	o	o	o	O
o	ve	ve	i—I	O
»-H	o	LQ	r-l	cn
cn	<n	rn	>«·	rM
44	44	44	44	44
o	o	o	o	O
o	o	o	o	o
M-	ve	Ol	r-	o
σ»	r-	tn	Ol	CD
m	o	r-	co	00
Ol	cn	Ol	04	H

o o o o o o co co Γ* m in th •Η 44 44 o o o o 04 o)

ΙΟ VD

V0 sr

600

V	cn	CM	r-i	o o co r- to
«-Ι	rM	rH	r4	H

- 15CZ 291342 B6

Data uvedená v tabulce 2 jsou také zpracována graficky na obr. 2A, 2B a 2C. Tato data ukazují, že relativní účinnost erythropoietinu in vivo stoupá v závislosti na obsahu kyseliny sialové až do izoformy č. 111. Izoformy 11 až 14 vykazují v podstatě stejnou relativní biologickou účinnost invivo (to je nejzjevnější, když se koncentrace izoformy 14 vyjádří za použití hodnoty z Bradfordova stanovení. Bradfordova hodnota může být pro izoformu 14 přesnější s ohledem na obecně nízkou dosaženou koncentraci a v důsledku toho na obtížnost stanovení A_2S0 a nejzjevněji sníženou reaktivitu při RIA u velmi negativních forem, viz \ýše uvedená diskuse). Vyšší relativní specifická účinnost in vivo izoforem erythropoietinu s větším množstvím sialové kyseliny je nej pravděpodobněji způsobena delším poločasem životnosti těchto forem v oběhu. Izoformy 9 a 13 byly označeny radioaktivním jódem ('T) a byla změřena jejich rychlost clearance u krysy. Poločas životnosti v oběhu je v případě izoformy 13 podstatně delší než v případě izoformy 9.

Příklad 4

Selekce směsí izoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografií na Q-Sepharose

Média zpracovaná buňkami produkujícími rekombinantní erythropoietin (získaná postupy popsanými ve výše uvedené publikaci Lín) se zkoncentrují a diafíltrují proti lOmM Tris opH7,2. Koncentrace proteinus e stanoví Bradfordovým proteinovým mikrostanovením za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. K 19,6 ml roztoku obsahujícímu 40 mg celkového proteinu se přidá síran měďnatý do koncentrace 20μΜ, roztok se přefiltruje přes filtr s vylučovací mezí 0,45 pm a nanese na sloupec (1,05 cm-výška; 2,2 cm-průměr) obsahující 4ml lože náplně O Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrované s lOmM Tris o pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po nanesení vzorku se sloupec promyje dvěma objemy sloupce stejného pufru. Průtok sloupcem je přibližně 1 ml/min. Při tomto postupu se pro selekci definovaných směsí izoforem erythropoietinu použije 6 oddělených kolon.

Kolony se promyjí 6 až 9 objemy sloupce pufr s nízkým pH, který se v případě kolony 1 skládá z 150 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 2 z 200 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 4 z 300 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny, přičemž pH je hydroxidem sodným nastaveno na 4,7; v případě kolony 5 z 150 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny a v případě kolony 6 z 300 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ síranu měďnatého a 6M močoviny. Hodnota pH v kolonách se zvýší na asi pH 7 promytím každé kolony 8 až 11 objemy sloupce 10 mM Tris-HCl, 55 mM chloridu sodného, 20 μΜ síranu měďnatého o pH 7. Definované směsi izoforem erythropoietinu se eluují ze sloupců promytím 10 mM Tris-HCl, 140 mM chloridem sodným a 20 μΜ síranem měďnatým o pH 7,0.

Eluované izoformové produkty z každé kolony se zkoncentrují a rozpouštědlo se vymění za vodu za použití mikrokoncentrátoru Centricon-10 (Amicon). Výsledky analytické izoelektrické fokusace těchto zkoncentrovaných produktů jsou uvedeny na obr. 3. V gelových drahách 1 až 6 jsou v uvedeném pořadí obsaženy definované směsi izoforem erythropoietinu eluované ze sloupců 1 až 6. Směs izoforem obsažená v gelové dráze u levého okraje obr. 3 představuje buněčné médium aplikované na sloupec Q-Sepharose popsaný výše, přičemž sloupec je promyt 5mM kyselinou octovou, lmM glycinem, 20μΜ síranem měďnatým, 6M močovinou a směs izoforem erythropoietinu je eluována ze sloupce za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs izoforem se dále purifikuje způsoby popsanými ve výše citované publikaci Lai et al. před prováděním analytické izoelektrické fokusace.

-16CZ 291342 B6

Příklad 5

Frakcionace izoforem rekombinantního erythropoietinu za použití gradientu s nízkou hodnotou pH na Q-Sepharose

Při dalším postupu se izoformy erythropoietinu dělí za použití gradientu s klesající hodnotou pH a stoupající iontovou silou. Koncentrované diafiltrované médium obsahující erythropoietin se nanese na sloupec Q-Sepharose v přibližném poměru 40 mg celkového proteinu na ml gelu. Potom se sloupec promyje přibližně 2 objemy sloupce lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a následně přibližně 10 objemy sloupce 2mM kyseliny octové/lmM glycinu/20pM síranu měd’natého/6M močoviny (o pH přibližně 4,8), aby se odstranily kontaminační proteiny a izoformy erythropoietinu obsahující méně než 7 zbytků ky seliny sialové. Izoformy obsahující přibližně 8 až 12 zbytků kyseliny sialové se eluují ze sloupce za použití gradientu od přibližně 2mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatého do 40mM kyseliny octové v 6M močovině/lmM glycinu/20pM síranu měďnatém (o pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů sloupce a sbírají se frakce o přibližném objemu jednoho sloupce do nádob obsahujícím Tris pufr v objemu postačujícím pro úpravu pH na hodnotu v rozmezí od 6 do 8,5, aby se zabránilo dlouhodobé expozici zachycených frakcí nízké hodnotě pH. Dělení se monitoruje analytickou izoelektrickou fokusací alikvotních vzorků frakcí. Na obr. 4 je znázorněno dělení izoforem 8 až 11, které lze tímto postupem provést. Izoformy 12 až 14, které zůstanou po skončení gradientově eluce vázány ke sloupci, se eluují promytím pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 140mM chlorid sodný a 20mM síran měďnatý (o pH 7,0). Izoformy (oddělené gradientovou elucí nebo eluované roztokem chloridu sodného) se zbaví kontaminačních proteinů chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií na obrácených fázích a následnou gelovou chromatografií (viz příklad 2 výše uvedené publikace Lai et al.).

Příklad 6

Konstrukce analogů humánního erythropoietinu

Existující místa připojení uhlohydrátových zbytků v aminokyselinové sekvenci humánního erythropoietinu jsou uvedena na obr. 5 (SEQ ID. NO: 26). Postupy, kterými se vytvářejí přídavná glykosylační místa v erythropoietinu, jsou souhrnně uvedeny na obr. 6A až 6C a jsou popsány dále.

-17CZ 291342 B6

Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.

[Asn*, Ser^J EPO: 5’ CGCCCACCAAAQCTCAQQTGTGACAGCCGA 3' (SEQ ID NO: 1) (AsnS, Ser¹¹] EPO: 5’ ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' (SEQ ID. NO: 2) [Asn69] EPO: 5' GGGCCTGGCCAAQCTGTCGGAAG 3' (SEQ ID. NO: 3) [Asnl24] epo: 5’ TCCCCTCCAGATfiATGCCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 4) [Asn¹²5, Ser¹²7] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCATQ^GCTCCAC 3’ (SEQ ID. NO: 5) [Asn¹^, Ser¹^] £PO: 5' AGGCCTGCAGGAŽZGGGaGSAGATGACCAGGTG 3’ (SEQ ID. NO: 6) [Thr¹²5] EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3’ (SEQ ID. NO: 7) [Pro¹²*, Thr¹²5] EPO: 5’ CCTCCAGATCCG&CCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 8)

Podtržené kodony ukazují párované oblasti, v nichž aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují aminokyseliny divokého typu.

Produkt [Asn⁴, Ser⁶]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N—glykosylačního místa do Asn 4. Produkt [Asn⁹, Serⁿ]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 9. produkt [Asn⁶⁹]EPO se zkonstruuje za účelem zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 69. Produkt [Asn¹²⁵, Ser^{1 7}]EPO se zkonstruuje za účelem 10 zavedení přídavného N-glykosylačního místa do Asn 125. Produkty [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr125.

