KR100249937B1 - 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은, (A) (1) 인간 L사슬 C영역, 및 (2) 인간 L사슬 구조영역(FR)과 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 상보성 결정영역(CDR)으로 이루어진 L사슬 V영역을 함유하는 L사슬과 (B) (1) 인간 H사슬 C영역, 및 (2) 인간 H사슬 FR과 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 CDR로 이루어진 H사슬 V영역을 함유하는 H사슬을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 재구성인 인간 항체인 것이다.

본 발명의 재구성 인간 항체의 대부분은 인간 항체와 면역원성이 더 적은 마우스 CDR에서 유도되었으므로, 본 발명의 재구성 인간 항체는 인간에 대하여 면역원성이 낮아서 치료 용도로 기대된다.

Description

[발명의 명칭]

인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체

[발명의 분야]

본 발명은 인간 인터루킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 마우스 모노클로날 항체의 가변영역(V영역), 인간 IL-6R에 대한 인간/마우스 키메라 항체, 인간 라이트 사슬(L사슬) V영역 및 인간 헤비(Heavy)사슬(H사슬) V영역의 상보성 결정영역(CDR)이 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR로 이식되어 있는 재구성된 인간 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기한 항체 또는 그 일부를 코딩하는 DNA를 제공한다. 본 발명은 상기 DNA를 함유하는 벡터, 특히 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환 또는 감염된 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 IL-6R에 대한 키메라 항체의 제조방법 및 인간 IL-6R에 대한 재구성된 인간 항체의 제조방법을 제공한다.

[발명의 배경]

인터루킨-6(IL-6)는 일련의 세포에 의해 생산되는 다기능 사이토킨이다. 이것은 면역반응, 급성기의 반응 및 조혈을 조절하며 숙주의 방어기전에서 중심적 역할을 할 수 있다. 이것은 목적세포의 성질에 따라 광범위한 조직에 대해 성장유도, 성장억제 및 분화유도 효과를 나타낸다. IL-6에 대한 특정한 수용체(IL-6R)는 IL-6의 다기능 성질에 따라 림프계뿐만 아니라 비림프계 세포상에서 발현된다. IL-6 유전자의 비정상적인 발현은 각종 질환, 특히 자기면역질환, 맥관막 세포증식성 사구체위염 및 형질세포종/골수종의 발병에 관련이 있는 것으로 추측된다(Hi-rano et al., Immunol. Today 11, 443-449,(1990)). 사람의 골수종 세포가 IL-6를 생산하고 IL-6R을 발현하는 것이 관찰되었다. 실험에서 IL-6에 대한 항체는 골수종 세포의 시험관내 성장을 억제하여 사람의 골수종의 발암에 있어서 오토크린 조절루프가 작용하는 것이 나타났다(Kawano et al., Nature, 332, 83 (1988)).

IL-6R은 여러가지 동물세포의 표면에 존재하는데 IL-6에 특이적으로 결합하여 있고 세포표면상의 IL-6R 분자수가 보고되어 있다(Taga 등, J. Exp. Med. 196, 967, (1987)). 또한, 인간 IL-6R을 코딩하는 cDNA는 클론되어 IL-6R의 1차 구조가 알려져 있다(Yamasaki et al., Science, 241, 825, (1988)).

마우스 항체는 인체내에서 고도의 면역원성이 있어서 인체내에서의 그들의 치료학적 가치는 제한된다. 인체내에서의 마우스 항체의 반감기는 비교적 짧다. 또한, 마우스 항체는 예정된 효과를 방해할 뿐만 아니라 환자에게 알레르기 반응을 일으킬 위험이 있는 면역반응을 일으킴 없이 수회 투여할 수 없다.

이러한 문제들을 해결하기 위하여 인간형질화된 마우스 항체를 제조하는 방법이 개발되었다. 마우스 항체는 두가지 방법으로 인간형질화될 수 있다. 보다 간단한 방법은 원래의 마우스 모노클로날 항체에서 V영역을 유도하고 적절한 인간 항체에서 C영역을 유도하는 키메라 항체를 제조하는 것이다. 제조된 키메라 항체는 원래 마우스 항체의 완전한 V영역을 함유하여 원래 마우스 항체와 같은 특이성을 갖는 항원에 결합할 것으로 기대된다. 또한, 키메라 항체는 사람이외에서 유래된 단백질 시퀀스의 비율이 실질적으로 감소되었으므로 원래 마우스 항체보다 면역원성이 적을 것으로 예상된다. 키메라 항체가 항원에 잘 결합되어 면역원성이 낮을 것으로 예상되기는 하지만 마우스 V영역에 대한 면역반응의 가능성은 여전히 남아 있다(LoBuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4220-4224,(1989)).

마우스 항체를 인간형질화하는 두번째 방법은 더욱 복합하기는 하지만 마우스 항체의 잠재적 면역원성을 대폭적으로 감소시킨다. 이 방법에 따르면 마우스 항체의 V영역으로부터의 상보성 결정영역(CDR)은 인간 V영역에 이식되어 재구성된 인간 V영역을 제조하게 된다. 이렇게 재구성된 인간 V영역은 인간 C영역에 결합된다. 인간이외의 단백질 시퀀스에서 유도된 최종적인 재구성 인간 항체의 일부만이 CDR이다. CDR은 매우 가변적인 단백질 시퀀스로 구성되어 있다. 이들은 종특이적 시퀀스를 나타내지 않는다. 이러한 이유로 마우스 CDR을 함유하는 재구성 인간 항체는 인간 CDR을 함유하는 천연 인간 항체보다 더 높은 면역원성을 갖지 않을 것이다.

상기한 바와 같이 재구성 인간 항체는 치료목적으로 유용할 것으로 예상되나 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체는 알려져 있지 않다. 또한, 임의의 특정한 항체에 대해서도 보편적으로 적용할 수 있는 재구성 인간 항체의 제조방법도 없다. 그러므로, 특정한 항원에 대한 충분히 활성인 재구성 인간 항체를 제조하기 위해서는 다양한 연구가 필요하다. 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체, 즉 PM1 및 MT18이 제조되었고(일본 특허출원 평2-189420호), 본 발명자들은 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체, AUK12-20, AUK64-7 및 AUK146-15를 제조하였으나 본 발명자들에 따르면 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체의 제조에 대한 문헌은 없었다.

본 발명자들은 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체를 인간 골수종세포계가 이식된 누드 마우스에 주입하였을 때 종양의 성장이 현저하게 억제되는 것을 발견하였다. 이는 항-인간 IL-6 수용체 항체가 골수종의 치료제로써 유용하다는 것을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 목적은 인간 IL-6R에 대한 면역원성이 감소된 항체를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체를 제공한다. 본 발명은 재구성 인간 항체의 제조시에 유용한 인간/마우스 키메라 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 재구성 인간 항체의 일부, 재구성 인간 항체와 그 일부 및 키메라 항체의 제조를 위한 발현계를 제공한다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 V영역 및 H사슬 V영역을 제공한다.

본 발명은

(1) 인간 L사슬 C영역 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 V영역으로 이루어진 L사슬; 및

(2) 인간 H사슬 C영역 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 V영역으로 이루어진 H사슬을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 키메라 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 V영역의 CDR 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 V영역의 CDR을 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 인간 L사슬 V영역의 구조영역(FR),

(2) 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 V영역의 CDR을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 항체의 재구성 인간 L사슬 V영역; 및

(1) 인간 H사슬 V영역의 FR,

(2) 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 V영역의 CDR을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 항체의 재구성 인간 H사슬 V영역을 제공한다.

본 발명은 또한,

(1) 인간 L사슬 C영역;

(2) 인간 FR 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR을 함유하는 L사슬 V영역으로 이루어진 인간 IL-6R에 대한 항체의 재구성 인간 L사슬; 및

(1) 인간 H사슬 C영역,

(2) 인간 FR 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR로 이루어진 H사슬 V영역을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 항체의 재구성 인간 H사슬을 제공한다.

본 발명은

(A) (1) 인간 L사슬 C영역,

(2) 인간 L사슬 FR 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 CDR로 이루어진 L사슬 V영역을 함유하는 L사슬; 및

(B) (1) 인간 H사슬 C영역,

(2) 인간 H사슬 FR 및 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 CDR로 이루어진 H사슬 V영역을 함유하는 H사슬을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체를 제공한다.

본 발명은 상기한 항체의 폴리펩타이드 또는 그 일부를 코딩하는 DNA를 제공한다.

본 발명은 상기한 DNA로 이루어진 벡터, 예를들면 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 상기한 벡터로 형질전환되거나 감염된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 인간 IL-6R에 대한 키메라 항체의 제조방법 및 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체의 제조방법을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 항체 펩티드 발현에 유용한 인간 사이토메갈로 비루스(HCMV) 프로모터/인핸서 시스템으로 이루어진 발현벡터를 나타낸 것이다.

제2도는 인간 IL-6R에 결합하는 본 발명의 키메라 항체 AUK12-20의 능력을 확인하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제3도는 인간 IL-6R에 IL-6의 결합을 억제하는 본 발명의 키메라 항체 AUK12-20의 능력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

제4도는 인간 IL-6R과 본 발명의 카메라 항체 PM1a와 PM1b의 결합에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제5도는 인간 IL-6R과의 결합에서 인간 IL-6를 억제하는 본 발명의 키메라 항체 PM1a와 PM1b의 능력을 시험한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제6도는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 제1버젼을 제조하는 다이아그램이다.

제7도는 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 제1버젼을 제조하는 다이아그램이다.

제8도는 H사슬의 발현에 유용한 인간 연장인자 1α(HEF-1α) 프로모터/인핸서로 이루어진 발현플라스미드 HEF-12h-gγ1의 제조방법을 나타낸 것이다.

제9도는 L사슬의 발현에 유용한 HEF-1α 프로모터/인핸서 시스템으로 이루어진 발현플라스미드 HEF-12k-gk의 제조방법을 나타낸 것이다.

제10도는 H사슬의 발현에 유용한 증폭을 위한 결함 SV40 프로모터/인핸서 시퀀스에 결합된 디하이드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 및 HCMV 프로모터/인핸서로 이루어진 발현플라스미드 DHFR-PMh-gγ1의 제조방법을 나타낸 것이다.

제11도는 H사슬의 발현에 유용한 증폭을 위한 결함 SV40 프로모터/인핸서 시퀀스에 결합된 dhfr 유전자와 EF1 α 프로모터/인핸서로 이루어진 발현플라스미드 DHFR-△E-RVh-PM1-f의 제조방법을 나타낸 것이다.

제12도는 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a'' 및 ''b''의 인간 IL-6R에 결합하기 위한 능력을 나타낸 그래프이다.

제13도는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 버젼 ''f'' + 재구성 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a''의 인간 IL-6R에 결합하기 위한 능력을 나타낸 그래프이다.

제14도는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 버젼 ''f'' + 재구성 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a''의 인간 IL-6R에, IL-6의 결합을 억제하는 능력을 나타낸 그래프이다.

제15도는 L사슬과 H사슬 각각의 발현에 유용한 인간 EF-1α 프로모터/인핸서로 이루어진 발현플라스미드 HEF-V_L-gk 및 HEF-V_H-gγ1을 나타낸 것이다.

제16도는 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA의 제조방법을 나타낸 것이다.

제17도는 인간 IL-6R에 결합하는 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역의 능력을 확인하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 이 도면에서 ''표준 AUK 12-20(키메라)''은 CHO 세포에 의해 생산되어 다량으로 정제된 키메라 AUK12-20 항체에 대한 결과를 의미한다.

제18도는 인간 IL-6R에 결합하는 재구성 인간 AUK12-20 항체(L사슬 버젼''a''+H사슬 버젼''b'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제19도는 인간 IL-6R에 결합하는 재구성 인간 AUK12-20 항체(L사슬 버젼''a''+H사슬 버젼''d'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제20도는 재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역의 화학적 합성방법을 나타낸 것이다.

제21도는 인간 IL-6R에 대한 IL-6의 결합을 억제하는 재구성 인간 sle1220 항체(L사슬 버젼 ''a'' +H사슬 버젼''a'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제22도는 인간 IL-6R에 대한 IL-6의 결합을 억제하는 재구성 인간 sle1220 항체(L사슬 버젼 ''a'' +H사슬 버젼 ''b'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제23도는 인간 IL-6R에 대한 IL-6의 결합을 억제하는 재구성 인간 sle1220 항체(L사슬 버젼 ''a'' +H사슬 버젼 ''c'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

제24도는 인간 IL-6R에 대한 IL-6의 결합을 억제하는 재구성 인간 sle1220 항체(L사슬 버젼 ''a'' +H사슬 버젼 ''d'')의 능력에 대한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.

[과제를 해결하기 위한 구체적인 방법]

[마우스 V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝]

더욱 상세하게는, 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코딩하는 DNA를 클론하기 위해서는 유전자원으로써 인간 IL-6R에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조할 필요가 있다. 이러한 하이브리도마로써 일본특허출원 평2-189420호에는 모노클로날 항체 PM1을 생산하는 마우스 하이브리도마 PM1과 그의 작용이 기재되어 있다. 본 발명에서의 참고예 1과 2에는 이 하이브리도마 PM1의 제조방법을 기재하였다. 본 발명자들은 하이브리도마 AUK12-20, AUK64-7 및 AUK146-15를 제조하였으며 이들 각각은 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체를 생산한다. 이들 하이브리도마의 제조방법은 참고예 3에 기재하였다.

마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코딩하는 목적하는 DNA를 클론하기 위해서 하이브리도마 세포를 균질화하고 Chirgwin 등, Biochemistry 18, 5294, (1977)에 기재된 종래의 방법에 따라 전체 RNA를 얻었다. 전체 RNA는 J.W. Larrick 등, Bio-technology, 7, 934,(1989)에 기재된 방법에 따른 단일가닥 cDNA의 합성에 사용하였다.

다음으로, 폴리머라제 사슬반응(PCR)방법을 이용하여 상기 cDNA의 관련부분의 특이적 증폭을 실시하였다. 마우스 모노클로날 항체의 κL사슬 V영역의 증폭을 위하여 시퀀스 번호 1 내지 11에 나타낸 11개 군의 올리고뉴클레오티드 프라이머(마우스 카파 변수;MKV)와 시퀀스 번호 12에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머(마우스 카파 상수:MKC)를 각각 5'-말단 프라이머와 3'-말단 프라이머로 사용하였다. 상기 MKV 프라이머는 마우스 κL사슬 리더시퀀스를 코딩하는 DNA 시퀀스와 혼성화하였고, MKC 프라이머는 마우스 κL사슬 정상영역을 코딩하는 DNA 시퀀스와 혼성화하였다. 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 V영역의 증폭을 위하여 시퀀스 번호 13 내지 22에 나타낸 10개 군의 올리고뉴클레오티드 프라이머(마우스 헤비 변수; MHV)와 시퀀스 번호 23에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 (마우스 헤비 상수; MHC)를 각각 5'-말단 프라이머와 3'-말단 프라이머로 사용하였다.

즉, 5'-말단 프라이머는 그의 5' 말단 근처에 제한효소 SalI 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 시퀀스 GTCGAC를 포함하고, 3'-말단 프라이머는 그 5-말단근처에 제한효소 XmaI 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 시퀀스 CCCGGG를 포함한다. 이러한 제한효소 절단부위는 가변영역을 코딩하는 DNA 절편을 클로닝 벡터로 서브클론하는데 사용된다.

다음으로, 증폭 생성물을 제한효소 SalI과 XmaI으로 절단하여 마우스 모노클로날 항체의 목적하는 V영역을 코딩하는 DNA 절편을 얻었다. 한편, 플라스미드 pUC19 등의 적절한 클로닝 벡터를 동일한 제한효소 SalI과 XmaI으로 절단하고 이 DNA 절편을 절단된 pUC19와 연결하여 마우스 모노클로날 항체의 목적한 V영역을 코딩하는 DNA 절편을 포함하는 플라스미드를 얻었다.

클론된 DNA의 시퀀싱은 종래의 방법에 의해 실시할 수 있다.

목적 DNA의 클로닝과 그 시퀀싱은 실시예 1 내지 3에 상세하게 기재하였다.

[상보성 결정영역 (CDR)]

본 발명은 본 발명의 각 V영역의 초가변영역 또는 상보성 결정영역을 제공한다.

L사슬과 H사슬 각 쌍의 V영역은 항원결합부위를 형성한다. L사슬 및 H사슬상의 그 영역은 동일한 일반적 구조를 가지며 각 영역은 시퀀스가 비교적 보존된 4개의 구조영역(FR)으로 이루어지며 이들은 3개의 CDR(Kabat,E.A., Wu,T.T., Bilofsky, H., Reid-Miller, M. and Perry, H., in ''Sequences of Proteins of Immunological Interest'', US Dept. Health and Human Services (1983) 참조)에 의해 연결되어 있다. 4개의 FR 은 대부분 β-시이트 구조를 채택하고 있고, CDR은 FR을 연결하는 루프를 형성하며 어떤 경우에는 β-시이트 구조의 일부분을 이루고 있다. CDR은 FR에 근접하여 위치하고 다른 영역의 CDR과 함께 항원결합부위의 형성에 참여한다. 상기 CDR은 실시예 4에 기재하였다.

[키메라 항체의 제조]

인간 IL-6R에 대한 항체의 재구성 인간 V영역을 설계하기에 앞서, 사용되는 CDR이 실제로 유효한 항원결합영역을 이루는지 확인할 필요가 있다. 이러한 목적으로 키메라 항체를 제조하였다. 또한, 실시예 1과 2에 기재된 4종류의 마우스 모노클로날 항체의 클론된 DNA의 뉴클레오티드 시퀀스에서 추정된 마우스 항인간 IL-6R 항체의 V영역의 아미노산 시퀀스를 서로 비교하고 기지의 마우스 및 인간 항체의 V영역과 비교하였다. 4종류의 마우스 모노클로날 항체 각각에 대하여 전형적인 기능성 마우스 L 및 H사슬 V영역 1세트를 클론하였다. 그러나, 마우스 항 IL-6R 항체 4종류 모두 비교적 다른 V영역을 가졌다. 상기 4종류의 항체는 서로 단순하게 다소의 차이가 있는 것은 아니었다. 클론된 마우스 V영역을 사용하여 4종류의 키메라 항-IL-6R 항체를 제조하였다.

키메라 항체를 제조하는 기본 방법은 PCR-클론된 cDNA에서 보이는 바와 같이 마우스 리더시퀀스와 V영역 시퀀스를 포유동물 세포 발현벡터에 이미 존재하는 인간 C영역을 코딩하는 시퀀스와 결합하는 것으로 이루어진다. 상기 4종류의 모노클로날 항체중에서 모노클로날 항체 AUK12-20으로부터 키메라 항체의 제조를 실시예 5에 기재하였다.

모노클로날 항체 PM-1에서 키메라 항체의 제조는 실시예 6에 기재하였다. 마우스 PM-1 κL사슬 리더와 V영역을 코딩하는 cDNA를 인간 κ C영역을 코딩하는 제놈성 DNA를 함유하는 발현벡터에 PCR-서브클론하였다. 마우스 PM-1 H사슬 리더와 V영역을 코딩하는 cDNA를 인간 감마-1 C영역을 코딩하는 제놈성 DNA를 함유하는 발현벡터에 PCR-서브클론하였다. 특별히 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 마우스 PM-1 V영역을 코딩하는 cDNA를 그들의 5'-와 3'-말단에 도입하여 (1) 이들이 발현벡터에 용이하게 삽입되고 (2) 이들이 발현벡터에서 적절하게 기능할 수 있도록 하였다. 그리고 나서 PCR-변성된 마우스 PM-1 V영역을 이미 목적하는 인간 C영역을 함유하는 HCMV 발현벡터에 삽입하였다(제1도). 이들 벡터는 다양한 포유동물 세포계에서 유전자조작된 항체의 일과성 발현 또는 안정한 발현 모두에 적절하다.

