ES2265693T3

ES2265693T3 - Proteinas de fusion con interferon-beta y usos.

Info

Publication number: ES2265693T3
Application number: ES99956574T
Authority: ES
Inventors: Adrian Whitty; Laura Runkel; Margot Brickelmaier; Paula Hochman
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2007-02-16
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: WO2000023472A3; EA200100447A1; PL200586B1; CY1105173T1; US20020155547A1; CA2343094A1; KR20010085932A; PL347932A1; EA005005B1; CZ300762B6; CN100480266C; BR9915548A; PT1121382E; NO20011861L; CN1333785A; US20090286958A1; DE69931507D1; US6800735B2; TR200101087T2; US7527946B2

Abstract

Un polipéptido que comprende: (a) un mutante de interferón-beta-1a (IFN-beta) seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2; y (b) un dominio bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina.

Description

Proteínas de fusión con interferón-beta y usos.

Antecedentes de la invención

La utilización de polipéptidos y proteínas para el tratamiento sistémico de enfermedades específicas está actualmente establecida en la práctica médica. El papel que juegan estas sustancias en terapia es tan importante que muchos trabajos de investigación se han dirigido hacia la síntesis de grandes cantidades mediante la tecnología de ADN recombinante. Muchos de estos polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y específicas en cuanto a sus acciones biológicas.

Un factor principal que limita la utilidad de estas sustancias proteináceas para su aplicación pretendida es que cuando se administran por vía parenteral son eliminadas del cuerpo en poco tiempo. Esto puede ocurrir como resultado del metabolismo por protesasas o por aclaramiento mediante las rutas normales para la eliminación de proteínas tal como por filtración en los riñones. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas son muy conocidos en la industria farmacéutica, y se utilizan diferentes estrategias con el fin de solucionarlos.

Una familia de péptidos, que ha sido objeto de gran cantidad de trabajo clínico y de intentos para mejorar su administración y bioasimilación, es la de los interferones. Los interferones se han ensayado en diferentes estados patológicos clínicos. La utilización del interferón beta humano, un miembro de esta familia, está establecida en el tratamiento de la esclerosis múltiple. En Europa y EEUU se han autorizado dos formas de interferón beta recombinante para el tratamiento de esta enfermedad. Una forma es el interferón-beta-1a (registrado, comercializado como AVONEX®, mfg.Biogen, Inc., Cambridge, MA) y de aquí en adelante en la presente memoria se utilizan indistintamente "interferón-beta-1a" o "IFN-beta-1a" o "IFN-\beta-1a" o "interferón-\beta-1a". La otra forma es interferón-beta-1b (registrado y comercializado como BETASERON®, Berlex, Richmond, CA), de aquí en adelante en la presente memoria, "interferón-beta-1b". El interferón-beta-1a se produce en células de mamífero utilizando la secuencia génica humana natural y está glicosilado, mientras que el interferón-beta-1b se produce en bacterias E. coli utilizando una secuencia génica humana modificada que contiene una sustitución cisteína-serina obtenida mediante ingeniería genética en el aminoácido de la posición 17 y no está glicosilado.

Previamente, muchos de nosotros hemos comparado directamente las potencias relativas in vitro del interferón-beta-1a y del interferón-beta-1b en ensayos funcionales y mostrado que la actividad específica del interferón-beta-1a es aproximadamente 10 veces mayor que la actividad específica del interferón-beta-1b (Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). A partir de estudios diseñados para identificar la base estructural de estas diferencias en la actividad, identificamos la glicosilación como la única de las diferencias estructurales conocidas entre los productos que influían en la actividad específica. El efecto del carbohidrato se puso de manifiesto a través de su papel estabilizador de la estructura. El efecto estabilizador del carbohidrato fue evidente en experimentos de desnaturalización térmica y análisis SEC. La ausencia de glicosilación también se correlacionó con un incremento en la agregación y con una sensibilidad incrementada frente a la desnaturalización térmica. La eliminación enzimática del carbohidrato del interferón-beta-1a con PNGasa F produjo la precipitación del producto desglicosilado.

Estos estudios indican que, a pesar de la conservación de la secuencia entre el interferón-beta-1a y el interferón-beta-1b, son entidades bioquímicas distintas y, por lo tanto, la mayoría de lo que se conoce acerca del interferón-beta 1b no puede aplicarse al interferón-beta-1a y viceversa.

El documento WO97/24137 describe un híbrido con interferón-\alpha y un Fc de una inmunoglobulina unidos a través de un péptido no inmunogénico. El documento WO 83/02461 describe interferones híbridos. Santillan et al., 1992, Mol. Cell. Biochem. 110, 181-191 describe una proteína híbrida compuesta por IFN-beta humano fusionado con PDGF. El documento EP-A 2 0 225 579 describe compuestos que comprenden dos moduladores polipeptídicos celulares unidos covalentemente incluyendo IFN alfa o beta.

Compendio de la invención

Hemos aprovechado las ventajas del interferón-beta glicosilado respecto a las formas no glicosiladas. En particular, hemos desarrollado una composición de interferón-beta-1a con una actividad incrementada respecto al interferón-beta-1b y que también tiene las propiedades ventajosas de las proteínas de fusión en general sin pérdida efectiva de actividad comparada con las formas de interferón-beta-1a que no son proteínas de fusión. Por lo tanto, si se realizan modificaciones de manera que los productos (proteínas de fusión con interferón-beta-1a) retienen todas o la mayoría de sus actividades biológicas, pueden resultar las propiedades siguientes: farmacocinética y farmacodinámica alteradas que dan lugar a una vida media incrementada y alteraciones en la distribución tisular (por ejemplo, capacidad para permanecer en el sistema vascular durante más tiempo). Dicha formulación es un avance sustancial en las técnicas farmacéutica y médica y será una contribución significativa para el control de diferentes enfermedades en las que el interferón tiene alguna utilidad, tales como esclerosis múltiple, fibrosis, y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, cánceres, hepatitis y otras enfermedades virales y enfermedades caracterizadas por neovascularización. En particular, la capacidad de permanecer durante más tiempo en el sistema vascular permite que el interferón-beta-1a pueda utilizarse para inhibir la angiogénesis y potencialmente para atravesar la barrera hematoencefálica.

En particular, la invención se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos X-Y-Z, en la que X es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón beta seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-\beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2, Y es un conector y resto opcional; y Z es un polipéptido que comprende al menos una parte de un polipéptido distinto del interferón beta, en el que dicha parte es una parte de una región constante de una inmunoglobulina y puede obtenerse a partir de una inmunoglobulina de la clase seleccionada de IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Si la clase es IgG, se selecciona de una de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La región constante de IgM e IgE humanas contiene 4 regiones constantes (CH1 (bisagra), CH2, CH3 y CH4) mientras que la región constante de IgG, IgA e IgD humanas contiene 3 regiones constantes (CH1 (bisagra), CH2 y CH3). En las proteínas de fusión más preferidas de la invención, la región constante contiene al menos los dominios bisagra, CH2 y CH3.

El resto opcional Y y el resto requerido Z pueden unirse bien al extremo N terminal o C terminal del interferón beta (X). Preferiblemente, X es interferón-beta-1a humano. La invención también describe que el resto Z es al menos una parte de un polipéptido que contiene dominios semejantes a inmunoglobulinas. Los ejemplos de dichos polipéptidos distintos incluyen CD1, CD2, CD4 y miembros de la clase I y clase II de los antígenos mayores de histocompatibilidad.

Otra realización de la invención es una proteína de fusión que tiene una región amino terminal que consiste en la secuencia de aminoácidos de un mutante del interferón beta seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-\beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2 y que tiene una región carboxilo terminal que comprende al menos una parte de una proteína distinta del interferón beta, en la que dicha parte es al menos una parte de una región constante de una inmunoglobulina obtenida a partir de una inmunoglobulina de la clase seleccionada de IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. En las proteínas de fusión más preferidas, la región constante contiene al menos los dominios bisagra, CH2 y CH3.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere a una proteína de fusión cuyo resto de interferón beta (por ejemplo, X en la fórmula anterior) se ha mutado para proporcionar muteínas con una actividad antiviral y/o antiproliferativa incrementada selectivamente o con otras propiedades ventajosas respecto a las formas no mutadas del interferón-beta-1a.

Otra realización más de la invención es un ADN que codifica las proteínas de fusión descritas anteriormente. La invención también se refiere a un ADN recombinante que comprende un ADN que codifica las proteínas de fusión descritas anteriormente y una secuencia de control de la expresión, en la que la secuencia de control de la expresión está unida de manera operativa al ADN. El alcance de la invención también incluye células anfitrionas transformadas con las secuencias de ADN recombinante de la invención.

La invención también se refiere a un método para producir un polipéptido recombinante de la invención que comprende: proporcionar una población de células anfitrionas según la invención; crecer la población de células en condiciones en las que se exprese el polipéptido codificado por el ADN recombinante; y aislar el polipéptido expresado.

Otro aspecto más de la invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico de una proteína de fusión como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Otro aspecto más de la invención es la utilización de las proteínas de fusión descritas en la presente memoria para la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis y la neovascularización.

Descripción breve de las figuras

Figura 1. ADNc y secuencia de aminoácidos deducida de una fusión de interferón-beta con etiqueta de histidina (también denominada "his IFN-beta" o "etiqueta-His_{6}"). Se muestran las secuencias completas de ADN y proteína de este his IFN-beta-1a. La secuencia señal VCAM-1 eliminada deja 3 restos amino terminales (SerGlyGly) por encima de la etiqueta de histidina (His_{6}, posiciones 4-9). La secuencia enteroquinasa conectora (AspAspAspAspLys) está separada de la etiqueta de histidina mediante un espaciador (posiciones 10-12. SerSerGly). La secuencia de la proteína natural IFN-beta-1a abarca las posiciones (Met18-Asn183).

Figura 2. ADNc y secuencia de aminoácidos deducida de una fusión interferón-beta-1a/Fc. Se muestran las secuencias completas de ADN y proteína de IFN-beta-1a humano/Fc de ratón. Las secuencias de la proteína humana IFN-beta-1a abarcan los restos de aminoácidos 1-166 (secuencias de ADN 1-498). La secuencia enteroquinasa conectora abarca los restos de aminoácidos 167-171 (secuencias de ADN 499-513). La secuencia de la proteína de la cadena pesada de IgG2a murina abarca los restos 172-399 (secuencias de ADN 514-437).

Figura 3. Unión de mutantes de interferón-beta por sustitución de alanina a una proteína de fusión dimérica que comprende el dominio extracelular de la cadena del receptor de interferón de tipo I, IFNAR2/Fc. Se determinaron las afinidades de la unión de los mutantes de IFN por sustitución de alanina (A1-E) para la cadena del receptor IFNAR2 como se describe en el Ejemplo 1 (subsección D). El histograma presenta sus afinidades de unión en este ensayo respecto a his-IFN-beta de tipo salvaje (% tipo salvaje). Los valores de % tipo salvaje se calcularon como la (afinidad de his-IFN-beta tipo salvaje)/(afinidad de IFN-beta mutado) x 100. Se muestran el % tipo salvaje (x) para varios ensayos (n = 3) y un % tipo salvaje medio (x) para el conjunto experimental. Los mutantes A2, AB1, AB2 y E no se unieron a IFNAR2/Fc a concentraciones 500 veces mayores que las del his-IFN-beta tipo salvaje CE 50(*).

Figura 4. Unión de mutantes de interferón-beta por sustitución de alanina a complejos del receptor de la superficie celular del interferón de tipo I ("complejo IFNAR1/2") expresados en células de linfoma de Daudi Burkitt. Las propiedades de unión al receptor de los mutantes por sustitución de alanina (A1-E) se determinaron utilizando un ensayo de unión al receptor de la superficie celular basado en FACS como se describe en el Ejemplo 1 (subsección D). El histograma presenta sus afinidades de unión al receptor en este ensayo respecto al his-IFN-beta de tipo salvaje (% tipo salvaje). El % tipo salvaje para cada mutante se calculó como (afinidad de his-IFN-beta de tipo salvaje)/(afinidad de IFN-beta mutante) x 100. Se muestran los valores % tipo salvaje (O) para varios ensayos bajo el histograma y una media del % tipo salvaje para el conjunto experimental (x).

Figura 5. Actividades antivirales de los mutantes de interferón-beta por sustitución de alanina. Se determinaron las actividades antivirales de los mutantes por sustitución de alanina (A1-E) en células humanas A549 ensayadas con virus EMC como se describe en el Ejemplo 1 (subsección E). El histograma presenta sus actividades en este ensayo respecto al his-IFN-beta de tipo salvaje (% tipo salvaje). El % tipo salvaje se calculó como el inverso de la concentración de IFN-beta mutante (50 cpe)/concentración de his-IFN-beta tipo salvaje (50% cpe) x 100. Se muestran el % tipo salvaje (O) para varios ensayos y la media de los datos del conjunto experimental (x).

Figura 6. Actividades antiproliferativas de los mutantes de interferón-beta por sustitución de alanina. Se determinó la actividad antiproliferativa de los mutantes por sustitución de alanina (A1-E) en células de linfoma de Daudi Burkitt como se describe en el Ejemplo 1 (subsección E). El histograma presenta sus actividades en este ensayo respecto a his-IFN-beta de tipo salvaje (% tipo salvaje). El % tipo salvaje se calculó como (concentración de his-IFN-beta de tipo salvaje (50% de inhibición del crecimiento)/concentración de IFN-beta mutante (50% de inhibición del crecimiento) x 100. Se muestran el % de tipo salvaje (O) para varios ensayos y la media de los datos del conjunto experimental (x).

Figura 7. Actividades antivirales y antiproliferativas relativas de los mutantes de interferón-beta por sustitución de alanina. Se compararon las actividades relativas de los mutantes por sustitución de alanina (A1-E) en los ensayos antivirales (eje de las x) y antiproliferativos (eje de las y). Los porcentajes medios de his-IFN-beta de tipo salvaje (% tipo salvaje (x)) presentados en las Figuras 5 y 6 se utilizaron para esta comparación. Los mutantes con una pérdida/ganancia coordinada de actividad estarán en o muy cerca de la línea vertical. Los mutantes con una pérdida/ganancia desproporcionada de actividades antivirales o antiproliferativas estarán fuera de la línea diagonal (DE1, D, C1). La significancia se determinó a partir de la consideración de las desviaciones estándar inherentes en la media de los valores de % de tipo salvaje utilizados.

Figura 8. Actividad antiviral de la fusión interferón-beta-1a/Ig. La actividad del interferón-beta-1a (utilizado como AVONEX®) o de la fusión interferón-beta-1a/Ig2a murina a las concentraciones indicadas en el eje de las X se evaluaron en ensayos antivirales utilizando células de carcinoma de pulmón humano (A549) ensayadas con virus EMC. Después de dos días de incubación con el virus, se tiñeron las células viables con MTT, las placas se leyeron a 450 nm, y la absorbancia que refleja la viabilidad celular se muestra en el eje de las Y. Las desviaciones estándar se muestran como barras de error. La concentración de interferón-beta-1a (utilizado como AVONEX®) que presentaba (50% de la DO450 máxima) y, por lo tanto, 50% de muerte por el virus (el "efecto citopático 50%") fue aproximadamente 0,4 pM y el efecto citopático 50% para la fusión del interferón-beta-1a fue aproximadamente 0,15 pM.

Figura 9. Determinaciones de la actividad antiviral del interferón-beta en el plasma de ratones tratados con la fusión interferón-beta-1a/Fc o interferón-beta-1a. Se inyectaron a ratones por vía iv 50.000 Unidades de interferón-beta-1a (utilizado como AVONEX®) ó 50.000 Unidades de la fusión interferón-beta-1a/Fc. La sangre de estos ratones se obtuvo mediante sangrados retro-orbitales a diferentes tiempos después de la inyección del interferón como se indica en el eje de las X. Hay al menos 3 ratones sangrados a cada tiempo, y el plasma se prepara y congela hasta que se evalúa la actividad del interferón-beta en ensayos antivirales utilizando células de carcinoma de pulmón humano (A549) ensayadas con el virus de la encefalomiocarditis. Las células viables se tiñeron con una disolución de MTT, las placas se leyeron a 450 nm para determinar la absorbancia que refleja la viabilidad celular y la actividad del interferón-beta. Las curvas estándar se obtuvieron para cada placa utilizando interferón-beta-1a como AVONEX® y se utilizaron para determinar la cantidad de la actividad de interferón-beta en cada muestra. Se muestran los datos de los animales individuales.