-18CZ 291342 B6

Pro použití při in vitro mutagenezi se syntetizují následující oligonukleotidové primery.

[Asn69, Thr71] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGC.TGTC. 3’ (SEQ ID. NO: 9) [Ser^⁸, Asn69, Thr⁷¹] EPO:

5’ CAGGGCCTGIQCAňQCTGaCAGAAGCTGTC 3' (SEQ ID. NO: 10) [Asnl25, Thr!27] EPO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' (SEQ ID. NO: 11) [Asnl25, Thr 127, Thr 131] EPO:

'ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' (SEQ ID. NO: 12) [Prol24, Asnl25, Serl27] EPO:

5' CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3' (SEQ ID. NO: 13) [Prol24, Asnl25, Tiirl27] EPO:

5’ CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3’ (SEQ ID. NO: 14) [Thrl25, Thrl26] EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3’ (SEQ ID. NO: 15) [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹]EPO

Pomocí [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO cDNA, jako výchozí látky se oligonukleotidový primer 5-AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3'(SEQ ID. NO: 16) převede na [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶]EPO. Oligonukleotidového primerů 5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' (SEQ ID. NO: 17) se potom použije pro vytvoření [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹]EPO se potom použije pro vytvoření [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹]EPO.

Produkty [Asn⁶⁹, Thr⁷¹]EPO a [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 69 a pro zvýšení stupně N-glykosylace v tomto místě. Produkty [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹]EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO a [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO se zkonstruují za účelem zavedení N-glykosylačního místa do Asn 125 a pro zvýšení 15 stupně glykosylace v tomto místě. Produkty [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹]EPO se zkonstruují za účelem zavedení přídavného O-glykosylačního místa do Thr¹²⁵ a za účelem zvýšení glykosylace v tomto místě.

-19CZ 291342 B6

Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenezi je plazmid Hul3, což je klon humánní erythropoietinové cDNA vpUC8 (Law et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 83, 6 920 (1986)). Plazmidová DNA získaná z Hul3 se štěpí restrikčními enzymy BstEII a BglII, vzniklé fragmenty DNA se podrobí elektrofotoréze na Agarózovém gelu a fragment erythropoietinové DNA o délce 810 bázových párů (bp) se izoluje z gelu za použití soupravy GeneClean^(R) a postupů poskytnutých výrobcem (BIO 101, lne.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje genomový gen erythropoietinu, jakožto fragment BamHI vložený do derivátu pBR322 (použitý způsob je popsán ve výše citovaném patentu, původce Lin). pBRgHuEPO se také štěpí BstEII a BglII a izoluje se vektorový fragment o délce 6 517 bp. Ligací těchto dvou fragmentů se získá IGT1. Při konstrukci pEC-1 se pDSVL (který je popsán ve výše uvedeném Línově patentu a který je znázorněn na obr. 5B) štěpí BamHI a liguje se do něj izolovaný 2,8kb fragment BamHI z IGT1 obsahující erythropoietinovou cDNA.

Pro vytvoření jednořetězcové DNA pro in vitro mutagenezi se pEC-1 štěpí BamHI a BglII a izoluje se 820pb fragment erythropoietinové cDNA. Tento fragment se liguje do místa BamHI ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA se získá ze supematantů E. coli kmene RZI032, který byl infikován ml3-EC-l způsobem popsaným vKunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol 101, 20 (1983). Pro in vitro mutagenezi se přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše smíchá se 6 μΐ pufru (250mM Tris o pH 7,8, 50mM chlorid hořečnatý a 50mM dithiothreitol). Teplotní hybridizace primeru ktemplátu se provede tak, že se reakční objem doplní vodou do 10 μΐ, směs se 5 minut zahřívá na 65 °C a potom se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Prodlužovací reakce se provede přídavkem vždy 2,5 μΐ dTTP, dATP, dGTP, dCTP a ATP (vždy o koncentraci 10μΜ) a následným přídavkem 1 μΐ (1 jednotky) E. coli DNA polymerázy (Klenowův fragment) a 1 μΐ (1 jednotky) T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje přes noc při 14 °C a použije sejí pro transformaci E. coli kmene JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 (1985)) způsobem popsaným ve výše uvedené Messingově publikaci.

Pro identifikaci mutantních klonů deferenciální hybridizací se plaky na živném agaru přenesou na filtry Gene Screen (New England Nuclear). Filtry se usuší pod infralampou a potom jednu hodinu inkubují v 6x SSC s obsahem 1% SDS při 60 °C. Pro hybridizací se výše uvedený oligonukleotidový primer (8 pmol) označí na konci T4 polynukleotid kinázou a gemma ³²P-značeným ATP a inkubuje s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a lOOmg/ml DNA lososího spermatu při 37 °C, za účelem mutace [Asn¹²⁴], při 55 °C,za účelem mutace [Asn⁴, Ser⁶], při 65 °C za účelem mutací [Thr¹²⁵] a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] a při 70 °C za účelem mutací [Asn⁹, Ser¹¹] a [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]. Následující den se filtry třikrát promyjí 6x SSC při teplotě místnosti a provede se autoradiografie. Je-li to zapotřebí, promyjí se filtráty 6x SSC při postupně se zvyšující teplotě, až již není pozorována žádná, nebo je pozorována jen malá hybridizace k plakům se sekvencí erythropoietinové cDNA divokého typu. Klony poskytující pozitivní hybridizační signály za těchto podmínek se identifikují a retransfekují do JMI09, za účelem izolace čistého klonu. Dideoxy-analýza terminace řetězců ukazuje, že jsou přítomny mutace na asparaginový, serinový, threoninový a prolinový zbytek.

Vyvařovací metodou (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)) se z transfekovaných buněk JMI09 získají dvouřetězcové ml3 EC-1 DNA obsahující změny [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]. Tyto DNA se štěpí BstEII a XhoII a izolují se 810bp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 se štěpí BstEII a potom částečně BglII a 5-konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosftasou v lOmM Tris o pH 8 při 60 °C v průběhu 60 minut. Vektorový fragment o délce 7 kb, který neobsahuje 810bp fragment BstEII-BglII, se izoluje a liguje kerythropoietinovým fragmentům popsaným výše. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X je číslo analogu) obsahují DNA kódující analogy erythropoietinu se změněnými aminokyselinovými zbytky v uvedených polohách.

-20CZ 291342 B6

Alternativně se zkonstruuje analog erythropoietinu (pEC34) in vitro metagenesí, při níž se deletují aminokyselinové zbytky 41 až 55. Přitom vznikne menší (775 bp) fragment BstEII-BglII obsahující EPO. Tento fragment se výše uvedeným způsobem vloží do pECl. Za účelem klonování analogů erythropoietinu se pEC34 štěpí BstEII, částečně štěpí BglII, defosforyluje 5 a vektor se izoluje (tento způsob je popsán výše). Vektorový fragment o délce 7 kb se potom liguje k fragmentům erythropoietinu, jak je to popsáno výše. Klonování s pEC34 umožňuje snadné rozlišení mezi rekombinanty a jednoduchým novým uzavřením. Pouhým novým uzavřením vzniká menší fragment BstEII-BglII než jsou analogy, což lze snadno rozlišit na Agarózovém gelu.

Těchto obecných postupů se použije pro konstrukci analogů erythropoietinu, které jsou uvedeny v tabulkách 3, 4 a 5. U každého analogu jsou uvedeny změny sekvence DNA; jinak mají oligonukleotidové primery použité na mutagenezi sekvenci, která je komplementární k humánnímu erythropoietinu.