마우스 PM-1 항체(버젼a)에 존재하는 V영역과 동일한 V영역을 가지는 키메라 PM-1 항체를 제조함과 함께, 키메라 PM-1 항체의 제2버젼을 제조하였다(버젼b). 키메라 PM-1 항체(버젼b)에 있어서, L사슬 V영역의 107위치의 아미노산은 아스파라긴에서 리신으로 변화되었다. 마우스 PM-1 항체로부터의 L사슬 V영역과 기타 마우스 L사슬 V영역의 비교에 있어서, 107위치의 아스파라긴이 이상하다는 것이 주목되었다. 마우스 κ L사슬 V영역에서 107위치의 가장 전형적인 아미노산은 리신이다. 마우스 PM-1 항체의 L사슬 V영역중의 107위치에 비전형적인 아미노산인 아스파라긴을 가지는 중요성을 평가하기 위해 107위치를 전형적인 아미노산 라신으로 변화시켰다. L사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스에서 필요한 변화를 일으키기 위해 PCR-돌연변이 방법(M. Kamman et al., Nucl. Acids Res. 17:5404(1989))를 사용하여 이러한 변화를 일으켰다.

키메라 PM-1 항체 버젼(a)는 인간 IL-6R에 결합하는 활성을 나타냈다. 키메라 PM-1 항체 버젼(b)도 버젼(a)와 같이 인간 IL-6R에 결합하였다. 유사하게 다른 2종류의 모노클로날 항체 AUK64-7과 AUK146-15로부터 키메라 항체를 제조하였다. 모두 4종류의 항체가 인간 IL-6R에 잘 결합되어 정확한 마우스 V영역이 클론되었고 시퀀스되었음을 기능분석에서 나타내었다.

4종류의 마우스 항-IL-6R 항체에서 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체의 설계 및 제조를 위한 제1후보로써 PM-1 항체가 선택되었다. 마우스 PM-1 항체의 선택은 대부분 누드 마우스에 이식된 인간 골수종양세포에 대한 마우스 항-IL-6R 항체의 효과를 연구하여 얻은 결과에 근거하였다. 4종류의 마우스 항-IL-6R 항체중에서 PM-1 항체가 가장 강력한 항종양세포 활성을 나타내었다.

[마우스 모노클로날 항체 PM-1의 V영역과 기지의 마우스 및 인간]

[항체의 V영역 비교]

마우스 모노클로날 항체의 CDR이 인간 모노클로날 항체에 이식된 재구성 인간 항체를 제조하기 위해서는 마우스 모노클로날 항체의 FR과 인간 모노클로날 항체의 FR간에 고도의 상동성이 요구된다. 그러므로, 마우스 PM-1 항체의 L 및 H사슬 V영역의 아미노산 시퀀스를 단백질 시퀀스에 대한 OWL(또는 Leeds) 데이타베이스에서 발견되는 모든 기지의 마우스 및 인간 V영역과 비교하였다.

마우스 항체의 V영역에 관해서는 PM-1 항체의 L사슬 V영역은 마우스 항체 musigkcko(Chen, H.T. et al., J. Biol. Chem. 262:13579-13583 (1987))의 L사슬 V영역과 매우 유사하고 93.5%의 동질성을 갖는다. PM-1 항체의 H사슬 V영역은 마우스 항체 musigvhr2(F.J. Grant et al., Nucl. Acids Res. 15:5496 (1987))의 H사슬 V영역과 거의 유사하고 84.0%의 동질성을 갖는다. 마우스 PM-1 V영역은 기지의 마우스 V영역에 대하여 높은 비율의 동질성을 나타내어 마우스 PM-1 V영역이 전형적인 마우스 V영역임을 나타내었다. 이는 또한 클론된 DNA 시퀀스가 정확하다는 간접적인 증거를 제공한다. 일반적으로 H사슬 V영역간에서 보다 L사슬 V영역간에 더 높은 비율의 동질성이 존재한다. 이것은 아마도 H사슬 V영역에 비하여 L사슬 V영역에서 일반적으로 관찰되는 다양성이 적기 때문일 것이다.

인간 항체의 V영역에 관해서는 PM-1 항체의 L사슬 V영역은 REI로도 일컬어지는 인간 항체 klhure(W. Palm et al., Physiol. Chem. 356:167-191 (1975))의 L사슬 V영역과 거의 유사하며 72.2%의 동질성을 가진다. PM-1 항체의 H사슬 V영역은 인간 항체 humighvap(VAP) (H.W. Schroeder et al., Science 238:791-793 (1987))의 H사슬 V영역과 거의 유사하며 71.8%의 동질성을 가진다. 인간 V영역에 대한 비교는 마우스 PM-1 항체로부터 재구성 인간 항체를 어떻게 설계하는가를 고려하기 위해 매우 중요하다. 인간 V영역에 대한 동질성 비율은 마우스 V영역에 대한 동질성 비율보다 적다. 이는 마우스 PM-1 V영역이 마우스 V영역에 유사하며 인간 V영역에는 유사하지 않다는 간접적인 증거이다. 이러한 증거는 또한 환자에게서 면역원성 문제를 피하기 위해 마우스 PM-1 V영역을 인간형질화하는 것이 최선임을 시사한다.

마우스 PM-1 항체로부터의 V영역을 E. A. Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, U.S. Department of Health and Human services, U.S. Government Printing Office)에 의해 정의된 인간 V영역의 상이한 서브그룹에 대한 컨센서스 시퀀스와 비교하였다. 이러한 비교는 V영역의 FR간에 이루어졌으며 그 결과를 표 1에 기재하였다.

[표 1]

마우스 PM-1 L사슬 V영역의 FR은 인간 L사슬 V영역의 서브그룹I(HSGI)에 대한 컨센서스 시퀀스의 FR과 매우 유사하고 70.1%의 동질성을 가진다. 마우스 PM-1 H사슬 V영역의 FR은 인간 H사슬 V영역의 서브그룹II(HSG II)에 대한 컨센서스 시퀀스의 FR과 매우 유사하고 52.9%의 동질성을 가진다. 이러한 결과들은 기지의 일간 항체와의 비교에서 얻어진 결과를 뒷받침한다. 인간 REI의 L사슬 V영역은 인간 L사슬 V영역의 서브그룹I에 속하며 인간 VAP의 H사슬 V영역은 인간 H사슬 V영역의 서브그룹II에 속한다.

인간 항체내의 V영역과의 이러한 비교들로부터 재구성 인간 PM-1 V영역의 설계를 위한 근거가 되는 인간 V영역을 선택할 수 있다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 설계를 위해서는 서브그룹I(SGI)에 속하는 인간 L사슬 V영역을 사용하고 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 설계를 위해서는 서브그룹II(SG II)에 속하는 인간 H사슬 V영역을 사용하는 것이 최선이 될 것이다.

[재구성 인간 PM-1 가변영역의 설계]

재구성 인간 PM-1 V영역을 설계하는 제1단계는 설계의 기초가 되는 인간 V영역을 선택하는 것이다. 마우스 PM-1 L사슬 V영역중의 FR은 서브그룹 I에 속하는 인간 L사슬 V영역중의 FR과 매우 유사하다(표 1). 상기한 바와 같이 마우스 PM-1 L사슬 V영역과 기지의 인간 L사슬 V영역과의 비교에서 인간 L사슬 V영역의 서브그룹I중 하나인 인간 L사슬 V영역 REI와 매우 유사하였다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역을 설계하는데 있어서는 REI의 FR이 사용되었다. 또한 REI FR은 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역 제조를 위한 출발물질로 사용되었다.

REI에 기초한 이들 인간 FR에는 원래의 인간 REI중의 FR과 5개의 차이가 있다(Kabat 등(1987)에 따른 39, 71, 104, 105 및 107위치; 표 2). FR4중의 3개의 변화(104, 105, 107위치)는 다른 인간 κ L사슬의 J영역에 기초하였으므로 인간으로부터 일탈하지는 않는다(L. Riechmann et al., Nature 322:21-25 (1988)). 39와 71위치에서의 2개의 변화는 래트 CAMPATH-1 L사슬 V영역에 있는 아미노산으로 되돌아가는 변화였다(Riechmann et al., (1988)).

재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 2개의 버젼이 설계되었다. 제1버젼(버젼''a'')에서는 인간 FR은 재구성 인간 CAMPATH-1H에 존재하는 REI에 기초하는 FR (Riechmann et al., (1988))과 동일하고 마우스 CDR은 마우스 PM-1 L사슬 V영역의 CDR과 동일하였다. 제2버젼(버젼''b'')은 버젼''a''에 기초하였고, 인간 FR3의 71위치의 아미노산 1개만이 달랐다. C. Chothia 등(J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))에 의해 정의된 바와 같이 잔기 71은 L사슬 V영역의 CDR1의 표준구조의 부분이다. 이 위치의 아미노산은 L사슬 V영역의 CDR1 루프의 구조에 직접적으로 영향을 미칠 것으로 예상되고, 그러므로 항원결합에 크게 영향을 미칠 것이다. 마우스 PM-1 L사슬 V영역에 있어서 71위치는 티로신이다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a''의 설계에 사용되는 변성된 REI FR에 있어서 71위치는 페닐알라닌이었다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼''b''에 있어서는 71위치의 페닐알라닌은 마우스 PM-1 L사슬 V영역에서 발견된 바와 같은 티로신으로 변화되었다. 마우스 PM-1 L사슬 V영역, 재구성 인간 CAMPATH-1H 항체(Riechmann et al., (1988))에 사용하기 위해 변성된 REI의 FR 및 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 2개 버젼 등의 아미노산 시퀀스를 표 2에 기재하였다.

[표 2]

주 : REI의 FR은 재구성 인간 CAMPATH-1H 항체에서 발견된 것들이다(Riechmann et al., 1988). REI FR중의 5개의 밑줄친 아미노산 잔기들은 인간 REI의 아미노산 시퀀스(Palm et al., (1975); O. Epp et al., Biochemistry 14:4943-4952(1975))와는 상이한 것들이다.

마우스 PM-1 H사슬 V영역의 FR은 서브그룹II에 속하는 인간 H사슬 V영역의 FR과 매우 유사하였다(표 1). 상기한 바와 같이 마우스 PM-1 H사슬 V영역과 기지의 인간 H사슬 V영역과의 비교에서 인간 H사슬 V영역의 서브그룹II중의 하나인 인간 H사슬 V영역 VAP와 매우 유사하였다. 인간 H사슬 V영역의 서브그룹II의 다른 하나인 인간 H사슬 V영역 NEW의 FR을 코딩하는 DNA 시퀀스는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역 제조를 위한 출발물질 및 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역을 설계하기 위한 기초로써 사용되었다.

재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 6개의 버젼을 설계하였다. 6개 버젼 모두에서 인간 FR은 재구성 인간 CAMPATH-1H(Riechmann et al., (1988))에 존재하는 NEW FR에 기초하였고 마우스 CDR은 마우스 PM-1 H사슬 V영역의 CDR과 동일하였다. 인간 FR중의 7개의 아미노산 잔기(1, 27, 28, 29, 30, 48 및 71; 표 3)는 항원결합에 부적합한 영향을 나타낼 수 있을 것으로 확인되었다. 마우스 PM-1 V영역의 모델에서 H사슬 V영역의 잔기 1은 CDR 루프에 가까이 위치한 표면잔기이다. 잔기 27, 28, 29 및 30은 C. Chothia 등 (Nature 34:877-883 (1989))에 의해 예측된 바와 같이 H사슬 V영역의 CDR1의 표준구조의 일부이거나 및/또는 H사슬 V영역의 제1구조루프의 일부를 이루는 마우스 PM-1 V영역의 모델에서 관찰되었다(Chothia, (1987)). 잔기 48은 마우스 PM-1 V영역의 모델에서 묻혀진 잔기로 관찰되었다. 묻혀진 잔기내의 변화는 V영역과 그의 항원결합부위의 전체 구조를 분쇄시킬 수 있다. 잔기 71은 Chothia 등(1989)이 예측한 바와 같이 H사슬 V영역의 CDR2의 표준구조의 부분이다. 재구성 인간 PM-1 항체의 6개 버젼은 인간 NEW FR내의 이들 7개 위치에서의 아미노산 변화의 상이한 결합을 포함한다(표 3).

[표 3]

주 : NEW의 FR은 재구성 인간 CAMPATH-1H 항체의 제1버젼에서 발견된 것들이다(Riechmann et al., 1988).

[재구성 인간 PM-1 V영역의 제조]

재구성 인간 PM-1 L 및 H사슬 V영역의 제1버젼은 PCR에 기초한 신규한 방법을 사용하여 제조하였다. 요약하면, 이미 적절한 인간 FR를 함유하는 재구성 인간 V영역을 코딩하는 플라스미드 DNA를 PCR 프라이머로 변성하여 출발 재구성 인간 V영역에 존재하는 CDR을 마우스 PM-1 항체의 CDR로 대체하였다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 제조를 위한 출발물질은 재구성 인간 D1.3 L사슬 V영역을 함유하는 플라스미드 DNA이었다. 재구성 인간 D1.3 L사슬 V영역은 REI의 인간 L사슬 V영역에 존재하는 FR에 기초하여 제조되었다. 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 제조를 위한 출발물질은 재구성 인간 D1.3 H사슬 V영역을 함유하는 플라스미드 DNA이었다. 재구성 인간 D1.3 H사슬 V영역은 NEW(M. Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))의 인간 H사슬 V영역에 존재하는 FR에 기초하여 제조되었다.

목적하는 인간 FR을 함유하는 출발 플라스미드 DNA를 선택한 후, PCR 프라이머는 마우스 D1.3 CDR 대신에 마우스 PM-1 CDR이 치환될 수 있도록 설계되었다. 각각의 재구성 인간 PM-1 V영역에 대하여 마우스 PM-1 CDR을 코딩하는 DNA 시퀀스를 함유하는 3개의 프라이머와 재구성 인간 V영역을 코딩하는 전체 DNA 시퀀스에 인접한 2개의 프라이머를 설계하여 합성하였다. 일련의 PCR 반응에서 5개의 PCR 프라이머를 사용하여 출발 재구성 인간 V영역에 존재하는 인간 FR과 마우스 PM-1 V영역에 존재하는 CDR로 이루어진 PCR 생성물을 얻었다(실시예 7, 제7도 및 제8도 참조). PCR 생성물을 클론하고 시퀀스하여 재구성 인간 PM-1 L 및 H사슬 V영역의 버젼 ''a''의 전체 DNA 시퀀스가 정확한 아미노산 시퀀스 (시퀀스번호 55)를 코드하는 것을 확인하였다.

재구성 인간 PM-1 V영역의 잔여 버젼은 알려진 PCR-돌연변이법(Kamman et al., (1989))을 약간 변형하여 제조하였다. 재구성 인간 PM-1 V영역의 설계에 대하여 기재한 바와 같이 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 1개의 추가 버젼(버젼''b'')을 제조하였고, 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 5개의 추가 버젼(버젼''b'', ''c'', ''d'', ''e'' 및 ''f'')을 제조하였다. 이러한 추가 버젼은 제1버젼에서의 일련의 미세한 변화를 함유한다. 아미노산 시퀀스에서의 이러한 미세한 변화는 PCR 돌연변이를 사용하여 DNA 시퀀스에서 미세한 변화를 일으켰다. DNA 시퀀스에 필요한 변화가 삽입될 수 있도록 PCR 프라이머를 설계하였다. 일련의 PCR 반응에 이어서 PCR 생성물을 클론하고 시퀀스하여 DNA 시퀀스중의 변화가 계획대로 일어났는지를 확인하였다. 재구성 인간 PM-1 항체 H사슬 V영역 버젼''f''의 시퀀스를 시퀀스 번호 54에 기재하였다.

재구성 인간 PM-1 V영역의 상이한 버젼의 DNA 시퀀스를 시퀀싱하여 확인한 후, 재구성 인간 PM-1 V영역을 인간 C영역을 함유하는 포유동물 세포 발현벡터에 서브 클론하였다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역을 인간 κ C영역을 코딩하는 DNA 시퀀스에 결합하였다. 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역은 인간 감마-1 C영역을 코딩하는 DNA 시퀀스에 결합하였다. 재구성 인간 PM-1 항체의 발현을 고수준으로 얻기 위해서 제1도에 나타낸 HCMV 발현벡터를 변성하여 HCMV 프로모터-인핸서 영역을 인간 연장인자 (HEF-1α) 프로모터/인핸서로 대체하였다(제15도 참조).

다음으로, 재구성 인간 L사슬 버젼(a) 및 (b)와 H사슬 V영역 버젼 (a) 내지 (f)와의 모든 조합을 인간 IL-6R과의 결합에 대해 시험하여 그 결과, 실시예 11에 상세하게 기재된 바와 같이 L사슬 버젼(a)와 H사슬 버젼(f)로 이루어진 재구성 인간 항체가 키메라 PM-1 (a) (제13도)와 동일한 수준으로 IL-6R에 결합하는 능력을 나타냈다.

[발현수준을 개선하기 위한 재구성 인간 PM-1 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스의 변성]

cos 세포에서 제조되는 재구성 인간 PM-1 항체의 발현수준 검토에서 재구성 인간 H사슬의 발현수준은 항상 재구성 인간 L사슬의 발현수준 또는 키메라 L 또는 H사슬보다 거의 10배가 낮다는 것이 분명하게 확인되었다. 재구성 인간 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA에 낮은 수준의 발현을 일으키는 문제가 있는 것으로 보인다. 낮은 수준의 단백질 발현이 낮은 수준의 전사때문인지를 규명하기 위하여 재구성 인간 PM-1 L사슬 및 H사슬을 발현하는 벡터로 동시감염된 cos 세포로부터 RNA를 제조하였다. 마우스 PM-1 V영역의 PCR 클로닝에 대하여 기재한 바와 같이 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 재구성 인간 L 또는 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA의 말단을 삽입하도록 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 재구성 인간 L사슬 V영역 또는 재구성 인간 H사슬 V영역에 해당하는 cDNA에서 PCR 생성물을 제조하였다.

재구성 인간 L사슬 V영역에 대하여는 예상한 바와 같이 408bp의 길이를 가지는 하나와 다른 1개의 더 짧은 299bp의 PCR 생성물 등, 2개의 PCR 생성물이 존재하였다. 정확한 크기의 PCR 생성물은 PCR 생성물의 전체 수득량의 약 90%를 차지하고, 더 짧은 PCR 생성물은 전체 수득량의 약 10%를 차지하였다. 재구성 인간 H사슬 V영역에 대하여, 2개의 PCR 생성물이 존재하며 1개는 예상처럼 444bp의 길이를 가지며 다른 1개는 더 짧은 370bp였다. 그러나, 이 경우에는 부정확한 더 짧은 PCR 생성물이 PCR 생성물 전체 수득량의 대부분인 약 90%를 차지하고, 정확한 크기의 PCR 생성물은 PCR 생성물 전체 수득량의 약 10%만을 차지하였다. 이러한 결과는 재구성 인간 V영역을 코딩하는 일부 RNA들이 삭제되었음을 나타낸다.

