ES2644275T3 - Preparaciones estabilizadas que contienen anticuerpos - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Preparaciones estabilizadas que contienen anticuerpos
La presente divulgacion se refiere a preparaciones que contienen anticuerpos, particularmente a preparaciones estabilizadas que contienen anticuerpos con baja perdida de principios activos incluso despues del almacenamiento a largo plazo. La presente divulgacion tambien se refiere a procedimientos para preparar preparaciones estabilizadas que contienen protemas, que comprenden ajustar el pH con un derivado de aminoacido acido o un aminoacido basico o una sal del mismo.
Se suministran al mercado una serie de preparaciones inyectables que contienen protemas, en donde se adoptan diversas medidas para proporcionar preparaciones estabilizadas que contienen protemas con poca perdida de principios activos incluso despues de un almacenamiento a largo plazo. Las preparaciones que contienen protemas son preparadas disolviendo los principios activos y diversos aditivos, tales como diluyentes, solubilizadores, excipientes, agentes calmantes, agentes tamponantes, agentes reductores que contienen azufre, antioxidantes, estabilizadores, surfactantes, etc. en un tampon.
Un problema generalmente asociado al almacenamiento de protemas como soluciones concentradas es su deterioro, como ejemplifica la formacion de agregados insolubles y que se ha de prevenir.
Por ejemplo, los anticuerpos, tales como inmunoglobulinas, anticuerpos monoclonales y anticuerpos humanizados, son protemas inestables susceptibles a cambios ffsicos o qmmicos, tales como asociacion o agregacion bajo estreses de filtracion, concentracion y calentamiento para eliminar virus durante el proceso de purificacion. Una formulacion farmaceutica acuosa estabilizada que comprende un anticuerpo se desvela en el documento WO 98/56418.
Un metodo convencional ampliamente utilizado para inhibir el deterioro de protemas y almacenarlas de manera estable es la estabilizacion mediante liofilizacion. Sin embargo, era necesario anadir algun agente para proteger frente a la congelacion y evitar la desnaturalizacion o los cambios qmmicos que podnan estar causados por estreses mecanicos durante la congelacion y la liofilizacion.
Se vio un efecto de estabilizacion anadiendo como estabilizador para inhibir los cambios qmmicos o ffsicos poffmeros o polioles, incluyendo protemas, tales como seroalbumina humana o gelatina purificada, u oligomeros, tales como aminoacidos, y surfactantes. Sin embargo, la adicion de biopoffmeros, tales como protemas, como estabilizadores presentaba problemas, tales como la necesidad de una etapa muy compleja para eliminar contaminantes, tales como virus, derivados de los estabilizadores. Mas aun, los tratamientos termicos para inactivar virus a veces causaban problemas, tales como asociacion o agregacion, debido a estreses termicos.
El receptor de interleuquina-6 (IL-6) es una protema de union a ligando que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 KD a la que se une la IL-6. Se vio que los anticuerpos anti-receptores de IL-6 tienen un efecto terapeutico sobre diversas enfermedades mediadas por IL-6, tales como trastornos inmunes, enfermedades inflamatorias o tumores linfocfficos, por bloqueo de la transduccion de senal de la IL-6 en celulas de mieloma inmaduras para inhibir las actividades biologicas de la IL-6 (Tsunenari, T. y col., Blood, 90: 2437, 1997; Tsunenari T. y col., Anticancer Res. 16: 2537, 1996). Tambien vimos que los anticuerpos anti-receptores de IL-6 tienen un efecto terapeutico sobre las celulas de mieloma inmaduras (JP-A-8-099902).
Conseguimos producir en masa un anticuerpo humanizado remodelado, hPM-1, como uno de tales anticuerpos anti- receptores de IL-6 y hemos intentado formular este anticuerpo anti-receptor de IL-6 purificado en preparaciones farmaceuticas.
De forma similar a otras preparaciones proteicas, un factor importante para la formulacion de anticuerpos anti-IL-6R es la estabilidad qmmica y ffsica. Especialmente, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 humanizados son protemas inestables susceptibles de cambios ffsicos o qmmicos, tales como asociacion o agregacion bajo estreses de filtracion, concentracion y calentamiento para la eliminacion de virus durante el proceso de purificacion.
Por lo tanto, existe una demanda en cuanto al desarrollo y la comercializacion de preparaciones que contengan un anticuerpo, especialmente un anticuerpo anti-receptor de iL-6 humanizado, que sean estables incluso despues de un almacenamiento a largo plazo.
Como para diversas protemas fisiologicamente activas, es tambien necesario establecer condiciones de preparacion y condiciones de almacenamiento para mantener sus estructuras y actividades con objeto de suministrarlas como productos farmaceuticos en una cantidad constante y con una gran calidad. Especialmente, sena deseable desarrollar un metodo para inhibir la formacion de agregados insolubles en soluciones de protemas.
Como resultado de cuidadosos estudios para conseguir los anteriores objetos, logramos la presente divulgacion en base al descubrimiento de que la agregacion inducida por calor es controlada formulando un anticuerpo anti-receptor
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de interleuquina-6 humanizado en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina y de que dichas formulaciones son ademas estabilizadas anadiendo glicina y/o sacarosa.
Tambien logramos la presente divulgacion en base al descubrimiento de que se puede reducir la agregacion y se puede aumentar el efecto de estabilizacion ajustando el pH con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
La presente invencion se refiere a las realizaciones tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Un aspecto de la presente invencion se refiere a un proceso para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa, que comprende ajustar el pH a 5-7,5 con un aminoacido basico, en donde el aminoacido basico es histidina, y en donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6. En este procedimiento, el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 puede ser anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado.
