JP3664723B2 - エリトロポエチン類似体 - Google Patents
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Description
[Val87Asn88Thr90]EPO、
[Ser87Asn88Thr90]EPO、
[Ser87Asn88Thr90Ala162]EPO、および
[Asn30Thr32Val87Asn88Thr90]EPO
を例示することができる。
Linら、前出、の記載に従って組換えエリトロポエチンを産生する。第1及び第3のイソ形単離用の出発物質として使用される組換えエリトロポエチンを、Laiら名義の特許、前出、の実施例2に記載の手順で精製する。第2及び第5のイソ形単離用の出発物質を、Q-セファロースを用いるように修正したLaiら、前出、に記載の方法に従って精製する。これらの調製物は、尿由来ヒトエリトロポエチンと同じアミノ酸配列を有する組換えエリトロポエチンのイソ形混合物を含有し、主としてイソ形9〜14を含有している。第4のイソ形調製用の出発物質は、Laiらの実施例2のアニオン交換カラムの5mMの酢酸/1mMのグリシン/6Mの尿素洗浄の間に溶出する物質である。この分画は、9個以下のシアル酸を有するイソ形を含有しており、分取用等電点電気泳動手順に使用する前にLaiらの実施例2に記載されたようなゲル濾過クロマトグラフィーによって更に精製した。第6のイソ形調製用の出発物質としては4〜13個のシアル酸残基を有する組換えエリトロポエチンの精製調製物を使用した。この物質は、出発物質中に存在するイソ形をほぼ保持するイオン交換カラムを用いるように修正した(pH8.4の塩化ナトリウム勾配によって組換えエリトロポエチンを溶出させ酢酸/尿素洗浄液を除く)Laiらの実施例2の手順で精製した。
実施例1に記載のごとく単離したイソ形及び Laiら、前出、に記載の手順で精製したエリトロポエチン(イソ形9〜14の混合物)の緩衝液を0.10〜0.15M の塩化ナトリウムに交換し、Jourdianら、J. Biol. Chem.246, 430 (1971) 、の手順の修正手順によってシアル酸含有を分析する。0.35M の硫酸で80℃で30分間加水分解することによって糖タンパク質からシアル酸残基を開裂し、分析前に水酸化ナトリウムで溶液を中和する。エリトロポエチンタンパク質の存在量を推定するために、Bio-Rad によって供給されるアッセイ試薬及び微量法手順を用い、ヒトエリトロポエチンのアミノ酸配列を有する組換えエリトロポエチンを標準として用いてBradfordタンパク質アッセイ(Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)を行う。その結果を、エリトロポエチン1モルあたりのシアル酸のモル数として表1に示す。1分子あたりのシアル酸の数に従って低酸性(イソ形9)から高酸性(イソ形14)の範囲までイソ形を命名する。イソ形9〜13は図1のゲルレーン6〜10に示されている。イソ形14はシアル酸含量を正確に測定するために十分な量で得られないため、このイソ形のシアル酸含量はIEFゲル上の泳動を他のイソ形に比較することによって推定する。イソ形5〜8(調製物#4) のシアル酸含量は測定しなかったがIEFゲル上の移動度から同様にして推定する。
実施例1に記載のごとく単離したイソ形について、組換えエリトロポエチンの存在量を測定するために、280nm の吸光度、Bradfordタンパク質アッセイ及びエリトロポエチン用RIAによって検定する。低酸素症でない赤血球増加症マウス(exhypoxic polycythemic mouse) のバイオアッセイ(Cotes ら、Nature 191, 1065 (1961))を用い、相対的in vivo 生物活性を測定する。エリトロポエチン用ラジオイムノアッセイを用いてエリトロポエチンタンパク質の存在量を定量する場合、大量のシアル酸を含有するイソ形では免疫反応性の見かけの減少が生じ、そのためエリトロポエチン濃度が過小評価され従って大抵の陰性イソ形の相対的in vivo 比活性が過大評価されるので、ある種のイソ形では他の定量法よりも高い相対的in vivo 比活性の値が得られた。単位/mlで表されたマウスバイオアッセイの測定値を対応タンパク質濃度によって除算すると、エリトロポエチンポリペプチド1mgあたりの単位で表されるin vivo 比活性が算出される。これらの比活性を表2に示す。
Lin ら、前出、に記載の手順に従って組換えエリトロポエチンを産生した細胞馴化培地を濃縮し、10mMのTris, pH 7.2に対し透析濾過する。ウシ血清アルブミンを標準として用いるBradfordマイクロタンパク質アッセイによってタンパク質濃度を測定する。40mgの総タンパク質を含有する19.6mlの溶液をCuSO4中で20μM にし、カットオフサイズ0.45ミクロンのフィルターで濾過し、4℃の10mMのTris,pH 6.8〜7.0 で平衡化しておいたQ−セファロースFast Flow (Pharmacia) を充填したベッドボリューム4ml(高さ1.05cm×直径2.2cm)のカラムに充填する。試料を添加した後、カラム容量の2倍の同じ緩衝液でカラムを洗浄する。カラムの流速は約1ml/分である。所定のエリトロポエチンイソ形混合物を選択するためにこの手順を用いる個別の6個のカラムを準備する。
別の手順では、pH漸減及びイオン強度漸増の勾配の勾配を用いてエリトロポエチンイソ形を分離する。濃縮し透析濾過したエリトロポエチン含有培地を、ゲル1mlあたり総タンパク質約40mgの割合でQ−セファロースカラムに充填する。次に、カラム容量の約2倍の10mMのTris-HCl,pH 7.0でカラムを洗浄し、次いでカラム容量の約10倍の2mMの酢酸/1mMのグリシン/20μM のCuSO4 /6M の尿素(pH 約4.8)で洗浄して、夾雑タンパク質及び約7個未満のシアル酸残基を含むエリトロポエチンイソ形を除去する。6M の尿素/1mMのグリシン/20μM のCuSO4中の約2mMの酢酸から出発して40mMの酢酸/6M の尿素/1mMのグリシン/20μM のCuSO4 (pH 約4)に到達する勾配を用いて、約8個から約12個のシアル酸を含むイソ形をカラムから溶出させる。勾配の総容量はカラム容量の約40倍であり、約1カラム容量の各分画を容器に収集する。この容器は、収集した分画が低pHに長期間接触することを防止するために、pHを6〜8.5の範囲に維持する十分な量のTris緩衝液を収容している。分画のアリコートを分析用等電点電気泳動にかけて分離をモニターする。
