HU220334B

HU220334B - Eritropoietin analógok

Info

Publication number: HU220334B
Application number: HU9501435A
Authority: HU
Inventors: Thomas E. Byrne; Steven G. Elliott
Original assignee: Kirin-Amgen Inc.
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 2001-12-28
Also published as: UA49793C2; DK0640619T3; NO2007008I2; NO2007008I1; ATE155796T1; IL110669A; CZ291342B6; NO323104B1; IL192290A0; FI951792A0; CN1105030A; NO951445L; EP0640619A1; WO1995005465A1; CN1057534C; AU7632794A; NO951445D0; EP0640619B2; CZ91795A3; RU95115239A

Abstract

A találmány tárgya humán eritropoietin analóg. A találmány tárgyát azjellemzi, hogy legalább egy további glikozilezési hellyel rendelkezőaminosavszekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezik az említetteritropoietin analógokat kódoló DNS-szekvenciák, valamint azokkifejezésére alkalmas gazdasejtek. ŕ

Description

A találmány legalább egy további glikozilezési hellyel, vagy egy glikozilezésihely-kiteijedéssel rendelkező eritropoietin analógokkal foglalkozik. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett eritropoietin analógokat kódoló DNS-szekvenciák, valamint azok expressziójára alkalmas rekombináns plazmidok és gazdasejtek.

Az eritropoietin (EPO) egy glikoprotein hormon, amely részt vesz az eritroid őssejtek eritrocitákká érésének folyamatában. Kulcsszerepet játszik a vörösvértestek számának a szabályozásában a keringésben. A természetes eritropoietint a magzati életben a máj, felnőtt korban a vese állítja elő, és a vérben keringve vörösvértestek képződését serkenti a csontvelőben. A veseműködés zavara csaknem mindig anémiával jár a vese csökkent eritropoietinképzése következtében. Krónikus veseelégtelenségből adódó anémia kezelésében hatékonynak bizonyult a géntechnikai eljárással, ezen belül eritropoietint kódoló génnel transzformált sejtben egy proteintermék expresszálásával előállított rekombináns eritropoietin.

Az emberi vizeletben normális körülmények között kis mennyiségű eritropoietin található, míg aplasztikus anémiában szenvedő egyéneknél megnövekedett vizeleteritropoietin-szintet találunk. A humán eredetű eritropoietin tisztítás kiindulási anyaga Miyake és munkatársai szerint [J. Bioi. Chem., 252, 5558, (1977)] aplasztikus anémiában szenvedő egyének vizelete. Napjainkig azonban a vizelet eredetű eritropoietin nem bizonyult hatásosnak a terápiában.

Eritropoietint kódoló gének azonosítását, klónozását, valamint expresszálását ismerteti Lin a 4 703 008 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, melyet szakirodalmi helyként mellékelünk. Sejttenyésztő folyadékból rekombináns eritropoietin tisztítására szolgáló eljárást imák le Lai és munkatársai a 4 667 016 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben. Az eritropoietin gént rekombináns plazmidon tartalmazó emlős gazdasejtekben biológiailag aktív rekombináns eritropoietin expresszálása és annak visszanyerése tette először lehetővé terápiás alkalmazásra felhasználható mennyiségű eritropoietin előállítását. Ezenkívül a génszekvencia ismerete, valamint a rendelkezésre álló nagyobb mennyiségű tisztított protein a fenti protein hatásmódjának jobb megértéséhez vezetett.

Számos eukarióta sejtben előállított sejtfelszíni és szekretoros protein módosul egy vagy több oligoszacharidcsoport hozzákapcsolódásával. Ez a glikozilezésnek nevezett módosulás drámai módon megváltoztathatja a proteinek fizikai sajátságait és lényeges lehet a protein stabilitása, kiválasztása és sejten belüli lokalizációja szempontjából. A megfelelő glikozilezés nélkülözhetetlen lehet a biológiai hatás kifejtéséhez. Tény, hogy néhány eukarióta szervezetből származó gén a proteinek glikozilezéséhez szükséges sejtfolymatokat nélkülöző baktériumokban (például E. coliban) expresszálva olyan proteinek keletkezését eredményezi, amelyek glikozilezés hiánya miatt alacsony aktivitással rendelkeznek, illetve nem mutatnak aktivitást.

A glikozilezés a polipeptidváz meghatározott pontjain történik és rendszerint két típus egyikébe tartozik:

O-kötésű oligoszacharidok szerin-, illetve treoninmaradékokhoz kapcsolódnak, míg az N-kötésű oligoszacharidok aszparaginmaradékokhoz kapcsolódnak, amenynyiben azok az Asn-X-Ser/Thr szekvencia részét képezik, ahol X prolin kivételével bármilyen aminosav lehet. Az O-kötésű, illetve N-kötésű oligoszacharidok szerkezete és az egyes típusokban található cukormaradékok különbözőek lehetnek. Egy mindkettőben gyakran előforduló cukor az N-acetil-neuraminsav (a továbbiakban sziálsav). A sziálsav rendszerint mind az Okötésű, mind az N-kötésű oligoszacharidok terminális maradéka és negatív töltésének köszönhetően a glikoprotein savas tulajdonságáért felelős.

Mind a humán vizeletből előállított, mind a humán eritropoietin 1-165. aminosavszekvenciájával rendelkező (emlőssejtekben expresszált) rekombináns eritropoietin három N-kötésű és egy O-kötésű oligoszacharidláncot tartalmaz, amelyek együttesen a glikoprotein teljes molekulatömegének körülbelül 40%-át teszik ki. N-kötésű glikozilezés történik a 24., 38., illetve a 83. pozíciókban található aszparaginmaradékoknál, míg Okötésű glikozilezés jön létre a 126. pozícióban található szerinmaradéknál [Lai és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 3116, (1986), Broudy és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 265. 329, (1988)]. Kimutatták, hogy az oligoszacharidláncokat terminális sziálsavmaradékok módosítják. Ha a glikozilezett eritropoietinről enzimatikus kezeléssel az összes sziálsavat eltávolítjuk, elveszti in vitro aktivitását, de nincs hatással az in vivő aktivitásra [Lowy és munkatársai, Natúré, 185, 102, (1960), Goldwasser és munkatársai, J. Bioi. Chem., 249, 4202, (1974)]. Ezt a viselkedést azzal magyarázták, hogy a keringésből az aszialoeritropoietin gyorsan eltűnik a májból származó aszialoglikoprotein-kötő proteinnal való kölcsönhatás révén [Morell és munkatársai, J. Bioi. Chem., 243, 155, (1968), Briggs és munkatársai, Am. J. Physiol., 227, 1385, (1974), Ashwell és munkatársai, Methods in Enzymol., 50, 287, (1978)]. Az eritropoietin tehát csak akkor fejti ki hatását in vitro, ha a máj eredetű kötőproteinnel való kapcsolódás elkerülésére sziálsavval kapcsolódott.

Az eritropoietin oligoszacharidláncaiban található egyéb összetevők szerepe nem tisztázott. Kimutatták, hogy a részben deglikozilezett eritropoietin a glikozilezett formával összehasonlítva nagymértékben csökkent in vivő aktivitással rendelkezik, de megtartja in vitro aktivitását [Dordal és munkatársai, Endocrinology, 116, 2293, (1985), valamint Lin szabadalmi bejelentése, lásd fent]. Egy másik tanulmányban azonban, a glikozilezési helyeket képező aszparagin, illetve szerinmaradékok mutagenezisén keresztül az N-kötésű, illetve O-kötésű oligoszacharidláncok egyenkénti vagy együttes eltávolítása határozottan csökkenti az emlőssejtekben előállított megváltozott eritropoietin in vitro aktivitását [Dube és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 17516, (1988)].

A glikoproteinek, mint például az eritropoietin olyan eljárásokkal, mint az izoelektrofokuszálás (IEF) különböző töltésű formákká választhatók szét. Néhány kutatócsoport nyers, illetve részlegesen tisztított eritropoietin-készítményekkel végzett IEF vizsgálatokról szá2

HU 220 334 B molt be [Lukowsky és munkatársai, J. Biochem., 50, 909, (1972), Shelton és munkatársai, Biochem Med., 12, 45, (1975), Fuhr és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 98, 930, (1981)]. Ezekben a vizsgálatokban IEF technikával legalább három vagy négy eritropoietin-aktivitással rendelkező frakciót sikerült elkülöníteni, egyiket sem jellemezték azonban szénhidráttartalmukat illetően. Ezenkívül nem mutattak ki összefüggést a frakciók izolelektromos pontja és biológiai aktivitása között sem.

Humán vizeletből Miyake és munkatársai (lásd fent) szerint a vizelet eredetű eritropoietin tisztítása közben hidroxilapatit oszlopról nyert II., illetve IIIA) jelzésű két frakcióról kimutatták, hogy hasonló fajlagos aktivitással rendelkeznek. A II., illetve IIIA) jelzésű frakciók szénhidrátelemzése azt mutatta, hogy a II. frakciónak nagyobb az átlagos sziálsavtartalma, mint a IIIA) frakciónak [Dordal és munkatársai, lásd fent].

A találmány tárgyát meghatározott sziálsavtartalommal és biológiai aktivitással rendelkező, elkülönített és izolált eritropoietin izoformok képezik. Az ilyen molekulákat tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazhatók lennének a terápiában.

A találmány legalább egy további glikozilezési helyet tartalmazó aminosavszekvenciával rendelkező humán eritropoietin analógokra vonatkozik. A hozzáadott glikozilezési helyek nagyobb számú szénhidrátláncot és nagyobb sziálsavtartalmat eredményeznek, mint az a humán eritropoietinben található. A találmány kiteljed legalább egy glikozilezésihely-átrendeződéssel rendelkező aminosavszekvenciákat tartalmazó eritropoietin analógokra is. A találmány tárgyát képezik továbbá az eritropoietin karboxi-terminális végén egy vagy több további aminosavat tartalmazó eritropoietin analógok, amennyiben a hozzáadott aminosav legalább egy glikozilezési helyet szolgáltat. A találmány kiteljed továbbá ilyen eritropoietin analógokat kódoló DNS-szekvenciákra, valamint az analógok expresszálására alkalmazható rekombináns plazmidokra és gazdasejtekre.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábra egy, a különböző rekombináns eritropoietin izoformokról készült analitikai izoelektromos fokuszálógélt mutat. Az 1-11. gélcsíkok az 1. csíkon a kevésbé savastól (magasabb pl-lel rendelkező) all. csíkon található savasabbig (alacsonyabb pl-lel rendelkező) terjedően mutatják a különböző izoformokat. A gél szélső bal, illetve jobb oldalán a 9-14. izoformok elegyét tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint is bemutatunk.

A 2. ábra az eritropoietin izoformokban található sziálsavak száma és az egyes eritropoietin izoformok 1 mg eritropoietin polipeptid/egységben kifejezett in vivő fajlagos aktivitása közti összefüggést mutatja.

A 2A) ábrán az egyes eritropoietin izoformok koncentrációját Bradford-féle proteinvizsgálattal határoztuk meg, a 2B) ábrán a koncentrációt 280 nanométeren mért abszorpció alapján határoztuk meg, a 2C) ábrán a koncentrációt RIA eljárással határoztuk meg.

A 3. ábra egy, különböző feltételek mellett anioncserés kromatográfiával előállított rekombináns eritropoietin izoformok meghatározott elegyeiről készült analitikai izoelektromos fokuszálógélt mutat. Az 1-6. gélcsíkok magas sókoncentráció mellett eluált eritropoietin izoformokat képviselnek, miután a Q-Sepharose fást flow oszlopot 150 mmol/1 ecetsavat (pH 4,7), 150 mmol/1 (nem pufferolt) ecetsavat, 200 mmol/1 ecetsavat (pH 4,7), 250 mmol/1 ecetsavat (pH 4,7), illetve 300 mmol/1 (nem pufferolt) ecetsavat tartalmazó oldattal mostuk. A gél bal szélső oldalán található csík a 2. példában ismertetett, Lai és munkatársai szerinti eljárásokkal (lásd fent) előállított izoformok elegyét tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint mutat be, azzal az eltéréssel, hogy a tisztításnál DEAE-Agarose kromatográfia helyett Q-Sepharose kromatográfiát alkalmaztunk.

A 4. ábra a 8-12. eritropoietin izoformok szétválasztását mutatja be, amelyet oly módon értünk el, hogy a QSepharose oszlopra felvitt sejttenyésztő folyadékot csökkenő pH-értékű és növekvő ionerősségű gradienssel mostuk. 2-40. számozású egyenlő térfogatú frakciókat analitikai izoelektromos fokuszálóeljárással vizsgáltunk. A gél legszélső bal oldalán található esik a 2. példában ismertetett, Lai és munkatársai szerinti eljárásokkal (lásd fent) előállított izoformok elegyét tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint mutat be, azzal az eltéréssel, hogy a tisztításnál DEAE-Agarose kromatográfia helyett Q-Sepharose kromatográfiát alkalmaztunk.

Az 5. ábra a humán eritropoietin aminosavszekvenciáját mutatja. A négyzetek olyan aszparaginmaradékokat jelölnek, amelyekhez N-kötésű szénhidrátláncok kapcsolódnak, a csillag az O-kötésű szénhidrátlánccal módosított szerinmaradékot jelöli.

A 6A), 6B), valamint 6C) ábrák humán eritropoietin analógok előállítására és vizsgálatára felhasznált plazmidok előállításánál alkalmazott klónozási lépések sorozatát mutatják. Ezek az analógok, amint azt az 5. ábra mutatja, megváltozott aminosavakat tartalmaznak, melyek további glikozilezési helyeket szolgáltatnak.

A 7. ábra humán szekvenciájú eritropoietint, valamint a jelzett eritropoietin analógokat tartalmazó COSsejt-felülúszók Westem-lenyomat-vizsgálatát mutatja. Az [Asn⁹, Serí'jEPO, [Asn⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO, valamint [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO analógokat a 6. példában ismertetett módon állítottuk elő. Összehasonlításképpen bemutatjuk a [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷]EPO, valamint [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸] EPO analógokat, melyek nem tartalmaznak további szénhidrátláncokat.

A 8. ábra humán szekvenciájú eritropoietint, valamint a jelzett eritropoietin analógokat tartalmazó COSsejt-felülúszók Westem-lenyomat-vizsgálatát mutatja N-glykanáz-kezelést követően. A [Thr¹²⁵]EPO, valamint [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵]EPO analógokat a 6. példában ismertetett módon állítottuk elő. Összehasonlításképp bemutattuk a [Val¹²⁶]EPO, [Pro¹²⁴]EPO, [Pro¹²⁵]EPO, [Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO, valamint a [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷]EPO analógokat.

A 9. ábra a [Thr¹²⁵] mutációt tartalmazó eritropoietin cDNS-sel transzfektált CHO-sejtek szaporodását elősegítő sejttenyésztő folyadékból Q-Sepharose és

HU 220 334 Β

C4 reverz fázisú kromatográfiás eljárással előállított 2., 3., és 4. frakciók izoelektromos fokuszálással kapott géljét mutatja. A gél bal és jobb szélén található csík a 2. példában ismertetett, Lai és munkatársai szerinti eljárásokkal (lásd fent) előállított izoformok elegyét tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint mutat be, azzal az eltéréssel, hogy a tisztításnál DEAE-Agarose kromatográfía helyett Q-Sepharose kromatográfíát alkalmaztunk.

A 10. ábra rekombináns humán eritropoietint (rHuEPO), valamint kiválasztott eritropoietin analógokat tartalmazó COS-sejt-felülúszók Westem-lenyomatvizsgálatát mutatja. Az analógok előállítását a 6. példában ismertettük. Az N9, N14, N18, N19, N21, N24, valamint N39 analógok legalább egy további szénhidrátláncot tartalmaznak, amint azt a gélen lassabb mobilitásuk igazolja.

All. ábra rekombináns humán eritropoietint, valamint az EPO14 analógot tartalmazó COS-sejt-felülúszók Westem-lenyomat-vizsgálatát mutatja N-glykanáz-emésztés alatt. A mintákat vettünk az 1., 4., 12., és 45. percben, valamint az éjszakáig tartó emésztést követően.

A 12. ábra EPO14 analóg izoformkészítmények izoelektromos fokuszálógéljét mutatja. Az alacsony sziálsavtartalmú izoformfrakció leginkább molekulánként 6-12 sziálsavval rendelkező EPO NI4 analógokat, a középső izoformfrakció leginkább molekulánként 10-15 sziálsavval rendelkező EPO N14 analógokat és a magas sziálsavtartalmú izoformfrakció leginkább molekulánként 12-17 sziálsavval rendelkező EPO NI4 analógokat tartalmaz.

A 13. ábra a rekombináns humán eritropoietin, izolált 14. izoform és EPO 14 analóg (15-17. izoformok) farmakokinetikáját mutatja patkányokba adott intravénás injekciót követően.

A 14. ábra jelölt ¹²⁵I rekombináns humán eritropoietin eritropoietinreceptorhoz való kötődésének hidegkiszorításos vizsgálatát mutatja változó mennyiségű jelöletlen rHuEPO, izolált 14. izoform és EPO N14 analóg jelenlétében.

A 15. ábra egérhematokrit-vizsgálatot mutat, amelyben összehasonlítottuk az EPO N14 magas sziálsavtartalmú izoformfrakció (0,036 és 0,0712 mikrogramm), az izolált 14. izoform (0,036 és 0,0712 mikrogramm), az EPO177 alacsony sziálsavtartalmú izoformfrakció (0,0712 mikrogramm), valamint a rHuEPO aktivitását.

A találmány szerinti megoldás leírása

A találmány eritropoietin izoformokra vonatkozik. A találmány szerinti meghatározott eritropoietin izoformok és azok sajátságai eltérőek lehetnek a kiindulási anyag eredetétől függően. Például a vizeletből származó eritropoietin izoformjai különböznek a rekombináns eritropoietin izoformjaitól. A találmány tárgyát előnyösen eritropoietin-molekulánként meghatározott számú (0-nál nagyobb meghatározott számú) sziálsavat tartalmazó eritropoietin izoform képezi, az említett számként 1-14 közötti számot tartalmaz. Előnyösen, a fenti szám 9,10,11,12,13 vagy 14. A találmány egy másik megvalósítási módjában az említett szám nagyobb mint 14, előnyösen 16-23.

„Eritropoietin izoform” a találmány szerint egyetlen izoelektromos ponttal (pl) és ugyanazzal az aminosavszekvenciával rendelkező eritropoietin-készítményekre vonatkozik. Az „eritropoietin” a találmány szerint természetben előforduló eritropoietinre, vizelet eredetű eritropoietinre vonatkozik, valamint olyan, a természetben elő nem forduló polipeptidekre vonatkozik, amely a természetben előforduló eritropoietinnel aminosavszekvenciájukban és glikozilezésben elegendő mértékű egyezést mutatnak ahhoz, hogy in vivő a csontvelősejteket retikulociták és vörösvértestek fokozott előállítására serkentő biológiai hatással rendelkezzenek.