Figura 10. Secuencias completas de ADN y proteína de los marcos de lectura abiertos de una fusión directa de IFN beta humano e IgG1Fc humana (ZL5107).

Figura 11. Secuencias completas de ADN y proteína de los marcos de lectura abiertos de una proteína de fusión que consiste en IFN beta humano/conector G4S/IgG1Fc humana (ZL6206).

Descripción detallada

En la presente memoria se utilizan los términos siguientes:

I. Definiciones

Interferón-Un "interferón" (también denominado "IFN") es un polipéptido pequeño, específico de especies, de cadena única, producido por células de mamífero en respuesta a la exposición a diferentes inductores tales como virus, polipéptidos, mitógenos y semejantes. El interferón más preferido utilizado en la invención está glicosilado, es humano, es interferón-beta que está glicosilado en el resto 80 (Asn 80) y que se obtiene preferiblemente mediante tecnologías de ADN recombinante. Este interferón beta glicosilado preferido se denomina "interferón-beta-1a" (o "IFN-beta-1a" o "IFN-\beta-1a" o "interferón beta 1a" o "interferón-beta-1a" o "interferón-\beta-1a", utilizados indistintamente). El término "interferón-beta-1a" también se pretende que englobe todas las formas mutantes (es decir, Ejemplo 1) siempre que los mutantes también estén glicosilados en el resto Asn 80.

Los métodos de ADN recombinante para producir proteínas, incluyendo interferones, son conocidos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EEUU 4.399.216, 5.149.636, 5.179.017 (Axel et al) y 4.470.461 (Kaufman).

Los polinucleótidos de interferón-beta-1a preferidos que pueden utilizarse en los presentes métodos de la invención se obtienen de las secuencias génicas de interferón beta de tipo salvaje de diferentes vertebrados, preferiblemente mamíferos, y se obtienen utilizando métodos que son muy conocidos para los expertos en la técnica tales como los métodos descritos en las Patentes de EEUU siguientes: Patente de EEUU 5.641.656 (expedida 24 jun. 1997: ADN que codifica proproteína de interferón tipo I aviario e interferón tipo I maduro aviario), Patente de EEUU 5.605.688 (25 feb. 1997-interferones de tipo I recombinantes de perro y de caballo); Patente de EEUU 5.231.176 (27 jul. 1993, molécula de ADN que codifica un interferón de leucocitos humano); Patente de EEUU 5.071.761 (10 dic. 1991, secuencia de ADN que codifica subsecuencias de interferones linfoblastoides humanos LyIFN-alfa-2 y LyIFN-alfa-3); Patente de EEUU 4.970.161 (13 nov. 1990, secuencia de ADN que codifica interferón gamma humano); Patente de EEUU 4.738.931 (19 abr. 1988, ADN que contiene un gen del interferón beta humano); Patente de EEUU 4.695.543 (22 sep. 1987, gen Gx-1 del interferón-alfa humano) y Patente de EEUU 4.456.748 (26 jun. 1984, ADN que codifica subsecuencias de interferones de leucocitos diferentes, naturales).

Los mutantes de interferón-beta-1a pueden utilizarse según esta invención. Las mutaciones se producen utilizando métodos convencionales de mutagénesis dirigida, conocidos para los expertos en la técnica. Más aún, la invención proporciona polinucleótidos de interferón-beta-1a equivalentes desde un punto de vista funcional que codifican polipéptidos de interferón-beta-1a equivalentes desde un punto de vista funcional.

Un primer polinucleótido que codifica interferón-beta-1a es "equivalente desde un punto de vista funcional" comparado con un segundo polinucleótido que codifica interferón-beta-1a si cumple al menos una de las condiciones siguientes:

(a) el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que híbrida con el segundo polinucleótido en condiciones de hibridación estándar y/o está degenerado respecto a la secuencia del primer polinucleótido. Más preferiblemente, codifica un interferón mutante que tiene la actividad [terapéutica] de un interferón-beta-1a;

(b) el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que codifica cuando se expresa una secuencia de aminoácidos codificada por el segundo polinucleótido.

En resumen, el término "interferón" incluye, pero no está limitado a, los agentes listados anteriormente así como sus equivalentes funcionales. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "equivalente funcional" se refiere, por lo tanto, a una proteína interferón-beta-1a o a un polinucleótido que codifica la proteína interferón-beta-1a que tiene el mismo efecto beneficioso o incrementado en el anfitrión mamífero que el del interferón del que se considera un equivalente funcional. Como apreciará el experto en la técnica, una proteína equivalente desde un punto de vista funcional puede producirse mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando un "ADN equivalente desde un punto de vista funcional". Según esto, la presente invención engloba proteínas interferón-beta-1a codificadas por ADN naturales, así como por ADN no naturales que codifican la misma proteína que codifican los ADN naturales. Debido a la degeneración de las secuencias de nucleótidos codificadoras, pueden utilizarse otros polinucleótidos para codificar el interferón-beta-1a. Éstos incluyen todas o partes de las secuencias anteriores que se alteran por sustitución de diferentes codones que codifican el mismo resto de aminoácido en la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. Dichas secuencias alteradas se consideran como equivalentes de esas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) está codificada por dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) está codificada por TAC o TAT e His (H) está codificada por CAC o CAT. Por otra parte, Trp (W) está codificado por un único codón, TGG. Según esto, se apreciará que para una secuencia de ADN determinada que codifica un interferón particular habrá varias secuencias de ADN degeneradas que lo codificarán. Estas secuencias de ADN degeneradas se consideran dentro del alcance de esta invención.

"fusión"- se refiere a una unión co-lineal, covalente de dos o más proteínas o fragmentos de éstas a través de sus péptidos centrales individuales, más preferiblemente mediante la expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica estas proteínas. Se prefiere que las proteínas o fragmentos de éstas sean de diferentes fuentes. Por lo tanto, las proteínas de fusión preferidas incluyen una proteína o fragmento de interferón-beta-1a unido covalentemente a un segundo resto que no es un interferón. Específicamente, una "fusión interferón-beta/Ig" es una proteína que comprende una molécula de interferón beta de la invención (es decir, interferón-beta-1a), o un fragmento de ésta cuyo extremo N terminal o C terminal está unido a un extremo N terminal de una cadena de inmunoglobulina en la que una parte del extremo N terminal de la inmunoglobulina se reemplaza por interferón beta. Una especie de fusión interferón-beta/Ig es una "fusión interferón-beta/Fc" que es una proteína que comprende una molécula de interferón beta de la invención (es decir, interferón-beta-1a) unida a al menos una parte del dominio constante de una inmunoglobulina. Una fusión Fc preferida comprende una molécula de interferón beta de la invención unida a un fragmento de un anticuerpo que contiene el dominio C terminal de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina.

El término "proteína de fusión" también significa una proteína interferón beta unida químicamente a través de una molécula mono o heterofuncional a un segundo resto que no es una proteína interferón beta y que se obtiene de novo a partir de una proteína purificada como se describe a continuación.

"Recombinante", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que una proteína se obtiene a partir de sistemas de expresión de mamíferos recombinantes. Las proteínas expresadas en la mayoría de los cultivos bacterianos, por ejemplo E. coli, no presentarán glicanos por lo que estos sistemas de expresión no son preferidos. Las proteínas expresadas en levaduras pueden tener estructuras de oligosacáridos que son diferentes de las expresadas en las células de mamíferos.

"Biológicamente activo", tal y como se utiliza en la presente memoria como una característica del interferón-beta-1a, significa que una molécula particular comparte una homología suficiente de la secuencia de aminoácidos con las realizaciones de la presente invención descritas en la presente memoria como para ser capaz de tener una actividad antiviral determinada en un ensayo antiviral in vitro del tipo mostrado en el Ejemplo 1, como se describe a continuación.

Una "composición terapéutica", tal y como se utiliza en la presente memoria, se define como una que comprende las proteínas de la invención y otros ingredientes compatibles desde un punto de vista fisiológico. La composición terapéutica puede contener excipientes tales como agua, minerales y vehículos tal como proteína.

"aminoácido" - una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Existen veinte aminoácidos que se encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos los cuales son isómeros L. El término también incluye análogos de los aminoácidos e isómeros D de los aminoácidos proteicos y sus análogos.

Un aminoácido "derivatizado" es un aminoácido natural o no natural en el que la cadena lateral o grupo final normal (o resto de azúcar en el caso del interferón-beta-1a) está modificado por una reacción química. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, carboxilación gamma, carboxilación beta, pegilación, sulfatación, sulfonación, fosforilación, amidación, esterificación, N-acetilación, carbobencilación, tosilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Un "polipéptido derivatizado" es un polipéptido que contiene uno o más aminoácidos derivatizados y/o uno o más azúcares derivatizados, si el polipéptido está glicosilado.

"proteína" - cualquier polímero que consiste esencialmente en cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque "polipéptido" se utiliza habitualmente en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se utiliza habitualmente en referencia a polipéptidos pequeños, la utilización de estos términos en la técnica se sobrelapa y varía. El término "proteína" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a no ser que se indique otra cosa.

"equivalente funcional" de un resto de aminoácido es un aminoácido que tiene propiedades físico-químicas similares que el resto de aminoácido que ha sido reemplazado por el equivalente funcional.

"mutante" - cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótido de tipo salvaje o cualquier cambio en una proteína de tipo salvaje. El término "muteína" se utiliza indistintamente con "mutante".

"tipo salvaje" - la secuencia de polinucleótido natural de un exón de una proteína, o una parte de ésta, o secuencia de proteína, o una parte de ésta, respectivamente, tal y como existe normalmente in vivo.

"condiciones de hibridación estándar" - condiciones de sal y temperatura equivalentes sustancialmente a 0,5 x SSC a aproximadamente 5 x SSC y 65ºC tanto para la hibridación como para el lavado. El término "condiciones de hibridación estándar", tal y como se utiliza en la presente memoria, es por lo tanto una definición operativa y engloba un intervalo de condiciones de hibridación. Unas condiciones más altas de astringencia pueden incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de hibridación (0,2% polivinilpirrolidona, 0,2% Ficoll 400; 0,2% albúmina de suero bovino, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1% pirofosfato sódico; 1% SDS); 10% dextransulfato y 100 \mug/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado sonicado a 65ºC durante 12-20 horas, y lavar con 75 mM NaCl/7,5 mM citrato sódico (0,5 x SSC)/1% SDS a 65ºC. Unas condiciones más bajas de astringencia pueden incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de hibridación, 10% dextransulfato y 110 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado sonicado a 55ºC durante 12-20 horas y lavar con 300 mM NaCl/30 mM citrato sódico (2,0 x SSC)/1% SDS a 55ºC. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, Secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).

"secuencia de control de la expresión" - una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando está unida de manera operativa a esos genes.

"unido de manera operativa" - una secuencia de polinucleótidos (ADN, ARN) está unida de manera operativa a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y la traducción de esa secuencia de polinucleótidos. El término "unido de manera operativa" incluye presentar una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) enfrente de la secuencia de polinucleótidos que se quiere expresar y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótidos bajo el control de la secuencia
de control de la expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótidos.

"vector de expresión" - un polinucleótido, tal como un plámido de ADN o fago (entre otros ejemplos habituales), que permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de expresión se introduce en una célula anfitriona. El vector puede o no ser capaz de replicarse en una célula.

"aislado" (utilizado indistintamente con "sustancialmente puro") - cuando se aplica a un ácido nucleico, es decir secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos, significa un polinucleótido de ADN o ARN, parte de un polinucleótido genómico, polinucleótido ADNc o sintéticos que debido a su origen o manipulación: (i) no está asociado con todo el polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza (por ejemplo, está presente en una célula anfitriona como un vector de expresión, o una parte de éste); o (ii) está unido a un ácido nucleico u otro resto químico distinto del que está unido en la naturaleza; o (iii) no está presente en la naturaleza. Por "aislado" también se quiere decir una secuencia de polinucleótidos que: (i) se amplifica in vitro mediante, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) se sintetiza químicamente; (iii) se produce recombinante mediante clonación; o (iv) se purifica, mediante degradación y separación en gel.

Por lo tanto, "ácido nucleico sustancialmente puro" es un ácido nucleico que no es inmediatamente contiguo a una o a ambas de las secuencias codificadoras a las que es contiguo normalmente en el genoma natural del organismo del que se obtiene el ácido nucleico. ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias adicionales.

"aislado" (utilizado indistintamente con "sustancialmente puro") - cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una parte de éste que, debido a su origen o manipulación: (i) está presente en una célula anfitriona como el producto de expresión de una parte de un vector de expresión; o (ii) está unido a una proteína u otro resto químico distinto del que está unido en la naturaleza; o (iii) no está presente en la naturaleza. Por "aislado" también se quiere decir una proteína que: (i) se sintetiza químicamente; o (ii) se expresa en una célula anfitriona y purifica de proteínas asociadas. El término significa generalmente un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que está presente en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias tales como anticuerpos o matrices de geles (poliacrilamida) que se utilizan para purificarlo.

"promotor heterólogo" - tal y como se utiliza en la presente memoria es un promotor que no está asociado con un gen o un ácido nucleico purificado.

"Homólogo" - tal y como se utiliza en la presente memoria es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias que se comparan está ocupada por la misma base o aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina) entonces las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es función del número de posiciones coincidentes u homólogas que comparten las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. Como ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT tienen una homología del 50% (3 de las 6 posiciones coinciden). Generalmente, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para producir una homología máxima. Dicha alineación puede proporcionarse utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), implementado de manera conveniente por programas de ordenador tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). Las secuencias homólogas comparten restos de aminoácidos idénticos o similares, en los que restos similares son sustituciones conservativas de, o "mutaciones puntuales permitidas" de, los restos de aminoácidos correspondientes en una secuencia alineada de referencia. A este respecto, una "sustitución conservativa" de un resto en una secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son similares físicamente o funcionalmente a los restos de referencia correspondientes, por ejemplo, que tienen un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno similares, o semejantes. Las sustituciones conservativas especialmente preferidas son las que cumplen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Supl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D. C. (1978).

Los términos "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" también se utilizan indistintamente en la presente memoria.

Los términos "neovascularización" y "angiogénesis" significan, en su sentido más amplio, la formación de vasos sanguíneos nuevos. En particular, "angiogénesis" también se refiere a la formación de vasos sanguíneos nuevos en un tumor.

"IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2" se refieren a las proteínas que se sabe que componen el receptor de la superficie celular del interferón tipo I. La parte extracelular (ectodominio) de la cadena IFNAR2 sola puede unir interferón alfa o beta.

La práctica de la presente invención utilizará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología que están dentro de la técnica. Dichas técnicas están descritas en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente de EEUU No. 4.683.195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Traslation (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed.). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu et al., eds.), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds.), Academic Press, Londres, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

II. Producción y Expresión de Proteínas de Fusión

La presente invención se refiere a un sistema para la generación de proteínas de fusión de interferón-beta-1a mutante. En particular, la presente invención se refiere a estas proteínas así como a las moléculas de ADN recombinante utilizadas en su producción.

La producción de los polipéptidos de esta invención puede conseguirse mediante diferentes métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede producirse interferón-beta-1a de longitud completa o formas truncadas de interferón-beta-1a mediante técnicas de ADN recombinante utilizando ADNc (véase más adelante).

Puede diseñarse un gen que codifica el polipéptido interferón-beta-1a deseado de la invención tomando como base la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado. Después, pueden aplicarse métodos estándar para sintetizar el gen. Por ejemplo, puede utilizarse la secuencia de aminoácidos para construir un gen por traducción inversa. Puede producirse un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos capaz de codificar interferón-beta-1a en una única etapa. Alternativamente, pueden sintetizarse varios oligonucleótidos más pequeños que codifican partes del interferón-beta-1a mutante deseado y después unirse entre sí. Preferiblemente, la secuencia de ADN que codifica el resto de interferón-beta-1a se producirá como varios oligonucleótidos separados que posteriormente se unirán entre sí. (Véase el Ejemplo 2). Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente protuberancias 5' ó 3' para una unión complementaria.

