JP6730271B2 - インターフェロンα２Ｂバリアント - Google Patents

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Description

本発明は、細胞表面抗原を標的とするリガンド及び脱グリコシル化(aglycosylated)インターフェロンα2b(IFNα2b)を含むポリペプチド、並びに癌の治療におけるこれらのポリペプチドの使用に関する。
多数のペプチド及びポリペプチドの分子が、細胞表面上の受容体と相互作用し、それにより、生物学的応答を刺激し、阻害し、又は別の形で調節することによって機能することが記載されており、このことには通常、前記受容体を担持する細胞内部のシグナル伝達経路が関与する。そのような分子の例として、ペプチド及びポリペプチドのホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、アポトーシス誘発因子等が挙げられる。これらの分子は、可溶性である場合があり、又は別の細胞の表面につながっている場合がある。
そのような分子の生物学的活性に起因して、それらの中には、治療剤として使用し得る可能性があるものもある。例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターフェロンIFNα2b、IFNα2a、IFNβ、エリスロポエチン、G-CSF及びGM-CSFを含めて、いくつかのペプチド又はポリペプチドの分子が、規制当局により、治療用製品として承認されている。これら及びその他のペプチドの多くは、治療に適用し得る可能性を示しているが、ヒト患者に投与する場合に、毒性も示すこともある。毒性についての1つの理由は、これらの分子のほとんどが、治療作用を媒介する細胞以外の細胞を含めた、多様な細胞上の受容体の作用を誘発することにある。例えば、IFNα2bを使用して、多発性骨髄腫を治療する場合には、INFα2bの有用性は少なくともある程度、それが骨髄腫細胞上のI型インターフェロン受容体に結合することにあり、この結合に続いて、増殖の低下が誘発され、したがって、疾患の進行が制限される。しかし残念なことに、このIFNはまた、体内の多数のその他の正常細胞にも結合して、多様なその他の細胞性応答を誘発し、それらのいくつかは有害である(例えば、インフルエンザ様症状、好中球減少症、うつ病)。ペプチドのそのような「オフ標的(off target)」活性の結果、多くのペプチドが、薬物候補として不適切になる。この文脈では、「オフ標的活性(off target activity)」は、ペプチドの天然の受容体であるが、治療に有益な作用を媒介する細胞以外の細胞の表面上の受容体に対する活性を指す。
いくつかのペプチド、例として、IFNα2bが、医学的状態の治療のために承認されているにもかかわらず、それらの「オフ標的」生物学的活性に起因して、それらの忍容性は低い。また、オフ標的活性、及び関連する低い忍容性は、これらのペプチドに基づく薬物の中には、治療作用を媒介する標的細胞に対して最適な治療作用をもたらすための十分に高い投与量で投与することができないものがあることも意味する。
同様に、1980年代半ば以来、インターフェロン、特に、IFNαが、特定の癌細胞のアポトーシスを増加させ、増殖を減少させることが可能であることも公知になっている。これらの生物学的活性は、癌細胞の表面上のI型インターフェロン受容体により媒介され、これらの受容体は、刺激されると、多様なシグナル伝達経路を開始して、増殖の低下及び/又は最終分化若しくはアポトーシスの誘発をもたらす。IFNαは、FDAにより、メラノーマ、腎臓細胞癌、B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病(CML)及び有毛細胞白血病を含めた、いくつかの癌の治療のために承認されている。IFNαが、それらの細胞上のI型IFN受容体に直接結合して、アポトーシス、最終分化、又は増殖の低下を刺激することによって、IFNαの腫瘍細胞に対する「直接的」な作用を媒介する。IFNαの非癌性細胞に対する1つの「間接的」な作用は、免疫系を刺激することであり、こうして、追加の抗癌作用を、免疫系に腫瘍を拒絶させることによってもたらすことができる。
残念なことに、I型インターフェロン受容体は、ほとんどの非癌性細胞上にも存在する。IFNαによる、そのような細胞上におけるこの受容体の活性化は、多数の炎症促進性のサイトカイン及びケモカインの発現を引き起こして、毒性をもたらす。そのような毒性により、癌細胞に対して、抗増殖性及びアポトーシス促進性の最大活性を発揮するレベルでIFNαを対象に投与する妨げとなっている。
Ozzelloら(Breast Cancer Research and Treatment 25:265〜76頁、1993年)は、腫瘍の成長速度を低下させる手段として、腫瘍を標的とする抗体にヒトIFNαを共有結合性につなぎ、それにより、IFNαの直接的な阻害活性を腫瘍に局在させることを記載し、そのようなコンジュゲートは、ヒト癌の異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示すことを実証した。観察された抗癌活性の機構は、癌細胞に対するIFNαの直接的な作用によるものである。というのは、実験で使用したヒトIFNαには、マウスI型IFN受容体との、間接的な抗癌作用をもたらすことができるであろう相互作用は明らかには認められなかったからである。しかし、ヒトIFNαのマウス細胞に対する結合のこの欠如に起因して、著者らは、抗体-IFNαのコンジュゲートの毒性を、遊離のINFαに比して評価することができなかった。これらの著者らは、化学的な方法を使用して、IFNαを抗体につないだ。
Alkanら(Journal of Interferon Research、volume 4、number 3、355〜63頁、1984年)は、ヒトIFNαを、エプスタイン-バーウイルス(EBV)の膜抗原(MA)に結合する抗体につなぐと、ヒトIFNαの、EBV-MA抗原を発現する細胞に対する抗増殖活性が増加することを示した。この効力の増加は、標的細胞が発現する抗原及び抗体の結合特異性の両方に依存した。テストした細胞株は、骨髄芽球性白血病の癌細胞株QIMR-WILであった。著者らは、腫瘍の成長を低下させるであろうことから、IFNαを抗体につないで、癌の治療として使用することができることを示唆した。Alkanらは、これらの抗体-IFNαのコンジュゲートが、正常な抗原陰性細胞と相互作用することによって生じるそれらの毒性の可能性については取り扱わなかった。
抗体とIFNαとの間の連結を、融合タンパク質コンストラクトを作製することによって達成することができることも公知である。例えば、IDEC(WO01/97844)は、ヒトIFNαの、腫瘍抗原CD20を標的とするIgGの重鎖のC末端への直接的な融合体を開示している。その他のグループにより、IgG重鎖のC末端とIFNαとの間の多様なリンカーの使用が開示されている。例えば、US7,456,257は、抗体重鎖定常領域のC末端を、セリン-グリシンがリッチな(S/G)リンカーの介在配列、すなわち、(GGGGS)n(式中、nは、1、2又は3であってよい)を介して、IFNαに接続することができ、リンカーの長さにかかわらず、融合タンパク質コンストラクトのIFNα活性に顕著な差がないことを開示している。
Morrisonら(US2011/0104112A1;及びXuan C、Steward KK、Timmerman JM、Morrison SL、「Targeted delivery of interferon-α via fusion to anti-CD20 results in potent antitumor activity against B-cell lymphoma」、Blood 2010年;115:2864〜71頁)も、介在S/Gリンカーを用いて、癌を標的とするIgG抗体の重鎖のC末端に連結させたIFNαを開示しており、IgG及びリンカーとIFNαとの融合体は、対応する抗原を細胞表面上に発現しない細胞に対するIFNαの活性を低下させることを観察した。これらの融合タンパク質コンストラクトのIFN活性の減少は、ヒト細胞に対して作用する、ヒトの非融合タンパク質IFNα(遊離のIFNα)と比較する場合には中程度であるが、マウス細胞上のマウスIFNαに対してはより顕著であるように見えた。ヒトIFNαを抗体のC末端に融合させることから得られる、ヒトIFNαの活性の減少は、Morrisonらにより、かつUS7,456,257において観察されたように、中程度であり、これは一般に、不都合であるとみなされており、というのは、このことにより、IFNの効力が低下するからである。この不都合は、例えば、Rossiら(Blood、114巻、18号、3864〜71頁)が指摘し、Rossiらは、IFNα活性の喪失が観察されないように、IFNαを、腫瘍を標的とする抗体につなぐ代替の戦略を使用した。
WO01/97844 US7,456,257 US2011/0104112A1 WO2014/178820 WO90/05144A1 US5,225,539 US6,054,297 US7,566,771 US5,585,089 US7,732,578 US5,565,332 US6,300,064 US6,248,516 米国特許第5,837,821号 US7,166,697 米国特許第6,180,370号 WO2008/006554 米国特許第6,277,375号 米国特許第6,821,505号 米国特許第7,083,784号 米国特許第7,217,797号 WO2000/42072 米国特許出願第20090142340号 米国特許出願第20090068175号 米国特許出願第20090092599号 米国特許第6,602,684号 米国特許第7,326,681号 米国特許第7,388,081号 US2010/0297076 US7,202,346 US7,723,485 US8,039,593 米国特許出願第2003-0211100号 米国特許出願第2002-0142358号 米国特許出願第2004-0006215号 米国特許出願第2006-0083736号 US6,417,337 US6,903,203 US7,776,330 US8,124,738 US5693761 米国特許第5,976,531号 米国特許第5,772,997号 米国特許第5,770,195号 米国特許第5,677,171号 米国特許第6,512,097号 米国特許第5,977,322号 WO97/00271 米国特許第5,844,093号 米国特許第5,558,864号 欧州特許第706,799A号 米国特許公開第2006/0099205A1号 米国特許公開第2004/0071696A1号
Ozzelloら(Breast Cancer Research and Treatment 25:265〜76頁、1993年) Alkanら(Journal of Interferon Research、volume 4、number 3、355〜63頁、1984年) Xuan C、Steward KK、Timmerman JM、Morrison SL、「Targeted delivery of interferon-α via fusion to anti-CD20 results in potent antitumor activity against B-cell lymphoma」、Blood 2010年;115:2864〜71頁 Rossiら(Blood、114巻、18号、3864〜71頁) WO2013/059885 Wardら、1989年、Nature 341 544〜6頁 Birdら、1988年、Science 242 423〜6頁 Hustonら、1988年、Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879〜83頁 Holliger, P.ら、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁 Poljak, R. J.ら、1994年、Structure 2:1121〜1123頁 Kontermann及びDubel編、「Antibody Engineering」、2001年、Springer-Verlag、New York、790頁、ISBN 3-540-41354-5 Hamers-Castermanら、1993年、Nature 363:446〜448頁 Davies及びRiechmann、1994年、FEBS Lett. 339:285〜290頁 Ku及びSchutz、1995年、Proc. Natl. Acad. Sci. 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一般に、先行技術は、強力なIFNを使用すること、及びこのIFNを、癌細胞に対し標的化することを教示している。このアプローチにより、癌細胞に対するIFNの活性の増加が得られるが、このアプローチは、正常な「オフ標的」細胞に対するIFNの活性の課題に対処しない。上記で言及した先行技術の例では、抗体-IFNαの融合タンパク質のヒトIFNαの部分が、対応する抗原を細胞表面上に発現しないヒト細胞に曝露されると、ネイティブのIFNα活性を高い比率で維持した。この活性は、融合タンパク質のIFNαの部分による、非癌性の正常な(「オフ標的」)細胞の活性化によって生じる毒性をもたらす恐れがある。したがって、IFNに基づく薬物の「オフ標的」活性を減少させ、かつ、そのような薬物の「オン標的(on target)」の治療作用を保つ必要性が存在する。標的に特異的な活性を維持し、同時に、これらのタイプの治療剤の非標的に対する毒性を低下させることによって、治療に有用なペプチドに対して、治療濃度のより大きなウィンドウが生み出されるであろう。例えば、ヒトIFNαを、その活性を癌細胞に向け、かつ正常ヒト細胞に対するその作用を最小限に留めることができるような形態で使用するのが望ましいであろう。理想的なのは、癌細胞上のI型インターフェロン受容体が最大限に刺激され、一方、非癌性細胞上の同じ受容体は最低限の刺激しか経験しないことであろう。ヒトIFNαが、抗原を提示する癌細胞に対して、抗原を提示しない正常細胞に対してよりも劇的に強い活性を示すように、ヒトIFNαを癌細胞に対し標的化する必要性がある。同じ論理が、その他の、治療剤になり得る可能性のある分子、例えば、その他のサイトカイン、ペプチド及びポリペプチドのホルモン、ケモカイン、増殖因子、アポトーシス誘発因子等に適用される。
このアプローチの論理が、WO2013/059885及びWO2014/178820に示されており、それらのそれぞれの開示が、相互参照により、本明細書に組み込まれている。
第1の態様では、本発明は、第1のドメイン及び第2のドメインを含む融合ポリペプチドであって、第1のドメインが、細胞表面関連抗原に結合するポリペプチドリガンドを含み、第2のドメインが、配列番号1又は配列番号2の配列を有するヒト脱グリコシル化インターフェロンα2b(IFNα2b)を含み、脱グリコシル化IFNα2bが、脱グリコシル化IFNα2bの活性を減弱させる1つ又は複数のアミノ酸の置換又は欠失を更に含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号31、61〜77、83及び87からなる群から選択される配列、並びに配列番号81、82及び84からなる群から選択される配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号87及び配列番号81を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号79及び配列番号85を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号80及び配列番号86を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号78を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の融合ポリペプチド及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、対象における腫瘍を治療する方法であって、本発明の融合ポリペプチド又は本発明の組成物を対象に投与する工程を含み、融合ポリペプチドの第1のドメインが、腫瘍細胞に結合する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍の治療における本発明の融合ポリペプチドの使用であって、融合ポリペプチドの第1のドメインが、腫瘍に結合する使用を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、1つ又は複数の本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞中でポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドを生成する方法であって、ポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドが、不均一性の低下及び/又はFcRn結合性の増強及び/又は標的選択性の改善を示し;前記方法が、ポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞を培養する工程を含み、IFNα2b配列のT106が、別のアミノ酸で置換されている又は欠失しており、したがって、哺乳動物細胞中で発現すると、融合タンパク質のIFNα2b成分が脱グリコシル化されている方法を提供する。
IgG1又はIgG4のフォーマットにおける抗CD38-減弱化IFNa2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合及び有さない場合を用いて、(A)ARP1細胞及び(B)NCI-H929細胞を処理した際の抗増殖活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を示すグラフである。 (A)A10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質及び(B)A10.43の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A)のオン標的活性を示すグラフである。 (A)A10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質及び(B)A10.43の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A)のオフ標的活性を示すグラフである。 抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A又はΔT106)によるオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 減弱化IFNα2bからO-連結型グリコシル化部位を除去する異なるアミノ酸の置換を有する抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性を示すグラフである。 A10.43の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)のオフ標的活性を示すグラフである。 多発性骨髄腫のマウスモデルにおいて腫瘍を治療する際の、抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の最適を下回る投与量において、O-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の効力を示すグラフである。 A10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A、ΔT106、T106S、T106V、T106G、T106E)の、IEFゲル上のバンドの数により評価した、荷電した種の数を示すグラフである。 種々のFcアイソタイプを有するA10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の、IEFゲル上のバンドの数により評価した、荷電した種の数を示すグラフである。 抗体の定常領域中のYTE置換の存在下における、A10.21(S228Pを有するIgG4)の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の、IEFゲル上のバンドの数により評価した、荷電した種の数を示すグラフである。 多様なIFN減弱化置換の存在下における、A10.21(S228Pを有するIgG4)の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の、IEFゲル上のバンドの数により評価した、荷電した種の数を示すグラフである。 異なる標的特異性を有する抗体、すなわち、減弱化IFNα2bに融合している抗CD138抗体、抗HLA抗体及び抗CD38抗体(A02.12)(全て、S228Pを有するIgG4)において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の、IEFゲル上のバンドの数により評価した、荷電した種の数を示すグラフである。 抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質(A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D))において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A、ΔT106、T106S、T106V、T106G、T106E)の「オン標的」活性を示すグラフである。 CD38上の異なるエピトープに結合する2つの異なる抗CD38抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質(A02.12及びA10.21;両方が、S228Pを有するIgG4)において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の「オン標的」活性を示すグラフである。 多様なIFN減弱化置換(R33A、R144I、R145Q、A145K又はA145G)を有するA10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質(A10.21IgG4(S228P)IFN)において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A)の「オン標的」活性を示すグラフである。 異なる標的特異性を有する抗体、すなわち、減弱化IFNα2bに融合している抗CD138抗体及び抗HLA抗体(両方が、S228Pを有するIgG4)において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)の「オン標的」活性を示すグラフである。 抗体重鎖のYTE置換の存在下における、A10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質(A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D))において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A)の「オン標的」活性を示すグラフである。 多様な免疫グロブリンFcアイソタイプを有するA10.21の抗CD38-減弱化IFNα2b(A145D)の融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)及び有さない場合(T106A)の「オン標的」活性を示すグラフである。 多様な、IFNのグリコシル化を除去するためのアミノ酸の置換、半減期を延長するための免疫グロブリン定常領域中のYTE置換、IFNの減弱化、及びFcアイソタイプの存在下における、A10.21の抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において、IFNα2bがO-連結型グリコシル化を有する場合及び有さない場合の選択指数を示すグラフである。
