ES2257884T3 - Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos. - Google Patents
Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos.Info
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Abstract
Una composición que comprende un interferón-beta- 1a glicosilado (IFN-â) que comprende la secuencia de aminoácidos MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLW QLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNE TIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSH CAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN acoplada a un polímero que no se da en la naturaleza en un extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a glicosilado, y dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.
Description
Conjugados de polímero e
interferón-\beta-1a y sus
usos.
El uso de polipéptidos y proteínas para el
tratamiento sistémico de enfermedades específicas está bien aceptado
actualmente en la práctica médica. El papel que juegan estas
sustancias en la terapia es tan importante que muchas actividades
investigadoras se están dirigiendo hacia la síntesis de grandes
cantidades mediante técnicas de ADN recombinante. Muchos de estos
polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y
específicas al desencadenar sus acciones biológicas.
Un factor importante que limita la utilidad de
estas sustancias proteicas para su aplicación deseada es que, cuando
se administran de forma parenteral, se eliminan del cuerpo en un
corto periodo de tiempo. Esto puede ocurrir como resultado del
metabolismo de proteasas o por el aclaramiento, que usa rutas
normales para la eliminación de proteínas tales como la filtración
en los riñones. La vía de administración oral de estas sustancias es
incluso más problemática, porque, además de la proteolisis en el
estómago, la elevada acidez del estómago las destruye antes de que
alcancen su tejido de destino. Los problemas asociados con estas
vías de administración de proteínas se conocen bien en la industria
farmacéutica, y se están usando diversas estrategias en intentos
para resolverlas.
Se han publicado muchos trabajos que se ocupan de
la estabilización de proteínas. Se conocen diversas formas de
conjugar proteínas con materiales poliméricos, que incluyen el uso
de dextranos, polivinilpirrolidonas, glucopéptidos, polietilenglicol
y poliaminoácidos. Se ha informado que los polipéptidos conjugados
resultantes mantienen sus actividades biológicas y la solubilidad
en agua para aplicaciones parenterales.
Una familia de péptidos que ha sido el centro de
mucho trabajo clínico y esfuerzos para mejorar su administración y
bioasimilación son los interferones. Los interferones se han
ensayado en una diversidad de enfermedades clínicas. El uso de
interferón beta humano, un miembro de esa familia, es el mejor
establecido en el tratamiento de esclerosis múltiple. Recientemente
se ha autorizado la comercialización de dos formas de interferón
beta recombinante en Europa y EE.UU. para el tratamiento de esta
enfermedad. Una forma es
interferón-beta-1a (denominado
comercialmente y vendido como AVONEX®, fabric. Biogen, Inc.,
Cambridge, MA) y en lo sucesivo
"interferón-beta-1a" o
"IFN-beta-1a" o
"IFN-\beta-1a" o
"interferón-\beta-1a", usados
de forma intercambiable. La otra forma es
interferón-beta-1b (denominado
comercialmente y vendido como BETASERON®, Berlex, Richmond, CA), en
lo sucesivo,
"interferón-beta-1b".
Interferón-beta-1a se produce en las
células mamíferas usando la secuencia del gen humano natural y está
glicosilado, mientras
interferón-beta-1b se produce en
bacterias E. coli usando una secuencia modificada del gen
humano que contiene una sustitución de cisteína a serina introducida
mediante ingeniería genética en la posición del aminoácido 17 y no
está glicosilado.
Previamente, se han comparado directamente las
potencias in vitro relativas de
interferón-beta-1a e interferón beta
1b en análisis funcionales y se ha demostrado que la actividad
específica de interferón-beta-1a es
aproximadamente 10 veces mayor que la actividad específica de
interferón-beta-1b (Runkel et
al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). A partir de
estudios diseñados para identificar la base estructural de estas
diferencias de actividad, se ha identificado la glicosilación como
la única de las diferencias estructurales conocidas entre los
productos que afecta a la actividad específica. El efecto del
hidrato de carbono se manifiesta en gran medida por medio de su
papel estabilizante de la estructura. El efecto estabilizante del
hidrato de carbono fue evidente en experimentos de desnaturalización
térmica y análisis SEC. La falta de glicosilación también se
correlacionó con un incremento en la agregación y una sensibilidad
incrementada a la desnaturalización térmica. La eliminación
enzimática del hidrato de carbono de
interferón-beta-1a con PNGasa F
provocó la precipitación considerable del producto
desglicosilado.
Estos estudios indican que, a pesar de la
conservación de secuencias entre
interferón-beta-1a e
interferón-beta-1b, son entidades
bioquímicas distintas, y por lo tanto gran parte de lo que se sabe
sobre interferón-beta-1b no se puede
aplicar a interferón-beta-1a, y
viceversa.
Se han aprovechado las ventajas del
interferón-beta glicosilado respecto de las formas
sin glicosilar. En particular, se ha desarrollado una composición de
interferón-beta-1a con actividad
incrementada respecto de
interferón-beta-1b, y que también
tiene las propiedades convenientes de las proteínas pegiladas en
general sin pérdida efectiva de actividad comparado con las formas
de interferón-beta-1a que no están
conjugadas. Así, si se hacen modificaciones de tal forma que los
productos (conjugados de
polímero-interferón-beta-1a)
mantienen todas o casi todas sus actividades biológicas, pueden
darse como resultado las siguientes propiedades: farmacocinética y
farmacodinámica alteradas que llevan a una semivida incrementada y a
alteraciones en la distribución tisular (p.ej., capacidad para
permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos),
estabilidad incrementada en disolución, inmunogenicidad reducida,
protección de la digestión proteolítica y de la supresión posterior
de la actividad. Tal formulación es un avance sustancial en las
técnicas farmacéutica y médica, y haría una contribución
significativa al tratamiento de diversas enfermedades en las que el
interferón tiene cierta utilidad, tales como esclerosis múltiple,
fibrosis, y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes,
cánceres, hepatitis y otras enfermedades víricas. En particular, la
capacidad para permanecer durante períodos de tiempo más largos en
la vasculatura permite que se use
interferón-beta-1a para inhibir la
angiogénesis y potencialmente atravesar la barrera
hematoencefálica. Además, la estabilidad térmica adquirida creando
conjugados de
polímero-interferón-beta-1a
es una ventaja cuando se formula
interferón-beta-1a en forma de polvo
para uso en la administración posterior por medio de inhalación.
Se usó el conocimiento de la estructura
cristalográfica de
interferón-beta-1a y se desarrolló
un conjugado de
interferón-beta-1a-polímero
en el que el polímero está unido a el/los sitio(s) de
interferón-beta-1a que permitirá(n)
que el conjugado mantenga la actividad completa del
interferón-beta-1a comparado con el
interferón-beta-1a que no está
conjugado.
Un aspecto de la invención es un complejo de
interferón-beta-1a conjugado, en el
que el interferón-beta-1a está unido
de forma covalente a un polímero que incorpora como parte integral
suya un polialquilenglicol.
En un aspecto particular, la presente invención
se refiere a una composición de
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo que comprende
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo acoplado a un polímero que comprende un resto de
polialquilenglicol, en el que el
interferón-beta-1a y el resto de
polialquilenglicol están dispuestos de forma que el
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo de la composición tiene una semivida aumentada respecto del
interferón-beta-1a solo (es decir,
en una forma sin conjugar desprovista del polímero acoplado a
él).
Otro aspecto de la invención es una composición
de interferón-beta-1a que comprende
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Tabla 1, acoplado a un polímero en el que el
interferón-beta-1a es una proteína
de fusión, preferiblemente una fusión con inmunoglobulina. En tal
complejo, la estrecha proximidad del extremo
N-terminal (sitio de conjugación con el polímero) y
el extremo C-terminal (sitio de fusión con el resto
Ig) sugiere que la conjugación del polímero puede reducir la
inmunogenicidad de la proteína de fusión.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a una composición de
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo que comprende
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Tabla 1, acoplado a un polímero, que comprende un resto de
polialquilenglicol, en el que el
interferón-beta-1a y el resto de
polialquilenglicol están dispuestos de forma que el
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo de la composición tiene una actividad aumentada respecto del
interferón-beta-1a solo (es decir,
en una forma sin conjugar desprovista del polímero acoplado a
él).
Otra realización de la invención es una proteína
conjugada de interferón-beta-1a cuyo
resto de interferón-beta-1a se ha
mutado para proporcionar muteínas con actividad antiviral y/o
antiproliferativa aumentada selectivamente respecto de las formas
sin mutar de interferón-beta-1a.
La invención se refiere en un aspecto adicional a
un complejo conjugado de
interferón-beta-1a estable e
hidrosoluble que comprende un
interferón-beta-1a fisiológicamente
activo, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Tabla 1, acoplado de forma covalente a un resto de polietilenglicol
fisiológicamente compatible. En tal complejo, el
interferón-beta-1a puede estar
acoplado de forma covalente al resto de polietilenglicol
fisiológicamente compatible mediante un enlace covalente lábil en un
grupo aminoácido libre del
interferón-beta-1a, en el que el
enlace covalente lábil se rompe in vivo mediante hidrólisis
bioquímica y/o proteolisis.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a una forma farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente
aceptable y un complejo de
interferón-beta-1a estable e
hidrosoluble como se definió anteriormente, que comprende
interferón-beta acoplado a un polietilenglicol
fisiológicamente compatible.
En otro aspecto, las composiciones de
interferón-beta-1a acoplado de forma
covalente, tales como las descritas anteriormente, pueden utilizar
interferón-beta-1a destinado a
aplicaciones diagnósticas o in vitro, en las que el
interferón-beta-1a es, por ejemplo,
un reactivo de diagnóstico para un inmunoanálisis u otras
aplicaciones diagnósticas o in vitro. En tales aplicaciones
no terapéuticas, los complejos de la invención se emplean de forma
muy útil como composiciones estabilizadas que se pueden formular,
por ejemplo, en disolventes compatibles u otras formulaciones
basadas en disoluciones para proporcionar formas compuestas estables
que tienen resistencia aumentada a la degradación.
La modificación de
interferón-beta-1a con un polímero
atóxico puede ofrecer ciertas ventajas. Si se hacen modificaciones
de forma que los productos (conjugados de
polímero-interferón-beta-1a)
mantienen todas o casi todas sus actividades biológicas, se puede
dar como resultado las siguientes propiedades: farmacocinética y
farmacodinámica alteradas, que conducen a una semivida incrementada
y a alteraciones en la distribución tisular (p.ej., capacidad para
permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos),
estabilidad incrementada en disolución, inmunogenicidad reducida,
protección de la forma modificada de interferón-beta
1a de la digestión proteolítica y de la eliminación posterior de la
actividad; estabilidad térmica incrementada que conduce a una
formulación más eficaz de
interferón-beta-1a en polvo para uso
oral o inhalado.
El
interferón-beta-1a dotado de las
propiedades mejoradas descritas anteriormente puede ser eficaz como
terapia después de la administración oral, en aerosol o parenteral.
Otras vías de administración, tales como nasal y transdérmica,
pueden ser posibles también usando el
interferón-beta-1a modificado.
En aplicaciones no terapéuticas (p.ej.,
diagnósticas), también se contempla la conjugación de especies
diagnósticas y/o reactivas de interferón-beta. El
agente conjugado resultante es resistente a factores degradativos
ambientales, que incluyen procesos de degradación mediados por
disolvente o por disolución. Como resultado de tal resistencia
aumentada y estabilidad incrementada del
interferón-beta-1a, la estabilidad
del ingrediente activo es capaz de incrementarse significativamente,
con fiabilidad concomitante de la composición que contiene
interferón-beta-1a en el uso final
específico para el que se emplea la misma.
Otros aspectos, características y modificaciones
de la invención serán aparentes de forma más completa a partir de la
descripción posterior y de las reivindicaciones adjuntas.
Figura
1
Las afinidades de unión de los mutantes de IFN
(A1 - E) sustituidos con alanina por la cadena del receptor IFNAR2
se determinaron como se describe en el Ejemplo 1 (subsección D). El
histograma presenta sus afinidades de unión en este análisis
respecto de his-IFN-beta de tipo
natural (% de t. n.). Los valores de % de t. n. se calcularon como
(afinidad de his-IFN-beta de tipo
natural)/afinidad de IFN-beta mutante x 100. Se
muestran el % de t. n. (O) para experimentos individuales (n = 3) y
un % de t. n. medio (x) para el grupo experimental. Los mutantes A2,
AB1, AB2 y E no se unieron a IFNAR2/Fc a concentraciones 500 veces
superiores que CE 50 de his-IFN-beta
de t. n. (*).
Figura
2
Las propiedades de unión a receptor de los
mutantes de sustitución con alanina (A1 - E) se determinaron usando
un ensayo de unión a receptor de superficie celular basado en FACS
como se describe en el Ejemplo 1 (subsección D). El histograma
presenta sus afinidades de unión a receptor en este análisis
respecto de his-IFN-beta de tipo
natural (% de t. n.). El % de t. n. para cada mutante se calculó
como (afinidad de his-IFN-beta de
tipo natural)/afinidad de IFN-beta mutante x 100. Se
muestran los valores de % de t. n. (O) para experimentos
individuales y una media de los valores de % de t. n. para el grupo
experimental (x).
Figura
3
Las actividades antivirales de los mutantes por
sustitución con alanina (A1 - E) se determinaron en células A549
humanas expuestas a virus de EMC como se describe en el Ejemplo 1
(subsección E). El histograma presenta sus actividades en este
análisis respecto de his-IFN-beta de
tipo natural (% de t. n.). El % de t. n. se calculó como
(concentración de his-IFN-beta de t.
n. [ECP del 50%]/concentración de IFN-beta mutante
[ECP del 50%] x 100. Se muestra el % de t. n. (O) para múltiples
análisis y la media del grupo de datos experimentales (x).
Figura
4
La actividad antiproliferativa de los mutantes
por sustitución con alanina (A1 - E) se determinó en células de
linfoma de Daudi Burkitt como se describe en el Ejemplo 1
(subsección E). El histograma presenta sus actividades en este
análisis respecto de his-IFN-beta de
tipo natural (% de t. n.). El % de t. n. se calculó como
(concentración de his-IFN-beta de
t. n. [50% de inhibición del crecimiento]/concentración de
IFN-beta mutante [50% de inhibición del crecimiento]
x 100. Se muestra el % de t. n. (O) para múltiples análisis y la
media del grupo de datos experimentales (x).
Figura
5
Se compararon las actividades relativas de los
mutantes de sustitución con alanina (A1 - E) en los análisis de
actividad antiviral (eje x) y de actividad antiproliferativa (eje
y). Se usó el porcentaje medio de
his-IFN-beta de tipo natural (% de
t. n., x) presentado en las figuras 3 y 4 para esta comparación. Los
mutantes que muestran un cambio coordinado en ambas actividades
estarían en la línea diagonal. Los mutantes que muestran un cambio
en la actividad antiviral que es desproporcionado respecto del
cambio en la actividad antiproliferativa se alejan
significativamente de la línea diagonal (DE1, D, C1). Se determinó
la significación estadística a partir de la consideración de las
desviaciones estándar inherentes en los valores medios de % de t. n.
usados.
Figura
6
Se sometió a
interferón-\beta-1a pegilado y sin
modificar a análisis de cartografía de péptidos. Las muestras se
digirieron con lisil-endopeptidasa y se sometieron a
HPLC de fase inversa en una columna C_{4}. La columna se
desarrolló con un gradiente 0-70% de acetonitrilo en
ácido trifluoroacético del 0,1%. El eluido de la columna se
monitorizó a 214 nm. Panel a,
interferón-\beta-1a sin modificar.
Panel b, interferón-\beta-1a
pegilado. Las flechas marcan la posición de elución del péptido de
lisil-endopeptidasa N-terminal de
interferón-\beta-1a que contiene
los residuos de aminoácido 1-19.
Figura
7
Se analizó la actividad de
interferón-beta-1a o
interferón-beta-1a PEGilado a las
concentraciones indicadas en el eje X en ensayos antivirales usando
células de carcinoma de pulmón (A549) humanas expuestas a virus de
encefalomiocarditis. Después de una incubación de dos días con
virus, las células viables se tiñeron con MTT, las placas se
leyeron a 450 nm y la absorbancia, que refleja la viabilidad
celular, se muestra en el eje Y. Las desviaciones estándar se
muestran como barras de error. La concentración de
interferón-beta-1a o
interferón-beta-1a PEGilado que
ofrecieron un 50% de destrucción viral (el "efecto citopático del
50%") (50% de DO_{450} máxima) fue de alrededor de 11 pg/ml, y
el efecto citopático del 50% para
interferón-beta-1a PEGilado fue de
alrededor de 11 pg/ml.
