JP5863865B2 - インターフェロン−β−１ａのポリマー結合体および使用 - Google Patents

Description

（発明の背景）
特定の疾患の全身処置に関するポリペプチドおよびタンパク質の使用は、今や、医学現場で十分に受け入れられている。これらの物質が治療において果たす役割は非常に重要であるので、組換えＤＮＡ技術による大量の合成に関して多くの研究活動が行われている。これらのポリペプチドの多くは、それらの生物学的作用を誘発する際に非常に強力かつ特異的な内因性分子である。

意図された適用に関してこれらのタンパク質性物質の有用性を制限する主要な因子は、非経口的に与えられた場合、それらが短時間で体内から排出されてしまうことである。このことは、プロテアーゼによるか、または腎臓における濾過によるようなタンパク質排出のための正常な経路を用いるクリアランスによる代謝の結果として生じ得る。これらの物質の投与の経口経路は、胃におけるタンパク質分解に加えて、胃が高酸性であることにより、それらが意図された標的組織に達する前にそれらが破壊されるので、よりいっそう問題である。タンパク質のこれらの投与経路と関連した問題は、製薬産業において周知であり、そして種々のストラテジーがこの問題を解決するための試みにおいて用いられている。

タンパク質安定性を扱う大量の研究が発表されている。ポリマー物質とタンパク質を結合体化する種々の方法が公知であり、これらの方法としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸の使用が挙げられる。得られた結合体化ポリペプチドは、非経口適用に関して、それらの生物学的活性および水溶性を維持することが報告されている。

これまで多くの臨床研究の焦点であり、そしてその投与および生物同化を改善する取り組みの焦点であったペプチドファミリーは、インターフェロンである。インターフェロンは、種々の臨床疾患状態において試験されてきた。そのファミリーの１メンバーであるヒトインターフェロンβの使用は、多発性硬化症の処置において最も確立されている。２つの形態の組換えインターフェロンβが、この疾患の処置のために欧州および米国で最近認可された。一方の形態は、インターフェロン−β−１ａ（商標登録されており、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）として販売されている、製造Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）であり、そして本明細書中以降、「インターフェロン−β−１ａ」または「ＩＦＮ−ベータ−１ａ」または「ＩＦＮ−β−１ａ」または「インターフェロン−β−１ａ」が交換可能に使用される。他方の形態は、インターフェロン−β−１ｂ（商標登録されており、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）として販売、Ｂｅｒｌｅｘ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）（本明細書中以降「インターフェロン−β−１ｂ」）である。インターフェロン−β−１ａは、天然のヒト遺伝子配列を用いて哺乳動物細胞中で生成され、そしてグリコシル化されるが、それに対してインターフェロン−β−１ｂは、アミノ酸１７位で遺伝子操作されたシステインからセリンへの置換を含み、そしてグリコシル化されていない、改変ヒト遺伝子配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌において生成される。

以前に、本発明者らの数名が、インターフェロン−β−１ａおよびインターフェロン−β−１ｂの相対的インビトロ効力を、機能的アッセイにおいて直接比較し、そしてインターフェロン−β−１ａの比活性が、インターフェロン−β−１ｂの比活性の約１０倍を超えることを示した（非特許文献１：Ｒｕｎｋｅｌら，１９９８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：６４１−６４９）。これらの活性差異に関する構造的基礎を同定するために設計した研究から、本発明者らは、比活性に影響を及ぼした産物間のわずか１つだけの既知の構造的差異として、グリコシル化を同定した。糖質の効果は、構造に関してその安定化する役割を介して大きく表れた。糖質の安定化効果は、熱変性実験およびＳＥＣ分析において明らかであった。グリコシル化の欠如はまた、凝集の増加および熱変性に対する感受性の増加と相関した。ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いたインターフェロン−β−１ａからの糖質の酵素的除去は、グリコシル化産物の大量の沈澱を生じた。

これらの研究は、インターフェロン−β−１ａとインターフェロン−β−１ｂとの間の配列における保存にも拘わらず、それらが、生化学的実体として異なり、従って、インターフェロン−β−１ｂについて公知であることの多くが、インターフェロン−β−１ａに適合し得ないことを示し、逆もまた然りである。