本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、単語「含む(comprise)」、又は変化形、例として、「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」は、記述する要素又は整数又は要素若しくは整数の群が含まれるが、その他の要素及び整数及び要素又は整数の群はいずれも排除されないことを示唆すると理解される。
本明細書において、先行する刊行物(若しくはそれに由来する情報)又は公知である事項に言及する場合、いかなる場合であっても、言及することによって、先行する刊行物(若しくはそれに由来する情報)又は公知の事項が本明細書に関わる事業分野における共通一般知識の一部を形成することに同意し、そうであることを認め、そうであることを何らかの形で示唆することにはならず、そのように解釈してはならない。
本明細書で言及する全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
主題の明細書において使用する場合、文脈上そうでないことが明らかでない限り、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、複数形の態様を含むことに注目しなければならない。したがって、例えば、「1つの薬剤」についての言及は、単一の薬剤、及び2つ以上の薬剤を含み、「1つの分子」についての言及は、単一の分子、及び2つ以上の分子を含む、等となる。
本発明のコンストラクトは、ポリペプチドリガンド-減弱化、脱グリコシル化IFNα2bの融合コンストラクトであり、これらのコンストラクトは、目的の細胞上の細胞表面受容体を標的とするリガンド、及び細胞表面のIFN受容体に対する親和性の低下を示す減弱化IFNα2bの両方の作用に起因して、シグナル伝達経路の活性化に関する抗原選択指数の上昇を示す。WO2013/059885に概要が述べられている、抗体-IFNの融合コンストラクトにおいては、抗原陰性細胞に対するIFN活性が、劇的に減弱し、一方、抗原陽性細胞に対するIFN活性は、仮にあったとしても、中程度に減弱するに過ぎないように、IFNの部分を変異させることができるという発見に、これらのコンストラクトは基づく。そのようなコンストラクトは、遊離のIFNよりも、1、2、3、4又は5桁大きい、抗原陰性細胞と比較する抗原陽性細胞に対する効力を示す。一実施形態では、抗体-減弱化IFNのコンストラクトは、抗原陽性細胞に対して、減弱化されていない、遊離の(すなわち、抗体につながっていない)IFNの少なくとも1%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%の効力を維持する。更に、一実施形態では、抗体-減弱化IFNのコンストラクトは、減弱化されていない、遊離の(すなわち、抗体につながっていない)IFNの最大活性を、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%維持する;この文脈では、「最大活性」は、用量応答曲線の高い、プラトー部分におけるシグナル伝達活性(又は下流のその作用)の量を意味すると理解すべきであり、プラトー部分では、薬剤を更に増加させても、応答の量は更に増加することがない。
本発明者らはここに、脱グリコシル化IFNα2bを含むコンストラクトを使用することによって、O-グリコシル化IFNα2bを含むコンストラクトと比較して、予想外の利点が得られることを見出すに至った。いくつかの実施形態では、これらの利点は、哺乳動物細胞発現系において生成する場合に、オン標的活性の増加、FcRnに対する標的選択性の増加及び親和性の増強のうちの1つ又は複数を含み、かつ、O-グリコシル化IFNα2bよりも、不均一性がより低い生成物をもたらすことである。FcRn結合性の増強は、Fc領域を含む生物学的治療剤のpKを改善するのに望ましい。標的選択性の増加が望ましく、これは、標的選択性の増加が、オン標的活性を実質的に維持しながら、オフ標的毒性を低下させる可能性があるからである。不均一性の低下により、哺乳動物細胞培養系から精製する生成物の収率を増加させることが可能になる。
したがって、第1の態様では、本発明は、第1及び第2のドメインを含む融合ポリペプチドであって、第1のドメインが、細胞表面関連抗原に結合するポリペプチドリガンドを含み、第2のドメインが、配列番号1又は配列番号2の配列を有する脱グリコシル化インターフェロンα2b(IFNα2b)を含み、脱グリコシル化IFNα2bが、脱グリコシル化IFNα2bの活性を減弱させる1つ又は複数のアミノ酸の置換又は欠失を更に含む融合ポリペプチドを提供する。
本発明のある実施形態では、脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その中で、106位の残基が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W又はYである。このことは、ヒトIFNα2b中に通例存在するT106を、哺乳動物細胞培養物中で生成する場合に、この位置におけるO-連結型グリコシル化を生じさせない、天然に存在するアミノ酸を用いて置換することを示す。本発明の別の実施形態では、脱グリコシル化IFNα2bの配列は、配列番号2である。このことは、正常ヒトIFNα2b中に見出される残基T106の欠失を示し、この欠失によってもまた、この分子中に見出されるO-連結型グリコシル化部位が除去される。本明細書で実証するように、CHO細胞により発現させる場合、置換又は欠失のそれぞれが、ヒト減弱化IFNα2bから、O-グリコシル化部位を除去し、分子の不均一性を、IEFゲル中で測定する場合に低下させ、かつ、減弱化IFNα2bの活性を少なくとも実質的に維持して、細胞表面のIFN受容体に結合し、下流のシグナル伝達を開始する。
さらなる実施形態では、脱グリコシル化IFNα2bの配列は、L15A、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33A、R33K、R33Q、H34A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R120E、R125A、R125E、K131A、E132A、K133A、K134A、M148A、R149A、S152A、L153A、N156A、(L30A、H57Y、E58N及びQ61S)、(M148A、H57Y、E58N及びQ61S)、(L153A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R144A、H57Y、E58N及びQ61S)、(N65A、L80A、Y85A及びY89A)(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD114A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL117A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR120A)、(Y85A、Y89A及びD114A)、(D114A及びR120A)、(L117A及びR120A)、(L117A、R120A及びK121A)、(R120A及びK121A)、(R120E及びK121E)、144位のRの、A、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYによる置換、145位のAの、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V又はYによる置換、並びに残基L161〜E165の欠失からなる群から選択される減弱化変異により改変された配列番号1である。
さらなる実施形態では、脱グリコシル化IFNα2bの配列は、L15A、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33A、R33K、R33Q、H34A、Q40A、D113R、L116A、R119A、R119E、R124A、R124E、K130A、E131A、K132A、K133A、M147A、R148A、S149A、L152A、N155A、(L30A、H57Y、E58N及びQ61S)、(M147A、H57Y、E58N及びQ61S)、(L152A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R143A、H57Y、E58N及びQ61S)、(N65A、L80A、Y85A及びY89A)(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD113A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL116A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR1190A)、(Y85A、Y89A及びD113A)、(D113A及びR119A)、(L116A及びR119A)、(L116A、R119A及びK120A)、(R119A及びK120A)、(R119E及びK120E)、143位のRの、A、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYによる置換、144位のAの、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V又はYによる置換、並びに残基L160〜E164の欠失からなる群から選択される減弱化変異により改変された配列番号2である。
別の実施形態では、減弱化変異により改変された脱グリコシル化IFNα2bの配列は、配列番号3〜30及び配列番号32〜47からなる群から選択される。
別の実施形態では、細胞表面関連抗原は、CD38、CD138、RANK-リガンド、HM1.24、CD56、CS1、CD20、CD74、IL-6R、Blys(BAFF)、BCMA、HLA-SR、HLA-DR、キニノーゲン、ベータ2ミクログロブリン、FGFR3、ICAM-1、マトリプターゼ、CD52、EGFR、GM2、アルファ4-インテグリン、IFG-1R、KIR、CD3、CD4、CD8、CD24、CD44、CD69、CD71、CD79、CD83、CD86、CD96、HLA、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD19、CD52、CD14、FSP1、FAP、PDGFRアルファ、PDGFRベータ、ASGR1、ASGR2、FSP1、RTI140/Ti-アルファ、HTI56、VEGF受容体、RCHE遺伝子の生成物であるCD241、CD117(c-kit)、CD71(トランスフェリン受容体)、CD36(トロンボスポンジン受容体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239及びCD240からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、抗体又はその抗原結合部分である。
別の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、CD38に結合する抗体である。抗体のVH配列は、配列番号48〜56及び58からなる群から選択され、抗体のVL配列は、配列番号81、82及び84からなる群から選択されるのが好ましい。
別の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、CD138に結合する抗体である。抗体のVH配列は、配列番号59であり、抗体のVL配列は、配列番号85であるのが好ましい。
別の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、RANK-リガンドに結合する。ポリペプチドリガンドの配列が、配列番号57であるのが好ましい。
別の実施形態では、第1のドメインは、第2のドメインに、ペプチド結合を介して連結している。第1のドメインを、第2のドメインに、ペプチド結合(「長さゼロのリンカー」)により直接連結するか、又は1〜20アミノ酸長のペプチドリンカーを介して連結することができる。リンカーは、(SGGGGS)nであり得、式中、nは、1〜3である。リンカーの例として、SGGGGS及びSGGGGSGGGGSGGGGSが挙げられる。
別の実施形態では、第1のドメインのC末端が、第2のドメインのN末端に連結している。
別の実施形態では、第1のドメインのアミノ酸配列が、グリコシル化されている。
別の態様では、本発明は、配列番号31、61〜77、83及び87からなる群から選択される配列、並びに配列番号81、82及び84からなる群から選択される配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号87及び配列番号81を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号79及び配列番号85を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号80及び配列番号86を含む融合ポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号78を含む融合ポリペプチドを提供する。
上記の論述から理解されるであろうが、現在の発明の融合ポリペプチドの特定の形態を、以下に示す。
a.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がAである。
b.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がCである。
c.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がDである。
d.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がEである。
e.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がFである。
f.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がGである。
g.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がHである。
h.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がIである。
i.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がKである。
j.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がLである。
k.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がMである。
l.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がNである。
m.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がPである。
n.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がQである。
o.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がRである。
p.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がVである。
q.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がWである。
r.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号1であり、その配列中、106位の残基がYである。
s.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L15Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
t.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異A19Wにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
u.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R22Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
v.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R23Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
w.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異S25Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
x.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L26Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
y.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異F27Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
z.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L30A又はL30Vにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
aa.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異K31Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