Kimutattuk, hogy a vizelet eredetű humán eritropoietin aminosavszekvenciájával rendelkező rekombináns eritropoietin egyes izoformjai 1-14 sziálsavat tartalmazó eritropoietin-molekuláknak felelnek meg, és a tisztított rekombináns eritropoietinben található egyes izoformok az izoformban található sziálsavak számával összefüggő in vivő aktivitást mutatnak.

A találmány előnyös megvalósítási módjában az eritropoietint egy nem humán eredetű eukarióta gazdasejtbe transzfektált exogén DNS-szekvencia expresszálásával állítjuk elő, tehát a találmány szerint előnyős eritropoietin „rekombináns eritropoietin”. A rekombináns eritropoietint előnyösen Lin 4 703 008 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésében leírt eljárással állítjuk elő, melyet szakirodalmi helyként mellékelünk. Rekombináns eritropoietint tisztíthatunk a 2. példában ismertetett általános eljárásokkal, illetve Lai és munkatársai által a 4 667 016 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, melyet szakirodalmi helyként mellékelünk, valamint más eljárás szerint Lai és munkatársainak a 2. példában leírt eljárásával, azzal az eltéréssel, hogy a DEAE-Agarose kromatográfiai Q-Sepharose kromatográfiával helyettesítjük.

Lai és munkatársainak a 2. példában leírt eljárásával tisztított eritropoietin (lásd fent) IEF-eljárással végzett vizsgálat alapján főként hat izoformot tartalmaz. Ezenkívül a 4. példában alkalmazott kromatorgáfiás eljárással legalább még egy további, savasabb izoformot mutattunk ki. (Ez a savasabb forma, amely IEF-gélen 14-nél több sziálsavat tartalmazó izoformnak megfelelően migrál, feltehetően nem sziálsav eredetű negatív töltéseket tartalmaz, amire a töltések egy részének szalidázemésztéssel szemben mutatott rezisztenciája utal). Ezeknek az izoformoknak a sziálsavtartalma különböző. Amint azt a példákban ismertetjük, ezt oly módon mutattuk ki, hogy a fentiek közül 10 izoformot preparatív IEF-eljárással izoláltunk és ötnél meghatároztuk a sziálsavtartalmat. Azok közül, amelyekben a sziálsavtartalmat meghatároztuk, azt találtuk, hogy az öt izoform 9, 10, 11, 12, illetve 13 sziálsavmaradékot tartalmazott.

Összefüggés van az eritropoietin relatív in vivő fajlagos aktivitása és az 5-11. eritropoietin izoformmolekulában található sziálsavmaradékok száma között (mindegyik izoformot az eritropoietin-molekulában talál4

HU 220 334 Β ható sziálsavak száma alapján neveztünk el). A 11-14. izoformok körülbelül azonos relatív in vivő fajlagos aktivitással rendelkeznek. Az 5-14. izoformoknál exhipoxiás policitémiás egérbioesszével vizsgáltuk az in vivő aktivitást, valamint Bradford-féle proteinvizsgálattal, 280 nanométeren mért abszorpció alapján, illetve eritropoietin radioimmunvizsgálattal (RIA) meghatároztuk az egyes izoformok mennyiségét. A RIA-meghatározás [Egrié és munkatársai, Immunbiology, 172, 213, (1986)] eredményét egység/ml-ben fejeztük ki, és hogy megkapjuk az izolált izoform, illetve izoformelegy proteinkoncentrációját mg eritropoietin polipeptid/ml-ben kifejezve, az előbbi értéket elosztottuk 121,770 egység/mg eritropoietin polipeptiddel, ami RIA-vizsgálat szerint a tisztított eritropoietin átlagos fajlagos aktivitásának felel meg. Amint azt a példákban láthatjuk, a relatív in vivő fajlagos aktivitás az 5. izoformtól all. izoformig lépcsőzetesen növekszik (lásd 2. táblázat).

A találmány szerinti in vivő fajlagos aktivitások relatív in vivő fajlagos aktivitások mérésén alapulnak, és nem abszolút in vivő fajlagos aktivitások. A találmány szerinti alkalmazásnál a fajlagos aktivitások fogalmát csak azon vizsgált izofomok relatív fajlagos aktivitásainak összehasonlítására használtuk, melyeket azonos vizsgálatban, azonos feltételek mellett, ezen belül azonos belső standard és azonos számú állat felhasználásával, a fajlagos aktivitás kiszámításánál azonos adatfeldolgozási mód, a proteintartalom meghatározásánál azonos esszé felhasználásával vizsgáltunk. A találmány szerint bármely izoformra megadott bármely in vivő fajlagosaktivitás-érték tehát nem jelent egy, az adott izoformra jellemző belső abszolút értéket.

A találmány tárgyát képezik továbbá két vagy több eritropoietin izoformot tartalmazó készítmények is. A találmány egyik megvalósítási módjában a készítmények eritropoietin-molekulánként előre meghatározott sziálsavak számánál több sziálsavat tartalmazó izoformok elegyét tartalmazzák, például eritropoietin-molekulánként 11-nél több sziálsavat vagy molekulánként 12-nél több sziálsavat tartalmazó izoformokat, például a 12., 13., és 14. izoformok elegyét tartalmazzák. A találmány egy másik megvalósítási módjában a készítmények eritropoietin-molekulánként előre meghatározott számú sziálsavat tartalmazó izoformok elegyét tartalmazzák, például eritropoietin-molekulánként 12-nél kevesebb, de 8nál több sziálsavat tartalmazó izoformokat, mint például a 9., 10., 11. izoformok elegyében. A találmány kiteljed olyan eritropoietin-készítményekre is, amelyekben az izoformok relatív mennyisége azonos vagy különböző. A 9., 10., 11. izoformok elegyében például az izoformok különböző arányban fordulhatnak elő, például 1:1:1,2:3:1 vagy 20:20:1 arányban. Előnyösen, a készítmények kevesebb mint négy izoform, például all., 12. és 13. izoformok vagy a 12. és 14., vagy a 7. és 13. izoformok elegyét tartalmazzák.

Az eritropoietin izoformok elegyének előállítása céljára a találmány tárgya egyidejűleg kiterjed kiválasztott eritropoietin izoformok izolálására szolgáló eljárásokra is. Ezek az eljárások magukban foglalják egyedi izoformok izolálását olyan eljárásokkal, mint preparatív izoelektrofokuszálás, vagy ioncserélő kromatográfiával, illetve kromatofokuszálással molekulánként előre meghatározott számú (például 11-nél több) sziálsavat tartalmazó izoformok elegyének előállítását. A fenti technikák mindegyike a proteineknek töltésük alapján való szétválasztásán alapul.

Általában az ioncserélő kromatográfia és kromatofokuszálás esetében vagy nyers humán eritropoietint (sejttenyésztő folyadékot) vagy tisztított anyagot viszünk fel egy oszlopra olyan feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik az eritropoietin izoformok közül egyeseknek vagy mindnek a kötődését a szemcsékhez. Nyerseritropoietin-készítmények esetében előnyösebb körülbelül pH 7-es érték mellett felvinni a proteint az oszlopra, míg tisztított készítményeknél a proteint pH 7 és körülbelül pH 4 értékek között vihetjük fel az oszlopra. Miután az oszlopot körülbelül pH 4-es érték körüli pufferrel mostuk, az ioncserélő oszlophoz kötődött izoformokat a puffer pH-jának és sókoncentrációjának növelésével, vagy csökkenő pH-jú és növekvő ionerősségű gradiens alkalmazásával, körülbelül pH 4-es érték mellett eluáltuk. Kromatofokuszálásnál az izoformokat az oszlopról csökkenő pH-gradienssel, illetve az oszlop nagy sókoncentrációjú pufferrel való mosásával eluáltuk.

Előnyösen az egyes izoformokat ioncserélő kromatográfiával izoláljuk. A 14. izoformot például a 8. példában ismertetett módon, ioncserélő kromatográfiával izoláltuk. A találmány tárgyát képezik továbbá bizonyos humán eritropoietin analógok. A találmány szerint „humán eritropoietin analóg” a humán eritropoietin aminosavszekvenciájában egy vagy több változtatással rendelkező eritropoietinre vonatkozik, amely változtatás a sziálsavkapcsolódási helyek számának növekedését okozza. Az analógokat hely irányította mutagenezissel állítjuk elő, mely magában foglalja olyan aminosavak addícióját, delécióját, vagy helyettesítését, melyek növelik vagy megváltoztatják a rendelkezésre álló glikozilezési helyek számát. Ezek az analógok a humán eritropoietinnél több szénhidrátláncot tartalmazhatnak.

A találmány szerinti eritropoietin analógok legalább egy további glikozilezési helyet tartalmazó aminosavszekvenciával rendelkeznek. A humán eritropoietinben találhatónál több sziálsavat tartalmazó analógokat olyan glikozilezési helyek hozzáadásával állítjuk elő, amelyek nem zavarják meg a biológiai aktivitáshoz szükséges másodlagos, illetve harmadlagos szerkezetet. Előnyösen, a humán eritropoietin analóg 1,2 vagy 3 további N-, illetve O-glikozilezési helyet tartalmaz, amely 1, 2, illetve 3 további N-kötésű vagy O-kötésű szénhidrátlánc hozzáadását eredményezi. A 69. pozícióban található leucint például aszparaginnal helyettesítve az AsnLeu-Ser szekvenciát kapjuk, amely egy negyedik Nglikozilezési helyet képez. Ilyen változtatással általában molekulánként négy további sziálsav hozzáadását érhetjük el. További O-glikozilezési helyeket képező módosítások például a 125. pozícióban alanin-treonin csere, vagy a 124. és 125. pozíciókban alanin-prolin, illetve alanin-treonin helyettesítések. Előállíthatunk olyan analógokat, amelyek egy vagy több N-kötésű, illetve O5

HU 220 334 Β kötésű láncot tartalmaznak, például az 5. példában ismertetett NO1 és NO2 analógokat. A gyakorlatban járatos személy számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgya kiterjed sok egyéb, további glikozilezési helyeket tartalmazó humán eritropoietin analógra.

A találmány tárgyát képezik továbbá a glikozilezési helyen magasabb szintű szénhidrát-kapcsolódással rendelkező analógok is. Ilyen analógok rendszerint egy vagy több olyan aminosavhelyettesítést tartalmaznak, amelyek egy N-kötésü vagy O-kötésű hely közeli szomszédságában találhatók. Ennek az aminosavmódosításnak az lesz a következménye, hogy az eritropoietinpolipeptid nagyobb részéhez fog szénhidrát kapcsolódni. A glikozilezési helyek lehetnek a természetben előforduló helyek vagy mutációval előállított helyek. Az N13 analógban például nem jön létre további szénhidrátlánc, annak ellenére, hogy egy glikozilezési helyet iktattunk be a 88. pozícióban. Az N14 és N18 analógok azonban, amelyek a 87. pozícióban szerin-, illetve valinhelyettesítést tartalmaznak, a 88. pozícióban egy további szénhidrátláncot hordoznak.

A találmány kiteljed olyan analógokra is, amelyek az eritropoietin karboxi-terminális végén túl egy vagy több aminosavat tartalmaznak, amennyiben a karboxiterminális meghosszabbítással legalább egy további szénhidrát-kapcsolódási hely jön létre. A találmány egyik megvalósítási módjában a humán eritropoietin 166. pozíciójában található argininmaradékhoz a humán koriogonadotropin (HCG) karboxi-terminális 28 aminosavát fuzionáltattuk. A HCG karboxi-terminális fragmense négy O-glikozilezési helyet tartalmaz [Kessler és munkatársai, J. Bioi. Chem., 254, 7909, (1879)].

A 3., 4. és 5. táblázatok olyan eritropoietin analógokat sorolnak fel, amelyek további helyeket tartalmaznak N-kötésű, illetve O-kötésű szénhidrátláncok számára. Az analógokban a humán eritropoietin polipeptidlánc különböző helyein N-kötésű helyek előállítása céljából az Asn-X-Ser/Thr szekvenciát helyettesítettük, vagy O-kötésű helyek előállítása céljából szerin- vagy treoninmaradékokat iktattunk a láncba.

A 6. táblázatban felsoroltuk azokat az analógokat, amelyekben legalább egy további N-kötésű vagy egy további O-kötésű szénhidrátlánc található, illetve egyidejűleg további N-kötésű és O-kötésű szénhidrátláncok találhatók, amelyet SDS-gélen a glikoprotein migrációjával igazoltunk (lásd 7. példa). Amint az a 3-6. táblázatokból kiderül, az egy vagy több szénhidrát-kapcsolódási hellyel rendelkező analógok nem szükségszerűen eredményeznek járulékos szénhidrátláncokat tartalmazó eritropoietin-molekulákat. Például a 123. és a 125. pozícióban a treonin helyettesítése egy további O-kötésű szénhidrátlánc kapcsolódását eredményezi, míg más pozíciókban a szerin vagy treonin helyettesítése nem eredményezett további O-kötésű láncokkal rendelkező analógokat (lásd 4. táblázat). A humán eritropoietin aminosavszekvenciájában a 30., 51., 57., 69., 88., 89., 136. és 138. pozícióban található aszparaginmaradékok helyettesítése azonban a fenti helyeken egy N-kötésű lánc hozzáadódását eredményezte. Egy HCG polipeptidfragmens fúziója a humán eritropoietin 166. pozíciójában található argininmaradékhoz legalább két további O-kötésű szénhidrátlánccal rendelkező eritropoietin -HCG fúziós molekulát eredményezett.

A találmány szerinti eritropoietin analógok kiterjednek legalább egy glikozilezésihely-átrendeződést tartalmazó aminosavszekvenciával rendelkező eritropoietinre is. A találmány szerint „glikozilezésihely-átrendeződés” alatt a humán eritropoietinben egy vagy több glikozilezési hely delécióját, és egy vagy több természetben elő nem forduló glikozilezési hely hozzáadását értjük. Az ilyen átrendeződés példái az RÍ, R2, és R3 analógok, melyeket a 24., 38., illetve 83. pozícióban található N-kötésű helyek deléciójával és a 88. pozícióban egy N-kötésű hely hozzáadásával állítottunk elő. Azonban számos egyéb szénhidrát-kapcsolódási hely átrendeződése lehetséges, és a kapott analógok a humán eritropoietinhez képest rendelkezhetnek több glikozilezési hellyel vagy nem rendelkeznek azzal.

Megvizsgáltuk az RÍ, R2, és R3 analógok in vivő biológiai aktivitását, az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze. A természetben előforduló három Nkötésű hely bármelyikének deléciójával rendelkező eritropoietinben egy N-kötésű lánc beiktatása a 88. Asnpozícióba visszaállította a biológiai aktivitást. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az eritropoietinben a szénhidrátláncok pozícióját a biológiai aktivitásra kifejtett lényeges hatás nélkül meg lehet változtatni alkalmazható analógok előállítása céljából.

A találmány tárgyát képezik továbbá N-kötésű és/vagy O-kötésű láncok számára szolgáló további helyeket tartalmazó eritropoietin analógokat, legalább egy szénhidrátlánc-kapcsolódási hely átrendeződését tartalmazó analógokat, valamint az eritropoietin karboxiterminális végén egy vagy több aminosavmeghosszabbítással rendelkező analógokat kódoló DNS-szekvenciák. A humán eritropoietin DNS-szekvenciájában szénhidrátlánc-kapcsolódási helyek előállítása és módosítása céljából végzett változtatások céljából alkalmazott eljárásokat a 6. példában ismertetjük.

Ezeket az eritropoietin analógokat előállíthatjuk egy exogén DNS-szekvencia expresszálásával, azaz rekombináns DNS-technológiával, illetve lehetnek szintetizált termékek. Exogén DNS-szekvencia lehet cDNS, genomiális DNS vagy egy eritropoietin analógot kódoló, vegyi úton előállított DNS. A találmány tárgyát képezik rekombináns DNS-plazmidok és az említett analógok expresszálására alkalmazható eukarióta gazdasejtek is. Expressziós vektor lehet bármely, egy eukarióta gazdasejtben egy klónozott DNS-szakasz expresszálására képes vektor, előnyösen a COS- és CHO-sejtekben expresszálásra használt vektorok. Ilyen vektorok például 6. példában leírt pEC és pDEdelta plazmidok. Az eritropoietin analógokat expresszáló COS- és CHO-gazdasejtek tenyésztését a gyakorlatban járatos személy számára ismert eljárásokkal végeztük.

Az eritropoietin analógokból származó izolált izoformokat és izoformok elegyét a humán eritropoietin izoformok előállítására fent ismertetett eljárásokkal állítottuk elő. Ezek az eljárások magukban foglalhatnak izoelektrofokuszálást, ioncserélő kromatográfiát és kroma6

HU 220 334 Β tofokuszálást. Előnyösen, eritropoietin analógokból származó egyes izoformok, illetve izoformok elegyének előállítására ioncserélő kromatográfiát alkalmazunk.

Az eritropoietinben a szénhidrátláncok, tehát az eritropoietin-molekulában található sziálsavak számának növelése előnyös tulajdonságokat, például fokozott oldékonyságot, proteolízissel szemben mutatott nagyobb ellenállást, csökkent immunogenitást, megnövekedett felezési időt a szérumban, valamint fokozott biológiai aktivitást kölcsönözhet a molekulának.

Eritropoietin analógokat expresszáló CHO-sejtekből származó sejttenyésztő folyadékot vizsgáltunk in vivő biológiai aktivitásra nézve, az eredményeket a 6. táblázat mutatja. Néhány vizsgált analóg aktivitása 3szor nagyobb volt, mint a humán eritropoietiné. Közelebbről, a 30. vagy a 88. pozícióban egy további Nkötésű szénhidrátlánc-kötődési helyet tartalmazó analógok a humán eritropoietin aktivitásánál 2-3-szor magasabb aktivitást mutattak, míg a humán eritropoietinnek egy HCG polipeptid ffagmenssel való fúziója eredményeképpen további O-kötésű láncokat tartalmazó analógok legalább 2-szer nagyobb aktivitással rendelkeztek. Két, további szénhidrátláncokat tartalmazó eritropoietin analógot tisztítottunk és különböző sziálsavtartalmú izoformelegyeket izoláltunk (lásd 8. táblázat). A Thr¹²⁵és Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ (EPO N14) analógokat három különböző izoformfrakcióra választottuk szét, és meghatároztuk mindhárom frakció in vivő biológiai aktivitását. A 8. táblázatban bemutatott eredmények szerint a nagyobb sziálsavtartalmú EPO N14 izoformfrakciók nagyobb in vivő aktivitással rendelkeznek.