삭제된 시퀀스를 결정하기 위하여 더 짧은 PCR 생성물을 클론하고 시퀀스하였다. 그 DNA 시퀀스로부터 L 및 H사슬 V영역 모두에 대하여 DNA의 특정한 부분이 삭제된 것이 분명하게 되었다. 삭제된 시퀀스를 삽입한 DNA 시퀀스의 시험에서 이들 시퀀스가 스플라이스(splice) 공여체-수용체 시퀀스에 대한 컨센서스 시퀀스에 해당하는 것이 드러났다 (Breathnach, R. et al., Ann. Rev. Biochem. 50:349-383 (1981)). 재구성 인간 H사슬 발현의 낮은 수준은 재구성 인간 H사슬 V영역의 설계가 보다 효율적인 스플라이스 공여체-수용체 부위를 부주의하게 형성시켰기 때문이라고 설명된다. 또한, 재구성 인간 L사슬 V영역의 설계는 오히려 비효과적인 스플라이스 공여체-수용체 부위를 부주의하게 형성시켰기 때문으로 보여진다. 이러한 스플라이스 공여체-수요체 부위를 제거하기 위해, 재구성 인간 PM-1 L사슬 및 H사슬 V영역의 버젼 ''a'' 및 ''f''를 코딩하는 DNA 시퀀스 각각에 상기한 PCR 돌연변이법을 이용하여 약간의 변성을 일으켰다.

감소된 수준의 발현에 대한 또 다른 가능한 이유는 재구성 인간 L 및 H사슬 V영역(시퀀스 번호 54 및 55) 모두의 리더시퀀스에 있는 인트론 때문인 것으로 생각된다. 이들 인트론은 원래 재구성 인간 D1.3 및 V영역(Verhoeyen et al., (1988))의 제조에 사용된 마우스 mu H사슬 리더시퀀스(M.S. Neuberger 등, Nature 314:268-270 (1985))에서 유도되었다. 재구성 인간 D1.3은 마우스 면역글로부린 프로모터를 사용한 포유동물 세포 벡터에서 발현되므로 마우스 리더 인트론의 존재는 중요하다. 리더 인트론은 면역글로부린 프로모터로부터의 발현에는 중요하나 HCMV와 같은 비루스성 프로모터로부터의 발현에는 중요하지 않은 (M.S. Neuberger et al., Nucl. Acids Res. 16: 6713-6724 (1988)) 시퀀스를 함유하고 있다. 재구성 인간 PM-1 L 및 H사슬이 면역글로부린 프로모터가 아닌 프로모터를 사용하는 벡터에서 발현되는 경우, 리더시퀀스중의 인트론은 재구성 인간 V영역을 코딩하는 cDNA의 PCR 클로닝에 의해 제거되었다(실시예 12).

저하된 수준의 발현에 대한 또 다른 가능한 이유는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역과 인간 감마-1 C영역간의 인트론내의 약 190bp의 비기능적 DNA의 존재때문인 것으로 생각된다. 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역은 원래 재구성 인간 B1-8 H사슬 V영역(P.T. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986))에서 유도된 DNA 시퀀스로부터 제조되었다. 상기한 최초의 재구성 인간 V영역은 마우스 NP H사슬 V영역(M.S. Neuberger et al., Nature (1985); M.S. Neuberger et al., EMBO J. 2:1373-1378 (1983))으로부터 제조되었다. 재구성 인간 H사슬 V영역과, 발현벡터에 재구성 인간 V영역의 결합을 위한 BamHI 부위간의 인트론중에 존재하는 약 190bp의 스트레치(stretch)는 재구성 인간 V영역을 코딩하는 cDNA의 PCR 클로닝에서 제거되었다.

발현수준을 개선시키기 위해 변형된 재구성 인간 PM-1 L 및 H사슬 V영역의 최종 버젼의 DNA와 아미노산 시퀀스를 시퀀스 번호 57과 56에 기재하였다. 상기 DNA 시퀀스들은 표 2에 기재한 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼''a''와 표 3에 기재한 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 버젼''f''를 코드한다. HEF-1α 발현벡터(제15도)에 삽입될 때, 이들 벡터들은 순간적으로 감염된 cos 세포에서 약 2 ㎍/㎖의 항체를 제조한다. 재구성 인간 PM-1 항체를 안정하게 대량 생산하기 위해 dhfr 유전자를 통합한 새로운 HEF-1α 발현벡터를 제조하였다(실시예 10, 제11도). 결함이 있는 dhfr 유전자를 인간 감마-1 H사슬을 발현하는 HCMV 벡터에 대해 기재한 바와 같이 인간 감마-1 H사슬을 발현하는 HEF-1α에 삽입하였다. 재구성 인간 PM-1 L사슬을 발현하는 HEF-1α 벡터와 재구성 인간 PM-1 H사슬을 발현하는 HEF-1α-dhfr 벡터를 CHO dhfr(-) 세포에 함께 감염시켰다. 안정하게 형질전환된 CHO 세포계는 뉴클레오시드가 없는 10% FCS와 500㎍/㎖의 G418을 함유하는 α-Minimum Essential Medium (α-MEM) 중에서 선택하였다. 유전자의 증폭단계에 앞서서 CHO 세포계는 재구성 인간 PM-1 항체를 1일 10㎍/10⁶세포까지를 생산하는 것이 관찰되었다.

[마우스 모노클로날 항체 AUK12-20의 V영역과 기지의 인간 항체 V영역 비교]

인간 κL사슬 V영역 서브그룹(HSG) I 내지 IV의 FR을 함유하는 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20의 κL사슬 V영역 FR의 상동성과 인간 H사슬 V영역 서브그룹(HSG) I 내지 III의 FR을 함유하는 마우스 모노클로날 항체 AUK 12-20의 H사슬 V영역 FR의 상동성을 표 4에 기재하였다.

[표 4]

표 4에 보이는 바와 같이 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20의 κL사슬 V영역은 인간 κL사슬 V영역 서브그룹(HSG) I 내지 IV와 유사한 범위(64 내지 68%)에서 상동성을 가진다. 단백질에 대한 데이타베이스 ''LEEDS''의 조사에서 HSG-IV에 속하는 인간 항체 Len(M. Schneider et al., Physiol. Chem. 366:507-557 (1975))의 L사슬 V영역은 68%로 높은 수준의 상동성을 나타냈다. 반면, HSG-I에 속하는 마우스 모노클로날 항체 PM-1으로부터 재구성 인간 항체의 제조에 사용되는 인간 항체 REI는 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20의 L사슬 V영역과 62%의 상동성을 나타냈다. 또한, AUK12-20 항체 L사슬 V영역의 CDR, 특히 CDR2는 LEN 보다는 REI의 CDR의 표준 구조에 더 해당하였다.

이러한 사실을 고려할 때, HSG IV에 속하는 이러한 항체에서 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20 L사슬 V영역의 인간형질화에 사용되는 인간 항체를 선택할 필요는 없다. 그러므로, 마우스 모노클로날 항체 PM-1 L사슬 V영역의 인간형질화에 있어서와 같이, REI의 FR을 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20 L사슬 V영역의 인간형질화에 사용한다.

표 4에 보이는 바와 같이 항체 AUK12-20의 H사슬 V영역은 HSG I과 높은 상동성을 나타내었다. 또한, 데이타베이스 ''LEEDS''의 조사에서 HSG I에 속하는 인간 항체 HAX (Stollar, B.O. et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987))는 AUK12-20 항체 H사슬 V영역과 약 66%의 상동성을 나타냈다. 따라서, 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 설계하기 위해서는 HSG I에 속하는 인간 항체 HAX의 FR과 HSG I 컨센서스 시퀀스로 이루어진 FR(Ketteborough C.A. et al., Protein Engineering 4: 773-783 (1991))을 가진 인간형질화된 425 항체 H사슬 V영역의 FR을 사용하였다. 즉, AUK12-20 항체 H사슬 V영역은 인간형질화된 425 항체 H사슬 V영역의 버젼''a''와 약 64%의 상동성을 나타냈다.

[재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역의 설계]

상기한 이유에 따라 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역은 REI의 FR을 사용하여 표 5에 기재한 바와 같이 설계하였다.

[표 5]

주 : 5개의 밑줄친 뉴클레오티드는 CAMPATH-1H 항체의 설계에서 변화된 것이다(표 2의 주 참조).

[재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역의 설계]

상기한 이유에 따라 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 재구성 인간 VHa 425의 FR을 사용하여 설계하였다. 그러나, 설계된 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 시퀀스는 스플라이싱 공여체 시퀀스에 따르는 것을 발견하였다. 그러므로, 재구성 인간 PM-1 항체의 경우와 같이 재구성 인간 AUK12-20 항체내에 비정상적인 스플라이싱의 가능성이 있다. 따라서, 이 뉴클레오티드 시퀀스는 스플라이싱 공여체-유사 시퀀스를 제거하기 위해 부분적으로 변성되었다. 변성된 시퀀스는 버젼''a''로써 표시하였다.

또한, 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역의 버젼''b'' 내지 ''d''를 설계하였다. 버젼''a'' 내지 ''d''의 아미노산 시퀀스를 표 6에 기재하였다.

[표 6]

주 : 일반적인 아미노산 잔기 1개가 HSG I V_H영역 (SGI) 에서 확인되지 않는 위치는 ''X''로 표시하였다. 2개의 밑줄친 아미노산 잔기는 SGI 컨센서스 시퀀스에 존재하는 것들과는 다르다. RV_Hb, RV_Hc 및 RV_Hd에 대하여는 RV_Ha에 존재하는 것들과 다른 아미노산만을 기재하였다.

또한, SLE 환자의 B세포에서 유도된 하이브리도마 21/28세포에 의해 제조된 항사슬 인간 항체 HAX (J. Immunology 139:2496-2501 (1987); 그 아미노산 시퀀스는 제6도에 기재하였고 아미노산 시퀀스를 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 문헌의 제4 및 6도에 기재되어 있다)의 FR을 이용하여 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역의 버젼''a'' 내지 ''d''를 표 7에 기재한 바와 같이 설계하였다.

[표 7]

주 : sle1220Ha의 밑줄친 2개의 잔기는 HAX FR으로부터 변화되었다.

sle1220Hb, sle1220Hc 및 sle1220Hd에 대하여는 HAX FR에 있는 것과 다른 FR의 아미노산만을 기재하였다.

인간 IL-6R에 대한 본 발명의 키메라 또는 재구성 인간 항체를 제조하기 위하여는 임의의 발현계, 구축된 포유동물세포계 등의 동물세포, 균류세포 및 효모세포 등의 진핵세포와 E. coli와 같은 박테리아세포 등의 원핵세포들을 사용할 수 있다. 본 발명의 키메라 또는 재구성 인간 항체는 cos 세포 또는 CHO 세포 등의 포유동물 세포에서 발현되는 것이 바람직하다.

이러한 경우에 있어서는, 포유동물 세포에서의 발현에 유용한 일반적인 프로모터를 사용할 수 있다. 예를들면, 인간 사이토메갈로비루스 전기(human cytomegalovirus immediate early, HCMV) 프로모터 등의 비루스성 발현계를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV 프로모터를 함유하는 발현벡터의 예로는 제1도에 나타낸 바와 같이 pSV2neo에서 유도된 HCMV-V_H-HCγ1, HCMV-V_L-HC_K, HCMV-12h-gγ1, HCMV-12k-gk 등이 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 프로모터의 다른 바람직한 예는 인간 연장인자 1α(HEF-1α) 프로모터이다. 이 프로모터를 함유하는 발현벡터로는 HEF-12h-gγ1과 HEF-12h-gκ(제8도 및 제9도) 및 HEF-V_H-gγ1과 HEF-V_L-gκ(제15도)가 있다.

숙주세포계에서 dhfr 유전자 증폭을 위해서 발현벡터는 dhfr 유전자를 함유할 수 있다. dhfr 유전자를 함유하는 발현벡터는 DHFR-△E-PMh-gγ1, (제10도) DHFR-△E-RVh-PM1-f(제11도) 등의 예가 있다.

요약하면, 본 발명은 첫째 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 V영역 및 H사슬 V영역과 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA 및 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 이들은 인간 IL-6R에 대한 인간/마우스 키메라 항체와 재구성 인간 항체의 제조에 유용하다. 모노클로날 항체의 예로는 AUK12-20, PM-1, AUK64-7 및 AUK146-15 등이 있다. L사슬 V영역은 예를들면 시퀀스 번호:24, 26, 28 또는 30에 기재한 아미노산 시퀀스를 가지며, H사슬 V영역은 시퀀스 번호:25, 27, 29 또는 31에 기재한 아미노산 시퀀스를 가진다. 이러한 아미노산 시퀀스는 예를들면 시퀀스 번호 24와 31에 각각 나타낸 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코드된다.

본 발명은,

(1) 인간 L사슬 C영역 및 마우스 L사슬 V영역으로 이루어진 L사슬; 및

(2) 인간 H사슬 C영역 및 마우스 H사슬 V영역으로 이루어진 H사슬을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 키메라 항체에 관한 것이다.

마우스 L사슬 V영역과 마우스 H사슬 V영역 및 이들을 코딩하는 DNA는 상기에 기재한 바와 같다. 인간 L사슬 C영역은 임의의 인간 L사슬 C영역일 수 있는데, 예를들면 인간 C_κ이다. 인간 H사슬 C영역은 임의의 인간 H사슬 C영역일 수 있는데, 예를들면 인간 C_γ1이다.

키메라 항체를 제조하기 위하여 두개의 발현벡터, 즉 인핸서/프로모터 시스템 등의 발현조절영역의 조절하에서 마우스 L사슬 V영역과 인간 L사슬 C영역을 코딩하는 DNA로 이루어진 하나와 인핸서/프로모터 시스템 등의 발현조절영역 하에서 마우스 H사슬 V영역과 인간 H사슬 C영역을 코딩하는 DNA로 이루어진 다른 하나를 제조하였다. 다음으로 발현벡터는 포유동물 세포 등의 숙주세포에로 함께 감염되고 감염된 세포는 생체내 또는 시험관내에서 배양되어 키메라 항체를 생산하였다.

임의로 마우스 L사슬 V영역과 인간 L사슬 C영역을 코딩하는 DNA 및 마우스 H사슬 V영역과 인간 H사슬 C영역을 코딩하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입하고 이 벡터를 사용하여 숙주세포를 감염시키고, 생체내 또는 시험관내에서 배양하여 목적하는 키메라 항체를 생산하였다.

본 발명은 또한,

(A) (1) 인간 L사슬 C영역, 및

(2) 인간 L사슬 FR과, 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 L사슬 CDR로 이루어진 L사슬 V영역을 함유하는 L사슬;

(B) (1) 인간 H사슬 C영역, 및

(2) 인간 H사슬 FR과, 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 H사슬 CDR로 이루어진 H사슬 V영역을 함유하는 H사슬을 함유하는 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체를 제공하는 것이다.

바람직한 구현예에서 L사슬 CDR은 시퀀스 번호:24, 26, 28 또는 30에 기재된 아미노산 시퀀스를 가지며 이들 아미노산 시퀀스는 표 9에 정의하였고, 사슬 CDR은 시퀀스 번호: 25, 27, 29 또는 31에 기재된 아미노산 시퀀스를 가지며 이들 아미노산 시퀀스는 표 9에 정의하였고, 인간 L사슬 FR은 REI에서 유도되었고 인간 H사슬 FR은 NEW 또는 HAX에서 유도되었다.

상기 바람직한 구현예에서 L사슬 V영역은 RV_La로써 표 2에 기재된 아미노산 시퀀스를 가지며 H사슬 V영역은 RV_Ha, RV_Hb, RV_Hc, RV_Hd, RV_He 또는 RF_Hf로써 표 3에 기재된 아미노산 시퀀스를 가진다. 아미노산 시퀀스 RV_Hf가 가장 바람직하다.

재구성 인간 항체를 제조하기 위하여, 두개의 발현벡터, 즉 인핸서/프로모터 시스템 등의 발현조절영역의 조절하에서 상기에서 정의한 바와 같은 재구성 L사슬을 코딩하는 DNA로 이루어진 하나와 인핸서/프로모터 시스템 등의 발현조절영역 하에서 상기에서 정의한 바와 같은 재구성 인간 H사슬을 코딩하는 DNA로 이루어진 다른 하나를 제조하였다. 다음으로 발현벡터는 포유동물 세포 등의 숙주세포에로 함께 감염되고 감염된 세포는 생체내 또는 시험관내에서 배양되어 재구성 인간 항체를 생산하였다.

임의로 재구성 인간 L사슬을 코딩하는 DNA 및 재구성 인간 H사슬을 코딩하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입하고 이 벡터를 사용하여 숙주세포를 감염시키고, 생체내 또는 시험관내에서 배양하여 목적하는 재구성 인간 항체를 생산하였다.

제조된 재구성 인간 항체의 키메라 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 등의 일반적인 방법에 의해 분리, 정제할 수 있다.

본 발명의 키메라 L사슬 또는 재구성 인간 L사슬은 항체 전체를 제조하기 위해 H사슬과 결합시킬 수 있다. 유사하게, 본 발명의 키메라 H사슬 또는 재구성 인간 H사슬은 항체 전체를 제조하기 위하여 L사슬과 결합시킬 수 있다.

본 발명의 마우스 L사슬 V영역, 재구성 인간 L사슬 V영역, 마우스 H사슬 V영역 및 재구성 인간 H사슬 V영역은 본질적으로 항원, 인간 IL-6R에 결합하는 영역이므로 치료제 또는 진단제 제조에서 상기와 같이 또는 다른 단백질과의 융합 단백질로써 유용할 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 L사슬 V영역 CDR과 H사슬 V영역 CDR은 본질적으로 항원, 인간 IL-6R에 결합하는 영역이므로 치료제 또는 진단제 제조에서 상기와 같이 또는 다른 단백질과의 융합 단백질로써 유용할 것으로 기대된다.

본 발명의 마우스 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA는 키메라 L사슬을 코딩하는 DNA 또는 재구성 인간 L사슬을 코딩하는 DNA의 제조에 유용하다.

유사하게, 본 발명의 마우스 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA는 키메라 H사슬을 코딩하는 DNA 또는 재구성 인간 H사슬을 코딩하는 DNA의 제조에 유용하다. 또한, 본 발명의 L사슬 V영역 CDR을 코딩하는 DNA는 재구성 인간 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA와 재구성 인간 L사슬을 코딩하는 DNA의 제조에 유용하다. 유사하게, 본 발명의 H사슬 V영역 CDR을 코딩하는 DNA는 재구성 인간 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA 및 재구성 인간 H사슬을 코딩하는 DNA의 제조에 유용하다.

[실시예]

본 발명을 하기 비제한 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

[인간 IL-6R(1)에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝]

인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역을 코딩하는 DNA를 다음과 같이 클로닝했다.

[1. 전체 RNA의 조제]

하이브리도마 AUK12-20으로부터 전체 RNA를 치그윈(chirgwin) 등의 Biotechnology 18, 5294(1979)에 기재된 방법에 따라서 조제했다. 즉, 2.1×10⁸개의 하이브리도마 AUK12-20의 세포를 4M 티오시안산구아니딘 (FULKA) 20㎖중에서 완전히 균질화했다. 균질액을 원심분리관 중에서 5.3M 염화세슘 용액층상에 중층하고, 이어서 이것을 베조만 SW40 회전자중에서 31,000rpm으로 20℃에서 24시간 동안 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 이 RNA 침전물을 80% 에탄올로 세정하고, 이어서 1mM EDTA 및 0.5% SDS를 함유하는 10mM Tris-Hcl(pH2.5) 150㎕중에 용해시키고, 여기에 프로테나제(Boehringer)를 첨가하여 0.5㎎/㎖가 되게 한 후에, 37℃에서 20분동안 배양시켰다. 이 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, RNA를 에탄올로 침전시켰다. 다음에, RNA침전물을 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-Hcl(pH7.5) 200㎖중에 용해시켰다.