bb.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異D32Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
cc.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R33A、R33K又はR33Qにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
dd.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異H34Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
ee.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異Q40Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
ff.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異D114Rにより改変された配列番号1、又は減弱化変異D113Rにより改変された配列番号2である。
gg.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L117Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異L116Aにより改変された配列番号2である。
hh.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R120A若しくはR120Eにより改変された配列番号1、又は減弱化変異R119A若しくはR119Eにより改変された配列番号2である。
ii.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R125A若しくはR125Eにより改変された配列番号1であり、又は減弱化変異R124A若しくはR124Eにより改変された配列番号2である。
jj.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異K131Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異K130Aにより改変された配列番号2である。
kk.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異E132Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異E131Aにより改変された配列番号2である。
ll.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異K133Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異K132Aにより改変された配列番号2である。
mm.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異K134Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異K133Aにより改変された配列番号2である。
nn.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異M148Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異M147Aにより改変された配列番号2である。
oo.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R149Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異R148Aにより改変された配列番号2である。
pp.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異S152Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異S151Aにより改変された配列番号2である。
qq.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L153Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異L152Aにより改変された配列番号2である。
rr.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異N156Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異N155Aにより改変された配列番号2である。
ss.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L30A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
tt.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異M148A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号1、又は減弱化変異M147A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号2である。
uu.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L153A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号1、又は減弱化変異L152A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号2である。
vv.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異R144A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号1、又は減弱化変異R143A、H57Y、E58N及びQ61Sにより改変された配列番号2である。
ww.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異N65A、L80A、Y85A及びY89Aにより改変された配列番号1又は配列番号2である。
xx.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD114Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD113Aにより改変された配列番号2である。
yy.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL117Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL116Aにより改変された配列番号2である。
zz.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR120Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR119Aにより改変された配列番号2である。
aaa.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異Y85A、Y89A及びD114Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異Y85A、Y89A及びD113Aにより改変された配列番号2である。
bbb.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異D114A及びR120Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異D113A及びR119Aにより改変された配列番号2である。
ccc.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、減弱化変異L117A及びR120Aにより改変された配列番号1、又は減弱化変異L116A及びR119Aにより改変された配列番号2である。
ddd.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、変異L117A、R120A及びK121Aにより改変された配列番号1、又は変異L116A、R119A及びK120Aにより改変された配列番号2である。
eee.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、変異R120A及びK121Aにより改変された配列番号1、又は変異R119A及びK120Aにより改変された配列番号2である。
fff.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、変異R120E及びK121Eにより改変された配列番号1、又は変異R119E及びK120Eにより改変された配列番号2である。
ggg.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列において、配列番号1が、144位のRを、A、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYにより置換することによって改変されており、配列番号2が、143位のRを、A、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYにより置換することによって改変されている。
hhh.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、145位のAを、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V若しくはYにより置換することによって改変された配列番号1、又は144位のAを、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V若しくはYにより置換することによって改変された配列番号2である。
iii.融合ポリペプチド中の脱グリコシル化IFNα2bの配列が、残基L161〜E165を欠失させることによって改変された配列番号1、又は残基L161〜E165を欠失させることによって改変された配列番号2である。
jjj.脱グリコシル化IFNα2bの配列が、配列番号3〜30及び配列番号32〜47からなる群から選択される、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、4つのポリペプチド鎖、すなわち、2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖から構成される任意の免疫グロブリン(Ig)分子、又はIg分子のエピトープに結合する必須の特徴を維持するIg分子の任意の機能性断片、変異体、バリアント若しくは誘導物を広く指す。そのような変異体、バリアント又は誘導体の抗体のフォーマットは、当技術分野で公知であり、下記に、それらの非限定的な実施形態について論じる。
完全長の抗体では、それぞれの重鎖が、重鎖可変領域(本明細書では、HCVR又はVHと略す)及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、すなわち、CH1、CH2及びCH3から構成される。それぞれの軽鎖が、軽鎖可変領域(本明細書では、LCVR又はVLと略す)及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、すなわち、CLから構成され、これは、ヒトにおいては、κ又はλのいずれかのクラスであり得る。VH及びVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域、及びその中に散在する、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存されている領域に更に細分することができる。VH及びVLはそれぞれ、3つのCDR及び4つのFRから構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順、すなわち、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に並ぶ。免疫グロブリン分子は、タイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスのいずれであってもよい。
抗体の「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原(例えば、CD38)に特異的に結合する能力を保持する、抗体又はタンパク質の1つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原に結合する機能を、完全長の抗体の断片が発揮することができることが示されている。また、そのような抗体の実施形態は、二特異性、二重特異性又は多重特異性のフォーマットであってもよく、2つ以上の異なる抗原に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価の断片;(ii)F(ab')2断片、ヒンジ領域の部分に加えて、ジスルフィド架橋によりヒンジ領域に連結している2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片;(v)単一の可変ドメインを含むドメイン抗体(dAb)(Wardら、1989年、Nature 341 544〜6頁、参照により本明細書に組み込まれているWinterら、PCT公開WO90/05144A1);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。更に、Fv断片の2つのドメイン、すなわち、VL及びVHは、別個の遺伝子によりコードされるが、それらを、組換えの方法を使用して、合成リンカーにより合体させることもでき、このことにより、それらのドメインを、VL及びVH領域が対をなして、(単鎖Fv(scFv)として公知である)一価の分子を形成する、タンパク質の単一の鎖として作製することが可能になる(例えば、Birdら、1988年、Science 242 423〜6頁;Hustonら、1988年、Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879〜83頁を参照されたい)。そのような単鎖の抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるものとする。また、その他の形態の単鎖の抗体、例として、ダイアボディも包含される。ダイアボディは、二価の二特異性抗体であり、この場合は、VH及びVLドメインを、単一のポリペプチド鎖上に発現させるが、同じ鎖上の2つのドメイン間で対をなすことを可能にするには短過ぎるリンカーを使用し、それにより、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対をなし、2つの抗原結合部位を作り出すことを推進する(例えば、Holliger, P.ら、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁;Poljak, R. J.ら、1994年、Structure 2:1121〜1123頁を参照されたい)。そのような抗体の結合部分は、当技術分野で公知である(Kontermann及びDubel編、「Antibody Engineering」、2001年、Springer-Verlag、New York、790頁、ISBN 3-540-41354-5)。ある実施形態では、抗体の結合部分は、Fab断片である。
本明細書に記載する抗体は、ヒト化抗体であり得る。用語「ヒト化抗体」は、ヒト様可変領域を含むタンパク質を指し、この中に、ヒト抗体に由来のFR上にグラフトされているか又はその中に挿入されている、非ヒト種(例えば、マウス若しくはラット、又は非ヒト霊長類)に由来の抗体から得られたCDRが含まれると理解するものとする(このタイプの抗体はまた、「CDRグラフト抗体」とも呼ばれている)。ヒト化抗体はまた、ヒトタンパク質の1つ若しくは複数の残基が、1つ若しくは複数のアミノ酸の置換により改変されており、かつ/又はヒトタンパク質の1つ若しくは複数のFR残基が、対応する非ヒト残基により置換されているタンパク質も含む。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体中にも非ヒト抗体中にも見出されない残基を含むこともできる。一般に、タンパク質のさらなる領域(例えば、Fc領域)はいずれもヒトに由来する。当技術分野で公知の方法、例えば、US5,225,539、US6,054,297、US7,566,771又はUS5,585,089を使用して、ヒト化を実施することができる。用語「ヒト化抗体」はまた、超ヒト化抗体、例えば、US7,732,578に記載されている抗体も包含する。
本明細書に記載する抗体は、ヒト抗体であり得る。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、ヒト、例えば、ヒトの生殖系列細胞若しくは体細胞中に見出されるか又はそのような領域を使用して生成されたライブラリーから得られる抗体の可変領域、及び任意選択により、定常領域を有するタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列がコードしないアミノ酸残基、例えば、in vitroにおけるランダム又は部位特異的な変異により導入された変異(特に、保存的置換が関与する変異、又はタンパク質の残基の少数、例えば、タンパク質の残基のうちの1、2、3、4若しくは5つにおける変異)を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は、必ずしも、ヒトの免疫応答の結果として生成する必要はなく、それどころか、組換えの手段(例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング)を使用して、かつ/又はヒト抗体の定常領域及び/若しくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物(例えば、マウス)により、かつ/又は(例えば、US5,565,332に記載されている)選択の誘導(guided selection)を使用して生成することができる。この用語はまた、そのような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的では、ヒトタンパク質はまた、例えば、US6,300,064及び/又はUS6,248,516に記載されている、ヒト抗体に由来のFR又はヒトFRのコンセンサス配列に由来の配列を含むFRを含み、CDRのうちの1つ又は複数が、ランダム又はセミランダムであるタンパク質も含むとみなす。
本発明のポリペプチドの抗体部分は、任意のクラス、好ましくは、IgG1、IgG2又はIgG4の完全長の抗体であり得る。そのような抗体の定常ドメインは、好ましくは、ヒトに由来する。そのような抗体の可変領域は、非ヒト起源であってもよく、又は、好ましくは、ヒト起源若しくはヒト化であってもよい。抗体断片もまた、完全長の抗体の代わりに使用することができる。
用語「抗体」はまた、工学的に操作された抗体も含む。理解されるであろうが、工学的に操作された抗体の多くの変更形態がある(例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及びヒトのモノクローナル抗体、単鎖可変抗体断片(scFv)、ミニボディ、アプタマー、並びに上記に記載した二重特異性抗体及びダイアボディ)。
単一の可変領域ドメイン(dAbと呼ばれている)が、例えば、(Wardら、1989年、Nature 341:544〜546頁;Hamers-Castermanら、1993年、Nature 363:446〜448頁;Davies及びRiechmann、1994年、FEBS Lett. 339:285〜290頁)に開示されている。
ミニボディは、全抗体の小型のバージョンであり、単鎖中に、全抗体の必須の要素をコードする。適切には、ミニボディは、例えば、米国特許第5,837,821号に開示されているように、免疫グロブリン分子のヒンジ領域及びCH3ドメインに融合している、ネイティブの抗体のVH及びVLドメインから構成される。
代替の実施形態では、工学的に操作された抗体は、免疫グロブリンから誘導されないタンパク質のフレームワークを含むことができる。例えば、(Ku及びSchutz、1995年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552〜6556頁)を参照することができ、ここでは、4つのへリックスの束からなるタンパク質であるチトクロームb562において、2つのループを無作為化してCDRを作成し、抗原結合性について選択するに至ったことが開示されている。