Tambien se proporciona en el presente documento lo siguiente:
(1) una preparacion estabilizada que contiene un anticuerpo en un tampon de glicinay/o un tampon de histidina;
(2) la preparacion estabilizada como se define en el punto (1) anterior en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado;
(3) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (1) o (2) anterior en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6;
(4) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (3) anterior en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado;
(5) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (1) anterior en donde la concentracion de tampon de glicina y/o de tampon de histidina es 5 mM - 200 mM;
(6) la preparacion estabilizada tal como se define en uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores que contiene glicina y/o sacarosa como agente isotonizante;
(7) la preparacion estabilizada como se define en el punto (6) anterior que contiene glicina 0,05-1 M y/o sacarosa;
(8) la preparacion estabilizada como se define en cualquiera de los puntos (1) a (7) anteriores, que no contiene NaCl como agente isotonizante;
(9) una preparacion estabilizada que contiene glicina y/o sacarosa como un agente isotonizante asf como un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina;
(10) la preparacion estabilizada tal como se define en uno cualquiera de los puntos (1) a (9) anteriores que tiene un pH de 5-8;
(11) un metodo para estabilizar una preparacion de anticuerpo que comprende incorporar un anticuerpo en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina;
(12) el metodo como se define en el punto (11) anterior, que comprende la incorporacion de glicina y/o sacarosa como agente isotonizante.
(13) un metodo para estabilizar una preparacion de anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6, que comprende incorporar glicina y/o sacarosa como un agente isotonizante asf como un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado en un tampon de glicina y/o en un tampon de histidina;
(14) un procedimiento para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa, que comprende ajustar el pH con un aminoacido basico o con un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo;
(15) el procedimiento tal como se define en el punto (14) anterior en donde el aminoacido basico es uno o mas miembros seleccionados de histidina, arginina y lisina;
(16) el procedimiento tal como se define en el punto (15) anterior en donde el aminoacido basico es histidina;
(17) el procedimiento tal como se define en uno cualquiera de los puntos (14) a (16) anteriores en donde la protema fisiologicamente activa es una protema recombinante;
(18) el procedimiento tal como se define en uno cualquiera de los puntos (14) a (17) anteriores en donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo;
(19) el procedimiento tal como se define en el punto (18) anterior en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimerizado o un anticuerpo humanizado;
(20) el procedimiento tal como se define en los puntos (18) o (19) anteriores en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6;
(21) el procedimiento tal como se define en el punto (20) anterior en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado;
(22) una preparacion estabilizada que contiene un anticuerpo en un tampon de histidina y que tiene un pH de 57,5;
(23) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (22) anterior en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6;
(24) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (23) anterior en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina 6 humanizado;
(25) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (24) anterior que tiene un pH de 5,5-6,2;
(26) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (25) anterior en donde la concentracion de
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histidina es de 1-50 mM;
(27) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (26) anterior en donde la concentracion de histidina es de 3-20 mM;
(28) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (27) anterior en donde la concentracion de histidina es de 5-10 mM;
(29) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (24) anterior que tiene un pH de 6,2-7,5;
(30) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (29) anterior en donde la concentracion de histidina es de 5-200 mM;
(31) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (30) anterior en donde la concentracion de histidina es de 10-150 mM;
(32) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (31) anterior en donde la concentracion de histidina es de 25-100 mM;
(33) la preparacion estabilizada tal como se define en uno cualquiera de los puntos (22) a (32) anteriores que contiene adicionalmente glicina y/o sacarosa;
(34) la preparacion estabilizada tal como se define en el punto (33) anterior que contiene glicina 0,05-1 M y/o sacarosa; y
(35) la preparacion estabilizada tal como se define en uno cualquiera de los puntos (22) a (34) anteriores, que tiene su pH ajustado con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa que muestran agregacion cuando se trato por calor el anticuerpo hPM-1 disuelto en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,5, a 75°C (electroforetograma).
La FIG. 2 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa que muestran el efecto del tipo de tampon sobre la agregacion (electroforetograma).
La FIG. 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa que muestran el efecto de la adicion de NaCl 50 mM a los tampones y del calentamiento sobre la agregacion (electroforetograma).
La FIG. 4 muestra la distribucion del coeficiente de sedimentacion g(s*), obtenida por DCDT y analisis de un anticuerpo hPM-1 control en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M.
La FIG. 5 muestra la distribucion del coeficiente de sedimentacion g(s*), mostrando el efecto del tipo de tampon sobre la agregacion.
La FIG. 6 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa que muestran el efecto de la glicina y de la sacarosa sobre la agregacion (electroforetograma).
La FIG. 7 muestra los resultados del analisis en gel nativo de seis muestras (muestras 1 a 6) antes y despues de calentar (electroforetograma).
La FIG. 8 muestra los resultados del analisis en gel nativo de las muestras 6-1, 6-2, 6-3 y 6-4 antes y despues de calentar (electroforetograma).
La FIG. 9 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se compararon las muestras 6-1 y 6-2 a varias concentraciones de histidina (electroforetograma).
La FIG. 10 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se compararon la muestra 6-1, pH 6,5, la muestra 6-2, pH 6,0, y la muestra 6-3, pH 6,5, a varias concentraciones de histidina (electroforetograma).
La FIG. 11 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se comparo el efecto de la histidina entre dos muestras a pH 6,0, es decir, las muestras 6-2 y 6-5 (electroforetograma).
La FIG. 12 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se compararon la muestra 6-1 (fosfato/Na 5 mM, pH 6,5), la muestra 6-2 (fosfato/His 5 mM, pH 6,0) y la muestra 6-5 (fosfato/Na 5 mM, pH 6,0) (electroforetograma).
La FIG. 13 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se compararon el efecto de la sacarosa (50-200 mM) anadida a la muestra 6-2 y el efecto de la glicina (50-200 mM) anadida a la muestra 6-5 (electroforetograma).
La FIG. 14 muestra los resultados del analisis en gel nativo en donde se comparo el efecto de la glicina o de la sacarosa 200 mM en dos muestras a pH 6,0 (muestras 6-2 y 6-5) (electroforetograma).
Los anticuerpos usados en las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion son preferentemente anticuerpos monoclonales, los cuales pueden ser preparados por cualquier procedimiento. Los anticuerpos monoclonales pueden ser basicamente construidos por tecnicas conocidas como se indica a continuacion. Se inmuniza a un huesped adecuado con un antfgeno inmunizante segun una tecnica de inmunizacion estandar y se fusionan las celulas inmunizadas resultantes con celulas parentales conocidas mediante una tecnica de fusion celular estandar, y luego se criban las celulas fusionadas en cuanto a celulas productoras de anticuerpos monoclonales por un metodo de cribado estandar.