[2. 단일가닥 cDNA의 합성]

J.W. Larrick 등의 Biotechnology 7, 934 (1989)에 기재된 방법에 따라서 단일 가닥 cDNA를 합성하기 위하여, 상기와 같이 조제한 전체 RNA 약 5㎍를 40mM KCl, 6mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 0.5mM dATP, 0.5mM dGTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM dTTP, 35㎛올리고 dT프라이머(Amersham), 48유니트의 RAV-2 역전사효소(RAV-2:Rous associated virus 2; Amersham) 및 25유니트의 인간 태반 리보뉴클리아제 억제제(Amersham)를 함유하는 50mM Tris-Hcl(pH 8.3) 완충액 10㎕중에 용해시키고, 이 혼합물을 37℃에서 60분동안 배양시킨 후, 다음 폴리머라제 체인 반응(PCR)법에 직접 사용했다.

3. 항체 V영역을 PCR법에 의해 코딩하는 cDNA의 증폭 PCR법을 Thermal Cycler Model PHC-2(Techne)를 이용해서 행했다.

(1) 마우스 κ라이트(κL) 사슬 가변영역을 코딩하는 cDNA의 증폭

PCR법에 사용하는 프라이머는 시퀀스 번호 1~11로 나타낸 MKV(Mouse Kappa Variable) 프라이머[이것은 마우스 κL 사슬 리더시퀀스로 교잡시킴(S.T. Jones 등의 Biotechnology, 9, 88(1991)]와 시퀀스 번호12로 나타낸 MKC(Mouse Kappa Constant)프라이머[이것은 마우스 κL사슬 C영역(S.T. Jones 등의 Biotechnology 9, 88 (1991)]이다.

우선, 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 0.1mM dATP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dCTP, 0.1mM dTTP, 1.5mM MgCl₂, 2.5유니트의 DNA 폴리머라제 Ampli Taq(Perkin Elmer Cetus), 0.25㎛ 각각의 MKV 프라이머, 3㎛ MKC프라이머 및 단일가닥 cDNA 합성의 반응혼합물 1㎕로 되는 PCR 용액 100㎕를 초기온도 94℃에서 1.5분동안 가열시킨 후, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분동안 가열시켰다. 이 온도 사이클을 25회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 10분동안 더 배양시켰다.

(2) 마우스 H사슬 V영역을 코딩하는 cDNA의 증폭

PCR법에 사용하는 프라이머로써, 시퀀스 번호 13~22로 나타낸 MHV(Mouse Heavy Variable) 프라이머 1~10(S.T. Jones 등의 Biotechnology, 9, 88 (1991))와 시퀀스 번호 23으로 나타낸 MHC 프라이머(S.T. Jones 등의 Biotechnology, 9, 88 (1991))를 사용했다. 상기 3(1)에 있어서 κL사슬 V영역 유전자의 증폭에 기재된 것과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.

4. PCR 생성물의 정제 및 절편화

상기한 바와 같이, PCR법으로 증폭한 DNA절편을 QIAGEN PCR 생성물 정제 키트(QIAGEN Inc. US)를 사용해서 정제하고, 10mM MgCl₂및 150mM NaCl을 함유하는 100mM Tris-HCl(pH 7.6)중에서 10유니트의 제한효소 Sal I(GIBCO BRL)을 사용해서 37℃에서 3시간 동안 소화했다. 이 소화 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켜서 DNA를 회수했다. 다음에, DNA침전물을 10유니트의 제한효소 XmaI(New England Biolabs)를 사용해서 37℃에서 2시간동안 소화하고, 생성되는 DNA절편을 저융점 아가로즈(FMC Bio Products USA)를 사용하는 아가로즈 겔 전기영동에 의해서 분리했다.

약 450bp 길이의 DNA절편을 함유하는 아가로즈편을 절제하여 65℃에서 5분동안 용융시키고, 여기에 2mM EDTA 및 200mM NaCl을 함유하는 같은 용적의 20mM Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가했다.

이 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, DNA절편을 에탄올 침전법으로 회수하고, 이어서 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.5) 10㎕중에 용해시켰다. 이 방법으로, 마우스 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA절편과 마우스 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA절편을 얻었다. 상기 DNA절편들은 모두 그의 5'-말단에 Sal I 접착말단을, 3'-말단에 XmaI 접착말단을 가졌다.

5. 연결 및 형질전환

상기와 같이 하여 조제한 마우스 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 Sal I-Xma I DNA절편 약 0.3㎍을 50mM Tris-HCl(pH7.4), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 1mM 스퍼미딘, 1mM dATP, 0.1㎍/㎖의 소혈청 알부민 및 2유니트의 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)로 되는 반응혼합물 중에서, Sal I 및 Xma I에 의해서 플라스미드 pUC19를 소화해서 조제한 pUC19 벡터 약 0.1㎍을 사용해서, 16℃에서 16시간동안 반응시켜서 연결했다.

다음에, 상기 연결 혼합물 7㎕를 대장균 DH5α의 컴피턴트 세포(competent cells) 200㎕에 첨가하고, 이 세포를 얼음 위에서 30분, 42℃에서 1분, 다시 얼음 위에서 1분동안 배양시켰다. 이어서, SOS 배지(Molecular cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Habor Laboratory Press,1989) 800㎕를 첨가하고, 세포 현탁액을 37℃에서 1시간동안 배양시킨 후, 2xYT아가 플레이트(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Habor Laboratory Press, (1989))상에 접종시키고, 이어서 37℃에서 철야 배양해서 대장균 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2xYT베지 5㎖중에서 37℃에서 철야 배양시키고, 이 배양물로부터 알칼리법(Molecular cloning: A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Habor Laboratory Press, (1989))에 따라서 플라스미드 DNA를 조제했다. 하이브리도마 AUK12-20에서 유래하는 마우스 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 상기와 같이 하여 얻은 플라스미드를 p12-K₂로 명명했다.

상기한 것과 동일한 방법에 의해서, 하이브리도마 AUK12-20에서 유래한 마우스 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 SalI-XmaI DNA절편으로부터 제조하여 p12-h2로 명명했다.

[실시예 2]

[마우스 모노클로날 항체(2)의 V영역을 코딩하는 DNA의 클로닝]

실시예 1에 기재한 것과 실질적으로 동일한 방법을 하이브리도마 PM1, AUK 64-7 및 AUK146-15에 적용해서 하기 플라스미드를 얻었다.

하이브리도마 PM1에서 유래한 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pPM-k3, 하이브리도마 PM1에서 유래한 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pPM-h1, 하이브리도마 AUK64-7에서 유래한 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 p64-K4, 하이브리도마 AUK64-7에서 유래한 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 p64-h2, 하이브리도마 AUK146-15에서 유래한 κL사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 p146-k3 및 하이브리도마 AUK146-15에서 유래한 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드 p146-h1, 상기 플라스미드를 함유하는 대장균주는, 부다페스트조약에 의거하여 National Collections of Industrial and Marine Bactcria Limited에 1991년 2월 11일자로 기탁했고, 하기 표 8에 기재한 수탁번호를 얻었다.

[표 8]

[실시예 3]

[DNA 시퀀싱]

상기 플라스미드중의 cDNA 코딩영역의 뉴클레오티드 시퀀스를 키트, Sequenase^(™)Version 2.0(U.S, Biochemical CORP. USA)을 사용해서 결정했다.

우선, 상기와 같이 하여 얻은 플라스미드 DNA 약 0.3㎍을 0.2N NaOH로 변성하고, 시퀀스 프라이머로 어닐링시키고, 공급자의 처방에 따라서³⁵S-dATP로 표지했다. 다음에, 표지한 DNA를 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드겔에 적용하여 전기영동시킨 후에, 이 겔을 10% 메탄올 및 10% 아세톤으로 고정하고, 건조시킨 후, 자동방사선사진법으로 뉴클레오티드 시퀀스를 결정했다. 각 플라스미드중의 cDNA 코딩영역의 뉴클레오티드 시퀀스는 시퀀스 번호 24~31에 나타냈다.

[실시예 4]

[CDR의 결정]

L사슬 및 H사슬 영역의 일반적인 구조는 서로 유사하며, 여기서 4개의 프레임 워크(FR)가 3개의 초가변영역, 즉 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. FR중의 아미노산 시퀀스는 비교적 양호하게 보존되어 있지만, CDR중의 아미노산 시퀀스는 매우 높은 가변성을 갖는다(Kabat, E.A. 등의 ''Sequences of Proteins of Immunological Interest'', US Dept. Health and Human Services 1983).

인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 V영역의 상기 결정한 아미노산 시퀀스에 기초하고, Kabat, E.A.등의 ''Sequences of Proteins of Immunological Interest'', US Dept. Health and Human Services 1983에 따라서, 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 각 V영역의 CDR을 결정해서 하기 표 9에 나타냈다.

[표 9]

[실시예 5]

[클론화된 cDNA(1)의 발현 확인(키메라 AUK12-20 항체의 조제)]

[발현 플라스미드의 조제]

키메라 L사슬/H사슬을 AUK12-20의 V영역 κL사슬 및 H사슬을 코딩하는 PCR-클론화 cDNA로부터 조제했다. 마우스 AUK12-20 영역을 코딩하는 cDNA를, 인간 사이토메갈로비루스(HCMV) 발현벡터의 인핸서 및 프로모터를 함유하는 포유동물 세포 발현벡터 중에서 인간 C영역을 코딩하는 DNA에 용이하게 연결하기 위하여, 마우스 cDNA의 5'- 및 3'-말단에 편리한 제한효소 절단부위를 도입할 필요가 있다.

이 5'- 및 3'-말단의 변형은 PCR법으로 행했다. 2세트의 프라이머를 설계하여 합성했다. L사슬 V영역 후방 프라이머(시퀀스 번호:32) 및 H사슬 V영역 후방 프라이머(시퀀스 번호:33)를 조제해서, 이들 프라이머를 리더시퀀스의 처음을 코딩하는 DNA로 교잡시키고, 효율적인 번역을 위하여 필수의 DNA 시퀀스(Kozak, M., J. Mol. Biod. 196:947-950,(1987))을 유지하고, HCMV 발현벡터로 클로닝시키기 위한 HindIII부위를 형성했다. L사슬 V영역 전방 프라이머(시퀀스 번호:34) 및 H사슬 V영역 전방 프라이머(시퀀스 번호:35)를 조제해서, 이들 프라이머를 J영역의 말단 부분을 코딩하는 DNA로 교잡시키고, C영역으로 연결시키기 위하여 필수의 DNA 시퀀스를 유지하고, HCMV 발현벡터중의 인간 C영역에 연결시키기 위하여 BamHI 부위를 형성한다.

PCR법으로 증폭시킨 다음에, PCR생성물을 Hind III 및 BamH I 으로 소화되고, 인간 κ 및 γ1 사슬 C 영역 DNA를 함유하는 HCMV 벡터로 클론화시키고, 이어서, 시퀀스화시켜서 PCR 증폭 도중에 에러가 생기지 않은 것을 확인했다. 생성되는 발현 벡터를 HCMV-12k-gk 및 HCMV-12h-g γ1로 칭했다.

HCMV 발현 플라스미드의 구조를 제1도에 나타냈다. 플라스미드 HCMV-V_L-HC_K에 있어서, V_L영역을 임의의 마우스 L사슬 영역일 수 있다. 이 실시예에서, AUK 12-20 κL사슬 V영역을 삽입해서 HCMV-12k를 얻었다. 플라스미드 HCMV-V_H-HC γ1에 있어서, V_H영역을 임의의 마우스 H사슬 V영역일 수 있다. 이 실시예에서, AUK 12-20 H사슬 V영역을 삽입해서 HCMV-12h-g γ1을 얻었다.

[cos 세포에서의 일과성 발현]

키메라 AUK12-20 항체의 cos세포에서의 일과성 발현을 관찰하기 위하여, 상기와 같이 조제한 발현벡터를 cos세포 중에서 시험했다. 벡터 DNA를 Gene Pulsar 장치(Bio Rad)를 사용하는 전기천공법(electroporation)에 의해서 cos세포에 도입했다. 즉, cos세포를 세포농도 1×10⁷세포/㎖가 되도록 인산염-완충염수(PBS)에 현탁하고, 이 현탁액 0.8㎖에 DNA 10㎍(각 플라스미드당)을 첨가했다. 펄스를 1,900V 및 25μF에서 부여했다.

실온에서 10분의 회복기간 후에, 전기천공한 세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM(GIBCO) 8㎖에 첨가했다. 72시간동안 배양시킨 후, 배양 상징액을 모으고, 원심분리해서 세포파편을 제거하고, 무균조건하에서 4℃에서 단시간, 또는 -20℃에서 장시간 저장했다.

[효소면역침전법(ELISA)에 의한 키메라 항체의 정량]

형질전환된 cos세포의 배양 상징액 ELISA로 분석하여서 키메라 항체의 생산을 확인했다. 키메라 항체를 검출하기 위하여, 플레이트를 염소의 항 인체 IgG 전분자(Sigma)로 도포했다. 플레이트를 블록시킨 후, cos세포로부터 배양 상징액을 연속적으로 희석하여 각 웰(Well)에 첨가했다. 배양 및 세정한 후에, 알칼리성 포스파타제-결합 염소의 항 인체 IgG(γ-사슬 특이성, Sigma)를 각 웰에 첨가했다. 배양 및 세정한 후에, 기질 완충액을 첨가했다. 반응혼합물을 배양하고, 반응 종료 후, 450㎚에서 광학밀도를 측정했다. 표준으로서, 정제한 인간 IgG(Sigma)를 사용했다.

[인간 IL-6R과의 결합능을 확인하기 위한 ELISA]

형질전환된 cos세포의 배양 상징액을 분석해서, 생산된 항체가 항원과 결합될 수 있는지 여부를 걸정했다. 항원에 결합하는 것을 검출하기 위하여, 플레이트를 MT18 마우스 모노클로날 항체(참고예 1)로 도포하고, 1% 소혈청 알부민(BSA)으로 블록킹시킨 후, 가용성 조환 인간 IL-6R(SR 344)를 첨가했다. 세정 후, cos세포로부터 연속적으로 희석한 배양 상징액을 각 웰에 첨가했다. 배양 및 세정 후, 알칼리성 포스파타제-결합 염소의 항 인체 IgG를 첨가했다. 반응혼합물을 접종하고, 세정 후, 기질 완충액을 첨가했다. 배양 후, 배양을 정지하고, 405㎚에서 광학밀도를 측정했다.

결과를 제2도에 나타냈다. cos세포중으로 키메라 항체 AUK12-20을 코딩하는 유전자의 감염을 2회 반복했다. 배양 상징액 샘플은 모두 IL-6R에 대해서 강한 결합능을 나타냈고, 405㎚에서 광학밀도는 제2도의 열린 서클과 닫힌 서클로 나타낸 바와 같이, 샘플 희석도(모노클로날 항체농도)에 의존하여 변화해서, 샘플 중에서 IL-6R에 대한 항체의 존재가 나타났다.

[IL-6를 갖는 IL-6R에 대한 결합억제능의 측정]

배지 중에 존재하는 항체가 IL-6R과 IL-6의 결합을 억제하는지 여부를 측정하기 위하여, 플레이트를 MT18 모노클로날 항체(참고예 1)로 도포했다. 블록킹시킨 후, 여기에 가용성 조환 인간 IL-6R(SR344)를 첨가했다. 세정 후, cos세포 배양액으로부터 연속적으로 희석한 샘플을 비오틴화 IL-6R과 함께 각 웰에 첨가했다.

세정 후, 알칼리성 포스파타제-결합 스트렙토아비딘을 첨가하고, 배양 및 세정후, 기질 완충액을 첨가했다. 반응혼합물을 배양시키고, 반응을 정지시킨 후, 405㎜에서 광학밀도를 측정하고, 정제한 마우스 AUK12-20 모노클로날 항체를 양성 대조물로서 첨가하고, 비관련 항체를 발현하는 cos세포로부터의 배지를 음성 대조물로서 사용했다.

결과를 제3도에 나타냈다. 키메라 항체 AUK12-20을 코딩하는 유전자로 감염시킨 cos세포의 배양 상징액을 최고 및 두번째로 높은 농도에서 IL-6R과 IL-6의 결합을 억제하였다. 즉, 제3도에서 닫힌 서클로 나타낸 바와 같이, 405㎚에서의 광학밀도는 샘플희석도(항체농도)에 의존해서 변화해서, 샘플 중에서 항체에 의해서 IL-6R과 IL-6의 결합을 억제하는 것으로 나타났다. 이것은 양성대조(열린 서클)의 항체농도 의존변화와 실질적으로 일치하는 것으로 더욱 확인되었다. 음성 대조는 저해 활성(열린 삼각형)을 나타내지 아니했다.

[실시예 6]

[클론화 cDNA의 발현 확인(2)(키메라 PM-1 항체의 조제)]

[발현벡터의 조제]

키메라 PM-1 항체를 발현하는 벡터를 조제하기 위하여, 마우스 PM-1 κL사슬 및 H사슬 V영역을 각각 코딩하는 cDNA클론 pPM-k3 및 pPM-h1을 PCR기술로 변형하고, 이어서 HCMV 발현벡터 (제1도 참조)에 도입했다. L사슬 V영역용 후방 프라이머 pmk-s(시퀀스 번호:38) 및 H사슬 V영역용 후방 프라이머 pmh-s(시퀀스 번호:40)을 조제해서, 리더시퀀스의 처음을 코딩하는 DNA 시퀀스를 교잡하고, 또는 Kozak 컨센서스 시퀀스 및 Hind III 제한부위를 갖도록 했다. L사슬 V영역용 전방 프라이머 pmk-a(시퀀스 번호 :36) 및 H사슬 V영역용 전방 프라이머 pmh-a(시퀀스 번호:39)를 조제해서 J영역의 말단을 코딩하는 DNA 시퀀스를 교잡하고, 또한 스플라이스 공여체 시퀀스 및 BamHI 제한부위를 갖도록 했다.

κL사슬 V영역을 위해서, 2개의 전방 프라이머를 합성했다. 거의 κ사슬중에서, 위치 107에서 리신은 보존되어 있지만, 마우스 PM-1 κL사슬에 있어서, 위치 107은 아스파라긴이다. 키메라 PM-1 항체의 항원 결합활성에 대한 변화효과를 검토하기 위하여, 전방 프라이머 pmk-b(시퀀스 번호:37)를 조제해서 위치 107이 아스파라긴에서 리신으로 바뀌도록 했다. PCR 반응 다음에, PCR 생성물을 정제하고, Hind III 및 BamH I으로 소화하고, pUC19벡터(Yanishe-Perron 등, Gene 33, 103-109 (1985))로 서브클론화하였다. DNA 시퀀싱한 후, Hind III-BamH I 절편을 절제하고, 발현벡터 HCMV-V_H-HC γ1로 클론화해서 키메라 H사슬용 HCMV-pmh-g γ1을 얻고, 발현벡터 HCMV-V_L-HCk로 클론화해서 키메라 L사슬용 HCMV-pmka-gk 및 HCMV-pmkb-gk를 얻었다.

[cos세포의 형질전환]

키메라 인간 PM-1 항체의 일과성 발현을 관찰하기 위하여 벡터를 cos세포중에서 시험했다. HCMV-pmh-g γ1, 및 HCMV-pmka-gk 또는 HCMV-pmkb-gk를 Gene Pulsar 장치(Biorad)를 사용하여 전기천공법에 의해서 cos세포로 함께 형질전환했다. DNA(플라스미드당 10㎍)를 PBS중 1×10⁷세포/㎖의 0.8㎖에 첨가했다. 펄스를 1,900V, 25μF의 용량으로 전달했다. 실온에서 10분 회복시간 후, 전기천공한 세포를 10% γ-글로불린이 없는 송아지 태혈청을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(GIBCO) 20㎖에 첨가했다. 72시간 배양 후, 배지를 모으고, 원심분리해서 세포파편을 제거하고, 무균조건하에서 4℃에서 단기간 저장하거나, 또는 -20℃에서 장기간 저장했다.