抗体でない、認識性のタンパク質又はタンパク質ドメインの骨格が多数あり、それらを、本発明のコンストラクト中で抗原結合ドメインとして利用することができる。これらは、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)(Evibody;US7,166,697);ヒトトランスフェリン(Trans-body);プロテインAのZ-ドメインに由来の3つのへリックスの束(アフィボディ);単量体又は三量体のヒトC型レクチンのドメイン(テトラネクチン);第10ヒトフィブロネクチンIII型ドメイン(アドネクチン);ヒト又はウシのトリプシン阻害物質のクニッツ型ドメイン;昆虫のデフェンシンA(IICA29)、APPI(クニッツドメイン);リポカリン、FABP、ビリン結合タンパク質、アポリポタンパク質D(アンチカリン);ヒトのα-クリスタリン又はユビキチンの分子(Affilin);トリプシン阻害物質II(Microbody);α2p8又はアンキリンリピート(反復モチーフタンパク質)、カリブドトキシン(サソリの毒素)、Min-23、セルロース結合ドメイン(ノッチン);ネオカルチノスタチン、CBM4-2及びテンダミスタットに基づく骨格を含む。
更に、上記に記載したような、抗体から誘導されたドメイン又は抗体でないフォールドにより提供される骨格に加えて、リガンド結合性のタンパク質又はタンパク質ドメインが天然に存在し、これらを、本発明のリガンドの結合ドメインとして利用することもできる。例えば、リガンド結合特性を保有するタンパク質ドメインとして、受容体の細胞外ドメイン、シグナル伝達タンパク質、例として、Ras結合タンパク質AF-6のPDZモジュール、接着分子、及び酵素が挙げられる。
当技術分野で周知の方法を使用して、結合性を、例えば、親和性の成熟により増加させ、又は免疫原性を、予測されるMHCクラスII結合モチーフを除去することによって減少させる。本明細書に記載する抗体の治療的有用性を、それらの機能上の特徴、例として、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、血清半減期、体内分布及びFc受容体に対する結合性、又はこれらのうちのいずれかの組合せを調節することによって更に増強することもできる。こうした調節は、タンパク質工学的、糖鎖工学的又は化学的な方法により達成することができる。必要とされる治療適用に応じて、これらの活性のうちのいずれかを増加又は減少させるのが好都合な場合があるであろう。
糖鎖工学のある例が、Shinkawa T.ら、2003年(J Biol Chem 278:3466〜73頁)に記載されているPotelligent(登録商標)方法を使用した。
抗体の親和性成熟のための方法が多数、当技術分野で公知である。これらの多くは、バリアントのタンパク質のパネル又はライブラリーを、変異誘発により生成し、続いて、親和性の改善について選択及び/又はスクリーニングを行う一般的な戦略に基づく。変異誘発はしばしば、DNAレベルで実施され、例えば、エラープローンPCR(Thie、Voedischら、2009年、Methods Mol Biol 525:309〜322頁)により、遺伝子シャフリング(Kolkman及びStemmer 2001年、Nat Biotechnol.5月;19(5):423〜8頁)により、変異誘発性の化学物質若しくは照射の使用により、エラープローンな複製機構を有する「変異誘発遺伝子」株の使用(Greener、1996年、「In Vitro Mutagenesis Protocols」、Humana press、NJ)により、又は天然の親和性成熟機構を生かす、体細胞の高頻度変異のアプローチ(Peled、Kuangら、2008年、Annu Rev Immunol. 26:481〜511頁)により行われる。変異誘発はまた、RNAレベルで、例えば、Qβレプリカーゼの使用(Kopsidas、Robertsら、2006年、Immunol Lett. 2006年11月15日; 107(2):163〜8頁)によって実施することもできる。バリアントのタンパク質の改善についてのスクリーニングを可能にする、ライブラリーに基づく方法は、ファージ、酵母、リボゾーム、細菌細胞又は哺乳動物細胞等の多様なディスプレイ技術に基づくことができ、当技術分野で周知である(Benhar、2007年、Expert Opin Biol Ther. 5月; 7(5):763〜79頁)。より指向性/予測性の方法、例えば、部位特異的変異誘発、又は3Dタンパク質モデル化から得られた知見により導かれる遺伝子合成により、親和性成熟を達成する場合がある(例えば、Queen, Schneiderら、1989年、PNAS、86(24):10029〜33頁、又は米国特許第6,180,370号若しくは米国特許第5,225,539号を参照されたい)。
ADCCを増加させる方法が、Ferrara、Brunkerら、2006年、Biotechnol Bioeng; 93:851〜61頁;Li、Sethuramanら、2006年、Nat Biotechnol; 24:210〜5頁;Stavenhagen、Gorlatovら、2007年、Cancer Res; 67:8882〜90頁;Shields、Namenukら、2001年、J Biol Chem; 276:6591〜604頁;Shinkawa、Nakamuraら、2003年、J Biol Chem; 278:3466〜73頁;及びWO2008/006554により記載されている。
CDCを増加させる方法が、Idusogie、Wongら、2001年、J Immunol; 176:346〜56頁;Dall'Acqua、Cookら、2006年、J Biol Chem; 281:23514〜24頁;Michaelsen、Aaseら、1990年、Scand J Immunol; 32:517〜28頁;Brekke、Bremnesら、1993年、Mol Immunol; 30:1419〜25頁;Tan、Shopesら、1990年、PNAS; 87:162〜6頁;及びNorderhaug、Brekkeら、1991年、Eur J Immunol; 21:2379〜84頁により記載されている。
ADCC及びCDCを増加させる方法を記載している参考文献には、Natsume、Inら、2008年、Cancer Res; 68:3863〜72頁が含まれる。これらの参考文献のそれぞれの開示は、相互参照により本明細書に含まれている。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドの抗体成分のADCC活性及びCDC活性を低下させ、又は排除し、その結果、IFNα2b活性が、ポリペプチドの主要な活性となり、標的細胞の生存を調節するのが好都合である場合がある。
抗体の血清半減期及び体内分布を調節するためのいくつかの方法は、抗体と、異化作用からのIgGの保護において主要な役割を有する受容体である新生児型Fc受容体(FcRn)との間の相互作用を改変すること、及び高い血清抗体濃度を維持することに基づく。Dall'Acquaらは、FcRnに対する結合親和性を増強し、それにより、血清半減期を増加させる、IgG1のFc領域における置換について記載しており(Dall'Acqua、Woodsら、2002年、J Immunol; 169:5171〜80頁)、更に、トリプル置換、M252Y/S254T/T256E(残基の番号付けはEUインデックスに従う)又はM265Y/S267T/T269(残基の番号付けは、Kabatの番号付けシステムに従う)を用いると、生物学的利用率もADCC活性の調節も増強されることを示している(Dall'Acqua、Kienerら、2006年、J Biol Chem; 279:6213〜6頁)。また、米国特許第6,277,375号;第6,821,505号;及び第7,083,784号も参照されたい。Hintonらは、in vivoにおける半減期の増加を付与する、250位及び428位における定常ドメインのアミノ酸の置換について記載している(Hinton、Johlfsら、2004年、J Biol Chem; 279:6213〜6頁;Hinton、Xiongら、2006年、J Immunol; 176:346〜56頁)。また、米国特許第7,217,797号も参照されたい。Petkovaらは、in vivoにおける半減期の増加を付与する、307位、380位及び434位における定常ドメインのアミノ酸の置換について記載している(Petkova、Akileshら、2006年、Int Immunol; 18:1759〜69頁)。また、Shieldsら、2001年、J Biol Chem; 276:6591〜604頁、及びWO2000/42072も参照されたい。Fc受容体に対する結合性、並びにそれに続く、FcRn結合性及び血清半減期を含めた、これらの受容体が媒介する機能を調節する、定常ドメインのアミノ酸の置換のその他の例が、米国特許出願第20090142340号;第20090068175号及び第20090092599号に記載されている。EUインデックスに従う番号付けにおいて「S228P」と本明細書で呼ぶ置換は、Kabatにおいてはまた、Kabatら(1987年、「Sequences of proteins of immunological interest」、United States Department of Health and Human Services、Washington DC)に従って「S241P」とも呼ばれることがある。この置換は、IgG4分子のヒンジ領域のコアの配列を、IgG1又はIgG2のアイソタイプの抗体のコアの配列と同じにする効果があり、IgG4分子のヒンジ領域を安定化させる。この結果、ヘテロ二量体性のIgG4抗体の生成をしばしばもたらす、重鎖の自発的な解離及び再結合が低下する。
抗体分子に連結しているグリカンが、抗体の、Fc受容体及びグリカン受容体との相互作用に影響を及ぼし、それにより、血清半減期を含めた、抗体の活性に影響を及ぼすことが公知である(Kaneko、Nimmerjahnら、2006年、Science; 313:670〜3頁;Jones、Papacら、2007年、Glcobiology; 17:529〜40頁;及びKanda、Yamadaら、2007年、Glycobiology; 17:104〜18頁)。したがって、所望の抗体活性を調節する特定のグリコフォームから、治療上の利点を得ることができる。工学的に操作したグリコフォームを生成するための方法が、当技術分野で公知であり、それらとして、これらに限定されないが、米国特許第6,602,684号;第7,326,681号;第7,388,081号、及びWO2008/006554に記載されている方法が挙げられる。
ポリエチレングリコール(PEG)の添加による半減期の延長が、タンパク質の血清半減期を延長するのに広く使用されるようになった;このことについては、例えば、Fishburn、2008年、J Pharm Sci; 97:4167〜83頁による総説がある。
理解されるであろうが、現在の発明の配列内に、保存的アミノ酸置換をもたらすことが可能である。「保存的置換」とは、類似の特性を有するアミノ酸のことを意味する。本明細書で使用する場合、アミノ酸の以下の群を、保存的置換と認めるものとする:H、R及びK;D、E、N及びQ;V、I及びL;C及びM;S、T、P、A及びG;並びにF、Y及びW。しかし、減弱化及び/又はグリコシル化の部位において、具体的に列挙した置換以外の置換をもたらすことは意図しない。
用語「細胞表面関連抗原」は、本明細書で使用する場合、非限定的に、悪性細胞、又は感染性若しくは外来性の細胞を含めた、細胞の表面上に発現する任意の抗原を広く指す。
本発明の特定の態様では、本発明の融合ポリペプチドのコンストラクト又は組成物を使用して、癌を有する患者を治療することができる。本明細書が企図する癌は、細胞が、特殊化した、異なる細胞に分化することが全くない、無制御の細胞の成長(例えば、腫瘍の形成)により特徴付けられる、一連の疾患及び障害を含む。そのような疾患及び障害は、ABL1原癌遺伝子、AIDS関連癌、聴神経腫瘍、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、副腎皮質癌、原発性骨髄線維症、脱毛症、胞巣状軟部肉腫、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳及びCNSの腫瘍、乳癌、カルチノイド腫瘍、子宮頚部癌、小児期の脳腫瘍、小児期の癌、小児期の白血病、小児期の軟部肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌癌、子宮内膜癌、脳室上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼の癌、眼:メラノーマ、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコニー貧血、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、泌尿生殖器癌、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科系癌、血液学的悪性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リー-フラウメニ症候群、唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性ラブドイド腎臓腫瘍、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口癌、多発性内分泌腫瘍症、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻癌、鼻咽頭癌、腎芽腫、神経芽細胞腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非メラノーマ性皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道(oesophageal)癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌造瘻術、膵臓癌、副鼻癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、希少癌及び関連障害(rare-cancers-and-associated-disorder)、腎臓細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロトムンド-トムソン症候群、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟部肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮細胞癌(皮膚)、胃の癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌(膀胱)、移行上皮癌(腎臓-骨盤-/-尿管)、絨毛性癌、尿道癌、泌尿器系癌、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症及びウィルムス腫瘍を含む。ある実施形態では、腫瘍は、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫の群から選択される。
本発明の融合コンストラクトの抗体部分は、癌の治療に用いることを企図することから、腫瘍関連抗原に、すなわち、癌細胞がほとんどの正常細胞に比して選択的に発現する細胞表面抗原又は癌細胞中で過剰発現する細胞表面抗原に結合することができる。多くの腫瘍関連抗原(TAA)が、当技術分野で公知である。TAAの非限定的な例として、酵素チロシナーゼ;メラノーマ抗原GM2;アルファフェトプロテイン(AFP);癌胎児性抗原(CEA);ムチン1(MUC1);ヒト上皮増殖因子受容体(Her2/Neu);T細胞白血病/リンパ腫1(TCL1)腫瘍性タンパク質が挙げられる。いくつかの異なる癌と関連がある例示的なTAAは、テロメラーゼ(hTERT);前立腺特異的膜抗原(PSMA);ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその受容体(uPA/uPAR);血管内皮増殖因子及びその受容体(VEGF/VEGFR);細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘発因子(EMMPRIN/CD147);上皮増殖因子受容体(EGFR);血小板由来増殖因子及びその受容体(PDGF/PDGFR)、並びにc-kit(CD117)である。
その他のTAAのリストが、US2010/0297076に提供されており、その開示が、参照により本明細書に含まれている。特に興味深いのが、これらに限定されないが、CD38、CD138、CD79、CS1及びHM1.24を含めた、多発性骨髄性白血病又はリンパ腫の細胞と関連がある細胞表面抗原である。一実施形態では、リガンド-減弱化IFNのコンストラクト、例えば、抗体-減弱化インターフェロンのコンストラクトのための抗原は、CD38である。
CD38は、46kDaのII型膜貫通糖タンパク質である。CD38は、20個のアミノ酸の短いN末端細胞質テール、単一の膜貫通へリックス、及び256個のアミノ酸の長い細胞外ドメインを有する(Bergsagel, P.、Blood; 85:436頁、1995年、及びLiu, Q.、Structure、13:1331頁、2005年)。CD38は、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞、B細胞、NK細胞、単核球、形質細胞を含めた、多くの免疫細胞の表面上に発現し、顕著な比率の、正常な骨髄前駆細胞上に発現する(Malavasi, F.、Hum. Immunol. 9:9頁、1984年)。しかし、リンパ球においては、発現は、細胞の分化及び活性化状態に依存するように見える。休止状態のT細胞及びB細胞は陰性であり、一方、未熟なかつ活性化されたリンパ球は、CD38の発現に関して圧倒的に陽性である(Funaro, A.、J. Immunol. 145:2390頁、1990年)。追加の研究から、非造血性臓器、例として、膵臓、脳、脾臓及び肝臓におけるmRNAの発現が示されている(Koguma, T.、Biochim. Biophys. Acta 1223:160頁、1994年)。
CD38は、膜貫通シグナル伝達及び細胞接着に関与する、多機能性の表面酵素である。CD38は、NAD+及びNADP+を、細胞外pHに応じて、cADPR、ADPR及びNAADPに変換することができることから、環状ADPリボースヒドロラーゼとしてもまた公知である。これらの生成物は、細胞内部へのCa2+の動員を引き起こし、これにより、チロシンのリン酸化及び細胞の活性化がもたらされ得る。CD38はまた、リガンド、すなわち、CD31と相互作用することができる受容体でもある。CD31を介する受容体の活性化により、Ca2+の動員、細胞の活性化、増殖、分化及び遊走を含めた、細胞内事象がもたらされる(Deaglio, S.、Trends in Mol. Med. 14:210頁、2008年に総説されている)。
CD38は、高いレベルで、多発性骨髄腫細胞上に発現し、T系列及びB系列の急性リンパ芽球性白血病のほとんどの症例において、急性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫及びTリンパ芽球性リンパ腫の一部の症例において発現する。(Malavasi, F., J. Clin Lab Res. 22:73頁、1992年)。より最近になって、CD38の発現は、B系列慢性リンパ芽球性白血病(B-CLL)における信頼できる予後診断マーカーとなるに至った(Ibrahim, S.、Blood. 98:181頁、2001年、及びDurig, J.、Leuk. Res. 25:927頁、2002年)。独立のグループが、CD38+クローンを提示するB-CLL患者は、疾患のより進行した段階、化学療法に対する芳しくない応答性、及びより短い生存時間を伴う、好ましくない臨床経過により特徴付けられることを示している(Morabito, F.、Haematologica. 87:217頁、2002年)。CD38の、リンパ系腫瘍上での一貫性のあるかつ増強された発現により、治療用抗体技術にとって、CD38は興味をそそる標的になる。