-21 CZ 291342 B6

Tabulka 3

Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

NI	Asn*Ser6	CGC-4AAC ATC—»AGC
N2	Asn9Ser11	AGC->AAC GTC—»AGC
N3	Asn19Thr21	GCC—»AAC GAG—»ACG
N4	Asn3°Thr32	GCT-4AAT CAC-»ACG
N5	Asn42	CCA—» AAT
N6	Ser42Asn43Thr43	CCA—»TCA GAC—>AAC AAA—»ACA
N7	Ser49	TAT—»TCT
N8	Asn51Thr53	TGG—»AAT AGG—»ACG
N9	Asn57Thr59	GGG—»AAC CAG—»ACG
N10	Asn®9	CTG—>AAC
Nil	Asn69Thr71	CTG—>AAC TCG—»ACA
N12	Ser63Asn69Thr71	Nil plus GCC—»TCC
N13	Asn88Thr90	TGG-4AAT CCC-JACC
NI 4	Ser87Asn88Thr90	N13 plus CCG-žTCG
N15	Ser87Asn88ThrThr92	NI4 plus CAG-4ACG

-22CZ 291342 B6

Tabulka 3 (pokračování)

Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

NI 6	Ser87Asn88Thr9°Alai-62	N14 plus AGG—>GCG
N17	Asn88Ser80	TGG—» AAT CCC—>TCC
NI 8	Val87Asn88Thr90	CCG—>GTG TGG-+AAT CCC—>ACC
NI 9	SerS7Asn88Gly89Thr90	CCG—>TCG TGG—»AAT GAG—»GGG CCC—>ACC
N20	AsnS9lie90Thr91	GAG—»AAC CCC—»ATC CTG—>ACG
N21	Ser87Asn89lle90Thr9i	N20 plus CCG—>TCG
N22	Asnii3Thrii5	GGA-+AAC CAG—»ACG
N23	Asnii8vali2i	GCC—>AAC CCT—>GTT
N24	Asnl2iSeri22Thri23	CCT—>AAT CCA->TCA GAT—»ACT
N25	Asni24	GCG—>AAT
N26	Serl22Asnl24	CCA-»TCA GCG-žAAC
N27	Asnl25Serl27	GCC—AAC GCT—>TCT
N28	Asnl25Thrl27	GCC-+AAC GCT-JACG

-23CZ 291342 B6

Tabulka 3 (pokračováni)

Analogy erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce

nalog číslo	Substituce aminokyselin	Změny v sekvenci
N29	Leu121Seri22Asni25Thri27	N28 plus CCT-+CTT CCA—>TCA
N30	Thri20Glyi22Leui23Asni25Thri27	N28 plus TCC—>ACC CGC-4GGG GAT-žCTC
N31	Asnl26seri28	TCA—>AAT GCT—>TCT
N32	Asnl26Thrl28Vall29	TCA—>AAT GCT—>ACT CCA—>GTA
N33	Leu121Ser122Asni26Thr128val129	N32 plus CCT-1CTT CCA—>TCA
N34	Thri2iGlyi23Seri25Asni26Thri28vali29	N32 plus CCT-4ACG GAT-+GGG GCC—>TCC
N35	Serl29Asnl30	CCA—»AGC CTC-4AAC
N36	Asni32	ACA—)AAC
N37	Asnl34Thrl36	ACT—>AAT GAC—>ACC
N38	Asn!35	GCT-4AAT
N39	Asn136Thr138	GAC—>AAC TTC-»ACC
N40	Asni37ihr139	ACT—>AAT CGC—>ACC
N41	Asnl38Thrl40	TTC-+AAC AAA-4ACA

-24CZ 291342 B6

Analogy

Analog číslo

Tabulka 3 (pokračování) erythropoietinu s místy pro N-vázané uhlohydrátové řetězce

Substituce Změny aminokyselin v sekvenci

N42

N43

N44

N45

N46

N47

N48

Asn¹⁴⁴

Ser¹⁴³Thr¹⁴⁹Val¹⁵⁰

Glyl48Thri⁴9

AsniSS

Asn¹⁶³Ser¹⁶⁵

Asn³⁰Thr³2Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰

GTC—>AAC

TTC—»TCC

CTC—>ACC

CGG-+GTG

TTC-»GGC

CTC—»ACC

CTG—>AAT

ACA—>AAT

N4 a N18

Nil a NI 4

-25CZ 291342 B6

Tabulka 4

Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

01	Ser6	ATC—>AGC
02	Ser7	TGT->TCC
03	Ser8	GAC—>AGC
04	Serll	GTC-9TCT
05	Ser18	GAG—»TCG
06	Ser23	GAG—>TCG
07	Ser29	TGT-*AGC
08	Ser29	TGT—>TCT
09	Ser38	GC.T—>TCT
010	Ser33	TGC—>TCA
011	Ser37	GAG—»TCG
012	Ser<9	TAT—>TCT
013	Ser61	GTA-4TCA
014	Ser63	GTC-4TCC
015	Ser67	CTG-4TCG
016	Ser68	GCC-žTCC
017	Ser70	CTG—>TCG
018	Ser73	GCT—>TCT
019	Ser7«	GTC-»TCT
020	Ser73	CTG->TCG
021	Ser79	GCC—>TCC
022	Ser81	TTG-žTCG
023	Ser86	CAG—>TCG
024	Ser87	CCG-+TCG
025	Ser93	CTG-HCG
026	Ser98	GCC—»TCC
027	Ser	GTC->TCC
028	Seri02	CTT-»TCT
029	Ser183	CGC—»AGT

-26CZ 291342 B6

Tabulka 4 (pokračování)

Analogy erythropoietinu s místy pro o-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

030	Ser105	CTC-4AGC
031	SeriOS	CTT-4TCT
032	Šerm	GCT-+TCT
033	Seriiz	CTG—>TCG
034	Ser**4	GCC-+TCC
035	Ser128	GCT-+TCT
036	Serosa	TCG-+GAG
037	Seriei	TGC-+TCC
038	Pro125Ser*27	GCC—»CCC GCT—>TCT
039	Thr62	GAA—»ACA
040	Thr64	TGG—>ACG
041	Thr65	CAG—>ACG
042	Thr 8 8	TGG—>ACG
043	Thr 9°	CCC—$ACC
044	Thr92	CAG—>ACG
045	ThrlW	AGT-4ACT
046	Thr**8	CGG->ACG
047	Thr**5	CAG—>ACG
048	Thrl23	GAT—>ACT
049	Thr*24	GCG-+ACG
050	Thr*25	GCC—»ACC
051	Thr*25ser*27	GCC—>ACC GCT->TCT
052	Thr*25Thr*26	GCC—»ACA TCA—>ACA
053	Thr126	TCA—»ACC
054	Thr*27	GCT-+ACT
055	Thr130	CTC—>ACC

-27CZ 291342 B6

Tabulka 4 (pokračování)

Analogy erythropoietinu s místy pro O-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo

Substituce aminokyselin

Změny v sekvenci

056	Thri3i	CGA-4ACA
057	Thri36	GAC-+ACC
058	Thr140	AAA—»ACA
059	Pro124Thr125	GCG—>CCG
		GCC-4ACC
060	Pro124Thr125Thr126	059 plus TCA—»ACC
061	Pro124Thr125Thr126Thr13i	060 plus CGA—»ACA
062	HGG C-terminální prodloužení

Tabulka 5

Analogy erythropoietinu s místy pro N- a O-vázané uhlohydrátové řetězce

Analog číslo__________ Substituce aminokyselin__________________Změny v sekvenci

NO1 Ser Asn Thr HCG C-terminální prodloužení N14 a 062

NO2 Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ HCG C-terminální prodloužení N47 a 062

Plazmidy označené pDEC-X (kde X představuje číslo analogu) se zkonstruují insercí erythro10 poietinové cDNA do pDECdelta, který je derivátem plazmidu pDSa2. Expresní vektor pDSa2 je obecně popsán v mezinárodní přihlášce PCT WO90/14363. pDECdelta se získá z pDSa2 následujícím sledem stupňů:

1) Místo HindlII v pDSa2 se deletuje štěpením pDSa2 DNA HindlII, na lepivé konce HindlII se působí E. coli DNA polymerázou (Klenowův fragment) a jednotlivými dNTP a provede se religace vektoru s tupými konci. Získá se plazmid pDSa2deltaH.

-28CZ 291342 B6

2) pDSa2deltaH se rozštěpí Sáli a liguje se k němu syntetický oligonukleotid obsahující sestřižený signál SV40 a Sáli linkerem připojeným k 3'-konci sestřiženého signálu. Syntetický oligonukleotid má následující sekvence (SEQ ID. NO: 18):

’ TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 ’

Výsledným plazmidem je sestřih pDSalIdeltaH.

3) Sestřih pDSadeltaH se štěpí Sáli a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí T4 DNA polymerázou a jednotlivými dNTP. Stejnou metodou se otupí konce 820 ligace k plazmidu. Získá se plazmid pDEC-1.

4) Plazmid pDEC se rozštěpí kpnl a PvuII a jeho konce se otupí tím, že se na lepivé konce působí nukleasou z bobu „Mung“. Plazmid se religuje za účelem delece vyštípnutého fragmentu Kpnl-PvuII, čímž vznikne plazmid pDECdelta.