[키메라 PM-1 항체의 발현 및 분석]

3일간의 일과성 발현 후에, cos세포로부터 배지를 모으고, 이어서 키메라 PM-1 항체에 대해서 시험했다. 우선, 배지를 ELISA로 분석해서 인간과 같은 항체가 형질전환된 cos세포에 의해서 생산되었는지 여부를 결정했다. 이 분석에서, 표준으로서 기지량의 정제된 인간 IgG를 사용하여, cos세포로부터 배지중에 존재하는 인간과 같은 항체(이 경우에, 키메라 PM-1 항체)의 양을 추정하는 것이 가능하다. 인간 항체를 검출하기 위하여, 플레이트를 염소 항-인체 IgG(전체분자, Sigma)로 도포했다. 블록킹시킨 후, cos세포로부터 샘플을 연속적으로 희석한 후, 각 웰에 첨가했다. 배양 및 세정 후, 알칼리성 포스타파제-결합 염소 항 인체 IgG(γ사슬 특이적, Sigma)를 첨가했다. 배양 및 세정후, 기질 완충액을 첨가했다. 배양 후, 반응을 정지시키고, 405㎚에서 광학밀도를 측정했다. 표준으로서 정제된 인간 IgG(Sigma)를 사용했다.

키메라 PM-1 유전자를 보유하는 벡터로 형질전환시킨 cos세포로부터 배지는 인간과 같은 항체의 발현에 대해서 양성이었고, 그 양을 상기와 같이 하여서 정량했다.

다음에, 키메라 PM-1 유전자를 보유하는 벡터로 형질전환시킨 cos세포로부터 동일한 배지를 인간 IL-6R에 결합하는 능력을 측정하기 위하여 사용했다. 항원의 결합을 측정하기 위하여, 플레이트를 인간 IL-6R에 대한 항체인 MT18 마우스 모노클로날 항체(참고예 1)로 도포했다. 블록킹시킨 후, 가용성 조환 인간 IL-6R(SR 344)을 첨가했다. 세정 후, 샘플을 연속적으로 희석시킨 후, 각 웰에 첨가했다. 배양 및 세정후, 알칼리성 포스파타제-결합 염소 항 인체 IgG(γ사슬 특이적, 시그마)를 첨가했다. 배양 및 세정후, 기질 완충액을 첨가했다. 배양 후, 반응을 정지시키고, 405㎜에서 광학밀도를 측정했다. 이 측정을 위하여 이용할 수 있는 표준품은 없었다.

2개의 샘플중 하나는 마우스 PM-1 항체(키메라 PM-1a 항체, 제4도)에서 발견된 것들과 같은 V영역을 갖는 키메라 항체를 코딩하는 유전자로 형질전환시킨 것이다. 다른 하나의 샘플은 상기한 바와 같이 L사슬 V영역중의 위치 107에서 단일 아미노산 변화를 갖는 키메라 항체를 코딩하는 유전자로 형질전환시킨 것이다(키메라 PM-1b 항체, 제4도). 샘플은 모두 샘플의 희석에 의해 감소하는 IL-6R에 대해 강한 결합을 나타냈다. 따라서, 조제된 키메라 PM-1 항체는 기능적이고, 그의 항원에 양호하게 결합할 수 있다. 가장 중요하기로는, 기능적 카메라 PM-1의 증명은 정확한 마우스 PM-1 V영역이 클론화되고, 시퀀스화되는 명백한 증거이다. L사슬 V영역 중의 위치 107에서 어느 아미노산을 갖는 키메라 PM-1항체도 그의 항원 IL-6R에 양호하게 결합했다. 마우스 PM-1 L사슬 V영역 중의 위치 107은 항원 결합에 있어서 그다지 중요하지 않으며, 이 위치에서 아스파라긴이나 리신도 만족하게 기능하는 것 같았다. 마우스 PM-1 항체는 그의 L사슬 V영역 중의 이 위치에서 아스파라긴을 가지므로, 키메라 PM-1 항체를 이용하는 그 후의 모든 연구는 마우스 PM-1 항체에서 발견된 것들과 같은 V영역을 갖는 버젼인 버젼 a로 행했다.

보다 많은 양의 키메라 PM-1 항체를 안정적으로 생산하기 위하여, dhfr유전자를 함유하는 새로운 HCMV 발현벡터를 조제했다. 키메라 PM-1 항체의 보다 높은 발현 수준을 달성하기 위한 제1단계는 벡터 HCMV-V_H-HC γ1(제1도)를 변형해서, 이 벡터가 결함이 있는 SV40 인핸서/프로모터에 의해 발현되는 dhfr유전자를 함유하도록 하는 것이다. SV40 인핸서 인자를 pSV2-dhfr벡터 (S. Subramani 등, Mol. Cell. Biol. 1:854-864(1981))로부터 제거하고, 결함이 있는 SV40 프로모터에 의해서 발현되는 dhfr유전자를 SV40 인핸서/프로모터에 의해서 발현되는 새로운 유전자 대신에, HCMV-V_H-HC γ1 벡터에 삽입했다. 이어서, 마우스 PM-1 V영역을 이 새로운 HCMV-V_H-HC γ₁-dhfr벡터에 삽입했다. 개량된 발현벡터의 조제는 실시예 10에 구체적으로 기술했다.

CHO dhfr(-)세포(G. Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220(1980))를 2개의 플라스미드 DNA, 즉 키메라 PM-1a L사슬(HCMV-pmka-gk) 발현용 HCMV-V_L-HCk 벡터 및 키메라 PM-1H사슬(DHFR-△E PMh-g γ1:실시예10) 발현용 HCMV-V_H-HC γ1-dhfr벡터로 동시에 형질전환시켰다. DNA(10㎍/㎖, 각 플라스미드)를 PBS중 1×10⁷세포 0.8㎖에 첨가했다. 펄스를 1,900V, 25μF의 전기용량에서 부여했다. 실온에서 10분간 회복 후, 전기천공한 세포를 뉴클레오시드 및 10% FCS를 함유하는 알파 최소필수배지(α-MEM) 10㎖에 첨가했다. 철야 배양시킨 후, 배지를 뉴클레오시드를 갖지 않고, 10% FCS 및 G418(GIBCO) 500㎍/㎖를 함유하는 α-MEM으로 변화시켜서 dhfr+ 및 네오+ 형질전환된 세포의 선택을 행했다. 선택후, 선택된 클론을 유전자를 증폭시키기 위하여 사용했다. 2×10^-8M 메토트렉세이트(MTX) 중에서 1라운드의 증폭 후, 키메라 PM-1a 항체 약 3.9㎍/10⁶세포/일을 생산하는 세포계(PM1k3-7)를 선택했다.

[인간 IL-6R에 IL-6R의 결합을 억제하는 키메라 항체의 능력에 대한 ELISA 측정]

형질전환된 cos세포 또는 안정한 CHO세포계에서 생산된 항체를 측정해서, 이 항체가 IL-6R에 결합하기 위한 비오티닐화 IL-6와 경쟁하는지 여부를 결정했다. 플레이트를 MT18 마우스 모노클로날 항체로 도포했다. 블록킹 후, 가용성 조환 인간 IL-6R(SR344)를 첨가했다. 세정후, cos세포로부터 얻은 샘플을 연속적으로 희석하고, 비오티닐화 IL-6와 함께 각 웰에 첨가했다. 세정후, 알칼리성 포스파타제-결합 스트렙타비딘을 첨가했다. 배양 및 접종 후, 기질 완충액을 첨가했다. 배양 후, 반응을 정지하고, 405㎚에서 광학밀도를 측정했다. 결과를 제5도에 나타냈다.

[실시예 7]

[재구성 인간 PM-1 항체의 조제]

보다 신속하고, 효율적으로 CDR 이식을 달성하기 위하여, PCR에 의한 순차 CDR 이식법을 개발했다. 이 방법은 PCR 변이유발법(Kamman 등, 1989)에 기초한 것이다.

CDR 이식을 위하여 선택된 인간 FR을 함유하는 주형 DNA를 조제하기 위하여, 적당한 재구성 인간 V영역을 편리한 벡터로 재클론시킬 필요가 있다. 플라스미드 DNA alys II 및 F10은 재구성 인간 D1.3 L 및 H사슬을 코드화하고, 인간 REI 및 NEW로부터 각각 FR을 함유한다. 재구성 인간 D1.3 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스를 함유하는 약 500bp의 NcoI-BamHI절편을 alys II로부터 절취하고, HindIII-BamHI으로 개열된 pBR327로 서브클론해서 벡터 V1-lys-pBR327을 얻었다. V1-lys-pBR327로부터 Hind III-BamHI 절편을 Hind III-BamHI에 의해서 개열된 pUC19로 삽입해서 벡터 V1-lys-pUC19를 얻었다. 재구성 인간 D1.3 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스를 갖는 약 700bp의 NcoI-BamHI 절편을 F10으로부터 절취하고, Hind III-NcoI 아답터를 사용해서, pBR327벡터의 Hind III-BamH I 부위로 서브클론화해서 Vh-lys-pBR327을 얻었다. 이어서, Hind III-BamHI절편을 이 벡터로부터 절취하고, Hind III-BamHI에 의해서 개열된 pUC19로 서브클론해서 Vh-lys-pUC19를 얻었다.

플라스미드 alys II 및 주형에서 사용한 재구성 인간 D1.3 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스를 기재했다. 주형으로서 사용한 플라스미드 F10중 재구성 인간 D.13 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스는 V. Verhoey 등의 Science 237:1534-1536(1988)의 제2도에 기재되어 있다.

제6도는 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 제1버젼을 조제하기 위하여 사용한 프라이머 및 PCR 반응을 나타낸 것이다. 후방 프라이머 A(APCR 1 ; 시퀀스 번호 41) 및 전방 프라이머 E(APCR 4 ; 시퀀스 번호 42)를 벡터상의 DNA 시퀀스에 교잡한다. APCR1 및 APCR4가 pUC19 벡터를 위해서 특이적으로 설계되어 있을지라도, 유니버살 M13 시퀀스 프라이머가 사용될 수 있다.

CDR 이식/변이유발 프라이머 B(phv-1 ; 시퀀스 번호 43), CDR2-이식 프라이머 C(phv-2 ; 시퀀스 번호 44) 및 CDR3-이식 프라이머 D(phv-3 ; 시퀀스 번호 45)는 40~60bp의 길이를 갖고, 마우스 PM-1 H사슬 V영역의 CDR 및 이 CDR 영역을 접하는 주형 DNA 중 인간 FR를 코딩하는 DNA 시퀀스로 구성된다. 제1PCR 반응에 있어서, 전방 프라이머 APCR4 및 후방 프라이머 D를 사용했다. 마우스 PM-1 CDR3 시퀀스를 함유하는 제1PCR 생성물을 정제하고, 후방 프라이머로서 프라이머 C를 갖는 전방 프라이머로서 제2PCR 반응에 사용했다. 동일한 방법으로, 마우스 PM-1 CDR2 및 CDR3를 함유하는 제2 및 제3PCR 생성물과 3개의 마우스 PM-1 CDR 모두를 다음 PCR 단계에서 프라이머로서 사용했다. 완전한 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역을 갖는 제4PCR 생성물을 정제하고, Hind III 및 Bam H I 으로 소화시키고, 추가로 분석하기 위하여 pUC19 벡터로 서브클론했다.

재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역을 조제하기 위하여 3개의 변이유발 프라이머 phv-1, phv-2 및 phv-3를 합성했다. 이들 프라이머를 8M 우레아를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 겔로 정제했다. 변이유발 프라이머 phv-1은 마우스 PM-1 CDR1의 이식뿐만 아니라 인간 FR1중의 위치 27 및 30에 있어서, 각각 Ser 내지 Tyr 및 Ser 내지 Thr의 변이를 위해서 조제했다. 각 100 ㎕의 PCR 반응물은 전형적으로 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 250㎛ dNTP, 50ng의 주형 DNA(Vh-lys-pUC19), 2.5u의 AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus) 및 프라이머를 함유했다. 각각 1㎛의 phv-3 및 APCR4 프라이머를 함유하는 제1PCR 반응을 행하고, 94℃에서 1.5분간 초기 변성 후, 94℃에서 1분간, 37℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 30사이클을 반복했다. 어닐링 단계와 합성 단계 사이의 변온시간은 2.5분으로 고정했다. 최종 사이클의 완료 후, 72℃에서 10분 동안 최종 연장반응을 행했다. 523bp의 PCR 생성물을 1.6% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, 이어서 제2PCR 반응에서 프라이머로서 사용했다.

제2PCR 반응에서, 약 1ng의 정제된 제1PCR 생성물과 250pmole의 변이유발 프라이머 phv-2를 프라이머로서 사용했다. PCR 조건은 제1PCR 반응에 대해서 기술한 조건과 동일했다. 동일한 방법으로, 제2PCR 반응에서의 665bp의 PCR 생성물과 제3PCR 반응에서의 737bp의 PCR 생성물을 프라이머 phv-1을 갖는 제3PCR 반응과 프라이머 APCR1을 갖는 제4PCR 반응에서 프라이머로서 사용했다. 제4PCR 반응에서의 1.172kb의 PCR 생성물을 정제하고, Hind III 및 BamH I으로 소화하고, 이어서 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역을 함유하는 약 700bp의 절편을 pUC19 벡터로 서브클론했다. 시퀀싱된 4개의 클론 중 2개가 정확한 아미노산 시퀀스를 코딩하는 DNA 시퀀스를 가졌고, 이것을 pUC-RVh-PM1a로 명명했다.

재구성 PM-1 H사슬 V영역의 다른 버젼을 조제하기 위하여, 5개의 변이유발 PCR 프라이머를 합성했다. 각 PCR 반응을 반드시 상기한 것과 동일한 조건하에서 행했다. 버젼 ''b''를 위해서, 변이유발 프라이머 phv-m4(Val-71 내지 Arg-71 ; 번호는 Kabat 등에 의한 것임, 표 3 참조)(시퀀스 번호 46) 및 APCR4를 주형 DNA로서 pUC-RVh-PM1a와 함께 제1PCR 반응에서 사용했다. 이 제1PCR 반응에서 PCR 생성물을 정제하고, 프라이머 APCR1을 갖는 제2PCR 반응에서 전방 프라이머로서 사용했다. 제2PCR 반응에서 PCR 생성물을 1.6% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, Hind III 및 BamHI으로 소화하고 pUC19 벡터로 서브클론해서 pUC-RVh-PM1b를 얻었다. 동일한 방법으로, 버젼 ''c''(pUC-RVh-PM1c)를 변이유발 프라이머 phv-nm(Asp1 내지 Gln-1)(시퀀스 번호 47) 및 주형 pUC-RVh-PM1b를 사용해서 얻었고 버젼 ''d''(pUC-RVh-PM1d)를 변이유발 프라이머 phv-mb(Ile-48 내지 Met-48)(시퀀스 번호 48) 및 주형 pUC-RVh-PM1b를 사용해서 얻었고, 버젼 ''e''(pUC-RVh-PM1e)를 변이유발 프라이머 phv-mb 및 주형 pUC-RVh-PM1c를 사용해서 얻었고, 버젼 ''f''(pUC-RVh-PM1f)를 변이유발 프라이머 phv-m7(Thr-28 내지 Ser-28 및 Phe-29 내지 Ile-29)(시퀀스 번호 49) 및 주형 pUC-RVh-PM1b를 사용해서 얻었다. 재구성 인간 H사슬 V영역의 버젼 ''f''의 아미노산 시퀀스와 그에 대한 뉴클레오티드 시퀀스 코딩은 시퀀스 번호 54에 나타냈다.

제7도는 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 제1버젼의 조제에 있어서 사용한 프라이머와 PCR 반응을 나타낸 것이다. 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 제1버젼을 조제하기 위하여, CDR1 이식 프라이머 pkv-1 (시퀀스 번호 50), CDR2 이식 프라이머 pkv-2(시퀀스 번호 51) 및 CDR3 이식 프라이머 pkv-3(시퀀스 번호 52)를 합성하여, 8% 우레아를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 겔로 정제하였다. PCR 반응을 상기한 바와 같이 행했다. 제1PCR 반응물은 각각 1㎛의 pkv-3 및 APCR4 프라이머를 함유했다. 제1PCR 반응에서 350bp의 PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, 제2PCR 반응에서 전방 프라이머로서 사용했다. 제2PCR 반응의 PCR 반응 생성물을 정제하고, BamHI 및 Hind III으로 소화하고, CDR3 이식 DNA를 함유하는 500bp의 절편을 DNA를 시퀀스화하기 위하여 pUC19 벡터로 서브클론했다. 정확한 시퀀스를 갖는 플라스미드 DNA를 동정했고, 다음 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용했다. 제3PCR 반응에 있어서, 250pmole의 변이유발 프라이머 pkv-2 및 APCR4를 사용했다. 제3PCR 반응의 PCR 생성물을 정제해서, 제4PCR 반응에서 프라이머 pkv-1과 함께 프라이머로서 사용했다. 동일한 방법으로, 제4PCR 반응의 PCR 생성물을 제5PCR 반응에서 APCR1 프라이머와 함께 프라이머로서 사용했다.

제5PCR 반응의 972bp의 PCR 생성물을 정제하고, BamHI 및 Hind III로 소화하고, DNA를 시퀀스화하기 위해서 pUC19 벡터로 서브클론했다. CDR2 영역에서 문제가 확인되었다. 2개의 추가 PCR 반응이 필요했다. 제6 및 제7PCR 반응에서, pUC19 벡터로 클론시킨 제5PCR 반응의 PCR 생성물을 주형 DNA로서 사용했다. 제6PCR 반응에서, 프라이머는 pkv-2 및 APCR4이였다. 제6PCR 반응의 PCR 생성물을 정제하고, 제7PCR 반응에서 APCR1 프라이머와 함께 프라이머로서 사용했다. 제7PCR 반응의 PCR 생성물을 정제하고, BamHI 및 Hind III으로 소화하고, 500bp의 DNA절편을 DNA를 시퀀싱하기 위하여 pUC19 벡터로 서브클론했다. 시퀀스된 5개의 클론중 2개는 정확한 DNA 시퀀스를 가졌다. 이 클론을 pUC-RV1-PM1a로 명명했다. 이 시퀀스를 시퀀스 번호 55에 나타냈다.

재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역 중 다른 버젼을 조제하기 위하여, 변이유발 프라이머 pkv-m1(시퀀스 번호 53)을 합성했다. PCR 반응은 본질적으로 상기한 바와 같다. 제1PCR 반응에서, 변이유발 프라이머 pkv-m1(Phe-71 내지 Tyr-71) 및 APCR4를 주형 DNA pUC-RV1-PM1a와 함께 사용했다. 제1PCR 반응의 PCR 생성물을 정제하고, 제2PCR 반응에서 APCR1 프라이머와 함께 프라이머로서 사용했다. 제2PCR 반응의 PCR 생성물을 정제하고, BamHI 및 Hind III으로 소화하고, DNA를 시퀀싱하기 위해서 pUC19 벡터로 서브클론했다. 이 클론을 pUC-RV1-PM1b로 명명했다.

[실시예 8]

[유전자로 조작된 항체를 포유동물 세포중에서 발현시키기 위한 인간 사이토메갈로비루스 전기(HCMV) 프로모터를 이용하는 벡터의 조제(제1도).]