Figura
8
Se calentó
interferón-beta-1a PEGilado y
control de interferón-beta-1a sin
tratar en HEPES 20 mM de pH 7,5, NaCl 20 mM a una velocidad fija de
1 grado/minuto. Se siguió la desnaturalización monitorizando los
cambios en la absorbancia a 280 nm. (a)
interferón-beta-1a sin modificar (b)
interferón-beta-1a PEGilado.
Figura
9
Se inyectó de forma iv a los ratones 50.000
unidades de interferón-beta-1a o
50.000 unidades de
interferón-beta-1a pegilado (que
contenía PEG 20K). La sangre de estos ratones se obtiene por medio
de extracciones retroorbitales en diversos momentos después de la
inyección de interferón, como se indica en el eje X. Hay al menos 3
ratones a los que se les extrajo sangre en cada punto de tiempo, y
se prepara el plasma y se congela hasta que se analiza la actividad
de interferón-beta de ese momento en análisis
antivirales usando células de carcinoma de pulmón (A549) humanas
expuestas a virus de encefalomiocarditis. Las células viables se
tiñeron con una disolución de MTT, las placas se leyeron a 450 nm
para determinar la absorbancia que refleja la viabilidad celular y
la actividad de interferón-beta. Se generaron curvas
estándar para cada placa usando
interferón-beta-1a y se usaron para
determinar la cantidad de actividad de
interferón-beta en cada muestra. Se muestran los
datos de los animales individuales.
Figura
10
Se muestran las secuencias completas de ADN (ID
SEC Nº: 1) y de la proteína (ID SEC Nº: 2) de
interferón-beta-1a marcado con
histidina. La secuencia señal VCAM-1 escindida deja
3 residuos amino-terminales (SerGlyGly) en dirección
del extremo N-terminal de la señal de histidina
(His_{6}, posiciones 4-9). La secuencia ligadora
de enteroquinasa (AspAspAspAspLys) está separada de la señal de
histidina por un espaciador (posiciones 10-12,
SerSerGly). La secuencia proteica de
IFN-beta-1a natural abarca las
posiciones (Met18-Asn183).
Como se usa aquí, la expresión "acoplado de
forma covalente" significa que los restos especificados están
unidos de forma covalente directamente entre sí, o si no, están
unidos de forma covalente indirectamente entre sí por medio de un
resto o restos intermedios, tales como un resto o restos que actúan
de puente, espaciador o unión.
Interferón: Un "interferón" (también
denominado "IFN") es un polipéptido de cadena única pequeño y
específico de especie, producido por células mamíferas en respuesta
a la exposición a una diversidad de inductores, tales como virus,
polipéptidos, mitógenos y similares. El interferón más preferido
usado en la invención es un interferón-beta humano
glicosilado que está glicosilado en el residuo 80 (Asn 80) y que se
obtiene preferiblemente por medio de técnicas de ADN recombinante.
Este interferón-beta glicosilado preferido se llama
"interferón-beta-1a" o
"IFN-beta-1a" o
"IFN-\beta-1a" o
"interferón beta 1a" o
"interferón-\beta-1a", todos
usados de forma intercambiable. La expresión
"interferón-beta-1a" también
pretende abarcar sus mutantes (p.ej., Ejemplo 1), con tal que tales
mutantes también estén glicosilados en el residuo 80 (Asn 80). Se
conocen métodos de ADN recombinante para producir proteínas, que
incluyen interferones. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU.
4.399.216, 5.149.636, 5.179.017 (Axel et al) y 4.470.461
(Kaufman).
Los polinucleótidos de
interferón-beta-1a preferidos que se
pueden usar en los presentes métodos de la invención se derivan de
las secuencias génicas de interferón beta de tipo natural de
diversos vertebrados, preferiblemente mamíferos, y se obtienen
usando métodos que son bien conocidos para aquellos que tienen
experiencia ordinaria en la técnica, tales como los métodos
descritos en las siguientes patentes de EE.UU.: patente de EE.UU.
5.641.656 (expedida el 24 de jun. de 1997: ADN que codifica
proproteína de interferón de tipo I aviar e interferón de tipo I
aviar maduro), patente de EE.UU. 5.605.688 (25 de feb. de 1997,
interferones de tipo I recombinantes de perro y caballo); patente
de EE.UU. 5.231.176 (27 de jul. de 1993, molécula de ADN que
codifica un interferón de leucocitos humanos); patente de EE.UU.
5.071.761 (10 de dic. de 1991, secuencia de ADN que codifica
sub-secuencias de interferones linfoblastoides
humanos LyIFN-alfa-2 y
LyIFN-alfa-3); patente de EE.UU.
4.970.161 (13 de nov. de 1990, secuencia de ADN que codifica
interferón-gamma humano); patente de EE.UU.
4.738.931 (19 de abr. de 1988, ADN que contiene un gen de interferón
beta humano); patente de EE.UU. 4.695.543 (22 de sep. de 1987, gen
de alfa-interferón Gx-1 humano) y
patente de EE.UU. 4.456.748 (26 de jun. de 1984, ADN que codifica
sub-secuencias de interferones diferentes y
naturales de leucocitos).
Las mutaciones de
interferón-beta-1a se pueden usar de
acuerdo con esta invención. Las mutaciones se desarrollan usando
métodos convencionales de mutagénesis dirigida, conocida para
aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, la
invención proporciona polinucleótidos de
interferón-beta-1a funcionalmente
equivalentes que codifican polipéptidos de
interferón-beta-1a funcionalmente
equivalentes.
Un primer polinucleótido que codifica
interferón-beta-1a es
"funcionalmente equivalente" comparado con un segundo
polinucleótido que codifica
interferón-beta-1a si satisface al
menos una de las siguientes condiciones:
(a) el "equivalente funcional" es un primer
polinucleótido que hibrida con el segundo polinucleótido en
condiciones de hibridación estándar y/o es degenerado para la
primera secuencia polinucleotídica. Lo más preferiblemente, codifica
un interferón mutante que tiene la actividad de un
interferón-beta-1a;
(b) el "equivalente funcional" es un primer
polinucleótido que codifica la expresión de una secuencia de
aminoácidos codificada por el segundo polinucleótido.
En resumen, el término "interferón" incluye
los agentes enumerados anteriormente, así como sus equivalentes
funcionales. Como se usa aquí, la expresión "equivalente
funcional", por lo tanto, se refiere a una proteína de
interferón-beta-1a o a un
polinucleótido que codifica la proteína de
interferón-beta-1a que tiene el
mismo efecto beneficioso o un efecto beneficioso mejorado sobre el
receptor mamífero respecto del interferón del que se juzga que es un
equivalente funcional. Como apreciará alguien de experiencia
ordinaria en la técnica, una proteína funcionalmente equivalente se
puede producir mediante técnicas recombinantes, p.ej., expresando un
"ADN funcionalmente equivalente". Por lo tanto, la presente
invención abarca proteínas de
interferón-beta-1a codificadas por
ADNs naturales, así como por ADNs que no se dan de forma natural,
que codifican la misma proteína codificada por el ADN natural.
Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas
codificantes, se pueden usar otros polinucleótidos para codificar
interferón-beta-1a. Estos incluyen
todas las secuencias anteriores o partes de éstas, que se alteran
por la sustitución de diferentes códones que codifican el mismo
residuo de aminoácido dentro de la secuencia, lo que produce un
cambio sinónimo. Tales secuencias alteradas se consideran como
equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) se codifica
mediante dos códones, TTC o TTT, Tyr (Y) se codifica mediante TAC o
TAT e His (H) se codifica mediante CAC o CAT. Por otra parte, Trp
(W) se codifica mediante un único codon, TGG. Por lo tanto, se
apreciará que para una secuencia de ADN dada que codifica un
interferón particular existirán muchas secuencias degeneradas de ADN
que lo codificarán. Estas secuencias de ADN degeneradas se
consideran dentro del alcance de esta invención.
"Fusión": Se refiere a una unión colineal de
dos o más proteínas o sus fragmentos por medio de sus esqueletos
peptídicos individuales a través de la expresión genética de una
molécula polinucleotídica que codifica esas proteínas. Se prefiere
que las proteínas o sus fragmentos sean de diferentes fuentes. Así,
las proteínas de fusión preferidas incluyen una proteína de
interferón-beta-1a o un fragmento
conectado de forma covalente a un segundo resto que no es un
interferón. Específicamente, una "fusión
interferón-beta-1a/Ig" es una
proteína que comprende una molécula de
interferón-beta-1a de la invención,
o un fragmento suyo, conectado a un extremo
N-terminal de una cadena de inmunoglo-
bulina, en la que una parte del extremo N-terminal de la inmunoglobulina está sustituida con el interferón-beta-1a.
bulina, en la que una parte del extremo N-terminal de la inmunoglobulina está sustituida con el interferón-beta-1a.
"Recombinante", como se usa aquí, significa
que una proteína se obtiene de sistemas de expresión recombinantes
mamíferos. La proteína expresada de la mayoría de los cultivos
bacterianos, p.ej. E. coli, carecerá de glicano, por lo tanto
no se prefieren estos sistemas la expresión. La proteína expresada
en levadura puede tener estructuras oligosacáridas que son
diferentes de las que se expresan en células mamíferas.
"Biológicamente activo", como se usa a lo
largo de la memoria descriptiva como una característica de
interferón-beta 1a, significa que una molécula
particular comparte una homología de secuencia de aminoácidos
suficiente con las realizaciones de la presente invención descritas
aquí para ser capaz de mostrar actividad antiviral como se mide en
un análisis antiviral in vitro del tipo mostrado en el
Ejemplo 1 (véase más adelante).
Una "composición terapéutica", como se usa
aquí, se define por comprender las proteínas de la invención y otros
ingredientes fisiológicamente compatibles. La composición
terapéutica puede contener excipientes tales como agua, minerales y
vehículos tales como proteína.
Una "cantidad eficaz" de un agente de la
invención es la cantidad que produce un resultado o ejerce una
influencia en el trastorno particular que se está tratando.
"Aminoácido": Una unidad monomérica de un
péptido, polipéptido o proteína. Hay veinte aminoácidos que se
encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos
los cuales son isómeros L. El término también incluye los análogos
de los aminoácidos y los isómeros D de los aminoácidos proteicos y
sus análogos.
Un aminoácido "derivado" es un aminoácido
natural o no natural en el que la cadena lateral o grupo terminal
normal está modificado mediante reacción química. Tales
modificaciones incluyen, por ejemplo,
gamma-carboxilación,
beta-carboxilación, sulfatación, sulfonación,
fosforilación, amidación, esterificación,
N-acetilación, carbobencilación, tosilación y otras
modificaciones conocidas en la técnica. Un "polipéptido
derivado" es un polipéptido que contiene uno o más aminoácidos
derivados.
"Proteína": Cualquier polímero que consiste
esencialmente en cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque
"polipéptido" se usa a menudo refiriéndose a polipéptidos
relativamente grandes, y "péptido" se usa a menudo refiriéndose
a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se
solapa y es variado. El término "proteína", como se usa aquí,
se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se
indique de otra forma.
"Mutante": Cualquier cambio en el material
genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir,
deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia
polinucleotídica de tipo natural o cualquier cambio en una proteína
de tipo natural. El término "muteína" se usa de forma
intercambiable con "mutante".
"Tipo natural": La secuencia
polinucleotídica natural de un exón de una proteína, o de una
porción suya, o una secuencia proteica, o una porción suya,
respectivamente, como existe normalmente in vivo.
"Condiciones de hibridación estándar": Las
condiciones iónicas y de temperatura sustancialmente equivalentes a
0,5 x SCC a alrededor de 5 x SSC y 65ºC para hibridación y lavado.
La expresión "condiciones de hibridación estándar", como se usa
aquí, por tanto, es una definición operacional y abarca un intervalo
de condiciones de hibridación. Las condiciones de rigurosidad
superiores pueden incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de
cribado en placa (0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de Ficoll 400;
0,2% de albúmina de suero bovino, Tris-HCl 50 mM (pH
7,5); NaCl 1 mM; 0,1% de pirofosfato sódico; 1% de SDS); 10% de
sulfato de dextrano, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado y sonicado a 65ºC durante 12-20
horas, y lavar con NaCl 75 mM/citrato sódico 7,5 mM (0,5 x SCC)/1%
de SDS a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad inferiores pueden
incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de cribado en placa, 10%
de sulfato de dextrano y 110 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado y sonicado a 55ºC durante 12-20
horas, y lavar con NaCl 300 mM/citrato sódico 30 mM (2,0 x SCC)/1%
de SDS a 55ºC. Véase también Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, secciones
6.3.1-6.3.6, (1989).
"Secuencia de control de expresión": Una
secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de
genes cuando se une de forma operable a esos genes.
"Unido de forma operable": Una secuencia
polinucleotídica (ADN, ARN) está unida de forma operable a una
secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de
expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa
secuencia polinucleotídica. La expresión "unido de forma
operable" incluye tener una señal de inicio apropiada (p.ej.,
ATG) delante de la secuencia polinucleotídica a expresar, y mantener
el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la
secuencia polinucleotídica bajo el control de la secuencia de
control de expresión y la producción del polipéptido deseado
codificado por la secuencia polinucleotídica.
"Vector de expresión": Un polinucleótido,
tal como un plásmido de ADN o un fago (entre otros ejemplos comunes)
que permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de
expresión se introduce en una célula hospedadora. El vector puede o
no ser capaz de replicarse en una célula.
"Aislado" (usado de forma intercambiable con
"sustancialmente puro"): Cuando se aplica a ácidos nucleicos,
es decir, secuencias polinucleotídicas, que codifican polipéptidos,
significa un polinucleótido de ARN o ADN, porción de polinucleótidos
genómicos, cADN o polinucleótido sintético que, debido a su origen o
manipulación: (i) no está asociado con la totalidad de un
polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza (p.ej.,
está presente en una célula hospedadora como un vector de expresión,
o una porción suya); o (ii) está unido a un ácido nucleico u otro
resto químico distinto de al que está unido en la naturaleza; o
(iii) no se da en la naturaleza. Por "aislado" se quiere decir
además una secuencia polinucleotídica que: (i) se amplifica in
vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR); (ii) se sintetiza químicamente; (iii) se produce de forma
recombinante mediante clonado; o (iv) se purifica, mediante escisión
y separación en gel.
Así, "ácido nucleico sustancialmente puro"
es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo con una o
ambas secuencias codificantes con las que está normalmente contiguo
en el genoma natural del organismo del que procede el ácido
nucleico. El ADN sustancialmente puro también incluye un ADN
recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias
adicionales.
"Aislado" (usado de forma intercambiable con
"sustancialmente puro"): Cuando se aplica a polipéptidos
significa un polipéptido o una porción suya que, debido a su origen
o manipulación: (i) está presente en una célula hospedadora como el
producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o
(ii) está unido a una proteína u otro resto químico distinto de al
que está unido en la naturaleza; o (iii) no se da en la naturaleza.
Por "aislado" se quiere decir además una proteína que: (i) se
sintetiza químicamente; o (ii) se expresa en una célula hospedadora
y se purifica de las proteínas asociadas. El término significa
generalmente un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y
ácidos nucleicos con los que se da de forma natural.
Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias
tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) que se
usan para purificarlo.
"Promotor heterólogo": Como se usa aquí, es
un promotor que no está asociado de forma natural con un gen o con
un ácido nucleico purificado.
"Homólogo": Como se usa aquí, es sinónimo
del término "identidad", y se refiere a la similitud de
secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos
nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está
ocupada por la misma base o subunidad monómera de aminoácido (por
ejemplo, si una posición en las dos moléculas de ADN está ocupada
por adenina, o una posición en los dos polipéptidos está ocupada
por una lisina), entonces las moléculas respectivas son homólogas en
esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es
una función del número de coincidencias o posiciones homólogas
compartidas por las dos secuencias dividido por el número de
posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las
posiciones en dos secuencias son coincidentes o son homólogas,
entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. Como ejemplo,
las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de homología
(3 de las 6 posiciones totales son coincidentes). En general, se
hace una comparación cuando dos secuencias están alineadas para dar
una homología máxima. Tal alineación se puede proporcionar usando,
por ejemplo, el método de Needleman et al., J. Mol.