Los anticuerpos contenidos en preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos monoclonales anti-antfgeno HM1,24, anticuerpos antipeptido relacionado con hormona paratiroidea (anticuerpos anti-PTHrP), anticuerpos antifactor tisular, etc. Por ejemplo los anticuerpos anti-receptor de IL-6 incluyen PM-° (Hirata et al., J. Immunol. 143:2900-2906, 1989), AUK12-20, AUK64- 7 o AUK146-15 (Publicacion Internacional N.° WO92/19759).
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Los anticuerpos monoclonales no se limitan a aquellos producidos por hibridomas, sino que tambien incluyen anticuerpos quimericos obtenidos mediante modificaciones artificiales para baja heteroantigenicidad para humanos o con otros fines. En la presente divulgacion tambien se pueden usar anticuerpos humanizados reconfigurados, que se obtienen sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano por las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo de mairnfero no humano tal como un anticuerpo de raton mediante tecnicas de recombinacion genica convencionales tambien conocidas. Estas tecnicas conocidas se pueden usar para obtener anticuerpos humanizados reconfigurados.
Si fuera necesario, los anticuerpos humanizados reconfigurados pueden tener algunos cambios de aminoacidos en las regiones marco (FR) de las regiones variables, de manera que las regiones determinantes de complementariedad formen un sitio de union a antfgeno apropiado (Sato et al. Cancer Res. 53:1-6, 1993). Tales anticuerpos humanizados reconfigurados se ejemplifican preferentemente mediante anticuerpos anti-receptor de IL-6 humanizados (hPM-1) (vease la Publicacion Internacional N.° WO92/19759). Otros anticuerpos preferidos para su uso en la presente divulgacion incluyen anticuerpos monoclonales antiantfgeno HM1,24 humanizados (vease la Publicacion Internacional N.° WO98/14580), anticuerpos antipeptido relacionado con hormona paratiroidea humanizados (anticuerpos anti-PTHrP) (vease la Publicacion Internacional N.° WO98/13388), anticuerpos antifactor tisular (vease la Publicacion Internacional N.° WO99/51743), etc.
Los anticuerpos humanos construidos con animales transgenicos o similares tambien son preferidos.
Los anticuerpos tambien incluyen fragmentos de anticuerpo reconfigurados tales como Fab y (Fab')2 y anticuerpos monovalentes o multivalentes de cadena simple (scFvs).
Las muestras que contienen protema fisiologicamente activa o las muestras que contienen anticuerpos en el presente documento pueden ser muestras que contienen cualquier protema o anticuerpo independientemente de si es una protema o anticuerpo biologico o de si es una protema o anticuerpo recombinante, preferentemente medios de cultivo de celulas de mamffero tales como celulas CHO que contienen una protema o anticuerpo fisiologicamente activo obtenido mediante cultivo de aquellos medios que se han sometido a algun tratamiento tal como la purificacion parcial.
Estudiamos la estabilidad termica del anticuerpo hPM-1 disuelto en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,5, para descubrir que apenas se produda agregacion incluso despues de una incubacion prolongada a 70°C o menos. Se formaron luego agregados cuando se trato con calor el anticuerpo hPM-1 a 75°C. Este resultado muestra que la agregacion es inducida en el anticuerpo hPM-1 solo despues de haber pasado una transicion termica caracterizada por un punto de fusion de 72°C. Al aumentar el penodo de incubacion, aumentaba la intensidad de la banda de agregados y practicamente se perdfa el contenido en monomeros despues de 60 minutos. Estos agregados paredan ser no covalentes, ya que se disociaban en presencia de dodecilsulfato de sodio.
Tras examinar diversos factores que contribuyen a la inhibicion de esta agregacion inducida por calor, vimos que se puede controlar la agregacion disolviendo un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina.
Por lo tanto, se pueden preparar las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion disolviendo un anticuerpo en tampon de glicina y/o en tampon de histidina.
El tampon de glicina o el tampon de histidina tiene una concentracion de 5-200 mM, preferentemente de 5-50 mM, mas preferentemente de 5-20 mM. El tampon de glicina y el tampon de histidina pueden ser usados solos o en combinacion en una concentracion total dentro del rango anterior.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion pueden ser preparaciones mas estables con menos agregacion mediante la adicion de glicina y/o sacarosa como agente isotonizante. La cantidad de glicina y/o sacarosa que se ha de anadir es de 0,05-1 M. Las preparaciones de la presente divulgacion estan preferiblemente libres de NaCl, ya que el efecto reductor de la agregacion de la glicina y/o de la sacarosa disminuye por la adicion de NaCl.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion preferentemente tienen un pH de 5-8.
Tambien examinamos diversos factores que contribuyen a la inhibicion de la agregacion para descubrir que la agregacion se reduce y el efecto de estabilizacion aumenta ajustando el pH con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo en lugar de NaOH como se usa en metodos convencionales.
Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona procedimientos para preparar una preparacion estabilizada que contiene protema, que comprende ajustar el pH con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
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Los procedimientos para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa de la presente divulgacion son utiles no solo para preparaciones que contienen anticuerpos tal como se describe anteriormente sino tambien otras preparaciones que contienen protema fisiologicamente activa. Por ejemplo, las protemas fisiologicamente activas incluyen, pero no se limitan a, factores hematopoyeticos tales como factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM- CSF), eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina; citocinas tales como interferon, IL-1 y IL-6; anticuerpos monoclonales, activador tisular del plasminogeno (TpA); urocinasa; albumina de suero; factor VIII de coagulacion sangumea; leptina: insulina; y factor de crecimiento de celulas madre (SCF). Las protemas preferidas son factores hematopoyeticos tales como EPO, G-CSF y trombopoyetina y anticuerpos monoclonales, mas preferentemente EPO, G-CSF y anticuerpos monoclonales.