키메라 PM-1 L사슬 및 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA절편을 포유동물 세포중에서 인간 카파 L사슬 또는 인간 γ-1 H사슬을 발현시키기 위하여 조제한 HCMV 벡터(HCMV-V_L-HC_K및 HCMV-V_H-HC γ1)로 초기에 삽입했다. HCMV 발현벡터 조제의 상세한 기재는 Maeda 등의 Human Antibodies and Hybridomas 2:124~134(1991); C.A. Kettleborough 등의 Protein Engeneering 4:773~783(1991)에 발표되었다. 벡터는 모두 pSV2neo(P.J. Southern 등의 J. Mol. Appln. Genet. 1:327~341(1982))에 기초했고, 면역글로부린 L사슬 및 H사슬의 높은 수준의 전사를 위하여 인간 사이토메갈로비루스(HCMV) 프로모터 및 인핸서(M. Boshant 등의 Cell 41:521~530(1985))를 함유했다. L사슬 발현벡터는 인간 카파 C영역 (T.H. Rabbitts 등의 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166~171(1984))을 코딩하는 제놈성 DNA를 함유하고, H사슬 발현벡터는 인간 γ-1 C영역(N. Takahashi 등의 Cell 29:671~679(1982))을 코딩하는 제놈성 DNA를 함유한다. HCMV 발현벡터는 다능이고, 여러가지의 포유동물 세포 타입에 있어서 일과성 및 안정한 발현 모두에 사용할 수 있다.

[실시예 9]

[유전자조작된 항체를 포유동물 세포 중에서 발현시키기 위한 인간 연장인자 1α(HEF-1α) 프로모터를 이용하는 벡터의 조제(제8도 및 제9도)]

인간 폴리펩티드 사슬 연장인자 1α(HEF-1α)는 가장 풍부한 단백질중의 하나이다. 이것은 거의 세포 중에서 발현된다. 인간 EF-1α 프로모터-인핸서의 전사 활성은 SV40 전기 프로모터-인핸서에 비해서 약 100배 강하다(D.W. Kirn 등의 Gene 91:217~223(1990) 및 T. Uetsuki 등의 J. Biol. Chem. 264:5791~5798(1989)). 약 2.5kb의 HEF-1α 프로모터-인핸서 영역은 유전자의 5'-말단에 접하는 약 1.5kb의 DNA, 제1엑손(exon)중의 33bp, 제1인트론(intron)중의 943bp 및 제2엑손 중 최초 부분의 10bp로 된다. 약 2.5kb의 Hind III-ECPRI 절편을 플라스미드 DNA pEF321-CAT (D.W. Kim 등, Gene 91:217~223 (1990), 및 T. Uetsuki 등, J. Biol. Chem. 264:5791~5798 (1987))로부터 절취하고, pdKCR벡터 DNA (M. Tsuchiya 등, EMBO J. 6:611~616(1987))(K. O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.78, 제3호, 1527~1531,(1981))로 클론화해서 SV40 전기 프로모터-인핸서 시퀀스를 함유하는 약 300bp의 HindIII-EcoRI 절편을 대체해서 pTEF-1을 얻었다. pTEF-1을 EcoRI으로 소화하고, 클레노우 폴리머라제로 채워넣고, Hind III 링커로 연결했다. 이어서, 약 1.6kb의 Hind III-SmaI 절편을 변형된 pTEF-1 벡터 DNA로부터 절취했다.

플라스미드 DNA HCMV-12h-g γ1(△E2)를 EcoRI으로 부분 소화하고, 클레노우 폴리머라제로 충전하고, 자가연결하여 실시예 5에서 조제한 HCMV-12h-g γ1으로부터 조제했다.

플라스미드 HCMV-12h-g γ1(△E2)를 EcoRI으로 소화하고, 클레노우 폴리머라제로 충전하고, Hind III으로 소화했다. 인간 γ-1 C영역을 코딩하는 DNA 시퀀스를 함유하는 생성되는 약 7kb의 절편을 HEF-1α 프로모터-인핸서를 함유하는 위에서 조제한 1.6kb의 Hind III-SmaI 절편에 연결해서 HEF-12h-g γ1을 얻었다. 이 벡터중 HEF-1α 프로모터-인핸서 영역은 5'-영역에 접하는 380bp의 DNA를 제외하고, pTEF-1의 그것과 동일하다. Hind III-BamHI절편으로서 존재하는 H사슬 V영역은 다른 H사슬 V영역과 용이하게 교환할 수 있다.

재구성 H사슬 V영역을 함유하는 Hind III-BamHI DNA절편을 pUC-RVh-PM1a, pUC-RVh-PM1b, pUC-RVh-PM1c, pUC-RVh-PM1d, pUC-RVh-PM1e, 및 pUC-RVh-PM1f(실시예 7)로부터 절취하고, HEF-12h-gr1의 Hind III-BamHI 부분에 삽입해서 발현벡터, RVh-PM1a, RVh-PM1b, RVh-PM1c, RVh-PM1d, RVh-PM1e 및 RVh-PM1f를 각각 얻었다. 발현벡터 RVh-PM1a, RVh-PM1b, RVh-PM1c, RVh-PM1d, RVh-PM1e 및 RVh -PM1f와 HEF-PMh-g γ1은 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역 버젼 ''a'', ''b'', ''c'', ''d'', ''e'' 및 ''f''와 마우스 PM-1 H사슬 V영역을 각각 갖는다.

L사슬 발현벡터인 HEF-12k-gk를 조제하기 위하여, HEF-1α 프로모터-인핸서 영역을 함유하는 약 3.0kb의 Pvu I-Hind III절편을 HEF-12h-g γ1으로부터 절취하고, 실시예 5에서 조제한 HCMV L사슬 발현벡터 HCMV-12k-gk로부터 약 7.7kb의 Pvu-Hind III 절편에 연결하여 HEF-12k-gk를 얻었다. H사슬 발현벡터 HEF-12h-g γ1의 경우와 같이, Hind III-BamHI 절편으로서 존재하는 HEF-12k-gk중 L사슬 V영역은 다른 L사슬 V영역과 용이하게 교환할 수 있다.

재구성 인간 L사슬 V영역을 함유하는 Hind III-BamHI DNA절편을 pUC-RV1-PM1a 및 pUC-RV1-PM1b(실시예7)로부터 절취하고, HEF-12k-gk의 Hind III-BamHI 부분에 삽입해서 발현벡터 RV1-PM1a 및 RV1-PM1b를 각각 얻었다. 발현벡터 RV1-PM1a, RV1-PM1b 및 HEF-PMk-gk는 재구성 인간 H사슬 V영역 ''a'', ''b'' 및 마우스 PM-1 L사슬 V영역을 각각 갖는다.

[실시예 10]

[유전자조작된 항체를 CHO세포중에서 높은 수준으로 발현시키기 위하여 결함 SV40 프로모터-인핸서 시퀀스에 연결된 디히드로폴레이트 리덕타제(dhfr) 유전자를 이용하는 벡터의 조제(제10도 및 제11도)]

SV40 전기 프로모터로부터 인핸서 시퀀스를 제거하기 위하여, 플라스미드 DNA pSV2-dhfr(S. Subramani 등, Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981)) (ATCC 33694)를 Sph I 및 Pvu II로 소화하고, 클레노우 폴리머라제로 소화하고, 자가연결해서 pSV2-dhfr-△E(제10도 참조)를 얻었다. HCMV 프로모터, H사슬 V영역 및 인간 γ-1 C 영역을 함유하는 약 3.7kb의 EcoRI 절편을 EcoRI으로 부분 소화해서 HCMV-PMh-g γ1로부터 절취했다. 이 절편을 EcoRI-소화 pSV2-dhfr-△E에 연결해서 DHFR-△E-PMh-g γ1을 얻었다.

유사한 벡터를 HEF-1α 프로모터-인핸서를 이용하는 H사슬 발현벡터에 기초해서 조제했다(제11도 참조). HCMV-12h-g γ1에서 유래한 약 3.7kb의 EcoRI 절편을 EcoRI-소화 pSV2-dhfr-△E와 연결해서 DHFR-△E-12h-g γ1을 얻었다. DHFR-△E-12h- g γ1중의 dhfr cDNA 시퀀스에 이어서 BamHI 부위를 BamHI으로 부분 소화해서 제거하고, 클레노우 폴리머라제로 충전하고, 자가연결했다. dhfr cDNA를 함유하는 약 4kb의 PvuI-BamHI 절편을 변형된 DHFR-△E-12h-g γ1 DNA로부터 절취하고, RVh-PM1f-4(실시예 12에서 조제)로부터 약 3kb의 PvuI-BamHI 절편에 연결해서 DHFR-△E-RVh-PM1f를 얻었다.

상기와 같이 제조한 개량된 발현 플라스미드를 본 발명의 재구성 인간 PH-1 항체를 생산하기 위하여 사용했다.

[실시예 11]

[재구성 인간 PM-1 항체의 여러가지 버젼의 발현 및 분석]

재구성 인간 PM-1 L사슬 및 H사슬을 발현시키는 HEF-1α 벡터를 cos세포 중에서 동시에 형질전환시켰다. 표준 대조물로서, 키메라 PM-1 L사슬 및 H사슬을 발현시키는 HEF-1α 벡터를 cos세포중에서 동시에 형질전환시켰다. 3일후 형질전환시킨 cos세포의 배지를 모으고, ELISA에 의하여 (1)상징액에 존재하는 인간 IgG 항체의 양과 (2)IL-6R에 결합하는 인간 IgG의 능력을 분석했다. 이어서, 동일한 샘플을 ELISA에 의해 시험해서 인간 IL-6이 인간 IL-6R에 결합하는 것을 억제하는 항체의 능력을 분석했다.

재구성 인간 PM-1 L사슬을 발현하는 2개의 벡터 중 하나(RV1-PM1a 또는 RV1-PM1b) 및 키메라 PM-1 H사슬(HCMV-PMh-g γ1)을 발현하는 벡터로 cos세포를 동시 형질전환시킴으로써 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역 중 2개의 버젼의 평가를 행했다. 이 세포를 또한 키메라 PM-1 L사슬 및 H사슬을 발현하는 벡터(HCMV-PMka-gk 및 HCMV-PMh-g γ1)로 동시에 형질전환시켰다. 미정제 cos세포 상징액을 사용하는 데이타는 IL-6R에 대한 결합의 평가에 있어서, 재구성 인간 PM-1 L사슬의 버젼 ''a''가 키메라 PM-1 L사슬과 동등한 것을 나타냈다. 그러나 재구성 인간 PM-1 L사슬의 버젼 ''b''는 IL-6R의 결합능을 실질적으로 폐지하였다(제12도 참조). 이들 결과로부터, FR3중 위치 71에서, 페닐알라닌(CAMPATH-1H를 위해 변형시킨 인간 REI중에 존재)으로부터 티로신(천연 인간 REI 및 마우스 PM-1중에 존재)으로의 변화는 기능적 항원 부위의 형성에 매우 유해한 것으로 결론지어졌다.

재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a''는 최상의 버젼으로 선택되었다. 재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 여러가지 버젼을 평가하기 위한 후속적인 실험에서, 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역의 버젼 ''a''를 항상 사용했다.

재구성 인간 PM-1 H사슬 V영역의 6개 버젼의 평가를 재구성 인간 PM-1 H사슬을 발현하는 6개의 벡터 중 하나(RVh-PM1a, RVh-PM1b, RVh-PM1c, RVh-PM1d, RVh-PM1e 또는 RVh-PM1f) 및 재구성 인간 PM-1 L사슬(RV1-PM1a)의 버젼 ''a''를 발현하는 벡터로 cos세포를 동시에 형질전환시켜서 행했다. 이 세포를 또한 키메라 PM-1 L사슬 및 H사슬을 발현하는 벡터(HEF-PMk-gk 및 HEF-PMh-g γ1)로 동시에 형질전화시켰다. 미정제 cos세포 상징액을 사용하는 예비 데이타는 재구성 인간 PM-1 L사슬의 버젼 ''a'' 및 재구성 인간 PM-1 H사슬의 버젼 ''f''가 IL-6R에 대한 결합의 평가에 있어서 키메라 PM-1 L사슬 및 H사슬과 동등한 것으로 나타났다.

이 예비 데이타를 확인하기 위하여, 키메라 및 재구성 인간 PM-1 항체를 농축하고, 단백질 A를 사용하는 cos세포 상징액으로부터 정제했다. 즉, cos세포의 배지를 100kd 커트-오프 한외여과장치(Amicon)를 사용하여 농축했다. 농축된 배지를 단백질 A 아가로즈(Affi-Gel Protein A MAPS II Kit, Biorad)를 사용하여 정제했다. 요약해서, 농축된 배지를 5베드 용적의 결합 완충액으로 평형시킨 단백질 A 아가로즈 컬럼에 적재했다. 이 컬럼을 15베드 용적의 결합 완충액으로 세정하고, 이어서 5베드 용적의 용출 완충액으로 세정했다. 용출액을 농축하고, 완충액을 마이크로콘센트레이터(Centricon 10, Amicon)를 사용하여 PBS로 변화시켰다. 정제된 항체를 추가 분석용으로 사용했다.

키메라 PM-1 항체, 및 재구성 인간 L사슬 V영역의 버젼 ''a'' 및 재구성 인간 H사슬 V영역의 버젼 ''a'', ''b'', ''c'', ''d'', ''e'' 및 ''f''를 갖는 재구성 인간 PM-1 항체의 정제된 샘플의 분석을 행했다. L사슬의 버젼 ''a''+ H사슬의 버젼 ''f''는 명백히 최상의 재구성 인간 PM-1 항체이었다. 이것은 키메라 PM-1항체와 동일하게 IL-6R에 결합한다(제13도). 이것은 또한 마우스 항체 및 키메라 PM-1 항체와 동일하게 IL-6R에 인간 IL-6가 결합하는 것을 저해한다(제14도).

[실시예 12]

[발현 수준을 개선시키기 위한 재구성 인간 PM-1 V영역의 개조]

재구성 인간 PM-1 L사슬 및 H사슬 V영역(시퀀스 번호 54 및 55)을 리더시퀀스를 코딩하는 DNA 시퀀스내에서 인트론을 제거하기 위하여, V영역을 코딩하는 cDNA를 PCR프라이머를 사용해서 재클론했다. L 및 H사슬 발현벡터 RV1-PM1a 및 RVh-PM1f를 cos세포로 동시에 형질전환시켰다. 48시간 후, 전체 RNA를 조제하고(Chirgwin 등, Biochemistry 18 : 5294-5299(1979)), 전체 RNA중 5㎍을 마우스 항체 V영역의 PCR 클로닝에 대해서 기술한 바와 같이 제1단일가닥 cDNA 합성을 위하여 사용했다. 3개의 PCR 프라이머를 설계해서 합성했다. LEV-P1(시퀀스 번호 60) 및 HEV-P1(시퀀스 번호 58) 은 스플라이스 공여체 시퀀스 및 BamHI 부위를 함유하고, L사슬 및 H사슬 V영역의 전방 프라이머로서 각각 사용했다. HEV-P2(시퀀스 번호 59)는 ATG 개시코돈 및 Hind III 부위 앞에 Kozak 컨센서스 시퀀스를 함유하고, L사슬 및 H사슬 V영역 모두에 대한 후방 프라이머로서 사용했다. 각 100㎕ PCR 반응물은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100, 0.1 ㎍ BSA, 250 ㎛ dNTP, 2.5u의 Vent DNA 폴리머라제 (Biolabs, U.K.), 50%의 제1단일가닥 cDNA 합성 반응물 및 각 100pmole의 전방 및 후방 프라이머를 함유했다. 각 PCR 튜브를 50㎕의 미네랄오일로 덮고, 이어서 94℃에서 1.5분간 초기 용융시킨 후, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간, 72℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 10분간 사이클시켰다. L사슬 V영역을 함유하는 408bp의 PCR 생성물 및 H사슬 V영역을 함유하는 444bp의 PCR 생성물을 2.0% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, BamHI 및 Hind III으로 소화하고, pUC19벡터로 서브클론해서 pUC-RV1-PM1a3 및 pUC-RVh-PM1f-3을 각각 얻었다.

재구성 인간 PM-1 L사슬 및 H사슬 V영역의 DNA 시퀀스는 부적절한 스플라이스 공여체 및 수용체 부위(시퀀스 번호 54 및 55)를 함유하는 것으로 나타났다. L사슬 V영역 내에서 이들 부위는 빈번하게 사용되지 아니하였으나(mRNA 중 약 10%), H사슬 V영역내에서 이들 부위는 빈번하게 사용되었다(mRNA 중 약 90%). 이 이상한 스플라이싱은 재구성 인간 PM-1 항체의 낮은 수준의 발현 결과를 가져왔다. V영역에서 이상한 스플라이싱을 피하기 위하여, 스플라이스 공여체 부위를 PCR법을 사용하여 제거했다. H사슬 V영역에 대해서, 후방 프라이머 NEW-SP1(시퀀스 번호 61) 및 전방 프라이머 NEW-SP2(시퀀스 번호 62)를 합성해서, DNA 시퀀스 TGG GTG AGA를 DNA 시퀀스 TGG GTT CGC로 변경시켰다. PCR반응의 조건은 상기 cDNA클로닝에 기술한 것과 같았으나, 예외로 주형 DNA는 50ng의 pUC-RVh-PM1f-3였고, 프라이머는 HEV-P2 및 NEW-SP2, 또는 HEV-P1 및 NEW-SP1이었다.

2개의 PCR 반응의 PCR 생성물은 2.0% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, PCR 결합반응에 사용했다. 제1PCR 생성물 0.5㎍ 및 Vent DNA 폴리머라제 5u를 함유하는 98㎕의 PCR 반응물을 94℃에서 2분간, 50℃에서 2분간, 72℃에서 5분간 배양시킨 후, 각각 100pmole의 HEV-P1 및 HEV-P2 프라이머를 첨가했다. PCR튜브를 30㎕의 미네랄오일로 덮고, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 1분간 25사이클의 PCR반응에 제공한 후, 72℃에서 10분간 배양시켰다.

동일한 방법으로, 재구성 인간 PM-1 L사슬 V영역 중의 스플라이스 공여체 부위를 PCR프라이머 REI-SP1(시퀀스 번호 63) 및 REI-SP2(시퀀스 번호 64)를 이용해서 제거하고, 이 프라이머들은 DNA 시퀀스 CAG GTA AGG를 DNA 시퀀스 CAG GAA AGG로 변경시켰다. PCR생성물 모두, 즉 L사슬 V영역의 408bp의 DNA절편 및 H사슬 V영역의 444bp의 DNA절편을 2.0% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제하고, Hind III 및 BamHI으로 소화하고, pUC19벡터로 서브클론해서 pUC-RV1-PM1a-4 및 pUC-RVh-PM1f-4를 각각 얻었다.

RVh-PM1f-4를, RVh-PM1f의 Hind III-BamHI 절편을 pUC-RVh-PM1f-4에서 절취한 Hind III-BamHI 절편으로 대체해서 조제했다. 재구성 인간 PM-1 항체 L사슬 V영역 버젼 ''a''(여기서 인트론을 삭제했음)의 시퀀스를 시퀀스 번호 57로 나타냈고, 재구성 인간 PM-1 항체 H사슬 V영역 버젼 ''f''(여기서 인트론을 삭제했음)의 시퀀스를 시퀀스 번호 56으로 나타냈다.

[실시예 13]

[재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA의 조제]

재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역을 코딩하는 DNA의 조제공정을 제16도에 나타냈다. 인간 항체 L사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 제한효소 Hind III 및 BamHI을 이용해서 pUC19로 결합했다. 8개의 PCR프라이머(A 내지 H)를 제조하고, V영역을 코딩하는 유전자를 형성하는 제1PCR 4영역 중에서 증폭했다. 프라이머 A 및 H는 pUC19벡터에 대해서 DNA 시퀀스에 대한 동족체를 갖는다. 프라이머 B, C 및 D는 결합시킬 CDR중 40~60bp 길이의 유전자 시퀀스를 갖는 프라이머이다. 프라이머 E, F 및 G는 각각 프라이머 B, C 및 D의 5'-말단에서 15~20bp의 길이를 갖는 DNA 시퀀스의 동족체를 갖는다. 4개의 PCR은 프라이머 A 및 E, B 및 F, C 및 G,와 D 및 H의 쌍을 각각 갖는다.