Biol. 48: 443-453 (1970), implementado
convenientemente mediante programas informáticos tales como el
programa Align (DNAstar, Inc.). Las secuencias homólogas comparten
residuos de aminoácidos idénticos o similares, en las que los
residuos similares son sustituciones conservativas, o "mutaciones
puntuales permitidas", de los residuos de aminoácidos
correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este
respecto, una "sustitución conservativa" de un residuo en una
secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son
físicamente o funcionalmente similares a los residuos de referencia
correspondientes, p.ej., que tienen similar tamaño, forma, carga
eléctrica, propiedades químicas, que incluyen la capacidad de formar
enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Las sustituciones
conservativas particularmente preferidas son las que cumplen los
criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en
Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and
Structure, 5: supl. 3, capítulo 22: 354-352,
Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).
Las expresiones "secuencia polinucleotídica"
y "secuencia nucleotídica" se usan también de forma
intercambiable aquí.
"Angiogénesis" y "neovascularización"
significan, en su sentido más amplio, la formación de vasos
sanguíneos nuevos. En particular, la angiogénesis también se refiere
a la formación de vasos sanguíneos nuevos en la localización de un
tumor.
"IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2" se
refieren a las proteínas que se sabe que componen el receptor de
interferón de tipo I de superficie celular. La parte extracelular
(ectodominio) de la cadena IFNAR2 sola puede unir interferón alfa o
beta.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de
biología celular, cultivo celular, biología molecular,
microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología,
las cuales están dentro de la experiencia en la técnica. Tales
técnicas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición.
(Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989; DNA Cloning, volúmenes I y II (D.N. Glover,
ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.),
1984; patente de EE.UU. nº 4.683.195 (Mullis et al.);
Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.),
1984; Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J.
Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney,
ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes,
IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B.
Perbal), 1984; Methods in Enzymology, volúmenes 154 y 155 (Wu
et al., eds), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer
Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, eds.),
1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in
Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds.), Academic
Press, Londres, 1987; Handbook of Experiment Immunology,
volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.),
1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1986.
El
interferón-beta-1a es útil como
agente para el tratamiento, remisión o atenuación de una enfermedad,
trastorno fisiológico, síntomas o factores etiológicos, o para su
evaluación o diagnóstico. La expresión también se refiere a
interferón-beta-1a que es parte de
una proteína de fusión, tal como una proteína de fusión
inmunoglobulina-interferón-beta-1a,
como se describe en la solicitud en tramitación junto con la
presente WO 00/23114. La preparación de proteínas de fusión en
general está dentro del conocimiento de las personas que tienen
experiencia ordinaria en la técnica.
Se ha(n) descubierto sitio(s)
único(s) para la unión de polímero que no
destruiría(n) la función de
interferón-beta-1a. Además, se han
usado métodos de mutagénesis dirigida para investigar de forma
independiente sitio(s) para la unión de polímero (véase el
Ejemplo 1). Brevemente, se ha emprendido un análisis mutacional de
interferón-beta-1a humano con el
propósito de cartografiar los residuos necesarios para la actividad
y la unión a receptor. La disponibilidad de la estructura cristalina
en 3D del interferón-beta-1a humano
(véase anteriormente y el Ejemplo 1) permite identificar, para
sustituciones con alanina (o serina), los residuos expuestos al
disolvente disponibles para las interacciones con el receptor de
interferón beta, y mantener los aminoácidos implicados en los
enlaces intramoleculares. Se diseñó un panel de quince mutaciones de
barrido de alaninas que sustituyeron entre dos y ocho residuos a lo
largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D,
E) y giros (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) de
interferón-beta-1a. Véase el Ejemplo
1.
Se incluyó una señal de histidina
amino-terminal (señal "his") para la
purificación por afinidad de los mutantes expresados en células
mamíferas (Figura 10 y ID SEC Ns: 1 y 2 para el cADN y las
secuencias de aminoácidos deducidas, respectivamente). Las
consecuencias funcionales de estas mutaciones se analizan en ensayos
antivirales y de antiproliferación. Se desarrolló un ensayo de unión
sin radiactividad para analizar la unión de estos mutantes al
receptor de superficie celular de interferón beta (receptor de
superficie celular IFNAR1/2). Además, se usó un análisis basado en
ELISA que emplea una proteína de fusión de ectodominio de IFNAR2/Ig
para unir interferón para cartografiar las interacciones de las
superficies entre interferón-beta-1a
e IFNAR2 (véase el Ejemplo 1). Estos análisis mutacionales
demostraron que los extremos N- y C-terminales se
encuentran en una porción de la molécula de
interferón-beta que no es importante para la unión a
receptor o la función biológica.
Los mutantes son variantes adicionales del resto
de interferón beta 1a de la invención que pueden ser particularmente
útiles, ya que exhiben propiedades nuevas que no se hallan en el
interferón-beta-1a de tipo natural
(véase el Ejemplo 1). Se han identificado tres tipos de efectos que
se causaron mediante mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser
ventajosos para el desarrollo de fármacos de interferón en ciertas
circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a)
mutantes con actividad antiviral superior que la del
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his (p.ej., mutante C1); (b) mutantes que exhiben
actividad tanto en ensayos antivirales como de antiproliferación,
pero para los que la actividad de antiproliferación es
desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antiviral,
comparado con el interferón-beta-1a
de tipo natural marcado con his (p.ej., mutantes C1, D y DE1); y (c)
antagonistas funcionales (p.ej., A1, B2, CD2 y DE1), que muestran
actividades antivirales y antiproliferativas que son
desproporcionadamente bajas con respecto a la unión a receptor,
comparadas con interferón-beta-1a de
tipo natural marcado con his.
Dentro del amplio alcance de la presente
invención, se puede emplear una única molécula de polímero para
conjugación con un interferón-beta 1a, aunque
también se contempla que se puede unir más de una molécula de
polímero. Las composiciones de interferón-beta 1a
conjugado de la invención pueden tener utilidad tanto en
aplicaciones in vivo como in vitro. Además, se
reconocerá que el polímero de conjugación puede utilizar otros
grupos, restos u otras especies conjugadas, según sea apropiado para
la aplicación final. A modo de ejemplo, puede ser útil en algunas
aplicaciones unir de forma covalente al polímero un resto funcional
que confiera resistencia a la degradación UV, o antioxidación, u
otras propiedades o características al polímero. Como ejemplo
adicional, puede ser ventajoso en algunas aplicaciones modificar el
polímero para hacerlo de carácter reactivo o entrecruzable, para
potenciar diversas propiedades o características del material
conjugado en su conjunto. Por lo tanto, el polímero puede contener
cualquier función, grupos repetitivos, uniones u otras estructuras
constituyentes que no impiden la eficacia de la composición de
interferón-beta 1a conjugado para su propósito
deseado. Otros objetivos y ventajas de la presente invención serán
aparentes de forma más completa a partir de la subsiguiente
descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Los polímeros ilustrativos que se pueden emplear
de forma útil para alcanzar estas características deseables se
describen aquí más adelante en los esquemas de reacción ejemplares.
En las aplicaciones de péptidos unidos de forma covalente, el
polímero se puede modificar y después se puede acoplar a
aminoácido(s) de el/los péptido(s) para formar
enlaces lábiles.
El
interferón-beta-1a se conjuga de
forma más preferible por medio de un grupo reactivo terminal del
polímero, aunque las conjugaciones también se pueden ramificar desde
los grupos reactivos que no son terminales. El polímero con el/los
grupo(s) reactivo(s) se designa aquí como "polímero
activado". El grupo reactivo reacciona de forma selectiva con
grupos amino libres u otros grupos reactivos de la proteína. El/los
polímero(s) activado(s) se hace(n) reaccionar
de forma que la unión puede darse en cualquier grupo amino
disponible de interferón-beta-1a,
tal como los grupos alfa amino o los grupos épsilon amino de las
lisinas. Los grupos carboxílicos libres, grupos carbonilo activados
de forma adecuada, hidroxilo, guanidilo, restos de hidratos de
carbono oxidados y grupos mercapto del
interferón-beta-1a (se están
disponibles) se pueden usar también como sitios de unión.
Aunque el polímero se puede unir en cualquier
parte de la molécula de interferón-beta 1a, el sitio
más preferido para el acoplamiento del polímero es el extremo
N-terminal del
interferón-beta-1a. Hay
sitio(s) secundario(s) en o cerca del extremo
C-terminal y en los restos de hidratos de carbono.
Así, la invención contempla como sus realizaciones más preferidas:
(i) conjugados de polímeros acoplados de forma
N-terminal de
interferón-beta-1a; (ii) conjugados
de polímeros acoplados de forma C-terminal de
interferón-beta-1a; (iii) conjugados
acoplados a hidratos de carbono de conjugados de polímeros; (iv) así
como conjugados de polímero acoplado a hidratos de carbono y a los
extremos N- y C-terminales de proteínas de fusión de
interferón-beta-1a.
En general, se emplean de alrededor de 1,0 a
alrededor de 10 moles de polímero activado por mol de proteína,
dependiendo de la concentración de proteína. La cantidad final es un
equilibrio entre maximizar el alcance de la reacción a la vez que se
minimizan las modificaciones inespecíficas del producto y, al mismo
tiempo, definir las propiedades químicas que mantendrán una
actividad óptima, mientras al mismo tiempo se optimiza, si es
posible, la semivida de la proteína. Preferiblemente, al menos se
conserva alrededor del 50% de la actividad biológica de la proteína,
y lo más preferiblemente se conserva el 100%.
Las reacciones pueden tener lugar mediante
cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales
biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a
alrededor de pH 5-7 si los grupos reactivos están en
el grupo alfa amino en el extremo N-terminal. En
general, el proceso implica preparar un polímero activado (que puede
tener al menos un grupo hidroxilo terminal) y posteriormente hacer
reaccionar la proteína con el polímero activado para producir la
proteína soluble adecuada para la formulación. La reacción de
modificación anterior se puede realizar mediante varios métodos, que
pueden implicar una o más etapas.
Como se mencionó anteriormente, las realizaciones
más preferidas de la invención utilizan el extremo
N-terminal de
interferón-beta-1a como unión al
polímero. Hay disponibles métodos adecuados para obtener de forma
selectiva un interferón-beta-1a
modificado de forma N-terminal. Un método se
ejemplifica mediante un método de alquilación reductora que explota
la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino
primarios (los grupos épsilon amino de la lisina respecto de los
grupos amino de la metionina N-terminal) disponibles
para la modificación de
interferón-beta-1a. En las
condiciones de selección apropiadas, se puede conseguir la
modificación sustancialmente selectiva de
interferón-beta-1a en su extremo
N-terminal con un polímero que contiene un grupo
carbonilo. La reacción se realiza a un pH que permite aprovechar la
ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos
épsilon-amino de los residuos de lisina y la del
grupo alfa-amino del residuo del extremo
N-terminal de
interferón-beta-1a. Este tipo de
procedimiento químico es bien conocido para las personas de
experiencia habitual en la técnica.
Se usó un esquema la reacción en el que esta
selectividad se mantiene llevando a cabo las reacciones a pH bajo
(en general 5-6) en condiciones en las que un
polímero PEG-aldehído se hace reaccionar con
interferón-beta-1a en presencia de
cianoborohidruro sódico. Esto da como resultado, después de la
purificación del
PEG-interferón-beta-1a
y análisis con SDS-PAGE, espectrometría de masas
MALDI y secuenciación/cartografía de péptidos, un
interferón-beta-1a cuyo extremo
N-terminal está marcado específicamente por el resto
PEG.
La estructura cristalina de
interferón-beta-1a es tal que los
extremos N- y C-terminales están localizados cerca
el uno del otro (véase Karpusas et al., 1997, Proc. Natl.
Acad. Sci. 94: 11813-11818). Así, las modificaciones
del extremo C-terminal del
interferón-beta-1a también deberían
tener un efecto mínimo sobre la actividad. Aunque no hay una
estrategia química simple para dirigir un polímero de
polialquilenglicol tal como PEG hacia el extremo
C-terminal, sería sencillo modificar mediante
ingeniería genética un sitio que se pudiese usar para dirigir el
resto de polímero. Por ejemplo, la incorporación de una Cys en un
sitio que está en el extremo C-terminal o cerca de
él permitiría la modificación específica usando un
polialquilenglicol (p.ej., PEG) activado con maleimida, vinilsulfona
o haloacetato. Estos derivados se pueden usar específicamente para
la modificación de las cisteínas alteradas mediante ingeniería
genética debido a la elevada selectividad de estos reactivos por
Cys. Otras estrategias, tales como la incorporación de una señal de
histidina que puede ser reconocida (Fancy et al., (1996)
Chem. & Biol. 3: 551) o un sitio de glicosilación adicional,
representan otras alternativas para modificar el extremo
C-terminal de
interferón-beta-1a.
El glicano del
interferón-beta-1a está también en
una posición que permitiría la modificación adicional sin alterar la
actividad. Los métodos para marcar hidratos de carbono como sitios
para la modificación química también se conocen bien, y por lo tanto
es probable que se pueda añadir un polímero de polialquilenglicol
directamente y específicamente a hidratos de carbono del
interferón-beta-1a que se han
activado por medio de oxidación. Por ejemplo, se puede generar un
polietilenglicol-hidrazida, que forma uniones
hidrazona relativamente estables mediante condensación con aldehídos
y cetonas. Esta propiedad se ha usado para la modificación de
proteínas por medio de uniones de oligosacáridos oxidados. Véase
Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. En
particular, el tratamiento con PEG-hidrazida de
carboximetilo con nitrito produce PEG-azida de
carboximetilo, que es un grupo electrófilo reactivo hacia grupos
amino. Esta reacción se puede usar para preparar también proteínas
modificadas con polialquilenglicol. Véase las patentes de EE.UU.
4.101.380 y 4.179.337.
Se ha descubierto previamente que el
procedimiento químico con ligador de tiol podría facilitar
adicionalmente la reticulación de proteínas. En particular, se
generaron multímeros homotípicos de LFA-3 y CD4
usando un procedimiento tal como generar aldehídos reactivos en
restos de hidratos de carbono con peryodato sódico, formar
conjugados de cistamina por medio de los aldehídos e introducir
reticulación por medio de los grupos tiol de las cistaminas. Véase
Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266:
18244-18249 y Chen, L.L. et al., (1991) J.
Biol. Chem., 266: 18237-18243. Por lo tanto, se
prevé que este tipo de procedimiento químico también sería apropiado
para la modificación con polímeros de polialquilenglicol en los que
se incorpora un ligador en el hidrato de carbono y el polímero de
polialquilenglicol se une al ligador. Aunque los ligadores de
aminotiol o que contienen hidrazina permitirán la adición de un
único grupo polimérico, la estructura del ligador se puede variar de
forma que se pueden añadir múltiples polímeros y/o de forma que se
cambia la orientación espacial del polímero con respecto al
interferón-beta-1a.
En la práctica de la presente invención, se
incorporan ventajosamente residuos de polialquilenglicol de alquil
C1-C4 polialquilenglicoles, preferiblemente
polietilenglicol (PEG), o residuos de
poli(oxi)alquilenglicol de tales glicoles en los
sistemas poliméricos de interés. Así, el polímero al que se une la
proteína puede ser un homopolímero de polietilenglicol (PEG) o es
un poliol polioxietilado, con tal que en todos los casos el polímero
sea hidrosoluble a temperatura ambiente. Los ejemplos de tales
polímeros incluyen homopolímeros de oxido de polialquileno, tales
como PEG o olipropilenglicoles, glicoles polioxietilenados, sus
copolímeros y sus copolímeros en bloque, con tal que se mantenga la
solubilidad en agua del copolímero en bloque. Los ejemplos de
polioles polioxietilados incluyen, por ejemplo, glicerol
polioxietilado, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada. El
esqueleto de glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo
esqueleto que se da de forma natural en, por ejemplo, animales y
humanos en los mono-, di-, y triglicéridos. Por lo tanto, esta
ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en
el
cuerpo.
cuerpo.
Como alternativa a los óxidos de polialquileno,
se puede usar dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas,
polivinilalcoholes, polímeros basados en hidratos de carbono y
similares.
El polímero no necesita tener un peso molecular
particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre
alrededor de 300 y alrededor de 100.000, más preferiblemente entre
10.000 y 40.000. En particular, los tamaños de 20.000 o más son los
mejores para prevenir la pérdida de proteína debida a la filtración
en los riñones.
La formación de derivados de polialquilenglicol
tiene varias propiedades ventajosas en la formulación de conjugados
de polímero-interferón-beta 1a en la
práctica de la presente invención, asociadas con las siguientes
propiedades de los derivados de polialquilenglicol: mejora de la
solubilidad en agua, mientras al mismo tiempo no se provoca
respuesta antigénica o inmunógena; grado elevado de
biocompatibilidad; ausencia de biodegradación in vivo de los
derivados de polialquilenglicol; y facilidad de excreción por
organismos vivos.