Ｒｕｎｋｅｌら，１９９８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：６４１−６４９

（発明の要旨）
本発明者らは、非グリコシル化形態と比較してグリコシル化インターフェロン−βの利点を利用した。特に、本発明者らは、インターフェロン−β−１ｂと比較して増加した活性を有するインターフェロン−β−１ａ組成物を開発し、そしてこれはまた、一般に、結合体化されていないインターフェロン−β−１ａ形態と比較して、事実上の活性喪失がない、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）タンパク質の有効な（ｓａｌｕｔｏｒｙ）特性を有する。従って、産物（ポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体）がそれらの生物学的活性の全てまたは大部分を保持する方法で改変が行われる場合、以下の特性が生じ得る：増加した半減期および組織分布の改変（例えば、長期間にわたり血管系にとどまる能力）を導く、変化した薬物動態学および薬力学；溶液における安定性の増加；免疫原性の減少；タンパク質分解消化からの保護；および活性のその後の消滅。このような処方は、薬学分野および医学分野における実質的進歩であり、そしてインターフェロンがいくらかの有用性を有する種々の疾患（例えば、多発性硬化症、線維症、ならびに他の炎症性疾患または自己免疫疾患、癌、肝炎、および他のウイルス性疾患）の管理に有意に寄与する。特に、血管系に長期間とどまる能力は、インターフェロン−β−１ａを使用して、脈管形成を阻害し、そして潜在的に血液脳関門を通過させることを可能にする。さらに、ポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体を作製することによって得られる熱安定性は、吸入を介するその後の投与において使用するためにインターフェロン−β−１ａを散剤形態に処方する場合、有利である。

本発明者らは、インターフェロン−β−１ａの結晶学的構造の知識を用い、そしてインターフェロン−β−１ａ−ポリマー結合体を開発した。ここで、このポリマーは、結合体が、結合体化していないインターフェロン−β−１ａと比較して、インターフェロン−β−１ａの十分な活性を保持することを可能にするインターフェロン−β−１ａの部位に連結されている。

本発明の１つの局面は、結合体化インターフェロン−β−１ａ複合体であり、ここでこのインターフェロン−β−１ａは、ポリアルキレングリコールをその不可欠部分として組み込む、ポリマーに共有結合されている。

１つの特定の局面において、本発明は、ポリアルキレングリコール部分を含むポリマーと連結された生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａを含む、生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａ組成物に関する。ここで、この組成物中の生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａが、インターフェロン−β−１ａ単独（すなわち、それらに連結されるポリマーが欠けている、非結合体化形態）と比較して増強した半減期を有するように、このインターフェロン−β−１ａおよびポリアルキレングリコール部分が配置されている。

本発明の別の局面は、ポリマーと連結された生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａを含む、インターフェロン−β−１ａ組成物である。ここで、このインターフェロン−β−１ａは、融合タンパク質（好ましくは、免疫グロブリン融合物）である。このような複合体において、Ｎ末端の最も近位（ポリマーとの結合体化部位）およびＣ末端（Ｉｇ部分との融合部位）は、ポリマー結合体化が、この融合タンパク質の免疫原性を低減し得ることを示唆する。

別の局面において、本発明は、ポリアルキレングリコール部分を含むポリマーと連結された生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａを含む、生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａ組成物に関する。ここで、この組成物中の生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａが、インターフェロン−β−１ｂ単独（すなわち、それらに連結されるポリマーが欠けている、非結合体化形態）と比較して増強した活性を有するように、このインターフェロン−β−１ａおよびポリアルキレングリコール部分が配置されている。

本発明の別の実施形態は、結合体化したインターフェロン−β−１ａタンパク質である。結合体化したインターフェロン−β−１ａタンパク質のインターフェロン−β−１ａ部分は、非変異形態のインターフェロンβ−１ａと比較して、選択的に増強した抗ウイルス活性および／または抗増殖活性を有するムテインを提供するように変異されている。

本発明は、さらなる局面において、生理学的に適合性のポリエチレングリコール部分に共有結合的に連結された、生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａを含む、安定な水溶性の結合体化インターフェロン−β−１ａ複合体に関する。このような複合体において、このインターフェロン−β−１ａは、不安定な共有結合により、このインターフェロン−β−１ａの遊離アミノ基（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）でこの生理学的に適合性のポリエチレングリコール部分に共有結合的に連結され得、ここでこの不安定な共有結合が、生化学的加水分解および／またはタンパク質分解によりインビボで切断される。

別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、および生理学的に適合性のポリエチレングリコールに連結されたインターフェロン−βを含む、安定な水溶性のインターフェロン−β−１ａ複合体を含有する、投薬形態に関する。

別の局面において、例えば、上記のような共有結合的に連結したインターフェロン−β−１ａ組成物は、診断適用またはインビトロ適用に関して意図したインターフェロン−β−１ａを利用し得る。ここで、このインターフェロン−β−１ａは、例えば、イムノアッセイまたは他の診断適用または非インビボ適用のための診断試薬である。このような非治療的適用において、本発明の複合体は、例えば、適合性溶媒または他の溶液ベースの処方物に処方されて、分解に対して抵抗性が増強している安定な組成形態を提供し得る、安定化した組成物として非常に有用に使用され得る。