PCR 생성물 A-E는 FR1을 코드하고, PCR 생성물 B-F는 CDRI 및 FR2를 코드한다. A-E절편의 3'-말단 부분과 B-F절편의 5'-말단 부분은 15~20bp길이에서 동족체를 갖게 되어 이들 절편들이 후자 단계에서 결합하게 해준다. 이와 유사하게, B-F절편은 CDR2 및 FR3을 코드하는 C-G절편을 갖는 동족체를 갖는다. CG절편은 CDR3 및 FR4를 코드하는 D-H절편을 갖는 동족체를 추가로 갖는다. 따라서, 이들 4개의 절편들은 그들의 상호 동족체에 의해서 결합될 수 있다. PCR 반응혼합물중에서 이들 4개의 절편들을 결합시킨 후, 프라이머 A 및 H를 제2PCR중에서 그 위에 첨가하여 4개의 절편의 정확한 결합에 의해 형성된 생성물을 증폭시킨다. 이와 같이 하여 얻은 제2PCR 생성물은 3개의 결합한 CDR을 가지며, Hind III 및 BamHI로 소화시킨 후, pUC19 벡터로 서브클론시켰다.

더욱 구체적으로, 주형으로서 재구성 인간 PM-1 항체 L사슬 V영역 버젼 ''a''를 코딩하는 DNA를 플라스미드 pUC19로 삽입해서 조제한 플라스미드 pUC-RV1-PM1a-4를 사용했다.

상기 프라이머 A-H는 하기 시퀀스를 갖는다.

CDR 이식용 후방 프라이머 1220-L1, 1220-L2 및 1220-L3를 사용하기 전에 8M 우레아를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 겔로 정제했다.

100㎕의 PCR 반응 혼합물은 20mM Tris-HCl(pH8.8), 10mM KCl, 100mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100, 1㎍ BSA, 250㎛ dNTP, 5유니트의 Vent DNA 폴리머라제(Biolabs, U.K), 50㎍ pUC-RV1-PM1a-4 DNA, 및 각 100pmole의 전방 및 후방 프라이머를 함유했다. 각 PCR튜브를 50㎕의 미네랄오일로 덮고, 94℃에서 1.5분간 초기 변성한 후, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간, 그리고 72℃에서 1분간 사이클 반응을 30회 행한 후, 72℃에서 10분간 배양시켰다.

각 PCR 생성물, 즉 225bp(A-E), 96bp(B-F), 130bp(C-G) 및 123bp(D-H)를 2.0% 저융점 아가로즈(FMC, Bio Products, U.S.A.)로 정제했다. 즉 DNA절편을 함유하는 아가로즈 소편을 절취하고, 65℃에서 5분간 용융시킨 후, 2mM EDTA 및 200mM NaCl을 함유하는 같은 용적의 20mM Tris-HCl(pH7.5)에 첨가했다. 이 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출했다. DNA절편을 에탄올 침전법으로 회수하고, 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.5)중에 용해시킨 후, PCR 결합반응에 사용했다.

다음에, 각 0.2㎍의 제1PCR 생성물 및 5유니트의 Vent DNA 폴리머라제를 함유하는 98㎕의 PCR 반응혼합물을 94℃에서 2분간, 50℃에서 2분간 그리고 72℃에서 5분간 배양해서 결합반응을 행했다. 다음에, 각 100pmole의 프라이머 A(REVERSE) 및 H(UNIVERSAL)을 반응혼합물에 첨가해서 100㎕ 용적으로 만들고, 반응 혼합물을 50㎕의 미네랄오일로 덮고, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 그리고 72℃에서 1분간 사이클 반응을 30회 행한 후, 72℃에서 10분간 배양시켰다.

마우스 모노클로날 항체 AUK12-20 L사슬의 CDR로 이식시킨 L사슬 V영역을 함유하는 558bp 길이의 제2PCR 생성물을 2.0% 저융점 아가로즈 겔로 정제하고, Hind III 및 BamHI으로 소화시킨 후, pUC19 벡터로 서브클론해서 pUC-RL_L-1220a를 얻고, 시퀀싱했다. L사슬 V영역의 생성된 아미노산 시퀀스 및 아미노산 시퀀스를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 시퀀스 번호 91에 나타냈다.

다음에, L사슬 발현벡터를 조제하기 위하여, 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역을 함유하는 Hind III-BamHI DNA절편을 상기 플라스미드 pUC-RV_L-1220a로부터 절취해서, L사슬 발현벡터 HEF-12k-gK의 Hind III-BamHI 부위에 삽입해서 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 V영역 버젼 ''a''용 발현벡터 RV_L-1220a를 얻었다.

[실시예 14]

[cos세포중에서 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 일과성 발현의 발현 및 분석]

재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬용 발현벡터 RV_L-1220a 및 키메라 12-20 항체 H사슬용 발현벡터 HEF-12h-g γ1(실시예 5)을 cos세포중에서 동시에 형질전환시켜서 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 버젼 ''a''를 평가했다. 즉 cos세포를 인산염으로 완충시킨 염수(PBS)중에서 1×10⁷세포/㎖의 농도로 현탁시키고, 이 현탁액 0.8㎖에 플라스미드 DNA(각 플라스미드당 10㎍)를 첨가했다. 이 현탁액에 Gene Pulser장치(Bio Rad)를 사용해서 1,900V, 25nF의 전기용량에서 펄스를 적용했다.

실온에서 10분간 회복시킨 후, 전기천공한 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 베지(GIBCO) 8㎖에 첨가했다. 72시간 동안 배양시킨 후, 상징액을 모으고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 4℃에서 단기간, 또는 -20℃에서 장기간동안 무균조건하에서 저장했다.

[ELISA에 의한 인간-유사 항체의 측정]

형질전환시킨 cos세포의 상징액을 ELISA에 의해 평가하고, 키메라 항체의 생산을 확인했다. 인간-유사 항체를 검출하기 위하여, 플레이트를 염소의 항-인간 IgG(전체분자)(Sigma)로 도포했다. 블록킹시킨 후, cos세포로부터 상징액을 연속적으로 희석하고, 각 웰에 첨가했다.

이 플레이트를 배양시킨 후, 세정하고, 여기에 알칼리성 포스파타제-결합 염소의 항-인간 IgG(α-사슬 특이적, Sigma)를 첨가했다. 배양 및 세정 후, 기질용액을 첨가했다. 추가로 배양시킨후, 반응을 정지하고, 405㎚에서 광학밀도를 측정했다. 표준으로서, 정제된 IgG(Sigma)를 사용했다.

[인간 IL-6R에 결합하는 능력을 확인하기 위한 ELISA]

형질전환시킨 cos세포로부터 상징액을 ELISA에 의해 평가해서 생산된 인간-유사 항체가 항원, 인간 IL-6R에 결합할 수 있는지 여부를 측정했다. 플레이트를 마우스 모노클로날 항체 MT18(참고예 1)로 도포했다. 1% BSA로 블록킹시킨 후, 이 플레이트에 가용성 조환 인간 IL-6R(SR344)를 첨가했다. 플레이트를 세정시킨 후, cos세포로부터 상징액을 연속적으로 희석한 후, 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 배양 및 세정 후, 상기 웰에 알칼리성 포스파타제-결합 염소의 항-인간 IgG를 첨가하고, 더욱 배양 및 세정시킨 후, 그 위에 기질용액을 첨가했다. 배양후, 반응을 정지하고, 405㎚에서 광학밀도를 측정했다.

그 결과를 제17도에 나타냈다. 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 버젼 ''a'' 및 키메라 12-20 항체 H사슬의 조합으로 구성되는 인간-유사 항체는 키메라 12-20 항체만큼 강하게 IL-6R에 대한 결합능력을 나타냈다. 405㎚에서 광학밀도는 희석율-의존방식으로 변화시켜서 샘플이 IL-6R에 대한 항체를 함유하는지를 확인했다. 그 외에, 이 결과는 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 버젼 ''a''가 키메라 AUK12-20 항체 L사슬만큼 높게 항원 결합능력을 갖는 것을 나타냈다.

[실시예 15]

[HSGI 컨센서스 시퀀스를 이용하여 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬을 코딩하는 유전자의 조제]

실시예 13에 기재한 것과 동일한 과정에 따라서, AUK12-20 항체 H사슬 V영역의 CDR을 그의 FR로서 HSGI 컨센서스 시퀀스를 갖는 재구성 인간 V_Ha425로 이식시켰다(Kettleborough 등의 Protein Engineering 4:773-783 (1991)). 우선, 재구성 인간 V_Ha425(문헌중 제3도)를 코딩하는 Hind III-BamHI DNA절편을 플라스미드 HCMV-RV_Ha-425-γ1로부터 절취하고, pUC19 벡터 중에서 Hind III-BamHI 부위에서 서브클론해서 pUC-RV_H-425a를 얻었고, 이어서 이것을 주형으로서 사용했다.

8개의 PCR프라이머(A1~H1)를 합성했다. 프라이머 1220-H1을 CDR1을 이식시키기 위해 설계하고 T-28에서 S-28로 변이유발하고, 프라이머 1220-H3를 CDR3를 이식시키도록 설계하고 S-94에서 R-94로 변이유발했다. 프라이머 1220-H1, 1220-H2 및 1220-H3을 사용하기 전에 8M 우레아를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 정제했다. 각 프라이머의 뉴클레오티드 시퀀스는 다음과 같다.

PCR의 조건은 실시예 13에 기재한 것과 동일하였으나, 예외로 주형 DNA로서 pUC-RV_H-425a를 사용했고, H사슬 CDR을 이식시키기 위하여 상기 프라이머를 사용했다. 프라이머쌍 A1 및 E1, B1 및 F1, C1 및 G1과 D1 및 H1을 사용하여 제1PCR반응을 행하고, 각각의 제1PCR 생성물, 186bp(A1-E1), 75bp(B1-F1), 173bp(C1-G1) 및 105bp(D1-H1)을 2.0% 저융점 아가로즈 겔로 정제하고, 후속적인 제2PCR 결합반응에 사용했다. 실시예 13에 기재된 조건에 따라서, 각 0.2㎍의 제1PCR 생성물을 사용해서 제2PCR 반응(PCR 결합반응 포함)을 행해서 마우스 AUK12-20 항체 H사슬 V영역 CDR로 이식된 인간 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 495bp의 PCR 생성물을 얻고, 이 PCR 생성물을 2.5% 저융점 아가로즈 겔을 사용하여 정제했다. PCR 생성물을 Hind III 및 BamHI으로 소화시킨 후, 생성되는 Hind III-BamHI DNA 절편을 pUC19로 서브클론하고 시퀀심해서 pUC-RV_H- 1220a를 얻었다.

재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA 시퀀스가 스플라이싱 공여체 시퀀스에 좋게 일치하는 시퀀스를 갖는 것으로 나타났으며, 이것은 재구성 인간 PM-1 항체의 생산에 있어서 난제가 되는 비정상 스플라이싱을 일으킬 수도 있다. 그러므로, 이 DNA 시퀀스를 PCR에 의해 변형시켰다. 변이유발 프라이머, SGI-SP1(시퀀스 번호 97) 및 SGI-SP2(시퀀스 번호 98)를 합성했다. 이들 프라이머는 DNA 시컨스 AAG GTG AGC를, DNA 시퀀스 AAA GIC AGC로 전환시킨다. PCR 반응의 조건은 상기한 것과 동일하였으나, 예외로 주형 DNA로서 50㎍의 pUC-RV_H-1220a를 사용했고, 프라이머로서 SGI-SP1 및 UNIVERSAL(시퀀스 번호 82), 또는 SGI-SP2 및 REVERSE(시퀀스 번호 83)를 사용했다.

2개의 PCR 반응에서의 PCR 생성물을 2% 저융점 아가로즈 겔에 의하여 정제하고, PCR 결합반응에 사용했다. 각 0.2㎍의 제1PCR 생성물 및 5유니트의 Vent DNA 폴리머라제를 함유하는 98㎕의 PCR 반응혼합물을 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간, 그리고 72℃에서 5분간 배양시켜서 결합반응을 행했다. 다음에, 각 100pmole의 UNIVERSAL 및 REVERSE 프라이머를 반응혼합물에 첨가하고, 이어서 50㎕의 미네랄오일로 덮고, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 배양시키는 제2PCR반응의 사이클에 30회 제공하고, 이어서 72℃에서 10분간 배양시켰다. 제2PCR에서 얻은 495bp의 DNA절편을 2.0% 저융점 아가로즈 겔로 정제하고, pUC19 벡터로 서브클론시킨 후, 시퀀싱해서 pUC-RV_H-1220a-2를 얻었다.

다음에, 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 Hind III-BamHI DNA절편을 pUC-RV_H-1220a-2에서 절취하고, H사슬 발현벡터 HEF-12h-g γ1의 Hind III-BamHI 부위에서 삽입해서 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 버젼 ''a''부위에서 삽입해서 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 버젼 ''a''용 발현벡터 RV_H-1220a를 얻었다.

재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역 버젼 ''a''를 코딩하는 유전자를 조제하기 위하여, 2쌍의 변이유발 프라이머를 합성했다. 각 PCR반응을 상기한 것과 실질적으로 동일한 조건하에서 행했다. 버젼 ''b''를 조제하기 위하여, 2개의 제1PCR반응에서, UNIVERSAL 프라이머(시퀀스 번호 82) 및 변이유발 프라이머 120H-㎖(시퀀스 번호 78), 또는 REVERSE 프라이머(시퀀스 번호 83) 및 변이유발 프라이머 1220H-m16(시퀀스 번호 79)와 주형으로서 pUC-RV_H-1220a를 사용했다. 202bp 및 323bp의 제1PCR 생성물을 2.0% 저융점 아가로즈 겔로 정제하고, 상기와 동일한 조건하에서 제2PCR(PCR 결합반응 포함)에 사용해서 495bp의 생성물(버젼 ''b'')을 얻었다. 이 생성물을 Hind III 및 BamH I 으로 소화하고, pUC19 벡터로 서브클론해서 pUC-RV_H-1220b를 얻었다.

유사하게, 변이유발 프라이머 1220H-m2(시퀀스 번호 80), 1220H-m2b(시퀀스 번호 81) 및 주형 pUC-RV_H-1220a를 PCR에서 사용해서 PCR생성물 (버젼''c'')을 얻었다. 이 생성물을 Hind III-BamH I 으로 소화하고, pU19 벡터의 Hind III-BamH I 부위에서 삽입하여 pUC-RV_H-1220c를 얻었다. 또한, 변이유발 프라이머 1220H-m1a(시퀀스 번호 78), 1220H-m1b(시퀀스 번호 79) 및 주형 pUC-RV_H-1220c를 사용해서 PCR 생성물(버젼 ''d'')을 얻었고, 이어서 이것을 Hind III 및 BamH I 으로 소화하고, pU19 벡터의 Hind III-BamH I 부위로 삽입해서 pUC-RV_H- 1220d를 얻었다.

재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역 버젼 ''b''의 아미노산 시퀀스 및 플라스미드 pUC-RV_H-1220b중에서 상기 아미노산 시퀀스를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 시퀀스 번호 84에 나타냈고, 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역 버젼 ''d''의 아미노산 시퀀스 및 플라스미드 pUC-RV_H-1220d중에서 상기 아미노산 시퀀스를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 시퀀스 번호 85에 나타냈다.

다음에, 발현벡터를 조제하기 위하여, 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역을 함유하는 Hind III-BamH I 절편을 pUC-RV_H-1220b, pUC-RV_H-1220c 및 pUC-RV_H-1220d에서 절취하고, H사슬 발현벡터 HEF-12h-g γ1의 Hind III-BamH I 부위로 삽입해서 RV_H-1220b, RV_H-1220c 및 RV_H-1220d를 각각 얻었다.

[실시예 16]

[재구성 인간 AUK12-20 항체의 여러가지 버젼의 발현 및 분석]

cos세포를 재구성 인간 AUK-12-20 항체 H사슬의 발현벡터(RV_H-1220a, RV_H-1220b, RV_H-1220c, RV_H-1220d)중 하나와 발현벡터 VR_L-1220a로 동시에 형질전환시켜서 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 V영역의 4개 버젼을 평가했다. 참고용으로, cos세포를 키메라 12-20 항체 L사슬 및 H사슬(HEF-12h-g γ1 및 FEF-12-gk)용 발현벡터로 동시에 형질전환시켰다. 인간 IL-6R에 대한 결합의 평가에 있어서, 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 및 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 버젼 ''b''로 되는 재구성 인간 AUK12-20 항체와 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬 및 재구성 인간 AUK12-20 항체 H사슬 버젼 ''d''로 되는 재구성 인간 AUK12-20 항체는 키메라 12-20 항체와 마찬가지로 양호한 결합을 나타냈다. 이 결과를 제18도 및 제19도에 나타냈다.

[실시예 17]

[인간 항체 HAX를 사용하는 재구성 인간 sle1220 항체 H사슬을 코딩하는 유전자의 조제]

마우스 모노클로날 항체 AUK12-20 H사슬 V영역을 최고의 동족체를 갖는 인간 항체는 단백질 데이타베이스 ''Leeds''에 의해서 HAX (J. Immunology 139:2496-2501 (1987) ; SLE 환자의 B세포에서 유래한 하이브리도마 21/28에 의해서 생산된 항체; 그 아미노산 시퀀스는 제6도에 나타냈고, 그에 대한 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 문헌의 제4도 및 제5도에 나타냈다)이다. 재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역은 항체 HAX의 FR 및 마우스 모노클로날 항체 AUK12-20 H사슬 V영역의 CDR을 사용하여 측정했다.

재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역 버젼 ''a''를 코딩하는 전체 DNA는 화학적으로 합성했다. 전체 길이 439bp를 갖는 sle1220H 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA는, DNA를 서로 중첩되는 90~94bp의 길이를 갖는 6개의 올리고뉴클레오티드로 21bp로 나눠서 설계했다(sle1220h 1~6; 시퀀스 번호 86~91). 올리고뉴클레오티드를 설계함에 있어서, 제2구조를 시험하고, 구조적인 문제를 갖는 부위에 대해서, 코돈 중의 제3뉴클레오티드를 코드된 아미노산을 변화시키지 않고서 변화시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드와 이중-단일가닥 합성 DNA의 조제 공정의 관계를 제20도에 나타냈다.

제20도에 나타낸 반응은 PCR 기술을 사용하여 행했다. 즉, 6개의 합성 올리고뉴클레오티드를 단일 PCR 반응관에 첨가해서 제1PCR 반응을 행함으로써 2개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킨 후, 연장시키고, 4개의 올리고뉴클레오티드 또는 전체 올리고뉴클레오티드를 추가로 얻었다.

다음에, 말단 프라이머 A(시퀀스 번호 92) 및 B(시퀀스 번호 93)를 첨가해서 제2PCR 반응을 행하고, 여기서 전체 길이를 갖는 정확한 올리고뉴클레오티드만이 증폭될 수 있다. 생성된 생산물을 Hind III 및 BamH I 으로 소화하고, pUC19 벡터로 서브클론하고, 이어서 시퀀싱하였다.