Además, en otro aspecto de la invención, se puede
utilizar interferón-beta 1a unido de forma covalente
al componente polimérico en el que la naturaleza de la conjugación
implica enlaces químicos covalentes escindibles. Esto permite el
control desde el punto de vista del transcurso del tiempo a lo largo
del cual el polímero se puede escindir del
interferón-beta 1a. Este enlace covalente entre el
fármaco de interferón-beta-1a y el
polímero se puede escindir mediante reacción química o enzimática.
El producto de
polímero-interferón-beta-1a
mantiene una cantidad aceptable de actividad. Al mismo tiempo, hay
presentes partes de polietilenglicol en el polímero de conjugación
para dotar al conjugado de
polímero-interferón-beta-1a
de solubilidad en agua elevada y capacidad de circulación sanguínea
prolongada. Como resultado de estas características mejoradas, la
invención contempla la administración parenteral, nasal, y oral de
tanto la especie de
polímero-interferón-beta-1a
activo como, después de la escisión hidrolítica, la
biodisponibilidad del
interferón-beta-1a per se, en
aplicaciones in vivo.
La reacción del polímero con el
interferón-beta 1a para obtener los productos
conjugados N-terminales más preferidos se lleva a
cabo fácilmente usando una amplia diversidad de esquemas de
reacción. La actividad y estabilidad de los conjugados de
interferón-beta-1a se puede variar
de diversas formas, usando un polímero de tamaño molecular
diferente. Las solubilidades de los conjugados se pueden variar
cambiando la proporción y tamaño del fragmento de polietilenglicol
incorporado en la composición de polímero.
La propiedad única de los polímeros derivados de
polialquilenglicol de valor para las aplicaciones terapéuticas de la
presente invención es su biocompatibilidad general. Los polímeros
tienen diversas propiedades de solubilidad en agua y son atóxicos.
Se cree que no son inmunógenos ni antigénicos, y que no interfieren
con las actividades biológicas del resto de
interferón-beta-1a cuando se
conjugan en las condiciones descritas aquí. Poseen una circulación
prolongada en la sangre y se excretan fácilmente de los organismos
vivos.
Se ha descubierto que los productos de la
presente invención son útiles para mantener la semivida del
interferón-beta 1a terapéutico, y se pueden
preparar, por ejemplo, para la administración terapéutica
disolviéndolos en agua o en un medio líquido aceptable. La
administración es por vía parenteral, en aerosol u oral. Se pueden
preparar suspensiones coloidales finas para administración
parenteral para producir un efecto prolongado, o por la vía oral,
mientras la formulación en aerosol puede ser de naturaleza líquida o
en polvo seco. En estado seco y liofilizado o en formulaciones en
solución, los conjugados de
interferón-beta-1a-polímero
de la presente invención deberían tener buena estabilidad de
almacenamiento. La estabilidad térmica del
interferón-beta-1a conjugado
(Ejemplo 3) es ventajosa en los procesos de formulación en polvo que
tienen una etapa de deshidratación. Véase, p.ej., el documento WO
95/31479: ("Métodos y composiciones para polvo seco de
interferones").
Los conjugados terapéuticos de polímero de la
presente invención se pueden utilizar para la profilaxis o
tratamiento de cualquier trastorno o enfermedad para la que el
constituyente de interferón-beta-1a
es eficaz. Además, los conjugados basados en polímero de la presente
invención se pueden utilizar en el diagnóstico de constituyentes,
trastornos o enfermedades en sistemas o especímenes biológicos, así
como para diagnóstico en sistemas no fisiológicos.
En el uso terapéutico, la presente invención
contempla composiciones para el uso en un método para tratar a un
sujeto animal que tiene o es susceptible de forma latente a
tal(es) trastornos(s) o enfermedad(es) y que
necesita tal tratamiento, que comprende administrar a tal animal una
cantidad eficaz de un conjugado de polímero de la presente invención
que es terapéuticamente eficaz para dicho trastorno o enfermedad.
Los sujetos a tratar mediante los conjugados de polímero de la
presente invención incluyen sujetos mamíferos, y, lo más
preferiblemente, sujetos humanos. Dependiendo del trastorno o
enfermedad específica a combatir, se puede administrar a los sujetos
animales conjugados de polímero de la invención a cualquier dosis
adecuada terapéuticamente eficaz y segura, como se puede determinar
fácilmente dentro de la experiencia en la técnica, y sin
experimentación excesiva. Debido a las barreras entre especies de
los interferones de tipo I, puede ser necesario generar conjugados
de interferón-polímero como se describe aquí con los
interferones de las especies apropiadas.
La actividad antiproliferativa celular de
interferón-beta-1a se conoce bien.
En particular, ciertos conjugados de polímero con
interferón-beta-1a descritos aquí
son útiles para tratar tumores y cánceres, tales como sarcoma
osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma de mama,
melanoma y carcinoma nasofaríngeo, así como trastornos autoinmunes,
tales como fibrosis, lupus y esclerosis múltiple. Se espera además
que la actividad antiviral exhibida por las proteínas conjugadas, en
particular ciertos conjugados de las muteínas de
interferón-beta-1a descritos aquí,
se puedan usar en el tratamiento de enfermedades virales, tales como
infección por ECM, gripe y otras infecciones del tracto
respiratorio, rabia, y hepatitis. También se espera que las
actividades inmunomoduladoras de
interferón-beta-1a exhibidas por las
proteínas conjugadas descritas aquí se puedan usar en el tratamiento
de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, tales como fibrosis,
esclerosis múltiple. La capacidad de los interferones para inhibir
la formación de vasos sanguíneos nuevos (es decir, inhibir la
angiogénesis y la neovascularización) posibilita que los conjugados
de la invención se usen para tratar enfermedades angiogénicas, tales
como retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad,
degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma
neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeosis y síndrome de
Osler-Webber.
Además, la actividad antiendotelial de interferón
se conoce desde hace tiempo, y un mecanismo potencial de la acción
del interferón puede ser interferir con la actividad de las células
endoteliales inhibiendo la producción o la eficacia de los factores
angiogénicos producidos por las células tumorales. Algunos tumores
vasculares, tales como hemangiomas, son particularmente sensibles
al tratamiento con interferón. El tratamiento con
interferón-alfa es el único tratamiento documentado
para esta enfermedad. Se espera que el tratamiento con los
conjugados de interferón-beta-1a de
la invención ofrecerá beneficios farmacéuticos sustanciales en
cuanto a farmacocinética y farmacodinámica, ya que se espera que el
conjugado permanezca en la vasculatura durante un período de tiempo
más largo que los interferones sin conjugar, lo que lleva a una
terapia más eficaz y efectiva para uso como agente
anti-angiogénico. Véase el Ejemplo 8.
Los conjugados de
polímero-interferón-beta-1a
de la invención se pueden administrar per se también en forma
de ésteres, sales y otros derivados suyos fisiológicamente
funcionales y farmacéuticamente aceptables. En tales formulaciones
farmacéuticas y de medicamentos, el
interferón-beta-1a se utiliza
preferiblemente junto con uno o más vehículos farmacéuticamente
aceptables y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico.
El/los vehículo(s) debe(n) ser farmacéuticamente
aceptable(s) en el sentido de ser compatible(s) con
los otros ingredientes de la formulación, y no excesivamente
perjudicial(es) para su receptor. El
interferón-beta-1a se proporciona
en una cantidad eficaz para conseguir el efecto farmacológico
deseado, como se describió anteriormente, en una cantidad apropiada
para conseguir la dosis diaria deseada.
Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas
para administración parenteral así como no parenteral, y las
modalidades de administración específicas incluyen la administración
oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea,
intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal,
intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, bronquial, linfática,
vaginal e intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas
para administración oral, nasal y parente-
ral.
ral.
Cuando se utiliza el
interferón-beta-1a en una
formulación que comprende una disolución líquida, la formulación se
puede administrar ventajosamente de forma oral o parenteral. Cuando
se emplea el interferón-beta-1a en
una formulación en suspensión líquida o como un polvo en una
formulación con un vehículo biocompatible, la formulación se puede
administrar ventajosamente de forma oral, rectal o bronquial.
Cuando se utiliza el
interferón-beta-1a directamente en
forma de un sólido pulverizado, el
interferón-beta-1a se puede
administrar ventajosamente de forma oral. Alternativamente, se puede
administrar de forma nasal o bronquial, por medio de la nebulización
del polvo en un gas portador, para formar una suspensión gaseosa del
polvo que es inspirada por el paciente desde un circuito de
respiración que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.
Las formulaciones que comprenden los conjugados
de polímero de la presente invención se pueden presentar de forma
conveniente en formas farmacéuticas unitarias, y se pueden preparar
mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica
farmacéutica. Tales métodos incluyen, en general, la etapa de
asociar el/los ingrediente(s)
activo(s) con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima el/los ingrediente(s) activo(s) con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en formas farmacéuticas de la formulación deseada.
activo(s) con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima el/los ingrediente(s) activo(s) con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en formas farmacéuticas de la formulación deseada.
Las formulaciones de la presente invención
adecuadas para administración oral se pueden presentar como unidades
discretas, tales como cápsulas, sellos, comprimidos o pastillas, que
contienen cada una la cantidad predeterminada del ingrediente activo
como polvo o gránulos; o una suspensión en un líquido acuoso o en un
líquido no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión, o
una poción.
Se puede hacer un comprimido mediante compresión
o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los
comprimidos mediante compresión se pueden preparar comprimiendo en
una máquina adecuada, con el compuesto activo en una forma fluida
tal como un polvo o gránulos, que opcionalmente se mezcla con un
aglutinante, desintegrante, lubricante, diluyente inerte, agente
tensoactivo o agente de descarga. Los comprimidos moldeados que
constan de una mezcla de los conjugados de polímero en polvo con un
vehículo adecuado se pueden hacer moldeando en una máquina
adecuada.
Se puede hacer un jarabe añadiendo el compuesto
activo a una disolución acuosa concentrada de un hidrato de carbono,
por ejemplo sacarosa, a la que también se le puede añadir cualquier
ingrediente(s) accesorio(s). Tal(es)
ingredientes(s) accesorio(s) puede(n) incluir
aromatizantes, conservante adecuado, agentes para retrasar la
cristalización del hidrato de carbono, y agentes para incrementar la
solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un alcohol
polihidroxílico, por ejemplo glicerol o sorbitol.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa
estéril del conjugado activo, que preferiblemente es isotónica con
la sangre del receptor (p.ej., solución salina fisiológica). Tales
formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes
espesantes u otros sistemas microparticulados que se diseñan para
dirigir al compuesto a componentes sanguíneos o a uno o más órganos.
Las formulaciones se pueden presentar en forma de dosis unitaria o
de dosis múltiple.
Las formulaciones de pulverizador nasal
comprenden disoluciones acuosas purificadas del conjugado activo con
agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se
ajustan preferiblemente a un pH y a un estado isotónico compatible
con las membranas mucosas nasales.
Las formulaciones para administración rectal se
pueden presentar como un supositorio con un vehículo adecuado, tal
como manteca de cacao, grasas hidrogenadas o ácido graso carboxílico
hidrogenado.
Las formulaciones oftálmicas, tales como gotas
oculares, se preparan mediante un método similar al pulverizador
nasal, excepto que el pH y los factores isotónicos se ajustan
preferiblemente para coincidir con los del ojo.
Las formulaciones tópicas comprenden los
conjugados de la invención disueltos o suspendidos en uno o más
medios, tales como aceite mineral, petróleo, alcoholes
polihidroxílicos, u otras bases usadas para formulaciones
farmacéuticas tópicas.
Además de los ingredientes anteriormente
mencionados, las formulaciones de esta invención pueden incluir
además uno o más ingrediente(s) accesorio(s)
seleccionados de disolventes, tampones, agentes aromatizantes,
desintegrantes, agentes tensoactivos, espesantes, lubricantes,
conservantes (que incluyen antioxidantes).
Por lo tanto, la presente invención contempla la
provisión de polímeros adecuados para la estabilización in
vitro de interferón-beta 1a en disolución, como
una aplicación ilustrativa preferida de aplicación no terapéutica.
Los polímeros se pueden emplear, por ejemplo, para incrementar la
estabilidad térmica y la resistencia a la degradación enzimática del
interferón-beta 1a. El aumento de la estabilidad
térmica característica del
interferón-beta-1a por medio de la
conjugación en la manera de la presente invención proporciona un
medio para mejorar la duración de almacenado, la estabilidad a
temperatura ambiente y la solidez de los reactivos y equipos de
investigación.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención.
Se emprendió un análisis mutacional extensivo de
interferón-beta-1a
(IFN-beta-1a) humano con objeto de
cartografiar los residuos necesarios para la actividad y la unión a
receptor. La disponibilidad de la estructura cristalina en 3D de
IFN-beta humano (Karpusas, M. et al., 1997,
Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818) permitió
identificar para las sustituciones con alanina (o serina) los
residuos expuestos al disolvente disponibles para las interacciones
con el receptor, y mantener los aminoácidos implicados en los
enlaces intramoleculares. Se diseñó un panel de 15 mutaciones por
sustitución con alanina que sustituían entre 2 y 8 residuos a lo
largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D,
E) y giros (AB, CD, DE). Se incluyó una señal de histidina
amino-terminal que comprendía seis residuos de
histidina para la purificación por afinidad, así como un sitio de
escisión de enteroquinasa para la eliminación de la extensión
amino-terminal. Los interferones resultantes se
denominan "interferón(IFN)-beta marcado con
his" o "His-interferón-beta"
o "His_{6}-interferón-beta" y
similares.
Se construyeron diversos plásmidos mutantes de
expresión de IFN-beta marcado con his usando una
construcción del gen de IFN-beta de tipo natural
como molde para la mutagénesis. La estrategia de mutagénesis implicó
introducir primero sitios de escisión de enzimas de restricción
únicos por todo el gen de IFN beta marcado con his de tipo natural,
después sustituir las distintas secuencias de ADN entre los sitios
de restricción con moléculas bicatenarias de oligonucleótidos
sintéticos, que codificaban las mutaciones de sustitución para
alanina (o serina). Finalmente, los genes de IFN mutantes se
subclonaron en un plásmido que dirigió la expresión en células
mamíferas en una línea celular de riñón 293 humana.
Las consecuencias funcionales de estas mutaciones
se analizaron en ensayos antivirales y de antiproliferación. Se
desarrolló un ensayo de unión de IFN no radiactivo para analizar
estos mutantes en su unión al receptor de superficie ("complejo
IFNAR1/2") de células de linfoma de Daudi Burkitt humanas.
Además, se desarrolló un ensayo para cartografiar las superficies
de interacción entre los mutantes de
his-IFN-beta e IFNAR2 que empleó una
proteína de fusión IFNAR2/Ig, que constaba del dominio extracelular
de la proteína receptora de IFN IFNAR2 fusionado con los dominios
bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana.
La estrategia para generar mutantes sustituidos
con alanina (o serina) de IFN-beta fue crear primero
un gen de IFN-beta modificado, que codificaba la
proteína de tipo natural, pero que portaba sitios de escisión únicos
para enzimas de restricción distribuidos a lo largo del gen. Los
sitios únicos se usaron para intercambiar las secuencias de tipo
natural por moléculas bicatenarias de oligonucleótidos sintéticos,
que codificaban los códones mutados. Para obtener un casete de
expresión de IFN-beta-1a humano
adecuado para la creación de genes mutantes, se amplificó el cADN de
IFN-beta (número de acceso de GenBank #E00029)
mediante PCR. Fue necesario un clonado inicial del gen de
IFN-beta en el plásmido pMJB107, un derivado de
pACYC184 (véase Rose, et. al., 1988, Nucleic Acids Res. 16
(1) 355) para realizar la mutagénesis dirigida del gen en un
plásmido que carecía de los sitios de restricción específicos que se
generarían por medio de la mutagénesis.
Los cebadores de PCR usados para subclonar las
secuencias codificantes del gen de IFN-beta humano
permitieron introducir también un sitio de escisión de enteroquinasa
en dirección 5' y en el marco de lectura del gen de
IFN-beta (cebador de PCR de 5'
5'-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAA
GAAGC-3' (I D SEC Nº: 3: "BET-021"), y cebador de PCR de 3' 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGG
TAACCTGTAAGTC-3' (ID SEC Nº: 4: "BET-022")) y sitios flanqueantes para enzimas de restricción (BspEI y XhoI) útiles para clonar en los sitios del plásmido pMJB107. El ADN resultante se denomina fragmento A de la
PCR.