Una vez unidos, los genes preferidos se caracterizarán mediante secuencias que son reconocidas por endonucleasas de restricción (incluyendo sitios de restricción únicos para una unión directa en un vector de clonación o expresión), codones preferidos teniendo en cuenta el sistema de expresión anfitrión que se va a utilizar (preferiblemente una célula de mamífero) y una secuencia que cuando se transcribe produce un ARN estable que se traduce de manera eficaz. La unión apropiada puede confirmarse mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un anfitrión adecuado.

Los ADNc de interferón beta de mamíferos pueden aislarse utilizando una secuencia de ADN de interferón beta humano adecuada como sonda para rastrear una biblioteca particular de ADNc de mamíferos mediante hibridación entre especies. El interferón beta de mamíferos utilizado en la presente invención incluye, como ejemplo, interferón beta primate, humano, murino, canino, felino, bovino, equino y porcino. El interferón beta de mamíferos puede obtenerse mediante hibridación entre especies, utilizando un ADNc de cadena única obtenido a partir de la secuencia de ADN del interferón beta humano como sonda de hibridación para aislar los ADNc de interferón beta a partir de bibliotecas de ADNc de mamíferos. Entre los métodos que pueden utilizarse para aislar y clonar secuencias del gen del interferón están los métodos que aparecen en las Patentes de EEUU resumidas anteriormente. Sin embargo, son de especial importancia los que aparecen en la Patente de EEUU 4.738.931 (19 abr., 1988) que describe ADN que contiene un gen de interferón beta humano.

La presente invención también se refiere a moléculas de ADN recombinante que comprenden las secuencias de ADN mencionadas anteriormente. Las moléculas de ADN recombinante de esta invención son capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos de la invención en anfitriones transformados con éstos. Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fusión de la invención debe estar unido de manera operativa a una secuencia de control de la expresión para dicha expresión. Para proporcionar una transcripción adecuada de las construcciones recombinantes de la invención, puede incorporarse preferiblemente en el vector recombinante una secuencia de promotor/amplificador adecuada, siempre que la secuencia de control de promotor/expresión sea capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de nucleótidos que codifica un interferón beta glicosilado. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión de la proteína de fusión que contiene inmunoglobulina incluyen, pero no están limitados a, región del promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor presente en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión de plantas que comprenden la región del promotor de la nopalina sintetasa (Hierrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) o el promotor del gen del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor de Gal4, promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de la fosfatasa alcalina, y las regiones de control de la transcripción de animales siguientes, que presentan una especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activo en células pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); promotores o amplificadores del gen de la insulina que son activos en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); amplificadores o promotores de genes de inmunoglobulinas que son activos en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); las regiones del promotor temprano y amplificador del citomegalovirus (Boshart et al., 1985, Cell 41:521-530); región de control del virus de tumor de mama en ratón que es activo en células de testículo, mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); región de control del gen de la albúmina que es activo en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activo en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de la alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); región de control del gen de la beta-globina que es activo en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activo en las células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es activo en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378). Los sistemas de expresión procariotas tales como el promotor de LAC o beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) no se prefieren ya que el interferón beta expresado no estará glicosilado. Sin embargo, los sistemas de expresión procariotas que permitan la glicosilación del interferón beta tanto en anfitriones procariotas como eucariotas están englobados en el alcance de la invención.

Los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen, pero no están limitados a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como vectores basados en el virus vaccinia, adenovirus o retrovirus; virus de insectos tal como baculovirus; vectores de levaduras; vectores de bacteriofagos (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN de plásmidos o cósmidos, por citar algunos. Específicamente, los vectores de expresión útiles para los anfitriones eucariotas preferidos incluyen vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, papilomavirus bovino, citomegalovirus. Además, en cada vector de expresión específico, pueden seleccionarse varios sitios para la inserción de estas secuencias de ADN. Estos sitios se diseñan habitualmente mediante la endonucleasa de restricción que los corta. Son muy conocidos para los expertos en la técnica. Debe apreciarse que un determinado vector de expresión útil en esta invención no necesita tener un sitio de endonucleasa de restricción para la inserción del fragmento de ADN elegido. En lugar de esto, el vector puede unirse al fragmento por medios alternativos.

El vector de expresión, y el sitio elegido para insertar un fragmento de ADN seleccionado y la unión operativa a una secuencia de control de la expresión, está determinado por diferentes factores tales como: el número de sitios susceptible a una enzima de restricción particular, el tamaño del polipéptido, la facilidad de degradación proteolítica del polipéptido, y semejantes. La elección de un vector y del sitio de inserción para un ADN determinado está determinada por el equilibrio de estos factores.

Las construcciones recombinantes de la invención pueden introducirse en células anfitrionas que son capaces de expresar la proteína de fusión utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo transformación (por ejemplo, utilizando DEAE-dextrano o técnicas de fosfato de calcio), transfección, microinyección, infección, bombardeo celular, y electroporación. Puede utilizarse cualquier tipo de célula anfitriona siempre que las secuencias de ácido nucleico recombinante de la proteína de fusión se transcriban adecuadamente en ARNm en ese tipo de célula y que la célula pueda glicosilar la proteína. Además, las construcciones de ácido nucleico recombinante de la invención pueden utilizarse para crear animales transgénicos no humanos capaces de producir la proteína de fusión basada en inmunoglobulina. En las realizaciones preferidas de la invención, la célula anfitriona es una célula de mamífero, tal como una célula COS o CHO.

La incorporación exitosa de estas construcciones de polinucleótidos en un vector de expresión determinado puede identificarse mediante tres métodos generales: (a) hibridación ADN-ADN, (b) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", y (c) expresión de las secuencias insertadas. En el primer método, la presencia del gen del interferón-beta-1a insertado en un vector de expresión puede detectarse mediante hibridación ADN-ADN utilizando sondas que comprenden secuencias homólogas al gen insertado de la proteína de fusión. En el segundo método, el sistema recombinante vector/anfitrión puede identificarse y seleccionarse tomando como base la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos tales como G418, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en el baculovirus, etc.) que se producen por la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si el polinucleótido se inserta de manera que interrumpa una secuencia génica marcadora en el vector, los recombinantes que contienen el inserto pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer método, los vectores de expresión recombinantes pueden identificarse ensayando el producto génico extraño expresado por el vector recombinante. Dichos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto génico en sistemas de bioensayos.

Se apreciará que no todas las combinaciones anfitrión/vector de expresión funcionarán con la misma eficacia en la expresión de secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de esta invención. Sin embargo, puede realizarse una selección particular de una combinación anfitrión-vector de expresión por el experto en la técnica después de tener en consideración los principios mostrados en la presente memoria sin alejarse del alcance de la invención.

La realización preferida de la invención contempla proteínas de fusión y secuencias de ADN que las codifican. Estas proteínas de fusión tienen una región amino terminal caracterizada por la secuencia de aminoácidos de un mutante de interferón-beta-1a seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-\beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2; y una región carboxilo terminal que comprende un dominio de una proteína distinta del interferón-beta-1a como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Una fórmula genérica preferida para dicha proteína es una proteína que tiene una secuencia primaria de aminoácidos X-Y-Z, en la que X es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del mutante de interferón beta humano seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-\beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2; Y es un resto conector opcional; y Z es un polipéptido que comprende al menos una parte de un polipéptido que contiene dominios semejantes a inmunoglobulina. Los ejemplos de dichos polipéptidos distintos incluyen CD1, CD2, CD4 y miembros de la clase I y la clase II de los antígenos principales de histocompatibilidad. Véase, EEUU 5.565.335 (Capon et al.) para ejemplos de dichos polipéptidos.

El resto Z puede incluir, por ejemplo, varios restos de histidina o, preferiblemente la región Fc de una inmunoglobulina, "Fc" se define en la presente memoria como un fragmento de un anticuerpo que contiene el dominio C terminal de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina.

En las proteínas de fusión más preferidas, el polipéptido mutante del interferón-beta-1a se fusiona a través de su extremo C terminal a al menos una parte de la región Fc de una inmunoglobulina. El interferón-beta-1a forma la parte amino terminal y la región Fc forma la parte carboxilo terminal. En estas proteínas de fusión, la región Fc está limitada preferiblemente a la región bisagra del dominio constante y a los dominios CH2 y CH3. La región Fc en estas fusiones también puede estar limitada a una parte de la región bisagra, siendo está parte capaz de formar puentes disulfuro intermoleculares, y a los dominios CH2 y CH3 o equivalentes funcionales de éstos. Estas regiones constantes pueden obtenerse a partir de cualquier fuente de mamífero (preferiblemente humana) y pueden obtenerse a partir de cualquier clase y/o isotipo apropiado, incluyendo IgA, IgD, IgM, IgE e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Las moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican las fusiones Ig pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) u obtenerse a partir de clones que están disponibles libremente. Los métodos para la preparación de los genes que codifican las regiones constantes de la cadena pesada o ligera de las inmunoglobulinas se muestran, por ejemplo, en Robinson, R. et al., Solicitud PCT, Publicación No. WO87-02671. La secuencia de ADNc que codifica la molécula o fragmento de interferón puede unirse directamente al ADNc que codifica las regiones constantes pesadas de Ig o puede unirse mediante una secuencia conectora. En realizaciones adicionales de la invención, puede crearse un sistema de vector recombinante para incluir secuencias que codifican interferón beta en el marco de lectura correcto con una región bisagra sintética. Adicionalmente, puede resultar deseable incluir, como parte del sistema de vector recombinante, ácidos nucleicos que se corresponden con la región 3' que flanquea un gen de inmunoglobulina incluyendo sitios de degradación/poliadenilación de ARN y secuencias aguas abajo. Además, puede resultar deseable obtener por ingeniería una secuencia señal por encima de las secuencias que codifican la proteína de fusión que contiene inmunoglobulina para facilitar la secreción de la molécula fusionada de una célula transformada con el vector recombinante.

La presente invención proporciona moléculas de fusión diméricas así como moléculas monoméricas o multiméricas que comprenden proteínas de fusión. Dichos multímeros pueden generarse utilizando las regiones Fc, o partes de éstas, de moléculas de Ig que son habitualmente multivalentes tales como pentámeros de IgM o dímeros de IgA. Se entiende que puede necesitarse un polipéptido cadena J para formar y estabilizar los pentámeros de IgM y los dímeros de IgA. Alternativamente, pueden formarse multímeros de proteínas de fusión de interferón-beta-1a utilizando una proteína con afinidad para la región Fc de las moléculas de Ig, tal como Proteína A. Por ejemplo, pueden unirse varias proteínas de fusión interferón-beta-1a/inmunoglobulina a lechos de Proteína A-agarosa.

Estas formas polivalentes son útiles ya que poseen muchos sitios de unión del receptor del interferón beta. Por ejemplo, un interferón-beta-1a bivalente soluble puede consistir en dos repeticiones en tándem de los aminoácidos 1 a 166 de la SEQ ID NO: 2 (o de los codificados por los ácidos nucleicos numerados 1 a 498 de la SEQ ID NO: 1) (resto X en la fórmula genérica) separados por una región conectora (resto Y), estando las repeticiones unidas a al menos una parte de un dominio constante de una inmunoglobulina (resto Z). Pueden construirse formas polivalentes alternativas, por ejemplo; mediante acoplamiento químico de fusiones interferón-beta-1a/Ig a cualquier molécula transportadora aceptable clínicamente, un polímero seleccionado del grupo que consiste en Ficoll, polietilenglicol o dextrano utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. Alternativamente, el interferón-beta-1a puede acoplarse químicamente a biotina, y unir el conjugado biotina-interferón beta Fc a avidina lo que resulta en moléculas tetravalentes avidina/biotina/interferón beta. Las fusiones interferón-beta-1a/Ig también pueden acoplarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y el conjugado resultante puede precipitarse con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10 para los sitios de unión del receptor del interferón beta.

Las proteínas, fragmentos y proteínas de fusión del interferón-beta-1a de la invención pueden aislarse y purificarse según las condiciones convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis o semejantes. Por ejemplo, las proteínas y fragmentos de interferón pueden purificarse pasando una disolución de éstos a través de una columna que tiene un receptor de interferón inmovilizado en ella (véase la Pat. de EEUU No. 4.725.669). La molécula de interferón unida puede eluirse mediante tratamiento con una sal caotrópica o mediante elución con ácido acético acuoso. Las proteínas de fusión con inmunoglobulinas pueden purificarse pasando una disolución que contiene la proteína de fusión a través de una columna que contiene proteína A o proteína G inmovilizada que une selectivamente la parte Fc de la proteína de fusión. Véase, por ejemplo, Reis, K.J., et al., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); Solicitud PCT, Publicación No. W087/00329. El anticuerpo quimérico puede eluirse mediante tratamiento con una sal caotrópica o mediante elución con ácido acético acuoso.

Alternativamente, las moléculas de fusión de proteínas de interferón y de inmunoglobulinas pueden purificarse en columnas de anticuerpo anti-interferón, o en columnas de anticuerpo anti-inmunoglobulina para rendir una proteína sustancialmente pura. Por el término "sustancialmente pura" se entiende que la proteína no tiene las impurezas a las que está asociada naturalmente. La pureza sustancial puede evidenciarse por una única banda en electroforesis.

Un ejemplo de una proteína de fusión interferón-beta-1a/Ig útil de esta invención es la de SEQ ID NO: 2, que se secreta en el cultivo celular por las células eucariotas que contienen el plásmido de expresión pCMG261 (Véase el Ejemplo 2). Esta proteína consiste en el interferón-beta-1a humano maduro fusionado con una parte de la región bisagra y los dominios constantes CH2 y CH3 de Ig murina. Ésta contiene una parte suficiente de la inmunoglobulina murina como para ser reconocida por la proteína de unión de Fc, Proteína A.

Se muestran otras proteínas de fusión de la invención que incorporan interferón-beta-1a humano: (a) en las SEQ ID NOS: 3 y 4 para el ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas, respectivamente de una fusión interferón-beta-1a con etiqueta de his (que también se muestra en la Figura 1) y; (b) en la SEQ NO: 1 para el ADNc que codifica la proteína de fusión interferón-beta-1a/Ig de la SEQ ID NO: 2 (que también se muestra en la Figura 2).

Las proteínas interferón-beta-1a preferidas de la invención incluyen la secuencia de ADN de "unión" nueva SEQ ID NO: 5 y de aminoácidos SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 5 representa los 11 tripletes de codones a cada lado de la unión entre el ADN del interferón beta humano y el ADN que codifica una región constante de una inmunoglobulina humana (véase el Ejemplo 5: SEQ ID NOS: 41 y 42). Específicamente, en la SEQ ID NO: 5, el ADN que codifica el interferón-beta-1a humano termina en el triplete de nucleótidos 568-570 (AAC) y el ADN que codifica una región constante de IgG1 humana empieza en el triplete (GAC) que empieza con el nucleótido número 574 de la SEQ ID NO: 41. La secuencia de "unión" de aminoácidos deducida correspondiente está representada en la SEQ ID NO: 6 y está basada en la SEQ ID NO: 42. Otra secuencia de "unión" única está definida de manera que incluye una secuencia conectora en la construcción de ADN final (Véase, el Ejemplo 5: SEQ ID NOS: 43 y 44). Las secuencias de "unión" de ADN y aminoácidos están representadas en las SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente, que muestran 11 tripletes de codones a cada lado de la unión directamente entre el final de la secuencia del interferón-beta-1a (nucleótido número 570 en la SEQ ID NO: 43) y la secuencia conectora (nucleótidos 571 a 585 en la SEQ ID NO: 43; GGGGS en la SEQ ID NO: 8).

Las secuencias de "unión" de ADN pueden utilizarse como sondas de ADN y pueden ser el ADN mínimo necesario para hibridar en condiciones estándar con cualquier secuencia de ADN que codifica cualquier proteína de fusión interferón-beta-1a/Ig. Sin embargo, pueden existir secuencias más pequeñas siempre que la sonda completa hibride con ambos lados de la unión y que ambos lados de la unión interferón beta/región constante participen en la hibridación. Además, los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de ADN más largas que la SEQ ID NO: 5 ó 7 también son adecuadas para la hibridación. Un experto en la técnica puede ensayar si una sonda particular tal como SEQ ID NO: 5 ó 7 es capaz de hibridar a ambos lados de la unión mediante el marcaje del extremo 5' de un oligonucleótido con sentido de cadena única o un oligonucleótido antisentido de cadena única con un fosfato de ATP marcado apropiadamente utilizando polinucleótido quinasa. Una secuencia de la invención debe hibridar con y, por lo tanto, marcarse con ambas sondas de oligonucleótidos. Además se entiende que la invención engloba secuencias completamente degeneradas que codifican la unión de SEQ ID NO: 5 ó 7.