Plazmidy pDEC-Χ se získají z pDECdelta úplným rozštěpením BstEII a potom částečným rozštěpením BglII. Vektorový fragment neobsahující erythropoietinové kódující sekvence se izoluje a liguje k 810bp fragmentům BstEII-BglII obsahujícím požadovaný plazmid.

Podrobnosti konstrukce některých analogů obsahujících několik aminokyselinových změn jsou popsány dále.

Konstrukce pDEC(N47) a pDEC(N48) pDEC(N47), který obsahuje mutace Asn30 Thr32 Vall87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N18) a pDEC(N4). pDEC(N18) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEC(N4) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N47).

pDEC(N48), který obsahuje mutace Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 a Thr90 se zkonstruuje z pDEC(N14) a pDEC(Nl 1). pDEC(N14) se rozštěpí HindlI a BglII a izoluje se 445bp fragment. pDEC(Nll) se rozštěpí BstEII a HindlII a izoluje se 377bp fragment. Tyto dva fragmenty se ligují do pDECdelta rozštěpeného BstEII a BglII způsobem popsaným výše za vzniku pDEC(N48).

Konstrukce pDEC(062) (fúze HCG-erythropoietin) pDEC (062) se složí zpECI a 107bp Stul—BglII linkeru se syntetické DNA, který obsahuje 28 karboxy-terminálních aminokyselin z humánního chorionického gonatropinu (Ser-Ser-SerSer-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-ThrPro-Ile-Leu-Pro-Gln) (SEQ ID. NO: 25) (Pierce et al. Ann. Rew. Biochem. 50, 465 (1981)). Tento linker má následující sekvenci

-29CZ 291342 B6 ’ CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3' GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG5 ’ CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA (SEQ ID. NO: 19)

3¹ gttcaggtagggctgagggccccgggagcctgtggggctaggagggtgttaczctag (SEQ ID. NO: 20) pECI se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se 610 bp fragment DNA. Tento syntetický linker se fosforyluje ATP a polynukleotidkinázou a liguje s fragmentem pECI do pDECdelta před tím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC(N01) pDEC(NOl) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). pDEC177 se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean^<R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr °. pDEC(062) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC(NO2) pDEC(NO2) se zkonstruuje složením pDEC(062) (HCG-EPO) a pDEC(N47) (Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). pDEC(N47) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean^<R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰. pDEC(062) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 107 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

Konstrukce pDEC(NO16) Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶² pDEC(N16) se zkonstruuje složením pDEC(N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) a pDEC258 (Ala¹⁶²). pDEC258 se zkonstruuje za použití výše popsaných způsobů mutageneze in vitro a v poloze 162 se kodon AGG vymění za kodon GCG. pDEC(N14) se rozštěpí Stul a BglII a pomocí GeneClean^(R) se izoluje 610bp fragment DNA obsahující mutace Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰. pDEC(258) se rozštěpí Stul a BglII a izoluje se fragment o délce 210 bp. Tyto dva fragmenty DNA se ligují do pDECdelta předtím rozštěpeného BstEII a částečně rozštěpeného BglII způsobem popsaným výše.

-30CZ 291342 B6

Konstrukce pDEC(Rl), (R2) a (R3)

Pro odstranění glykosylačních míst zpDEC(N14) se ml3-EPO(N14) obsahující mutace Ser87, Asn88 a Thr90 podrobí in vitro mutagenezi popsané výše za použití následujících primerů

5 ’ GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3 ’	GLN24
(SEQ ID. NO: 21)
5 ’ CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3 ’	GLN38
(SEQ ID. NO: 22)
5 ’ CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3'	GLN83
(SEQ ID. NO: 23)

Výsledné plazmidy se označí pDEC(Rl) (Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰, pDEC(R2) (Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) a pDEC(R3) mutagenezi za použití výše uvedených oligonukleotidových primerů, a získají se tak pEClO (Gin²⁴) a pEC8 (Gin³⁸). pEC9 (Gin⁸³) se zkonstruuje za použití následujícího primeru ' CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3 ’ GLN8 3 (SEQ ID. NO: 24)

Klony cDNA humánního erythropoietinu a analogy odpovídající [Asn⁴, Ser⁶]EPO, [Asn⁹, Serⁿ]EPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁴]EPO, [Asn^,2\ Ser^1Í7]EPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]EPO, [Thr^12:i]EPO a [Pro¹²⁴, Thr^{1 5}]EPO a klony cDNA analogů popsaných v tabulkách 3, 4 a 5 se elektroporací přenesou do buněk COS-1 (ATCC č. CRL-1650). Buňky COS-1 se sklidí z semi-konfluentních misek, promyjí médiem (Dulbeccovo modifikované esenciální médium obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % L-glutaminu/penicilinu/streptomycinu (Irvine Scientifíc) a resuspendují na koncentraci 4 x 10⁵ buněk/ml. Jeden ml buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad). Elektroporace se provádí pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser při kapacitě 25 pF a napětí 1 600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosičové DNA a 2 až 20 pg plazmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporované buňky se přenesou do misek v množství 2 x 10⁶ buněk na misku pro kultivaci tkání o průměru 60 mm s 5 ml média. 2 až 4 hodiny po přenesení do misek se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Médium upravené buňkami se oddělí 3 až 6 dnů po elektroporací.

Příklad 7

Charakterizace analogů erythropoietinu

A. Stanovení adice uhlohydrátu

Objem supematantu obsahující 5 až 21 jednotek z buněk COS tranfekovaných jednotlivými cDNA erythropoietinových analogů popsanými v příkladu 6 se přes noc při teplotě místnosti imunoprecipituje králičí protierythropoietinovou polyklonální protilátkou. 20 až 80 pl 1:1 Protein A-Sepharose v fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) se přidá k imunoprecipitátu a směs se 1 hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Vzorky se odstředí, promyjí PBS a tam, kde je to uvedeno, se peleta zpracuje N-glykanázou, aby se odstranily N-vázané uhlohydrátové řetězce. Vzorky se analyzují elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, provede se přenos na nitrocelulózu a analýza Western popsaná v Bumette et al., Anal.

-31 CZ 291342 B6

Biochem. 112, 195 až 203 (1981) a Elliott et al., Gene 79, 167 až 180 (1989) za použití směsi myších anti-erythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána v Elliott et al. (1989) Bood 74, Supp. 1, A.1228.

Analýza supematantů buněk COS transfekovaných [Asn⁶⁹]EPO cDNA a [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO cDNA ukazuje, že proteiny mají větší velikost než erythropoietin shumánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje na přítomnost přídavného N-vázaného uhlohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů buněk COS transfekovaných cDNA [Thr¹²ⁱ[EPO a cDNA [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO N-glykanázou ukazuje, že proteiny mají větší velikost ve srovnání s erythropoietinem s humánní sekvencí. Tato zvětšená velikost ukazuje, že je přítomen přídavný O-vázaný uhlohydrátový řetězec (obr. 8). Analýza Western blot jiných vybraných analogů je uvedena na obr. 10.

Pro stanovení počtu N-vázaných uhlohydrátových řetězců, které jsou připojen}' k EPO, se provede částečné rozštěpení N-glykanázou. Analogy rHuEPO se exprimují v buňkách CHO a oddělí se zpracované médium neobsahující sérum. Zkumavky obsahují 40 jednotek EPO (objem je nastaven vodou na 15 μΐ). Do každé zkumavky se přidá 10 μΐ 0,5% SDS a vzorky se 3 hodiny vaří. Potom se ke každému vzorku přidají tyto složky: 10,8 μΐ 0,5M fosforečnanu sodného o pH 8,6, 5 μΐ 7,5%Nonidetu P40 a 1,5 μΐ roztoku N-glykanázy (Genzyme) o koncentraci 250 jednotek/ml. Vzorky se inkubují uvedenou dobu při 37 °C. Reakce se zastaví přídavkem vzorkového pufru SDS-PAGE (viz výše) a potom podrobí analýze Western na SDS-PAGE (10% akrylamidu) za použití anti-EPO polyklonální protilátky a anti—králičí soupravy Wectastain^<R) (Vector Laboratories) a 4-chlomaftolu, jako substrátu. Analýza N-vázaných řetězců za použití této metody je pro humánní erythropoietin a analog N14 znázorněna na obr. 11.