Las protemas fisiologicamente activas usadas como principios activos en la presente divulgacion pueden provenir de fuentes naturales o preferentemente disenadas geneticamente en la medida en que tienen sustancialmente las mismas actividades biologicas que las protemas fisiologicamente activas de mairnferos, especialmente del ser humano. Las protemas disenadas geneticamente pueden tener las mismas secuencias de aminoacidos que las de las protemas naturales o pueden contener delecion, sustitucion o adicion de uno o mas aminoacidos en las secuencias de aminoacidos siempre que mantengan las actividades biologicas. Las protemas fisiologicamente activas tambien incluyen aquellas modificadas qmmicamente con PEG o similares.
Las protemas fisiologicamente activas usadas como principios activos en la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, protemas que tienen una cadena de azucares. La cadena de azucares puede provenir de cualquier fuente, pero preferentemente de las de glicosilacion en celulas de mamffero. Las celulas de mamnfero incluyen, por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas BHK, celulas COS, celulas de origen humano, etc., entre las que las celulas CHO son las mas preferidas.
Cuando la protema fisiologicamente activa usada como principio activo en la presente divulgacion es EPO, se puede preparar ePo mediante cualquier procedimiento, por ejemplo, se puede extraer a partir de la orina humana y aislar y purificar mediante diversas tecnicas o se puede producir mediante tecnicas de ingeniena genetica (vease el documento JP-A-61-012288, por ejemplo) en celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas BHK, celulas COS, celulas de origen humano o similares y despues extraerlas, aislarlas y purificarlas mediante diversas tecnicas. La EPO modificada qmmicamente con PEG o similares tambien se incluye (vease la Publicacion Internacional N.° WO90/12874). La EPO que no tiene cadena de azucar y esta modificada qmmicamente con PEG o similares tambien se incluye. Los analogos de EPO tambien se incluyen, en los que EPO se ha modificado para aumentar el numero de uno o mas sitios de glicosilacion en el sitio de union a la cadena de carbohidratos unido a N o en el sitio de union a la cadena de carbohidratos unido a O en la secuencia de aminoacidos de EPO (vease el documento JP- A-8-151398 y JP-A-8-506023, por ejemplo). Ademas, se puede aumentar la cantidad de cadenas de azucares aumentando el contenido de acido sialico o similares sin cambiar el numero de sitios de union a la cadena de azucares.
Cuando la protema fisiologicamente activa usada como un principio activo en la presente divulgacion es G-CSF, cualquiera de los G-CSF humanos altamente purificados se puede usar. El G-CSF en la presente divulgacion se puede preparar mediante cualquier procedimiento, por ejemplo, se pueden extraer de los cultivos de una lmea de celulas tumorales humana y aislar y purificar mediante diversas tecnicas o se puede producir mediante tecnicas de ingeniena genetica en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de levadura, celulas de cultivo animal tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), C127 o COS y despues extraerlo y aislarlo y purificarlo mediante diversas tecnicas. El G-CSF se produce preferentemente mediante recombinacion genetica en E. coli, levaduras o celulas CHO, mas preferentemente mediante recombinacion genetica en celulas CHO. El G-CSF qmmicamente modificado con PEG o similares tambien se incluye (vease la Publicacion Internacional N.° WO90/12874).
El aminoacido basico usado para ajustar el pH es preferentemente uno o mas miembros seleccionado de histidina, arginina y lisina, mas preferentemente histidina.
Los aminoacidos basicos o los derivados de aminoacidos basicos o sales de los mismos incluyen aminoacidos basicos libres o derivados de aminoacidos basicos y sus sales tales como sales de sodio, sales de potasio o clorhidratos. Los aminoacidos basicos o los derivados de aminoacidos basicos o sales de los mismos usados en procesos y preparaciones de la presente divulgacion pueden estar en configuracion D, L o DL, mas preferentemente en configuracion L. Los derivados de aminoacidos basicos incluyen compuestos de nitrogeno de aminoacidos, aminoalcoholes, dipeptidos o similares. Por ejemplo, los derivados de histidina incluyen derivados descritos en el documento JP-A-11-315031, es decir, metilester de histidina, His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Phe, imidazol, histamina o acido imidazol-4-acetico.
En procedimientos de la presente divulgacion, el pH se ajusta preferentemente a 5-7,5 con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo, preferentemente uno o mas miembros seleccionados de histidina, arginina, lisina o derivados o sales de los mismos, mas preferentemente histidina o un derivado del mismo o una sal del mismo. Mas preferentemente, el pH se ajusta con histidina.
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En una realizacion preferida de un procedimiento de la presente divulgacion, se ajusta el pH de una preparacion que contiene un anticuerpo en un tampon de histidina con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo. Por ejemplo, la agregacion se puede reducir cuando un anticuerpo anti-receptor de interleuquina- 6 humanizado esta contenido en un tampon de histidina en lugar de tampones fosfato convencionales. Sin embargo, tambien se usan otros tampones.
Existe una correlacion entre el pH de las preparaciones y las concentraciones de histidina preferidas en los tampones. Cuando el pH de las preparaciones es 5,5-6,2, preferentemente 5,7-6,2, el efecto de estabilizacion es especialmente notable a una concentracion de histidina de 1-50 mM, preferentemente de 3-20 mM, mas preferentemente de 5-10 mM. Cuando el pH de las preparaciones es 6,2-7,5, preferentemente 6,3-7,0, el efecto de estabilizacion es notable a una concentracion de histidina de 5-200 mM, preferentemente 10-150 mM, mas preferentemente 25-100 mM.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacionpueden ser preparaciones mas estables con menos agregacion mediante la adicion de mas glicina y/o sacarosa. La cantidad de glicina y/o sacarosa que se ha de anadir es preferiblemente de 0,05-1 M.