III. Otras Variantes de Polipéptidos de Fusión de Interferón

Los derivados de las proteínas de la invención también incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria que mantienen la actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, la proteína de fusión de interferón beta puede estar en la forma de sales acídicas o básicas, o puede estar en forma neutra. Los restos individuales de aminoácidos también pueden modificarse por oxidación o reducción. Además, la estructura primaria de aminoácidos (incluyendo los extremos N y/o C terminales) o el glicano del interferón-beta-1a pueden modificarse ("derivatizarse") mediante la formación de conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, polímeros de polialquilenglicol tales como polietilenglicol (PEG: véase la solicitud en tramitación con la presente Número de Serie 60/104.491 y 60/720.237), lípidos, fosfato, grupos acetilo y semejantes, o mediante la creación de mutantes de la secuencia de aminoácidos.

Otros derivados de interferón beta/Ig incluyen conjugados covalentes o de agregación del interferón beta o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en cultivo recombinante como extremo N terminal o extremo C terminal adicional. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia de polipéptido señal (o líder) en la región N terminal de la proteína que dirige en la traducción o después de la traducción la transferencia de la proteína desde su lugar de síntesis hasta su lugar funcional en el interior o exterior de la membrana o pared celular (por ejemplo, el factor alfa líder de las levaduras). Las proteínas del receptor del interferón beta pueden comprender péptidos que se añaden para facilitar la purificación o identificación del interferón beta (por ejemplo, fusiones histidina/interferón-beta-1a). La secuencia de aminoácidos del interferón beta también puede unirse al péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Esta secuencia es muy antigénica y proporciona un epítopo que se une reversiblemente a un anticuerpo monoclonal específico permitiendo un ensayo rápido y una purificación sencilla de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también se degrada específicamente por la enteroquinasa mucosa bovina en el resto siguiente al par Asp-Lys.

Otros análogos incluyen la proteína de fusión interferón beta Fc o sus fragmentos activos biológicamente cuyas secuencias de interferón beta difieren de las mostradas en SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8 en una o más sustituciones conservativas de aminoácidos o en una o más sustituciones no conservativas de aminoácidos, o en deleciones o inserciones que no eliminan la actividad biológica de la proteína aislada. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares tales como las sustituciones en los grupos siguientes: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Otras sustituciones conservativas serán conocidas para el experto en la técnica. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, una sustitución conservativa puede ser por cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, una sustitución puede ser cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. Generalmente, las sustituciones que se espera que induzcan cambios en las propiedades funcionales de los polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i) un resto polar, por ejemplo, serina o treonina, se sustituye por un resto hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un resto de cisteína se sustituye por cualquier otro resto; (iii) un resto con una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye por un resto que tiene una cadena lateral electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un resto con una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por uno que no tenga dicha cadena lateral, por ejemplo, glicina. En la invención se incluyen las moléculas aisladas que son: variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos, proteínas codificadas por ADN que hibrida en condiciones de alta o baja astringencia con un ácido nucleico que codifica un polipéptido tal como SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8.

Hemos desarrollado mutantes de interferón-beta-1a que son variantes adicionales del resto de interferón-beta-1a de la invención. Estos restos de interferón-beta-1a pueden resultar especialmente útiles ya que presentan propiedades nuevas que no están presentes en el interferón-beta-1a de tipo salvaje (Véase el Ejemplo 1). Brevemente, realizamos un análisis mutacional del interferón-beta-1a humano con el objetivo de mapear los restos requeridos para la actividad y la unión al receptor. La disponibilidad de la estructura 3-D en cristal del interferón-beta-1a humano (véase Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818) nos permitió identificar, para las sustituciones de alanina (o serina), los restos expuestos al disolvente disponibles para las interacciones con el receptor del interferón beta, y mantener los aminoácidos implicados en los enlaces intramoleculares. Se diseñó un panel de quince mutaciones de alanina que reemplazaban entre dos y ocho restos a lo largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D, E) y bucles (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) del interferón-beta-1a. Véase el Ejemplo 1.

Se incluyó una etiqueta de histidina en el extremo amino terminal (etiqueta "his") para la purificación por afinidad de los mutantes expresados en células de mamíferos (SEQ ID NO: 2: Figura 1). Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se evaluaron en ensayos antivirales y antiproliferativos. Se desarrolló un ensayo de unión no radiactivo para analizar la unión de estos mutantes al receptor de la superficie celular del interferón beta (receptor de la superficie celular IFNAR1/2). Además, se utilizó un ensayo basado en ELISA utilizando una proteína de fusión ectodominio IFNAR2/Fc para unir interferón para mapear las interacciones de las superficies entre el interferón-beta-1a e IFNAR2 (Véase el Ejemplo 1). Estos análisis mutacionales demostraron que los extremos N y C terminales se encuentran en una parte de la molécula del interferón beta que no es importante para la unión al receptor ni para la función
biológica.

Hemos identificado tres tipos de efectos que se produjeron por la mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de medicamentos con interferón en determinadas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con la actividad antiviral más alta que la del interferón-beta-1a his de tipo salvaje (por ejemplo, mutante C1); (b) mutantes que presentan actividad tanto en los ensayos antivirales como antiproliferativos, pero para los que la actividad antiproliferativa es desproporcionadamente baja respecto a la actividad antiviral, comparada con la del interferón-beta-1a his de tipo salvaje (por ejemplo, mutantes C1, D y DE1); y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, A1, B2, CD2 y DE1) que muestran actividades antivirales y antiproliferativas que son desproporcionadamente bajas respecto a la unión al receptor, comparada con la del interferón-beta-1a his de tipo
salvaje.

Más aún, el acoplamiento entre el resto interferón-beta-1a (X) y el segundo resto Z distinto de interferón-beta-1a (por ejemplo, una región Fc de una inmunoglobulina) también puede realizarse mediante cualquier reacción química que una las dos moléculas entre sí siempre que la inmunoglobulina y el interferón-beta-1a mantengan sus actividades respectivas. Esta unión química puede incluir muchos mecanismos químicos tales como unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y formación de complejos. Los agentes de acoplamiento representativos (es decir, los conectores "Y" en la fórmula genérica) para desarrollar una unión covalente entre los restos de interferón-beta-1a e inmunoglobulina pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres succinimida, diisocianatos tales como tolilen-2,6-diisocianato, glutaraldehidos, diazobencenos y hexametilen diaminas tales como bis-(p-diazonio-benzoil)-etilendiamina, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como dimetil adipimidato, y compuestos de flúor bis-activos tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno. Esta lista no pretende ser exhaustiva respecto a las distintas clases de agentes químicos de acoplamiento conocidos en la técnica. Muchos de éstos están disponibles comercialmente tales como N-succinimidil-3-(2-piridiltio) propionato (SPDP), 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida hidrocloruro (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (SMPT: Pierce Chem. Co., Cat # 21558G).

IV. Utilidad de la invención

Las proteínas de fusión de esta invención pueden utilizarse en composiciones terapéuticas cuando se necesite la terapia con interferón beta. Estas moléculas tienen las ventajas normales asociadas con las proteínas de fusión, especialmente las fusiones Ig; es decir, farmacocinética y farmacodinámica alteradas lo que da lugar a una vida media incrementada y a un tiempo de residencia incrementado en el sistema vascular. Más aún, las proteínas interferón-beta-1a glicosiladas especialmente preferidas, aunque tienen una estructura similar al interferón beta 1a, son varias veces más activas biológicamente que el interferón beta 1a no glicosilado. Véase Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649.

Se ha visto que los productos de la presente invención son útiles en el mantenimiento de la vida media del interferón beta 1a terapéutico, y pueden prepararse, por ejemplo, para administración terapéutica disolviéndolos en agua o en un medio líquido aceptable. La administración es bien por vía parenteral, aerosol u oral. Pueden prepararse suspensiones coloidales finas para administración parenteral para producir un efecto de liberación lenta, o para vía oral si la formulación en aerosol es líquida o en polvo. En el estado seco, liofilizado o en formulaciones en disolución, las fusiones de interferón-beta-1a de la presente invención deberían tener una buena estabilidad una vez almacenadas.

Las proteínas terapéuticas de la presente invención pueden utilizarse para la profilaxis o el tratamiento de cualquier condición o enfermedad para la que sea eficaz el interferón-beta-1a como constituyente. Además, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse en el diagnóstico de constituyentes, condiciones o enfermedades en sistemas o especímenes biológicos, así como para propósitos diagnósticos en sistemas no fisiológicos.

En la utilización terapéutica, la presente invención contempla un método para tratar un animal que presenta o es susceptible a dicha condición o condiciones o enfermedad o enfermedades y que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar a dicho animal una cantidad eficaz de una proteína de fusión de la presente invención que es eficaz desde un punto de vista terapéutico para dicha condición o enfermedad. Los sujetos que se van a tratar con las fusiones de la presente invención incluyen mamíferos y preferiblemente seres humanos. Dependiendo de la condición o enfermedad específica que se quiere combatir, puede administrarse a los animales las proteínas de fusión de interferón-beta-1a de la invención a una dosis adecuada eficaz desde un punto de vista terapéutico y segura, como se determinará en la técnica, y sin demasiada experimentación. Debido a las barreras entre especies de los interferones de Tipo I, puede resultar necesario generar proteínas de fusión de interferón como se describe en la presente memoria a partir de interferones de la especie apropiada.

La actividad antiproliferativa celular del interferón-beta-1a es muy conocida. En particular, determinadas fusiones de interferón-beta-1a descritas en la presente memoria son útiles para tratar tumores y cánceres tales como sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma de mama, melanoma y carcinoma nasofaríngeo, así como condiciones autoinmunes tales como fibrosis, lupus y esclerosis múltiple. Además, se espera que la actividad antiviral que presentan las proteínas de fusión, en particular determinadas muteínas de interferón-beta-1a descritas en la presente memoria, pueda utilizarse en el tratamiento de enfermedades virales tales como infección por ECM, gripe, y otras infecciones del tracto respiratorio, rabia, y hepatitis. También se espera que las actividades inmunomoduladoras del interferón-beta-1a que presentan las proteínas descritas en la presente memoria, puedan utilizarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como fibrosis o esclerosis múltiple. La capacidad de los interferones para inhibir la formación de vasos sanguíneos nuevos (angiogénesis o neovascularización) permite utilizar las proteínas de la invención para tratar enfermedades angiogénicas tales como retinopatía diabética, retinopatía de los prematuros, degeneración macular, rechazo de injertos de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis y Síndrome de Osler-Webber. Más aún, desde hace tiempo se conoce la actividad antiendotelial del interferón y un mecanismo potencial de la acción del interferón puede ser interferir con la actividad de las células endoteliales inhibiendo la producción o eficacia de los factores angiogénicos producidos por las células tumorales. Algunos tumores vasculares, tales como hemangiomas, son especialmente sensibles al tratamiento con interferón. El tratamiento con interferón-alfa es el único tratamiento documentado para esta enfermedad. Se espera que el tratamiento con las proteínas de fusión de interferón-beta-1a de la invención ofrecerá unos beneficios farmacéuticos sustanciales en términos de farmacocinética y farmacodinámica, ya que se espera que el conjugado permanezca en el sistema vascular durante un periodo de tiempo mayor que los interferones no conjugados, dando lugar, por lo tanto, a una terapia más eficaz y eficiente para utilizarse como agente antiangiogénico. Véase el Ejemplo 9.

Las fusiones polímero-interferón-beta-1a de la invención pueden administrarse por sí mismas así como en la forma de ésteres, sales y otros derivados de éstos fisiológicamente funcionales aceptables desde un punto de vista farmacéutico. En dichas formulaciones farmacéuticas y medicamentosas, el interferón-beta-1a se utiliza preferiblemente junto a uno o más vehículos aceptables desde un punto de vista farmacéutico y, opcionalmente, junto a cualquier otro ingrediente terapéutico. El vehículo o vehículos deben ser aceptables desde un punto de vista farmacéutico en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el recipiente. El interferón-beta-1a se proporciona en una cantidad eficaz como para conseguir el efecto farmacológico deseado, como se ha descrito anteriormente, y en una cantidad apropiada para conseguir la dosis diaria deseada.

Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para una administración parenteral así como no parenteral y las modalidades específicas de administración incluyen administración oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoide, bronquial, linfática, vaginal e intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas para administración oral, nasal y parente-
ral.

Cuando el interferón-beta-1a se utiliza en una formulación que comprende una disolución líquida, la formulación puede administrarse ventajosamente por vía oral o parenteral. Cuando el interferón-beta-1a se utiliza en una formulación en forma de suspensión líquida o como un polvo en una formulación vehicular biocompatible, la formulación puede administrarse ventajosamente por vía oral, rectal o bronquial.

Cuando el interferón-beta-1a se utiliza directamente en la forma de un sólido en polvo, el interferón-beta-1a puede administrarse ventajosamente por vía oral. Alternativamente, puede administrarse por vía nasal o bronquial, mediante la nebulización del polvo en un gas para formar una dispersión gaseosa del polvo que es inspirada por el paciente desde un circuito de respiración que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.

Las formulaciones que comprenden las proteínas de la presente invención pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Dichos métodos incluyen generalmente la etapa de asociar el o los ingredientes activos con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. Típicamente, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el o los ingredientes activos con un vehículo líquido, un vehículo sólido dividido finamente o ambos y después, si es necesario, dando forma al producto en formas de dosificación de la formulación deseada.

Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sobres, comprimidos o pastillas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo como un polvo o gránulos; o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso, tal como jarabe, elixir, emulsión o bebida.

Un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos obtenidos por compresión pueden prepararse mediante compresión en una máquina adecuada, estando el compuesto activo en una forma sin aglomerar tal como un polvo o gránulos que se mezcla opcionalmente con un aglutinante, disgregante, lubricante, diluyente inerte, agente tensioactivo, o agente de liberación. Los comprimidos obtenidos por moldeo que comprenden una mezcla de los conjugados de polímero en polvo con un vehículo adecuado pueden prepararse mediante moldeo en una máquina adecuada.

Un jarabe puede prepararse añadiendo el compuesto activo a una disolución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo sacarosa, a la que también puede añadirse cualquier ingrediente auxiliar. Dichos ingredientes auxiliares pueden incluir saporíferos, conservantes adecuados, agentes para retardar la cristalización del azúcar, y agentes para incrementar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un polihidroxi alcohol, por ejemplo glicerol o sorbitol.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del conjugado activo, que preferiblemente es isotónico con la sangre del recipiente (por ejemplo, disolución salina fisiológica). Dichas formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas microparticulados que están diseñados para dirigir al compuesto a componentes sanguíneos o uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis única o dosis múltiple.

Las formulaciones en forma de pulverizador nasal comprenden disoluciones acuosas purificadas del conjugado activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan preferiblemente a un pH y a un estado isotónico compatibles con las membranas de la mucosa nasal.

Las formulaciones para la administración rectal pueden presentarse como un supositorio con un vehículo adecuado tal como manteca de cacao, grasas hidrogenadas o ácido carboxílico graso hidrogenado.

Las formulaciones oftálmicas tales como gotas para los ojos se preparan mediante un método similar al pulverizador nasal, excepto en que los factores de pH e isotónicos se ajustan preferiblemente para ser similares a los del ojo.

Las formulaciones tópicas comprenden los conjugados de la invención disueltos o suspendidos en uno o más medios, tales como aceite mineral, petróleo, polihidroxi alcoholes, u otras bases utilizadas para las formulaciones farmacéuticas tópicas.

Además de los ingredientes mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir además uno o más ingredientes auxiliares seleccionados de diluyentes, tampones, agentes saporíferos, disgregantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y semejantes.