더욱 구체적으로, 100mM Tris-HCl(pH8.5), 50mM KCl, 0.1mM dATP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dCTP, 0.1mM dTTP, 1.5mM MgCl₂및 2.5 유니트의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus)와 각 5pmole의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 98㎕의 반응혼합물을 94℃에서 1.5분간 변성시키고, 이어서 92℃에서 3분간, 50℃에서 2분간, 그리고 72℃에서 5분간 사이클 반응을 3회 행하고, 이어서 72℃에서 10분간 배양시켰다. 각 1㎕의 50mM 말단 프라이머 A 및 B를 반응혼합물에 첨가하고, 이어서 80㎕의 미네랄오일을 덮고, 94℃에서 1.5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 배양시켜서 사이클 반응을 30회 행하고, 이어서 72℃에서 10분간 배양시켰다. 439bp의 PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로즈 겔로 정제시킨 후, 제한효소 Hind III 및 BamH I 으로 소화하고, pUC19벡터로 서브클론시키고, 이어서 시퀀스를 확인했다. 이와 같이 하여 얻은 클론을 pUC-RV_H-sle1220Ha로 명명했다.

재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역 버젼 ''a''의 아미노산 시퀀스와 플라스미드 pUC-RV_H-sle1220Ha중에서 상기 버젼 ''a''를 코딩하는 뉴클레오티드를 시퀀스 번호 94에 나타냈다.

다음에, 재구성 인간 12-20(sle1220H) 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 Hind III-BamH I DNA절편을 pUC-RV_H-sle1220Ha로부터 절취해서 H사슬 발현벡터 HEF-12h-g γ1의 Hind III-BamH I 부위에서 삽입하여 RV_H-sle1220Ha를 얻었다.

재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역의 버젼 ''b''~''d''를 조제하기 위하여, 2개의 변이유발 프라이머 sle1220Hm1(시퀀스 번호 95) 및 sle1220Hm2(시퀀스 번호 96)을 합성했다. 각 PCR에서, Vent DNA폴리머라제와 실시예 13에 기재된 반응혼합물 조성을 사용했다. 각 PCR 반응에서, 주형으로서 pUC-RV_H-sle1220Ha, 50pmole의 변이유발 프라이머 sle1220Hm1 또는 sle1220Hm2 및 50pmole의 말단 프라이머 B를 함유하는 반응혼합물을 94℃에서 1.5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 배양시켜서 사이클반응을 30회 행한 후, 이어서, 72℃에서 10분간 배양시켰다. 235bp 또는 178bp의 생성물을 제2PCR 반응에서 프라이머로서 사용하기 위하여 1.5% 저융점 아가로즈 겔로 정제했다. 즉, 제2PCR 반응을 50pmole의 말단 프라이머 A, 0.2㎍의 PCR 생성물 및 주형으로서 pUC-RV_H-sle1220Ha를 사용하여 행하고, 439bp의 생성되는 생산물을 1.5% 저융점 아가로즈 겔로 정화시키고, Hind III-BamH I으로 소화시킨 후, pUC19벡터로 서브클론해서 pUC-RV_H-sle1220Hb 또는 pUC-RV_H-sle1220Hc를 얻었고, 이것은 재구성 인간 sle1220 항체 H사슬 V영역 버젼 ''b'' 또는 ''c''를 코딩한다.

재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역 버젼 ''d''를 코딩하는 DNA는 또한 다음과 같이 조제했다. 주형으로서, pUC-RV_H-sle1220Hb를 사용했다. 각 50pmole 의 변이유발 프라이머 sle1220Hm2 및 말단 프라이머 B를 사용해서 제1PCR 사이클 반응을 30회 행했다. 생성되는 176bp PCR 생성물을 1.6% 저융점 아가로즈 겔로 정제해서 제2PCR에서 프라이머로서 사용했다. 이 프라이머와 50pmole의 말단 프라이머 A를 제2PCR에서 사용해서 439bp의 DNA절편을 얻었다. 이와 같이 하여 얻은 PCR 생성물을 정제하고, Hind III 및 BamH I으로 소화시킨 후, pUC19벡터로 서브클론해서 pUC-RV_H-sle1220Hd를 얻었다.

다음에, 재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역의 여러가지 버젼용 발현벡터를 조제하기 위하여, 재구성 인간 sle1220 항체 H사슬 V영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 Hind III-BamH I 절편을 pUC-RV_H-sle1220Hb, pUC-RV_H-sle1220Hc 및 pUC-RV_H-sle1220Hd로부터 절취한 후, H사슬 발현벡터 HEF-12h-g γ1의 Hind III-BamH I 부위로 삽입해서 발현벡터 RV_H-sle1220Hb, RV_H-sle1220Hc 및 RV_H-sle1220Hd를 각각 얻었다.

재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬을 발현하는 4개의 벡터 각각 (RV_H-sle1220Ha, RV_H-sle1220Hb 및 RV_H-sle1220Hc 또는 RV_H-sle1220Hd)와 재구성 인간 AUK12-20 항체 L사슬을 발현하는 벡터 RV_L-1220a를 cos세포에 동시에 형질전환시켜서 IL-6의 IL-6R에 대한 결합의 억제능에 대해서 재구성 인간 sle1220H 항체 H사슬 V영역의 4개의 버젼을 평가했다. 그 결과를 제21도 내지 제24도에 나타냈다. 이들 결과를 단백질 A에 의해서 생산된 항체를 정제한 후에 얻었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하여, 키메라 L사슬 또는 재구성 인간 L사슬, 또는 키메라 H사슬 또는 재구성 인간 H사슬, 특히 RF에서, 1개의 아미노산 이상이 인간 IL-6R의 결합능을 유지하는 다른 아미노산으로 대치될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 키메라 항체 및 재구성 인간 항체, 키메라 L사슬 및 재구성 인간 L사슬, 키메라 H사슬 및 재구성 인간 H사슬, 재구성 L사슬 V영역 및 재구성 H사슬 V영역을 포함하며, 여기서 12개의 아미노산 이상이 그들의 천연 특성을 유지하는 한 다른 아미노산과 이 아미노산을 코딩하는 DNA로 대치된다.

본 발명에서 사용하는 출발 하이브리도마는 다음과 같이 조제되었다.

[참고예 1]

[하이브리도마 MT18의 조제]

인간 IL-6R에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 조제하기 위하여, 면역됨으로서 세포표면에 인간 IL-6R를 발현하는 마우스 T 세포계를 다음과 같이 조제했다. 즉, 일본국 특허출원 평1-9774호에 기재된 플라스미드 pBSF 2R.236과, pSV2neo를 종래의 방법으로 마우스 T세포계 CTLL-2(ATCC TIB 214)로 동시에 형질전환시키고, 생성되는 형질전환체를 종래의 방법으로 G418을 사용해서 스크린하여서 세포당 약 30,000개의 IL-6R를 발현하는 세포계를 얻었다. 이 세포계를 CTBC3으로 명명했다.

CTBC3세포를 종래의 방법으로 RPMI1640중에서 배양시키고, 배양시킨 세포를 PBS 완충액으로 세정한 후, 1×10⁷개의 세포를 C57BL/6 마우스에 복강내 주사하여 면역감작했다. 이 면역감작은 1주간에 1회 6주간에 걸쳐서 행했다.

이 면역감작된 마우스로부터 비장 세포를 얻고, 종래의 방법으로 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 골수종 P3U1 세포를 융합하고, 융합된 세포를 다음과 같이 스크린했다. IL-6R 음성 인간 T세포계 JURKAT(ATCC CRL 8163)를 플라스미드 pBSF 2R. 236 및 pSV2neo로 동시에 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 스크린해서 세포당 약 100,000개의 IL-6R을 발현하는 세포계를 얻었다. 이 세포계를 NJBC8로 명명했다. NP40으로 세포용해한 NJBC8을 인식하지만 NP40으로 세포용해한 JURKAT를 인식하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 클론을 클론화하고, MT18로 명명했다. 이 하이브리도마 MT18을 부다페스트조약에 의거해서, Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology(FRI)에 1990년 7월 10일자로 FERM BP-2999로 기탁했다.

[참고예 2]

[하이브리도마 PM1의 조제]

IL-6R에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 조제하기 위하여, 면역원으로서, 인간 IL-6R을 다음과 같이 추출했다. 3×10⁹인간 골수종 U266 세포(IL-6R 생산세포)를 1㎖의 1% 디기토닌(digitonin), 10mM 트리에탄올아민 완충액(pH7.4), 0.15M NaCl 및 1mM PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드; Wako Pure Chemicals)중에서 용해했다. 한편, 참고예 1에서 조제한 MT18 하이브리도마에 의해 생산되는 MT18 항체를 종래의 방법으로 브롬화시안으로 활성화된 Sepharose 4B(Pharmacia)에 결합했다. 이 MT18 항체로 결합한 Sepharose 4B를 상기 세포 용해물과 혼합해서 Sepharose 4B상의 MT18 항체에 가용화된 IL-6R을 결합했다. Sepharose 4B에 비특이적으로 결합한 물질을 세정하여 제거하고, MT18 항체를 거쳐서 Sepharose 4B에 결합된 IL-6R을 면역원으로서 사용했다.

상기 면역원을 사용해서, BALB/C 마우스를 1주간에 1회 4주간에 걸쳐서 복강내로 면역감작했다. 다음에, 이 면역감작된 마우스로부터 바장세포를 얻고, 종래의 방법으로 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포 P3U1과 융합시켰다. 이 융합된 세포를 다음과 같이 스크린했다. 우선, 배양상징액 및 0.01㎖의 Protein G Sepharose(Pharmacia)를 혼합해서 상징액중의 면역글로부린을 Protein G Sepharose에 흡착했다. 한편,³⁵S-메티오닌으로 내부 표지한 107개의 U266세포를 용해하고, MT18-결합 Sepharose 4B를 사용해서 친화성 정제했다. 다음에,³⁵S-메티오닌으로 표지한 IL-6R을 면역글로부린이 결합해 있는 상기 Protein G Sepharose로 면역 침전시키고, 이 침전물을 SDS/PAGE로 분석했다. 그 결과, IL-6R에 특이적으로 결합한 항체를 생산하는 1개의 하이브리도마 클론이 단리되었고, 이것을 PM1으로 명명했다. 이 하이브리도마 PM1을 부다페스트조약에 의거 FRI에 1990년 7월 10일자 FERM BP-2998로 기탁했다.

[참고예 3]

[하이브리도마 AUK12-20, AUK64-7 및 AUK146-15의 조제]

면역원으로서, 가용성 IL-6R(SR344)을 Yasukawa K. 등의 J. Biochem. 108, 673-676(1990)에 기재된 방법에 따라서 제조하였다. 즉, N-말단으로부터 345번째의 코돈이 종지코돈으로 대치된 IL-6R을 코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pECEdhfr344를 CHO(5E27) 세포로 형질전환시키고, 이 형질전환된 세포를 혈청이 없는 배지(SF-O 배지, Sanko Junyaku)중에서 배양하고 생성되는 상징액을 HF-Lab1시스템(Tosoh)에 의해 농축한 후, Blue-5PW 컬럼 및 Phenyl-5PW 컬럼에 의해서 정제했다. 정제된 가용성 IL-6R은 SDS-PAGE중에서 단일 밴드를 나타냈다.

암컷 BALB/cAnNCrj 마우스 (Nippon CREA)에 1회의 면역원량을 10㎍/마우스로하여 Freund의 완전 보조약(Bacto Adjuvant Complete H37 Ra, Difco)과 함께 피하 주사하고, 이어서 각각 최초 주사 후 2주간 및 3주간 후에, Freund의 불완전 보조약(Bacto Adjuvant Incomplete Freund, Difco)과 함께 동량의 면역원을 2차 및 3차로 피하 주사했다. 최종 면역감작(제4회 주사)은 제3회 주사 1주간 후에 보조약을 사용하지 않고 꼬리정맥내에 행했다. 면역감작된 마우스로부터 혈청시료를 채취하고, 묽은 완충액으로 순차적으로 희석하고, Goldsmith, P.K.의 Analytical Biochemistry, 117, 53-60 (1981)에 기재된 방법에 의하여 ELISA로 평가했다. 즉, SR344(0.1μ/㎖)로 피복한 플레이트를 1% BSA로 블록킹시키고, 그 위에 희석된 시료를 첨가했다. SR344에 결합된 마우스 IgG를 염소의 항-마우스 IgG/알칼리성 포스파타제(A/P)(ZYMED) 및 알칼리성 포스파타제용 기질(Sigma-104)를 사용하여 측정했다.

혈청중에서 항-SR344 항체의 증가를 확인한 후, 최종 면역감작으로부터 3일 후 5마리의 BALB/c 마우스로 부터 비장세포를 얻었다. 비장세포와 골수종세포(P3U1)를 25:1의 비율로 혼합하고, PEG1500을 사용하여 융합시키고, 2000개의 웰 중에서 0.7~1.1×10⁶세포/웰의 세포농도로 배양했다. 웰로부터의 상징액을 SR344에 결합하는 그의 능력에 대해서(R344 인식평가로서 칭하는 제1스크리닝), 및 IL-6/sIL-6R 결합 억제 평가(RBIA)에 의해서 인터루킨-6을 갖는 SR344의결합을 억제하는 그의 능력에 대해서 스크린했다. 제1스크리닝은 240개의 양성 웰을 제공했고, 제2스크리닝은 36개의 양성 웰을 제공했다.

상기 R344 인식평가를 다음과 같이 행했다. 염소의 항-마우스 Ig(Cappel)(1㎍/㎖)로 피복한 플레이트(MaxiSorp, Nunc)를 1% BSA로 블록킹시키고, 그 위에 100㎕/㎖의 하이브리도마 배양 상징액을 첨가하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 플레이트를 세정시킨 후, 각 웰에 20㎍/㎖의 SR344를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양을 행했다. 상징액에서 유래한 고정화된 항체에 의해서 포착된 SR344의 양을 토끼 항-SR344 IgG(#2, 5㎍/㎖), 염소의 항-토끼 IgG-알칼리성 포스파타제(A/P)(1:3000, Tago), 및 기질(1㎎/㎖, Sigma-104)의 첨가에 의해 측정하고, 이어서 405 내지 600㎚에서 광학밀도를 측정했다.

상기 RBIA를 다음과 같이 행했다. MT18 항체로 피복한 플레이트를 100㎍/㎖의 SR344(100㎕/웰)로 충전하고, 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 플레이트를 세정시킨 후, 50㎕/웰의 하이브리도마 상징액 및 50㎍/웰의 비오틴-인터루킨-6-결합체(20㎍/㎖)를 각 웰에 동시에 첨가하고, 이 웰을 실온에서 1시간동안 배양시켰다. SR344에 결합된 비오틴-IL-6의 양을 스트렙타비딘-A/P(1:7000, PIERCE) 및 대응하는 기질(Sigma-104)을 첨가해서 측정하고, 이어서 405 내지 600㎚에서 광학밀도를 측정했다.

최종적으로, 양성 클론을 한계희석법을 2회 반복하여 정제하고, SR344와 IL-6의 결합을 억제하는 3개의 하이브리도마 클론, 즉 AUK12-20, AUK145-15 및 AUK64-7과, SR344와 IL-6의 결합을 억제하는 하이브리도마 클론 AUK181-6을 얻었다.

[공업적 응용성]

본 발명은 인간 IL-6R에 대한 재구성 인간 항체를 제공하며, 여기서 인간 V영역의 CDR은 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체의 CDR로 대치된다. 재구성 인간 항체의 대부분이 인간 항체로부터 유래하고, 마우스 CDR이 항원성이 낮으므로, 본 발명의 재구성 인간 항체는 인간에 대한 면역원성이 낮으므로 치료요법용으로 기대된다.

부다페스트 조약 규칙 13-2에 의거해서 기탁된 미생물의 참고

기탁기관 : National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limied

주 소 : 영국 아버딘 AB2 IRY, St 마쳐 드라이브 23

기탁기관 : Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology

주 소 : 일본국 이바라키 즈쿠바시 히가시 1쵸메, 1-3

Claims (25)

1. 다음 구조를 가지는, 인간 인터루킨-6(IL-6)에 대한 항체의 라이트(L) 사슬 가변(V) 영역.

   FR1¹-CDR1¹-FR2¹-CDR2¹-FR3¹-CDR3¹-FR4¹

   상기 식에서, CDR1¹, CDR2¹및 CDR3¹는 다음 시퀀스로 표시되는 아미노산 시퀀스 세트로 이루어진 3개의 상보성 결정 영역(CDR¹s)의 1 세트 또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물이다:

   CDR1¹Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

   CDR2¹Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

   CDR3¹Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

   상기 식에서, FR1¹, FR2¹, FR3¹및 FR4¹는 인간 서브그룹 I 항체(HSGI)의 L 사슬 V 영역으로부터 유도된 4개의 구조 영역(FR¹s)의 1 세트이거나 또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 HSGI가 REI 항체인 것인 L 사슬 V 영역.
3. 제2항에 있어서, REI 항체의 FR1¹, FR2¹, FR3¹및 FR4¹또는 그의 작용 등가물이 다음 아미노산 시퀀스 중의 1 세트로 이루어지는 것인 L 사슬 V 영역.

   또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물.
4. 제1항에 있어서, 시퀀스 번호 57의 아미노산 시퀀스를 가지는 L 사슬 V 영역.
5. (1) 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 항체의 L 사슬 V 영역; 및 (2) 인간 항체로부터 유도된 C 영역으로 이루어진 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 항체의 L 사슬.
6. 제5항에 있어서, 상기 C 영역이 Ck인 것인 L 사슬.
7. 다음 구조를 가지는, 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 항체의 헤비(H) 사슬 가변(V) 영역.

   FR1²-CDR1²-FR2²-CDR2²-FR3²-CDR3²-FR4²

   상기 식에서, CDR1², CDR2²및 CDR3²는 다음 시퀀스로 표시되는 아미노산 시퀀스 세트로 이루어진 3 개의 상보성 결정 영역(CDR²s)의 1 세트 또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물이다.

   CDR1²Ser Asp His Ala Trp Ser

   CDR2²Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

   CDR3²Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr

   상기 식에서, FR1², FR2², FR3²및 FR4²는 인간 서브그룹 II 항체(HSGII)의 H 사슬 V 영역으로부터 유도된 4개의 구조 영역(FR²s)의 1 세트이거나 또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물이다.
8. 제7항에 있어서, 상기 HSGII가 NEW 항체인 것인 H 사슬 V 영역.
9. 제8항에 있어서, NEW 항체의 FR1², FR2², FR3²및 FR4²또는 그의 작용 등가물이 다음 아미노산 시퀀스 중의 1 세트로 이루어지는 것인 H 사슬 V 영역.

   또는 1 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하는 그의 작용 등가물.
10. 제9항에 있어서, 시퀀스 번호 56의 아미노산 시퀀스를 가지는 H 사슬 V 영역.
11. (1) 제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 인간 IL-6 수용체에 대한 항체의 H 사슬 V 영역과; (2) 인간 항체로부터 유도된 C 영역으로 이루어진 인간 IL-6 수용체에 대한 항체의 H 사슬.
12. 제11항에 있어서, 상기 C 영역이 Cr인 H 사슬.
13. (1) 제5항 또는 제6항에 따른 인간 IL-6 수용체에 대한 항체의 L 사슬과; (2) 제11항 또는 제12항에 따른 인간 IL-6 수용체에 대한 항체의 H 사슬로 이루어진 인간 IL-6 수용체에 대한 재구성 인간항체.
14. 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 따른 L 사슬 V 영역을 코딩하는 DNA.
15. 제5항 또는 제6항에 따른 L 사슬을 코드하는 DNA.
16. 제7항 내지 제10항중 어느 하나의 항에 따른 H 사슬 V 영역을 코드하는 DNA.
17. 제11항 또는 제12항에 따른 H 사슬을 코드하는 DNA.
18. 제14항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
19. 제15항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
20. 제16항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
21. 제17항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
22. 제15항에 따른 DNA 와 제17항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
23. 제19항에 따른 벡터와 제21항에 따른 벡터로 동시 형질전환된 숙주 세포.
24. 제22항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
25. 제23항 또는 제24항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계와; 재구성 인간 항체를 회수하는 단계로 이루어진 인간 IL-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체의 제조방법.