ヒトエリトロポエチンアミノ酸配列内部の既存の炭水化物結合部位の位置を図5に示す(SEQID.NO:26) 。エリトロポエチンの付加的グリコシレーション部位の作製手順を図6A−Cに要約し以下に説明する。
[Asn4,Ser6]EPO:5'CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA3'
(SEQ ID NO:1);
[Asn9,Ser11]EPO:5'ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT3'
(SEQ ID NO:2);
[Asn69]EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG3'
(SEQ ID NO:3);
[Asn124]EPO:5'TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC3'
(SEQ ID NO:4);
[Asn125,Ser127]EPO:5'CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC3'
(SEQ ID NO:5);
[Asn163,Ser165]EPO:5'AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG3'
(SEQ ID NO:6);
[Thr125]EPO:5'TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC3'
(SEQ ID NO:7);
[Pro124,Thr125]EPO:5'CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC3'
(SEQ ID NO:8)。
[Asn69, Thr71]EPO:5'GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC3'
(SEQ ID NO:9);
[Ser68, Asn69, Thr71]EPO:5'CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC3'
(SEQ ID NO:10);
[Asn125, Thr127]EPO:5'CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC3'
(SEQ ID NO:11);
[Asn125, Thr127, Thr131]EPO:5'ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT3'
(SEQ ID NO:12);
[Pro124, Asn125, Ser127]EPO:5'CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC3'
(SEQ ID NO:13);
[Pro124, Asn125, Thr127]EPO:5'CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC3'
(SEQ ID NO:14);
[The125, Thr126]EPO:5'CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA3'
(SEQ ID NO:15)。
[Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]EPOの作製:[Pro124, Thr125]EPO cDNAから出発し、オリゴヌクレオチドプライマー5'AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC3'(SEQ ID NO.16)を使用して、[Pro124, Thr125, Thr126] EPOを作製する。次にオリゴヌクレオチドプライマー5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG3'(SEQ ID.:17)を使用して、[Pro124, Thr125, Thr126, Thr131]EPO を作製する。
5'TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC3'。
得られたプラスミドは pDSα2ΔH スプライスであった。
Asn30, Thr32, Val87, Asn88及びThr90 突然変異を含むpDEC(N47)を、pDEC(N18)及びpDEC(N4)から構築した。pDEC(N18) をHindII及びBglII で消化し、445bp のフラグメントを単離した。pDEC(N4)をBstEII及びHindIII で消化し、377bp のフラグメントを単離した。これらの2つのフラグメントを、上述のようにBstEII及びBglII で切断したpDECΔに結合してpEDC(N47) を得た。
pEC1と、ヒト絨毛性ゴナドトロンピンのカルボキシ末端の28個のアミノ酸(ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-pro-ser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leu-pro-gln)(SEQ ID. NO:25)(Pierceら、Ann. Rev. Biochem. 50, 465 (1981)) を含む107 塩基対のStuI-BglII合成DNAリンカーとからpDEC(O62) を組立てた。リンカーの配列を以下に示す。