De acuerdo con esto, la presente invención contempla la provisión de proteínas de fusión adecuadas para la estabilización in vitro del interferón-beta-1a en disolución, como una aplicación ilustrativa preferida de una aplicación no terapéutica. Las proteínas de fusión pueden utilizarse, por ejemplo, para incrementar la resistencia a la degradación enzimática del interferón-beta-1a y proporcionan un medio para mejorar la duración a temperatura ambiente y la robustez de los reactivos y kits de investigación.

Los Ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención y no deben considerarse como limitativos de ésta. En particular, debe entenderse que los experimentos con animales in vivo descritos en la presente memoria pueden variarse de forma que son posibles otras modificaciones y variaciones de la metodología básica. Por ejemplo, en el Ejemplo 7, un experto en la técnica podría utilizar otros ensayos de neopterina o podría alterar el número y el tipo de los primates utilizados. Estas modificaciones y variaciones de los Ejemplos deben considerarse como parte del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 Estudios de estructura/actividad del interferón-beta-1a humano utilizando mutaciones por sustitución de alanina/seri-na: Análisis de los sitios de unión al receptor y de los dominios funcionales A. Visión general

Se realizó un análisis mutacional extenso del interferón-beta-1a humano (IFN-beta-1a) con los objetivos de mapear los restos requeridos para la actividad y la unión al receptor. La disponibilidad de la estructura 3-D en cristal del IFN-beta humano (Karpusas M. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818) nos permitió identificar, para las sustituciones de alanina (o serina), los restos expuestos al disolvente disponibles para las interacciones con el receptor, y mantener los aminoácidos implicados en los enlaces intramoleculares. Se diseñó un panel de 15 mutaciones por sustitución de alanina que reemplazaban entre 2 y 8 restos a lo largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D, E) y bucles (AB, CD, DE). Se incluyó una etiqueta amino terminal que consistió en 6 restos de histidina para la purificación por afinidad, así como una secuencia enteroquinasa conectora para la eliminación de la extensión amino terminal. Los interferones resultantes se refieren indistintamente como "interferón (IFN)-beta etiquetado con his" o "interferón-beta-His_{6}" y semejantes.

Se construyeron diferentes plásmidos de expresión mutantes IFN-beta etiquetados con his utilizando una construcción del gen IFN-beta de tipo salvaje como molde para la mutagénesis. La estrategia de la mutagénesis implicó introducir en primer lugar sitios de degradación de enzima de restricción únicos a lo largo del gen IFN-beta etiquetado con his de tipo salvaje, después reemplazar distintas secuencias de ADN entre los sitios de restricción elegidos con dúplex de oligonucleótidos sintéticos que codificaban las mutaciones por sustitución de alanina (o serina). Finalmente, los genes IFN mutantes se subclonaron en un plásmido que dirigía la expresión en células de mamífero en una línea celular humana de riñón 293.

Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se evaluaron en ensayos antivirales y antiproliferativos. Se desarrolló un ensayo de unión de IFN no radiactivo para analizar la unión de estos mutantes al receptor de la superficie ("complejo IFNAR1/2") de células de linfoma de Daudi Burkitt humano. Además, se desarrolló un ensayo para mapear las superficies de interacción entre los mutantes his-IFN-beta e IFNAR2 que utilizaba una proteína de fusión IFNAR2/Fc, que comprende el dominio extracelular de la proteína IFNAR2 del receptor de IFN fusionado con los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana.

1. Creación de un gen de interferón beta como molde para la mutagénesis

Nuestra estrategia para generar mutantes IFN-beta por sustitución de alanina (o serina) fue crear en primer lugar un gen de IFN-beta modificado, que codificaba la proteína de tipo salvaje y que portaba sitios de degradación de enzimas de restricción únicos distribuidos a lo largo del gen. Los sitios únicos se utilizaron para intercambiar secuencias de tipo salvaje por dúplex de oligonucleótidos sintéticos que codifican los codones mutados. Con el fin de obtener un casete de expresión de IFN-beta-1a humano adecuado para la creación de genes mutantes, se amplificó el ADNc de IFN-beta (Genbank referencia #E00029) mediante PCR. Fue necesaria una clonación inicial del gen de IFN-beta en el plásmido pMJB 107, un derivado de pACYC184, véase Rose et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16(1) 355) con el fin de realizar mutagénesis dirigida del gen en un plásmido que carecía de los sitios de restricción específicos que se generarían mediante la mutagénesis.

Los cebadores de PCR utilizados para subclonar las secuencias codificadoras del gen de IFN-beta humano también nos permitieron introducir una secuencia enteroquinasa conectora por encima y en marco con el gen de IFN-beta (cebador 5' PCR 5'-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTT GCTTGGATTCCTACAAA
GAAGC-3' (SEQ ID NO: 9: "BET-021" y cebador 3' PCR 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTG
TAAGTC-3' (SEQ ID NO: 10: "BET-022") y sitios de enzimas de restricción que flanquean (BspEI y Xho I) útiles para clonar en los sitios del plásmido pMJB 107. El ADN resultante se refiere como fragmento A de PCR.

En la construcción final se introdujeron una secuencia señal eficaz de la secuencia señal de la molécula de adhesión de las células vasculares-1 (VCAM-1) humana y una etiqueta de seis histidinas de un segundo fragmento de ADN creado a partir de pDSW247 (fragmento B). El plásmido pDSW247 es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del que se ha delecionado el gen EBNA-1 y que porta la secuencia señal de VCAM-1 (VCAMss) fusionada por encima y en marco con una etiqueta de seis histidinas. Los cebadores de PCR que se utilizaron para generar el resto VCAMss-1/etiqueta de histidina del casete fueron KID-369 (cebador 5' PCR 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCAT
CATCATCATAGCT-3': SEQ ID NO: 11) y KID-421 (cebador 3' PCR 5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGG CCCCCGGA-3': SEQ ID NO: 12) que incorpora sitios de degradación de enzimas de restricción que flanquean (NotI y BspEI) que permitieron la escisión del fragmento B de ADN.

Para crear un vector plasmídico que portara la secuencia señal de VCAM-1, la etiqueta de his y el gen del interferón-beta se realizó una ligación de tres vías utilizando fragmentos de ADN purificados en gel del vector plasmídico pMJB107 (degradado con NotI y XhoI), fragmento A de PCR (degradado con BspEI y XhoI) y fragmento B (degradado con NotI y BspEI). El plásmido ligado se utilizó para transformar células de E. coli JA221 o XL1-Blue y se tomaron y ensayaron las colonias resistentes a ampicilina para detectar insertos mediante análisis de mapas de restricción. Se obtuvo ADN Maxiprep y la secuencia del inserto se verificó mediante secuenciación de ADN. La construcción resultante se denominó pCMG260.

2. Creación de mutantes por sustitución de alanina del interferón-beta humano en pCMG260

El plásmido pCMG260 se utilizó como molde para múltiples ciclos de mutagénesis (U.S.E. Kit de Mutagénesis Dirigida (Boehringer-Mannheim) que introdujeron sitios de degradación de restricción únicos en posiciones a lo largo de la secuencia que codifica la proteína IFN-beta pero que no cambiaron la secuencia resultante de la proteína. Los plásmidos mutagenizados se utilizaron para transformar las cepas de E. coli JA221 o XL1-Blue y las colonias recombinantes se seleccionaron por resistencia a cloranfenicol. Las colonias resistentes a cloranfenicol se ensayaron adicionalmente para detectar la presencia del sitio de enzima de restricción único deseado mediante análisis de mapeo de restricción de ADN. El plásmido IFN-beta resultante, pCMG275.8, contenía el conjunto completo de sitios de degradación de enzimas de restricción únicos y se verificó la secuencia de ADN del gen. La secuencia de ADN completa del gen de interferón-beta con etiqueta de his modificado junto a la secuencia codificadora de la proteína de tipo salvaje se muestran en la Figura 1.

El conjunto completo de mutaciones por sustitución de alanina se muestra en la Tabla 1 (página siguiente). Los nombres de los mutantes especifican las regiones estructurales (hélices y bucles) en las que se introdujeron las mutaciones. El panel entero de las sustituciones de alanina (o serina) resulta en la mutación de 65 de los 165 aminoácidos del IFN-beta humano.

El panel de mutantes se creó a partir de pCMG275.8 reemplazando segmentos de ADN entre los sitios de restricción únicos con dúplex de oligonucleótidos sintéticos que portaban la información genética codificadora que se muestra en la Tabla 2 (véase más adelante). Para crear los distintos plásmidos mutantes por sustitución de alanina, se ligaron entre sí el vector pCMG275.8 purificado en gel (degradado con la enzima de restricción apropiada, como se indica en la lista que aparece más adelante para cada región estructural de IFN-beta) y dúplex de oligonucleótidos (las secuencias de las cadenas codificadoras se muestran en la Tabla 2). Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar la cepa JA221 de E. coli y las colonias recombinantes se seleccionaron por resistencia a ampicilina. Las colonias resistentes a ampicilina se ensayaron para detectar la presencia de la inserción de las mutaciones mediante el cribado de sitios de enzimas de restricción apropiados. Para dos mutantes (A2 y CD2) la estrategia de clonación implicó la utilización de dos dúplex de oligonucleótidos sintéticos (mostrados en la Tabla 2) que portan extremos protuberantes complementarios para permitir que ligaran entre sí y con el núcleo IFN-beta del vector en una ligación de tres vías. La lista siguiente ilustra los sitios que se utilizaron para clonar los oligonucleótidos mutados de la Tabla 2. El esquema de clonación (subsección B) muestra las posiciones de estos sitios únicos en el gen del interferón-beta.

Hélice A: BspEI a MunI o BgIII a PstI

Bucle AB: MunI a PstI o MunI a BsaHI

Hélice B: BspHI a BsaI o BsaHI a BsaI

Hélice C: BsaI a XbaI

Bucle CD: XbaI a BspHI o XbaI a DraIII

Hélice D: BspHI a DraIII

Bucle DE: BspHI a PvuI

Hélice E: PvuI a BstEII

TABLA 1 Posiciones de las mutaciones por sustitución de alanina de ^{HU}IFN-\beta

1

La línea que designa IFN-\beta muestra la secuencia de IFN-\beta humano de tipo salvaje. Las sustituciones de alanina o serina en los restos de IFN-\beta se muestran para cada uno de los mutantes y los guiones debajo de las regiones relevantes indican las secuencias de tipo salvaje. Las estructuras de las hélices y los bucles se indican como líneas sólidas debajo de los mutantes. El bucle DE ocupa el hueco entre las hélices D y E. Se generaron dos mutantes adicionales por sustitución de alanina (H93A, H97A y H121A) y se analizaron en ensayos antivirales para determinar los efectos de mutar estas histidinas que quelan cinc en la estructura de dímero en el cristal. Estos dos mutantes retuvieron la actividad del tipo salvaje en los ensayos antivirales lo que sugiere que la formación del dímero mediada por cinc no es importante para la actividad de IFN-\beta.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

3

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B. Construcción de plásmidos de expresión EBNA 293

Los genes de IFN-beta de tipo salvaje y mutante, fusionados con la secuencia señal de VCAM-1, la etiqueta de his y la secuencia enteroquinasa conectora, se purificaron en gel como fragmentos de restricción de 761 pares de bases NotI y BamHI. Los genes purificados se subclonaron en el vector plasmídico pDSW247 degradado con NotI y BamHI, que es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido pDSW247 es un vector de expresión para la expresión transitoria de proteínas en células humanas de riñón EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Contiene el gen del promotor temprano del citomegalovirus y los elementos reguladores de EBV que se requieren para un alto nivel de expresión génica en este sistema, así como marcadores que se pueden seleccionar para E. coli (resistencia a ampicilina) y para células EBNA 293 (resistencia a higromicina). Los plásmidos ligados se utilizaron para transformar células de E. coli JA221 o XL1-Blue y las colonias resistentes a ampicilina se cogieron y ensayaron para detectar la presencia de insertos mediante análisis de mapas de restricción. Se preparó ADN Maxiprep y la secuencia de los insertos se verificó mediante secuenciación de ADN. Los clones positivos que presentaban las secuencias mutagenizadas deseadas se utilizaron para transfectar células de riñón humanas EBNA 293.

La estrategia global de clonación y expresión se presenta en la Figura 12.

C. Expresión y Cuantificación de los mutantes de IFN-beta-1a por sustitución de alanina

Las células EBNA 293 humanas (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) se mantuvieron como cultivos subconfluentes en medio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM glutamina y 250 \mug/ml Geneticina (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Los plásmidos de expresión pDSW247 se transfectaron de manera transitoria en células EBNA 293 utilizando el protocolo de lipofectamina (Gibco/BRL, Life Technologies). Se recogió el medio condicionado 3-4 días después de la transfección, se eliminaron los restos celulares mediante centrifugación y la concentración de his-IFN-beta-1a se cuantificó mediante ELISA.

El ensayo de ELISA se realizó utilizando anticuerpos policlonales de conejo (IgG purificada mediante proteína A, anticuerpos frente a IFN-beta-1a humano purificado) para recubrir placas de ELISA de 96 pocillos y una forma biotinilada de la misma Ig policlonal de conejo se utilizó como reactivo secundario para permitir la detección del interferón utilizando peroxidasa de rábano unida a estreptavidina (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA). Se utilizó una serie de diluciones de interferón-beta-1a (como AVONEX® vendido por Biogen, Inc.) para generar curvas de concentración estándar. Los medios condicionados que contienen his-IFN-beta de los transfectantes EBNA se diluyeron para obtener muestras con concentraciones en el intervalo entre 10 ng/ml y 0,3 ng/ml en el ensayo ELISA. Para confirmar las concentraciones de IFN-beta en los medios determinadas por ELISA, se realizaron análisis por transferencia Western. Los sobrenadantes de los cultivos y los estándar de IFN-beta-1a reducidos se sometieron a SDS-PAGE en geles con un gradiente 10-20% (Novex, San Diego, CA) y se transfirieron a membranas de PDVF. Se detectaron bandas inmunorreactivas con un antisuero policlonal de conejo anti-IFN-beta-1a (#447, Biogen, Inc., un segundo antisuero frente a IFN-beta-1a) seguido de tratamiento con IgG anti-conejo de burro unida a HRP (Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA).

D. Evaluación de la Unión al Receptor de los Mutantes del Interferón-beta

Las propiedades de unión al receptor de los mutantes del interferón-beta-1a descritos en C se evaluaron utilizando dos ensayos de unión diferentes. Un ensayo determinó la unión de los mutantes del interferón-beta a una proteína de fusión, IFNAR2/Fc, que comprende el dominio extracelular de la cadena del receptor IFNAR2 humano fusionado con parte de la región constante de una IgG humana. IFNAR2-Fc se expresó en células de ovario de hamster chino (CHO) y se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A sefarosa según las instrucciones del fabricante (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, catálogo #20334). La unión de los mutantes del interferón-beta a IFNAR2-Fc se determinó en un ensayo con formato ELISA. Las placas de ELISA se prepararon recubriendo placas de 96 pocillos de fondo plano durante toda la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de anticuerpo monoclonal de ratón anti IgGI humana (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) a 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento (50 mM NaHCO_{3}, 0,2 mM MgCl_{2}, 0,2 mM CaCl_{2}, pH 9,6). Las placas se lavaron dos veces con PBS que contiene 0,05% Tween-20 y se bloquearon con 0,5% de leche en polvo desnatada en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de dos lavados más, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de 1 \mug/ml de IFNAR2-Fc en 0,5% leche en PBS que contiene 0,05% Tween 20 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y las placas se lavaron dos veces más. La unión de los mutantes del interferón-beta a IFNAR2-Fc se determinó añadiendo 50 \mul/pocillo de interferón-beta mutante en medio condicionado, diluido de manera seriada en Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino y se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las diluciones del mutante del interferón-beta están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 \muM a 10 pM. Después de lavar, el interferón-beta unido a las placas se detectó añadiendo 50 \mul/pocillo de una mezcla que consiste en una dilución 1:1.000 de un anticuerpo policlonal de conejo anti-interferón (#447, Biogen, Inc.) más IgG de burro anti-conejo marcada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoReaserach) e incubando durante 15 minutos a 4ºC. Después de dos lavados, se añadió el sustrato de HRP, y la placa se incubó a 4ºC antes de leerla en un lector de placas de ELISA a una absorbancia de 450 nm. Los datos se representaron como absorbancia frente a la concentración del interferón-beta mutante, y la afinidad de la unión del interferón-beta mutante a IFNAR2-Fc se determinó ajustando los datos a una ecuación de unión hiperbólica simple. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 3, en la que la afinidad de la unión de cada mutante, determinada en experimentos en triplicado, se expresa como porcentaje de la medida para el interferón-beta-1a His_{6} de tipo salvaje.