B. Stanovení účinnosti analogů erythropoietinu

Provedenou se radioimunoeseje (RIA) způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Egrie et al. Stanovení EIA se provádějí za použití soupravy EIA Clinigen^(R) (Systémy R a D), přičemž se pracuje podle postupů dodaných výrobcem. Biologická účinnost in vivo analogů erythropoietinu se stanovuje na supematantech získaných z buněk CHO exprimujících analog erythropoietinu nebo na purifíkovaném erythropoietinu získaném z média zpracovaného buňkami CHO způsobem popsaným dále za použití exhypoxického polycythemického myšího biologického stanovení (Cotes et al., výše uvedená citace).

Účinnost erythropoietinu in vitro se stanoví zkouškou tvorby erythroidní kolonie, kterou popsali Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83, 309 až 320 (1974); zkouška je modifikována. Mononukleované buňky z buněk humánní kostní dřeně se částečně purifikují na „ficoll-paque cushion“, promyjí se Iscoveho médiem, aby se odstranily ulpělé buňky, a potom se nanesou na misky. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje žádný hovězí sérový albumin. Erythroidní kolonie se zjišťuje po 8 až 10 dnech kultivace.

Analogy erythropoietinu transfekované a exprimované v buňkách COS způsobem popsaným v příkladu 6 se analyzují v surových supematantech buněk COS za použití RIA, ELA a stanovení s tvorbou erythroidní kolonie. Purifikovaný erythropoietin s humánní sekvencí vykazuje in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA stanovenou při výše uvedených zkouškách. Analogy [Asn⁶⁹]EPO, [Thr¹²⁵]EPO a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO vykazují in vitro účinnost, která je srovnatelná s účinností podle RIA a poskytují důkaz, že obsahují přídavné uhlohydrátové řetězce (podle stanovení uvedeného v části A). [Thr¹²⁵]EPO a analogy N4, N11,N14, N16, N18, N47, N48, 062, NO1 a NO2 se dále analyzují tak, že se klon cDNA kódující analog erythropoietinu transfekuje do buněk CHO a supematanty buněk CHO se podrobí stanovení RIA nebo ELA a biologickému stanovení in vivo. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Účinnosti in vivo analogů Rl, R2 a R3 exprimovaných v supematantech buněk CHO jsou uvedeny v tabulce 7.

-32CZ 291342 B6

Tabulka 6

Analogy erythropoietinu obsahující přídavné uhlohydrátové řetězce

Sekvence EPO	N-vázané řetězcea	0-vázané řetězce	Účinnost in vivo RIA nebo EIA
	3C	id	0,8
Asn30rhr32	3 až 4C	n.t.	1,1
Asn51rhr53	4	n.t.	n.t.
Asn57Thr59	4	n.t.	n.t.
Asn 69	4	.. e sniz.mn.	n.t.
Asn^Thr7!	4	n.t.	0,25-0,7
Ser^SAsnSSThr^l	4	n.t.	n.t.
Val87Asn®®Thr90	4C	n.t.	1,8
Ser87Asn88ihr90	3 až 4C	normální	1,0
Ser87Asn88Giy89jhr90	4	n.t.	n.t.
Ser87Asn88Thr90Thr92	4	snlž.mn/	n.t.
Asn89iie90Thr91	4	n.t.	n.t.
Ser87Asn89ne90Thx91	4	n.t.	n.t.
Ser87Asn88ihr90jQal62	4	n.t.	1,8
Asn*36Thr138	3 až 4	n.t.	n.t.
Asnl38jhr140	3 až 4	n.t.	n.t.
Asn69jhr7lser87A3n88Thr90	4 až 5	n.t.	0,025-0,25
Asn30Thr32val87Aan88Thr38	4 až 5C	normální	1,8
Thrl23	3	1 a 2f	n.t.
Thrl25	3	1 a 2f	0,7
Prol24ihr125	3	1 a 2f	n.t.
HCG c- terminální prodlouéení	3	alespoň 39	1,0-1,3
Ser87A3n88ihx;90
hcg prodloužení	4	alespoň 39
Asn30Thr32val®7Asn88Thr98
hcg prodloužení	4 až 5	alespoň 39	0,8

-33CZ 291342 B6

Poznámky' k tabulce 6:

“Počet přídavných N-vázaných řetězců se odhaduje na základě mobility peptidových analogů v SDS gelech způsobem popsaným v příkladu 7A.

^bPoměr účinnosti analogu in vivo k množství analogu erythropoietinu. Měření účinnosti se provádějí na supernatantech buněk CHO s analogy za použití myšího polycythemického biologického stanovení. Množství analogu erythropoietinu v supernatantech buněk CHO se stanovuje zkouška RIA nebo ELA popsanou v textu.

c

Počet přídavných uhlohydrátových řetězců se potvrdí zkouškou migrace glykoproteinu v SDS-gelech po částečném rozštěpení N-glykanázou způsobem popsaným v příkladu 7A.

^dO-vázaný řetězec v Ser¹²⁶ je přítomen na 70% molekul humánního erythrpoietinu.

'Analogy se sníženým stupněm O-glykosylace, které obsahují uhlohydrátový řetězec v Ser¹²⁶ na méně než 70 % molekul.

^fThr¹²³EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 60 % molekul. Thr¹²⁵EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na přibližně 40 % molekul. Pro¹²⁴Thr¹²’EPO obsahuje dva O-vázané řetězce na více než 80 % molekul.

⁸Tyto analogy obsahují alespoň tři O-vázané řetězce a mohou mít i čtyři nebo pět řetězců. O samotném HCG je známo, že obsahuje čtyři O-vázané řetězce.

n.t. znamená, že zkoušení nebylo prováděno.

Tabulka 7

Účinnost humánního erythropoietinu a analogů obsahujících přesmyky uhlohydrátových míst

Sekvence EPO	N-vázané řetězce	Účinnost in vivo RIA nebo EIA
	3	0,69
Gin24	2	0,16
Gin38	2	0,16
Gin83	2	0,23
Gln24Ser87Asn88Thr90(R1)	3	0,69
Gln38Ser87Asn88Thr90(R2j	3	0,41
Gln83Ser87Asn88Thr90(R3'	3	0,50
Ser87Asn88Thr90	3 až 4	1,48

Poměr účinnosti in vivo kRIA nebo EIA se stanovuje způsobem popsaným v poznámce ^a k tabulce 6.

C. Výroba izomorfních směsí získaných z analogů erythropoietinu [Thr¹²⁵]EPO (EPO 050)

Analog erythropoietinu, [Thr¹²⁵]EPO, se zkonstruuje způsobem popsaným v části A. příkladu 6. 810bp fragment eiythropoietinové cDNA nesoucí [Thr^l25]mutaci se izoluje rozštěpením plazmidu pEC obsahujícího [Thr¹²⁵] mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací vzniklého fragmentu k pDECdelta (derivát pDSa2) (viz příklad 6).

-34CZ 291342 B6

Plazmid pDECdelta obsahující [Thr¹²⁵] erythropoietinovou cDNA se tranfekuje do DHFR-deficientních buněk CHO. 770 ml média zpracovaného buňkami CHO se zkoncentruje za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti lOOOOdalton a diafiltruje proti lOmM Tris-HCl o pH 8,6 do dosažení konečného objemu 34 ml. Alikvot vzniklého koncentrátu o objemu 17 ml se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (objem lože 5 ml), který je ekvilibrován ve stejném pufru. Eluce se provádí lineárním gradientem od 0 do 250mM chloridu sodného v lOmM Tris-HCl o pH 8,6. Alikvoty frakcí eluovaných ze sloupce, buď neupravené, nebo štěpené N-glykanázou se analyzují SDS-PAGE nebo IEF a spojí se příslušné frakce podle obsahu izoforem a/nebo uhlohydrátu, přičemž vzniklé směsi se označí čísly 2, 3 a 4. Každá směs se nanese na sloupec Vydac 24 (214TPB2030; průměr 1 cm; objem lože 1,8 až 2,5 ml; průtok 0,34 ml/min). Sloupec se promyje vždy 2 objemy sloupce 20% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Sloupce se eluují lineárními gradienty 20 až 94% ethanolu v lOmM Tris-HCl o pH 7,0. Vyrobí se směsi 2, 3 a 4, tyto směsi se zředí lOmM Tris-HCl o pH 7,0 a nanesou na sloupce Q-Sepharose s rychlým průtokem. Po promytí lOmM Tris-HCl o pH7,0 se vzorky eluují 20mM citranem sodným/250mM chloridem sodným o pH 7,0. Purifikované [Thr¹²⁵] směsi se analyzují pomocí IEF (viz obr. 9). Tyto směsi se také analyzují výše uvedeným způsobem (Cotes et al.) na biologickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

[Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO (EPO NI4)

Preparativní postup 1

Analog EPON14 se purifikuje třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografíi, chromatografií na obrácených fázích a gelovou filtrační chromatografií. Během stupně ionexové chromatografíe se spojí vhodné frakce za účelem získání směsi izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové. Dvě další se vyrobí při chromatografií na obrácených fázích s obsahem analogu s agregátem nebo bez něho. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.