Las preparaciones de la presente divulgacion pueden ademas contener agentes isotonizantes, v.g., polietilenglicol, y azucares, tales como dextrano, manitol, sorbitol, inositol, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, manosa, maltosa y rafinosa.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion pueden ademas contener surfactantes. Como ejemplos tfpicos de surfactantes, se incluyen:
surfactantes no ionicos, v.g., esteres de sorbitan y acidos grasos, tales como monocaprilato de sorbitan, monolaurato de sorbitan y monopalmitato de sorbitan; esteres de glicerina y acidos grasos, tales como monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina y monoestearato de glicerina; esteres de poliglicerina y acidos grasos, tales como monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo y monolinoleato de decaglicerilo; esteres de polioxietilensorbitan y acidos grasos, tales como monolaurato de polioxietilensorbitan, monooleato de polioxietilensorbitan, monoestearato de polioxietilensorbitan, monopalmitato de polioxietilensorbitan, trioleato de polioxietilensorbitan y triestearato de polioxietilensorbitan; esteres de polioxietilensorbitol y acidos grasos, tales como tetraestearato de polioxietilensorbitol y tetraoleato de polioxietilensorbitol; esteres de polioxietilenglicerina y acidos grasos, tales como monoestearato de polioxietilenglicerilo; esteres de polietilenglicol y acidos grasos, tales como diestearato de polietilenglicol; polioxietilen alquil eteres, tales como polioxietilen lauril eter; polioxietilen polioxipropilen alquil eteres, tales como polioxietilen polioxipropilen glicol eter, polioxietilen polioxipropilen propil eter y polioxietilen polioxipropilen cetil eter; polioxietilen alquil fenil eteres, tales como polioxietilen nonil fenil eter; aceites de ricino endurecidos polioxietilenados, tales como aceite de ricino polioxietilenado y aceite de ricino endurecido polioxietilenado (aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado); derivados de cera de abejas polioxietilenados, tales como cera de abejas polioxietilensorbitol; derivados de lanolina polioxietilenados, tales como polioxietilenlanolina; amidas de acidos grasos polioxietilenadas, tales como la amida del acido estearico polioxietilenada con un HLB de 6-18; surfactantes anionicos, v.g., alquilsulfatos que tienen un grupo alquilo C10-18, tales como cetilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio y oleilsulfato de sodio; polioxietilen alquil eter sulfatos que tienen un numero medio de moles de oxido de etileno de 2-4 y un grupo alquilo C10-18, tales como polioxietilenlaurilsulfato de sodio; sales de esteres de acidos alquilsulfosuccmicos que tienen un grupo alquilo C8-18, tales como laurilsulfosuccinato de sodio; y surfactantes naturales, v.g., lecitina, glicerofosfolfpidos, esfingofosfolfpidos, tales como esfingomielina, y esteres de sacarosa y acidos grasos de acidos grasos C12-18. Se pueden anadir uno o mas de estos surfactantes en combinacion a las preparaciones de la presente divulgacion.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion pueden ademas contener diluyentes, agentes solubilizantes, excipientes, modificadores del pH, agentes calmantes, agentes tamponantes, agentes reductores que contienen azufre, antioxidantes o similares, si se desea. Por ejemplo, como agentes reductores que contienen azufre, se incluyen N-acetilcistema, N-acetilhomocistema, acido tioctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiosorbitol, acido tioglicolico y sus sales, tiosulfato de sodio, glutation y compuestos que contienen sulfhidrilo, tales como acido tioalcanoico de 1 a 7 atomos de carbono. Como antioxidantes, se incluyen acido eritorbico, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol, a-tocoferol, acetato de tocoferol, acido L-ascorbico y sus sales, palmitato de L-ascorbilo, estearato de L-ascorbilo, bisulfito de sodio, sulfito de sodio, galato de triamilo, galato de propilo o agentes quelantes, tales como etilendiaminotetraacetato disodico (EDTA), pirofosfato de sodio y metafosfato de sodio. Tambien pueden estar contenidos otros componentes comunmente anadidos, v.g., sales inorganicas, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, fosfato de potasio y bicarbonato de sodio, y sales organicas, tales como citrato de sodio, citrato de potasio y acetato de sodio.
Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion son normalmente administradas por vfas parenterales, tales como inyeccion (v.g., inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal), o por administracion percutanea, mucosal, nasal o pulmonar, pero tambien pueden ser administradas por via oral.
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Las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion pueden tambien estar en forma de formulaciones en solucion o de formulaciones liofilizadas para ser reconstituidas en solucion antes de su uso. Como excipientes adecuados para la liofilizacion, se incluyen alcoholes de azucares o azucares, tales como manitol o glucosa.
La cantidad de anticuerpos contenida en las preparaciones de la presente divulgacion depende del tipo de la enfermedad que haya de ser tratada, de la gravedad de la enfermedad, de la edad del paciente y de otros factores, pero generalmente vana de 0,1 a 200 mg/ml, preferiblemente de 1 a 120 mg/ml, expresada como concentracion final.
Como se muestra en los ejemplos que se dan a continuacion, se demostro que se puede controlar la agregacion inducida por calor con las preparaciones estabilizadas de la presente divulgacion formuladas en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina, y que se puede reducir aun mas la agregacion anadiendo glicina y/o sacarosa.
De acuerdo con los procedimientos para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa de la presente divulgacion, la agregacion inducida por calor se puede controlar para proporcionar una preparacion estable mediante el ajuste del pH con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
Ejemplos
Metodos de ensayo
(1) Materiales
Se uso el anticuerpo hPM-1 como anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado. El anticuerpo hPM-1 es un anticuerpo humanizado preparado segun el protocolo descrito en el Ejemplo de referencia 2 de JP-A-8-099902 usando el promotor del factor de elongacion humano Ia descrito en el Ejemplo 10 de la Publicacion Internacional N° WO92/19759. Se purifico el anticuerpo hPM-1 a traves de una columna de protema A y se guardo en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,5.
(2) Determinacion de las concentraciones de protema
Se calcularon las concentraciones de protema a partir de las absorbancias medidas a 280 nm con un espectrofotometro (DU-600, Beckman-Coulter) usando coeficientes de extincion por mg/ml (calculados a partir de la secuencia de aminoacidos).
(3) Velocidad de sedimentacion
La velocidad de sedimentacion determinada por ultracentrifugacion analttica es una excelente herramienta para detectar cambios menores en la agregacion proteica. Este metodo puede detectar la agregacion a nivel de aproximadamente un 1% en peso.