Se utilizó un segundo ensayo de unión al receptor para determinar la afinidad con la que los mutantes del interferón-beta se unen a células Daudi que expresan ambas cadenas del receptor, IFNAR1 e IFNAR2, que conjuntamente comprenden el receptor del interferón-beta. Este ensayo basado en FACS utilizó un anticuerpo monoclonal de bloqueo dirigido frente al dominio extracelular de IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.) para distinguir los receptores sin ocupar (libres) de los receptores a los que se ha unido el interferón-beta. Las células Daudi (20 \mul a 2,5 x 10^{7} células/ml) se pusieron en placas de ELISA de fondo en V de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 4ºC con diferentes concentraciones del mutante del interferón-beta (20 \mul en tampón FACS; 5% FBS, 0,1% NaN_{3} en PBS). Las diluciones seriadas deseables de los mutantes de interferón-beta estaban en el intervalo de 0,5 \muM hasta 0,5 pM. A cada placa se añadieron 100 ng de anticuerpo monoclonal murino anti-IFNAR EA12 biotinilado (10 \mul) y las placas se incubaron durante 2 minutos más a temperatura ambiente antes de lavarlas dos veces con tampón FACS (4ºC). Las células se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con 50 \mul/pocillo de una dilución 1:200 de estreptavidina conjugada con R-Ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), se lavaron dos veces en tampón FACS, se resuspendieron en 300 \mul de tampón FACS que contiene 0,5% paraformaldehido y se transfirieron a tubos de poliestireno de 12x75 mm (Falcon 2052). Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson). Los datos se representaron como canal medio de intensidad de la fluorescencia (MFCI) frente a la concentración del mutante del interferón-beta. Las afinidades de unión se definieron como la concentración del mutante del interferón-beta que produce un 50% de inhibición en la tinción del anticuerpo. Cada mutante se ensayó varias veces. La Figura 4 muestra las afinidades de unión al receptor de cada mutante del interferón-beta, determinadas por este método, expresadas como porcentaje de la afinidad determinada para el interferón-beta-1a His_{6} de tipo salvaje en cada experimento.

E. Evaluación de la Función de los Mutantes del Interferón-beta

También se ensayo la actividad funcional de los mutantes del interferón-beta utilizando ensayos in vitro para determinar la actividad antiviral y la capacidad del interferón-beta de inhibir la proliferación celular. Se realizó un mínimo de tres ensayos antivirales, cada uno con puntos de datos en triplicado, para cada mutante. El interferón-beta-1a His_{6} de tipo salvaje se incluyó como referencia en todos los experimentos. Los ensayos antivirales se realizaron tratando células de carcinoma de pulmón humano A549 (ATCC CCL 185) durante toda la noche con diluciones seriadas de dos veces del mutante del interferón-beta a concentraciones en el intervalo entre protección antiviral completa y falta de protección frente a la muerte celular por el virus. Al día siguiente, las células se ensayaron durante dos días con el virus de la encefalomiocarditis (ECMV) a una dilución que resultó en muerte celular completa en ausencia de interferón. Las placas se revelaron con el colorante metabólico MTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida) (M-5655, Sigma, St. Louis, MO). Se preparó una disolución madre de MTT a 5 mg/ml en PBS y se esterilizó por filtración y 50 \mul de esta disolución se diluyeron en los cultivos celulares (100 \mul por pocillo). Después de incubar a temperatura ambiente durante 30-60 minutos la disolución MTT/medio se desechó, las células se lavaron con 100 \mul de PBS y finalmente el colorante metabolizado se solubilizó en 100 \mul de ácido clorhídrico 1,2 N en isopropanol al 90%. Las células viables (como se prueba por la presencia del colorante) se cuantificaron mediante absorbancia a 450 nm. Los datos se analizaron representando la absorbancia frente a la concentración del mutante del interferón-beta y la actividad de cada mutante se definió como la concentración en la que se observó la muerte del 50% de las células. La Figura 5 muestra la actividad de cada mutante expresada como porcentaje de la actividad determinada para el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje en cada experimento.

También se ensayó la función de los mutantes del interferón-beta en un ensayo antiproliferativo. Se sembraron células de linfoma de Daudi Burkitt humanas (ATCC#CCL 213) a 2 x 10^{5} células/ml en RPMI 1620 suplementado con 10% de suero fetal de ternera definido (Hyclone, Logan, Utah) y 2 mM de L-glutamina. Cada pocillo también contenía una concentración determinada del mutante del interferón-beta en un volumen final total de 100 \mul de medio por pocillo; las concentraciones de interferón-beta utilizadas se eligieron para cubrir el intervalo desde inhibición máxima de la proliferación de las células Daudi hasta no inhibición (es decir, proliferación completa). Se utilizaron puntos en duplicado para cada concentración del mutante del interferón-beta ensayada, y se incluyó un conjunto duplicado de células sin tratar en todos los experimentos. Las células se incubaron durante dos días a 37ºC en incubadores con 5% de CO_{2}, después de lo cual se añadió a cada pocillo 1 \muCi por pocillo de timidina tritiada ((metil-^{3}H) timidina, Amersham TRK758) en 50 \mul de medio y se incubó durante 4 h adicionales. Las células se recogieron utilizando un recolector de placas LKB y se determinó la incorporación de timidina tritiada utilizando un lector de placas beta LKB. Se hizo la media de los valores experimentales duplicados y se determinaron las desviaciones estándar. Los datos se representaron como las medias de las cuentas por minuto frente a la concentración del mutante del interferón-beta y la actividad de cada mutante se definió como la concentración requerida para rendir un 50% de la inhibición del crecimiento máxima observada. Se realizaron múltiples ensayos para cada mutante. La Figura 6 muestra los resultados expresados como porcentaje de la actividad encontrada para el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje en cada experimento.

F. Propiedades de los Mutantes del Interferón-Beta

Se vio que el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje tiene actividades en los ensayos antivirales y antiproliferativos que eran cada una 3 veces menores que las actividades correspondientes encontradas con el interferón-beta-1a de tipo salvaje sin etiquetar. Debido a que todos los mutantes del interferón-beta A1-E contienen la misma secuencia de etiqueta de his en su extremo N terminal, los efectos de las mutaciones en las propiedades de la molécula se determinaron comparando las actividades de estos mutantes en los ensayos antivirales, antiproliferativos y de unión con la actividad observada para el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje. Haciendo esto, asumimos que las variaciones en las actividades de los mutantes A1-E, comparadas con las del interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje son aproximadamente iguales desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo que los efectos que estas mismas mutaciones tendrían en ausencia de esta etiqueta de his N terminal. La asunción equivalente para las construcciones etiquetadas o de fusión de otras citoquinas solubles se considera habitualmente cierta por los expertos en la técnica de la mutagénesis de alanina, especialmente cuando la actividad funcional in vitro de la construcción etiquetada o de fusión es cercana a la de la citoquina de tipo salvaje como es el caso de la presente memoria. Véanse, por ejemplo, Pearce K.H. Jr, et al., J. Biol. Chem. 272: 20595-20602 (1997) y Jones J.T., et al., J. Biol. Chem. 273: 11667-11674 (1998).

Los datos mostrados en las Figuras 3-6 sugieren tres tipos de efectos causados por la mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de medicamentos con interferón en determinadas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con la actividad antiviral más alta que la del interferón-beta-1a de tipo salvaje (por ejemplo, mutante C1); (b) mutantes que presentan actividad tanto en los ensayos antivirales como antiproliferativos, pero para los que la actividad antiproliferativa es desproporcionadamente baja respecto a la actividad antiviral, comparada con la del interferón-beta-1a de tipo salvaje (por ejemplo, mutantes C1, D y DE1); y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, A1, B2, CD2 y DE1) que muestran actividades antivirales y antiproliferativas que son desproporcionadamente bajas respecto a la unión al receptor, comparada con la del interferón-beta-1a de tipo salvaje. Puede observarse que algunos mutantes pertenecen a más de una clase. Estas clases se revisan más adelante. Aunque hemos caracterizado estas clases de mutantes respecto a los ejemplos listados, debe apreciarse que otras mutaciones en estas regiones pueden resultar en efectos similares o incluso incrementados sobre la actividad:

(a) El mutante C1 presenta una actividad antiviral que es aproximadamente 6 veces mayor que la del interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje. Este mutante y otros de este tipo se prevé que sean útiles reduciendo la cantidad de interferón-beta que debe administrarse para conseguir un nivel determinado de efecto antiviral. Es de esperar que una reducción de la cantidad de la proteína administrada reduzca la inmunogenicidad de la proteína y también puede reducir los efectos secundarios de toxicidades no basadas en mecanismo. Las mutaciones en esta clase se prevé que sean ventajosas en situaciones en las que el beneficio terapéutico de la administración del interferón-beta resulte de sus efectos antivirales y en las que los efectos antiproliferativos contribuyen a la toxicidad o a efectos secundarios no deseados.

(b) Las actividades relativas (% del tipo salvaje) de los mutantes por sustitución de alanina en los ensayos antivirales y antiproliferativos se comparan en la Figura 7. Las actividades cambiadas de manera coordinada (es decir, las actividades antivirales y antiproliferativas que difieren en el mismo factor de las actividades del interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje) se observan en la mayoría de los mutantes (aquellos que aparecen en la línea diagonal). Sin embargo, varios mutantes muestran unas alteraciones mayores de la actividad en un ensayo respecto al otro, comparadas con el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje, como se prueba por el desplazamiento de la diagonal. Tres de estos mutantes se muestran en la Tabla que aparece a continuación. El mutante C1 muestra una actividad antiviral que es 6 veces mayor que la del interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje, pero su actividad en el ensayo antiproliferativo es similar a la del tipo salvaje. El mutante C1, por lo tanto, tiene una actividad antiviral incrementada por un factor de 5,2 sobre su actividad antiproliferativa, respecto al interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje. De manera similar, el mutante D presenta una actividad del 65% respecto al tipo salvaje en el ensayo antiviral, pero sólo un 20% de la actividad del tipo salvaje en el ensayo antiproliferativo y, por lo tanto, tiene una actividad antiviral incrementada 3,4 veces sobre su actividad antiproliferativa comparado con el tipo salvaje. El mutante DE1 presenta un 26% de la actividad del tipo salvaje en el ensayo antiviral pero sólo un 8,5% en el ensayo antiproliferativo y, por lo tanto, tiene una actividad antiviral incrementada 3,0 veces sobre su actividad antiproliferativa comparado con el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje. Cuando se administran a una concentración suficiente como para conseguir un nivel de actividad antiviral deseado, estas proteínas mutantes presentarán unos niveles de actividad antiproliferativa sustancialmente menores que la proteína de tipo salvaje. Las mutaciones de esta clase, como las de la clase (a) se prevé que sean ventajosas en situaciones en las que el beneficio terapéutico de la administración del interferón-beta resulte de sus efectos antivirales y cuando los efectos antiproliferativos contribuyan a la toxicidad o a efectos secundarios no deseados.

Mutante	Actividad Antiviral	Actividad	AV/AP
	(AV) (% del tipo salvaje)	Antiproliferativa (AP)
		(% del tipo salvaje)
C1	571	109	5,2
D	65	19	3,4
DE1	26	8,5	3,0

(c) Mutantes con actividades antivirales y antiproliferativas que son bajas respecto a la unión al receptor, comparadas con el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje (véase la Tabla que aparece a continuación). El mutante A1 presenta unas actividades antivirales y antiproliferativas que son 2,0 veces y 1,8 veces más altas que las observadas con el interferón-beta-1a etiquetado con his de tipo salvaje, pero se une al receptor afín en células Daudi con una afinidad que es 29 veces mayor que la del tipo salvaje. La unión de este mutante al receptor IFN-beta está, por lo tanto, incrementada aproximadamente 15 veces comparada con las actividades antivirales y antiproliferativas de la proteína. De manera similar, los mutantes B2, CD2 y DE1 muestran incrementos en la unión respecto a la actividad antiviral de 4,6, 4,6 y 18 veces, respectivamente, y respecto a la actividad antiproliferativa de 3,5, 15 y 54 veces. Estas proteínas se prevé que sean útiles como antagonistas funcionales de la actividad del IFN-beta endógeno y posiblemente de otros interferones de Tipo I endógenos, debido a que tienen la capacidad de unirse y ocupar el receptor generando sólo una pequeña parte de la respuesta funcional en las células diana que se observaría con el IFN-beta de tipo salvaje.

Mutante	Actividad	Actividad	Actividad	Unión/AV	Unión/AP
	Antiviral (AV)	Antiproliferativa (AV)	de Unión Celular
	(% del tipo salvaje)	(% del tipo salvaje)	(% del tipo salvaje)
A1	200	180	2.900	15	16
B2	7,1	9,2	33	4,6	3,5
CD2	150	46	690	4,6	15
DE1	26	8,5	460	18	54

G. Relación entre las Muteínas y la Estructura Tridimensional del Interferón

Mientras que las estructuras de cristal publicadas de una forma no glicosilada del interferón beta murino (T. Senda, S. Saitoh y Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-\beta at 2.15 \ring{A} Resolution. J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995)) y del interferón alfa-2b humano (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhushan y M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-\alpha2b Revealed by X-ray Crystallography. Structure. 4: 1453-1463 (1996)) han proporcionado modelos para el núcleo polipeptídico del interferón beta humano, nosotros hemos resuelto recientemente la estructura del interferón-beta-1a en su estado glicosilado (M. Karpusas, M. Nolet, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb y S.E. Goelz. The Crystal Structure of Human Interferon-\beta at 2.2 \ring{A} Resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818 (1997)).

Los resultados de nuestros análisis mutacionales pueden resumirse respecto a la estructura 3D del interferón-beta-1a (no presentada aquí). Determinados restos mutados produjeron una reducción en la actividad (2 a >5 veces reducida). Las regiones mutadas corresponden a las sustituciones mostradas en las Tablas 1 y 2.

Las mutaciones más significativas en cuanto a su efecto sobre la función resultaron en una reducción dramática tanto de la actividad como de la unión al receptor de la superficie celular. Las mutaciones en esta región (hélice A2, bucle AB y AB2 y hélice E) corresponden a mutaciones en el sitio de unión a IFNAR2, ya que ninguno de estos mutantes se unieron a IFNAR2/Fc en nuestro ensayo.

Aunque estas mutaciones que fueron importantes para la unión a IFNAR2 también afectaron la unión a las células, las propiedades de unión a la superficie celular también se ven influidas por restos en otras regiones de la molécula (hélice B1, hélice C2). Puede observarse en los modelos 3D (no mostrados) que muestran los efectos de los mutantes por sustitución de alanina que el extremo N terminal, C terminal y las regiones glicosiladas de la hélice C de la molécula de IFN-beta-1a no están en el sitio de unión al receptor. Las mutaciones en estas regiones no redujeron la actividad biológica ni redujeron la unión al receptor de la superficie celular.

Ejemplo 2 Construcción de Plásmidos para la Expresión de la Proteína de Fusión del Interferón-beta-1a (IFN-beta/Fc)

Se utilizó tecnología PCR para crear un plásmido de expresión que codifica la secuencia de ADN del IFN-beta humano fusionada con la parte Fc de la cadena pesada de la molécula IgG2a murina. El vector plasmídico pDSW247 (véase el Ejemplo 1) es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del que se delecionó el gen de EBNA-1. Este plásmido se utilizó para la construcción de un vector de expresión útil para la expresión transitoria de la proteína en células de riñón humanas EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA., Shen, E.S., et al., 1995, Gene 156, 235-239). Se diseñó para contener una secuencia señal de la molécula de adhesión de las células vasculares-1 (VCAM-1) humana en marco y por encima de la secuencia del interferón beta y una secuencia enteroquinasa conectora en la unión de las secuencias del interferón beta e Ig.