1. Médium upravené buňkami CHO exprimujícími analog EPON14 se sklidí a přibližně 2,5násobně zkoncentruje za použití míchané kyvety s membránou YM10 (Amicon) a diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.

2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 12 A_2g0/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.

3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.

4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se spojí takové frakce, aby vzniklá směs obsahovala převážně izoformy 11 až 18. K této směsi se přidá EDTA do lmM výsledné koncentrace.

5. Směs izoforem se nanese při asi A₂₈o/ml pryskyřice na sloupec s obrácenými fázemi C4 (Vydac) ekvilibrovaný ve 20% ethanolu v lOmM Tris o pH7,0 při průtokové rychlosti 2,5 cm/min. Sloupec se promyje jedním objemem sloupec 20% ethanolu v lOmM Tris o pH 7,0 a eluuje 30 objemy sloupce gradientu od 20 do 94% ethanolu v lOmM Tris o pH7,0 při průtokové rychlosti 1 cm/min. Sbírají se frakce o objemu odpovídajícím 0,2 objemu sloupce.

6. Vzorek každé frakce se analyzuje pomocí neredukujícího 12% SDS-PAGE. Na základě přítomnosti agregátu pozorovaného na SDS-gelu se vytvoří dvě oddělené směsi. Směs č. 1 obsahuje analog EPO, ale žádný agregát, a směs č. 2 obsahuje jak analog EPO, tak agregát.

-35CZ 291342 B6

7. Směs č. 1 se přibližně 65násobně zkoncentruje a směs č. 2 se přibližně 250násobně zkoncentruje za použití zařízení Centricon 10 (amicon). U každé směsi se provede výměna pufru za 20mM citran sodný/ lOOmM chlorid sodný o pH 7,0.

8. Každá směs se individuální purifikuje na sloupci HPLC BioSil SEC-250 (BioRad) ekvilibrovaném ve 20mM citranu sodném/lOOmM chloridu sodného o pH 7,0. Směsi se nanesou při hodnotě nižší než 6 A28o/ml pryskyřice při průtokové rychlosti 2,26 cm/min. Při každé zkoušce se sbírají píkové frakce odpovídající monomerním analogům.

9. Měří se absorbance každé směsi a část každé směsi se zkoncentruje pro analýzu gelu SDS-PAGE a IEF. Směs č. 1 obsahuje izoformy 15 až 17 a použije seji pro farmakokinetické studie a studie vazby k receptoru.

Preparativní postup 2

Podobně se purifikuje analog EPO N14 třístupňovým postupem, který zahrnuje ionexovou chromatografií, vysoce účinnou chromatografií na obrácených fázích a chromatografií na hydroxylapatitu. Během stupně ionexové chromatografie se analog rozdělí do tří směsí obsahujících podle obsahu izoforem. Podrobnosti tohoto purifikačního stupně jsou uvedeny dále.

1. Supematant buněk CHO exprimujících analog EPON14 se oddělí a přibližně lOx zkoncentruje za použití zařízení Filtron Mini-LJltrasette s tangenciálním tokem a potom diafiltruje proti lOmM Tris o pH 8,5.

2. Zkoncentrované médium se nanese při asi 10 A2so/ml pryskyřice na sloupec Q-Sepharose FF (Pharmacia) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH 8,5 při průtoku 0,2 cm/min.

3. Po nanesení média se sloupec promyje třemi objemy sloupce lOmM Tris o pH 8,5 a eluuje 50 objemy sloupce gradientu od 0 do 0,5M chloridu sodného v lOmM Tris o pH 8,5. Sbírají se frakce, jejichž objem odpovídá objemu sloupce.

4. Vzorek každé frakce se zkouší na IEF gelu při pH 3 až 5. Na základě rozdělení izoforem zjištěného metodou IEF se jednotlivé frakce rozdělí do tří směsí. Směs označená názvem „nízké izoformy“ obsahuje izoformy 4 až 12, směs označená názvem „střední izoformy“ obsahuje izoformy 5 až 15 a směs označená názvem „vysoké izoformy“ obsahuje izoformy 6 až 18.

5. Každá směs izoforem se individuálně purifikuje na sloupci pro HPLC s obrácenými fázemi C4 (Vydac). Sloupec se vyvíjí gradientem od 0,1% kyseliny trifluoroctové ve vodě do 0,1% kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu, přičemž zvyšování koncentrace acetonitrilu probíhá rychlostí 1 %/min.

6. Píková frakce analogu z každé směsi se shromáždí a zředí 4 objemy 80mM Tris-HCl/20mM Tris-báze a potom zkoncentruje. provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 3, která jsou odolná proti rozpouštědlům.

7. Každý vzorek se zředí na hodnotu 2 A₂so/ml v lOmM Tris o pH 7,2 a přidá se stejný objem 4M hydrochloridu quanidinu (GuHCl, lOmM CHAPS, lOmM Tris o pH7,2 do koncentrace výsledného vzorku 1 Α280/Π1Ι). Každý vzorek se nanese na hydroxylapatitový minisloupec ekvilibrovaný 2M GuHCl, 5mM CHAPS, lOmM Tris o pH 7,2. Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem a shromažďují se frakce o objemu jednoho sloupce.

8. Změří se absorbance frakcí, vyrobí se směsi a provede se výměna pufru za lOmM Tris o pH 7,2 za použití zařízení Centricon 10. Změří se absorbance každé směsi.

-36CZ 291342 B6

Výsledné směsi se analyzují na SDS-PAGE a IEF gelech. IEF gely jsou znázorněny na obr. 12. Zkoušky RIA a zkoušky účinnosti in vivo se provádějí způsoby popsaným v příkladu 7A. Účinnost výsledných směsí izoforem in vivo je uvedena v tabulce 8. Směs izoforem s vysokým obsahem kyseliny sialové se použije při experimentech zaměřených na zjištění zvýšení hematokritu u myší.

Tabulka 8

Účinnost izoforem analogů erythropoietinu

Sekvence EPO	Směs izoforem	Účinnost in vivo (U/mg peptidů)3
Thr125	izoformy 8 až 12	147 000b
	izoformy 9 až 12	215 000b
Ser87Asn88Thr90	izoformy 13 až 15	111 000b
izoformy 7 až 12	132 000 ± 17 000
	izoformy 10 až 14	233 000 ± 39 000
	izoformy 12 až 12	272 000 ± 14 000

Množství erythropoietinového peptidů v mg se vypočítá z hodnot A₂go směsí izoforem 87 88 90

Ser Asn Thr EPO s použitím extinkčního koeficientu 0,93 pro 1 mg/ml roztoku.

Směrodatná odchylka u směsí izoforem Thr¹²⁵EPO není uvedena, poněvadž stanovení účinnosti bylo prováděno jednou nebo dvakrát.

Příklad 8

Biologické vlastnosti analogu EPO N14

Účinnosti směsí izoforem analogu EPONI4, rekombinantního humánního erythropoietinu (rHuEPO) a izolované izoformy rHuEPO 14 se srovnávají při i.v. farmakokinetických zkouškách, zkouškách vazby k receptorů a studiích hematokritu. Směsi izoforem EPO NI4 se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 7C. rHuEPO se vyrobí způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Lei et al. Izoforma 14 rHuEPO se purifikuje následujícím způsobem: rHuEPO, který se skládá ze směsi izoforem 10, 11,12, 13,14 a 15 se nanese na sloupec Q-Sepharose s rychlým průtokem (průměr 2,2 cm, výška 3,4 cm) ekvilibrovaný v lOmM Tris o pH7,2. Sloupec s rHuEPO se ekvilibruje s 2mM kyselinou octovou/6mM močovinou (pufr A) a potom se provede eluce vícefázovým gradientem navrženým pro optimální purifikaci izoforem 13 a 14. Gradient zahrnuje 0 až 7,3 % 800mM kyseliny octové/6M močoviny (pufr B) v 750 ml, 7,3 až 11,4 % pufru B v 750 ml, 11,4 až 26,8 pufru B ve 1 250 ml, 26,8 až 62,4 % pufru B ve 1 250 ml a potom 62,4 až 100% pufru B v 700 ml. Sbírají se frakce o objemu 12,5 ml. Frakce se neutralizují hydroxidem amonným a zkouší izoelektrickou fokusací na polyakrylamidových gelech. Frakce obsahující čistou izoformu 14 se spojí, zkoncentrují vmíchané kyvetě Amicon vybavené membránou YM-10 a potom se provede výměna pufru za vodu.