GAAGC-3' (I D SEC Nº: 3: "BET-021"), y cebador de PCR de 3' 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGG
TAACCTGTAAGTC-3' (ID SEC Nº: 4: "BET-022")) y sitios flanqueantes para enzimas de restricción (BspEI y XhoI) útiles para clonar en los sitios del plásmido pMJB107. El ADN resultante se denomina fragmento A de la
PCR.
Se introdujo una secuencia señal eficaz de la
molécula de adhesión de células vasculares humanas 1
(VCAM-1) y una señal de seis histidinas en la
construcción final a partir de un segundo fragmento de ADN creado a
partir de pDSW247 (fragmento B). El plásmido pDSW247 es un derivado
de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del que se ha delecionado el gen
EBNA-1, y que porta la secuencia señal
VCAM-1 (VCAMss) fusionada en 5' y en el marco de
lectura con una señal de seis histidinas. Los cebadores de PCR que
se usaron para generar el resto de casete
VCAMss-1/señal de histidina fueron
KID-369 (cebador de PCR de 5'
5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCAT
CATCATCATAGCT-3': ID SEC Nº: 5) y
KID-421 (cebador de PCR de 3'
5'-CCGGAGCTATGATGATGATGATG
ATGGCCCCCGGA-3': ID SEC Nº: 6), que incorporaban sitios de escisión flanqueantes para enzimas de restricción (NotI y BspEI) que permitieron la escisión del fragmento B de ADN.
ATGGCCCCCGGA-3': ID SEC Nº: 6), que incorporaban sitios de escisión flanqueantes para enzimas de restricción (NotI y BspEI) que permitieron la escisión del fragmento B de ADN.
Para crear un vector plasmídico que llevase la
secuencia señal VCAM-1, la señal de his y el gen de
interferón-beta se realizó una ligadura triple
usando los fragmentos de ADN purificados de un gel a partir del
vector plasmídico pMJB107 (escindido con NotI y XhoI), fragmento A
de PCR (escindido con BspEI y XhoI) y fragmento B (escindido con
NotI y BspEI). El plásmido ligado se usó para transformar células de
E. coli JA221 o XL1-Blue, y las colonias
resistentes a ampicilina se escogieron y se analizó la presencia de
insertos mediante análisis de cartografía de restricción. Se hizo
ADN Maxiprep y se verificó la secuencia del inserto mediante
secuenciación de ADN. La construcción resultante se llamó
pCMG260.
Se usó el plásmido pCMG260 como molde para
múltiples rondas de mutagénesis (U.S.E. Site Directed Mutagenesis
Kit (Boehringer-Mannheim)), que introdujeron sitios
de escisión de restricción únicos en posiciones a lo largo de la
secuencia codificante de la proteína de IFN-beta,
pero no cambiaron la secuencia resultante de la proteína. Los
plásmidos mutados se usaron para transformar las cepas de E.
coli JA221 o XL1-Blue, y las colonias
recombinantes se seleccionaron por su resistencia a cloranfenicol.
Se analizó adicionalmente en las colonias resistentes a
cloranfenicol la presencia del sitio único deseado para enzima de
restricción mediante análisis de cartografía de restricción de ADN.
El plásmido de IFN-beta resultante, pCMG275.8,
contenía el grupo completo de sitios de escisión únicos para enzima
de restricción y se verificó la secuencia de ADN del gen. La
secuencia de ADN completa (ID SEC Nº: 1) del gen de interferón beta
modificado y marcado con his, junto con la secuencia codificante de
la proteína (ID SEC Nº: 2), se dan en la Figura 10.
El grupo completo de las mutaciones por
sustitución con alanina se describe en la Tabla 1 (más adelante).
Los nombres de los mutantes especifican las regiones estructurales
(hélices y giros) en los que se introdujeron las mutaciones. El
panel entero de sustituciones con alanina (serina) da como resultado
la mutación de 65 de los 165 aminoácidos de IFN-beta
humano.
El panel de mutantes se creó a partir de
pCMG275.8 sustituyendo segmentos de ADN entre los sitios de
restricción únicos con moléculas bicatenarias de oligonucleótidos
sintéticos, que portaban la información codificante genética
descrita en la Tabla 2 (véase más adelante). Para crear los diversos
plásmidos mutantes de sustitución con alanina se ligó vector
pCMG275.8 purificado en gel (escindido con la enzima de restricción
apropiada, como se indica en la lista más adelante para cada región
estructural de IFN-beta) y moléculas bicatenarias de
oligonucleótidos (las secuencias de las cadenas codificantes se
muestran en la Tabla 2). Las mezclas de ligadura se usaron para
transformar la cepa JA221 de E. coli y las colonias
recombinantes se seleccionaron por su resistencia a ampicilina. Se
analizó en las colonias resistentes a ampicilina la presencia de la
inserción de las mutaciones cribando los sitios apropiados de las
enzimas de restricción. Para dos mutantes (A2 y CD2), la estrategia
de clonado supuso usar dos moléculas bicatenarias de
oligonucleótidos sintéticos (mostradas en la Tabla 2), que portaban
extremos salientes complementarios para permitir que ligasen entre
sí y con el esqueleto del
vector-IFN-beta en una ligadura
triple. La siguiente lista ilustra los sitios que se usaron para
clonar los oligonucleótidos mutados de la Tabla 2. El esquema de
clonado (subsección B) muestra las posiciones de estos sitios únicos
en el gen de interferón beta.
La línea designada IFN-\beta
muestra la secuencia de IFN-\beta de tipo natural.
Las sustituciones con alanina o serina de los residuos de
IFN-\beta se muestran para cada uno de los
mutantes y los puntos, debajo de las regiones relevantes, indican
las secuencias de tipo natural. Las hélices y estructuras en giro se
indican como líneas continuas debajo de los mutantes. El giro DE se
extiende en el hueco entre las hélices D y E. Se generaron dos
mutantes por sustitución con alanina adicionales (H93A, H97A y
H121A) y se analizaron en ensayos antivirales para analizar los
efectos de mutar estas histidinas, que quelan cinc en el dímero de
la estructura cristalina. Ambos mutantes mantuvieron la actividad de
tipo natural completa en los ensayos antivirales, lo que sugiere que
la formación del dímero mediada por cinc no es importante para la
actividad de IFN-\beta.
Los genes de IFN-beta de tipo
natural y mutante, fusionados con la secuencia señal
VCAM-1, señal de his y sitio de escisión de
enteroquinasa, se purificaron en gel como fragmentos de restricción
de NotI y BamHI de 761 pares de bases. Los genes purificados se
subclonaron en el vector plasmídico pDSW247 escindido con NotI y
BamHI, como se describe en el esquema. El plásmido pDSW247 es un
vector de expresión para la expresión transitoria de proteína en
células renales EBNA 293 humanas (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Contiene el promotor de genes tempranos de citomegalovirus y
elementos reguladores de VEB que son necesarios para la expresión
génica de nivel elevado en ese sistema, así como marcadores
seleccionables para E. coli (resistencia a ampicilina) y
células EBNA 293 (resistencia a higromicina) como se observa en el
esquema de la estrategia de clonado (más adelante). Los plásmidos
ligados se usaron para transformar células de E. coli JA221 ó
XL1-Blue, y las colonias resistentes a ampicilina se
recogieron y se analizó la presencia de insertos mediante análisis
de cartografía de restricción. Se hizo ADN Maxiprep y se verificó la
secuencia de los insertos mediante secuenciación de ADN. Los clones
positivos que mostraban las secuencias mutadas deseadas se usaron
para transfectar células renales EBNA 293 humanas como se describe
más adelante.
La estrategia de clonado global se presenta a
continuación:
Representación esquemática de la
estrategia de clonado y plásmidos de expresión de
IFN-\beta
Las células EBNA 293 humanas (Invitrogen,
Carlsbad, CA, Chittenden, T. (1989) J. Virol. 63:
3016-3025) se mantuvieron como cultivos
subconfluentes en medios Dulbecco's Modified Eagle complementados
con un 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM y 250 \mug/ml de
geneticina (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Los plásmidos de
expresión pDSW247 se transfectaron transitoriamente en células EBNA
293 usando el protocolo de lipofectamina (Gibco/BRL, Life
Technologies). Se recolectaron los medios condicionados
3-4 días después de la transfección, los restos
celulares se eliminaron mediante centrifugación, y se cuantificó la
concentración de his-IFN-beta
mediante ELISA.
El análisis ELISA se realizó usando anticuerpos
policlonales de conejo (IgG purificada con proteína A, los
anticuerpos se habían obtenido para
IFN-beta-1a humano purificado) para
revestir placas de ELISA de 96 pocillos y se usó una forma
biotinilada de la misma IgG policlonal de conejo como reactivo
secundario para permitir la detección de interferón usando
peroxidasa de rábano unida a estreptavidina (HRP: Jackson
ImmunoResearch, W. Grove, PA). Se usó una serie de diluciones de
interferón-beta-1a para generar
curvas de concentración estándar. Este medio condicionado que
contenía his-IFN-beta de
transfectantes de EBNA se diluyó para obtener muestras con
concentraciones que oscilaban entre 10 ng/ml y 0,3 ng/ml en el
análisis ELISA. Para confirmar las concentraciones de
IFN-beta de los medios determinadas mediante ELISA,
se realizó análisis de transferencia de Western. Los sobrenadantes
del cultivo reducidos y los patrones de
IFN-beta-1a se sometieron a
SDS-PAGE en geles en gradiente del
10-20% (Novex, San Diego, CA) y se transfirieron a
membranas PDVF. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con
antisuero
anti-IFN-beta-1a
policlonal de conejo (#447, Biogen, Inc., un segundo antisuero que
se había obtenido para IFN-beta-1a),
seguido de tratamiento con IgG anti-conejo de burro
unida a HRP (Jackson ImmunoResearch).
Las propiedades de unión a receptor de los
mutantes de interferón-beta descritos en C se
analizaron usando dos análisis de unión diferentes. Un análisis
midió la unión de los mutantes de interferón-beta a
una proteína de fusión, IFNAR2/Ig, que comprendía el dominio
extracelular de la cadena del receptor IFNAR2 humano fusionado con
parte de la región constante de una IgG humana.
IFNAR2-Fc se expresó en células de ovario de hámster
chino (CHO) y se purificó mediante cromatografía de afinidad en
Sepharose con proteína A según las instrucciones del fabricante
(Pierce Chem. Co., Rockford, IL, catálogo #20334). La unión de
mutantes de interferón-beta a
IFNAR2-Fc se midió en un análisis con formato ELISA.
Las placas de ELISA se prepararon revistiendo placas de 96 pocillos
de fondo plano durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de
anticuerpo monoclonal IgG anti-humano de ratón
(CDG5-AA9, Biogen, Inc.) de 10 \mug/ml en tampón
de revestimiento (NaHCO_{3} 50 mM, MgCl_{2} 0,2 mM, CaCl_{2}
0,2 mM, pH 9,6). Las placas se lavaron dos veces con PBS que
contenía 0,05% de Tween-20, y se bloquearon con 0,5%
de leche en polvo desnatada en PBS durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de dos lavados más, se añadieron 50 \mul de 1
\mug/ml de IFNAR2-Fc en 0,5% de leche en PBS que
contenía 0,05% de Tween-20 a cada pocillo y se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y las placas se
lavaron después dos veces más. La unión de los mutantes de
interferón-beta a IFNAR2-Fc se midió
añadiendo 50 \mul/pocillo de interferón-beta
mutante en medio condicionado, diluido en serie en Dulbecco's
Modified Eagle's Medium (DMEM) complementado con un 10% de suero
bovino fetal, e incubando durante 2 horas a 4ºC. Las diluciones de
mutante de interferón-beta oscilaron típicamente de
aproximadamente 1 \muM hasta 10 pM. Después de lavar, el
interferón-beta unido a las placas se detectó
añadiendo 50 \mul/pocillo de una mezcla que consistía en una
dilución 1:1000 de un anticuerpo anti-interferón
policlonal de conejo (#447) más IgG anti-conejo de
burro marcada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson
ImmunoResearch), e incubando durante 15 minutos a 4ºC. Después de
dos lavados, se añadió sustrato de HRP, y la placa se incubó a 4ºC
antes de leerse en un lector de placas de ELISA a una absorbancia de
450 nm. Los datos se trazaron como absorbancia respecto de la
concentración de interferón-beta mutante, y se
determinó la afinidad para la unión del
interferón-beta mutante a IFNAR2-Fc
ajustando los datos a una ecuación de unión hiperbólica simple. Los
resultados de estos análisis se muestran en la Figura 1, en la que
la afinidad de unión para cada mutante, determinada al menos en tres
experimentos independientes, se expresa como un porcentaje de la
medida para interferón-beta-1a de
tipo natural con His_{6}.
Se usó un segundo análisis de unión a receptor
para medir la afinidad con la que los mutantes de
interferón-beta se unieron a células Daudi que
expresaban ambas cadenas del receptor, IFNAR1 y IFNAR2, que juntas
comprenden el receptor para interferón-beta. Este
análisis basado en FACS usó un anticuerpo monoclonal bloqueante
dirigido contra el dominio extracelular de IFNAR1, EA12 (Biogen,
Inc.), para distinguir el receptor sin ocupar (libre) del receptor
al que se ha unido interferón-beta. Las células
Daudi (20 \mul a 2,5 x 10^{7} células/ml) se colocaron en placas
de ELISA de fondo en V de 96 pocillos, y se incubaron durante 1 hora
a 4ºC con diversas concentraciones de mutante de
interferón-beta (20 \mul en tampón de FACS; 5% de
FBS, 0,1% de NaN_{3} en PBS). Las diluciones en serie deseadas de
mutantes de interferón-beta oscilaron desde 0,5
\muM hasta 0,5 pM. Se añadió a cada pocillo 100 ng de anticuerpo
EA12 monoclonal anti-IFNAR1 murino biotinilado (10
\mul), y las placas se incubaron durante 2 minutos adicionales a
temperatura ambiente antes de lavarse dos veces con tampón de FACS
(4ºC). Las células se incubaron después durante 30 minutos a 4ºC con
50 \mul/pocillo de una dilución 1:200 de estreptavidina conjugada
con R-ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch), se
lavaron dos veces con tampón de FACS, se resuspendieron en 300
\mul de tampón de FACS que contenía 0,5% de paraformaldehído, y se
transfirieron a tubos de poliestireno de 12x75 mm (Falcon 2052). Las
muestras se analizaron después mediante citometría de flujo en un
FACScan (Becton Dickinson). Los datos se dibujaron como intensidad
de fluorescencia media por canal (IFMC) respecto de la
concentración de mutante de interferón-beta; las
afinidades de unión se definieron como la concentración de mutante
de interferón-beta que daba un 50% de inhibición de
tinción con anticuerpo. Cada mutante se ensayó múltiples veces. La
Figura 2 muestra las afinidades de unión a receptor para cada
mutante de interferón-beta, determinadas mediante
este método, expresadas como un porcentaje de la afinidad medida
para interferón-beta-1a de tipo
natural con His_{6} en cada experimento.
Se analizó también la actividad funcional de los
mutantes de interferón-beta usando ensayos in
vitro de actividad antiviral y la capacidad del
interferón-beta para inhibir la proliferación
celular. Se realizó con cada mutante un mínimo de tres ensayos
antivirales, cada uno con puntos por triplicado. Se incluyó
interferón-beta-1a de tipo natural
con His_{6} como referencia en cada experimento. Los ensayos
antivirales se realizaron tratando células de carcinoma de pulmón
humanas A549 (ATCC CCL 185) durante la noche con diluciones en serie
a un medio de interferón-beta mutante a
concentraciones que abarcaban el intervalo entre la protección
antiviral completa y un estado sin protección de muerte celular
viral. El siguiente día, las células se expusieron durante dos días
a virus de encefalomiocarditis (ECMV) a una dilución que dio como
resultado la muerte celular completa en ausencia de interferón. Las
placas se revelaron después con la tinción metabólica MTT
(2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida)
(M5655, Sigma, St. Louis, MO). Se preparó una disolución madre de
MTT de 5 mg/ml en PBS y se filtró de forma estéril, y se diluyeron
50 \mul de esta disolución en cultivos celulares (100 \mul por
pocillo). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30
- 60 minutos, la disolución MTT/medios se desechó, las células se
lavaron con 100 \mul de PBS, y finalmente la tinción metabolizada
se solubilizó en 100 \mul de ácido clorhídrico 1,2 N en un 90% de
isopropanol. Se cuantificaron las células viables (como evidenció la
presencia de la tinción) mediante absorbancia a 450 nm. Los datos se
analizaron trazando la absorbancia respecto de la concentración de
mutante de interferón-beta, y la actividad de cada
mutante se definió como la concentración a la que el 50% de las
células murieron. La Figura 3 muestra la actividad de cada mutante
expresada como porcentaje de la actividad medida para el
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his en cada experimento.