非毒性ポリマーを用いたインターフェロン−β−１ａの改変は、特定の利点を提供しうる。産物（ポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体）がそれらの生物学的活性の全てまたは大部分を保持する方法で改変が行われる場合、以下の特性が生じ得る：増加した半減期および組織分布の改変（例えば、長期間にわたり血管系にとどまる能力）を導く、変化した薬物動態学および薬力学；溶液における安定性の増加；免疫原性の減少；タンパク質分解消化からのこの改変インターフェロン−β−１ａの保護；および活性のその後の消滅；経口使用または吸入使用のために散剤化したインターフェロン−β−１ａのより有効な処方物をもたらす、熱安定性の増加。

上記のように改善した特性を付与したインターフェロン−β−１ａは、経口投与、エアロゾル投与、または非経口投与のいずれかに従う治療として有効であり得る。他の投与経路（例えば、経鼻および経皮）もまた、改変インターフェロン−β−１ａを用いて可能である。

本発明の別の局面は、脈管形成および新生血管形成をを阻害する方法であり、この方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する。血管系におけるインターフェロンのレベルおよび持続時間の増加の結果として、本発明のＰＥＧ化産物は、脈管形成インヒビターとして特に有効であるはずである。

非治療（例えば、診断）適用において、インターフェロンβの診断種および／または試薬種の結合体化もまた、企図される。得られた結合体化薬剤は、環境的分解性因子（溶媒媒介性分解プロセス−または溶液媒介性分解プロセスを含む）に抵抗性である。インターフェロン−β−１ａのこのような増強した抵抗性および増加した安定性の結果として、活性成分の安定性は、用いられる特定の最終用途（ｅｎｄ ｕｓｅ）におけるインターフェロン−β−１ａ含有組成物の付随する信頼性とともに、有意に増加し得る。

上記に加えて、課題を解決するために、本発明は、以下を提供する：
（項目１） 天然に存在しないポリマーに連結されたグリコシル化インターフェロン−βを含む組成物であって、該ポリマーがポリアルキレングリコール部分を含む、組成物。

（項目２） 項目１に記載の組成物であって、前記ポリアルキレン部分が、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、複数のヒスチジン残基、ヒドラジン基およびアミノチオール基から選択される基により、インターフェロン−βに連結されている、組成物。

（項目３） 項目１に記載の組成物であって、前記グリコシル化インターフェロン−βが、インターフェロン−β−１ａであり、そして抗ウイルスアッセイにおいて測定した場合にインターフェロン−β−１ｂより活性がある、組成物。

（項目４） 項目３に記載の組成物であって、前記インターフェロン−β−１ａが、抗ウイルスアッセイにおいて測定した場合に前記ポリマーを欠如するインターフェロン−β−１ａの０．５〜１倍の効力を保持する、組成物。

（項目５） 前記インターフェロン−βが、インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質である、項目１に記載の組成物。

（項目６） 前記インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質が免疫グロブリン分子の一部を含む、項目５に記載の組成物。

（項目７） 前記インターフェロンβが、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する、変異体インターフェロンβである、項目１または５に記載の組成物：（ａ）該変異体は、野生型インターフェロン−β−１ａより高い抗ウイルス活性を有し、ここで該抗ウイルス活性が、ウイルス誘導性の細胞溶解により測定される；（ｂ）該変異体が、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗増殖活性より大きな抗ウイルス活性を有する；（ｃ）該変異体がインターフェロンレセプターに結合するが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較した場合、レセプター結合活性と比較して、低下した抗ウイルス活性および低下した抗増殖活性を有する。

（項目８） ポリアルキレングリコール部分を含むポリマーに連結された生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａを含む、生理学的に活性なインターフェロン−β組成物であって、該生理学的に活性なインターフェロンβ組成物中の該生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａが、抗ウイルスアッセイによって測定された場合に、生理学的に活性なインターフェロン−β−１ｂと比較して増強した活性を有するように、該生理学的に活性なインターフェロン−β−１ａおよび該ポリアルキレングリコール部分が配置されている、組成物。

（項目９） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＮ末端のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目８に記載の組成物。

（項目１０） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＣ末端またはその付近のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目８に記載の組成物。

（項目１１） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａのグリカン部分を介してある部位で前記ポリマーに連結されている、項目８に記載の組成物。

（項目１２） 前記インターフェロン−β−１ａが、インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質である、項目８に記載の組成物。

（項目１３） 前記インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質が、免疫グロブリン分子の一部を含む、項目１２に記載の組成物。