A. i.v. farmakokinetické studie

Provedou se dvě oddělené studie pro srovnání farmakokinetických parametrů analogu EPON14 (izoformy 15 až 17) a izolované izoformy 14 s rHuEPO.

Při každé studii se 1 pCi buď ¹²⁵I-izolované izoformy 14, analogu ¹²⁵I-EPON14 nebo ¹²⁵I-rekombinantního humánního erythropoietinu (Amersham) intravenosně vstříkne do kanyly zavedené do krční tepny samce krysy Sprague-Dawley o hmotnosti v rozmezí od 310 do 378 g. V různých dobách po podání se odebírají krevní vzorky o objemu 0,3 ml, které se centrifugací

-37CZ 291342 B6 zpracují na sérum. Každý vzorek séra o objemu 0,1 ml se inkubuje přes noc při 4 °C z 90% ethanolem a potom se v něm stanoví koncentrace ¹²⁵I-EPO (buď rekombinantního humánního erythropoietinu, izolované izoformy 14, nebo analogu EPON14). Ethanolem vysrážený ¹²⁵I-EPO v každém vzorku séra se spočítá v počítači gamma-rozpadů. Výsledné 5 farmakokinetické křivky jsou uvedeny na obr. 13. Pro každou krysu se stanoví farmakokinetické parametry za použití nelineární regresní analýzy PCNONLIN 4.0 Statistical Consultants, 1992 a výsledky pro každou skupinu szprůměrují. Výsledky farmakokinetických studií získané za požití analogu EPO N14 a izolované izoformy 14 jsou souhrnně uvedeny v tabulce 9.

ío Jak je zřejmé z tabulky 9, existuje podstatný rozdíl mezi hodnotou sérové clearance analogu EPON14 a hodnotou vypočtenou pro rekombinantní humánní erythropoietin. Rekombinantní humánní erythropoietin vykazuje nejrychlejší beta poločas 3,10 hodiny ve srovnání s 3,97 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 4,36 hodiny pro analog EPON14. Skupina s rekombinantním humánním erythropoietinem vykazuje také nejrychlejší poločas clearance 1,78 hodiny ve 15 srovnání se 2,40 hodiny pro izolovanou izoformu 14 a 3,03 hodiny pro analog EPO N14.

-38CZ 291342 B6 to Λ >o o rH o P4

Φ O ti cS

O

00	t-	o	1O	co	t-
fc-	CM		rH	O	CM
rH	O	CM	o	co	O

Přehled farmakokinetických parametrů rHuEPO, isoformy 14 rHuEPO a EPO N14 (isoformy 15 až 17) po i.v. podání o ti «1

Φ i-H

O

Λ ώ Λί rH E

sr	CO	O	CM	fc-	fc-
rH	co	00	rH	co	rH
CO	rH	CO	O	CM	o

o	o	00	o	o	rH
o	co	00	CM	co	CM
	o	CM	O	CM	O
M		**	*	·>	Λ
o	o	o	o	o	O

G5	co	LO	CM	xť	05
XT	00	co	CM	b-	rH
AT		co		co

rH	b-	σ>	00	rH	1Λ
O	00	CM	co	CO	m
05	rH	co	co	CM	co
co	O>	co	co	CM	o
O	CO	co	ΙΛ	05	KT
co				CD

I

4-» o > •r* >N

o	xr		o	to	CO
rH	in	o		co	co
CO	o	co	o		o

OJ	ιΛ	00	co	OJ	tn
co	in	00	co	co	CD
co	iH	co	o	xjf	rH
*	«»			*
o	O	o	o	o	O
Ό	•	Ό	«	Ό
Φ >IU	o	>ti	o	Φ	O
4-»	•	4J	•	4->	*
ω	<Z)	m	ca	M	CQ
		Xř
		r-4
		03		xr
O			r-H
At				Z
M 3	to II	<2 Λ	0< 11	O	xi· 11
ffi	c	CJ ω	ti	A«	ti

Průměrná hodnota pro skupiny, kterým byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin při farmakokinetické studii s EPO N14 (n = 4, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánr erythropoietin) a při farmakokinetické studii s izolovanou isoformou 14 (n = 2, v případě skupiny, které byl podáván rekombinantní humánní erythropoietin).

CQ

-39CZ 291342 B6

B. Stanovení vazby k receptoru

Interakce analogu EPON14 (izoformy 15 až 17) sreceptorem erythropoietinu se studují vytěsňovací zkouškou za chladu za použití erythroleukemických buněk 0CIM1 (Papayannopoulou et al., Blood 64 (supp. 1), 116a (1984)). Zvyšující se koncentrace neznačeného EPON14 se inkubují s buňkami OCIM1 spolu s konstantní koncentrací ¹²⁵I-rHuEPO, za účelem stanovení množství EPO NI4 potřebného pro soutěž s ^12;>I rHuEPO o vazbu k receptoru. Pro srovnání se nechá s konstantní koncentrací ¹²⁵I-rHuEPO soutěžit také postupně se zvyšující koncentrace neznačeného rHuEPO.

Neznačený EPON14 se zředí zkouškovým pufrem a přidá v množství 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10, ng a 30,0 ng (vztaženo na hmotnost peptidu). Do všech zkumavek se přidá 0,5 ng ^l25I-rekombinantního humánního EPO a potom se přidá vždy přibližně 0,5 x 10⁶ buněk OCIM1. Zkumavky se inkubují při 37 °C ve třepané vodní lázni po dobu 2 hodin. Po inkubaci se roztoky odstředí přes dibutylftalátový/biftalátový olejový roztok, aby se oddělil nenavázaný ¹²⁵I-rHuEPO od ¹²⁵I-rHuEPO vázaného k buňkám OCIM1. Izolují se buněčné pelety a množství ^l25I-rHuEPO vázaného k buňkám se stanoví spočítáním gamma-rozpadů. Vypočítá se údaj charakterizující specifickou vazbu k buňkám a lineární regresní analýzou se stanoví koncentrace neznačeného proteinu, které je zapotřebí pro to, aby bylo 50 % ¹²⁵l-rHuEPO vázaného za nepřítomnosti kompetitoru vyřazeno ze soutěže.

Z výsledků tří zkoušek vyplývá, že v průměru je zapotřebí 2,67 ± 0,73 ng neznačeného peptidu EPON14 pro snížení vazby ^l25I-rHuEPO k buňkám OCIM1 o 50%. Při stejných třech zkouškách je zapotřebí v průměru 0,51 ±0,15ng neznačeného rHuEPO pro soutěž s vazbou 0,5 ng ¹²⁵I-rHuEPO. Na základě těchto výsledků je zapotřebí 5,25násobného nadbytku EPON14 pro soutěž s vazbou ¹²⁵I-rHuEPO k receptoru EPO ve srovnání s neznačeným rHuEPO (p<0,01).

Také se provede přídavný experiment přímého srovnání vazby analogu EPO NI4, izolované izoformy 14 a rekombinantního erythropoietinu k receptoru erythropoietinu. Výsledky tohoto experimentu ukazují, že analog EPO N14 má k receptoru nižší afinitu než izolovaná izoforma 14. Ve srovnání s neznačenou izoformou 14 je při soutěži s ¹²⁵I-rHuEPO o vazbu k receptoru zapotřebí přibližně dvojnásobného nadbytku analogu EPO N14 (obr. 14).

C. Studie hematokritu

Provede se in vivo studie pro srovnání schopnosti vysokých a nízkých izoforem EPON14 (z preparativního postupu 2 popsaného v příkladu 7C), izolované izoformy 14 a rekombinantního humánního EPO zvýšit hematokrit ošetřených myší. Rozdělení izoforem ve směsích izoforem EPO NI4 označených názvy „vysoké izoformy“ a „nízké izoformy“, kterých se používá při této studii, je uvedeno na obr. 12.