5'CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC-
3'GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG-
5'CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA
(SEQ ID. NO:19)
3'GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG
(SEQ ID. NO: 20)
pEC1をStuI及びBglII で消化し、610bp のDNAフラグメントを単離した。合成リンカーを ATP及びポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化し、pEC1フラグメントと共に、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結合した。
pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)からpDEC(NO1) を組立た。pDEC177 をStuI及びBalIIで消化し、Ser87Asn88Thr90 突然変異を含む610bpのDNAフラグメントをgene-cleanで単離した。pDEC(O62) をStuI及びBglII で消化し、107 塩基対のフラグメントを単離した。これらの2つのDNAフラグメントを、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結合した。
pDEC(O62)(HCG-EPO)及びpEDC(N47)(Asn30Thr32Val87Asn88Thr90)からpDEC(NO2) を組立てた。pDEC(N47) をStuI及びBalIIで消化し、Asn30Thr32Val87Asn88Thr90突然変異を含む610bp のDNAフラグメントを GeneCleanTMで単離した。pDEC(O62) をStuI及びBglII で消化し、107 塩基対のフラグメントを単離した。これらの2つのDNAフラグメントを、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結合した。
pDEC(N14)(Ser87Asn88Thr90)及びpEDC258(Ala162) からpDEC(N16) を組立てた。pDEC258 は上述のin vitro突然変異誘発手順を用いて構築し、162 位のAGG コドンをGCG に変異させた。pDEC(N14) をStuI及びBalIIで消化し、Ser87Asn88Thr90 突然変異を含む610bpのDNAフラグメントを GeneCleanTMで単離した。pDEC258をStuI及びBglII で消化し、210 塩基対のフラグメントを単離した。これらの2つのDNAフラグメントを、上述のように予めBstEIIで消化しBglII で部分消化したpDECΔに結合した。
pDEC(N14) からグリコシレーション部位を除去するために、ser87 asn88 及びthr90 突然変異を含むm13-EPO(N14)を、以下のプライマーを用いて上述のようにin vitro突然変異誘発した。
5'GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3' GLN24
(SEQ ID. NO:21);
5'CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC3' GLN38
(SEQ ID. NO:22);
5'CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG3' GLN83
(SEQ ID. NO:23)。
5'CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC3' GLN83 (SEQ ID. NO:24)
を用いてpEC9(gln83) を構築した。
A.炭水化物付加の測定
実施例6に記載のようなエリトロポエチン類似体cDNAでトランスフェクトしたCOS細胞から得られた5〜20単位を含有する量のCOS細胞上清を、ウサギ抗エリトロポエチンポリクローナル抗体と共に室温で一夜免疫沈降させた。リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)中の20〜80μl の1:1プロテインA−セファロースを免疫沈降物に添加し、室温で1時間インキュベートした。試料を遠心し、PBSで洗浄し、指示されている場合にはN−結合炭水化物鎖を除去するためにペレットをN−グリカナーゼで処理した。試料を、15%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、ニトロセルロースに移し、マウス抗エリトロポエチンモノクローナル抗体混合物を用いて文献に記載のウェスタン分析(Burnetteら、 Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981);Elliott ら、Gene 79, 167-180 (1989))によって処理した。このような抗体の1つ、9G8Aは、Elliott ら、(1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228 に記載されている。
Egrie ら、前出、に従ってRIAを実施した。CLINIGENTM EIAキット(R及びDシステム)を製造業者から提供された手順を用いてEIAを実施した。低酸素症でない赤血球増加症マウスのバイオアッセイ(Cotes ら、前出)を用い、エリトロポエチン類似体を発現するCHO細胞の上清または後述するようなCHO細胞馴化培地から得られた精製エリトロポエチンを用いてエリトロポエチン類似体のin vivo 生物活性を測定した。
a実施例7Aに記載のようなSDSゲル中の類似体ポリペプチドの移動度に基づいて、付加的なN−結合鎖の数を推定した。