Az EPO N14 analóg nagy sziálsavtartalmú izoformjainak frakcióját, valamint rekombináns eritropoietint (9-14. izoformokat) receptorkötési esszékben, farmakokinetikai kísérletekben, valamint egerek megnövekedett hematokritértékeinek meghatározására szolgáló kísérletekben vizsgáltunk. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei arra utalnak, hogy közvetlen kapcsolat áll fenn a sziálsavtartalom, a kiürülés felezési ideje, és a kezelt egerekben a hematokritérték növelésének képessége között. Tehát, amint azt a 13., 14. valamint 15. ábra mutatja, a nagy sziálsavtartalmú EPO N14 izoformfrakció lényegesen hosszabb in vivő felezési idővel rendelkezett és nagyobb fokú hematokritemelkedést hozott létre, mint akár az izolált 14. izoform, akár a rekombináns humán eritropoietin, annak ellenére, hogy a nagy sziálsavtartalmú EPO N14 izoformffakció nem kötődött olyan erősen a receptorhoz.

A találmány kiterjed továbbá emlős eredetű (például kínaihörcsög-ovarium, CHO) gazdasejtekre, amelyek előnyösen molekulánként meghatározott számú sziálsavnál többet, például molekulánként 10 sziálsavnál többet tartalmazó humán eritropoietin izoformokat vagy eritropoietin analóg izoformokat szintetizálnak. Az eritropoietin-molekulákban található N-kötésű és Okötésű oligoszacharidstruktúrák korlátozhatják a molekula sziálsavtartalmát. Például a „négyantennás” (négyágú) N-kötésű oligoszacharidok legtöbbször négy lehetséges sziálsavkapcsolódási helyet szolgáltatnak, míg a két-, illetve „háromantennás” oligoszacharidláncokhoz, amelyek az aszparaginkötésű helyeken helyettesíthetik a „négyantennás” formát, általában legfeljebb két vagy három sziálsav kapcsolódik. Az O-kötésű oligoszacharidok általában két sziálsavkapcsolódási helyet szolgáltatnak. Az eritropoietin-molekulák tehát összesen 14 sziálsavmaradékkal rendelkezhetnek, feltéve ha mind a három N-kötésű oligoszacharid „háromantennájú”. Emlős eredetű sejttenyészeteket vizsgáltunk arra nézve, hogy mely sejtek adnak főként négyantennájú láncokat a rekombináns eritropoietinhez, ily módon maximalizálva a sziálsavkapcsolódási helyek számát.

A vizeletből származó eritropoietin N-kötésű oligoszacharidjai mind alfa-2,3, mind alfa-2,6 kötésű galaktózhoz kötött sziálsavakat tartalmaznak [Takeuchi és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263, 3657, (1988)]. Az alfa-2,3 kötésű sziálsav tipikusan a mannóz alfa-1,6 ágon kapcsolódik a galaktózhoz, az alfa-2,6 kötésű sziálsav tipikusan a mannóz alfa-1,3 ágon kapcsolódik a galaktózhoz. Ezeket a sziálsavakat hozzáadó enzimek (béta-galaktozid alfa-2,3-szialiltranszferáz és béta-galaktozid alfa-2,6-szialiltranszferáz) a mannóz alfa-1,6, illetve mannóz alfa-1,3 ágon adnak leghatékonyabban sziálsavat az oligoszacharidokhoz. Rekombináns glikoproteinek, ezen belül rekombináns eritropoietin előállítására leggyakrabban alkalmazott gazdasejtek a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) defficiens kínaihörcsögovarium- (CHO-) sejtek. Ezek a sejtek nem expresszálják a béta-galaktozid alfa-2,6-szialil-transzferáz enzimet, ezért nem adnak az alfa-2,6 kötésben sziálsavat az ezekben a sejtekben előállított glikoproteinek N-kötésű oligoszacharidjaihoz [Mutsaers és munkatársai, Eur. J. Biochem., 156, 651, (1986), Takeuchi és munkatársai, J. Chromatogr., 400, 207, (1987)]. A CHO-sejtekben előállított rekombináns eritropoietinben tehát nem található galaktózhoz 2,6 kötésben kapcsolódó sziálsav [Sasaki és munkatársai, (1987), lásd fent, Takeuchi és munkatársai, (1987), lásd fent].

A találmány egy másik megvalósítási módjában humán eritropoietint vagy eritropoietin analógot állítunk elő funkcionális béta-galaktozid alfa-2,6-szialil-transzferáz génnel transzfektált CHO-sejtekben, hogy az alfa-2,6 kötésben a galaktózhoz sziálsav kapcsolódjon. A kapott izoformok mind alfa-2,3, mind alfa-2,6 kötésben galaktózhoz kötött sziálsavat fognak tartalmazni. Lásd Lee és munkatársai, J. Bioi. Chem., 264, 13848, (1989), melyet módosított CHO-sejtek, illetve egyéb módosított, emlős eredetű gazdasejt előállítására szolgáló eljárásokat ismertető szakirodalmi helyként mellékelünk.

A találmány kiteljed egy adott izoform vagy izoformok elegyének terápiásán hatékony mennyiségét, valamint egy szokásos hígítóanyagot, adjuvánst és/vagy az eritropoietinterápiában alkalmazható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekre is. Szintén a találmány tárgyát képezi egy eritropoietin analóg terápiásán hatékony mennyiségét, valamint egy szokásos hígítóanyagot, adjuvánst és/vagy hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények. A találmány szerint „terápiásán hatékony mennyiség” alatt azt a mennyiséget értjük, amely az adott feltételek és adagolási mód mellett

HU 220 334 Β terápiás hatással rendelkezik. A humán eritropoietin vagy eritropoietin analóg izoformokat előnyösen parenterálisan adagoljuk. A választott adagolási mód függ a kezelt állapotától. A humán eritropoietin vagy eritropoietin analóg izoformokat előnyösen egy olyan készítmény részeként adagoljuk, amely egy megfelelő hordozóanyagot, például humán-szérumalbumint, egy szokásos hígítóanyagot, például pufferolt sóoldat, és/vagy egy szokásos adjuvánst is tartalmaz. A szükséges adag a beteg hematokritértékének emeléséhez elegendő mennyiség, és a beteg állapotának súlyosságától, az adagolás módjától és hasonlóktól függően változik.

Az alábbi példák a találmány szerinti megoldás alaposabb szemléltetését szolgálják, a korlátozás szándéka nélkül. A példákban alkalmazott in vivő eritropoietin bioesszékben felhasznált eritropoietin standard egy rekombináns eritropoietin standard, amelyet egy részlegesen tisztított vizelet eredetű eritropoietin standarddal szemben standardizáltunk. Tehát csak relatív in vivő fajlagos aktivitásokat mértünk. Az in vivő fajlagos aktivitásokat „egység/ml”, „egység/mg”, illetve egység/A₂₈₀mértékegységben fejeztük ki és nem IU/ml, lU/mg, illetve IU/A₂₈₀ egységekben, mivel az alkalmazott eritropoietin standardot nem viszonyítottuk közvetlenül valamely létező nemzetközi standardhoz.

1. példa

Rekombináns eritropoietin izoformok izolálása

Rekombináns eritropoietint Lin szerint állítottunk elő (lásd fent). Az első és harmadik izoformizolálásokhoz kiindulási anyagként felhasznált rekombináns eritropoietint a 2. példában leírtak szerint, Lai és munkatársai módszerével (lásd fent) tisztítottuk. A második és ötödik izoformizolálásokhoz felhasznált kiindulási anyagot Q-Sepharose-kromatográfia-módosítással, egyébként Lai és munkatársai szerint tisztítottuk (lásd fent). Ezek a készítmények vizelet eredetű humán eritropoietin aminosavszekvenciájával megegyező szekvenciával rendelkező rekombináns eritropoietin izoformok elegyét és elsősorban a 9-14. izoformokat tartalmazzák. A negyedik izoformkészítményhez kiindulási anyagként a 2. példában ismertetett módon, Lai és munkatársai szerinti anioncserélő oszlopról 5 mmol/1 ecetsav/1 mmol/1 glicin/6 mol/1 ureatartalmú oldattal történő eluálás közben lejövő anyagot használtuk fel. Ez a frakció 9-nél kevesebb, illetve 9 sziálsavval rendelkező izoformokat tartalmazott, és azt gélszűréses kromatográfiával a 2. példában ismertetett módon, Lai és munkatársai szerint tovább tisztítottuk, mielőtt azt a preparatív izoelektrofokuszálási eljárásban felhasználtuk. A hatodik izoform készítményhez kiindulási anyagként 4-13. sziálsavmaradékot tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint használtunk. Ezt az anyagot a 2. példában ismertetett módon, Lai és munkatársai szerint tisztítottuk, azzal az eltéréssel, hogy az ioncserélő oszlopot módosítottuk (a rekombináns eritropoietin eluálását pH 4,8 érték mellett, nátrium-kloriddal végeztük, és elhagytuk az ecetsav/urea mosást), amely a kiindulási anyagban található legtöbb izoform visszatartását eredményezte.

Egy granulált gélágyban (Ultrodex, LKB) végzett izoelektrofokuszálással hat különböző egyedi izoformot tartalmazó készítményt állítottunk elő lényegében az LKB 198. számú alkalmazási utasítása szerint. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolitokat használtunk, a gélágy 5 mol/1 ureát tartalmazott.

Az első készítményben a gélre 6,8 ml, 20 mmol/1 nátrium-citrát/100 mmol/1 nátrium-klorid (pH 7,0) oldatban körülbelül 20 mg rekombináns eritropoietint vittünk fel a gélre, és 8 watt mellett, körülbelül 16 órán keresztül fókuszáltuk. Az izoelektrofokuszálást követően, a gélben található izoformcsíkokat a gélágy papírlenyomatával tettük láthatóvá. A lenyomat elkészítése után azt 3-szor cserélt (mindegyik körülbelül 10 percig, szobahőmérsékleten) fixálóoldattal (40% metanol/10% ecetsav/10% TCA/3,5% szulfoszalicilsav) itattuk át, egyszer (körülbelül 10 percig) 40% metanol/10% ecetsav (30-60 °C) elegyével kezeltük, 15 percig 60 °C-on 0,125% Coomassie Blue R-250/40% metanol/10% ecetsav elegyével festettük, a felesleges festéket a szétválasztott izoformok láthatóvá tétele céljából 7,5% metanol/10% ecetsav keverékével eltávolítottuk. A granulált gélágy izoformokat tartalmazó részét (a gélszemcsék körülbelül 50%-át) eltávolítottuk, ehhez vizet adtunk (körülbelül 16 ml), majd a zavaros elegyet egy

5.5 χ 24,5 inch méretű tálcába öntöttük és a nettó tömeg körülbelül 40%-ára bepároltuk. Ezt a készítményt másodszor is fókuszáltuk, és a gélről az előbbiek szerint lenyomatot készítettünk. A hat elkülöníthető izoform mindegyikét tartalmazó gélrészt eltávolítottuk a gélágyból.

A gélből az izoformok eluálása céljából mindegyik izoformhoz 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) 5 mmol/1 Chaps elegyét adtuk, hogy sűrű félfolyékony elegyet kapjunk, a sűrű elegyeket kis méretű oszlopokba öntöttük, és a Tris-Chaps-pufferrel mostuk. Az átfolyó puffért összegyűjtöttük, és külön-külön kis méretű, 20% etanol/10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferrel ekvilibrált Vydac C4 reverz fázisú gélszemcséket tartalmazó oszlopokra vittük fel. Az oszlopokat fokozatosan eluáltuk 20% etanol/10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0), 35% etanol/10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0), valamint 65% etanol/10 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferekkel. A 65% etanol/10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferrel eluálódó frakciót 1:1 arányban 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferrel hígítottuk, koncentráltuk majd Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátor alkalmazásával a puffért 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferre cseréltük. Ezt a készítményt analitikai izoelektrofokuszálásnak vetettük alá lényegében a 250. számú LKB technikai utasítás szerint, egy 5 mol/1 ureát tartalmazó poliakrilamid-gélben, Servalyte 3-5 ampholinek (Serva) felhasználásával.

Egy második készítménynél körülbelül 6,5 ml deionizált vízben 26 mg rekombináns eritropoietint vittünk a gélre és 2,5 watt mellett, 35 percig, majd 10 watt mellett, körülbelül 17 óráig fókuszáltuk. A gélágyon látható fókuszált proteineket 11 különböző frakcióban távolítottuk el. Mindegyik frakciót deionizált vízzel körülbelül

7.5 ml-re egészítettünk ki, és a kapott frakciók mindegyi8

HU 220 334 Β kének felülúszójából 20 mikrolitert a fentiek szerint analitikai izoelektrofokuszálásnak vetettünk alá. Mindegyik frakcióhoz 5 ml 1,5 mol/1 Tris-HCl (pH 8,8) puffért adtunk, és a félfolyékony elegyeket kis méretű oszlopokba töltöttük és a folyékony fázist hagytuk átfolyni. A gélszemcséket körülbelül háromszoros térfogatú 0,5 mol/1 Tris-HCl (pH 7) pufferrel mostuk és a mosópuffert az átfolyó frakcióhoz adtuk. Az eluálódott oldatot koncentráltuk és a puffért 10000 D molekulatömegig áteresztő Amicon márkájú eldobható ultraszűrő eszközzel 20 mmol/1 nátrium-citrát/100 mmol/1 nátrium-klorid (pH 7,0) pufferre cseréltük. Ezután a koncentrált oldatokat (körülbelül 0,5 ml) egy 0,22 mikron méretig áteresztő cellulóz-acetát szűrőn szűrtük. Az analitikai izoelektrofokuszálás alapján öt frakció főként egyetlen izoformot, a 10., 11., 12., 13. és 14. izoformokat tartalmazta. Egy harmadik készítménynél körülbelül 21,8 ml desztillált vízben 30 mg rekombináns eritropoietint vittünk a gélre és 2 watt mellett, 25 percig, 10 watt mellett, 20 óráig, majd 15 watt mellett, 15 percig fókuszáltuk. Az egyes izoformoknak megfelelő proteincsíkokat megfigyeltük, és eltávolítottak a gélágyból. A gélen izolált izoformokhoz desztillált vizet adtunk, hogy sűrű félfolyékony elegyet kapjunk, és a kapott felülúszókat analitikai izoelektrofokuszálással vizsgáltuk. Mindegyik elegyhez egyenlő térfogatú 1 mol/1 Tris-HCl (pH 7,2) puffért adtunk, a szuszpenziókat külön kis méretű oszlopokba töltöttük, és a folyékony fázist az izoformok eluálása céljából hagytuk átfolyni az oszlopon. Mindegyik átfolyó frakciót koncentráltuk és a puffért 10000 D molekulatömegig áteresztő Amicon márkájú eldobható ultraszűrő eszközökkel 20 mmol/1 nátrium-citrát/100 mmol/1 nátrium-klorid (pH 7,0) pufferre cseréltük. Analitikai izoelektrofokuszálógélen azt láttuk, hogy a kapott frakciók főként a 9., 10., 11., 12., 13. és 14. elkülönített izoformokat tartalmazták.

Egy negyedik izoformkészítményhez kiindulási anyagként (a fent ismertetettek szerint előállított) 3-9. izoformokat tartalmazó eritropoietint használtunk. A lényegében az 1-3. készítmények esetében alkalmazott módon végzett preparatív izoelektrofokuszálást megelőzően az amfolitokat (Pharmalyte 2,5-5) egy Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA) folyékony fázisú izoelektrofokuszáló cellában frakciókra bontottuk, hogy a kiindulási anyag alacsonyabb izoelektromos pontjának inkább megfelelő amfolit eloszlást kapjunk. Az előfrakcionálást oly módon végeztük, hogy 6,7 ml Pharmalyte 2,5-5-öt, valamint 15 gramm ureát elegyítettünk és a térfogatot desztillált vízzel 50 ml-re egészítettük ki. Ezt az elegyet a Rotofor készülékben frakcionáltuk 10 watt mellett, 1 °C-on, 5 1/2 óráig, anolytként, illetve katolytként 0,1 mol/1 foszforsav, illetve 0,1 mol/1 nátriumhidroxid alkalmazásával. A mért pH-értékek alapján a

4,5 és körülbelül 6 közötti amfolitfrakciókat használtuk a laposágyú izoelektrofokuszálásnál.

Az amfolitokat az izoformoktól egy 10000 D molekulatömegig áteresztő Centrieluter (Amicon) készülékkel távolítottak el, az alábbi paraméterek alkalmazása mellett: 0,18 Tris puffer (pH 8,8), 100 volt, 25-30 mA, 3 óra. Az izoformokon a puffért Sephadex G-25 (Pharmacia) oszlopon végzett gélszűréssel 0,1 mol/1 nátriumkloridra cseréltük. Az így kapott öt frakció analitikai izoelektrofokuszálása azt mutatta, hogy azok a 4., 5., 6., 7., és 8. izoformokat tartalmazzák. A 4. izoform több csíkot adott, ami arra utal, hogy bizonyos mértékű lebomláson ment keresztül.

Az ötödik izoformkészítmény esetében módosításként egy előfokuszálási lépést adtunk a laposágyú izoelektrofokuszálási eljáráshoz. Ennél a módosításnál nem adtuk a proteint az elektroforézist megelőzően az amfolit/urea/gél elegyhez, hanem azután vittük az izoelektrofokuszáló berendezésre, miután a gélágyban kialakult a pH-gradiens. 75 percig végzett elő-fokuszálást követően (1500 volt-óra) a katódtól 2,25-4,25 cm-re található gélrészt eltávolítottak, elkevertük az eritropoietin-oldattal, és visszatöltöttük a gélágyba. Az izoelektrofokuszálást követően a 1., 11., 12., 13. és 14. izoformokat eluáltuk a gélágyból, és Centricon-10 (Amicon) készülékekkel végzett ultraszűréssel elválasztottuk az amfolitektől. Az előfokuszálási módosítást azért végeztük, hogy az izoformkészítmények ultraviola abszorpciós jellemzői jobban hasonlítsanak a kiindulásként használt rekombináns eritropoietinéhez. Az izolált izoformok spektrális sajátságainak előnyös változása 280-260 nanométer között látható. A 2. és 3. (nem előfokuszált) izoformkészítmények 280 nanométeren és 260 nanométeren mért abszorpcióinak aránya (A₂₈(/A₂₆₀) átlagosan 1,36+-0,11, míg az 5. és 6. (előfokuszált) készítmények abszorpcióinak aránya (A₂₈₀/A₂₆₀) átlagosan 1,68+-0,20. Ha a 14. számú készítményt kihagyjuk a számításból a 2. és 3., illetve 5. és 6. készítmények abszorpcióinak aránya (A_28O/A_26O) átlagosan 1,39+-0,11, illetve 1,74-1—0,09. (A 14. számú izoform rendelkezhet a legkevésbé tipikus spektrummal, mivel ez van a legkisebb mennyiségben jelen, így nyomokban található amfolitkomponens-szennyeződések sokkal inkább okozhatnak interferenciát, valamint a laposágyú izoelektrofokuszálás során ez van legközelebb az elektródhoz). A 2. példában ismertetett módon, Lai és munkatársai szerint (a korábbiakban leírt módosítással, anioncsere gélszemcsékként Q-Sepharose alkalmazásával) előállított rekombináns eritropoietin (A₂₈₀/A₂₆₀) aránya átlagosan 1,91 + -0,04.