癌を標的とする、抗体-減弱化、脱グリコシル化IFNα2bの融合タンパク質コンストラクトの開発に好ましい抗原は、体内において、癌細胞上で、ほとんどのその他の非形質転換細胞上と比して、選択的な又はより多くの発現を示す抗原である。そのような抗原の、タンパク質でない例として、スフィンゴ脂質、ガングリオシドGD2(Salehら、1993年、J. Immunol.、151、3390〜3398頁)、ガングリオシドGD3(Shitaraら、1993年、Cancer Immunol. Immunother. 36:373〜380頁)、ガングリオシドGM2(Livingstonら、1994年、J. Clin. Oncol. 12:1036〜1044頁)、ガングリオシドGM3(Hoonら、1993年、Cancer Res. 53:5244〜5250頁)、並びにタンパク質又は糖脂質上に提示され得るルイスx、ルイスy及びルイスxyの炭水化物抗原が挙げられる。タンパク質抗原の例は、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6又は-E7、MUC-1;KS1/4汎細胞癌(pan-carcinoma)抗原(Perez及びWalker、1990年、J. Immunol. 142:3662〜3667頁;Bumal、1988年、Hybridoma 7(4):407〜415頁);卵巣細胞癌抗原CA125(Yuら、1991年、Cancer Res. 51(2):468〜475頁);前立腺酸性リン酸(Tailorら、1990年、Nucl. Acids Res. 18(16):4928頁);前立腺特異的抗原(Henttu及びVihko、1989年、Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903〜910頁;Israeliら、1993年、Cancer Res. 53:227〜230頁);メラノーマ関連抗原p97(Estinら、1989年、J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445〜446頁);メラノーマ抗原gp75(Vijayasardahlら、1990年、J. Exp. Med. 171(4):1375〜1380頁);前立腺特異的膜抗原;癌胎児性抗原(CEA)(Foonら、1994年、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294頁)、MUC16(抗体には、MJ-170、MJ-171、MJ-172及びMJ-173[US7,202,346]、3A5[US7,723,485]がある);NMB(US8,039,593)、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1(Bernhardら、1989年、Science 245:301〜304頁);高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA)(Nataliら、1987年、Cancer 59:55〜63頁;Mittelmanら、1990年、J. Clin. Invest. 86:2136〜2144頁);バーキットリンパ腫抗原38.13;CD19(Ghetieら、1994年、Blood 83:1329〜1336頁);ヒトBリンパ腫抗原CD20(Reffら、1994年、Blood 83:435〜445頁);GICA19-9(Herlynら、1982年、J. Clin. Immunol. 2:135頁)、CTA-1及びLEA;CD33(Sgourosら、1993年、J. Nucl. Med. 34:422〜430頁);癌胎児性抗原(oncofetal antigen)、例として、肝臓癌の場合のアルファ-フィトプロテイン又は膀胱腫瘍癌胎児性抗原(oncofetal antigen)(Hellstromら、1985年、Cancer. Res. 45:2210〜2188頁);分化抗原、例として、ヒト肺細胞癌抗原L6又はL20(Hellstromら、1986年、Cancer Res. 46:3917〜3923頁);線維肉腫の抗原;ヒト白血病T細胞抗原Gp37(Bhattacharya-Chatterjeeら、1988年、J. Immunol. 141:1398〜1403頁);腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原(TSTA)、例として、T抗原、DNA腫瘍ウイルス及びRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含めた、ウイルス誘発型腫瘍抗原;ネオ糖タンパク質、乳癌抗原、例として、EGFR(上皮増殖因子受容体)、多型性上皮ムチン(PEM)(Hilkensら、1992年、Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359頁);多型性上皮ムチン抗原;ヒト乳脂肪球抗原;結腸直腸腫瘍関連抗原、例として、TAG-72(Yokataら、1992年、Cancer Res. 52:3402〜3408頁)、CO17-1A(Ragnhammarら、1993年、Int. J. Cancer 53:751〜758頁);分化抗原(Feizi、1985年、Nature 314:53〜57頁)、例として、胃腺癌中に見出されるI(Ma)、骨髄細胞中に見出されるSSEA-1、乳房上皮癌中に見出されるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、M18及びM39、結腸直腸癌中に見出されるD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌中に見出されるC14、肺腺癌中に見出されるF3、胃癌中に見出されるAH6、胚性癌腫細胞中に見出されるYハプテン、TL5(血液型A)、膵臓癌中に見出されるE1系(血液型B)抗原、胚性癌腫細胞中に見出されるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中に見出されるCO-514(血液型Lea)、腺癌中に見出されるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞中に見出されるG49、結腸癌中に見出される19.9;胃癌ムチン;メラノーマ中に見出されるR24、結腸腺癌中に見出されるMH2(血液型ALeb/Ley)、胚性癌細胞中に見出される4.2、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2及びM1:22:25:8、並びにSSEA-3及びSSEA-4である。HMW-MAA(配列番号433)は、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしてもまた公知であり、2322個の残基の膜結合型タンパク質であり、これは、外科的に除去された良性の母斑及びメラノーマの病変の90%超上に過剰発現する(Camploiら、Crit Rev Immunol.;24:267頁、2004年)。したがって、これは、標的の細胞表面関連抗原となる可能性があり得る。
本発明の融合タンパク質コンストラクトの標的となる、その他の例の癌抗原(例示的な癌を、括弧内に示す)として、CD5(T細胞白血病/リンパ腫)、CA15-3(細胞癌)、CA19-9(細胞癌)、L6(細胞癌)、CA242(結腸直腸)、胎盤アルカリホスファターゼ(細胞癌)、前立腺酸性ホスファターゼ(前立腺)、MAGE-1(細胞癌)、MAGE-2(細胞癌)、MAGE-3(細胞癌)、MAGE-4(細胞癌)、トランスフェリン受容体(細胞癌)、p97(メラノーマ)、MUC1(乳癌)、MART1(メラノーマ)、CD20(非ホジキンリンパ腫)、CD52(白血病)、CD33(白血病)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(細胞癌)、CD38(多発性骨髄腫)、CD21(B細胞リンパ腫)、CD22(リンパ腫)、CD25(B細胞リンパ腫)、CD37(B細胞リンパ腫)、CD45(急性骨髄芽球性白血病)、HLA-DR(B細胞リンパ腫)、IL-2受容体(T細胞白血病及びリンパ腫)、CD40(リンパ腫)、CD79(B細胞白血病又はリンパ腫、ホジキンリンパ腫)、多様なムチン(細胞癌)、P21(細胞癌)、MPG(メラノーマ)、Ep-CAM(上皮腫瘍)、葉酸受容体アルファ(卵巣)、A33(結腸直腸)、G250(腎臓)、フェリチン(ホジキンリンパ腫)、de2-7EGFR(神経膠芽腫、乳房、及び肺)、線維芽細胞活性化タンパク質(上皮)、並びにテネイシンメタロプロテイナーゼ(神経膠芽腫)が挙げられる。いくつかの特異的であり、有用である抗体として、これらに限定されないが、BR64(Trailら、1997年、Cancer Research 57:100〜105頁)、BR96mAb(Trailら、1993年、Science 261:212〜215頁)、CD40抗原に対するmAb、例として、S2C6mAb(Franciscoら、2000年、Cancer Res. 60:3225〜3231頁)、若しくはその他の抗CD40抗体、例として、米国特許出願第2003-0211100号及び第2002-0142358号に開示されている抗体;CD30抗原に対するmAb、例として、AC10(Bowenら、1993年、J. Immunol. 151:5896〜5906頁;Wahlら、2002年、Cancer Res. 62(13):3736〜42頁)、又はMDX-0060(米国特許出願第2004-0006215号)、並びにCD70抗原に対するmAb、例として、1F6mAb及び2F2mAb(例えば、米国特許出願第2006-0083736号を参照されたい)、又は抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7(US8,124,738)が挙げられる。その他の抗体が、他の箇所で総説されている(Frankeら、2000年、Cancer Biother. Radiopharm. 15:459〜76頁;Murray、2000年、Semin. Oncol. 27:64〜70頁;Breitling, F.及びDubel, S.、Recombinant Antibodies、John Wiley, and Sons、New York、1998年)。
特定の実施形態では、有用な抗体を、標的細胞上に発現する受容体又は受容体の複合体に結合させることができる。受容体又は受容体の複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバー、主要組織適合性タンパク質、サイトカイン受容体、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー、ケモカイン受容体、インテグリン、レクチン、補体制御タンパク質、増殖因子受容体、ホルモン受容体又は神経伝達物質受容体を含むことができる。適切な免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの非限定的な例が、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD22、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1、B7-H4、B7-H3及びICOSである。適切なTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの非限定的な例が、TACI、BCMA、CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/0X40、CD137/4-1BB、TNFR1、TNFR2、RANK、オステオプロテジェリン、APO3、Apo2/TRAIL R1、TRAIL R2、TRAIL R3及びTRAIL R4である。適切なインテグリンの非限定的な例が、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103及びCD104である。適切なレクチンの非限定的な例が、S型、C型及びI型のレクチンである。CEAに対する抗体の例を、Table 1(表1)に示す。
Figure 0006730271
ヒトB細胞上に発現するCD22抗原に結合する抗体として、例えば、HD6、RFB4、UV22-2、To15、4KB128及びヒト化抗CD22抗体(hLL2)が挙げられる(例えば、Liら(1989)Cell. Immunol. 111:85〜99頁;Masonら(1987)Blood 69:836〜40頁;Behrら(1999)Clin. Cancer Res. 5:3304s〜3314s頁;Bonardiら(1993)Cancer Res. 53:3015〜3021頁を参照されたい)。
CD33に対する抗体として、例えば、HuM195(例えば、Kossmanら(1999)Clin. Cancer Res. 5:2748〜2755頁;US5693761を参照されたい)、及びCMA-676(例えば、Sieversら(1999)Blood 93:3678〜3684頁を参照されたい)が挙げられる。
例示的な抗MUC-1抗体として、これらに限定されないが、Mc5(例えば、Petersonら(1997)Cancer Res. 57:1103〜1108頁;Ozzelloら(1993)Breast Cancer Res. Treat. 25:265〜276頁を参照されたい)、及びhCTMO1(例えば、Van Hofら(1996)Cancer Res. 56:5179〜5185頁を参照されたい)。
例示的な抗TAG-72抗体として、これらに限定されないが、CC49(例えば、Pavlinkovaら(1999)Clin. Cancer Res. 5:2613〜2619頁を参照されたい)、B72.3(例えば、Divgiら(1994)Nucl. Med. Biol. 21:9〜15頁を参照されたい)、及び米国特許第5,976,531号に開示されている抗体が挙げられる。
例示的な抗HM1.24抗体として、これらに限定されないが、マウスモノクローナル抗HM1.24、及びヒト化抗HM1.24IgG1カッパ抗体が挙げられる(例えば、Onoら(1999)Mol. Immuno. 36:387〜395頁を参照されたい)。
特定の実施形態では、標的化部分は、抗Her2抗体を含む。erBB2遺伝子は、(Her-2/neu)としてより一般に公知であり、膜貫通受容体をコードする癌遺伝子である。いくつかの抗体が、Her-2/neuに対して開発されており、これらのいくつかは、臨床的に使用されている。これらには、トラスツズマブ(例えば、HERCEPTIN(商標);Fornirら(1999)Oncology (Huntingt)13:647〜58頁)、TAB-250(Rosenblumら(1999)Clin. Cancer Res. 5:865〜874頁)、BACH-250(同上)、TA1(Maierら(1991)Cancer Res. 51:5361〜5369頁)、並びに米国特許第5,772,997号;第5,770,195号(mAb 4D5;ATCC CRL 10463);及び米国特許第5,677,171号に記載されているmAbがある。
その他の完全ヒト抗Her2/neu抗体が、当業者に周知である。そのような抗体には、これらに限定されないが、C6抗体、例として、C6.5、DPL5、G98A、C6MH3-B1、B1D2、C6VLB、C6VLD、C6VLE、C6VLF、C6MH3-D7、C6MH3-D6、C6MH3-D5、C6MH3-D3、C6MH3-D2、C6MH3-D1、C6MH3-C4、C6MH3-C3、C6MH3-B9、C6MH3-B5、C6MH3-B48、C6MH3-B47、C6MH3-B46、C6MH3-B43、C6MH3-B41、C6MH3-B39、C6MH3-B34、C6MH3-B33、C6MH3-B31、C6MH3-B27、C6MH3-B25、C6MH3-B21、C6MH3-B20、C6MH3-B2、C6MH3-B16、C6MH3-B15、C6MH3-B11、C6MH3-B1、C6MH3-A3、C6MH3-A2及びC6ML3-9がある。これら及びその他の抗HER2/neu抗体は、米国特許第6,512,097号及び第5,977,322号、PCT公開WO97/00271、Schierら(1996)J Mol Biol 255:28〜43頁、Schierら(1996)J Mol Biol 263:551〜567頁等に記載されている。
より一般的には、上皮増殖因子受容体ファミリーの多様なメンバーに対して作られた抗体は、本発明のコンストラクトにおいて、標的化抗体又はそれらの抗原結合部分として使用するのに十分に適切である。そのような抗体として、これらに限定されないが、米国特許第5,844,093号及び第5,558,864号、並びに欧州特許第706,799A号に記載されている抗EGFR抗体が挙げられる。その他の例示的な抗EGFRファミリー抗体として、これらに限定されないが、抗体、例として、C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8及びHER4.C7等が挙げられる(例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開第2006/0099205A1号及び第2004/0071696A1号を参照されたい)。
CD38は、本発明の融合タンパク質コンストラクトについての抗体の標的として、特に興味深い。CD38に対する抗体として、例えば、AT13/5(例えば、Ellisら(1995)J. Immunol. 155:925〜937頁を参照されたい)、HB7等が挙げられる。
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを含む組成物も提供する。これらの組成物は、任意の適切な補助剤、例として、これらに限定されないが、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等のうちの少なくとも1つを更に含むことができる。薬学的に許容される補助剤が好ましい。そのような無菌溶液の非限定的な例、及びそれらを調製する方法が、当技術分野で周知であり、例として、これに限定されないが、Gennaro編、「Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition」、Mack Publishing Co.(Easton、Pa.)、1990年がある。抗体組成物の投与様式、溶解性及び/又は安定性に適切である、薬学的に許容される担体は、日常的に容易に選択することができ、その上、当技術分野で公知であるか、又は本明細書に記載されている。
提示する組成物中で有用である、薬学的な賦形剤及び添加剤として、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、更に、炭水化物(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖及びオリゴ糖を含めた、糖;誘導体化された糖類、例として、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖等;並びに多糖又は糖高分子)が挙げられ、これらは、単独で又は組み合わせて存在し、単独で又は組み合わせて、質量又は体積に関して、1〜99.99%含まれてもよい。例示的なタンパク質賦形剤として、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)等の血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。緩衝能の点でもまた機能することができる、代表的なアミノ酸として、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が挙げられる。1つの好ましいアミノ酸が、ヒスチジンである。第2の好ましいアミノ酸は、アルギニンである。
本発明において使用するのに適切な炭水化物賦形剤として、例えば、単糖、例として、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボース等;二糖、例として、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等;多糖、例として、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等;及びアルジトール、例として、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール(グルシトール)、ミオイノシトール等が挙げられる。本発明において使用するのに好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース及びラフィノースである。
また、抗体組成物は、緩衝剤又はpH調整剤、典型的には、有機の酸又は塩基から調製された塩の緩衝剤を含むこともできる。代表的な緩衝剤として、有機酸の塩、例として、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸若しくはフタル酸の塩;Tris、トロメタミン塩酸塩、リン酸緩衝剤、又はアミノ酸緩衝剤が挙げられる。提示する組成物中で使用するのに好ましい緩衝剤は、有機酸の塩、例として、クエン酸塩、又はアミノ酸である。
更に、本発明の組成物は、高分子の賦形剤/添加剤、例として、ポリビニルピロリドン、フィコール(高分子糖)、デキストレート(例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン)、ポリエチレングリコール、矯味矯臭剤、抗菌剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤(例えば、「TWEEN(登録商標)20」及び「TWEEN(登録商標)80」等のポリソルベート)、脂質(例えば、リン脂質、脂肪酸)、ステロイド(例えば、コレステロール)、及びキレート化剤(例えば、EDTA)も含むことができる。