Se diluyeron todas las muestras con diversos tampones formulados a aproximadamente 0,5 mg/ml inmediatamente antes del analisis y se escanearon en cuanto a agregados muy grandes sedimentados por centrifugacion a una baja velocidad del rotor de 3.000 rpm usando una ultracentnfuga analftica Beckman XLA a 20°C. Se sedimentaron luego el monomero y pequenos oligomeros a una velocidad del rotor de 45.000 rpm.
Se analizaron los datos mediante el programa DCDT+ desarrollado por John Philo usando el metodo dc/dt (Stafford, Anal. Biochem. 203: 295-230, 1992). En algunos casos, se uso el programa SVEDBERG (tambien desarrollado por John Philo).
(4) Electroforesis en gel nativa
Se analizo la agregacion proteica por electroforesis en gel nativa en ausencia de SDS. En este metodo, la movilidad de las protemas depende tanto del tamano hidrodinamico como del estado de carga. La electroforesis en gel nativa permite detectar agregados proteicos no covalentes en ausencia de SDS. Desarrollamos un protocolo para el analisis en gel nativo del anticuerpo hPM-1, ya que el anticuerpo hPM-1 es una protema basica para la cual no se puede aplicar la polaridad ordinaria en sistemas tampon de Tris-glicina normales o en electroforesis en gel de SDS.
Se realizo la electroforesis en gel nativa en un gel de Tris-acetato Novex NuPAGE al 7% (comprado a Novex). El tampon de electrodo utilizado era p-alanina 80 mM/AcOH 40 mM, pH 4,4, o histidina 30 mM/MES 30 mM, pH 6,1. El anticuerpo hPM-1 estaba positivamente cargado a pH 6,1, y se le sometio a electroforesis en una direccion del anodo al catodo. Se mezclaron las muestras con un exceso cinco veces mayor del tampon de electrodo que contema sacarosa y verde de metilo.
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Ejemplo 1: Estabilidad termica del anticuerpo hPM-1
Se estudio el anticuerpo hPM-1 disuelto en fosfato de sodio 19 mM, NaCI 0,2 M, pH 6,5, en cuanto a estabilidad termica. La Fig. 1 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa antes y despues del tratamiento termico a 75°C durante 5-60 minutos.
En la Fig. 1, aparece una sola banda antes del tratamiento termico, para mostrar que la protema purificada es muy homogenea en cuanto a estado de carga y tamano. La velocidad de sedimentacion de la misma muestra era constante, para mostrar que es una especie monomerica. Despues de calentar a 75°C durante 5 minutos, se observo una banda correspondiente a agregados. Al aumentar el penodo de incubacion, aumento la intensidad de la banda de agregados y se perdio practicamente el contenido monomerico despues de 60 minutos. Estos agregados paredan ser no covalentes, ya que se disociaban en presencia de dodecilsulfato de sodio.
Ejemplo 2: Efecto del tipo de tampon sobre la agregacion
Se usaron cinco tampones (todos 19 mM) para examinar su efecto sobre la agregacion. Los pH de las muestras preparadas disolviendo una preparacion de anticuerpo hPM-1 en estos tampones (a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml) son como se indica a continuacion.
1) fosfato de sodio (pH 6,8)
2) histidina-HCl (pH 7,1)
3) citrato de sodio (pH 6,7)
4) Tris-HCl (pH 7,2)
5) glicina (pH 7,6).
Se calentaron estas muestras a 75°C durante 60 minutos y se las sometio a analisis en gel nativo. La Fig. 2 muestra los resultados antes y despues del calentamiento. El contenido monomerico era el mas alto, para dar la menor cantidad de agregacion en glicina, y disminrna en el orden histidina-HCl, Tris-HCl, fosfato de sodio y citrato de sodio. Se observaron muy pocos agregados en glicina.
Cuando se anadio NaCl 50 mM a estos tampones, la agregacion tras el calentamiento aumento en gran medida en cualquiera de los tampones (Fig. 3).
Ejemplo 3: Efecto del tipo de tampon sobre la distribucion de sedimentacion
Con objeto de examinar la naturaleza de la agregacion inducida por calor en estos tampones, se realizo entonces una prueba de sedimentacion. La Fig. 4 muestra la distribucion del coeficiente de sedimentacion g(s*) obtenida gracias al analisis dc/dt de un anticuerpo hPM-1 control en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M. Se ve que esta muestra es una sola especie que tiene un coeficiente de sedimentacion de aproximadamente 6,2 svedbergs (S).
La Fig. 5 muestra el perfil de sedimentacion de una muestra de preparacion que contiene anticuerpo hPM-1 disuelta en los cinco tampones mostrados en el Ejemplo 2 y calentada a 75°C durante 60 minutos. Se observaron una considerable agregacion y perdida de especies monomericas en los tampones distintos de la glicina 19 mM, pH 7,6. La perdida monomerica era mayor en el citrato de sodio, seguido del fosfato de sodio, del Tris-HCl, de la histidina- HCl y de la glicina en orden descendente. Se observo una amplia distribucion que representaba la existencia de agregados en fosfato, citrato y Tris, que se extendfan a 40 So mas y teman un pico a aproximadamente 15-18 S. Los agregados observados en histidina no fueron observados a aproximadamente 25 So mas y teman un pico a aproximadamente 10 S. Estos resultados concuerdan con los resultados del analisis en gel nativo sobre las preparaciones despues del tratamiento termico descrito en el Ejemplo 2.
Ejemplo 4: Efecto de la glicina y de la sacarosa
Este ejemplo se relaciona con la evaluacion del efecto de la glicina o de la sacarosa sobre la agregacion al utilizarlas en lugar de NaCl. Se dializaron muestras de anticuerpo hPM-1 disuelto en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, pH
6,5, frente a fosfato de sodio 19 mM, pH 6,5, que contema glicina 0,2 M o sacarosa 0,2 M. Se calentaron estas muestras a 75°C durante 20-60 minutos en paralelo. La Fig. 6 muestra los resultados de la electroforesis en gel nativa. Comparando las bandas de monomeros, el contenido en monomeros era inferior en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, despues de calentar durante 20 minutos. Esta diferencia se hizo mas significativa cuando se prolongo el penodo de incubacion hasta 40 y 60 minutos. La sacarosa era mas efectiva que la glicina en la reduccion de la agregacion del anticuerpo hPM-1 inducida por el tratamiento termico. Asf, el NaCl mostro un efecto negativo sobre la prevencion de la agregacion como lo hizo en el Ejemplo 2.