Amint azt a fentiekben leírtuk, a 6. készítmény kiindulási anyagaként a 4-13. izoformokat tartalmazó rekombináns eritropoietint használtunk. Az amfolitokat a negyedik készítménynél alkalmazott módszerrel, egy Rotofor készülékben előfokuszáltuk. A mért pH-értékek alapján a 3,7 és 4,8 közötti amfolitfrakciókat használtuk a laposágyú izoelektrofokuszálásnál. A lapos gélágyat az 5. futtatáshoz hasonló módon előfokuszáltuk, és a hordozó amfolitek eltávolítása céljából végzett ultraszűrést követően a 9., 10., 11., 12 és 13. izoformokat nyertük.

2. példa

Rekombináns eritropoietin izoformok sziálsavtartalma

Az 1. példa szerint izolált izoformok és a Lai és munkatársai szerinti eljárásokkal (lásd fent) tisztí9

HU 220 334 B tott eritropoietin (9-14. izoformok elegye) pufferét 0,10-0,15 mol/1 nátrium-kloridra cseréltük és Jourdian és munkatársai eljárásával [J. Bioi. Chem., 246, 430, (1971)] meghatároztuk azok sziálsavtartalmát. A sziálsavmaradékokat 0,35 mol/1 kénsavval, 80 °C-on, 30 per- 5 cig végzett hidrolízissel lehasítottuk a glikoproteinről, és az oldatot vizsgálat előtt nátrium-hidroxiddal neutralizáltuk. A jelen levő eritropoietin mennyiségének meghatározása céljából standardként a humánt eritropoietin aminosavszekvenciájával rendelkező rekombináns éri- 10 tropoietin felhasználásával Bradford-féle proteinesszét [Bradford Anal. Biochem., 72, 248, (1976)] végeztünk, a Bio-Rad által forgalmazott vizsgálati reagensek és mikromódszer alkalmazásával. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze, és egy mól eritropoietin- 15 ben található szlálsavmólok számában adtuk meg. Az izoformokat a molekulában található sziálsavak száma alapján és a legkevésbé savastól (9. izoform) a legsavasabbig (13. izoform) jelöltük.

A 9-13. izoformokat az 1. ábrán a 6-10. csíkok mu- 20 tátják. A 14. izoform mennyisége nem volt elegendő a sziálsavtartalom pontos meghatározásához. Ennek az izoformnak a sziálsavtartalmára az izoelektrofokuszáló gélen a többi izoformhoz viszonyított migrációja alapján következtettünk. Az 5-8. izoformok (4. számú ké- 25 szítmény) sziálsavtartalmát nem mértük, de hasonló módon következtettünk rá az izoelektrofokuszáló gélen való migrációjuk alapján.

1. táblázat

Eritropoietin izoform	Mól sziálsav/mol eritropoietin
izoform 13	12,9±0,5
izoform 12	ll,8±0,2
izoform 11	ll,0±0,2
izoform 10	9,8±0,3
izoform 9	8,9±0,6
izoformelegy (9-14)	11,3 ±0,2

3. példa

Rekombináns eritropoietin izoformok aktivitása Az 1. példa szerint izolált izoformokat 280 nanométeren mért abszorpció mérésével, Bradford-féle protein- 45 esszével, valamint RIA eljárással vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a bennük található rekombináns eritropoietin mennyiségét. A relatív in vivő aktivitást exhipoxiás policitémiás egérbioesszével határoztuk meg [Cotes és munkatársai, Natúré, 191, 1065, (1961)]. Az eritropoietin radioimmunesszé alapján az eritropoietin proteinmennyiségének meghatározásánál bizonyos izoformok esetében magasabb relatív in vivő fajlagos aktivitást kaptunk, mivel a nagy mennyiségű sziálsavat tartalmazó izoformok immunreaktivitása nyilvánvalóan csökkent, ami a leginkább negatív izoformoknál az eritropoietin koncentráció alábecsüléséhez és így a relatív in vivő fajlagos aktivitás túlbecsüléséhez vezet. Az egység ml-ben kifejezett egérbioesszé-meghatározás eredményeit elosztottuk a megfelelő proteinkoncentrációkkal, hogy egység/mg eritropoietin polipeptidben kifejezve megkapjuk az in vivő fajlagos aktivitást. Az említett fajlagos aktivitásokat a 2. táblázat mutatja.

A 2. táblázatban „n” a fajlagos aktivitás értékéhez hozzájáruló független izoformkészítmények számát jelöli. A legtöbb esetben mindegyik izoformkészítménynyel több in vivő vizsgálatot végeztünk. A fajlagos aktivitást mindhárom oszlopban ugyanazon in vivő eredmények alapján számítottuk, az egység/mg-ban kifejezett eritropoietin-polipeptid-koncentrációt a 280 nanométeren mért abszorpció, a radioimmunesszé-potenciálok, valamint a Bradford-féle proteinesszé eredményei segítségével határoztuk meg. A Bradford-féle proteinesszében a 9-14. izoformokat tartalmazó tisztított rekombináns eritropoietint használtunk standardként. A Bradford-féle proteinesszénél végzett számításoknál „n” az előzőeknél kisebb lehet, mivel néhány készítményből már nem állt több rendelkezésre a Bradfordesszé kivitelezésekor. A RIA és az in vivő esszék esetében Lai és munkatársai eljárásai szerint tisztított (lásd fent) és a 9-14. izoformokat tartalmazó eritropoietin elegyet használtunk standardként.

Az egység/mg eritropoietin polipeptidben megadott fajlagos aktivitást kifejezhetjük egység/A_28O értékben oly módon, hogy azt 0,807 mg eritropoietin polipeptid/A₂₈₀-nal megszorozzuk. A konverziós faktort úgy kaptuk, hogy az eritropoietin extinciós koefficiensét (1,345 mg/A₂₈₀) megszoroztuk az eritropoietin-glikoprotein proteintartalmával (a tömeg körülbelül 60%-a, Davis és munkatársai, Biochemistry, 26, 2633, (1987)], hogy megkapjuk a mg eritropoietin-polipeptid/A_2g0 értéket (azaz, 1,345 mg eritropoietin/A₂₈₀xO,60 mg polipeptid/mg eritropoietin=0,807 mg polipeptid/A₂₈₀). Ezenkívül az egység/mg eritropoietin polipeptidben kifejezett fajlagos aktivitást megszorozhatjuk a 0,60 mg polipeptid/mg eritropoietin-glikoprotein-faktorral, hogy egység/mg eritropoietin-glikoproteinben kifejezett fajlagos aktivitásokat kapjunk.

2. táblázat

Izoform	E/mg polipeptid (Bradford-proteinesszé)	n	E/mg polipeptid (A 280-ból)	n	E/mg polipeptid RIA-ból	n
14	289,400±3,100	2	205,800±37,700	2	366,700±55,900	2
13	307,600±30,600	4	258,700±59,500	5	337,200±40,200	5
12	275,200±55,600	4	258,400±41,700	5	287,700±42,600	5
11	282,700±41,100	3	255,800±67,300	4	251,400±62,700	4

HU 220 334 B

2. táblázat (folytatás)

Izoform	E/mg polipeptid (Bradford-proteinesszé)	n	E/mg polipeptid (A 280-ból)	n	E/mg polipeptid RIA-ból	n
10	188,000± 1,900	1	170,300±34,500	3	171,900±31,600	3
9	-		96,600±46,700	2	113,600±39,600	2
8	65,200±3,800	1	70,600±4,100	1	61,000±3,500	1
7	46,200±5,800	1	50,300±6,300	1	42,800±5,400	1
5	16,600± 1,700	1	18,300±l,900	1	15,500± 1,600	1

A 2. táblázat eredményeit a 2A), 2B) és 2C) ábrákon grafikusan is ábrázoltuk. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az eritropoietin relatív in vivő aktivitása all. izoformig a sziálsavtartalom függvényében növekszik. A 11-14. izoformok lényegében azonos relatív in vivő bioaktivitással rendelkeznek. (Ez különösen nyilvánvaló, ha a 14. számú izoform koncentrációját a Bradfordféle vizsgálat értékeivel fejezzük ki. A Bradford-féle érték a 14. izoform esetében sokkal pontosabban tükrözheti a valós koncentrációt az általában alacsony koncentrációk, a A_2s0 nanométeren végzett meghatározás nehézségei, valamint a RIA módszerben az előbb említett, nagy mértékben negatív töltésű formáknál tapasztalt szembetűnő reaktivitáscsökkenés miatt.) A több sziálsavat tartalmazó eritropoietin izoformok nagyobb relatív in vivő fajlagos aktivitása legvalószínűbben annak a következménye, hogy ezeknek a formáknak hosszabb a keringési fél életideje. A 9. és 13. izoformokat radioaktív jóddal (¹²⁵J) jelöltük, és patkányokban meghatároztuk a kiürülés mértékét. A 13. izoform esetében a keringési fél életidő lényegesen hosszabb volt, mint a 9. izoform esetében.

4. példa

Rekombináns eritropoietin izoformelegyek kiválasztása Q-Sepharose kromatográfiával Lin eljárása szerint (lásd fent) rekombináns eritropoietin előállításából származó sejttenyésztő folyadékot koncentráltunk és 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) pufferrel szemben dializáltunk. A proteinkoncentrációt Bradfordféle mikroproteinesszével határoztuk meg, standardként szarvasmarha-szérumalbumint használtunk. 40 mg összproteint tartalmazó 19,6 ml oldatot CuSO₄-ban 20 mikromól/1 koncentrációra állítottunk be, egy 0,45 mikron szemcsenagyságig áteresztő szűrőn szűrtük, és egy 4 ml térfogatú (1,05 cm magas χ 2,2 cm átmérőjű) Q-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra vittük fel, amelyet 10 mmol/1 Tris (pH 6,8-7,0), (4 °C) pufferrel ekvilibráltunk. A minta felvitelét követően az oszlopot ugyanazon puffer kétszeres oszloptérfogatával mostuk. Az oszlopon az átfolyás sebessége körülbelül 1 ml/perc volt. Ennek az eljárásnak az alkalmazásával hat külön oszlopot készítettünk meghatározott eritropoietin izoformokat tartalmazó izoformelegyek kiválasztása céljából.

Az oszlopokat 6-9 oszloptérfogatnak megfelelő alacsony pH-értékű pufferrel mostuk, melyek összetétele az alábbi volt: az 1. oszlop esetében 150 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 urea, a pH-t NaOH-dal 4,7-re állítottuk be, a 2. oszlopnál 200 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1

CuSO₄, 6 mol/1 urea, a pH-t NaOH-dal 4,7-re állítottuk be, a 3. oszlopnál 250 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 urea, a pH-t NaOH-dal 4,7-re állítottuk be, a 4. oszlopnál 300 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 urea, a pH-t NaOH-dal 4,7-re állítottuk be, az 5. oszlopnál 150 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 urea, a 6. oszlopnál 300 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 urea. Az oszlopok pH-ját körülbelül pH 7-re növeltük oly módon, hogy mindegyiket 8-11 oszloptérfogatnak megfelelő térfogatú 10 mmol/1 Tris-HCl, 55 mmol/1 NaCl, 20 mikromól/1 CuSO₄, (pH 7) pufferrel mostuk. A meghatározott összetételű eritropoietin izoformelegyeket az oszlopokról 10 mmol/1 Tris-HCl, 140 mmol/1 NaCl, 20 mikromól/1 CuSO₄, (pH 7,0) tartalmú pufferrel eluáltuk.

Az egyes oszlopokról nyert izoformfrakciókat koncentráltuk és az oldatukat egy Amicon Centricon-10 mikrokoncentrátor segítségével vízre cseréltük. Ezeknek a koncentrált frakcióknak az analitikai izoelektrofokuszálási eredményeit a 3. ábra mutatja. Az 1-6. csíkok az 1-6. oszlopokról eluált, meghatározott összetételű eritropoietin izoformelegyeket képviselnek. A 3. ábra jobb széli gélcsíkján bemutatott „izoformelegy” a fentiek szerint egy Q-Sepharose oszlopra felvitt sejttenyésztő folyadékot tartalmazott, az oszlopot 5 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 ureatartalmú pufferrel mostuk, és az eritropoietin izoformelegyet az előbbiekben leírt eljárással eluáltuk az oszlopról. Ezt az eluált izoformelegyet az analitikai izoelektrofokuszálást megelőzően Lai és munkatársai eljárása szerint (lásd fent) tovább tisztítottuk.

5. példa

Rekombináns eritropoietin izoformok frakcionálása

Q-Sepharose oszlopon, alacsony pH-gradienssel

Egy másik eljárás szerint eritropoietin izoformokat csökkenő pH és növekvő ionerősségű gradienssel választottunk szét. Az eritropoletint tartalmazó koncentrált és dializált tápfolyadékot kb 40 mg összprotein/ml gél arányban egy Q-Sepharose oszlopra vittük fel. Ezután az oszlopot körülbelül kétszeres oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferrel, majd körülbelül 10-szeres oszloptérfogatnak megfelelő 2 mmol/1 ecetsav, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄, 6 mol/1 ureatartalmú pufferrel (pH körülbelül 4,8) mostuk a kontamináló proteinek és körülbelül 7-nél kevesebb sziál11

HU 220 334 Β savmaradékot tartalmazó eritropoietin izoformok eltávolítása céljából. A körülbelül 8-12 sziálsavat tartalmazó izoformokat az oszlopról egy olyan gradienssel eluáltuk, amely kezdetben 2 mmol/1 ecetsav, 6 mol/1 urea, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO4-tartalmú puffért tartalmazott és 40 mmol/1 ecetsav, 6 mol/1 urea, 1 mmol/1 glicin, 20 mikromól/1 CuSO₄ (pH körülbelül 4) tartalmú pufferrel fejeződött be. A gradiens teljes térfogatát, körülbelül 40 oszloptérfogatnak megfelelő oldatot és egyenként körülbelül egy oszloptérfogatnak megfelelő frakciókat olyan edényekbe gyűjtöttünk, amelyek elegendő térfogatú Tris-puffert tartalmaztak ahhoz, hogy a pHt 6-8,5 közé állítsuk be abból a célból, hogy az összegyűjtött frakciókat ne tegyük ki hosszú ideig alacsony pH-nak. A frakciókból egyenlő térfogatú mintákat analitikai izoelektrofokuszálással vizsgáltunk a szétválasztás monitorozása céljából. A 4. ábra a 8-11. izoformoknak ezzel az eljárással elérhető szétválasztását mutatja. A 12-14. izoformokat, amelyek a gradiens végén az oszlophoz kötődve maradtak, 10 mmol/1 Tris-HCl, 140 mmol/1 NaCl, 20 mmol/1 CuSO₄ (pH 7,0) tartalmú pufferrel végzett mosással eluáltuk. Az izoformokat (melyeket a gradienssel választottunk szét, illetve a nátriumklorid-oldattal eluáltunk), Lai és munkatársai 2. példában ismertetett eljárása szerint, reverz fázisú kromatográfiával, majd ezt követően végzett gélszűréses kromatográfíával megszabadítottuk a szennyező proteinektől.

6. példa

Humán eritropoietin analógok előállítása A humán eritropoietin aminosavszekvenciáján belül található szénhidrát-kapcsolódási helyek lokalizációját az 5. ábra mutatja (26. szekvencia). Az eritropoietinben további glikozilezési helyek előállításának folyamatát a 6A)-C) ábrákon foglaltuk össze és az alábbiakban ismertetjük.

Az in vitro mutagenezis céljára az alábbi oligonukleotid primereket szintetizáltuk:

[Asn⁴, Ser⁶] EPO: 5’ CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3’ (1. szekvencia) [Asn⁹, Ser¹¹] EPO: 5’ ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3’ (2. szekvencia) [Asn⁶⁹] EPO: 5’ GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3’ (SEQID. NO: 3) [Asn¹²⁴] EPO: 5’ TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID. NO: 4) [Asn¹²⁵, Ser¹²²] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3’ (5. szekvencia) [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] EPO: 5’ AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3’ (6. szekvencia) [Thr¹²⁵] EPO: 5’ TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3’ (SEQ ID. NO: 7) [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO: 5’ CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3’ (8. szekvencia)

Az aláhúzott kodonok a nem illeszkedő kodonokat 35 mutatják, ahol a vad típusú aminosavakat a zárójelben jelölt aminosavak helyettesítik.

Az [Asn⁴, Ser⁶] EPO mutánst az Asn⁴ helyhez egy N-glikozilezési hely hozzáadása céljából állítottuk elő.

Az [Asn⁹, Ser¹¹] EPO mutánst az Asn⁹ helyhez egy N- 40 glikozilezési hely hozzáadása céljából állítottuk elő. Az [Asn⁶⁹] mutánst az Asn⁶⁹ helyhez egy N-glikozilezési hely hozzáadása céljából állítottuk elő. Az [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO mutánst az Asn¹²⁵ helyhez egy N-glikozilezési hely hozzáadása céljából állítottuk elő. A [Thr¹²⁵] EPO és [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO mutánsokat az Thr¹²⁵ helyhez egy O-glikozilezési hely hozzáadása céljából állítottuk elő.

[Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO: 5’ GGGCCTGGCAACCTGACAGAAGCTGTC 3’ (9. szekvencia) [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO: 5’ CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3’ (10. szekvencia) [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO: 5’ CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3’ (11. szekvencia) [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹] EPO: 5’ ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3’ (12. szekvencia) [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO: 5’ CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3’ (13. szekvencia) [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO: 5’ CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3’ (14. szekvencia) [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO: 5’ CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3’ (15. szekvencia) [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO:

HU 220 334 B

A [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNS-ből kiindulva az 5’ AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3’ oligonukleotid primer (16. szekvencia) felhasználásával állítottuk elő a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO-t. Ezután az 5’ TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3’ (17. szekvencia) oligonukleotid primerrel állítottuk elő a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO-t.