本発明に従う抗体組成物中で使用するのに適切な、これら及び追加の公知の薬学的な賦形剤及び/又は添加剤は、当技術分野で公知であり、例えば、「Remington: The Science & Practice of Pharmacy」、19 th ed.、Williams & Williams(1995)、及び「Physician's Desk Reference」、52nd ed.、Medical Economics、Montvale、N.J.(1998)に列挙されており、これら全体の開示が、参照により本明細書に組み込まれている。担体又は賦形剤の好ましい材料は、炭水化物(例えば、糖及びアルジトール)並びに緩衝剤(例えば、クエン酸塩)、又は高分子物質である。
当業者であれば、本明細書に記載する本発明は、具体的に記載するもの以外の変更形態及び改変形態を行い得ることを理解するであろう。本発明は、その精神及び範囲に属する全てのそのような変更形態及び改変形態を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書において個々に又はまとめて言及するか又は示す工程、特徴、組成物及び化合物の全て、並びに任意の2つ以上の前記工程又は特徴のあらゆる組合せも含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似する又はそれらと均等である任意の材料及び方法を使用して、本発明を実行又はテストすることができるが、好ましい材料及び方法を、ここに記載する。
一般的な方法
HEK-293E細胞中での抗体-融合コンストラクトの生成
提示する融合ポリペプチド中のいくつかのドメインのDNA配列を、添付する、本明細書に組み込まれている配列表に示す。タンパク質コンストラクト(抗体-減弱化IFNα2bの融合コンストラクト)をコードするDNAプラスミドを、HiSpeed Plasmid Maxiキット(Qiagen社、Valencia、CA)を使用して調製し、次いで、0.45%(w/v)のD-(+)-グルコース(Sigma社、Castle Hill、NSW)、25μg/mLのGeneticin(Invitrogen社、Carlsbad、CA)及び1×のGlutaMAX(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を補充したF17合成培地中で成長させたHEK293E細胞(CNRC社、Montreal、カナダ)に、市販されているトランスフェクション試薬、及びOptiMEM培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を使用してトランスフェクトした。培養培地を、5%のCO2を供給したインキュベーター中、120rpmで振盪しながら6日間放置して発現させた後に、単離し、プロテインA Mab Select SuRe(商標)アガロースビーズ(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)を使用する親和性精製に付した。精製したタンパク質コンストラクトに対して、PD Midi-Trap G-25カラム(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)又はHiPrep 26/10 Desaltingカラム(HiTrap Desalting、HiPrep 26/10 Desalting)を使用して、0.2MのアルギニンHCl、25mMのクエン酸、71.5mMの水酸化ナトリウム、pH6.0中へ緩衝液交換を行った。次いで、精製したタンパク質コンストラクトを、50kDaのAmicon超遠心ろ過機(Millipore社、Billerica、MA)を使用して濃縮し、続いて、タンパク質濃度を、280nmの吸光度で読み取ることによって決定した。
EXPI293細胞中での抗体-融合コンストラクトの生成
タンパク質コンストラクト(抗体-IFNα2b関連コンストラクト)をコードするDNAプラスミドを、HiSpeed Plasmid Maxiキット(Qiagen社、Valencia、CA)を使用して調製し、次いで、EXPI発現培地(Life Technologies社、Carlsbad、CA)中で成長させたEXPI293細胞(Life Technologies社、Carlsbad、CA)に、EXPI293トランスフェクションキット中に提供されたトランスフェクション試薬、及びOptiMEM培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を使用してトランスフェクトした。培養培地を、5%のCO2を供給したインキュベーター中、125rpmで振盪しながら3日間放置して発現させた後に、単離し、プロテインA Mab Select SuRe(商標)アガロースビーズ(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)を使用する親和性精製に付した。精製したタンパク質コンストラクトに対して、PD Midi-Trap G-25カラム(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)又はHiPrep 26/10 Desaltingカラム(HiTrap Desalting、HiPrep 26/10 Desalting)を使用して、0.2MのアルギニンHCl、pH6.0中への緩衝液交換を行った。次いで、精製したタンパク質コンストラクトを、50kDaのAmicon超遠心ろ過機(Millipore社、Billerica、MA)を使用して濃縮し、続いて、タンパク質濃度を、280nmの吸光度で読み取ることによって決定した。
CHO細胞中での抗体-融合コンストラクトの生成
タンパク質コンストラクト(抗体-IFNα2b関連コンストラクト)をコードするDNAプラスミドを、HiSpeed Plasmid Maxiキット(Qiagen社、Valencia、CA)を使用して調製し、次いで、Freestyle(商標)CHO発現培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA)中で成長させたCHO細胞(Lonza社)に、市販されているトランスフェクション試薬、及びOptiPro SFM(商標)培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を使用してトランスフェクトした。培養培地を、10%のCO2を供給したインキュベーター中、120rpmで振盪しながら6日間放置して発現させた後に、単離し、プロテインA Mab Select SuRe(商標)アガロースビーズ(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)を使用する親和性精製に付した。精製したタンパク質コンストラクトに対して、PD Midi-Trap G-25カラム(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)又はHiPrep 26/10 Desaltingカラム(HiTrap Desalting、HiPrep 26/10 Desalting)を使用して、0.2MのアルギニンHCl、25mMのクエン酸、71.5mMの水酸化ナトリウム、pH6.0中へ緩衝液交換を行った。次いで、精製したタンパク質コンストラクトを、50kDaのAmicon超遠心ろ過機(Millipore社、Billerica、MA)を使用して濃縮し、続いて、タンパク質濃度を、280nmの吸光度で読み取ることによって決定した。
抗体-IFNα2bの融合タンパク質コンストラクトの抗原標的化活性を測定するための方法
「オン標的(Daudi)アッセイ」:このアッセイを使用して、IFN受容体、及びIFNα2bが融合している抗体が標的とする抗原の両方を提示する細胞上で、IFNα2b、及び抗体-IFNα2bの融合タンパク質コンストラクトの抗増殖活性を定量化した。Daudi細胞は、細胞表面関連抗原としてのCD20及びCD38の両方、並びに細胞表面IFN受容体を発現する。Daudi細胞の生存率を、Promega社(Madison、Wisconsin)製の試薬CellTiter-Glo(登録商標)、カタログ番号G7570を使用して測定した。これは、発光に基づくアッセイであり、培養物の細胞の生存率を、ATPの定量化に基づいて決定する。シグナル強度が、マイクロタイタープレートウエル中の生存細胞の数に比例する。以下に、アッセイの詳細を示す。
T75フラスコ(TPP社、Trasadingen、スイス、カタログ番号90076)中の10%のウシ胎仔血清(FBS;Hyclone社、Logan、UT、カタログ番号SH30070.03)を有するRPMI1640(Mediatech, Inc.社、Manassas、VA、カタログ番号10-040-CV)中で、Daudi細胞(ATCC、Manassas、VAから入手)を培養して、0.5×105〜0.8×105個の生存細胞/mlの好ましい密度を得た。400gで5分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットを10%のFBSを有するRPMI1640中に再懸濁させることよって、細胞を収集した。次いで、10%のFBSを有するRPMI1640中で、細胞を計数し、密度を調整して、3.0×105個の細胞/mlを得た。次いで、50μlの細胞懸濁液を、96ウエルの丸底組織培養プレート(下記、「実験用プレート」)(TPP社、カタログ番号92067)の各ウエル内に分注した。別個の無菌の96ウエルのプレート(下記、「希釈用プレート」;Costar社、Corning、NY、カタログ番号3879)上では、テスト品目を、二つ組で、10%のFBSを有するRPMI1640中に段階希釈した。次いで、希釈用プレートから、50μl/ウエルを実験用プレートに移した。次いで、実験用プレートを、5%のCO2下、37℃で4日間インキュベートした。
製造業者により供給されたアッセイ用緩衝液とアッセイ用基質との混合物(下記、「CellTiterGlo試薬」;製造業者の使用説明に従って混合した)を、100μl/ウエルで実験用プレートに添加した。プレートを、2分間振盪した。次いで、実験用プレートから、100μl/ウエルを、96ウエルの平底白色不透明プレート(下記、「アッセイ用プレート」;BD Biosciences社、Franklin Lakes、NJ、カタログ番号353296)に移した。次いで、アッセイ用プレートの内容物を、暗所中、室温で15分間放置して、安定化させた。Victor 3V Multilabelカウンター(Perkin Elmer社、Waltham、MA、モデル番号1420-041)上において、発光測定用(luminometry)のチャネル上で、プレートを読み取り、発光を測定した。結果を、「相対発光単位(RLU)」として示す。
Prism 5(Graphpad社、San Diego、CA)を使用して、データを解析し、非線形回帰及び3パラメーター曲線の当てはめを使用して、曲線の中間点(EC50)を決定した。各テスト品目について、遊離のIFNα2b(又はIFNα2bと比べた効力が分かっている、IFNのいくつかのその他の形態)と比べた効力を、EC50の比として計算した。
当業者であれば、細胞生存率を測定するための、多くのその他の一般に使用されているアッセイがあり、これらもまた使用することができるであろうことを理解するであろう。
「オン標的(ARP)アッセイ」(本明細書では時にはまた、「標的化アッセイ」とも呼ぶ):多発性骨髄腫細胞株ARP-1は、University of Arkansas Medical CenterのMyeloma Institute(Little Rock、AK)のDirectorであるBart Barlogie MD、PhDから寄贈された。この細胞株は、Hardin J.ら(「Interleukin-6 prevents dexamethasone-induced myeloma cell death」、Blood; 84:3063頁、1994年)に記載されている。ARP-1細胞(CD38+)を使用して、CD38を標的とする、抗体-IFNの融合タンパク質コンストラクトをテストした。培養及びアッセイの条件は、上記で概要を述べたDaudiに基づくアッセイに関する条件と、以下の例外:ARP-1を培養して、4.0×105〜6.0×105個の細胞/mlの密度を得たことを除いて、同じであった。アッセイの前に、ARP-1の濃度を調整して、1.0×104個の細胞/mlを得た。
(実施例1)
抗CD38抗体減弱化IFNα2b融合タンパク質の等電点
抗CD38抗体-減弱化IFNα2bの融合コンストラクト(Table 2(表2))を発現する、一過性にトランスフェクトした多様な細胞を収集し、Mab Select SureプロテインAカラムを使用して精製した。HiLoad Superdex200カラムを使用して、試料を、200mMのアルギニン、25mMのヒスチジン、pH6.5中に脱塩した。
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等電点電気泳動ゲルを使用して、融合ポリペプチドの等電点(pI)を決定し、翻訳後修飾、例として、リン酸化及びグリコシル化に起因するタンパク質中の軽微な変化を検出した。
あらかじめ流し込んだIEFゲルを、ゲル用タンク中に、ゲルと緩衝液との間の密封が強固であることを確かめて配置した。次いで、200mLの1×のカソード緩衝液を、緩衝液が外側チャンバーには絶対に入らないように、内側チャンバー内に注いだ。次いで、500mLの1×のアノード緩衝液を、外側チャンバー内に注ぎ、タンクの3/4を満たした。試料及びラダーを、ゲル上に充填し、次いで、ゲルを、100ボルトで1時間、200ボルトで1時間、及び500ボルトで30分間運転した。ゲルの運転が完了すると直ぐに、ゲルを取り出し、ガラス容器中のTCA溶液中で30分間固定した。次いで、ゲルを即時に、脱イオン水を用いて3回洗浄した。ゲルを、SimplyBlue SafeStain(Invitrogen Life Technologies社)中でしっかり1時間かけて染色し、水中に終夜放置して、脱染した。スキャナーを使用して、最終画像をスキャンした。
抗体-減弱化インターフェロンの融合コンストラクトのIFNα2b部分のO-連結型グリコシル化部位を、インターフェロンのスレオニン106(T106)を、アラニン(T106Aと示す)、セリン(T106S)、バリン(T106V)、グリシン(T106G)若しくはグルタミン酸(T106E)に置換すること、又はT106を欠失させる(ΔT106と示す)ことのいずれかにより除去した。これらの変化の、融合コンストラクトのpI及び不均一性に対する作用について、O-連結型グリコシル化を有するコンストラクトとO-連結型グリコシル化を有さないコンストラクトとを、IEFゲル上での分離により比較することによって検討した。
いずれの場合も、未改変のT106と直接比較する場合のバンドの数の低下から明らかなように、T106を欠失させること、又はT106を、アラニン、セリン、バリン、グリシン若しくはグルタミン酸を用いて置換することによって、IEFゲル上で観察される、荷電した種の数が減少し、したがって、融合コンストラクトの不均一性が低下した(図9)。IEFゲル上における荷電した種の数の低下、したがって、T106Sを組み込んでいる分子の不均一性の低下と、IFNα2bの残基106におけるO-連結型グリコシル化の除去とには整合性があった。
抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、O-連結グリコシル化タンパク質と比べて、pIが増加した。A10.21の同じ抗体前端を使用する場合、コンストラクト中の抗体のアイソタイプが、IgG4、IgG1、IgG1AA(IgG1 L235A、G237A;IgG1のエフェクター機能を低下させた形態)、IgG2又はIgG2SS(IgG2(A330S、P331S))のいずれであるかにかかわらず、この傾向には一貫性があった(図10)。
YTE置換(M252Y、S254T、T256E)により、FcRnに対する親和性の増加が付与され、おそらく、抗体の半減期が増加することが示されている。さらなる実験により、抗体IFN融合コンストラクトのその他の部分における置換が、T106の欠失又は置換の結果得られた不均一性の低下に影響を及ぼすかどうかを調べた。グリコシル化A10.21抗CD38-減弱化IFNα2bの融合コンストラクト(YTE、T106T)及びYTE置換を有する非グリコシル化IFN融合コンストラクト(YTE、T106A)の不均一性を、IEFゲル上で評価した。YTE変異を担持する融合コンストラクトのIFNα2b成分のグリコシル化を除去すると、不均一性が減少した(図11)。
IFNα2bの減弱化は、IFN受容体への結合に関与する主要なアミノ酸残基の置換により達成される。IFNα2b中の多様な減弱化アミノ酸置換を有するA10.21IgG4(S228P)IFNコンストラクトについて、IFNα2b成分のO-連結型グリコシル化も一緒に有する場合(T106T)又は有さない場合(T106A)に、荷電した種の数を評価した。IFNα2bのアミノ酸残基であるアルギニン-33、アルギニン-144及びアラニン-145を個々に、残基33についてはアラニン(R33A)を、残基144についてはイソロイシン(R144I)を、又は残基145については、リジン、グリシン若しくはグルタミン(A145K、A145G、A145Q)を用いて1つずつ置換した。直接比較する場合、脱グリコシル化IFN融合コンストラクトは一貫して、それらのグリコシル化対応物よりも、不均一性が低かった(図12)。
示された不均一性の低下は、コンストラクトの抗体部分に依存しなかった。また、HLA、CD138及びCD38(抗体A10.21とは異なる、抗体A02.12に対するCD38上のエピトープ)に対する特異性を有する、抗体(IgG4(S228P))-減弱化IFNの融合コンストラクトの減弱化IFNα2b部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去しても、IEFにより検出する場合、不均一性が減少した(図13)。
(実施例2)
抗体減弱化インターフェロンα2b融合タンパク質の抗増殖活性
IFNα2bの抗増殖作用は、直接的及び間接的な活性からなる。直接的な活性は、細胞周期の停止(Matsuiら、2003年)、細胞死受容体依存性経路(Crowderら、2005年)及び細胞死受容体非依存性経路(Otsukiら、1998年)によるアポトーシス、又は分化(Matsuiら、2003年)によって阻害される癌細胞の成長を通して生じる。抗体減弱化インターフェロン融合タンパク質の、標的に特異的である直接的な細胞傷害を、標的陽性細胞株に対し、発光細胞生存率アッセイを使用して測定した。
抗CD38-IFNのリード配列の試料
コンストラクト(Table 3(表3))は、安定なクローニング又は一過性のトランスフェクションのいずれかにより得、収集し、Mab Select SureプロテインAカラムを使用して精製した。HiLoad Superdex200カラムを使用して、試料を、200mMのアルギニン、25mMのヒスチジン、pH6.5中に脱塩した。
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市販のIFNα2b
INTRON(登録商標)A、すなわち、Schering-Plough社製の、細菌により生成された市販のIFNα2bを、陽性対照として使用した。
抗増殖活性の測定
上記に記載した方法である「Daudi細胞増殖アッセイ」及び「ARP-1細胞増殖アッセイ」を使用して、抗増殖活性を測定した。ARP-1細胞増殖アッセイの方法を、さらなる細胞株NCI-H929と共に使用して、抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の抗増殖活性を測定した。いくつかの実験では、プレートを、専用のGloMax(登録商標)96マイクロプレートルミノメーター上で読み取り、CellTiter-Glo(登録商標)2.0試薬を、元々のCellTiter-Gloの代わりに使用したが、それらはいずれも、結果に影響しなかった。ARP-1/NCI-H929細胞増殖アッセイ又はDaudi細胞増殖アッセイを使用して、CD38を提示する細胞上で、IFN、及び抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質コンストラクトの抗増殖活性を定量化した。Daudi細胞、ARP1細胞及びNCI-H929細胞は、CD38を細胞表面関連抗原として発現する。以下に、アッセイの詳細を示す。