Ejemplo 5: Analisis en gel nativo de muestras de anticuerpo hPM-1 antes y despues del calentamiento
Se sometieron seis muestras (muestras 1 a 6) de dicha preparacion de anticuerpo hPM-1 almacenadas en fosfato de sodio 19 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,5, a analisis en gel nativo. Se muestran los resultados de muestras de
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aproximadamente 28 |ig sobre el gel en la calle derecha de la Fig. 7.
Se diluyeron dichas seis muestras en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,5, para preparar una solucion de anticuerpo hPM-1 a una concentracion de aproximadamente 2 mg/ml, que se dializo frente al tampon. Tras la dialisis, se determinaron espectrofotometricamente las concentraciones de protema a un coeficiente de extincion de 1,401, con los resultados siguientes.
Muestra 1: 1,87 mg/ml Muestra 2: 1,77 mg/ml Muestra 3: 1,89 mg/ml Muestra 4: 1,89 mg/ml Muestra 5: 1,87 mg/ml Muestra 6: 1,85 mg/ml.
Estas muestras fueron sometidas a analisis en gel nativo. Los resultados fueron los mismos que los mostrados en la calle derecha de la Fig. 7, lo que confirma que la agregacion no estaba influenciada por la dilucion y la dialisis.
Se calentaron luego estas muestras a 75°C durante una hora y se las sometio a analisis en gel nativo del mismo modo (excepto por usar muestras de 49 |ig). Los resultados son mostrados en la calle izquierda de la Fig. 7. El contenido en monomeros de anticuerpo hPM-1 disminuyo notablemente en todas las muestras, para mostrar que se habfan formado agregados.
Ejemplo 6: Efecto del tipo y del pH del tampon sobre la agregacion
Se diluyo la muestra 6 en los cinco tampones siguientes para preparar soluciones de anticuerpo hPM-1 a una concentracion de aproximadamente 2 mg/ml.
Muestra 6-1: fosfato/Na 5 mM, pH 6,5 [fosfato de sodio (monobasico) 5 mM ajustado a pH 6,5 con NaOH concentrado].
Muestra 6-2: fosfato/His 5 mM, pH 6,0 [fosfato de sodio (monobasico) 5 mM ajustado a pH 6,0 con histidina (base) concentrada a una concentracion final de histidina de 1 mM].
Muestra 6-3: fosfato/His 5 mM, pH 6,5 [fosfato de sodio (monobasico) 5 mM ajustado a pH 6,5 con histidina (base) concentrada a una concentracion final de histidina de 6,6 mM].
Muestra 6-4: fosfato/Na 5 mM + His/HCl 20 mM, pH 6,5 [fosfato 10 mM, pH 6,5, mezclado con igual cantidad de His/HCl 40 mM, pH 6,5].
Muestra 6-5: fosfato/Na 5 mM, pH 6,0 [fosfato de sodio (monobasico) 5 mM ajustado a pH 6,0 con NaOH concentrado].
Se dializaron estas muestras frente a los tampones respectivos mostrados anteriormente. Tras la dialisis, se determinaron las concentraciones proteicas con los resultados siguientes.
Muestra 6-1: 1,80 mg/ml Muestra 6-2: 1,75 mg/ml Muestra 6-3: 1,82 mg/ml Muestra 6-4: 1,84 mg/ml Muestra 6-5: 1,68 mg/ml.
Se sometieron estas muestras a analisis en gel nativo antes y despues del tratamiento termico a 75°C durante 1 hora.
La Fig. 8 muestra los resultados analtticos de las muestras 6-1, 6-2, 6-3 y 6-4. La agregacion era menor en la muestra 6-2, seguida de la muestra 6-4. Esto mostro que un pH de 6,0 daba mejores resultados que un pH de 6,5 y que el ajuste del pH con histidina tema un efecto de estabilizacion.
La Fig. 9 muestra los resultados de la comparacion de las muestras 6-1 y 6-2 a diversas concentraciones de histidina. Se prepararon las muestras mezclando la muestra 6-1 o 6-2 con una solucion de histidina 0,25 M (mezclada con el correspondiente tampon para ajustar el pH). Se formaron menos agregados a pH 6,0 (muestra 6-2) que a pH 6,5 (muestra 6-1), lo que muestra que el efecto de la histidina vana con el pH.
El efecto de estabilizacion de la histidina era considerable a una concentracion de 5-10 mM a pH 6,0, mientras que el efecto de estabilizacion aumentaba con la concentracion de histidina a pH 6,5, como muestran los resultados a 25-50 mM.
Se examino entonces el efecto de la concentracion de histidina sobre la agregacion en otras muestras. La Fig. 10 muestra los resultados de la comparacion de la muestra 6-1, pH 6,5, la muestra 6-2, pH 6,0, y la muestra 6-3, pH
6,5, a diversas concentraciones de histidina.
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Se vio algun efecto de estabilizacion en la muestra 6-3, pH 6,5, incluso cuando se aumento la concentracion a 100 mM, pero el efecto era mayor a concentraciones menores de histidina, tales como 5-10 mM, a pH 6,0 (muestra 6-2), que a cada concentracion de histidina a pH 6,5. Sin embargo, las concentraciones reales de histidina de la muestra 6-3 son 3,3 mM superiores a lo indicado, ya que esta muestra contiene inicialmente 6,6 mM de histidina.
La comparacion de las muestras 6-1 y 6-3 a 50 o 100 mM (por la misma razon, la muestra 6-3 tambien contiene aqu histidina en una cantidad 3,3 mM superior a lo indicado) mostro que la muestra 6-3 tema un mayor contenido en monomeros con menos agregacion. Las muestras 6-1 y 6-3 difieren en el medio de ajuste del pH a 6,5. Es decir, la muestra 6-1 fue ajustada a pH 6,5 con NaOH, mientras que la muestra 6-3 fue ajustada con histidina concentrada utilizada como base. Por lo tanto, el efecto de estabilizacion es mayor cuando se usa histidina que cuando se usa el NaOH convencional para ajustar el pH a 6,5.