El casete de expresión de la proteína de fusión se construyó a partir de varios fragmentos de ADN. Para obtener un fragmento de ADN que codifica el gen del IFN-beta humano, se utilizó el subclón ADNc del IFN-beta humano (GenBank, referencia #E00029) como molde para PCR utilizando cebadores (5'-GGTGGTCTCACATGAGCTA
CAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC (SEQ ID NO: 31: "BET-025") y 5'-GCCCTCGAGTCGACCTTGT
CATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (SEQ ID NO: 32: "BET-026") que también incorporaban un sitio de degradación de enzimas de restricción (BsaI) por encima del primer codón del IFN-beta. El cebador 3' de PCR (SEQ ID NO: 32: BET-026) para el gen del IFN-beta eliminaba el codón de terminación del IFN-beta, e incorporaba una secuencia enteroquinasa conectora en marco (DDDDK) y un sitio de enzima de restricción terminal (XhoI) útil para la subclonación en el vector de expresión. El sitio BsaI introducido por encima de la secuencia que codifica IFN-beta nos permitió ligar la secuencia señal de VCAM-1 por encima y en marco con la secuencia que codifica IFN-beta. Esta secuencia señal de VCAM-1 también se generó por PCR utilizando los pares de cebadores 5'- CAAGCTTGC
TAGCGGCCGCGG-3' (SEQ ID NO: 33: "BET-023" y 5'- GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 34: "BET-024") que contenían un sitio 5' de degradación de enzimas de restricción (NotI, para la ligación en el sitio de clonación NotI de pDSW247) y un sitio 3' de degradación de enzimas de restricción (BsaI, para la ligación en el fragmento 5' de PCR de IFN-beta-1a). El molde para PCR fue el ADNc de la molécula de adhesión de las células vasculares-1 (VCAM-1) humana (GenBank número de referencia X53051).

Para crear el gen de la fusión IFN-beta-1a/Fc se realizaron los siguientes procesos. El fragmento IgG2a murino se eliminó de pEAG293 mediante purificación en gel de un fragmento de ADN obtenido por digestión con SaII + BamHI. El plásmido pEAG293 es un subclón Bluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla, Ca, catálogo #212205) de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG2a murina (GenBank número de referencia V00798). Los pares de cebadores de PCR 5'- AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3' (SEQ ID NO: 35) en el que S=C o G, M=A o C, R=A o G, W=A o T, y 5'-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3')SEQ ID NO: 36) crearon sitios SalI y NotI que flanquean en los extremos 5' y 3' del casete, respectivamente. El casete del dominio Fc de IgG2a murina difiere de la secuencia de GenBank en una única base (codón V369) creando una mutación silenciosa. Por lo tanto, la proteína Fc de tipo salvaje se expresa a partir de este casete IgG2a Fc.

El fragmento de ADN que contiene la secuencia señal de VCAM-1 fusionada con el gen del IFN-beta humano con la secuencia enteroquinasa conectora en el extremo C terminal, se escindió de pCMG258 con una digestión NotI a BamHI y se purificó en gel. El sitio SalI estaba presente en el plásmido pDSW247 original y está localizado justo por debajo y en marco con la secuencia que codifica IFN-beta. El vector plasmídico pDSW247 se preparó como un fragmento NotI + BamHI purificado en gel (véase el Ejemplo 1). Se realizó una ligación de 3 vías, utilizando los fragmentos mencionados anteriormente, para construir el vector de expresión final que codifica la fusión IFN-beta-1a/IgG2a. Este plásmido de expresión se denominó pCMG261 y contiene la secuencia señal de VCAM-1 fusionada con el gen del IFN-beta humano maduro, secuencia enteroquinasa conectora y dominio Fc de IgG2a murina. El ADN completo (SEQ ID NO: 1) y la secuencia proteica (SEQ ID NO: 2) de la proteína de fusión se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 3 Producción de la proteína de fusión del interferón-beta-1a en células de mamíferos

El vector de expresión recombinante IFN-beta/Fc, pCMG261, se transfectó de manera transitoria en células de riñón humanas EBNA 293 para conseguir la expresión de una proteína de fusión IFN-beta-1a de la invención. Este plásmido de expresión recombinante se transfecta mediante el protocolo de la lipofectamina (catálogo # 18324-020, Life Technologies) en células de riñón humanas EBNA 283 según el protocolo del fabricante (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P., Ciccarone, V., Gebeyehu, G., Jessee, J., Feigner, P.L. (1993) Focus 15.73) utilizando 1-3 microgramos de ADN plasmídico para una placa de cultivo de 100 mm de células EBNA 293. Al día siguiente a la transfección de las células con lipofectamina, el medio se reemplaza por medio de crecimiento (medio Eagle Modificado por Dulbecco, 10% de suero fetal bovino, 4 mM glutamina, 250 microgramos de Gentecina/ml (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El medio condicionado se recoge 3-4 días después y se determina la concentración de IFN-beta-1a-Fc como se describe a continuación.

También puede llevarse a cabo la producción de una proteína de fusión IFN-beta-1a/Fc en otros sistemas de expresión de células de mamíferos o células procariotas después de transferir la región que codifica la proteína de la proteína de fusión en vectores de expresión apropiados para estos sistemas. Los sistemas de expresión alternativos incluirán sistemas de expresión de células de mamíferos tales como células de ovario de hamster chino (CHO) (Barsoum, J. (1995, Methods in Mol. Biol. 48, capítulo 18, 225-237) y células murinas NS-0 (Rossman, C. et al., 1996, Protein Expression and Pur. 7, 335-342) y células de riñón de mono COS7 (Ettinger, R. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 23, 13102-13107). Otros sistemas de expresión eucariotas que podrían aplicarse serían la levadura Pichia pastoris (Eldin, P.E. et al., 1997, J. Immun. Methods, 201, 67-75) y Saccharomyces cerevisiae (Horwitz, A.H., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682).

La cuantificación de los niveles de expresión de la proteína IFN-beta-1a-Fc en los sobrenadantes del cultivo de células EBNA 293 transfectadas se realizó mediante ELISA utilizando una fracción de IgG purificada con proteína A de anticuerpos policlonales de conejo anti-IFN-beta-1a (el antígeno fue IFN-beta-1a purificado, Biogen Inc.) para recubrir placas de 96 pocillos. El anticuerpo detecta IFN-beta-1a estándar y sobrenadantes de los cultivos en una concentración de interferón en el intervalo entre 10 ng/ml y 0,3 ng/ml. Se utilizaron anticuerpo policlonal de conejo anti-IFN-beta-1a biotinilado (los mismos anticuerpos anteriores) y peroxidasa de rábano unida a estreptavidina para detectar los interferones unidos. Para confirmar los valores de ELISA, se realizaron análisis por transferencia Western en los que sobrenadantes de los cultivos y estándar de IFN-beta-1a reducidos se corrieron en geles de Tris-glicina al 5-20% (Novex, San Diego, CA), se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Life Science, Inc., Cleveland, OH) y se detectaron con un suero policlonal de conejo diferente (producido frente a IFN-beta-1a), seguido de anticuerpos de burro anti-IgG de conejo unidos a peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoReaserach, West Grove, PA).

Ejemplo 4 Actividad Antiviral de la proteína de fusión IFN-beta-1a/IgG2a murina

Se pretrataron células de carcinoma de pulmón humano (A549) durante 24 horas con IFN-beta-1a o IFN-beta-IgG2a murina (61, 41, 27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 pg/ml) antes del ensayo con el virus de la encefalomiocarditis (EMCV). Después de dos días de incubación con el virus, las células viables se tiñeron con una disolución de XTT:PMS (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida sal interna: Fenazina metosulfato, a 333 \mug/ml y 2 ng/ml, respectivamente, en disolución salina tamponada con fosfato) y se detectaron mediante espectroscopía a 450 nm. El ensayo se realizó utilizando puntos de datos en triplicado para cada concentración de IFN.

En la Figura 8 se muestran las desviaciones estándar como barras de error. Se determinó el 50% del efecto citopático del IFN-beta-1a y se vio que era aproximadamente 0,4 pM. Se vio que el 50% del efecto citopático de IFN-beta-IgG2a murina era 0,15 pM.

Ejemplo 5 Construcción y Producción de una Proteína de Fusión Interferón-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana A. Construcción de la Proteína de Fusión Interferón-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana

Se utilizó tecnología PCR para crear un plásmido de expresión que codifica la secuencia de ADN de IFN beta humano fusionada con la parte Fc (dominios bisagra, CH2 y CH3) de la molécula de la cadena pesada de la IgG1 humana.

Construcción EBNA

El vector plasmídico pCH269 es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del que ha delecionado el gen de EBNA-1. El plásmido se utilizó para la construcción de un vector de expresión útil para la expresión transitoria de la proteína en células de riñón humano EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA; Shen E.S. et al., 1995, Gene 156: 235-239).

El casete de expresión de la proteína de fusión se construyó a partir de tres fragmentos de ADN: un fragmento Not I/Sal I que codifica la secuencia señal de VCAM-1 en marco y fusionada con la secuencia que codifica el IFN beta humano, un fragmento Sal I/Not I que codifica los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana y un fragmento Not I del vector de expresión EBNA pCH269.

Mediante tecnología PCR se obtuvieron dos fragmentos Not I/Sal I distintos que codifican la secuencia señal madura de VCAM-1 en marco y fusionada con el gen de IFN beta humano. El molde de PCR fue el plásmido pCMG258 (véase el Ejemplo 2 anterior) que codifica la secuencia señal madura de VCAM-1 en marco y fusionada con el gen de IFN beta humano, que por sí mismo está en marco y fusionado con la secuencia de enteroquinasa conectora. Se utilizaron dos conjuntos de cebadores de PCR. Un conjunto de cebadores (5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCT
CACTGGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 37) y 5'-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 38)) introdujo un cambio de aminoácidos de G a C en la posición 162. Este fragmento se denomina IFN beta-C 162 humano.

El segundo conjunto de cebadores (5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 39) y 5'-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 40)) también introdujo la sustitución de aminoácidos G 162 a C 162 y cambió la secuencia enteroquinasa conectora (DDDDK) a una secuencia conectora GGGGS en marco y fusionada en 3' con el gen de IFN beta humano. Este fragmento se denomina IFN-beta-C162/G4S humano. Ambos conjuntos de cebadores contienen un sitio Not I en 5' para permitir la ligación en pCH269 y un sitio de degradación Sal I en 3' para permitir la ligación con el fragmento Sal I/Not I de IgG1 humana.

El fragmento de IgG1 humana que codifica los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana se preparó mediante la digestión con enzimas de restricción (Sal I/Not I) del plásmido pEAG409, un derivado del plásmido SAB 144 (descrito en la Patente de EEUU 5.547.853). El fragmento se escindió y se purificó en gel. El vector plasmídico de expresión EBNA pCH269 se digirió con Not I y se purificó en gel.

Se generaron dos construcciones de fusión IFN-beta humano Fc de IgG humana mediante dos ligaciones de tres vías. Una construcción, denominada ZL6206 contiene el conector G4S; la otra construcción, denominada ZL5107, es una fusión directa. Las secuencias completas de ADN y proteína de los marcos de lectura abiertos de la fusión directa (véase la Figura 10) se muestran en la SEQ ID NO: 41 y en la SEQ ID NO: 42, respectivamente. Las secuencias completas de ADN y proteína de los marcos de lectura abiertos de la fusión con conector (véase la Figura 11) se muestran en la SEQ ID NO: 43 y en la SEQ ID NO: 44, respectivamente.

Construcción CHO

Se obtuvo una construcción que se expresaba de manera estable en CHO de la fusión IFN beta humano-Fc de IgG1 humana que estaba comprendida por IFN beta humano unido directamente a Fc de IgG1 humana. El fragmento IFN beta humano-Fc de IgG1 humana se cortó del plásmido ZL5107 con Not I y se purificó en gel; se ligó en el sitio Not I de pEAG347 (un vector de expresión que contiene en tándem los promotores tempranos de SV40 y principales tardíos de Adenovirus [obtenido del plásmido pAD2beta], un sitio de clonación único Not I, seguido de señales tardías de terminación de la transcripción y poliA de SV40 [obtenidas del plásmido pCMVbeta]. pEAG347 contiene un núcleo de plásmido obtenido de pUC19 y dhfr obtenida de pSV2dhfr para la selección en MTX y amplificación en células CHO transfectadas).

B. Producción de la proteína de fusión interferón-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana en células de mamífero Transfección transitoria de las construcciones de fusión del IFN beta humano en células EBNA293

Los vectores de expresión recombinantes IFN-beta/Fc de IgG1 humana descritos anteriormente se transfectaron de manera transitoria en células de riñón humano EBNA 293 para conseguir la expresión de una proteína de fusión IFN-beta-1a de la invención. Estos plásmidos de expresión recombinantes se transfectaron mediante el protocolo de la lipofectamina (catálogo #18324-020, Life Technologies) en células de riñón humano EBNA 293 según el protocolo descrito en el Ejemplo 3 anterior.

Transfección estable de la construcción de fusión IFN-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana (sin conector) en células CHO dhfr-

El vector de expresión recombinante IFN-beta/Fc de IgG1 humana (sin conector) que contiene dhfr descrito anteriormente se transfectó de manera estable en células CHO dhfr- para conseguir la expresión de una proteína de fusión IFN-beta-1a de la invención. Este plásmido de expresión recombinante se transfectó mediante electroporación y la selección de los clones positivos se logró según el protocolo siguiente:

El ADN del plásmido (20 microgramos) digerido con BgIII se precipitó, se resuspendió en 800 \mul de tampón HEPES y se añadió a 10 x 10^{7} células CHO/ml. Después de la electroporación, las células se cultivaron en medio DMEM completo durante 2 días. Las células se dividieron en 20-40 placas de 10 cm con DMEM completo/10% de FBS dializado y se cultivaron durante 5 días antes de poner las células en medio selectivo con concentraciones crecientes (50-200 ng/ml) de MTX en DMEM durante dos semanas. Al final de las dos semanas, se seleccionaron y expandieron colonias individuales de células. Los sobrenadantes obtenidos de 22 clones de CHO se ensayaron en ensayos antivirales.

Actividad

La actividad antiviral de las proteínas de fusión se determinó en ensayos CPE como se describe en el Ejemplo 4. Tomando como base la actividad específica de 60 MU/mg del interferón-beta-1a estándar utilizado en el ensayo, la actividad de la proteína de fusión expresada de manera transitoria (EBNA) interferón-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana con el conector fue 900 U/ml y la actividad sin el conector fue 440 U/ml. La actividad de la proteína de fusión interferón-beta-1a humano/Fc de IgG1 humana expresada en CHO fue 50 U/ml.

Ejemplo 6 Determinación de la actividad antiviral del interferón-beta-1a en el plasma de ratones tratados con interferón-beta-1a y la proteína de fusión interferón-beta-1a/IgG2a murina

Se inyectaron por vía i.v. a ratones (C57/B 16) en la vena de la cola 50.000 Unidades de interferón-beta-1a ó 5.000 Unidades de la proteína de fusión interferón-beta-1a-IgG2a murina. Se proporcionó un volumen igual de tampón fosfato como control.

La sangre se recogió mediante sangrados retro-orbitales a diferentes tiempos (inmediatamente, 0,25, 1, 4, 24 y 48 horas) después de la inyección de interferón beta. Se utilizaron al menos 3 ratones por tiempo. La sangre completa se recoge en tubos que contienen anticoagulante, las células se eliminan y el plasma resultante se congela hasta el momento del ensayo. Las muestras de plasma se diluyen 1:10 en medio de ensayo sin suero y se pasan a través de un filtro de jeringa de 0,2 \mum.

Las muestras diluidas se titulan en pocillos designados de una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contiene células A549. Un interferón-beta-1a estándar (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 y 0,6 U/ml de AVONEX) y 4 muestras se corrieron en cada placa. Las células se pretrataron con muestras durante 24 horas antes del ensayo con el virus EMC. Después de una incubación de dos días con el virus, las células viables se tiñeron con una disolución de MTT (a 5 mg/ml en tampón fosfato) durante 1 hora, se lavaron con tampón fosfato y se solubilizaron con HCl 1,2 N en isopropanol. Los pocillos se leyeron a 450 nm. Se generaron curvas estándar para cada placa y se utilizaron para determinar la cantidad de actividad interferón-beta-1a en cada muestra. La actividad en las muestras de los diferentes ratones se representa frente a los diferentes tiempos en la Figura 9.