Myším CD1 (o hmotnosti asi 30 g) se po dobu celkem 6 týdnů 3 x za týden intraperitoneálně injikuje jeden z výše uvedených přípravků v 0,25% myším sérovém albuminu nebo placebo (PBS s 0,25% myším sérovým albuminem). Dávkování erythropoietinových přípravků je vztaženo na hmotnost peptidu a je upraveno tak, aby 30gmyš obdržela 0,71 pg peptidu/dávka, a to buď vysokých frakcí EPO NI4, nízkých frakcí EPO NI4, izoformy 14, nebo standardního rHuEPO. Při zkoušení vysokých frakcí EPO N14 a izoformy N14 se použije též přídavné skupiny, které se podává 0,036 pg peptidu/dávka. Hematokrity všech myší se stanoví před zahájením pokusu a potom se zjišťují dvakrát týdně retroorbitálním odběrem krve. Na závěr pokusu se shromáždí sérum všech zvířat a zkouší se na protilátky proti vstříknutému produktu. Dat získaných u zvířat, která jsou charakterizována jako negativní s ohledem na neutralizaci protilátek, se použije při následné analýze.

-40CZ 291342 B6

Jak ukazuje obr. 15, zvířata, kterým byly podaný vysoké izoformy EPON14, vykazují nejvyšší průměrnou hodnotu hematokritu ve skupině ve srovnání se zvířaty kterým byly podány ostatní přípravky. Izoforma 14, rekombinantního humánního EPO a nízké izoformy EPON 14 zvyšují hematokrit v menším rozsahu.

Za účelem porovnání různých erythropoietinových přípravků kvantitativnějším způsobem se vypočítá průměrná počáteční rychlost vzrůstu hematokritu (0 až 11 dnů), změří se plocha pod křivkou (0 až 39 dnů) a vypočítá se celkové zvýšení hematokritu (tabulka 10). Ať již se použije kteréhokoliv z těchto kritérií, zdá se být směs „vysoké izoformy“ EPON 14 účinnější (vztaženo 10 na hmotnost peptidu) než kterýkoliv z ostatních zkoušených přípravků. Jak směs vysoké izoformy“ EPO NI4, tak izoforma 14 je účinnější než rekombinatní humánní EPO. Směs „nízké izoformy“ EPO N14 vykazuje nejnižší účinnost při srovnání za použití kterékoliv z těchto analýz.

-41 CZ 291342 B6 činek EPO N14 (směsi vysoké isoformy a nízké isoformy) isoformy 14 a rHuEPO na hematokrit myší m

1	β
Φ	+J
>w	•H
	54 34 —
N	0 >i +> Ό
XV	Φ O
>	g Λ
O	Φ
34	X!
rd
Φ	M
O	β

M β '«j }> O xn >ΤΗ tn β

Φ 34 > XŮ Q

	<D	t—1	r-	in	CO
	K	*»
in	CM	cn	o	r*	σχ
CM	CM	rd	c-d	r4

σ>	kO	CO	’Τ		Ol
		CM	00	CM	r—1
	in		OJ		Ol

4J tn O rH

X! O β +> r-. •Η C

Φ

Φ «J k α VI >14 P4

kD	σι	co	\0
	r-4	Ol		o	tn
rd	rd	o	o	r-<	o

<-4	rd	ko	ko	rd	i-d
r-	Γ*	o	co	r*	r-
o	o	o	o	o	o
	«»		·.		*»
o	o	o	o	o	o

1		1
0	Γ1	o	rd		1
		tn 'ř			0	'Φ
•rl rd	φ	-r| fd	ti		η	r4
53	a	25	e		•ď
XV	M	XV	fi	O
34 >i	O	34 >i	0	Λ	XV
o Č	04	o e	Od	W	34	Ε
Φ β	0	tn β	0	β	Ν	Μ
>ιθ	m	>i 0	tn	Μ	VI	0
> 04	H	> 04	H	$4	S3	<Η

Počáteční rychlost zvyšování hematokritu se vypočítá metodou lineární regrese z výsledků od dne 0 do dne 11.

Plocha pod křivkou se vypočítá trapezoidní sumací z výsledků od dne 0 do dne 39.

Celkové zvýšení hematokritu se vypočítá jako rozdíl průměrné hodnoty hematokritu u skupiny v den 39 a průměrné hodnoty hernatokrytu u skupiny při zahájení pokusu.

-42CZ 291342 B6

Vynález byl sice za použití přednostních provedení, odborníkům v tomto oboru je však zřejmé, že jej lze různým způsobem obměňovat a modifikovat, přičemž všechny takové variace spadají do rozsahu tohoto vynálezu, pokud jsou kryty následujícími patentovými nároky. Tyto patentové nároky je třeba vykládat na podkladě ekvivalentů.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Elliott, Steven G. Byme, Thomas E.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Analogy erythropoietinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 26 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Amgen lne. U.S. Patent Operations/rbw (B) ULICE: 1840 DeHavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 91320-1798 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/108,016 (B) DATUM PODÁNÍ: 17. srpna 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 30

-43CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT 27 (2) IFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY. CDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bázových pár“ (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:4:

TCCCCTCCAG ATAATGCCTG AGCTGC 26

-44CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová ky selina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:5:

CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG 33 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:7:

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC 23

-45CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:8:

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:9:

GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

CAGGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC 30

-46CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT 35 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC

-47CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 23

-48CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 184 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC 60

AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCCTTT 120 ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTGGTC 130 GACC 134 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAGTC

CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA

107

-49CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 108 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:20:

GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGGAA 60

GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG 108 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:21:

GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:22:

CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 23

-50CZ 291342 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:23:

CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:24:

CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:25:

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 15 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin

25 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 193 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:26:

Met Gly 1

Val His

Glu 5

Cys Pro

Ala

Trp

Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

10

15

Leu

Ser

Leu

Pro 20

Leu

Gly

Leu

Pro

Val 25

Leu

Gly

Ala

Pro

Pro 30

Arg

Leu

lle

Cys

Asp 35

Ser

Arg

Val

Leu

Glu 40

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu 45

Ala

Lys

Glu

Ala

Glu 50

Asn

lle

Thr

Thr

Gly 55

Cys

Ala

Glu

His

Cys 60

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn 65

lle

Thr

Val

Pro

Asp 70

Thr

Lys

Val

Asn

Phe 75

Tyr

Ala

Trp

Lys

Arg 80

Met

Glu

Val

Gly

Gin 85

Gin

Ala

Val

Glu

Val 90

Trp

Gin

Gly

Leu

Ala 95

Leu

Leu

Ser

Glu

Ala 100

Val

Leu

Arg

Gly

Gin 105

Ala

Leu

Leu

Val

Asn 110

Ser

Ser

Gin

Pro

Trp 115

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu 120

His

Val

Asp

Lys

Ala 125

Val

Ser

Gly

Leu

Arg 130

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu 135

Leu

Arg

Ala

Leu

Gly 140

Ala

Gin

Lys

Glu

Ala 145

lle

Ser

Pro

Pro

Asp 150

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala 155

Pro

Leu

Arg

Thr

lle 160

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe 165

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg 170

Val

Tyr

Ser

Asn

Phe 175

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu 180

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly 185

Glu

Ala

Cys

Arg

Thr 190

Gly

Asp

Arg

Claims (8)

1. Analog humánního erythropoietinu obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující přesmyk alespoň jednoho místa pro glykosylaci.

2. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 1, v němž přesmyk zahrnuje deleci kteréhokoliv N-vazebného místa pro uhlohydrát v humánním erythropoietinu a adici N-vazebného uhlohydrátového místa v poloze 88 aminokyselinové sekvence humánního erythropoietinu.

3. Analog humánního erythropoietinu podle nároku 2 zvolený ze souboru sestávajícího z

Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO,

Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO a

Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.

4. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 1.

5. Sekvence DNA kódující analog humánního erythropoietinu podle nároku 3.

6. Eukaryontní hostitelská buňka transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 4 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat analog humánního erythropoietinu.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 3 spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, adjuvantem nebo nosičem.

8. Použití terapeuticky účinného množství analogu erythropoietinu podle některého z nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšování hematokritu u pacienta.