La Fig. 11 muestra los resultados de la comparacion del efecto de la histidina en dos muestras a pH 6,0, es decir, las muestras 6-2 y 6-5. En ambas muestras, la histidina 5-10 mM era la mas efectiva.
La Fig. 12 muestra los resultados de la comparacion de la muestra 6-1 (fosfato/Na 5 mM, pH 6,5), la muestra 6-2 (fosfato/His 5 mM, pH 6,0) y la muestra 6-5 (fosfato/Na 5 mM, pH 6,0). El contenido en agregados era menor en 6-2, seguido de 6-5 y luego de 6-1. Esto confirmaba que el anticuerpo hPM-1 es mas estable a pH 6,0. Las muestras 6-2 y 6-5 difieren en el medio de ajuste del pH a 6,0. Es decir, la muestra 6-5 fue ajustada a pH 6,0 con NaOH, mientras que la muestra 6-2 fue ajustada con histidina concentrada utilizada como base. Por lo tanto, el efecto de estabilizacion es mayor cuando se usa histidina que cuando se usa NaOH convencional para ajustar el pH a 6,0, de forma similar al pH 6,5.
La Fig. 13 muestra el efecto de la sacarosa (50-200 mM) anadida a la muestra 6-2. Se observo una prevencion efectiva de la agregacion al aumentar la concentracion de sacarosa.
La Fig. 13 tambien muestra el efecto de la glicina (50-200 mM) anadida a la muestra 6-5. Se observo una prevencion notablemente efectiva de la agregacion al aumentar la concentracion de glicina.
La Fig. 14 muestra una comparacion del efecto de la glicina o la sacarosa 200 mM en dos muestras a pH 6,0 (6-2 y 6-5). La agregacion era menor en 6-2 que en 6-5. Se confirmo ademas por estos resultados que el ajuste del pH es mas efectivo con histidina que con NaOH.
Ademas, la presente divulgacion se refiere a los siguientes puntos:
1. Una preparacion estabilizada que contiene un anticuerpo en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina.
2. La preparacion estabilizada del punto 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.
3. La preparacion estabilizada del punto 1 o 2 en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6
4. La preparacion estabilizada del punto 3 en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado.
5. La preparacion estabilizada del punto 1 en donde la concentracion del tampon de glicina y/o del tampon de histidina es 5 mM - 200 mM.
6. La preparacion estabilizada de uno cualquiera de los puntos 1 a 5 que contiene glicina y/o sacarosa como un agente isotonizante.
7. La preparacion estabilizada del punto 6 que contiene 0,05-1 M de glicina y/o sacarosa.
8. La preparacion estabilizada de uno cualquiera de los puntos 1 a 7, que no contiene NaCl como un agente isotonizante.
9. Una preparacion estabilizada que contiene glicina y/o sacarosa como agente isotonizante asf como un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina.
10. La preparacion estabilizada de uno cualquiera de los puntos 1 a 9 que tiene un pH de 5-8.
11. Un metodo para estabilizar una preparacion de anticuerpos, que comprende incorporar un anticuerpo en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina.
12. El metodo del punto 11, que comprende incorporar glicina y/o sacarosa como un agente isotonizante.
13. Un metodo para estabilizar una preparacion de anticuerpos anti-receptor de interleuquina-6, que comprende incorporar glicina y/o sacarosa como un agente isotonizante asf como anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado en un tampon de glicina y/o un tampon de histidina.
14. Un procedimiento para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa, que comprende ajustar el pH con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
15. El procedimiento del punto 14 en donde el aminoacido basico es uno o mas miembros seleccionados de histidina, arginina y lisina.
16. El procedimiento del punto 15 en donde el aminoacido basico es histidina.
17. El procedimiento de uno cualquiera de los puntos 14 a 16 en donde la protema fisiologicamente activa es una protema recombinante.
5
10
15
20
25
18. El procedimiento de uno cualquiera de los puntos 14 a 17 en donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo.
19. El procedimiento del punto 18 en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimerizado o un anticuerpo humanizado.
20. El procedimiento del punto 18 o 19 en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6.
21. El procedimiento del punto 20 en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo antireceptor de interleuquina-6 humanizado.
22. Una preparacion estabilizada que contiene un anticuerpo en un tampon de histidina y que tiene un pH de 5
7,5.
23. La preparacion estabilizada del punto 22 en donde el anticuerpo en un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6.
24. La preparacion estabilizada del punto 23 en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado.
25. La preparacion estabilizada del punto 24 que tiene un pH de 5,5-6,2.
26. La preparacion estabilizada del punto 25 en donde la concentracion de histidina es 1-50 mM.
27. La preparacion estabilizada del punto 26 en donde la concentracion de histidina es 3-20 mM.
28. La preparacion estabilizada del punto 27 en donde la concentracion de histidina es 5-10 mM.
29. La preparacion estabilizada del punto 24 que tiene un pH de 6,2-7,5.
30. La preparacion estabilizada del punto 29 en donde la concentracion de histidina es 5-200 mM.
31. La preparacion estabilizada del punto 30 en donde la concentracion de histidina es 10-150 mM,
32. La preparacion estabilizada del punto 31 en donde la concentracion de histidina es 25-100 mM.
33. La preparacion estabilizada de uno cualquiera de los puntos 22 a 32 que comprende adicionalmente glicina y/o sacarosa.
34. La preparacion estabilizada del punto 33 que contiene 0,05-1 M de glicina y/o sacarosa.
35. La preparacion estabilizada de uno cualquiera de los puntos 22 a 34, que tiene su pH ajustado con un aminoacido basico o un derivado de aminoacido basico o una sal del mismo.
Claims (2)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para preparar una preparacion estabilizada que contiene una protema fisiologicamente activa, que comprende ajustar el pH a 5-7,5 con un aminoacido basico, en donde el aminoacido basico es histidina y en5 donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6.
- 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 es un anticuerpo anti-receptor de interleuquina-6 humanizado.
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