Az [Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO-t és a [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO-t az Asn 69. helyhez egy N-glikozilezési hely hozzáadása és ezen a helyen az N-glikozilezés fokozása céljából állítottuk elő. [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO, valamint a [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO mutánsokat az Asn 125. helyhez egy N-glikozilezési hely hozzáadása és ezen a helyen az N-glikozilezés fokozása céljából állítottuk elő. A [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO és a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO mutánsokat a Thr 125. helyhez egy O-glikozilezési hely hozzáadása és ezen a helyen a glikozilezés fokozása céljából állítottuk elő.

Az in vitro mutagenezisnél felhasznált eritropoietin DNS-forrása a Hul3 plazmid volt, amely egy pUC8 plazmidba található humán eritropoietin cDNS-klón [Law és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 6920, (1986)]. A Hul3 plazmidból származó DNS-t BstEII és BglII restrikciós enzimekkel emésztettük, a kapott DNSffagmenseket agaróz-gélelektroforézissel vizsgáltuk és a 810 bázispár (bp) hosszúságú eritropoietin DNS-ffagmenst egy GeneClean készlettel a gyártó utasításai szerint (BIO 101, Inc) izoláltuk a gélből. A pBRgHuEPO plazmidba az eritropoietin genomiális génje egy pBR322 származékba inszertált BamHI ffagmensként van jelen, amint azt Lin által benyújtott szabadalmi bejelentés leírja (lásd fent). A pBRgHuEPO plazmidot BstEII és BglII enzimekkel is emésztettük, és a 6517 bázispár-hosszúságú vektorfragmenst izoláltuk. A két fragmens összekapcsolásával kaptuk az IGT1 plazmidot. A pEC-1 előállítása céljából a pDSVL plazmidot (Lin által benyújtott szabadalmi bejelentés, lásd fent, és az 5B) ábrát), BamHI enzimmel emésztettük és abba ligáltuk az IGT 1-ből származó, izolált eritropoietin cDNS-t tartalmazó 2,8 kilobázis nagyságú BamHI ffagmenst.

Az in vitro mutagenezisnél felhasznált egyszálú DNS előállítására a pEC-1 plazmidot BamHI és BglII enzimekkel emésztettük és a 820 bázispár-hosszúságú eritropoietin cDNS-ffagmenst izoláltuk. Ezt ml3mpl8 BamHI helyére ligáltuk, így kaptuk az ml3-EC-l-et. ml3-EC-l-gyel fertőzött RZ1032 E. coli törzs felülúszójából egyszálú DNS-t nyertünk Kunkel és munkatársai [Methods in Enzymol., 154, 367. (1987)], valamint Messing [Methods in Enzymol., 101, 20, (1983)] szerint. Az in vitro mutagenezis végzésénél körülbelül 1 mikrogramm egyszálú DNS-t és a fent említett szintetikus primerek egyikének 0,2 pikomól mennyiségét elkevertük 6 mikroliter pufferrel (250 mmol/1 Tris (pH 7,8), 50 mmol/1 MgCl₂, és 50 mmol/1 ditioreitol). A primemek a templáttal való összekapcsolásához a reakció térfogatát 10 mikroliterre egészítettük ki, az elegyet 5 percig, 65 °C-ra melegítettük, majd hagytuk szobahőmérsékletre hűlni. Az elongációs reakció végzésénél az elegyhez 2,5 mikroliter dTTP-t, dATP-t, dGTP-t, dCTP-t, valamint ATP-t adtunk (mindegyik 10 mikromól/1 koncentrációban), majd ehhez 1 mikroliter (1 egység) E. coli DNS-polimerázt (Klenow-ffagmenst) és 1 mikroliter (1 egység) T4 DNS ligázt adtunk. Az elegyet ezt követően egy éjszakán át 14 °C-on inkubáltuk, majd azzal E. coli JM 109 törzset [Yanisch-Peeron és munkatársai, Gene, 33, 103, (1985)] transzformáltunk Messing eljárása szerint (lásd fent).

Hogy differenciáló hibridizációs eljárással mutáns kiónokat izolálhassunk, nutrient agaron kinőtt telepeket GeneScreen szűrőkre (New England Nuclear) vittünk át. A szűrőket hősugárzó lámpa alatt szárítottuk, majd 1 órán keresztül, 60 °C-on, 1% SDS-t tartalmazó 6 x SSC oldatban inkubáltuk. A hibridizációhoz a fenti oligonukleotid primer (8 pikomól) végét T4 polinukleotidkinázzal, valamint gamma-³²P-jelölt ATP-vel megjelöltük, és egy éjszakán át, 0,5% SDS-t tartalmazó 6xSSC és 100 mg/ml lazacsperma-DNS jelenlétében, az [Asn¹²⁴] mutációnál 37 °C-on, az [Asn⁴, Ser ⁶] mutációnál 55 °C-on, a [Thr¹²⁵] mutációnál és a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] mutációnál 65 °C-on, az [Asn⁹, Ser¹¹] mutációnál és az [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] mutációnál 70 °C-on a szűrőkkel inkubáltuk. A következő napon a szűrőket szobahőmérsékleten háromszor 6 χ SSC-vei mostuk, és autoradiográfiát végeztünk. Szükség esetén, a szűrőket emelkedő hőmérsékletek mellett addig mostuk 6 χ SSC-vel, amíg a vad típusú eritropoietin cDNS-szekvenciát tartalmazó plakkok esetében alacsony szintű hibridizáció volt kimutatható, illetve nem volt hibridizáció kimutatható. A fenti feltételek mellett pozitív hibridizációs jelet adó kiónokat azonosítottuk és ezeket tiszta klón izolálása céljából újból JM 109 sejtekbe juttattuk. Didezoxi lánc-terminációs szekvenciavizsgálattal igazoltuk, hogy az aszparagin-, szerin-, threonin- és prolinmutációk valóban megtörténtek.

Az [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser ⁿ], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser ¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵], és [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] módosításokat tartalmazó dupla szálú ml3 EC-1 DNS-eket forralásos eljárással [Holmes és munkatársai, Anal. Biochem., 117, 193, (1981)] visszanyertük a transzfektált JM109 sejtekből. A DNS-eket BstEII és XboII enzimekkel emésztettük és a 810 bázispár-hosszúságú eritropoietin DNS-ffagmenst izoláltuk. A pEC-1 plazmidot BglII enzimmel végzett részleges emésztést követően BstEII enzimmel emésztettük és a kapott ffagmensek 5’ végét bakteriális eredetű alkalikus foszfatázzal 10 mmol/1 Tris (pH 8) pufferben, 60 °C-on, 60 percig defoszforileztük. A 810 bázispárhosszúságú BstEII-BglII ffagmenst nem tartalmazó 7 kilobázis nagyságú vektorfragmenst izoláltuk és a fenti eritropoietin fragmenssel ligáltuk. Az így kapott plazmidok (pEC-Χ, ahol X az analóg száma) a jelzett pozíciókban módosított aminosavmaradékokkal rendelkező eritropoietin analógokat kódoló DNS-t tartalmaztak.

Más eljárás szerint, in vitro mutagenezissel egy olyan eritropoietin analógot (pEC34) állítottunk elő, amelyben a 41-55. aminosavakat deletáltuk. Ez egy BstEII-BglII ffagmenst tartalmazó, kisebb (755 bázispár) EPO-t eredményezett. A ffagmenst a fentiek sze13

HU 220 334 Β rint pEC-l-be inszertáltuk. Az eritropoietin analógok klónozásához a pEC34-et BstEII enzimmel emésztettük, részlegesen BglII enzimmel emésztettük, defoszforileztük, és a vektort a fent ismertetett módon izoláltuk. A 7 kilobázis nagyságú vektorffagmenst ezután a 5 fent leírt módon eritropoietin fragmensekkel ligáltuk.

A pEC34 plazmiddal való klónozás lehetővé teszi a rekombináns, illetve az egyszerűen visszazáródott plazmidklónok megkülönböztetését. A visszazáródott plazmidok az analógoknál kisebb BstEII-BglII fragmenst eredményeznek, és ezek agarózgélen könnyen megkülönböztethetőek.

Ezeket az általános eljárásokat alkalmaztuk a 3., 4. és 5. táblázatban felsorolt eritropoietin analógok előállításánál. Az egyes analógok esetében jelöltük a DNS-szekvencia-változtatásokat, a mutagenezisnél használt oligonukleotid primerek egyébként a humán eritropoietin szekvenciájával komplementer szekvenciával rendelkeztek.

3. táblázat

N-kötésű szénhidrátláncok kapcsolódására alkalmas helyekkel rendelkező eritropoietin analógok

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvenciacserc
NI	Asn⁴Ser⁶	CGC—>AAC ATC—>AGC
N2	Asn’Ser¹¹	AGC->AAC GTC-+AGC
N3	Asn¹⁹Thr²¹	GCC—>AAC GAG—>ACG
N4	Asn³⁰Thr³²	GCT—>AAT CAC->ACG
N5	Asn⁴²	CCA-+AAT
N6	Ser^Asn^Thr⁴⁵	CCA-»TCA GAC—>AAC AAA—>ACA
N7	Ser⁴⁹	TAT-»TCT
N8	Asn^3lThr⁵³	TGG-»AAT AGG—>ACG
N9	Asn³⁷Thr³⁹	GGG-»AAC CAG—>ACG
N10	Asn⁶⁹	CTG-+AAC
Nll	Asn⁶⁹Thr⁷¹	CTG-+AAC TCG->ACA
N12	Ser<>8Asn⁶⁹Thr⁷>	Nll plus GCC—»TCC
N13	Asn^Thr⁹®	TGG—»AAT CCC—>ACC
N14	SeriTAsn^Thr⁹⁰	NI 3 p1u s CCG—>TCG
N15	Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²	NI 4 p1u s CAG->ACG
N16	Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²	NI 4 p1u s AGG->GCG
N17	Asn⁸⁸Ser⁹⁰	TGG—>AAT CCC->TCC
N18	Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	CCG—>GTG TGG—>AAT CCC-+ACC
N19	Ser⁸⁷ Asn⁸⁸Gly⁸⁹T rhr⁹⁰	CCG—»TCG TGG—»ΛΛΤ GAG—>GGG CCC->ACC
N20	Asn^Ile’OThr⁹¹	GAG->AAC CCC—>ATC CTG->ACG

HU 220 334 Β

3. táblázat (folytatás)

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvenciacsere
N21	Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹	N20 plus CCG-»TCG
N22	Asn^ll3Thr¹¹⁵	GGA-» AAC CAG-»ACG
N23	Asn¹¹⁸Val¹²¹	GCC—»AAC CCT—»GTT
N24	Asn¹²¹Ser¹²²Thr¹²³	CCT-»AAT CCA-+TCA GAT-» ACT
N25	Asn¹²⁴	GCG-»AAT
N26	Ser^l22Asn¹²⁴	CCA—»TCA GCG—>AAC
N27	Asn¹²⁵Ser¹²⁷	GCC-» AAC GCT—»TCT
N28	Asn^l25Thr¹²⁷	GCC-» AAC GCT-» ACG
N29	Leu^l21Ser¹²²Asn¹²⁵Thr¹²⁷	N28 plus CCT-»CTT
N30	Thr¹²⁰Gly¹²²Leu¹²³Asn^l25Thr¹²⁷	CCA-»TCA N28 plus TCC—»ACC CGC^GGG
N31	Asn¹²⁶Ser¹²⁸	GAT—»CTC TCA—» AAT
N32	Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹	GCT—»TCT TCA-» AAT GCT—» ACT
N33	Leu¹²¹Ser^,22Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹	CCA-»GTA N32 plus CCT-»CTT CCA-»TCA
N34	Thr¹²¹Gly¹²³Ser¹²⁵Asn¹²⁶Thr¹²⁸Val¹²⁹	N32 plus CCT—» ACG GAT-»GGG GCC-»TCC
N35	Ser¹²⁹Asn^!3°	CCA—»AGC CTC—>AAC
N36	Asn¹³²	ACA-» AAC
N37	Asn¹³⁴Thr¹³⁶	ACT-» AAT GAC—»ACC
N38	Asn¹³⁵	GCT-» AAT
N39	Asn¹³⁶Thr¹³⁸	GAC-» AAC TTC-»ACC
N40	Asn¹³⁷Thr¹³⁹	ACT-» AAT CGC-»ACC
N41	Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰	TTC-»AAC AAA-»ACA
N42	Asn¹⁴⁴	GTC-» AAC
N43	Ser¹⁴³Thr¹⁴⁹Val¹⁵⁰	TTC-»TCC CTC—»ACC CGG-»GTG

HU 220 334 Β

3. táblázat (folytatás)

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvenciacsere
N44	Gly'⁴⁸Thr¹⁴⁹	TTC->GGC CTC—>ACC
N45	Asn¹⁵⁵	CTG->AAT
N46	Asn'⁶³Ser¹⁶⁵	ACA—>AAT
N47	Asn’°Thr’²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	N4 és NI 8
N48	Asn⁶⁹Thr⁷'Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	Nll és NI 4

4. táblázat

O-kötésű szénhidrátláncok kapcsolódására alkalmas helyekkel rendelkező eritropoietin analógok

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvenciacsere
01	Ser⁶	ATC-+AGC
02	Ser⁷	TGT—>TCC
03	Ser⁸	GAC->AGC
04	Ser¹¹	GTC—>TCT
05	Ser'⁸	GAG-+TCG
06	Ser²’	GAG->TCG
07	Ser²⁹	TGT—>AGC
08	Ser²⁹	TGT->TCT
09	Ser³⁰	GCT—>TCT
010	Ser”	TGC->TCA
011	Ser’⁷	GAG-»TCG
012	Ser⁴⁹	TAT-»TCT
013	Ser⁶'	GTA-+TCA
014	Ser⁶’	GTC->TCC
015	Ser⁶⁷	CTG—>TCG
016	Ser⁶⁸	GCC->TCC
017	Ser⁷⁰	CTG—>TCG
018	Ser⁷’	GCT->TCT
019	Ser⁷⁴	GTC->TCT
020	Ser⁷⁵	CTG->TCG
021	Ser⁷⁹	GCC—>TCC
022	Ser⁸¹	TTG-+TCG
023	Ser⁸⁶	CAG->TCG
024	Ser⁸⁷	CCG—>TCG
025	Ser⁹’	CTG-+TCG
026	Ser⁹⁸	GCC—>TCC
027	Ser⁹⁹	GTC—>TCC
028	Ser'⁰²	CTT->TCT
029	Ser»	CGC-+AGT
030	Ser»	CTC—>AGC
031	Ser¹⁰⁹	CTT->TCT
032	Ser'	GCT—>TCT
033	Ser²	CTG-+TCG
034	Ser”⁴	GCC-»TCC

HU 220 334 Β

4. táblázat (folytatás)

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvenciacsere
035	Ser¹²⁸	GCT—>TCT
036	Ser¹⁵⁹	TCG->GAG
037	Ser¹⁶¹	TGC—>TCC
038	Pro¹²⁵Ser¹²⁷	GCC->CCC GCT—>TCT
039	Thr⁶²	GAA->ACA
040	Thr⁶⁴	TGG—>ACG
041	Thl*⁸	CAG—>ACG
042	Thr⁸⁸	TGG->ACG
043	Thr⁹	CCC->ACC
044	Thr⁹²	CAG-»ACG
045	Thrioo	AGT—»ACT
046	Thr¹¹⁰	CGG—>ACG
047	Thr³	CAG->ACG
048	Thr¹²³	GAT—»ACT
049	Thr¹²⁴	GCG->ACG
050	Thr¹²⁵	GCC—>ACC
051	Thr¹²⁵Ser¹²⁷	GCC-»ACC GCT—>TCT
052	Thr¹²⁵Thr¹²⁶	GCC—>ACA TCA->ACA
053	Thr¹²⁶	TCA->ACC
054	Thr'²⁷	GCT—>ACT
055	Thr¹³⁰	CTC-»ACC
056	Thr'³'	CGA—>ACA
057	Thr¹³⁶	GAC—»ACC
058	Thr¹⁴⁰	AAA—»ACA
059	Pro¹²⁴Thr¹²⁵	GCG->CCG GCC—>ACC
060	Pro¹²⁴Thr¹²⁵Thr¹²⁶	059 plus TCA—>ACC
061	Pro¹²⁴Thr^,25Thr¹²⁶Thr¹³¹	060 plus CGA-»ACA
062	HGG C-terminal extension,

5. táblázat

N-kötésű és O-kötésű szénhidrátláncok kapcsolódására alkalmas helyekkel rendelkező eritropoietin analógok

Analóg száma	Aminosavszubsztitúció	Szekvencia- csere
NO1	Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr^w HCG C-terminális toldás	N14 és 062
NO2	Asn'OThrWaPAsn^Thr⁹⁰HCG C-terminális toldás	N47 és 062

A pDEC-X nevezetű plazmidokat (melyekben X az analóg számát jelöli), oly módon állítottuk elő, hogy eritropoietin cDNS-t a pDEC-delta plazmidba inszer60 táltunk, amely a pDS-alfa-2 származéka. A pDS-alfa2 expressziós vektort általában a 90/14363 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti. A pDEC-delta plazmidot az alábbi lépések szerint kaptuk a pDS-alfa2 plazmidból:

(1) A pDS-alfa-2 plazmidból a Hindin hasítási helyet oly módon deletáltuk, hogy a pDS-alfa-2 plazmidot Hindin enzimmel hasítottuk, a ragadós Hindin végeket E. coli DNS-polimerázzal (Klenow-fragmenssel) és dNTP-ékkel kezeltük, és a tompa végűvé alakított vektort újból ligáitok. Az így kapott plazmidot pDSalfa-2-delta-H plazmidnak neveztük.

(2) A pDS-alfa-2-delta-H plazmidot Sáli enzimmel emésztettük, és ehhez egy olyan SV40 hasítási jellel

HU 220 334 Β rendelkező szintetikus oligonukleotidot ligáltunk, csolódott. A szintetikus oligonukleotid az alábbi szekamelyben a hasítási jel 3’ végéhez egy Sáli linker kap- venciával rendelkezett (18. szekvencia).

’ TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT

CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA

AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG

AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3 ’

Az így nyert plazmidot pDS-alfa-2-delta-H „splice”nak neveztük.

(3) pDS-alfa-2-delta-H „splice” plazmidot Sáli enzimmel emésztettük és a ragadós végek T4 DNS polimerázzal és dNTP-kkel való kezelésével tompa végűvé alakítottuk. Egy 820 kilobázis nagyságú BamHI-BglII humán eritropoietin cDNS-fragmenst ugyanezzel a módszerrel tompa végűvé alakítottunk és a plazmiddal ligáltuk. Az így kapott plazmidot pDEC-1-nek neveztük.

(4) A pDEC-Ι plazmidot KpnI és PvuII enzimekkel emésztettük, a ragadós végeket „mung” babnukleázzal kezeltük. A plazmidot újból összezártuk, hogy ily módon a kivágott Kpnl-PvuII fragmenst deletáljuk, így kaptuk a pDEC-delta plazmidot.