ARP-1/NCI-H929細胞増殖アッセイでは、細胞の生存率を、Promega社(Madison、Wisconsin)製の試薬CellTiter-Glo(登録商標)2.0、カタログ番号G9242を使用して測定した。これは、発光に基づくアッセイであり、培養物の細胞の生存率を、ATPの定量化に基づいて決定する。シグナル強度が、マイクロタイタープレートウエル中の生存細胞の数に比例する。細胞(ATCC、Manassas、VAから入手したNCI-H929、及びUniversity of Arkansas Medical CenterのMyeloma Institute(Little Rock、AK)のDirectorであるBart Barlogie MD、PhDから寄贈されたARP-1)を、T75フラスコ(TPP社、Trasadingen、スイス、カタログ番号90076)中の10%のウシ胎仔血清(FBS;Hyclone社、Logan、UT、カタログ番号SH30070.03)を有するRPMI1640(Mediatech, Inc.社、Manassas、VA、カタログ番号10-040-CV)中で培養して、0.5×105〜0.8×105個の生存細胞/mLの好ましい密度を得た。400×gで5分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットを10%のFBSを有するRPMI1640中に再懸濁させることによって、細胞を収集した。次いで、10%のFBSを有するRPMI1640中で、細胞を計数し、密度を調整して、3.0×105個の細胞/mLを得た。96ウエルの丸底組織培養プレート(下記、「実験用プレート」)(TPP社、カタログ番号92067)の各ウエル内に、50μLの細胞懸濁液を播種した。細胞を4℃で1時間インキュベートしてから、試験化合物を添加した。別個の無菌の96ウエルのプレート(下記、「希釈用プレート」;Costar社、Corning、NY、カタログ番号3879)上では、テスト品目を、二つ組で、10%のFBSを有するRPMI1640中に段階希釈した。希釈用プレートから、50μL/ウエルを、実験用プレートに移した。次いで、実験用プレートを、5%のCO2下、37°Cで4日間インキュベートした。「CellTiter-Glo(登録商標)試薬2.0」を、実験用プレートに100μL/ウエルで添加した。プレートを、2分間振盪した。実験用プレートから、100μL/ウエルを、96ウエルの平底白色不透明プレート(下記、「アッセイ用プレート」;BD Biosciences社、Franklin 5 Lakes、NJ、カタログ番号353296)に移した。次いで、アッセイ用プレートの内容物を、暗所中、室温で15分間放置して、安定化させた。GloMax(登録商標)96マイクロプレートルミノメーター上で、プレートを読み取った。結果を、「相対発光単位」(RLU)として示す。
Prism 5(Graphpad社、San Diego、CA)を使用して、データを解析し、非線形回帰及び4パラメーター曲線の当てはめを使用して、IC50を決定した。
抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合コンストラクトのO-連結型グリコシル化部位を、スレオニン106(T106)を、アラニン(T106A)、セリン(T106S)、バリン(T106V)、グリシン(T106G)若しくはグルタミン酸(T106E)に置換すること、又はT106を欠失させる(ΔT106と示す)ことのいずれかにより除去した。細胞増殖に対する作用を、減弱化IFNα2bに融合しているA10.21抗CD38抗体について、O-連結型グリコシル化を有する場合と有さない場合とを比較することによって検討した。抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、抗増殖活性が増加した;このことは、ARP1細胞(図1A)及びNCI-H929細胞(図1B)の両方において、対応するO-連結型グリコシル化融合タンパク質、すなわち、A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)、及びA10.21IgG1IFN(A145D、T106T)と比べて、IC50(nM)がより低いことにより認められる。抗体のアイソタイプがIgG4であるか、IgG1であるかどうかにかかわらず、この傾向には一貫性があった。
スレオニン106(T106)を、アラニン(T106A)、セリン(T106S)、バリン(T106V)、グリシン(T106G)又はグルタミン酸(T106E)に置換すると、抗増殖活性が増加した;このことは、O-連結型グリコシル化融合タンパク質と比べて、IC50(nM)がより低いことにより認められる。NCI-H929細胞中で、全ての非グリコシル化コンストラクトが、それらのグリコシル化対応物と比べて、より高い「オン標的」効力を示した(図14)。
減弱化IFNα2b成分からO-連結型グリコシル化部位を除去することの、抗増殖活性に対する影響を、様々な、抗CD38抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質において調べた。抗CD38抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質R10A2IgG4(S228P)IFN(A145D)において、T106において異なるアミノ酸の置換を保有させて、IFN成分上のO-連結型グリコシル化部位を除去したバリアント(T106A、T106G、T106N、T106F、T106R、T106D、T106E、T106Q、T106H、T106I、T106L、T106K、T106M、T106F、T106P、T106S、T106V、T106Y及びT106W)(Table 4(表4))を調べた;結果を、図2に示す。
効力のレベルは、T106部位における異なる置換の間で変動したが、O-連結型グリコシル化の除去をもたらすことが予測されるいずれの置換でも、対応するO-連結型グリコシル化タンパク質と比べて、効力が増加した(図2)。
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類似の様式で、CD38上の異なるエピトープに結合する、2つの異なる抗CD38抗体インターフェロン融合タンパク質(A02.12及びA10.21)において、O-連結型グリコシル化を有する場合と有さない場合とについて、効力の相対変化を評価した(A02.12IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)、A02.12IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)、A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)、及びA10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)。CD38に対して異なる特異性を有する抗体(IgG4(S228P))融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、コンストラクトの抗体部分の標的にかかわらず、抗増殖活性が増加した(図15)。
IFNα2bの減弱化は、多様な減弱化置換により達成される。また、IFNα2b中に多様な減弱化置換を有するA10.21IgG4(S228P)IFNコンストラクトの抗増殖活性も、O-連結型グリコシル化を有する場合(T106T)と有さない場合(T106A)とについて評価した(Table 5(表5))。多様な減弱化置換を有するコンストラクトのIFNα2b成分中のO-連結型グリコシル化部位を除去するといずれも、それらのグリコシル化対応物よりも高い効力を示した(図16)。
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異なる結合標的を有する、その他の減弱化IFNα2bが融合している抗体/タンパク質が、O-連結型グリコシル化の除去の結果としての、抗増殖活性の調節を示すかどうかを検討するために、2種のコンストラクト(IFN(A145D)に融合している抗CD138抗体及び抗HLA抗体)をO-連結型グリコシル化有り又は無しで作製し(Table 6(表6))、抗増殖活性についてテストした。
HLA及びCD138に対する特異性を有する抗体(IgG4(S228P))融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、コンストラクトの抗体部分の標的にかかわらず、抗増殖活性が増加した。このことを、HLA及びCD138に対する抗体融合コンストラクトにおいて示した(図17)。
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半減期を延長させる又はエフェクター機能を低下させるためにFc領域中に置換を含む融合タンパク質からO-連結型グリコシル化を除去することの、抗増殖活性に対する作用
YTE置換により、FcRnに対する親和性の増加が付与され、おそらく、抗体の半減期が増加することが示されている。YTE置換を含有するIFN融合抗体を、抗増殖活性について、O-連結型グリコシル化の存在下と非存在下とにおいてテストした。以下のバリアントを、A10.21抗CD38抗体減弱化IFN融合タンパク質から作製した(Table 7(表7))。
A10.21IgG4(S228P)(A145D、T106A)にYTE置換を導入しても、減弱化IFNからのO-連結型グリコシル化の除去がもたらす効力の増加は影響を受けなかった(図18)。
IgG1バリアントのFc部分中のL235A及びG237Aの置換、並びにIgG2バリアントのFc部分中のA330S及びP331Sの置換の結果、エフェクター機能が低下した。L235A及びG237Aの置換を含有する減弱化IFN融合IgG1抗体、並びにA330S及びP331Sの置換を含有する減弱化IFN融合IgG2抗体を、抗増殖活性について、O-連結型グリコシル化の存在下と非存在下とにおいてテストした。これらのバリアントを、A10.21抗CD38抗体減弱化IFN融合タンパク質から作製した(Table 7(表7))。抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、抗体コンストラクト中の抗体のアイソタイプが、IgG1又はIgG1AA(IgG1(L235A、G237A))、IgG2又はIgG2SS(IgG2(A330S、P331S))であるかどうかにかかわらず、効力が増加した(図19)。
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抗CD38抗体インターフェロン融合タンパク質の減弱化インターフェロン部分から、T106のアミノ酸の置換又は欠失によりO-連結型グリコシル化部位を除去すると、標的のCD38、CD138又はHLAに陽性の細胞に対する抗増殖活性が増加した(1.3〜12倍)。
(実施例3)
抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオン/オフ標的活性
iLite(商標)レポーター遺伝子アッセイを実施して、ルシフェラーゼが生成するバイオルミネセンスを使用する、ヒトインターフェロンアルファ(IFNα2b)の生理活性(IU/ml)の定量的な決定を行った。このアッセイにおいて使用する細胞は、CD38を発現する細胞であり、これらを使用して、抗CD38-減弱化IFNα2bの融合タンパク質の「オン標的」活性を測定した。また、これらの細胞を使用して、同じエピトープを認識する抗CD38抗体を用いてCD38をブロックする場合の「オフ標的」活性を測定することもできる。これらのアッセイを使用して、選択指数(SI)を決定することができ、SIは、どれほど選択的に、抗CD38IFN融合タンパク質が、CD38+標的細胞に対して活性を示し、CD38がブロックされている(CD38-細胞を模倣する)細胞に対して活性を示さないかの尺度である。SIが大きいほど、薬剤が、標的に対してより選択的であり、一方、1に近い数は、標的又は非標的に対して選択性がないことを示す。Intron Aを、陽性対照として使用した;というのは、これは、インターフェロンアルファ受容体のIFNαR1/2を発現する細胞に対しては活性を示すが、その他の細胞表面発現抗原(すなわち、CD38)に対しては選択的でなく、およそ1のSIを有するからである。
抗体-減弱化IFNのコンストラクト
使用したコンストラクトについての配列を、配列表に記載し、以下のTable 8(表8)に列挙した。
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INTRON(登録商標)Aを、陽性対照として使用した。
オン/オフ標的活性の測定
上記に記載した「iLite遺伝子レポーターアッセイ」と同じ方法を使用して、オン/オフ標的活性を測定した
iLiteレポーター遺伝子アッセイ(PBL Interferon Source社、Piscataway、NJ、カタログ番号51100)を、主として製造業者による記載に従い、ヒトIgGをブロックする工程を追加して実施した。iLite細胞株は、製造業者により、「市販されている前単核球ヒト細胞株に由来し、細胞表面上におけるMHCクラスII抗原、特に、ヒトリンパ球抗原(HLADR)の発現により特徴付けられる、安定な、トランスフェクトされた細胞株」と記載されている。この細胞株は、CD38を発現し、安定にトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子を含有し、その発現は、インターフェロン応答エレメント(IRE)により推進され、このことによって、インターフェロン活性を、発光アウトプットに基づいて定量化することが可能になる。
製造業者により供給されたiLiteプレート(下記、アッセイ用プレート)及び希釈液を、-80℃のフリーザーから取り出し、放置して、室温に平衡化させた。アッセイ用プレートに、希釈液を1つのウエル当たり50μL添加した。製造業者により供給されたレポーター細胞のバイアルを、-80℃のフリーザーから取り出し、37℃の水浴中で解凍した。25μLの一定分量の細胞を、アッセイ用プレートの各ウエル内に分注した。次に、10%のFBSを有するRPMI1640中に希釈した8mg/mLのヒトIgG(Sigma Chemicals社、St. Louis、MO;カタログ番号I4506)を、1つのウエル当たり12.5μL添加した。内容物を混合し、37°Cで15分間インキュベートした。別個「希釈用プレート」上で、10%のFBSを有するRPMI1640中に、テスト品目を二つ組で段階希釈した。次いで、希釈用プレートから、12.5μLのテスト品目を、アッセイ用プレートに移した。次いで、アッセイ用プレートを、5%のCO2下、37℃で17時間インキュベートした。製造業者により供給されたアッセイ用緩衝液及び基質を、-80℃のフリーザーから取り出し、2時間放置して、室温に平衡化させた。製造業者の使用説明に従って、製造業者により供給されたアッセイ用緩衝液を、製造業者により供給された基質のバイアルに添加し、十分に混合して、「発光用溶液」を作製した。次いで、100μLの発光用溶液を、アッセイ用プレートの各ウエルに添加した。プレートを、2分間振盪した。次いで、プレートを、暗所中、室温で5分間インキュベートし、Victor 3V Multilabelカウンター上において、発光測定用のチャネル上で読み取り、発光を測定し、RLUとして示した。
iLiteアッセイにおいて、抗CD38抗体-IFN融合タンパク質のコンストラクトのオフ標的活性をテストするために、製造業者により供給された希釈液に、0.25mg/mLの抗CD38抗体(抗CD38抗体-IFN融合タンパク質のコンストラクトの、iLite細胞上に発現しているCD38に対する結合をいずれもブロックするための、テストしている抗体-IFNの融合タンパク質コンストラクトが認識するのと同じ、CD38上のエピトープを認識する抗体)を補充した。このブロックする段階に続いて、抗CD38抗体-IFN融合タンパク質、又はIFNα2bを用いる処理を行った。
Prism 5(Graphpad社、San Diego、CA)を使用して、データを解析し、非線形回帰及び3パラメーター曲線の当てはめを使用して、曲線の中間点(EC50)を決定した。選択指数(SI)を、EC50(オフ標的活性)/EC50(オン標的活性)により計算した。選択指数(SI)は、抗CD38IFNコンストラクトが、どれほど選択的に、CD38発現細胞に対して活性を示し、CD38を有さない細胞中で活性を示さないかの尺度である。その数が大きいほど、コンストラクトが、標的に対してより選択的であり、一方、1に近い数は、標的に対する選択性はないことを示す。Intron Aを、陽性対照として使用した;これは、およそ1のSIを有する。
抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合コンストラクトのO-連結型グリコシル化部位を、スレオニン106(T106)をアラニンに置換する(T106Aと示す)ことによって除去した。IFNα2bに融合しているA10.21及びA10.43抗CD38抗体について、O-連結型グリコシル化を有する場合と有さない場合とを比較することによって、活性を検討した。
抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去する(T106Aと示す)と、O-連結型グリコシル化タンパク質と比べて、オン標的活性は若干増加し(図3及びTable 9(表9))、オフ標的活性は若干増加する場合もあり、増加しない場合もあった。O-連結型グリコシル化タンパク質及び非グリコシル化タンパク質の両方が、CD38+細胞に対して高い選択性を示し、一方、Intron Aは、選択性を示さなかった。
Figure 0006730271
また、融合タンパク質の減弱化IFNからO-連結型グリコシル化部位を除去することの、オン/オフ標的活性に対する影響も、類似の様式で調べることができる。
iLite(商標)レポーター遺伝子オン-オフ標的活性アッセイを実施して、抗CD38減弱化IFN融合タンパク質が、標的のCD38+細胞に対しては、選択的な活性を示すこと、及び(同じエピトープを認識する)抗CD38抗体を用いてCD38をブロックする場合には、細胞に対して限定的な活性しか示さないことを実証した;後者は、標的陰性細胞に対する予期される活性を模倣する。
抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を(T106A置換により)除去すると、O-連結型グリコシル化タンパク質と比べて、オン標的活性は若干増加し、オフ標的活性は若干増加する場合もあり、増加しない場合もあった。O-連結型グリコシル化抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合タンパク質及び非グリコシル化抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合タンパク質の両方が、CD38+細胞に対して高い選択性を示し、一方、Intron Aは、選択性を示さなかった。
抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去した結果生じる選択指数の調節を更に調べるために、オン-オフ標的活性を、様々なコンストラクトにおいて調べた。調べた変化は、A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)コンストラクトに基づいた。これらには、スレオニン106の欠失(ΔT106)、T106のセリンへの置換(T106S)、YTE置換(YTE T106T及びYTE T106A)、アラニン145からグルタミンへの置換(A145Q)、並びに種々の抗体のアイソタイプからIgG1への置換(IgG1T106T及びIgG1T106A)によるIFNの減弱化が含まれた。
大半のコンストラクトが、>1の選択指数を示し、標的のCD38+細胞に対する選択性の大きさは、抗CD38IFN融合コンストラクトに依存して変化した(図20)。最も高い選択性が、A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)において観察された。
(実施例4)
抗CD38抗体-減弱化IFNα2bの融合タンパク質のオフ標的活性
HEK-Blue(商標)IFN-α/β細胞を用いると、ISGF3経路の活性化をモニターすることによって、生理活性を示すヒトI型IFNの検出が可能となる。HEK-Blue(商標)IFN-α/β細胞を、ヒトIFN-αを用いて刺激することによって、JAK/STAT/ISGF3経路が活性化され、続いて、SEAP(IFN-α/β誘導性のISG54プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子)の生成が誘発される。上清中のSEAPのレベルは、QUANTI-Blue(商標)を用いて容易に決定することができる。このレポーター遺伝子アッセイを使用して、抗体インターフェロン融合タンパク質の減弱化インターフェロン部分からO-連結型グリコシル化を除去することがもたらす作用を評価した。
抗体/Fcの融合タンパク質コンストラクトの生成
インターフェロン融合タンパク質を発現する、一過性にトランスフェクトした多様な細胞を、収集し、Mab Select SureプロテインAカラムを使用して精製した。HiLoad Superdex200カラムを使用して、試料を、200mMのアルギニン、25mMのヒスチジン、pH6.5中に脱塩した。
Figure 0006730271
Figure 0006730271
Figure 0006730271
INTRON(登録商標)Aを、陽性対照として使用した。
オフ標的活性の、HEK-Blueアッセイによる測定