Los mutantes de interferón-beta
también se analizaron en cuanto a su función en un ensayo de
antiproliferación. Se cultivaron células de linfoma de Daudi Burkitt
humanas (ATCC # CCL 213) a 2 x 10^{5} células/ml en RPMI 1620
complementado con un 10% de suero bovino fetal definido (Hyclone,
Logan Utah), y L-glutamina 2 mM. Cada pocillo
también contenía una concentración dada de mutante de
interferón-beta en un volumen final total de 100
\mul de medio por pocillo; las concentraciones de
interferón-beta usadas se eligieron para abarcar el
intervalo desde la inhibición máxima de proliferación de células de
Daudi hasta la ausencia de inhibición (es decir, proliferación
completa). Se usaron puntos experimentales duplicados para cada
concentración de mutante de interferón-beta probada,
y se incluyó un grupo duplicado de células sin tratar en todos los
experimentos. Las células se incubaron durante dos días a 37ºC en
incubadores con un 5% de CO_{2}, después de lo cual se añadió a
cada pocillo 1 \muCi de timidina tritiada
((metil-^{3}H) timidina, Amersham TRK758) en 50
\mul de medio, y se incubó durante otras 4 h. Las células se
recogieron usando un recolector de placas LKB, y se midió la
incorporación de timidina tritiada usando un lector de placas beta
LKB. Se hallaron las medias de los valores experimentales
duplicados y se determinaron las desviaciones estándar. Los datos se
dibujaron como cuentas medias por minuto respecto de la
concentración de mutante de interferón-beta, y la
actividad de cada mutante se definió como la concentración necesaria
para dar un 50% de la inhibición máxima observada del crecimiento.
Se realizaron múltiples ensayos para cada mutante. La Figura 4
muestra los resultados expresados como porcentaje de la actividad
hallada para interferón-beta-1a de
tipo natural marcado con his en cada experimento.
Se descubrió que el
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con histidina tenía actividades en los ensayos antivirales y
de antiproliferación que eran alrededor de tres veces menores que
las actividades correspondientes halladas para
interferón-beta-1a de tipo natural
sin marcar. Debido a que todos los mutantes de
interferón-beta A1-E contienen la
secuencia señal de his en sus extremos N-terminales,
los efectos de las mutaciones sobre las propiedades de la molécula
se determinaron comparando las actividades de estos mutantes en
ensayos antivirales, de antiproliferación y de unión para la
actividad observada para el
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his. Al hacerlo, se asume que las variaciones en las
actividades de los mutantes A1-E, comparadas con el
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his, son cualitativamente y cuantitativamente más o
menos las mismas que los efectos que estas mismas mutaciones
tendrían en ausencia de la señal de his N-terminal.
La suposición equivalente para construcciones marcadas o fusionadas
de otras citocinas solubles es considerada como verdadera por los
practicantes de la técnica de mutagénesis de barrido de alaninas,
especialmente cuando la actividad funcional in vitro de la
construcción marcada o fusionada es cercana a la de la citocina de
tipo natural, como es el caso aquí. Véase, por ejemplo, Pearce K.H.
Jr, et al., J. Biol. Chem. 272:
20595-20602 (1997) y Jones J.T., et al.,
J. Biol. Chem. 273: 11667-11674
(1998).
Los datos mostrados en las figuras
1-4 sugieren tres tipos de efectos que estuvieron
causados por la mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser
ventajosos para el desarrollo de fármacos de interferón en ciertas
circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a)
mutantes con actividad antiviral superior a la del
interferón-beta-1a de tipo natural
(p.ej., mutante C1); (b) mutantes que exhiben actividad tanto en
ensayos antivirales como en ensayos de antiproliferación, pero para
los cuales la actividad de antiproliferación es
desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antiviral,
comparado con el interferón-beta-1a
de tipo natural (p.ej., mutantes C1, D y DE1); y (c) antagonistas
funcionales (p.ej., A1, B2, CD2 y DE1), que muestran actividades
antiviral y antiproliferativa que son desproporcionadamente bajas
con respecto a la unión a receptor, comparado con el
interferón-beta-1a de tipo natural.
Se puede observar que algunos mutantes están incluidos en más de una
clase. Estas clases se analizan más adelante. Aunque se han
caracterizado estas clases de mutantes con respecto a los ejemplos
enumerados, se debería apreciar que otras mutaciones en estas
regiones pueden dar como resultado efectos similares, o incluso
aumentados sobre la actividad:
(a) El mutante C1 posee una actividad antiviral
que es aproximadamente seis veces mayor que la del
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his. Se predice que este mutante y otros de este tipo
son útiles para reducir la cantidad de
interferón-beta que se debe administrar para
alcanzar un nivel dado de efecto antiviral. Se espera que reducir la
cantidad de proteína administrada reduzca la inmunogenicidad de la
proteína, y también puede reducir los efectos secundarios de
toxicidades que no se basan en el mecanismo. Se predice que las
mutaciones en esta clase son ventajosas en situaciones en las que el
beneficio terapéutico de la administración de
interferón-beta resulta de sus efectos antivirales,
y en las que los efectos antiproliferativos contribuyen a la
toxicidad o a efectos secundarios indeseados.
(b) Las actividades relativas (% de tipo natural)
de los mutantes sustituidos con alanina en el ensayo antiviral y de
antiproliferación se comparan en la Figura 5. Se observan
actividades modificadas de forma coordinada (es decir, actividades
antivirales y de antiproliferación que difieren por el mismo factor
de las actividades del
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his) en la mayoría de los mutantes (los que se
encuentran en la línea diagonal). Sin embargo, varios mutantes
muestran alteraciones mayores de actividad en un ensayo respecto del
otro, comparado con
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his, como evidencia el desplazamiento de la diagonal.
Se muestran tres mutantes tales en la Tabla 3 más adelante. El
mutante C1 muestra una actividad antiviral que es seis veces
superior que la de
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his, pero su actividad en el ensayo de antiproliferación
es similar a la del de tipo natural. El mutante C1 tiene actividad
antiviral que está aumentada en un factor de 5,2 sobre su actividad
de antiproliferación respecto del
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his. De forma similar, el mutante D exhibe un 65% de
actividad de tipo natural en el ensayo antiviral, pero solamente un
20% de actividad de tipo natural en el ensayo de antiproliferación,
y así tiene actividad antiviral que está aumentada 3,4 veces sobre
su actividad de antiproliferación comparado con el tipo natural. El
mutante DE1 exhibe un 26% de la actividad de tipo natural en el
ensayo antiviral, pero solamente un 8,5% en el ensayo de
antiproliferación, y así tiene actividad antiviral que está
aumentada 3,0 veces sobre su actividad de antiproliferación
comparado con el interferón-beta-1a
de tipo natural marcado con his. Cuando se administren a una
concentración suficiente para alcanzar un nivel deseado de actividad
antiviral, estas proteínas mutantes mostrarán niveles
sustancialmente inferiores de actividad antiproliferativa que la
proteína de tipo natural. Se predice que las mutaciones de esta
clase, como las de la clase (a), son ventajosas en situaciones en
las que el beneficio terapéutico de la administración de
interferón-beta resulta de sus efectos antivirales,
y en las que los efectos antiproliferativos contribuyen a la
toxicidad o a efectos secundarios indeseados.
Mutante | Actividad antiviral (AV) | Actividad antiproliferativa (AP) | AV/AP |
(% de tipo natural) | (% de tipo natural) | ||
C1 | 571 | 109 | 5,2 |
D | 65 | 19 | 3,4 |
DE1 | 26 | 8,5 | 3,0 |
(c) Mutantes con actividades antiviral y
antiproliferativa que son bajas con respecto a la unión a receptor,
comparado con el interferón-beta-1a
de tipo natural marcado con his (véase la Tabla 4 más adelante). El
mutante A1 exhibe actividades antiviral y antiproliferativa que son
2,0 veces y 1,8 veces mayores que la observada para
interferón-beta-1a de tipo natural
marcado con his, pero se une al receptor afín de las células Daudi
con una afinidad que es 29 veces mayor que la del de tipo natural.
La unión de este mutante al receptor de IFN-beta se
aumenta así aproximadamente 15 veces comparado con las actividades
antiviral y de antiproliferación de la proteína. De forma similar,
los mutantes B2, CD2 y DE1 muestran aumentos de la unión sobre la
actividad antiviral de 4,6, 4,6 y 18 veces, respectivamente, y sobre
la actividad de antiproliferación de 3,5, 15 y 54 veces. Se predice
que estas proteínas son útiles como antagonistas funcionales de la
actividad de IFN-beta endógeno, y posiblemente de
otros interferones de tipo I endógenos, debido a que tienen la
capacidad de unirse y ocupar el receptor, y sin embargo generan
solamente una pequeña fracción de la respuesta funcional en las
células de interés que se observaría con IFN-beta de
tipo natural.
Mutante | Actividad antiviral | Actividad antiproliferativa | Actividad de unión | Unión/AV | Unión/AP |
(AV) (% t. n.) | (AP) (% t. n.) | a células (% t. n.) | |||
A1 | 200 | 180 | 2900 | 15 | 16 |
B2 | 7,1 | 9,2 | 33 | 4,6 | 3,5 |
CD2 | 150 | 46 | 690 | 4,6 | 15 |
DE1 | 26 | 8,5 | 460 | 18 | 54 |
Aunque las estructuras cristalinas publicadas
para una forma sin glicosilar de interferón beta murino (T. Senda,
S. Saitoh y Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant
Murine Interferon-\beta at 2.15 \ring{A}
Resolution. J. Mol. Biol. 253: 187-207
(1995)) y para interferón alfa-2b humano (R.
Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L.
Nagabhushan y M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human
Interferon-\alpha2b Revealed by
X-ray Crystallography. Structure. 4:
1453-1463 (1996)) han proporcionado modelos para el
esqueleto polipeptídico del interferón beta humano, se ha resuelto
recientemente la estructura para el
interferón-beta-1a en su estado
glicosilado (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N.
Lipscomb, y S.E. Goelz. The Crystal Structure of Human
Interferon-\beta at 2.2 \ring{A} resolution.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
11813-11818 (1997)).
Los resultados de los análisis de mutación se
pueden resumir con respecto a la estructura 3D de
interferón-beta-1a (no presentada
aquí). Ciertas mutaciones crearon una reducción en la actividad (2 a
>5 veces reducida). Las regiones mutadas correspondieron a las
sustituciones dadas en las tablas 1 y 2. Los residuos importantes
para la actividad antiviral y de antiproliferación se localizan en
la mitad inferior de la molécula de
IFN-beta-1a (panel a y b). Las
mutaciones en la mitad superior de la molécula, en la que están
situados los extremos amino- y carboxi-terminal, no
tuvieron efecto sobre las actividades biológicas o sobre la unión a
receptor.
Las mutaciones en la hélice A2, giros AB, AB2 y
hélice E son las más significativas en su efecto sobre la función, y
dieron como resultado una reducción dramática tanto en la actividad
como en la unión a receptor de superficie celular. Esta región
(hélice A2, giros AB y AB2 y hélice E) corresponde al sitio de unión
de IFNAR2, ya que ninguno de estos mutantes unió IFNAR/Fc en el
ensayo.
Aunque esas mutaciones que eran importantes para
la unión a IFNAR2 también afectaron a la unión celular, las
propiedades de unión a superficie celular también están
influenciadas por residuos en otras regiones de la molécula (hélice
B1, hélice C2). Se puede observar en los modelos 3D (no presentados
aquí) que describen los efectos de los mutantes por sustitución con
alanina que las regiones N-terminal,
C-terminal y hélice C glicosilada de la molécula de
IFN-beta-1a no se encuentran dentro
del sitio de unión a receptor. Las mutaciones en estas regiones no
redujeron la actividad biológica o la unión a receptor de superficie
celular.
Se diluyó intermedio en bruto de
interferón-beta-1a sin formular
(vendido como AVONEX ®) a 250 \mug/ml en fosfato sódico 100 mM de
pH 7,2, NaCl 200 mM) con un volumen igual de MES 100 mM de pH 5,0, y
el pH se ajustó a 5,0 con HCl. La muestra se cargó en una columna
SP-Sepharose ® FF (Pharmacia, Piscataway, NJ) a 6 mg
de interferón-beta-1a/ml de resina.
La columna se lavó con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 75 mM, y
el producto se eluyó con fosfato sódico 30 mM de pH 6,0, NaCl 600
mM. Se analizaron los valores de absorbancia de las fracciones de
elución a 280 nm, y la concentración de interferón de las muestras
se estimó a partir de la absorbancia usando un coeficiente de
extinción de 1,51 para una disolución de 1 mg/ml.
A una disolución de 1 mg/ml del
interferón-beta-1a del eluido de SP
se le añadió fosfato sódico 0,5 M de pH 6,0 hasta 50 mM,
cianoborohidruro sódico (Aldrich, Milwaukee, WI) a 5 mM, y aldehído
de PEG 20K (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) a 5 mg/ml. La
muestra se incubó a temperatura ambiente durante 20 horas. El
interferón pegilado se purificó de los productos de reacción
mediante etapas de cromatografía secuenciales en una columna de
separación por tamaño de FPLC Superose ® (Pharmacia) con fosfato
sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 150 mM como fase móvil y
SP-Sepharose ® FF. La columna de separación por
tamaño dio como resultado la separación inicial de interferón beta
modificado y sin modificar (cromatograma no presentado aquí). La
mezcla de elución que contenía PEG-interferón beta
procedente de la filtración en gel se diluyó 1:1 con agua y se cargó
a 2 mg de interferón beta/ml de resina en una columna de
SP-Sepharose ®. La columna se lavó con fosfato
sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 75 mM, y después el interferón beta
pegilado se eluyó de la columna con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5,
NaCl 800 mM. Se analizó el contenido de proteína en las fracciones
de elución mediante absorbancia a 280 nm. La concentración de
interferón pegilado se informa en equivalentes de interferón, ya que
el resto de PEG no contribuyó a la absorbancia a 280 nm
Se analizó el grado de modificación en las
muestras mediante SDS-PAGE (gel no presentado aquí).
La adición de un único PEG dio como resultado un desplazamiento en
la masa aparente de interferón de 20 kDa a 55 kDa, que fue
fácilmente aparente en el análisis. En la muestra pegilada no había
indicios de interferón-beta-1a sin
modificar ni de formas con masa superior resultantes de la presencia
de grupos PEG adicionales. La presencia de un único PEG se verificó
mediante espectrometría de masas MALDI. La especificidad de la
reacción de pegilación se analizó mediante cartografía de péptidos.
Se digirieron alícuotas de 20 \mug de
interferón-beta-1a pegilado y sin
modificar como control, en 240 \mul de Tris-HCl
200 mM de pH 9,0, EDTA 1 mM con 1,5 \mug de
lisil-endopeptidasa de Achromobacter (Wako
Bioproducts, Richmond, VA) durante 3-4 horas a 27ºC.
Se añadieron 200 mg de guanidina HCl a cada muestra y los productos
de escisión se fraccionaron en una columna Vydac C_{4} (0,46 x 25
cm) usando un gradiente de 30 min desde 0 hasta 70% de acetonitrilo,
en 0,1% de TFA con un caudal de 1,4 ml/min. Se monitorizó la
absorbancia a 214 nm en el efluente de la columna.
Los resultados del análisis se muestran en la
Figura 6. Todos los péptidos predichos de la digestión con
lisil-endopeptidasa de
interferón-beta-1a se han
identificado mediante secuenciación N-terminal y
espectrometría de masas y de éstos, solamente el péptido que
contiene el extremo N-terminal de interferón (AP8)
se alteró por la modificación, como es evidente por su desaparición
del gráfico. Los datos de cartografía indican, por lo tanto, que el
resto de PEG está unido específicamente a este péptido. Los datos
indican además que la modificación con PEG se dirige al extremo
N-terminal de la proteína, ya que solamente la
modificación N-terminal daría como resultado la
pérdida específica de este péptido.
Se obtuvieron indicios adicionales para esta
conclusión aislando el péptido N-terminal PEGilado
de la digestión con lisil-endopeptidasa, digiriendo
el péptido adicionalmente con bromuro de cianógeno (CNBr) y
sometiendo a esta muestra a análisis de secuencia mediante
descomposición metaestable por desorción/ionización con láser
asistida por matriz (MALDI PSD). La digestión con CNBr del péptido
N-terminal escindirá adicionalmente este péptido en
dos fragmentos, la metionina terminal (M1) que contiene el resto de
PEG y SYNLLGFLQR (residuos 2-11 de la secuencia de
interferón beta maduro). El análisis de la secuencia identificó el
péptido sin modificar SYNLLGFLQR, que era el resultado predicho de
este tratamiento.