A pDEC-X plazmidokat a pDEC-delta plazmidból állítottuk elő oly módon, hogy először BstEII enzimmel teljes, majd BglII enzimmel részleges emésztést végeztünk. Izoláltuk az eritropoietin kódolószekvenciától mentes vektorfragmenst és ezt ligáltuk a kívánt plazmidot tartalmazó, 810 bázispár-hosszúságú BstEII-BglII fragmensekkel.

Néhány többszörös aminosavmódosítással rendelkező analóg előállításának részleteit az alábbiakban ismertetjük.

A pDEC(N47) és pDEC(N48) plazmidok előállítása

A pDEC(47) plazmidot, amely Asn30, Thr32, Vall87, Asn88 és Thr90 mutációkat tartalmaz, a pDEC(N18), valamint pDEC(N4) plazmidokból állítottuk elő. A pDEC(18) plazmidot Hindii és BglII enzimekkel emésztettük és egy 445 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltunk. A pDEC(N4) plazmidot BstEII és HindlII enzimekkel emésztettük és egy 337 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltunk. Ezt a két fragmenst a fent ismertetettek szerint BstEII és BglII enzimekkel hasított pDEC-delta plazmidba ligáltuk, így kaptuk a pDEC(N47) plazmidot.

A pDEC(N48) plazmidot, amely Asn69, Thr71, Ser87, Asn88 és Thr90 mutációkat tartalmaz, a pDEC(N14), valamint pDEC(Nll) plazmidokból állítottuk elő. A pDEC(14) plazmidot Hindii és BglII enzimekkel emésztettük és egy 445 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltunk. A pDEC(Nll) plazmidot BstEII és HindlII enzimekkel emésztettük és egy 337 bázispárhosszúságú fragmenst izoláltunk. Ezt a két fragmenst a fent ismertetettek szerint BstEII és BglII enzimekkel hasított pDEC-delta plazmidba ligáltuk, így kaptuk a pDEC(N48) plazmidot.

A pDEC(O62) plazmid előállítása (HCG-eritropoietin fúzió)

A pDEC(O62) plazmidot a pECl plazmid és a humán choriogonadotropin karboxi-terminális 28 aminosavát (ser-ser-ser-ser-lys-ala-pro-pro-pro-ser-leu-proser-pro-ser-arg-leu-pro-gly-pro-ser-asp-thr-pro-ile-leupro-gln) (25. szekvencia), (Pierce és munkatársai, Ann. Rév. Biochem., 50, 465, (1981) tartalmazó 107 bázispár-hosszúságú Stul-BglII szintetikus DNS linker összekapcsolásával állítottuk elő. A linker szekvenciája a következő volt:

5’CCTGTAGGACAGGGGACAGATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTC3 ’ GGACATCCTGTCCCCTGTCTAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGTCGGAAG5 ’ CAAGTCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATGA (19. szekvencia) ’ GTTCAGGTAGGGCTGAGGGCCCCGGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGTGTTACTCTAG (20. szekvencia)

A pECl plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a 610 bázispár-hosszúságú DNS-fragmenst izoláltuk. A szintetikus linkért ATP-vel és polinukleotidkinázzal foszforileztük, és a pECl fragmenssel együtt az előzetesen BstEII enzimmel teljesen és BglII enzimmel részlegesen emésztett pDEC-delta plazmidba ligáltuk a fentiekben leírtak szerint.

A pDEC(NOl) plazmid előállítása

A pDEC(NOl) plazmidot a pDEC(O62) (HCG-EPO), valamint a pDEC(N14) [Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰] plazmidokból állítottuk össze. A pDEC177 plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰ mutációkat tartalmazó 610 bázispárhosszúságú fragmenst „gene-clean” készlettel izolál- 60 tűk. A pDEC(O62) plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a 107 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltuk. Ezt a két DNS-fragmenst az előzetesen 50 BstEII enzimmel teljesen és BglII enzimmel részlegesen emésztett pDEC-delta plazmidba ligáltuk a fentiekben leírtak szerint.

A pDECfNOi) plazmid előállítása A pDEC(NO2) plazmidot a pDEC(O62) 55 (HCG-EPO), valamint a pDEC(N47) (Asn²⁹, Thr⁸², Val¹⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰) plazmidokból állítottuk össze. A pDEC47 plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és az Asn³⁰, Thr³², Val¹⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰ mutációkat tartalmazó 610 bázispár-hosszúságú fragmenst ,Gene-Clean” készlettel izoláltuk. A pDEC(O62) plaz18

HU 220 334 B midot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a 107 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltuk. Ezt a két DNS-fragmenst az előzetesen BstEII enzimmel teljesen és BglII enzimmel részlegesen emésztett pDEC-delta plazmidba ligáltuk a fentiekben leírtak szerint.

A pDEC(N16) plazmid [Ser⁸⁷, Asn ^S8, Thr ⁹⁰, Alá¹⁶²] előállítása

A pDEC(NO2) plazmidot a pDEC(N14) [Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰] és a pDEC258 [Alá¹⁶²] plazmidokból állítottuk elő az in vitro mutagenezisnél fent ismertetett eljárással és a 162. pozícióban az AGG kodonnak GCG kodonra való felcserélésével. A pDEC(N14) plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰ mutációkat tartalmazó 610 bázispár-hosszúságú fragmenst „Gene-Clean” készlettel izoláltuk. A pDEC258 plazmidot Stul és BglII enzimekkel emésztettük és a 210 bázispár-hosszúságú fragmenst izoláltuk. Ezt a két DNS-fragmenst az előzetesen BstEII enzimmel teljesen és BglII enzimmel részlegesen emésztett pDEC-delta plazmidba ligáltuk a fentiekben leírtak szerint.

A pDEC(Rl), pDEC(R2) és pDEC(R3) plazmidok előállítása

A pDEC(N14) plazmidból glikozilezési helyek eltávolítása céljából a Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹⁰ mutációkat tartalmazó mp-EPO(N14)-et a fent leírtak szerint in vitro mutagenezisnek vetettük alá az alábbi primerek felhasználásával :

5’ GGAGGCCGAGCAGATCACGACGG3’ GLN24 (21. szekvencia)

5’ CTTGAATGAGCAGATCACTGTCC 3’ GLN38 (22. szekvencia)

5’ CTGTTGGTCCAGTCTTCCCAG 3’ GLN83 (23. szekvencia)

Az így kapott plazmidokat pDEC(Rl)-nek (gin²⁴, ser⁸⁷, asn⁸⁸, thr⁹⁰), pDEC(R2)-nek [gin³⁸, ser⁸⁷, asn⁸⁸, thr⁹⁰], illetve pDEC(R3)-nak [gin⁸³, ser⁸⁷, asn⁸⁸, thr⁹⁰] neveztük. Az ml3-EC-l-et szintén in vitro mutagenezisnek vetettük alá a fenti oligonukleotid primerek felhasználásával, így kaptuk a pECIO [gin²⁴] és pEC8 [gin³⁸] plazmidokat. A pEC9 plazmidot [gin⁸³] az alábbi primer felhasználásával állítottuk elő:

5’ CCTGTTGGTCCAGTCTTCCCAGC 3’ GLN83 (24. szekvencia)

A humán eritropoietin cDNS-klónt, az [Asn⁴, Ser⁶] EPO, [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁴] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] EPO, [Thr¹²⁵] EPO, valamint [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO analógoknak megfelelő cDNS-klónokat valamint a 3., 4. és 5. táblázatban leírt analógok cDNS-klónjait elektroporációs eljárással COS-1 sejtekbe (ATCC CRL-1650) juttattuk, A COS-1 sejteket félig összefolyó növekedésű sejtréteget tartalmazó edényekből összegyűjtöttük, tápfolyadékkal (5% borjúszérumot és 1% L-glutamin/penicillin/streptomycin elegyet tartalmazó Dulbecco-féle módosított esszenciális tápfolyadékkal, Irvin Scientific) mostuk és 4xl0⁶ sejt/ml sűrűségben szuszpendáltuk. Egy ml sejtszuszpenziót egy elektroporációs küvettába (Bio-Rad) vittünk át és Bio-Rad Gene Pulser készülékkel, 25 mikroFarad és 1600 volt mellett, 100-200 mikrogramm hordozó-DNS és 2-20 mikrogramm eritropoietin analógot kódoló plazmid DNS jelenlétében elektroporáltuk. Az elektroporált sejteket 2χ10⁶sejt/5 ml tápfolyadék sűrűségben 60 mm átmérőjű sejttenyésztő edénybe oltottuk. A kioltást követően 2-4 órával a tápfolyadékot 5 ml friss tápfolyadékra cseréltük. A kondicionált tápfolyadékot az elektroporáció után 3-5 nappal összegyűjtöttük.

7. példa

Eritropoietin analógok jellemzése

A) Szénhidrát-kapcsolódás meghatározása

Eritropoietin analóg cDNS-sel a 6. példában ismertetettek szerint transzfektált, 5-20 egységet tartalmazó COS-1 sejt felülúszót egy éjszakán át, szobahőmérsékleten immunprecipitáltunk nyúlban termelt antieritropoietin poliklonális ellenanyaggal. A immunprecipitátumhoz 20-80 mikroliter 1:1 arányú Protein A-Sepharose-t adtunk foszfátpufferes fiziológiás sóoldatban (PBS) és egy órán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mintákat centrifugáltuk, PBS-sel mostuk, és a jelzett minták üledékét az N-kötésű szénhidrátláncok eltávolítása céljából N-glikanázzal kezeltük. A mintákat 15%os SDS, poliakrilamid-gélen végzett elektroforézissel vizsgáltuk, nitrocellulóz szűrőre vittük át, és Bumette és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 112, 195-203, (1981)], valamint Elliott és munkatársai által leírt eljárással [Gene, 79, 167-180, (1989)] Westem-lenyomattecnikával vizsgáltuk egérben termelt antieritropoietin monoklonális ellenanyagok elegyének felhasználásával. Egy ilyen, 9G8A elnevezésű ellenanyagot ismertetnek Elliott és munkatársai [Blood, 74, 1. kiég. A) 1228, (1989)].

Az [Asn⁶⁹] EPO és az [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO cDNSsel transzfektált COS-sejt-felülúszók vizsgálata a humán szekvenciájú eritropoietinhez képest a protein méretének megnövekedését mutatta. Ez a megnövekedett méret egy további N-kötésű szénhidrátlánc-kapcsolódásra utal (lásd 7. ábra). A [Thr¹²⁵] EPO, valamint [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNS-sel transzfektált COS-sejtfelülúszók N-glikanázzal való kezelése humán szekvenciájú eritropoietinhez képest a protein méretének megnövekedését mutatta. Ez a megnövekedett méret egy további O-kötésű szénhidrátlánc-kapcsolódásra utal (lásd

8. ábra). Egyéb kiválasztott analógok Westem-lenyomat-vizsgálatát mutatja a 10. ábra.

Az EPO-hoz kapcsolódó N-kötésű szénhidrátláncok számának meghatározására részleges N-glikanázemésztést végeztünk. Az analógokat, illetve az rHuEPOt CHO-sejtekben expresszáltuk és a szérummentes kondicionált tápfolyadékot összegyűjtöttük. A csövek 40 egység EPO-t tartalmaztak (a térfogatot vízzel 15 mikroliterre egészítettük ki). Mindegyik csőhöz 10 mikroliter 0,5%-os SDS-t adtunk és a mintákat 3 percig forraltuk. Ezután az alábbi komponenseket adtuk a mintákhoz: 10,8 mikroliter 0,5 mol/1 NaPO₄ (pH 8,6), 5 mikroliter 7,5%-os nonidet P40 és 1,5 mikroliter 250 egység/ml Nglikanáz (Genzyme). A mintákat a jelzett ideig 37 °C-on inkubáltuk. A reakciót SDS-PAGE mintapuffer hozzáadásával (lásd fent) leállítottuk, majd SDS-PAGE

HU 220 334 Β

Westem-lenyomat-vizsgálatot végeztünk (10%-os akrilamid gélen) antiEPO poliklonális ellenanyag, valamint egy antinyúl Vectastain készlet (Vector Laboratories) felhasználásával, szubsztrátként 4-kloronaftolt használtunk. A humán eritropoietin és az N14 analóg N-kötésű 5 láncainak a fenti módszerrel végzett vizsgálatát mutatja a 11. ábra.

B) Vizsgálatok eritropoietin analógok aktivitásának meghatározására

A RIA vizsgálatokat Egrié és munkatársai szerint vé- 10 geztük (lásd fent). Az EIA vizsgálatokat a CLINIGEN EIA készlet (R and D Systems) felhasználásával végeztük a gyártó utasításai szerint. Az eritropoietin analógok in vivő biológiai aktivitását egy eritropoietin analógot expresszáló CHO-sejt felülúszójában, illetve CHO-sejt- 15 kondicionált tápfolyadékából nyert tisztított eritropoietinben határoztuk meg az alább ismertetettek szerint az exhipoxiás polycytémiás egérbioesszével [Cotes és munkatársai, lásd fent).

Az in vitro eritropoietin-aktivitást az erythroidkoló- 20 nia-képzési vizsgálattal határoztuk meg Iscove és munkatársai módosított eljárásával [J. Cell. Physiol., 83, 309-320, (1974)]. Humán csontvelőből egy fikollpaque párnán mononukleáris sejteket tisztítottunk részlegesen, és azokat az adherens sejtek eltávolítása céljá- 25 ból kioltás előtt Iscove-féle tápfolyadékkal mostuk. A tápfolyadék 0,9% metil-cellulózt tartalmazott és egyáltalán nem tartalmazott szarvasmarha-szérumalbumint. Az erythroidkolóniákat 8-10 napos tenyésztés elteltével számszerűen értékeltük.

A 6. példában ismertetettek szerint COS-sejtekbe transzfektált és azokban expresszált eritropoietin analógokat nyers-COS-sejt felülúszóban vizsgáltuk RIA, EIA, valamint erythroidkolónia-képzési esszével. A tisztított, humán szekvenciájú eritropoietin a fent említett vizsgálatban meghatározott RIA aktivitással összehasonlítható in vitro aktivitással rendelkezett. Az [Asn⁶⁹] EPO, a [Thr³²⁶] EPO, valamint a [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO a RIA aktivitással összehasonlítható in vitro aktivitást mutatott, ami (az A) fejezetben leírt meghatározás szerint) további szénhidrátláncok kapcsolódását igazolta. A [Thr¹²⁵] EPO-t és az N4, Nll, N14, N16, N18, N47, N48, 062, NO1, valamint NO2-analógokat tovább vizsgáltuk oly módon, hogy az eritropoietin analógot kódoló cDNS-sel CHO-sejteket transzfektáltunk és a CHO-sejtek felülúszóját RIA, EIA és in vivő biológiai esszével vizsgáltuk. Az eredményeket a

6. táblázat mutatja. A CHO-sejtek felülúszójába expresszált RÍ, R2 és R3 analógok in vivő aktivitását a 7. táblázatban ismertetjük.

6. táblázat

További szénhidrátláncokkal rendelkező eritropoietin analógok

EPO-szckvencia	N-kapcsolt^a láncok	O-kapcsolt láncok	In vivo^b aktivitás RIA vagy EIA
Humán	3«=	l^d	0,6
Asn³⁰Thr³²	3 vagy 4^C	n.t	1,1
Asn⁵¹Thr⁵³	4	n.t.	n.t.
Asn⁵⁷Thr⁵⁹	4	n.t.	n.t.
Asn⁶⁹	4	redukált?	n.t.
Asn⁶⁹Thr⁷¹	4	n.t.	0,25-0,7
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹	4	n.t.	n.t.
Val^Asn^Thr⁹⁰	4^C	n.t.	1,8
Ser^Asn^Thr	3 vagy 4^C	normál	1,0
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰	4	n.t.	n.t.
Ser^Asn^Thr^Thr⁹²	4	redukáld	n.t.
Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr⁹¹	4	n.t.	n.t.
Ser⁸⁷Asn⁸⁹lle^9OThr⁹¹	4	n.t.	n.t.
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr^9OAla¹⁶²	4	n.t.	1,8
Asn¹³⁶Thr¹³⁸	3 vagy 4	n.t.	n.t.
Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰	3 vagy 4	n.t.	n.t.
Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	4 vagy 5	n.t.	0,025-0,25
Asn³«Thr³²Val»⁷Asn»⁸Thr⁹»	4 vagy 5^C	normál	1,8
Thr¹²³	3	1 vagy 2^f	n.t.
Thr¹²⁵	3	1 vagy 2^f	0,7
Pro¹²⁴Thr¹²⁵	3	1 vagy 2^f	n.t.
HCG C-terminális toldás Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	3	legalább 3 g	1,0-1,3

HU 220 334 Β

6. táblázat (folytatás)

EPO-szekvencia	N-kapcsolt^a láncok	O-kapcsolt láncok	In vivo^b aktivitás RIA vagy EIA
HCG toldás Asn³»Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰	4	legalább 3 g	1,5
HCG toldás	4 vagy 5	legalább 3 g	0,8

6. táblázat, lábjegyzetek ^aA járulékos N-kötésű szénhidrátláncok számát az analóg polipeptidek SDS-gélen mutatott mobilitása alapján becsültük meg a 7A) példában ismertetettek szerint.

^b Egy analóg in vivő aktivitásának és egy eritropoietin analóg mennyiségének aránya. Az aktivitásméréseket az analógok CHO-sejt felülúszójában végeztük az egéipolycytémiás bioesszével. A CHO-sejt felülúszókban az eritropoietin analógok mennyiségét RIA, illetve EIA módszerrel határoztuk meg a szövegben leírtak szerint.

^c A járulékos szénhidrátláncok számát oly módon határoztuk meg, hogy a 7. A) példában leírtak szerint részleges N-glikanáz-emésztést követően SDSgélen vizsgáltuk a glikoprotein migrációt.

^d A humán eritropoietin-molekulák 70%-án található O-kötésű lánc a Ser¹²⁶-on.

^e Alacsonyabb fokú O-glikozilezéssel rendelkező analógok esetében a molekulák kevesebb mint 70%-ánál található szénhidrátlánc a Ser¹²⁶-on. ^f A Thr¹²³ EPO a molekulák több, mint 60%-ánál két O-kötésű lánccal rendelkezik. A Thr¹²⁵ EPO molekulák körülbelül 40%-án két O-kötésű lánc található. A [Pro¹²⁴, Thr ¹²⁵] EPO a molekulák több mint 80%-ánál két O-kötésű lánccal rendelkezik.

s Ezekben az analógokban legalább három O-kötésű lánc található, de lehet négy vagy öt is.

Ismereteink szerint a HCG egyedül négy O-kötésű lánccal rendelkezik.