La pérdida más lenta de la fusión de interferón-beta-1a de la circulación en función del tiempo indica que la vida media de la muestra de la proteína de fusión es mucho más larga que la del interferón-beta-1a sin modificar utilizado como control. Un segundo descubrimiento muy significativo del estudio fue que se perdió muy poca proteína de fusión durante la fase de distribución, como se demuestra por los niveles altos similares de actividad en los tiempos 15 y 60 minutos. Los datos indican que, al contrario que el interferón-beta-1a control, la distribución de la proteína de fusión de interferón-beta-1a está muy limitada al sistema vascular.

Ejemplo 7 Farmacocinéticas y Farmacodinámicas Comparadas en Primates

Se realizaron estudios comparativos con la fusión de interferón-beta-1a y el interferón-beta-1a nativo (como intermedio no formulado AVONEX® interferón-beta-1a en 100 mM fosfato sódico, 200 mM NaCl, pH 7,2) para determinar su estabilidad y actividad relativas en primates. En estos estudios, se comparan las farmacocinéticas y las farmacodinámicas de la fusión de interferón-beta-1a en primates con las del interferón-beta-1a nativo y pueden extenderse razonables inferencias a los seres humanos.

Animales y Métodos Diseño del Estudio

Este es un estudio paralelo de dosis repetidas para evaluar las farmacocinéticas y farmacodinámicas comparadas de la proteína de fusión de interferón-beta-1a y el interferón-beta-1a no fusionado.

En este estudio se utilizan primates sanos (preferiblemente monos rhesus). Antes de la dosificación, todos los animales serán evaluados para detectar signos de mala salud por un Veterinario de Animales de Laboratorio en dos ocasiones dentro de los 14 días anteriores a la administración del compuesto de ensayo; una evaluación debe realizarse en las 24 horas anteriores a la primera administración del compuesto de ensayo. Sólo los animales sanos recibirán el compuesto de ensayo. Las evaluaciones incluirán un examen físico general y obtención de sangre antes de la dosificación para una línea base de la patología clínica y un nivel basal de los niveles de anticuerpos frente al interferón-beta-1a. Todos los animales se pesarán y se registrarán las temperaturas corporales en las 24 horas anteriores a las administraciones de los compuestos de ensayo.

Participaron doce sujetos que se distribuyeron en grupos de tres para recibir 1 MU/kg de interferón-beta-1a bien en forma fusionada o no fusionada, pero en cualquier caso el mismo interferón-beta-1a. La administración es por vía subcutánea (SC) o intravenosa (IV). Seis animales macho recibirán el compuesto de ensayo por vía IV (3/tratamiento) y otros 6 animales macho recibirán el compuesto de ensayo por vía SC (3/tratamiento). Ninguno de los animales debe haber sido tratado previamente con interferón-beta. Cada animal recibirá dosis en dos ocasiones; las dosificaciones se separarán cuatro semanas. El volumen de la dosificación será 1,0 ml/kg.

La sangre se recoge para ensayo farmacocinético a las 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas después de cada inyección. Las muestras de sangre para las determinaciones del marcador de la respuesta biológica inducida por el interferón, neopterina sérica, se recogen a las 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 y 504 horas después de la administración del compuesto de estudio.

Las evaluaciones durante el periodo del estudio incluyen observaciones clínicas realizadas 30 minutos y 1 hora después de la dosificación para detectar signos de toxicidad. Se realizarán observaciones diarias y se registrarán la apariencia general, signos de toxicidad, malestar y cambios en el comportamiento. Los pesos corporales y las temperaturas corporales se registrarán a intervalos regulares durante 21 días después de la dosificación.

Métodos de Ensayo

Los niveles de interferón beta en el suero se cuantifican utilizando el ensayo del efecto citopático (CPE). El ensayo CPE determina los niveles de la actividad antiviral mediada por interferón. El nivel de la actividad antiviral en una muestra refleja el número de moléculas de interferón activo contenido en esa muestra en el momento en el que se recoge la sangre. Este método ha sido el método estándar para evaluar las farmacocinéticas del interferón beta. El ensayo CPE utilizado en los presentes estudios detecta la capacidad del interferón beta para proteger células de carcinoma de pulmón humano (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) frente a la citotoxicidad debida al virus de la encefalomiocarditis (EMC). Las células se preincuban durante 15 a 20 horas con muestras de suero para permitir la inducción y síntesis de proteínas inducibles por interferón que producen una respuesta antiviral. Después, se añade el virus EMC y se incuba durante 30 horas adicionales antes de realizarse la evaluación de la citotoxicidad utilizando una tinción con cristal violeta. En cada placa de ensayo se ensaya conjuntamente con las muestras un estándar interno de interferón beta así como un estándar interno de interferón-beta-Ig. Este estándar se calibra frente a un estándar de referencia del interferón natural de fibroblastos humanos (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Cada placa de ensayo también incluye pocillos control del crecimiento celular que no contienen interferón beta de ninguna clase ni EMC, y los pocillos control del virus contienen células y EMC pero no interferón beta. También se preparan placas control que contienen el estándar y las muestras para determinar el efecto, si existe, de las muestras en el crecimiento celular. Estas placas se tiñen sin la adición del virus.

Las muestras y los estándar se ensayan en duplicado en cada una de dos placas de ensayo duplicadas, lo que rinde cuatro datos por muestra. Se muestra la media geométrica de la concentración de cuatro réplicas. El límite de la detección en este ensayo es 10 unidades (U)/ml.

Las concentraciones séricas de neopterina se determinan en la unidad de clínica farmacológica utilizando ensayos que están disponibles comercialmente.

Métodos Farmacocinéticos y Estadísticos

Se utiliza el programa RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para ajustar los datos a modelos farmacocinéticos. Las medias geométricas de las concentraciones se representan frente al tiempo para cada grupo. Debido a que los resultados del ensayo están expresados en diluciones, las medias geométricas se consideran más apropiadas que las medias aritméticas. Los niveles de interferón en el suero se ajustan con los valores basales y las concentraciones en suero no detectables se fijan en 5 U/ml lo que representa la mitad del límite más bajo de detección.

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Para los datos de infusión IV, se ajusta un modelo de infusión IV de dos compartimentos a las concentraciones detectables en suero para cada sujeto y los datos SC se ajustan a un modelo de inyección de dos compartimentos.

Se calculan los parámetros farmacocinéticos siguientes:

(i): concentración observada en el pico, C_{max} (U/ml);

(ii): área bajo la curva de 0 a 48 horas, AUC utilizando la regla trapezoidal;

(iii): vida media de eliminación;

y, de los datos de infusión IV (si se utiliza IV):

(iv): vida media de distribución (h);

(v): aclaramiento (ml/h);

(vi): volumen aparente de distribución, Vd (L).

Se utiliza el programa WinNonlin (Versión 1.0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC) para calcular las vidas medias de eliminación después de inyección SC e IV.

Para la neopterina, se presentan las medias aritméticas por tiempo para cada grupo. Se calcula E_{max}, el cambio máximo respecto a la línea base. C_{max}, AUC y E_{max} se someten a un análisis de varianza de una vía para comparar los grupos de dosificación. C_{max} y AUC se transforman logarítmicamente antes del análisis; se muestran las medias geométricas.

Ejemplo 8 Efectos Anti-Angiogénicos de la Fusión de Interferón-Beta-1a Evaluación de la capacidad de una Fusión de interferón-beta-1a para inhibir la proliferación in vitro de las células endoteliales

Las células endoteliales venosas humanas (Cell Systems, Cat. #2V0-P75) y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Cat. #2M1-C25) se mantienen en cultivo con CS-C Medium Kit (Cell Systems, Cat. #4Z0-500). Veinticuatro horas antes del experimento, las células se tripsinizan y se resuspenden en el medio de ensayo, 90% M199 y 10% de suero fetal bovino (FBS) y se ajustan a la densidad celular deseada. Las células se ponen en placas recubiertas de gelatina de 24 ó 96 pocillos bien a 12.500 células/pocillo ó 2.000 células/pocillo, respecti-
vamente.

Después de incubar durante toda la noche, el medio de ensayo se reemplaza por medio fresco que contiene 20 ng/ml de Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico recombinante humano (Becton Dickinson, Cat. #40060) y diferentes concentraciones de proteínas interferón-beta-1a de fusión o no o control positivo (puede utilizarse endostatina como control positivo, así como un anticuerpo frente a bFGF). El volumen final se ajusta a 0,5 ml en la placa de 24 pocillos o a 0,2 ml en la placa de 96 pocillos.

Después de setenta y dos horas, las células se tripsinizan para contaje con Coulter, se congelan para lectura por fluorescencia con CyQuant o se marcan con [3H] timidina.

Este ensayo in vitro ensaya las moléculas de interferón-beta humano de la invención para evaluar efectos en la proliferación de las células endoteliales que pueden ser indicativos de efectos angiogénicos in vivo. Véase O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, y J. Folkman. (1997). Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88: 277-285.

Ejemplo 9 Modelo In Vivo para Ensayar los Efectos Anti-Angiogénicos y Anti-Neovascularización de la Fusión Interferón-beta-1a/Ig

Se han desarrollado distintos modelos para ensayar los efectos anti-angiogénicos y anti-neovascularización de las moléculas descritas en la presente memoria. Algunos de estos modelos se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos 5.733.876 (31 mar. 1998: "Method of inhibiting angiogenesis") y 5.135.919 (4 ago. 1992: "Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis"). Otros ensayos incluyen el ensayo de la membrana corioalantoica sin cubierta (CAM) de S. Taylor y J. Folkman; Nature, 297, 307 (1982) y R. Crum, S. Szabo y J. Folkman; Science, 230, 1375 (1985); el modelo de angiogénesis del método del saco aéreo dorsal de ratones de Folkman, J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275 (1971) y el ensayo de la microbolsa corneal de rata de Gimbrone, M.A. Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 413 (1974) en el que se induce la vascularización corneal en ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley (Charles River, Japón) implantando 500 ng de FGF básico (bovino, R&D Systems, Inc.) impregnado con gránulos de EVA (copolímero etileno-acetato de vinilo) en cada córnea.

Otros métodos para ensayar los efectos anti-angiogénicos de las fusiones interferón-beta/Ig en un modelo animal incluyen (pero no están limitados a) protocolos para rastrear agentes anticancerígenos potenciales como se describe en el original Cancer Chemotherapy Reports, Parte 3, Vol. 3, No. 2, septiembre 1972 y en el suplemento In Vivo Cancer Models, 1976-1982, Publicación NIH No. 84-2635, febrero 1984. Debido a las barreras entre especies de los interferones de Tipo I, para evaluar la actividad anti-angiogénica de las fusiones de interferón-beta en modelos de roedores, se generan preparaciones de la fusión interferón-beta/Ig de roedores. Dichos métodos de rastreo están ejemplificados mediante un protocolo para ensayar los efectos anti-angiogénicos de fusiones murinas de interferón-beta/Ig en Carcinoma de Pulmón de Lewis implantado subcutáneamente.

Origen de la Línea Tumoral

Surgió espontáneamente en 1951 como un carcinoma de pulmón en un ratón C57BL/6. Resumen de los Procedimientos de Ensayo: Se implanta subcutáneamente un fragmento del tumor en la región axilar de un ratón B6D2F1. El compuesto de ensayo (es decir, una proteína de fusión de la invención) se administra a diferentes dosis, subcutáneamente (SC) o intraperitonealmente (IP) en múltiples días después del implante del tumor. El parámetro determinado es el tiempo de supervivencia medio. Los resultados se expresan como porcentaje del tiempo de supervivencia control.

Animales

Propagación: Ratones C57BL/6.

Ensayo: Ratones B6D2F1.

Peso: Los ratones deben estar en un intervalo de peso de 3 g con un peso mínimo de 18 g para los machos y 17 g para las hembras.

Sexo: Se utiliza un sexo para todos los animales de ensayo y control en un experimento.

Fuente: Una fuente, si es posible, para todos los animales en un experimento.

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Tamaño del Experimento

Diez animales por cada grupo de ensayo.

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Transferencia del Tumor Propagación

: Fragmento: Preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor donante s.c.

: Tiempo: Días 13-15.

: Sitio: Implantar el fragmento s.c. en la región axilar con una punción en la región inguinal.

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Ensayo

: Fragmento: Preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor donante s.c.

: Tiempo: Días 13-15.

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Esquema del Ensayo

Día 0: Implantar el tumor. Realizar cultivos bacterianos. Ensayar el compuesto utilizado como control positivo en cada experimento con numeración impar. Preparar los materiales. Registrar las muertes diariamente.

Día 1: Chequear los cultivos. Desechar el experimento si está contaminado. Distribuir los animales aleatoriamente. Tratar como se ha indicado (en el día 1 y en los días siguientes).

Día 2: Volver a chequear los cultivos. Desechar el experimento si está contaminado.

Día 5: Ponderar la evaluación de la toxicidad del agente de ensayo en el Día 2 y en el día de la evaluación inicial.

Día 14: Día del control de muertes tempranas.

Día 48: Día de control sin toma.

Día 60: Terminar y evaluar el experimento. Examinar los pulmones por encima para detectar tumor.

Control de Calidad

Planear el compuesto utilizado como control positivo (NSC 26271 (Citoxán a una dosis de 100 mg/kg/inyección)) en cada experimento con numeración impar, siendo su régimen intraperitoneal en el Día 1 sólo. El límite más bajo de Ensayo/Control para el control positivo es 140%. El tiempo de supervivencia medio aceptable para los controles sin tratar es 19-35,6 días.

Evaluación

El parámetro determinado es el tiempo de supervivencia medio. Calcular los pesos corporales medios de los animales en el Día 1 y Día 5, calcular la relación Ensayo/Control para todos los grupos de ensayo. Se calculan los pesos corporales medios de los animales en el día del inicio y el día de la evaluación final. La relación Ensayo/Control se calcula para todos los grupos de ensayo con >65% de supervivientes en el Día 5. Un valor de la relación Ensayo/Control <86% indica toxicidad. Una diferencia excesiva en el cambio del peso corporal (ensayo menos control) también puede utilizarse para evaluar la toxicidad.

Criterios para Actividad

Una relación Ensayo/Control inicial mayor que o igual a 140% se considera necesaria para demostrar una actividad moderada. Un valor de la relación Ensayo/Control reproducible mayor que o igual a 150% se considera actividad significativa.

Claims

1. Un polipéptido que comprende:

(a) un mutante de interferón-beta-1a (IFN-\beta) seleccionado del grupo que consiste en mutantes de IFN-\beta que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 como A1, B1, C1, CD1 y CD2; y

(b) un dominio bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana.

3. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la inmunoglobulina es una IgG.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, en el que la IgG es IgG1.

5. El polipéptido de la reivindicación 4 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 10.

6. El polipéptido de la reivindicación 4 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 11.

7. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido está glicosilado en un aminoácido de la secuencia de aminoácidos.

8. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el polipéptido comprende además un derivado.

9. El polipéptido de la reivindicación 8, en el que el derivado comprende un polímero de polialquilglicol.

10. El polipéptido de la reivindicación 9, en el que el polímero de polialquilglicol está acoplado al extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos.

11. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Una célula anfitriona transformada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Un método para proporcionar el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende crecer la célula anfitriona de la reivindicación 12 en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y aislar dicho polipéptido expresado.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz desde un punto de vista terapéutico del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. Utilización de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de un medicamento.

16. Utilización de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias, autoinmunes, angiogénicas, tumorales o virales.

17. La utilización de la reivindicación 16, en la que dicha enfermedad viral es infección por ECM, gripe, infección del tracto respiratorio, rabia o hepatitis.

18. La utilización de la reivindicación 16, en la que dicha enfermedad autoinmune es lupus o esclerosis múltiple.

19. La utilización de la reivindicación 16, en la que dicha enfermedad inflamatoria es fibrosis.

20. La utilización de la reivindicación 16, en la que dicha enfermedad angiogénica es retinopatía diabética, retinopatía de los prematuros, degeneración macular, rechazo de injertos de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis o Síndrome de Osler-Webber.

21. La utilización de la reivindicación 16, en la que dicha enfermedad tumoral es sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma de mama, melanoma, carcinoma nasofaríngeo o hemangioma.