bエリトロポエチン類似体のin vivo活性の比。マウス赤血球増加症のバイオアッセイを用い、CHO細胞上清中の類似体の活性を測定した。CHO細胞上清中のエリトロポエチン類似体の量を本明細書中に記載のようなRIAまたはEIAによって測定した。
c実施例7Aに記載のようなN−グリカナーゼによる部分消化後のSDS−ゲル中の糖タンパク質の泳動を試験することによって付加的炭水化物鎖の数を確認した。
dSer126の0‐結合鎖はヒトエリトロポエチン分子の70%に存在する。
e0−グリコシレーションが減少した類似体分子の70%未満はSer126に炭水化物鎖を有している。
f60%を上回るThr123EPO分子が2つの0−結合鎖を有している。約40%のThr125EPO分子が2つの0−結合鎖を有している。80%を上回るPro124Thr125EPO分子が2つの0−結合鎖を有している。
gこれらの類似体は少なくとも3つの0−結合鎖を有しており、4個または5個有することもある。HCG単独では4個の0−結合鎖を有することが判っている。
N.T.試験せず。
C.エリトロポエチン類似体に由来のイソ形混合物の調製
〔Thr 125 〕EPO(EPO 050)
実施例6の〔sectionA〕に記載のようにエリトロポエチン類似体〔Thr125〕EPOを構築した。〔Thr125〕突然変異を含むプラスミドpECをBstEII及びBgIIIで開烈し、フラグメントをpDEC△〔pDSα2の誘導体〕(実施例6に記載)に結合することによって、〔Thr125〕突然変異を含む810bpのエリトロポエチンcDNAフラグメントを単離した。
調製方法1
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーから成る3段階手順を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中に、高レベルのシアル酸を含むイソ形の混合物を与える分画をプールした。逆相クロマトグラフィー中に、類似体を擬集物と共に含むかまたは擬集物を伴わずに含む追加の2つのプールを作製した。精製手順を以下に詳細に説明する。
イオン交換クロマトグラフィー、逆相HPLC及びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーから成る3段階手順を用いてEPO N14類似体を精製した。イオン交換段階中に、類似体を、異なるイソ形混合物を含む3つのプールに分割した。精製手順を以下に説明する。
bThr125EPOイソ形プールについては、実施した活性アッセイが1回または2回だったので標準偏差を記録していない。
EPO N14類似体のイソ形プール、組換えヒトエリトロポエチン(rHuEPO)及び単離rHuEPOイソ形14の活性を、i.v.薬物動態アッセイ、受容体結合アッセイ及びヘマトクリット試験で比較した。EPO N14イソ形プールは、実施例7Cに記載の手順で調製した。rHuEPOは、Laiら、前出、に従って調製した。rHuEPOイソ形14は、以下の手順で調製した。イソ形10,11,12,13,14及び15の混合物から成るrHuEPOを、10mMのTris,pH7.2中で平衡化させたQ−セファロースFast Flowカラム(寸法=直径2.2cm×高さ3.4cm)に充填した。充填カラムを2mMの酢酸/6Mの尿素(緩衝液「A」)に平衡化させ、イソ形13及び14の精製を最適にするように設計された多相勾配を実施した。勾配は、750ml中0%−7.3%の800mM酢酸/6M尿素(緩衝液「B」)、750ml中7.3%−11.4%の緩衝液B、1250ml中11.4%−26.8%の緩衝液B、1250ml中26.8%−62.4%の緩衝液B、次いで700ml中62.4%−100%の緩衝液Bであった。12.5mlの分画を収集し、アンモニア水で中和し、次いでポリアクリルアミドゲル中の等電点電気泳動によって検定した。純粋なイソ形14を含む分画を一緒にプールし、YM−10膜を備えたAmicon撹拌槽で濃縮し、緩衝液を水に交換した。
EPO N14類似体(イソ形15〜17)及び単離イソ形14の薬物動態パラメーターをrHuEPOのものと比較するために個々の2つの試験を実施した。
EPO N14類似体(イソ形15〜17)とエリトロポエチン受容体との相互作用を、ヒト赤白血球OCIMI細胞(Papayannopoulouら、Blood 64(supp.1),116a(1984))を用いた低温置換アッセイで試験した。受容体との結合において125I−rHuEPOと競合するEPO N14の必要量を決定するために、漸増濃度の非標識EPO N14を一定濃度の125I−rHuEPOと共にOCIM1細胞とインキュベートした。比較として、漸増濃度の非標識rHuEPOも一定濃度の125I−rHuEPOと競合させた。
(実施例7Cに記載の調製物2から得られた)EPO N14の高イソ形プール及び低イソ形プール、単離イソ形14並びに組換えヒトEPOの処置マウスへマトクリット増加能力を比較するためにin vivo試験を実施した。この試験で使用したEPO N14の高イソ形プール及び低イソ形プールのイソ形分布を図12に示す。
Claims (2)
- ヒトエリトロポエチン、あるいは[Ser 87 Asn 88 Thr 90 ]EPOまたは[Asn 30 Thr 32 Val 87 Asn 88 Thr 90 ]EPOから選択されるヒトエリトロポエチン変異体、のカルボキシル末端に、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシル末端由来のアミノ酸配列:
Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln
を含むペプチドフラグメントが付加された、炭水化物鎖の数の増大したエリトロポエチン活性を有するヒトエリトロポエチン類似体。 - 治療有効量の請求項1に記載のヒトエリトロポエチン類似体を、医薬として許容される希釈剤、アジュバント又は担体と共に含む、赤血球細胞の産生を増進するための医薬組成物。
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