N.T. nem vizsgáltuk.

7. táblázat 25

Humán eritropoietin és szénhidrátkötődésihelyátrendeződéssel rendelkező analógok aktivitása

EPO-szekvencia	N-kapcsolt^a láncok	In vivo^baktivitás RIA vagy EIA
Humán	3	0,69
Gin²⁴	2	0,16
Gin³⁸	2	0,16
Gin⁸³	2	0,23
Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(Rl)	3	0,69
Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr^9O(R2)	3	0,41
Gln⁸³Scr⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰(R3)	3	0,50
Ser^Asn^Thr⁹®	3 vagy 4	1,48

Az in vivő aktivitás RIA, illetve EIA értékekhez viszonyított arányát a 6. táblázat lábjegyzetében leírtak szerint határoztuk meg. 45

C) Eritropoietin analógokból származó izoformelegyek előállítása [Thr 125] EPO (EPO 050)

Az [Thr 125] epo eritropoietin analógot a 6. példában (A) pontban leírtak szerint állítottuk elő. Egy a 50 [Thr¹²⁵] mutációt hordozó 810 bázispár-hosszúságú eritropoietin cDNS-ffagmenst izoláltunk oly módon, hogy a pEC plazmidot BstEII és BglII enzimekkel hasítottuk és a ffagmenst pDEC-delta plazmidba (egy pDSalfa-2 származékba) (lásd a 6. példát) ligáltuk. 55

A [Thr¹²⁵] eritropoietin cDNS-t tartalmazó pDECdelta plazmidot DHFR-deficiens CHO-sejtekbe transzfektáltuk. 770 ml CHO-sejt-kondicionált tápfolyadékot egy 10 000 D molekulatömegig áteresztő szűrő segítségével koncentráltunk, és 10 mmol/1 Tris-HCl pufferrel 60 szemben (pH 8,6) 34 ml végtérfogatra dializáltunk. A koncentrátumból 17 ml-t egy ugyanezzel a pufferrel ekvilibrált (5 ml ágytérfogatú) Q-Sepharose „fást flow” oszlopra vittünk fel és 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,6) pufferben 0-250 mmol/1 NaCl-t tartalmazó lineáris gradienssel eluáltunk. Az oszlopról lejövő frakciók egy részét kezeletlenül, illetve N-glikanáz emésztést követően SDS-PAGE vagy IAE módszenei vizsgáltuk és a frakciók izoform- és/vagy szénhidrát-összetétele alapján a frakciókból csoportokat képeztünk (melyeket 2., 3., illetve 4. jelzéssel láttunk el). Mindegyik frakciócsoportot egy Vydac C4 (214TPB 2030, 1 cm átmérőjű, 1,8-2,5 ml térfogatú, 0,34 ml/perc) oszlopra vittük fel és kétszeres oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferben elegyített 20%-os etanollal mostuk. Az oszlopokat 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferben elegyített 20-94%-os lineáris etanolgradienssel eluáltuk. A frakciókból csoportokat képeztünk, 10 mmol Tris-HCl (pH 7,0) pufferben hígítottuk, és Q-Sepharose „fást flow” oszlopokra vittük fel. Miután az oszlopokat 10 mmol Tris-HCl (pH 7,0) pufferrel mostuk, a mintákat 20 mmol/1 nátrium-citrátot és 250 mmol/1 NaCl-t (pH 7,0) tartalmazó pufferrel eluáltuk. A tisztított [Thr¹²⁵] frakciócsoportokat IEF eljárással vizsgáltuk, az eredményeket a 9. ábra mutatja. Az előbbiekben ismertettek szerint (Cotes és munkatársai, lásd fent) megvizsgáltuk a fenti frakciócsoportok in vivő biológiai aktivitását is, az eredményeket a 8. táblázatban foglaltuk össze.

[Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Thr⁹»] EPO (EPO N14)

1. készítmény

Az EPO N14 analógot egy három lépésből álló eljárással tisztítottuk, amely ioncserélő kromatográfiát, reverz fázisú kromatográfiát és gélszűréses kromatográfiát foglalt magába. Az ioncserélő kromatográfia során a frakciókat úgy csoportosítottuk, hogy magas sziálsav21

HU 220 334 Β tartalmú izoformokat tartalmazó elegyet kapjunk. A reverz fázisú kromatográfia során további két frakciócsoportot képeztünk, amelyek aggregátumokat tartalmazó, illetve azt nem tartalmazó analógokat tartalmaztak. A tisztítási eljárás részleteit az alábbiakban ismertetjük:

1. Az EPO N14 analógot expresszáló CHO-sejtek kondicionált tápfolyadékát összegyűjtöttük és egy YM10 szűrőt (Amicon) tartalmazó...stirred cell... felhasználásával körülbelül 2,5-szer koncentráltuk, 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,5) pufferrel szemben dializáltuk.

2. A koncentrált tápfolyadékot 10 mmol/1 Tris (pH 8,5) pufferrel ekvilibrált, körülbelül 12 A_28O/ml sűrűségű szemcséket tartalmazó Q-Sepharose FF (Pharmacia) oszlopra vittük fel 0,2 cm/perc átfolyási sebesség mellett.

3. Az anyag felvitelét követően az oszlopot 3 oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris (pH 8,5) pufferrel mostuk, és 50 oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,5) pufferben 0-0,5 mol/1 NaCl-t tartalmazó lineáris gradienssel eluáltunk. 1 oszloptérfogatnak megfelelő térfogatokat gyűjtöttünk.

4. Mindegyik frakcióból egy mintát IEF-gélen (pH 3-5) futtattunk. Az IEF-gélen látott izoformeloszlás alapján a főként 11-18. izoformokat tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. A frakciócsoporthoz 1 mol/1 végkoncentrációban EDTA-t adtunk.

5. Az összegyűjtött izoformokat 10 mmol Tris-HCl (pH 7,0) pufferben elegyített 20%-os etanollal ekvilibrált, körülbelül 5 A₂₈₀/ml sűrűségű szemcséket tartalmazó reverz fázisú C4 oszlopra (Vydac) vittük fel 2,5 cm/perc átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot 1 oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris (pH 7,0)/20% etanol elegyével mostuk, és 30 oszloptérfogatnak megfelelő 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,0) pufferben 20-94% etanolt tartalmazó lineáris gradienssel eluáltuk 1 cm/perc átfolyási sebesség mellett. 0,2 oszloptérfogatnak megfelelő térfogatokat gyűjtöttünk.

6. Mindegyik frakcióból egy mintát nem redukáló 12%-os SDS-PAGE gélen vizsgáltunk. Az SDS-gélen megfigyelt aggregátumok jelenléte alapján két külön frakciócsoportot képeztünk. Az 1. csoport EPO analógokat tartalmazott de nem tartalmazott aggregátumokat. A 2. csoport EPO analógokat és aggregátumokat tartalmazott.

7. Az 1. csoportot Centricon 10 szűrővel (Amicon) körülbelül 65-ször koncentráltuk a 2. csoportot körülbelül 250-szer koncentráltuk. Mindegyik csoportnál a puffért 20 mmol/1 Nátrium-citrát/100 mmol/1 NaCl-re (pH 7,0) cseréltük.

8. Mindegyik csoportot egyenként 20 mmol/1 Nátrium-citrát/100 mmol/1 NaCl-re (pH 7,0) pufferrel ekvilibrált HPLC BioSil SEC-250 (BioRad) oszlopon tisztítottuk. A mintákat 6 A₂₈₀/ml alatti szemcsesűrűség és 2,26 cm/perc átfolyási sebesség mellett vittük fel az oszlopra. Mindegyik futtatásból összegyűjtöttük a monomer analógoknak megfelelő csúcsokat.

9. Az összegyűjtött frakciók abszorpcióját megmértük és mindegyik frakciócsoport egy részét SDS-PAGE és IEF-géleken való vizsgálat céljából koncentráltuk. Az 1. csoport 15-17. izoformokat tartalmazott, ezeket használtuk a továbbiakban farmakokinetikai és receptorkötési vizsgálatokban.

2. készítmény

Az EPO N14 analógot egy három lépésből álló eljárással tisztítottuk, amely ioncserélő kromatográfiát, reverz fázisú HPLC-t és hidroxilapatit kromatográfiát foglalt magába. Az ioncserélő kromatográfia során az analógokat három, különböző izoformelegyet tartalmazó csoportra osztottuk. A tisztítási eljárás részleteit az alábbiakban ismertetjük:

1. Az EPO N14 analógot expresszáló CHO-sejtek felülúszóját összegyűjtöttük és egy Filtron Mini ultrasette tangenciális átfolyó eszközzel körülbelül 10-szer koncentráltuk és 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,5) pufferrel szemben dializáltuk.

2. A koncentrált tápfolyadékot 10 mmol/1 Tris (pH 8,5) pufferrel ekvilibrált, körülbelül 10 A_2g0/ml sűrűségű szemcséket tartalmazó Q-Sepharose FF (Pharmacia) oszlopra vittük fel 0,2 cm/perc átfolyási sebesség mellett.

4. Mindegyik frakcióból egy mintát IEF-gélen (pH 3-5) futtattunk. Az IEF-gélen látott izoformeloszlás alapján három külön frakciócsoportot képeztünk. Egy alacsony sziálsavtartalmú (4-12. izoformokat tartalmazó) izoformcsoportot, egy közepes sziálsavtartalmú (5-15. izoformokat tartalmazó) izoformcsoportot és egy magas sziálsavtartalmú (6-18. izoformokat tartalmazó) izoformcsoportot képeztünk.

5. Mindegyik csoportot egyenként egy Vydac C4 reverz fázisú HPLC oszlopon tisztítottuk. Az oszlopot 0,1% TFA/H₂O-0,l% TFA/75% acetonitrilgradienssel eluáltuk az acetonitril koncentrációját percenként 1%kal növelve.

6. Mindegyik csoportból összegyűjtöttük az analógot tartalmazó csúcsot és azt 4 térfogat 80 mmol/1 Tris HC1/20 mmol/1 Tris bázis pufferrel hígítottuk, majd koncentráltuk és egy oldószernek ellenálló Centricon 3 segítségével a puffért 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) pufferre cseréltük.

7. Mindegyik mintát 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) pufferben 2 A₂₈₀/ml-re hígítottuk és azokhoz 1 A₂₈₀/ml végső mintakoncentrációig azonos térfogatú, 4 mol/1 Guanidin-hidrokloridot (GuHCl), 10 mmol/1 CHAPS-t, 10 mmol/1 Tris-t (pH 7,2) tartalmazó puffért adtunk. Mindegyik mintát egy 2 mol/1 Gu-HCl, 5 mmol/1 CHAPS, 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) összetételű pufferrel ekvilibrált hidroxilapatit mini-oszlopra vittük fel. Az oszlopot az ekvilibráláshoz használt pufferrel mostuk és az átfolyó pufferból egy oszloptérfogatnak megfelelő frakciókat gyűjtöttünk.

8. A frakciók abszorpcióját megmértük, csoportokat képeztünk és a puffért egy Centricon 10 eszközzel 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) pufferre cseréltük. Megmértük mindegyik csoport abszorpcióját.

HU 220 334 Β

Végül a csoportokat SDS-PAGE és IEF-géleken vizsgáltuk. Az IEF-géleket a 12. ábrán mutatjuk be.

A RIA és in vivő aktivitás vizsgálatokat a 7. A példában leírtak szerint végeztük. A végső izoformcsoportok in vivő aktivitási eredményeit a 8. táblázatban ismertet- 5 jük. A magas sziálsavtartalmú izoformcsoportot használtuk egérben a hematokritértékek emelkedésének meghatározására végzett kísérletekben.

8. táblázat

Eritropoietin analóg izoformok aktivitása

EPO-szekvencia	Izoform pool	In vivő aktivitás E/mg peptid
Thr¹²⁵	8- 12. izoform 9- 15. izoform 13-15. izoform	147,000^b 215,000^b lll,000^b
Ser^Asn^Thr¹*⁰	7-12. izoform 10-14. izoform 12-17. izoform	132,000+17,000 233,000+39,000 272,000+14,000

^a az eritropoietin peptid milligrammban megadott mennyiségét a Ser⁸⁷, Asn⁸⁸, Hír⁹⁰ epo izoformcsoportok 280 nanométeren mért abszorpciója alapján számítottuk 1 mg/ml oldatra 0,93 extinkciós koefficiens alkalmazásával.

^b A Thr¹²⁵ EPO izoformcsoportok esetében a standard deviációt nem közöltük, mivel az aktivitásmeghatározást egy, illetve két alkalommal végeztük.

8. példa

Az EPO NI4 analógok biológiai sajátságai Összehasonlítottuk az EPO N14. analóg, a rekombináns humán eritropoietin (rHuEPO) és az izolált rHuEPO 14 izoform aktivitását in vivő farmakokinetikai vizsgálatokban, receptorkötési vizsgálatokban és hematokritvizsgálatokban. Az EPO N14 izoformcso- 35 portokat a 7C) példában leírtak szerint állítottuk elő,

A rHuEPO-t Lai és munkatársai szerint állítottuk elő (lásd fent). A rHuEPO 14. izoformot az alábbiak szerint tisztítottuk: A 10., 11., 12., 13., 14. és 15. izoformok elegyét tartalmazó rHuEPO-t 10 mmol/1 Tris (pH 7,2) 40 pufferrel ekvilibrált Q-Sepharose Fást Flow (2,2 cm átmérőjű, 3,4 cm magas) oszlopra vittük fel. A betöltött oszlopot 2 mmol/1 ecetsav/6 mol/1 urea elegyével („A” puffer) ekvilibráltuk, majd egy a 13. és 14. izoformok tisztítását optimalizáló többfázisú gradienst futtattunk 45 rajta. A gradiens az alábbi pufferokból állt: 750 ml térfogatban 0%-7,3% 800 mmol/1 ecetsav/ 6 mol/1 urea („B” puffer), 750 ml térfogatban 7,3-11,4% „B” puffer, 1250 ml térfogatban 11,4-26,8% „B” puffer, 1250 ml térfogatban 26,8-62,4% „B” puffer, majd 700 ml térfogatban 62,4-100% „B” puffer. 12,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk, melyeket ammónium-hidroxiddal neutralizáltunk, majd izoelektrofokuszálásos eljárással poliakrilamid-géleken vizsgáltunk. A tisztán 14. izoformot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, YM-10 membránnal ellátott Amicon... kamrával koncentráltuk, és a puffért vízre cseréltük.

A) In vivő farmakokinetika

Két külön vizsgálatot végeztünk az EPO N14 analóg (15-17. izoformok), az izolált 14. izoform farmakokinetikai paramétereinek az rHuEPO-val való összehasonlítása céljából. Mindegyik vizsgálatban 1 mik15 roCi ¹²⁵I-izolált 14. izoformot, ¹²⁵I-EPO N14 analógot, illetve ¹²⁵I-rekombináns humán eritropoietint (Amersham) injektáltunk intravénásán 310-378 gramm testtömegű hím Sprague-Dawley-patkányok carotisába vezetett kanülbe. Az adagolást követően különböző idő20 pontokban 0,3 ml vért vettünk és centrifugálással abból szérumot nyertünk. Egy éjszakáig tartó, 90%-os etanol jelenlétében, 4 °C-on végzett inkubálást követően mindegyik szérumminta 0,1 ml térfogatában meghatároztuk a ¹²⁵I-EPO (rekombináns humán, izolált 14. izoform, il25 letve EPO NI4 analóg) koncentrációt. Az egyes mintákban egy gamma-számláló készülék segítségével meghatároztuk az etanollal kicsapott ¹²⁵I-EPO mennyiségét, az így kapott farmakokinetikai görbéket a 13. ábra mutatja. Mindegyik patkány esetében PCNONLIN 4,0 30 nem lineáris regressziós analíziseljárással (Statistical Consultants, 1992) meghatároztuk a farmakokinetikai paramétereket és az eredményeket az egyes csoportokban átlagoltuk. Az EPO N14 analóg és az izolált 14. izoform farmakokinetikai vizsgálatának eredményeit a

9. táblázatban összegeztük.

Amint azt a 9. táblázat mutatja, a rekombináns humán eritropoietin esetében számított és az EPO NI4 analóg szérumkiürülési ideje szignifikánsan eltér. A rekombináns humán eritropoietin esetében kaptuk a leggyorsabb béta-féléletidőt (3,10 óra), összehasonlítva az izolált 14. izoform esetében meghatározott 3,97 órával és az EPO N14 analóg esetében kapott 4,36 órával. Ugyancsak a rekombináns humán eritropoietincsoport rendelkezett a leggyorsabb kiürülést fél életidővel (1,78 óra), összehasonlítva az izolált 14. izoform esetében meghatározott 2,04 órával és az EPO N14 analóg esetében kapott 3,03 órával.

9. táblázat

Az rhuEPO, rHuEPO 14. izoform, valamint az EPO N14 (15-17. izoformok elegye) intravénás adagolást követően meghatározott farmakokinetikai paramétereinek összefoglalása

Készítmény	Felezési idő (óra)	AUC (cpm-ó/ml) 0-00 óra	VD (ml/kg)	Eliminációs fok állandó (óra¹)	Érték (ml/kg-óra)	Érték (óra)
alfa	béta
rHuEPO átlag	0,332	3,10	308 901	44,9	0,400	6,14	1,78
*n=6 S.D.	0,155	0,54	69 187	8,3	0,069	1,36	0,27

HU 220 334 Β

9. táblázat (folytatás)

Készítmény	Felezési idő (óra)	AUC (cpm-ó/ml) 0-00 óra	VD (ml/kg)	Eliminációs fok állandó (óra¹)	Érték (ml/kg-óra)	Érték (óra)
alfa	béta
Izoform 14 átlag	0,388	3,97	483 329	36,5	0,288	3,80	2,40
n=4	0,066	0,40	53 638	2,2	0,020	0,12	0,15
EPO N14 átlag	0,422	4,36	692 231	37,4	0,230	2,67	3,03
n=4	0,165	0,36	40 355	1,9	0,021	0,17	0,27

+ Az EPO N14 farmakokinetikai vizsgálatából származó (a rekombináns humán eritropoietincsoport esetében n=4), valamint az izolált 14. izoform farmakokinetikai vizsgálatából származó (a rekombináns humán eritropoietin csoport esetében n=2) rekombináns humán eritropoietin csoportok átEgy jelöletlen liganddal való helyettesítéses vizsgálattal, humán erythroleukémia OCIM1 sejtek [Papayannopoulou és munkatársai, Blood, 64, (1. kiég) 116a, (1984)] felhasználásával vizsgáltuk az EPO N14 analógnak (15-17. izoformok) az eritropoietinreceptorral való kölcsönhatását. Növekvő koncentrációjú jelöletlen EPO N14-et inkubáltunk OCIM1 sejtekkel állandó koncentrációjú ¹²⁵I-rHuEPO jelenlétében annak az EPO N14 mennyiségnek a meghatározása céljából, amely képes az ¹²⁵I-rHuEPO-val versengeni a receptorhoz való kötődésért. Összehasonlításként növekvő koncentrációjú jelöletlen rHuEPO-t inkubáltunk állandó koncentrációjú ¹²⁵I-rHuEPO jelenlétében.