抗体-IFNの融合体のオフ標的活性を、「HEK-Blueオフ標的アッセイ」に記載されている方法と同じ方法を使用して測定した;ただし、播種した細胞の体積に対して、希釈した抗体及び上清を使用した。以下に、アッセイの詳細を示す。
HEK-Blueオフ標的アッセイを使用して、抗体-IFNの融合コンストラクトの、インターフェロン-アルファ/β受容体(IFNAR)に結合する能力を、HEK-Blue(商標)IFN-アルファ/β細胞株(InvivoGen社、San Diego、CA)を使用して定量化した。HEK-Blue IFN-アルファ/β細胞株の製造業者による記載に主として従って、「オフ標的(HB-IFN)アッセイ」を実施した。HEK-Blue(商標)IFN-アルファ/β細胞は、I型IFNにより誘発されるJAK-STAT経路の活性化をモニターするように特異的に設計されている。ヒトのSTAT2遺伝子及びIRF9遺伝子をHEK293細胞内に導入することによって、この細胞を生成して、十分に活性なI型IFNシグナル伝達経路を得た。HEK-Blue(商標)IFN-アルファ/β細胞は、ISG54プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子、すなわち、分泌型胎児性アルカリホスファターゼ(SEAP)を安定に発現する。ISG54は、I型IFNによりISRE依存性の機構を介して活性化される、周知のISGである。HEK-Blue(商標)IFN-アルファ/β細胞は、IFN-アルファ又はIFNβにより刺激されると、JAK-STAT経路を、次いで、SEAPレポーター遺伝子の発現を活性化させる。SEAPは、培地内に分泌され、これを、比色分析試薬であるQUANTI-Blue(商標)を使用して定量化することができる。
手短に述べると、HEK-Blue IFN-アルファ/β細胞(InvivoGen社、San Diego、CA、カタログ番号hkb-Ifnab)を解凍し、熱不活性化させてある10%のFBS(Hyclone社、Logan、UT、カタログ番号SH30070.03)(HI FBS)を有するDMEM培地(Mediatech社、Manassas、VA、カタログ番号10-013-CV)中で培養した。細胞が、60〜80%のコンフルエンスに到達したら、それらを、細胞ストリッパー(Mediatech社、カタログ番号25-056-Cl)を用いてリフトした。細胞を、HI FBSを有するDMEM中で2回洗浄し、計数した。細胞を、HI FBSを有するDMEM中で2.77×105個の生存細胞/mLに調整し、平底96ウエル組織培養プレート(下記、「実験用プレート」)内に1つのウエル当たり180μLで播種した。次いで、HI FBSを有するDMEM内に希釈したIFN-アルファ2b又は融合タンパク質コンストラクトを、1つのウエル当たり20μL添加した。プレートを、5%のCO2下、37℃で16〜24時間インキュベートした。QUANTI-Blue(InvivoGen社、カタログ番号rep-qb1)を、製造業者の指示に従って調製した。QUANTI-Blue(180μL)を、平底プレート(下記、「アッセイ用プレート」)の各ウエル内に播種した。次いで、実験用プレートから、1つのウエル当たり20μLの上清を、アッセイ用プレートに移した。次いで、アッセイ用プレートを、37℃で1〜3時間インキュベートした。アッセイ用プレートの620nmにおける吸光度を、Molecular Devices社製のSpectraMaxPlus 384モデルのマイクロプレートリーダー上で読み取った。データを、Graph Pad Prismを使用して解析した。
IFNα2b中のO-連結型グリコシル化の有無が、減弱化IFN融合抗CD38抗体のオフ標的活性に対して及ぼす影響を評価した。
減弱化インターフェロン融合コンストラクトを有する抗CD38抗体のO-連結型グリコシル化部位を、スレオニン106(T106)をアラニンに置換する(T106Aと示す)こと、又はT106を欠失させる(ΔT106と示す)ことのいずれかにより除去した。オフ標的活性に対する作用を、減弱化IFNα2bに融合しているX10.21抗CD38抗体について、O-連結型グリコシル化を有する場合と有さない場合とを比較することによって検討した。
抗体融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、オフ標的活性が、O-連結型グリコシル化タンパク質、すなわち、A10.21IgG4IFN(145D、T106T)及びA10.21IgG1IFN(145D、T106T)と比べて若干増加した(図5)。アイソタイプにかかわらず、この傾向には一貫性があった(図5)。しかし、このアッセイにおいては、IFNα2b(A145D)の減弱の度合いが非常に高いので、SEAPの誘発のレベルは、使用した最も高い用量でさえも限定的である。したがって、EC50は、近似値に過ぎない。
異なるアミノ酸の置換を保有する、減弱化IFNと融合している抗体(R10A2IgG4(S228P)IFN(A145D))のオフ標的活性を、O-連結型グリコシル化の除去について調べた。全ての可能なアミノ酸の置換をテストし、コンストラクトを、Table 11(表11)に列挙する。
Figure 0006730271
これらの置換のそれぞれが、O-グリコシル化IFN融合抗体R10A2IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)と比べて、類似の又は若干より低いオフ標的活性(EC50の増加)を示すことが示された。しかし、このアッセイにおいては、IFNα2b(A145D)の減弱の度合いが非常に高いので、SEAPの誘発のレベルは、使用した最も高い用量でさえも限定的である。したがって、EC50は、近似値に過ぎない。
別の抗CD38抗体減弱化IFNα2bコンストラクトのオフ標的活性、及びT106A置換によるO-連結型グリコシル化の除去の影響を検討した。A10.43は、A10.21と比較して、7つの、重鎖中のアミノ酸の変化を有するが、2つのコンストラクトは、同じ軽鎖配列を共有する(配列表を参照されたい)。結果から、O-連結型グリコシル化部位を、T106A置換により除去することによって、A10.43のオフ標的活性が若干増加することが示された。しかし、このアッセイにおいては、IFNα2b(A145D)の減弱の度合いが非常に高いので、SEAPの誘発のレベルは、使用した最も高い用量でさえも限定的である。したがって、EC50は、近似値に過ぎない。
抗体インターフェロン融合コンストラクトの減弱化IFN部分中のO-連結型グリコシル化部位を除去すると、O-連結型グリコシル化タンパク質と比べて、オフ標的活性は、若干増加したり、増加しなかったりし、オン標的活性は、若干増加した。O-連結型グリコシル化抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合タンパク質及び非グリコシル化抗CD38抗体減弱化インターフェロン融合タンパク質の両方が、CD38+細胞に対して高い選択性を示し、一方、Intron Aは、選択性を示さなかった。
(実施例5)
ヒト新生児型Fc受容体(FcRn)の、抗CD38-減弱化IFNに対する結合性の評価
アミンカップリングのプロトコールを使用して増強したBiacore T200装置中で、CM5センサーチップの指定した活性なフローセル上に、ポリ-hisタグ付きFcRnを固定化し、一方、ブランクの固定化を、参照フローセル上で実施した。ポリ-hisタグ付きFcRnのパルスを、活性な表面上に注入して、確実に、溶液をフローセル上にあらかじめ濃縮させた。次いで、表面を、50mMのNaOHを用いて洗浄した。参照の表面及び活性な表面の両方を、50:50のEDC/NHSのミックスを用いて7分間活性化させた。これに続いて、活性な表面上のみに、ポリ-hisタグ付きFcRnの一連のパルスを、10mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中の2μg/mLで注入した。目標の150RUに到達したら、両方の表面を、1Mのエタノールアミン、pH8.5を用いて、7分間不活性化した。このプロトコールにより、活性な表面上に、およそ150RUのポリ-hisタグ付きFcRnの固定化を得た。活性な各表面を、1回の試行のために使用した。
Zeba Spin Desaltingカラム、7KのMWCO、0.5mL(Pierce社、製品番号89882)を使用して、PBS-P試行用緩衝液(DPBS、pH7.4及び0.005%のTween-20、25℃でHClを用いてpH6.0に調整した)で、テスト抗体を脱塩した。脱塩の後に、各試料の濃度を、1mg/mLに調整した。
アッセイの当日に、これらの1mg/mLの溶液を試行用緩衝液中で更に希釈して、最も高い濃度を調製し、次いで、1:2に希釈して、濃度系列を作製した。テスト試料を、表面上に、50μL/分の流速を使用して通した。テストした全ての濃度について、結合(association)の期間は100秒であり、一方、解離の期間は300秒であった。活性な表面及び参照の表面を、100mMのTris、50mMのNaCl、pH8.0の60秒間の注入を使用して再生して、テスト抗体を除去した。結合定数を、25℃において決定した。
抗体とポリ-his-FcRnとの結合の相互作用を、二段階反応モデルを使用して評価し、この場合、Rmaxを、ローカルに設定し、RI(屈折率)パラメーターを、ローカルに設定した。全てのデータに対して、参照の減算を二重に行った:第1に、抗体のデキストランマトリックスに対する結合から生じた、参照セル(ブランクの固定化)中のシグナルを減算し、第2に、活性な表面上の、0nMの抗体のシグナルを減算した。
各抗体について、結合定数を、少なくとも2つの別個の試行に対して決定した。それぞれの試行において、陽性対照として、Prolia、ロット1035726を、抗CD38/IFNの試料と平行してテストした。ka1、kd1、ka2、kd2及びKDについての平均値を決定した。
4つの抗CD38/IFN(A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)、A10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T)、A10.43IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)、A10.43IgG4(S228P)IFN(A145D、T106T))について、FcRnの結合性に関する速度論的な及び親和性の値の平均を測定した。この試料セットにおいては、クローンA10.21IgG4(S228P)IFN(A145D、T106A)が、FcRnに対して、最も高い親和性を示した。
(実施例6)
マウスNCI-H929多発性骨髄腫モデルにおける、減弱化インターフェロンアルファ2bに融合している抗CD38抗体の効能:O-連結型グリコシル化を有する場合及び有さない場合
薬物及び治療:
Figure 0006730271
手順:
・CR雌CB.17SCIDマウスを、50%のマトリゲル中の1×107個のH929腫瘍細胞を用いて、側腹部中scにて準備する。
・細胞の注射体積は、0.2mL/マウスである。
・開始日において:8〜12週齢。
・腫瘍が170〜350mm3の平均サイズに到達したら、ペアマッチを実施し、治療を開始する。
・投与体積=0.2mL/マウス。体重についての調整は行わない。
・体重:qd、5回、次いで、終了まで、biwk
・ノギス測定:終了まで、biwk
・エンドポイントTGD。動物は、個々にモニターするものとする。実験のエンドポイントは、2000mm3の腫瘍体積又は60日後の、いずれか早い方である。レスポンダーは、より長期に追跡する場合がある。エンドポイントに到達したら、動物を、SOP番号687に従って、安楽死させるものとする。
結果を、図8に示す。腫瘍の成長の妨害において、O-連結型グリコシル化を有する場合も有さない場合も、おおよそ同等の効能が認められ、脱グリコシル化形態は、若干より強力であった。
(実施例7)
ヒト新生児型Fc受容体(FcRn)の、減弱化IFNに融合している抗CD38抗体に対する結合性を、O-連結型グリコシル化を有する場合と有さない場合とについて評価したところ、O-連結型グリコシル化を有さないタンパク質が、FcRnに対して、最も高い親和性を示した。この作用を、カニクイザル及びヒト化FcRnマウスにおいて評価することができる。
カニクイザルにおける研究
サルにおける研究設計-+O-glycと-O-glycとを比較する
・留置カテーテルを介する単回3mg/kg静脈内注入(1時間)
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106A)(n=4)
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106T)(n=4)
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106A)(n=4)
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106T)(n=4)
・PK及びPD(生物学的作用、すなわち、血清ネプテリンレベル)を比較する
・PK:全てのサル、≦1ml、11個のタイムポイント(投与前、0分(注入終了の直後)、注入してから、2、6、12、24、48、96、120、168及び240時間後。試料(80個)を、ELISAにより分析する。
・TKモデル化:WinNonlin Table Assembly(非コンパートメント解析)
・臨床病理学的検査:血液学的及び血液化学的検査-全てのサル、3度(治療前、投与してから24時間後及び8日目)
・血清ネプテリン:全てのサル、5つのタイムポイント(投与前、投与してから12、24、96、168時間後)において、約0.5ml、3回
ヒト化FcRnマウスにおける薬物動態学的研究
1.1日目に、32匹(32)のB6.Cg-Fcgrtm1DcrTg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ(JAX、ストック番号004919)雌マウスに、
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106A)(n=8)
- A10.21IgG4(S228P)IFN(145D、T106T)(n=8)
- A10.43IgG4(S228P)IFN(145D、T106A)(n=8)
- A10.43IgG4(S228P)IFN(145D、T106T)(n=8)
を、1mg/kgのIP注射により投与する。
2.体重を、投与の3日前、投与の日に、次いで、週1回測定する。
3.ケージ内の動物の様子を、1日1回観察し、臨床的な観察を、週1回行う。
4.薬物動態学的検査のための血液の収集:投与の3日前に、投与してからは、1、12、24、48及び72時間後並びに5、7、10及び14日後において、マウスから(25μlを)採血する。2つのコホートのマウスから採血する(4匹のマウス/群/コホート)。
5.全てのマウスを、14日目に屠殺する。終末の心臓穿刺を実施して、血液を収集する。
6.血液を、リチウムヘパリンチューブ中に収集し、10,000rpm、4℃で2分間遠心分離する。
7.血漿試料を、PBS中に1:10に希釈し、A10.21IgG4IFN(145D)A106、A10.21IgG4IFN(145D)T106、A10.43IgG4IFN(145D)A106、又はA10.43IgG4IFN(145D)T106について、結合ELISAにより解析するまで凍結しておく。

Claims (15)

  1. 第1及び第2のドメインを含む融合ポリペプチドであって、第1のドメインが、細胞表面関連抗原に結合する抗体又はその抗原結合部分を含み、第2のドメインが、脱グリコシル化(aglycosylated)インターフェロンα2b(IFNα2b)を含み、
    (a) 脱グリコシル化IFNα2bのアミノ酸配列が、配列番号25である、
    (b) 融合ポリペプチドが、アミノ酸配列である配列番号87、もしくは、配列番号81を含む、
    (c) 配列番号1に関して、脱グリコシル化IFNα2bが、減弱化変異A145Dを含む、又は、
    (d) 配列番号1に関して、106位における残基が欠失しており、脱グリコシル化IFNα2bが、減弱化変異A144Dを含む、
    融合ポリペプチド。
  2. 細胞表面関連抗原が、CD38、CD138、RANK-リガンド、HM1.24、CD56、CS1、CD20、CD74、IL-6R、Blys(BAFF)、BCMA、HLA-SR、HLA-DR、キニノーゲン、ベータ2ミクログロブリン、Ep-CAM、FGFR3、ICAM-1、マトリプターゼ、CD52、EGFR、GM2、アルファ4-インテグリン、IFG-1R、KIR、CD3、CD4、CD8、CD24、CD44、CD69、CD70、CD71、CD79、CD83、CD86、CD96、HLA、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD19、CD52、CD14、FSP1、FAP、PDGFRアルファ、PDGFRベータ、ASGR1、ASGR2、FSP1、RTI140/Ti-アルファ、HTI56、VEGF受容体、RCHE遺伝子の生成物CD241、CD117(c-kit)、CD71(トランスフェリン受容体)、CD36(トロンボスポンジン受容体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239及びCD240からなる群から選択される、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
  3. ポリペプチドリガンドが、CD38に結合する抗体である、請求項1又は2に記載の融合ポリペプチド。
  4. 抗体のVHアミノ酸配列が、配列番号48〜56及び58からなる群から選択される、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
  5. 抗体のVLアミノ酸配列が、配列番号81、82及び84からなる群から選択される、請求項3又は4に記載の融合ポリペプチド。
  6. 第1のドメインが、第2のドメインに、ペプチド結合を介して連結している、請求項1から5のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  7. 第1のドメインが、第2のドメインに、ペプチド結合を介して直接連結している、請求項1から5のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  8. 第1のドメインのC末端が、第2のドメインのN末端に連結している、請求項1から5のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  9. 請求項1から8のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む組成物。
  10. 請求項1から8のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む、腫瘍の治療剤であって、融合ポリペプチドの第1のドメインが、腫瘍細胞に結合する、治療剤。
  11. 多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫である癌を治療するために使用する、請求項10に記載の治療剤。
  12. 請求項1から8のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
  13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの1つ又は複数を含むベクター。
  14. 請求項13に記載のベクターを含む形質転換細胞。
  15. 哺乳動物細胞中でポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドを生成する方法であって、ポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドが、不均一性の低下及び/又はFcRn結合性の増強及び/又は標的選択性の増強を示し; 前記方法が、ポリペプチドリガンド-減弱化IFNα2bの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを1つ又は複数含む組換え哺乳動物細胞を培養する工程を含み、IFNα2b配列のT106が、別のアミノ酸で置換されている又は欠失しており、発現すると、融合タンパク質のIFNα2b成分が脱グリコシル化(aglycosylated)し、
    (a) 脱グリコシル化IFNα2bのアミノ酸配列が、配列番号25である、
    (b) 融合ポリペプチドが、アミノ酸配列である配列番号87、もしくは、配列番号81を含む、
    (c) 配列番号1に関して、脱グリコシル化IFNα2bが、減弱化変異A145Dを含む、又は、
    (d) 配列番号1に関して、106位における残基が欠失しており、脱グリコシル化IFNα2bが、減弱化変異A144Dを含む、
    方法。
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