La actividad antiviral de las muestras de
interferón-beta-1a se analizó con
células de carcinoma de pulmón humanas (células A549) que se habían
expuesto a virus de encefalomiocarditis (EMC) usando los
procedimientos que implican la tinción con MTT resumidos
anteriormente. Brevemente, las células A549 se pretrataron durante
24 horas con interferón-beta-1a o
interferón-beta-1a modificado con
PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3,
22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) antes de la exposición al virus.
El análisis se realizó usando puntos duplicados para cada
concentración de interferón-beta-1a.
Las desviaciones estándar se muestran como barras de error en la
Figura 7. La concentración de
interferón-beta-1a (formulada o en
bruto) que ofreció el 50% de destrucción viral (el "efecto
citopático del 50%") (50% de la DO_{450} máxima) fue de
alrededor de 11 pg/ml, y el efecto citopático del 50% para
interferón-beta-1a modificado con
PEG fue alrededor de 11 pg/ml. Así, la conjugación de PEG no alteró
la actividad antiviral de
interferón-beta-1a. En este ensayo,
se descubre de forma rutinaria que la actividad específica de
interferón-beta-1a es alrededor de
10 veces mayor que la actividad específica de
interferón-beta-1b, y por lo tanto
interferón-beta-1a PEGilado es
significativamente más activo que cualquier producto de
interferón-beta-1b.
Se PEGiló también
interferón-beta-1a con un resto de
PEG 5K-aldehído que se adquirió de Fluka, Inc. (nº
cat. 75936, Ronkonkoma, NY) siguiendo el mismo protocolo descrito
para la modificación con aldehídos de PEG 20K, excepto que la
reacción contenía 2 mg/ml de PEG 5K. La modificación con el PEG 5K
fue también sumamente específica para el extremo
N-terminal y no alteró la actividad antiviral de
interferón-beta-1a. Como el aducto
20K, el interferón-beta-1a
modificado con PEG 5K fue indistinguible del
interferón-beta-1a sin modificar en
el ensayo antiviral.
La agregación de interferón beta es un efecto
perjudicial para la actividad. Previamente se ha demostrado que la
glicosilación tiene un efecto dramático sobre la estabilidad de
interferón-beta-1a respecto de las
formas sin glicosilar de interferón beta, y se ha deducido que la
glicosilación contribuye a la actividad específica superior de
interferón-beta-1a (Runkel L. et
al., Pharm. Res. 15: 641-649). Para investigar
si la conjugación con polímero de polialquilenglicol podría
estabilizar adicionalmente interferón beta, se sometió al
interferón-beta-1a PEGilado a
agresión térmica usando el siguiente protocolo:
Se llevó a cabo la desnaturalización térmica
usando un espectrofotómetro de UV-visible CARY 3 con
un soporte de cubetas controlado por ordenador y calentado de forma
termoeléctrica. Las disoluciones de
interferón-beta-1a en HEPES 20 mM de
pH 7,5, NaCl 20 mM se equilibraron a 25ºC en una cubeta de 1 ml. La
temperatura del soporte de cubetas se elevó de 25ºC a 80ºC a una
velocidad de 2ºC/min, y la desnaturalización de la proteína se
siguió mediante monitorización continua de la absorbancia a 280 nm.
Se obtuvo el punto medio del suceso de desplegamiento cooperativo,
Tm, a partir de las curvas de desnaturalización, determinando la
temperatura a la que la absorbancia medida estuvo a medio camino
entre los valores definidos por las líneas extrapoladas de las
regiones lineales de cada lado de las transiciones de desplegamiento
cooperativo.
Los resultados de este análisis se muestran en la
Figura 8. Mientras el
interferón-beta-1a sin PEGilar se
desnaturalizó y agregó con un punto de transición del 50% a 60ºC, no
hubo indicios de agregación para el interferón PEGilado incluso a
80ºC. En un análisis independiente, se amplió el tratamiento de
agresión térmica a 95ºC, e incluso a esta temperatura más elevada no
se observaron indicios de agregación. Así, la conjugación con este
polímero de polietilenglicol tiene un efecto profundo y beneficioso
para la estabilidad de la proteína. Se observó una estabilización
similar con interferón-beta-1a
modificado que contenía los PEG de 20K y 5K.
Se inyectó i.v. a ratones (C57B1/6) por medio de
la vena de la cola 50.000 unidades de
interferón-beta-1a ó 50.000 unidades
de interferón-beta-1a PEGilado que
contenía PEG 20K o un volumen igual de tampón fosfato dado como
control. La sangre de estos ratones se obtiene por medio de
extracciones retroorbitales en diferentes tiempos después de la
inyección (inmediatamente, 0,25, 1, 4, 24 y 48 horas). Se extrae
sangre al menos a 3 ratones para cada tiempo. La sangre completa se
recoge en tubos que contienen anticoagulante, las células se
eliminan y el plasma resultante se congela hasta el momento del
análisis. Estas muestras de plasma se analizan después en ensayos
antivirales.
Las muestras de plasma se diluyen 1:10 en medios
sin suero y se pasan a través de un filtro de jeringa de 0,2 \mum.
Las muestras diluidas se analizan en ensayos antivirales. Las
muestras se titulan en pocillos designados de una placa de cultivo
de tejidos de 96 pocillos que contiene células A549. Se analizan en
cada placa diluciones de un
interferón-beta-1a patrón (10, 6,7,
4,4, 2,9, 1,3, 0,9 y 0,6 U/ml) y de cuatro muestras de plasma. Las
células A549 se pretratan con muestras de plasma diluido durante 24
horas antes de la exposición a virus EMC. Después de una incubación
de dos días con virus, las células viables se tiñen con una
disolución de MTT (a 5 mg/ml en tampón fosfato) durante 1 hora, se
lavan con tampón fosfato y se solubilizan con HCl 1,2 N en
isopropanol. Los pocillos se leyeron a 450 nm. Se generan curvas
patrón para cada placa y se usan para determinar la cantidad de
actividad de interferón-beta-1a en
cada muestra de prueba. La actividad en las muestras de los
diferentes ratones se representa gráficamente respecto de los
tiempos en la Figura 9.
La pérdida menor de
interferón-beta-1a PEGilado de la
circulación como función del tiempo indica que la semivida de la
muestra PEGilada es mucho más larga que la del control de
interferón-beta-1a sin tratar.
Mientras el control se aclaró en gran medida después de 4 h, se
detectó una fracción significativa del producto PEGilado después de
48 h. Basándose en los niveles iniciales de actividad en suero y los
que permanecen después de 48 h, se deduce que la semivida del
interferón PEGilado se alarga cuando se compara con la semivida del
interferón-beta-1a sin modificar. Un
segundo hallazgo sumamente significativo del estudio fue que se
perdió muy poca cantidad de la forma PEGilada durante la fase de
distribución, como se demuestra por los niveles elevados similares
de actividad a tiempo 0 y después de 60 min. Los datos indican que,
a diferencia del interferón-beta-1a
de control, la distribución del producto PEGilado se limita en gran
medida a la vasculatura.
Se llevan a cabo estudios comparativos con
conjugados de
polímero-interferón-beta 1a e
interferón-beta 1a nativo (como
interferón-beta-1a intermedio en
bruto sin formular en fosfato sódico y NaCl, pH 7,2) para determinar
su estabilidad y actividad relativas en primates. En estos estudios,
se compara la farmacocinética y la farmacodinámica del conjugado de
polímero-interferón-beta 1a en
primates con la del interferón-beta 1a nativo, y las
deducciones razonables se pueden ampliar a los humanos.
Este es un estudio de grupo paralelo, y de dosis
repetida para evaluar la farmacocinética y la farmacodinámica
comparativas de interferón-beta-1a
conjugado y sin conjugar.
Se usaron primates sanos (preferiblemente monos
rhesus) para este estudio. Antes de la dosis, se valorarán signos de
enfermedad en todos los animales por un veterinario de animales de
laboratorio en dos ocasiones dentro de los 14 días anteriores a la
administración del artículo de prueba; una evaluación debe ser
dentro de las 24 horas anteriores a la primera administración del
artículo de prueba. Solamente los animales sanos recibirán este
artículo de prueba. Las evaluaciones incluirán un examen físico
general y extracciones de sangre anteriores a la dosis para
determinar la patología clínica inicial y la concentración de
anticuerpos inicial para
interferón-beta-1a. Todos los
animales se pesarán y se registrarán las temperaturas corporales
dentro de las 24 horas anteriores a las administraciones del
artículo de prueba.
Se utilizan y se asignan doce sujetos a grupos
para recibir 1 MU/kg de
interferón-beta-1a como conjugado de
PEG-interferón-beta-1a
o sin conjugar, pero por lo demás
interferón-beta-1a idéntico. La
administración es por vía subcutánea (SC) o intravenosa (IV). Todos
los animales deben no haber sido sometidos a tratamiento previo con
interferón-beta. A cada animal se le administrará la
dosis en dos ocasiones; las dosis irán separadas por cuatro semanas.
El volumen de dosis será de 1,0 ml/kg.
Se extrae sangre para las pruebas
farmacocinéticas en diversos intervalos de tiempo después de cada
inyección. También se extraen muestras de sangre para las medidas
del marcador de respuesta biológica inducida por interferón,
neopterina sérica, después de la administración del fármaco en
estudio.
Las evaluaciones durante el periodo de estudio
incluyen observaciones clínicas realizadas 30 minutos y 1 hora
postdosis en busca de signos de toxicidad. Se realizarán
observaciones diarias en las jaulas y se registrará la apariencia
general, signos de toxicidad, molestias y cambios en el
comportamiento. Los pesos corporales y las temperaturas corporales
se registrarán a intervalos regulares durante 21 días postdosis.
Las concentraciones de interferón beta en suero
se cuantifican usando un bioensayo de efecto citopático (ECP). El
ensayo de ECP mide los niveles de actividad antiviral mediada por
interferón. El nivel de actividad antiviral en una muestra refleja
el número de moléculas de interferón activo contenidas en esa
muestra en el momento en el que se extrae la sangre. Esta
aproximación ha sido el método estándar para analizar la
farmacocinética de interferón beta. El ensayo de ECP usado en el
estudio actual detecta la capacidad de interferón beta para proteger
células de carcinoma de pulmón humanas (A549,
#CCL-185, ATCC, Rockville, MD) a partir de la
citotoxicidad debida al virus de encefalomiocarditis (EMC). Las
células se preincuban durante 15 a 20 horas con muestras de suero
para permitir la inducción y síntesis de proteínas inducibles por
interferón que después provocan una respuesta antiviral. Después, se
añade el virus EMC y se incuba durante 30 horas adicionales antes de
hacer el análisis de la citotoxicidad usando una tinción de violeta
cristal. Se analiza un patrón de interferón beta interno, así como
un patrón interno de conjugado con PEG, de forma concurrente con las
muestras en cada placa de ensayo. Este patrón se calibra con
respecto a un patrón de referencia de interferón natural de
fibroblastos humanos (WHO Second International Standard for
Interferon, Human Fibroblast,
Gb-23-902-53). Cada
placa de ensayo también incluye pocillos de control de crecimiento
celular que no contienen ni interferón beta de ningún tipo ni EMC,
y pocillos de control viral que contienen células y EMC pero sin
interferón beta. Las placas de control que contienen el patrón y las
muestras también se preparan para determinar el efecto, si procede,
de las muestras sobre el crecimiento celular. Estas placas se tiñen
sin la adición de virus.
Las muestras y los patrones se analizan por
duplicado en cada una de las dos placas de ensayo duplicadas, lo que
produce cuatro puntos por muestra. Se informa la concentración media
geométrica de los cuatro duplicados. El límite de detección en este
análisis es 10 unidades (U)/ml.
Las concentraciones séricas de neopterina se
determinan en la unidad de farmacología clínica usando análisis
disponibles comercialmente.
Se usa el programa informático RstripTM
(MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para ajustar los datos a
modelos farmacocinéticos. Se trazan las concentraciones medias
geométricas por tiempo para cada grupo. Ya que los resultados del
ensayo se expresan en diluciones, las medias geométricas se
consideran más apropiadas que las medias aritméticas. Las
concentraciones de interferón sérico se ajustan a los valores
iniciales y las concentraciones séricas indetectables se establecen
en 5 U/ml, que representa un medio del límite de detección
inferior.
Para los datos de infusión IV, se ajusta un
modelo de infusión IV de dos compartimentos a las concentraciones
séricas detectables para cada sujeto, y los datos SC se ajustan a un
modelo de inyección de dos compartimentos.
Se calculan los siguientes parámetros
farmacocinéticos:
- (i)
- concentración máxima observada, C_{max} (U/ml);
- (ii)
- área bajo la curva de 0 a 48 horas, ABC usando la regla trapezoidal;
- (iii)
- semivida de eliminación;
y de los datos de infusión IV (si se emplea
IV):
- (iv)
- semivida de distribución (h);
- (v)
- aclaramiento (ml/h);
- (vi)
- volumen aparente de distribución, Vd (L).
Se usa del programa informático WinNonlin
(Scientific Consulting Inc., Apex, NC) para calcular las semividas
de eliminación después de inyección SC e IV.
Para neopterina, se presentan las medias
aritméticas por tiempo para cada grupo. Se calcula E_{max}, la
máxima carga a partir del valor inicial. C_{max}, ABC y E_{max}
se someten a un análisis de varianza de un factor para comparar
grupos de dosis. C_{max} y ABC se transforman de forma logarítmica
antes del análisis; se informan las medias geométricas.
Se administró interferón beta-1a
o IFN beta-1a PEGilado a monos rhesus en el día 1 y
otra vez en el día 29 por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC)
como se describió en el protocolo general del Ejemplo 5. En el día
1, seis monos recibieron IFN beta-1a (3 por vía) y
otros seis monos recibieron IFN beta-1a PEGilado (3
por vía). En el día 29 las dosis se repitieron. La dosis IV se
administró como una inyección de bolo lenta en una vena cefálica o
safena.
La dosis SC se administró bajo la piel de la
espalda después de afeitar el sitio de inyección. Se recogió sangre
por medio de la vena femoral en los tiempos especificados y se dejó
coagular para obtener suero. Se analizaron las concentraciones de
sustancias farmacológicas funcionales en el suero usando un método
de ECP antiviral validado, y las concentraciones de neopterina y
\beta2-microglobulina sérica como medidas
farmacodinámicas de la actividad. Se calcularon los parámetros
farmacológicos usando el programa informático WinNonlin versión 2.0
(Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Los datos de concentración se analizaron mediante
métodos independientes de modelo estándar (análisis no
compartimental) para obtener los parámetros farmacocinéticos. Se
calculó el área bajo la curva (ABC) usando la regla trapezoidal. Los
análisis estadísticos, que incluyen la media aritmética y la
desviación estándar, se realizaron usando del programa informático
Microsoft Excel versión 5.0 (Microsoft Corp., Redmond WA). Los
valores de concentración informados como inferiores a los límites de
cuantificación (BLQ) no se usaron en el análisis farmacocinético.
Debido al hecho de que diferentes ordenadores y programas
informáticos redondean o truncan los números de forma diferente,
los valores en algunas tablas (p.ej. medias, desviaciones estándar o
valores individuales) pueden diferir ligeramente de los de otras
tablas, a partir de los datos calculados de forma individual, o a
partir de los datos de los análisis estadísticos. Ni la integridad
ni la interpretación de los datos se vio afectada por estas
diferencias.
\newpage
Dentro de cada vía de administración, IFN
beta-1a pegilado exhibió una biodisponibilidad
superior (tal como se mide mediante el área bajo la curva de
concentración sérica-tiempo). Además, el IFN
beta-1a pegilado tuvo una biodisponibilidad absoluta
superior comparado con IFN beta-1a cuando se
administró por vía SC. Se resumen los parámetros farmacocinéticos en
la Tabla 5. La administración de IFN beta-1a
pegilado por ambas vías IV y SC da como resultado un incremento de
la semivida, así como el ABC de IFN beta-1a.