A jelöletlen EPO N14-et vizsgálati pufferben hígítottuk és (a peptid tömegének figyelembevételével) 0,03 nanogramm (ng), 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng, illetve 30,0 ng mennyiséget adtunk a mintához. Mindegyik vizsgálati csőhöz 0,5 ng ^I25I-rekombináns humán EPO-t, majd körülbelül 0,5 χ 10⁶ OCIM1 sejtet adtunk. A vizsgálati csöveket ezután 37 °C-on, rázó vízfürdőben, 2 órán keresztül inkubáltuk. Az inkubálást követően az oldatokat egy dibutyl-phthalát/biphthalát olajoldaton keresztül centrifugáltuk az OCIM1 sejtekhez kötődött ¹²⁵I-rHuEPO és a nem kötődött ¹²⁵IrHuEPO elkülönítése céljából. Elkülönítettük a sejtüledékeket és a sejtekhez kötődött ¹²⁵I-rHuEPO mennyiségét gamma-számlálóval meghatároztuk. Kiszámítottuk a sejtekhez való fajlagosan kötődésnek megfelelő beütésszámot, és lineárisregresszió-számítással kiszámítottuk azt a jelöletlen proteinkoncentrációt, amely kompetitor hiányában képes volt a ¹²⁵I-rHuEPO 50%-át a kötődésből kiszorítani.

Három vizsgálat során kapott eredmények arra mutattak, hogy átlagosan 2,67 +/-0,73 ng jelöletlen EPO N14 peptid szükséges ahhoz, hogy az ¹²⁵I-rHuEPO-nak az OCIM1 sejtekhez való kötődését 50%-kal csökkentsük. Ugyanabban a három vizsgálatban átlagosan 0,51 +/0,15 ng jelöletlen rHuEPO volt szükséges ahhoz, hogy a 0,5 ng ¹²⁵I-rHuEPO felét a kötésből leszorítsa. A fenti eredmények alapján, összehasonlítva a jelöletlen rHuEPO-val, az EPO N14-nek 5,25-szoros feleslegben kellett jelen lennie ahhoz, hogy a ¹²⁵I-rHuEPO-val versengjen az EPO receptorhoz való kötődésért (p<0,01).

Egy további kísérletet végeztünk az EPO N14 analóg, az izolált 14. izoform, illetve a rekombináns eritropoietin eritropoietinreceptorhoz való kötődésének direkt összehasonlítására. Ennek a vizsgálatnak az eredményei arra mutattak, hogy az EPO N14 analóg a receptorhoz alacsonyabb affinitással kötődött, mint az izolált 14. izoform. Összehasonlítva a jelöletlen 14. izoformmal, az EPO N14 analógnak körülbelül kétszeres feleslegben kellett jelen lennie ahhoz, hogy a ¹²⁵I-rHuEPOval versengjen a receptorhoz való kötődésért (lásd 14. ábra).

C) Hematokritvizsgálatok

Egy in vivő vizsgálatot végeztünk annak összehasonlítására, hogy az EPO N14 (a 7C) példában a 2. készítmény leírása szerint előállított) magas sziálsavtartalmú és alacsony sziálsavtartalmú izoformcsoportjai, az izolált 14. izoform, valamint a rekombináns humán eritropoietin milyen mértékben képes a kezelt egerek hematokritját növelni. A fenti vizsgálatban felhasznált EPO N14 magas sziálsavtartalmú és alacsony sziálsavtartalmú izoformcsöpörtök izoform-összetételét a 12. ábra mutatja.

CDI egereket (körülbelül 30 gramm testtömegű) intraperitoneálisan, hetente háromszor, összesen hat hétig a fenti készítmények egyikével (0,25%-os egérszérumalbuminban oldva), illetve placebóval (PBS és 0,25%-os egér-szérumalbumin) injektáltunk. Az eritropoietinkészítmények adagja a peptid tömegétől függött, tehát egy 30 grammos egéradagonként 0,071 mikrogramm pepiidet kapott az EPO N14 alacsony sziálsavtartalmú csoportból, a 14. izoformból, illetve a r-HuEPO standardból. Egy további adagolási csoportot képeztünk (adagonként 0,036 mikrogramm peptid) az EPO N14 magas szénhidráttartalmú izoformcsoport és a 14. izoform esetében. Rertroorbitális vérvétellel meghatároztuk mindegyik egér hematokritját az alapállapotban, majd hetente kétszer. A vizsgálat befejezésekor mindegyik állattól szérumot nyertünk, és azt az injektált termék elleni ellenanyagokra vizsgáltuk. A neutralizáló ellenanyagokra nézve negatívnak bizonyult állatoktól származó adatokat használtuk a további vizsgálatokban.

Amint azt a 15. ábra mutatja, összehasonlítva az egyéb készítményekkel az EPO N14 magas sziálsavtartalmú izoformcsoporttal kezelt állatoknál találtuk a

HU 220 334 B legmagasabb hematokritcsoport-átlagértékeket. A 14. izoform, a rekombináns eritropoietin és az alacsony sziálsavtartalmú EPO N14 csoport kisebb mértékben növelte a hematokritot.

Abból a célból, hogy a különböző eritropoietin- 5 készítményeket kvantitatívabb módszerrel összehasonlíthassuk, kiszámítottuk az kezdeti hematokritnövekedés átlagos mértékét (0-11. nap), a görbe alatti területet (0-39. nap), és az összes hematokritnövekedést (10.

táblázat). A fenti ismérvek bármelyike szerint, peptidtömeg alapján az EPO N14 magas sziálsavtartalmú izoformcsoportja sokkal aktívabbnak tűnik, mint bármelyik vizsgált egyéb készítmény. Mind az EPO N14 magas sziálsavtartalmú izoformcsoportja, mind a 14. izoform sokkal aktívabb volt, mint a rekombináns humán EPO. Bármelyik vizsgálatot használtuk összehasonlításra, az EPO N14 alacsony sziálsavtartalmú csoportja rendelkezett a legalacsonyabb aktivitással.

10. táblázat

Az EPO N14 (magas és alacsony sziálsavtartalmú izoformcsoportok), a 14. izoform, és a rHuEPO hatása egerek hematokritértékére

Készítmény	Dózis (pg)	Hct-érték-növekedés¹(pont/nap)	Görbe alatti terület²	Teljes Hct-növekedés³(Hct-pontok)
N14 nagy pool	0,071	1,46	619	25,4
Izoform 14	0,071	L19	546	22,6
N14 nagy pool	0,036	0,98	428	19,1
Izoform 14	0,036	0,76	284	10,7
r-HuEPO	0,071	1,0	424	17,5
N14 alacsony pool	0,071	0,5	212	9,3

¹ A hematokritnövekedés kezdeti mértékét lineáris regresszió számítással számítottuk a 0-11. napok alapján.

² A görbe alatti területet a 0-39. napok alapján számítottuk, trapéz-összegzéses eljárással.

³ Az összes hematokritnövekedést a 39. napon mért csoport-hematokritátlag és az alaphelyzetben mért csoport-hematokritátlag különbségeként számítottuk.

A találmányt előnyös megvalósítási módjaival lég, a találmány tárgya kiterjed különböző módosításokszemléltettük a korlátozás szándéka nélkül, ellenkező- ra és megfelelőkre.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információk:

(i) Bejelentő: Elliott, Steven G.

Byme, Thomas E.

(ii) A találmány címe: Eritropoietin analógok (iii) A szekvenciák száma: 26 (iv) Levelezési cím:

(A) Címzett: Amgen Inc., U.S. Patent Operations/rbw (B) Utca: 1840 DeHavilland Drive (C) Város: Thousand Oaks (D) Állam: Califomia (E) Ország: U.S.A.) (F) Irányítószám: 91320-1789 (v) Számítógéppel olvasható forma:

(A) A hordozó típusa: Floppy lemez (B) Számítógép: IBM PC kompatibilis (C) Operációsrendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release #1,0, Version #1,25 (vi) A bejelentés fontos dátuma:

(A) A bejelentés száma: US 08/108,016 (B) A bejelentés napja: 1993.08.17.

(C) Osztályozás:

(2) Információ a SEQID NO. 1-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris

HU 220 334 Β (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQID NO. 1 szekvencia leírása:

CGCCCACCAA ACCTCAGCTG TGACAGCCGA 30 (2) Információ a SEQ ID NO. 2-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 2 szekvencia leírása:

ATCTGTACAA CCGAAGCCTG GAGAGGT 27 (2) Információ a SEQ ID NO. 3-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 3 szekvencia leírása:

GGGCCTGGCC AACCTGTCGG AAG 23 (2) Információ a SEQ ID NO. 4-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 4 szekvencia leírása:

TCCCCTCCAG ATAATGCCTC AGCTGC 26 (2) Információ a SEQ ID NO. 5-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 5 szekvencia leírása:

CAGATGCGAA CTCATCTGCT CCAC 24 (2) Információ a SEQ ID NO. 6-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 6 szekvencia leírása:

AGGCCTGCAG GAATGGGAGC AGATGACCAG GTG 33 (2) Információ a SEQ ID NO. 7-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia : lineáris

HU 220 334 Β (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 7 szekvencia leírása:

TCCAGATGCG ACCTCAGCTG CTC (2) Információ a SEQ ID NO. 8-ról:

(i) A szekvencia jellemzői :

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 8 szekvencia leírása:

CCTCCAGATC CGACCTCAGC TGC (2) Információ a SEQ ID NO. 9-ről:

(i) A szekvencia jellemzői :

(A) Hossz: 28 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 9 szekvencia leírása:

GGGCCTGGCC AACCTGACAG AAGCTGTC (2) Információ a SEQ ID NO. 10-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 30bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ 1D NO. 10 szekvencia leírása:

CAGGCCTGT CCAACCTGAC AGAAGCTGTC (2) Információ a SEQ ID NO. 11-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ 1D NO. 11 szekvencia leírása:

CAGATGCGAA CTCAACGGCT CCAC (2) Információ a SEQ ID NO. 12-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 35 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 12 szekvencia leírása:

ATGCGAACTC AACGGCTCCA CTCACAACAA TCACT (2) Információ a SEQ ID NO. 13-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris

HU 220 334 Β (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 13 szekvencia leírása:

CCAGATCCAA ATTCATCTGC TCCACTC 27 (2) Információ a SEQ ID NO. 14-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 14 szekvencia leírása:

CCAGATCCAA ATTCAACAGC TCCACTC 27 (2) Információ a SEQ ID NO. 15-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 24bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 15 szekvencia leírása:

CCAGATGCGA CAACAGCTGC TCCA 24 (2) Információ a SEQ ID NO. 16-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 16 szekvencia leírása:

AGATCCGACC ACCGCTGCTC CAC 23 (2) Információ a SEQ ID NO. 17-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 17 szekvencia leírása:

TGCTCCACTC ACAACAATCA CTG 23 (2) Információ a SEQ ID NO. 18-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 184 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 18 szekvencia leírása:

TCGAGGAACT GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC 60 AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCTCAGTGGA TGTTGCCTTT 120 ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA GCTGCTGCAA CAAGCTGGTC 180 GACC 184 (2) Információ a SEQ ID NO. 19-ről: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 107 bázispár

HU 220 334 B (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQID NO. 19 szekvencia leírása:

CCTGTAGGAC AGGGGACAGA TCCTCTTCCT CAAAGGCCCC TCCCCCCAGC CTTCCAAGTC 60 CATCCCGACT CCCGGGGCCC TCGGACACCC CGATCCTCCC ACAATGA 107 (2) Információ a SEQ ID NO. 20-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 108 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 20 szekvencia leírása:

GATCTCATTG TGGGAGGATC GGGGTGTCCG AGGGCCCCGG GAGTCGGGAT GGACTTGGAA 60 GGCTGGGGGG AGGGGCCGAG GAAGAGGATC TGTCCCCTGT CCTACAGG 108 (2) Információ a SEQ ID NO. 21-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 21 szekvencia leírása:

GGAGGCCGAG CAGATCACGA CGG 23 (2) Információ a SEQ ID NO. 22-ről:

(i) A szekvencia jellemzői :

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 22 szekvencia leírása:

CTTGAATGAG CAGATCACTG TCC 23 (2) Információ a SEQ ID NO. 23-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 23 szekvencia leírása:

CTGTTGGTCC AGTCTTCCCA G 21 (2) Információ a SEQ ID NO. 24-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 23 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: cDNA (xi) A SEQ ID NO. 24 szekvencia leírása:

CCTGTTGGTC CAGTCTTCCC AGC 23

HU 220 334 Β (2) Információ a SEQ ID NO. 25-ről: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 28 aminosavak (B) Típus: aminosav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: protein (xi) A SEQ ID NO. 25 szekvencia leírása:

Ser	Ser	Ser	Ser	Lys	Al a	Pro	Pro	Pro	Ser	Leu	Pro Ser Pro Ser Arg
1				5					10		15
Leu	pro	Gly	Pro	Ser	Asp	Thr	Pr o	I le	Leu	Pro	Gin
			20					25

(2) Információ a SEQ ID NO. 26-ról: (i) A szekvencia jellemzői :

(A) Hossz: 193 aminosavak (B) Típus: aminosav (C) Csavarodás: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: protein (xi) A SEQ ID NO. 26 szekvencia leírása:

Me t 1

Gly

Val

Hi s

Glu 5

Cy s

Pro

Alá

Trp

Leu 10

Trp

Leu

Ser 15

Leu

Ser

Leu

Pro 20

Leu

Gly

Leu

Pro

Val 25

Leu

Gly

Al a

Pro

Pro 30

Arg

Leu

I le

Cys

Asp 35

Ser

Arg

Val

Leu

Glu 40

Arg

Tyr

Leu

Glu 45

Al a

Ly s

Glu

Al a

Glu 50

Asn

I le

Thr

Gly 55

Cys

Al a

Glu

Hi s

Cys 60

Ser

Leu

Asn

Glu

Asn 65

I le

Thr

Val

Pr o

As p 70

Thr

Lys

Val

Asn

Phe 75

Tyr

Al a

Trp

Lys

Arg 80

Me t

Glu

Val

Gly

Gin 85

Gin

Al a

Val

Glu

Val 90

Trp

Gin

Gly

Leu

Al a 95

Leu

Ser

Glu

Al a 100

Val

Leu

Arg

Gly

Gin 105

Al a

Leu

Va 1

Asn 110

Ser

Gin

Pro

Trp 115

Glu

Pro

Leu

Gin

Leu 120

Hi s

Val

Asp

Lys

Al a 125

Va 1

Ser

G1 y

Leu

Arg 130

Ser

Leu

Thr

Leu 135

Leu

Arg

Al a

Leu

Gly 140

Al a

Gin

Lys

Glu

Al a 145

I le

Ser

Pro

Asp 150

Al a

Ser

Al a

Alá 155

Pro

Leu

Arg

Thr

11 e 160

Thr

Al a

As p

Thr

Phe 165

Arg

Ly s

Leu

Phe

Arg 170

Val

Tyr

Ser

Asn

Phe 175

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu 180

Lys

Leu

Tyr

Thr

Gly 185

Glu

Al a

Cys

Arg

Thr 190

Gly

As p

Arg

HU 220 334 Β

Claims

1. Humán eritropoietin analóg, amely legalább egy további N-glikozilezési helyet tartalmaz, ahol az egyik további ilyen hely a 30,51,57,88, 89,136 vagy 138-as pozíció egyikében helyettesítve van, és ahol legalább egy N-kapcsolt szénhidrátlánc az említett aminosavhelyzetek egyikéhez kapcsolódik.

2. Humán eritropoietin analóg, amely Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO.

3. Humán eritropoietin analóg, amely az alábbi csoportok közül van kiválasztva:

Asn³⁰Thr³²-EPO;

Asn⁵¹Thr⁵³-EPO;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹-EPO;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰-EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²-EPO;

Ser^Asn^Thi^Alaiö-EPO;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thi⁹⁰-EPO;

Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr⁹¹-EPO;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr^9,-EPO;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸-EPO;

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰-EPO.

4. Humán eritropoietin analóg, amely az eritropoietin karboxi-terminális végén egy vagy több aminosavkiterjesztést tartalmaz, ahol a kiterjesztés legalább egy glikozilezési helyet tartalmaz.

5. A 4. igénypont szerinti analóg, ahol a kiterjesztés a humán korion gonadotropin karboxi-terminálisából származó peptidfragmenst tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti analóg, amely a következők valamelyikét tartalmazza:

a) humán eritropoietin, amely a karboxi-terminálisból kiterjesztett Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-SerLeu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-ThrPro-Ile-Leu-Pro-Gln aminosavszekvenciát tartalmaz;

b) az a) pont szerinti analóg, amely további Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO részt tartalmaz; és

c) az a) pont szerinti analóg, amely további Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr^9<)-EPO részt tartalmaz.

7. Humán eritropoietin analóg, amelyben a humán eritropoietinben levő egy vagy több glikozilezési hely törölve van és ehelyett egy vagy több nem természetes glikozilezési helyet tartalmaz.

8. A 7. igénypont szerinti analóg, ahol a nem természetes glikozilezési hely egy N-kötésű szénhidrát a humán eritropoietin 88-as aminosav helyzetében.

9. A 8. igénypont szerinti analóg, amelyet az alábbiak közül választunk ki:

Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO;

Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰-EPO és

Gln⁸³Ser⁸⁷Asn^8SThr⁹⁰-EPO.

10. Humán eritropoietin analóg, amely legalább egy O-glikozilezésre alkalmas további helyet tartalmaz, ahol az egyik további hely a 123-as aminosavpozícióban van és ahol az O-kötésű szénhidrátlánc a mondott aminosavpozícióhoz kapcsolódik.

11. DNS-szekvencia, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti analógot kódolja.

12. all. igénypont szerinti DNS-szekvencia által transzfektált eukarióta gazdasejt, amely képes humán eritropoietin analóg kifejezésére.

13. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti analóg, amely egy exogén DNS-szekvencia által kifejezett termék.

14. Gyógyászati készítmény, amely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eritropoietin analóg terápiásán hatásos mennyiségét és gyógyszerészetileg elfogadható hígító-, hordozó- vagy vivőanyagot tartalmaz.

15. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti analóg, ahol a humán eritropoietin az 1-165 vagy az 1-166 aminosavszekvenciával rendelkezik, a 26. számú szekvencialista szerint.