Formulación (vía de | C_{max} | T_{max} | ABC | CL | Vss | T_{1/2} |
administración) | U*h/ml | (ml/kg) | (ml/kg) | |||
IFN B-1a (IV) | 6400 | 0,083 | 4453 | 229 | 543 | 3,2 |
(\pm0) | (\pm0) | (\pm799) | (\pm38) | (\pm147) | (\pm1,4) | |
IFN-B-1a | 10800 | 0,083 | 34373 | 29 | 250 | 9,5 |
pegilado (IV) | (\pm3811) | (\pm0) | (\pm3601) | (\pm3) | (\pm30) | (\pm2,1) |
IFN B-1a (SC) | 277 | 5,3 | 4753 | N/D | N/D | 10,0 |
(\pm75) | (\pm1,2) | (\pm3170) | (\pm2,9) | |||
IFN B-1a | 1080 | 3,3 | 42283 | N/D | N/D | 22,0 |
pegilado (SC) | (\pm381) | (\pm1,2) | (\pm5934) | (\pm3,4) | ||
^{a}n=3 |
Después de la administración IV de la primera
dosis, las concentraciones séricas máximas (Cmax) medias (\pm
desv. est.) de IFN beta-1a e IFN
beta-1a pegilado fueron 6400 (\pm 0) y 10800
(\pm 3,5) U/ml, respectivamente. Los valores de ABC medios (\pm
desv. est.) fueron 4453 (\pm 799) y 34373 (\pm 3601) U*h/ml,
respectivamente. Después de la primera administración SC, la Cmax
media (\pm desv. est.) de IFN beta-1a e IFN
beta-1a pegilado fueron 277 (\pm 75) y 1080 (\pm
381) U/ml, respectivamente. Los valores de ABC medios (\pm desv.
est.) fueron 4753 (\pm 3170) y 44952 (\pm 1443) U*h/ml,
respectivamente.
Las concentraciones de neopterina sérica y
\beta2-microglobulina sérica fueron elevadas
después del tratamiento con IFN-beta e
IFN-beta pegilado, lo que indica actividad
farmacológica de los productos. A las dosis elevadas de los
compuestos de prueba usados, no hubo diferencia en la actividad
farmacológica de IFN beta-1a e IFN
beta-1a pegilado por ninguna vía de administración
(datos no mostrados).
El propósito de este estudio fue determinar la
biodisponibilidad comparativa de interferón beta-1a
e interferón beta-1a pegilado mediante diversas vías
de administración.
Se usaron ratas Lewis hembra (190 gramos cada
una) para los análisis farmacocinéticos con dos ratas por
vía/formu-
lación. Se aplicó una cánula yugular y se administró interferón beta-1a humano o interferón beta-1a humano 5K PEGilado o un interferón beta-1a humano 20K PEGilado (en un vehículo que consistía en 14 mg/ml de HSA en fosfato sódico 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2) de forma intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutánea o intratraqueal. La sangre se procesó varias veces a lo largo de un período de 72 horas a los 0, 5 min, 15 min, 30 min,75 min, 3 h, 24 h, 48 h y 72 h. El protocolo se presenta en la Tabla 6. El bioensayo de efecto citopático (ECP) se llevó a cabo con las muestras de suero para detectar interferón-beta en el suero. Los resultados generados con interferón beta-1a sin modificar e interferón beta-1a pegilado con PEG 20K se presentan en la Tabla 7. En todos los casos la pegilación dio como resultado incrementos significativos en T_{1/2} y ABC.
lación. Se aplicó una cánula yugular y se administró interferón beta-1a humano o interferón beta-1a humano 5K PEGilado o un interferón beta-1a humano 20K PEGilado (en un vehículo que consistía en 14 mg/ml de HSA en fosfato sódico 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2) de forma intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutánea o intratraqueal. La sangre se procesó varias veces a lo largo de un período de 72 horas a los 0, 5 min, 15 min, 30 min,75 min, 3 h, 24 h, 48 h y 72 h. El protocolo se presenta en la Tabla 6. El bioensayo de efecto citopático (ECP) se llevó a cabo con las muestras de suero para detectar interferón-beta en el suero. Los resultados generados con interferón beta-1a sin modificar e interferón beta-1a pegilado con PEG 20K se presentan en la Tabla 7. En todos los casos la pegilación dio como resultado incrementos significativos en T_{1/2} y ABC.
Formulación (vía de | C_{max} | T_{max} | ABC/dosis | T_{1/2} |
administración) | (U/ml) | (hr) | (U hr)/(ml \mug) | (hr) |
IFN (dosis IV, 20 \mug) | 64000 | 0,25 | 3035 | 1,25 |
IFN-PEG (dosis IV, 3 \mug) | 23970 | 0,08 | 47728 | 8,44 |
IFN (dosis SC, 20 \mug) | 2400 | 1,00 | 464,4 | 0,96 |
IFN-PEG (dosis SC, 3 \mug) | 2400 | 7,0 | 14688 | 11,9 |
IFN (dosis IP, 20 \mug) | 26000 | 1,25 | 4159 | 1,53 |
IFN-PEG (dosis IP, 3 \mug) | 9700 | 1,25 | 52148 | 16,2 |
IFN-PEG (dosis IT, 15 \mug) | 240 | 1,5 | 70,7 | 1,29 |
IFN-PEG (dosis IT, 15 \mug) | 270 | 7,0 | 233,5 | 6,21 |
Se mantienen en cultivo células endoteliales
venosas humanas (Cell Systems, cat. # 2V0-P75) y
células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems,
cat. # 2M1-C25) con CS-C Medium Kit
(Cell Systems, cat. # 4Z0-500). Veinticuatro horas
antes del experimento las células se tratan con tripsina, y se
resuspenden en medio de ensayo, 90% de M199 y 10% de suero bovino
fetal (FBS), y se ajustan a la densidad celular deseada. Después las
células se colocan en placas de 24 ó 96 pocillos revestidas con
gelatina, a 12.500 células/pocillo o a 2.000 células/pocillo,
respectivamente.
Después de incubar durante la noche, el medio de
ensayo se sustituye con medio fresco que contiene 20 ng/ml de
Fibroblast Growth Factor (Becton Dickinson, Cat. # 40060) básico
recombinante humano y diversas concentraciones de proteínas de
interferón-beta-1a conjugadas y sin
conjugar o control positivo (se puede usar endostatina como control
positivo, como se podría hacer con un anticuerpo para bFGF). El
volumen final se ajusta a 0,5 ml en la placa de 24 pocillos o 0,2 ml
en la placa de 96 pocillos.
Después de setenta y dos horas, las células se
tratan con tripsina para contarlas en un Coulter, se congelan para
la lectura de fluorescencia con CyQuant, o se marcan con [3H]
timidina. La inhibición de la proliferación de células endoteliales
in vitro mediante interferón-beta 1a
conjugado y sin conjugar fue comparable, lo que indica que la
PEGilación no interfirió con la capacidad del interferón para
funcionar en esta situación.
Este análisis in vitro analiza los efectos
sobre la proliferación de células endoteliales de las moléculas de
interferón-beta humano de la invención, que pueden
ser indicativos de efectos anti-angiogénicos in
vivo. Véase O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G.
Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, y J. Folkman.
(1997). Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and
Tumor Growth. Cell 88, 277-285.
Se ha desarrollado una diversidad de modelos para
analizar los efectos anti-angiogénicos y de
anti-neovascularización de las moléculas descritas
aquí. Algunos de estos modelos se han descrito en las patentes de
Estados Unidos nºs 5.733.876 (31 de mar. de 1998: "Método para
inhibir la angiogénesis") y 5.135.919 (4 de ago. de 1992:
"Método y composición farmacéutica para la inhibición de la
angiogénesis"). Otros ensayos incluyen el ensayo de la membrana
corioalantoidea (MCA) sin cáscara de S. Taylor y J. Folkman; Nature,
297,307 (1982) y R. Crum. S. Szabo y J. Folkman; Science. 230.1375
(1985); el modelo de antiangiogénesis del método de saco de aire
dorsal en ratón de Folkman, J. et al.; J. Exp. Med., 133, 275
(1971) y el ensayo de microbolsa corneal en rata de Gimbrone, M.A.
Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 413 (1974) en el que la
vascularización corneal se induce en ratas macho adultas de la raza
Sprague-Dawley (Charles River, Japón) implantando
miniesferas de 500 ng de FGF básico (bovino, R & D Systems,
Inc.) impregnado con EVA (copolímero de
etileno-acetato de vinilo) en cada córnea.
Otros métodos para analizar los efectos
anti-angiogénicos de interferón-beta
murino PEGilado en un modelo animal incluyen (pero no se limitan a)
los protocolos para cribar nuevos agentes antineoplásicos
potenciales como se describe en Cancer Chemotherapy Reports, parte
3, vol. 3, nº 2, septiembre de 1972 original y en el suplemento
In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH
Publication No. 84-2635, febrero de 1984.
Debido a las barreras entre especies de los
interferones de tipo I, para analizar la actividad
anti-angiogénica de interferón-beta
conjugado con polímero en modelos de roedores, se generan
preparaciones de interferón-beta de roedor conjugado
con polímero. Tales métodos de cribado se ejemplifican mediante un
protocolo para analizar los efectos
anti-angiogénicos del
interferón-beta murino pegilado sobre el carcinoma
pulmonar de Lewis implantado de forma subcutánea.
Apareció de forma espontánea en 1951 como un
carcinoma de pulmón en un ratón C57BL/6.
Resumen de los procedimientos de ensayo:
Se implanta un fragmento de tumor de forma subcutánea en la región
axilar de un ratón B6D2F1. El agente de ensayo (es decir, un
interferón PEGilado de la invención) se administra en dosis
diversas, de forma subcutánea (SC) o intraperitoneal (IP) en
múltiples días después de la implantación del tumor. El parámetro
medido es el tiempo de supervivencia medio. Los resultados se
expresan como un porcentaje del tiempo de supervivencia de
control.
Propagación: Ratones C57BL/6.
Ensayo: Ratones B6D2F1
Peso: Los ratones deberían estar dentro de un
intervalo de peso de tres gr con un peso mínimo de 18 gr para los
machos y 17 gr para las hembras.
Sexo: Se usa un sexo para todos los animales de
ensayo y de control en un experimento.
Fuente: Una fuente, si es factible, para todos
los animales en un experimento.
Diez animales por grupo de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento: Preparar un fragmento de
2-4 mm de un tumor s.c. donante
Tiempo: Día 13-15
Localización: Implantar el fragmento s.c. en la
región axilar con una punción en la región inguinal.
Fragmento: Preparar un fragmento de
2-4 mm de un tumor donante s.c.
Tiempo: Día 13-15
Localización: Implantar el fragmento s.c. en la
región axilar con una punción en la región inguinal.
\vskip1.000000\baselineskip
- Día 0:
- Implantar el tumor. Establecer cultivos bacterianos. Ensayar el compuesto de control positivo en cada experimento impar. Preparar los materiales. Registrar las muertes diariamente.
- Día 1:
- Comprobar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado. Aleatorizar los animales. Tratar como se indicó (en el día 1 y en los siguientes días).
- Día 2:
- Volver a comprobar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado.
- Día 5:
- Pesar el día 2 y el día de la evaluación inicial de la toxicidad del agente de ensayo
- Día 14:
- Controlar las muertes prematuras
- Día 48:
- Controlar los "no prendidos"
- Día 60:
- Finalizar y evaluar el experimento. Examinar los pulmones macroscópicamente en busca de tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
Programar el calendario del compuesto de control
positivo (NSC 26271 (citoxano a una dosis de 100
mg/kg/inyec-
ción)) en cada experimento impar, para el que el régimen es intraperitoneal solamente en el día 1. El límite inferior de ensayo/control para el control positivo es el 140%. El tiempo de supervivencia medio del control sin tratar aceptable es 19-35,6 días.
ción)) en cada experimento impar, para el que el régimen es intraperitoneal solamente en el día 1. El límite inferior de ensayo/control para el control positivo es el 140%. El tiempo de supervivencia medio del control sin tratar aceptable es 19-35,6 días.
El parámetro medido es el tiempo de supervivencia
medio. Calcular los pesos corporales medios de los animales para el
día 1 y el día 5, calcular la proporción ensayo/control para todos
los grupos de ensayo. Se calculan los pesos corporales medios de los
animales para el día de inicio y el día de la evaluación final. La
proporción ensayo/control se calcula para todos los grupos de ensayo
con >65% de supervivientes en el día 5. Un valor de la
proporción ensayo/control <86% indica toxicidad. Una diferencia
de cambio de peso corporal excesiva (ensayo menos control) se puede
usar también al evaluar la toxicidad.
Una proporción inicial ensayo/control mayor o
igual a 140% se considera necesariamente que demuestra una actividad
moderada. Un valor de la proporción ensayo/control reproducible
mayor o igual de 150% se considera actividad significativa.
Claims (20)
1. Una composición que comprende un
interferón-beta-1a glicosilado
(IFN-\beta) que comprende la secuencia de
aminoácidos
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNI
FAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEY
SHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN acoplada a un polímero que no se da en la naturaleza en un extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a glicosilado, y dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.
FAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEY
SHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN acoplada a un polímero que no se da en la naturaleza en un extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a glicosilado, y dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que el resto de polialquilenglicol está acoplado al
interferón-beta por medio de un grupo seleccionado
de un grupo aldehído, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un
grupo haloacetato, una pluralidad de residuos de histidina, un grupo
hidrazina y un grupo aminotiol.
3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en
la que el interferón-beta-1a
(IFN-\beta) es una proteína de fusión de
interferón-beta-1a.
4. La composición de la reivindicación 3, en la
que la proteína de fusión de
interferón-beta-1a comprende una
porción de una molécula de inmunoglobulina.
5. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el
interferón-beta-1a está acoplado al
polímero en un sitio por medio de un resto de glicano del
interferón-beta-1a.
6. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que el polímero tiene un peso
molecular de alrededor de 5 a alrededor de 40 kilodaltons.
7. Una composición farmacéutica que comprende la
composición de interferón-beta de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. El uso de la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de una composición
farmacéutica.
9. El uso de una composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de una composición
farmacéutica para tratar tumores y cánceres, trastornos autoinmunes,
enfermedades víricas o enfermedades angiogénicas.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dichos tumores y cánceres se seleccionan del grupo que consiste en
sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma
de mama, melanoma y carcinoma nasofaríngeo.
11. El uso de la reivindicación 9, en el que
dichos trastornos autoinmunes se seleccionan del grupo que consiste
en fibrosis, lupus y esclerosis múltiple.
12. El uso de la reivindicación 9, en el que
dichas enfermedades víricas se seleccionan del grupo que consiste en
infección por ECM, gripe, infecciones víricas del tracto
respiratorio, rabia y hepatitis.
13. El uso de la reivindicación 9, en el que
dichas enfermedades angiogénicas se seleccionan del grupo que
consiste en retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad,
degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma
neovascular, fibroplasias retrolenticulares, rubeosis y síndrome de
Osler-Webber.
14. Una composición que comprende un mutante de
interferón-beta-1a glicosilado
(IFN-\beta) seleccionado del grupo que consiste
en
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
MAYAALGALQASSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMN
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
MSYNLLGFLQRSSNAACAALLAALNGRLEYCLKDRMN
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRAAACAADRMN
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
FDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRAA
FAIPAEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
FAIPAEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
\newpage
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMN
FDIPEEIAAAAAFAAADAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
FDIPEEIAAAAAFAAADAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDF
TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN,
IFN-\beta que comprende la
secuencia de aminoácidos
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IFN-\beta que comprende la
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TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRAEILANFARIARLTGYLRN acoplada a un polímero que no se da de forma natural en el extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a glicosilado, y dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.
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TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRAEILANFARIARLTGYLRN acoplada a un polímero que no se da de forma natural en el extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a glicosilado, y dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.
15. La composición de la reivindicación 14, en la
que el mutante de interferón-beta-1a
glicosilado es una proteína de fusión de
interferón-beta-1a.
16. La composición de la reivindicación 14, en la
que la proteína de fusión de
interferón-beta-1a comprende una
porción de una molécula de inmunoglobulina.
17. Una composición farmacéutica que comprende la
composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.
18. Un método in vitro para prolongar la
actividad de interferón-beta-1a en
un sistema in vitro, que comprende acoplar dicho
interferón-beta-1a en un extremo
N-terminal a un resto de polímero que no se da de
forma natural para producir una composición de
polímero-interferón-beta-1a
acoplado, e introducir la composición de
polímero-interferón-beta-1a
acoplado en el sistema in vitro.
19. El uso de un resto de polímero que no se da
de forma natural para producir una composición de
polímero-interferón-beta-1a
acoplado como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6
para la preparación de una composición farmacéutica.
20. El uso de la composición de la reivindicación
6 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir
la angiogénesis en un sujeto.
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