（項目１４） 項目８または１２に記載の組成物であって、前記インターフェロン−β−１ａは以下の特性のうち少なくとも１つを有する変異体インターフェロン−β−１ａである、組成物：（ａ）該変異体は、野生型インターフェロン−β−１ａより高い抗ウイルス活性を有し、ここで該抗ウイルス活性が、ウイルス誘導性の細胞溶解により測定される；（ｂ）該変異体が、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗増殖活性より大きな抗ウイルス活性を有する；（ｃ）該変異体がインターフェロンレセプターに結合するが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較した場合、レセプター結合活性と比較して、低下した抗ウイルス活性および低下した抗増殖活性を有する。

（項目１５） ポリアルキレングリコール部分を含むポリマーにＮ末端で連結された生理学的に活性なグリコシル化インターフェロン−βを含む、生理学的に活性なインターフェロン−β組成物であって、該生理学的に活性なインターフェロンβ組成物中の該生理学的に活性なインターフェロン−βが、抗ウイルスアッセイによって測定された場合に、該部分を欠如した生理学的に活性なインターフェロン−βと比較して、実質的に類似の活性を有するように、該生理学的に活性なインターフェロン−βおよび該ポリアルキレングリコール部分が配置されている、組成物。

（項目１６） 前記インターフェロン−βが、該インターフェロン−β上のＮ末端のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目１５に記載の組成物。

（項目１７） 前記インターフェロン−βが、該インターフェロン−β上のＣ末端またはその付近のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目１５に記載の組成物。

（項目１８） 前記インターフェロン−βが、該インターフェロン−βのグリカン部分を介してある部位で前記ポリマーに連結されている、項目１５に記載の組成物。

（項目１９） 前記インターフェロン−βが、インターフェロン−β融合タンパク質である、項目１５に記載の組成物。

（項目２０） 前記インターフェロン−β融合タンパク質が免疫グロブリン分子の一部を含む、項目１９に記載の組成物。

（項目２１） 項目１５または１９に記載の組成物であって、前記グリコシル化インターフェロン−βが、以下の特性のうち少なくとも１つを有する変異体インターフェロン−βである、組成物：（ａ）該変異体は、野生型インターフェロン−β−１ａより高い抗ウイルス活性を有し、ここで該抗ウイルス活性が、ウイルス誘導性の細胞溶解により測定される；（ｂ）該変異体が、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗増殖活性より大きな抗ウイルス活性を有する；（ｃ）該変異体がインターフェロンレセプターに結合するが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較した場合、該変異体のレセプター結合活性と比較して、低下した抗ウイルス活性および低下した抗増殖活性を有する。

（項目２２） ポリエチレングリコール部分に連結されたインターフェロン−β−１ａを含む、安定な水溶性の結合体化インターフェロン−β−１ａ複合体であって、該インターフェロン−β−１ａは、不安定な結合により該ポリエチレングリコール部分に連結され、該不安定な結合が、生化学的加水分解および／またはタンパク質分解により切断可能である、複合体。

（項目２３） 前記ポリマーが、約５〜約４０キロダルトンの分子量を有する、項目１、１５、または２２に記載のインターフェロン−β組成物。

（項目２４） 項目２３に記載のインターフェロン−β組成物を含む、薬学的組成物。

（項目２５） 哺乳動物被験体において、潜在的または発症した、状態または疾患状態を、有効なインターフェロン−β−１ａを用いて処置する方法であって、該方法は、ポリエチレングリコール部分に連結されている該インターフェロン−β−１ａを含むインターフェロン−β−１ａ組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。

（項目２６） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＮ末端のある部位で、前記ポリマーに連結されている、項目２５に記載の方法。

（項目２７） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＣ末端またはその付近のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目２５に記載の方法。

（項目２８） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａのグリカン部分を介してある部位で前記ポリマーに連結されている、項目２５に記載の方法。

（項目２９） 前記インターフェロン−β−１ａが、インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質である、項目２５に記載の方法。

（項目３０） 前記インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質が免疫グロブリン分子の一部を含む、項目２９に記載の方法。

（項目３１） 項目２５または２９に記載の方法であって、前記インターフェロン−β−１ａは以下の特性のうち少なくとも１つを有する変異体インターフェロン−β−１ａである、方法：（ａ）該変異体は、野生型インターフェロン−β−１ａより高い抗ウイルス活性を有し、ここで該抗ウイルス活性が、ウイルス誘導性の細胞溶解により測定される；（ｂ）該変異体が、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗増殖活性より大きな抗ウイルス活性を有する；（ｃ）該変異体がインターフェロンレセプターに結合するが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較した場合、該変異体のレセプター結合活性と比較して、低下した抗ウイルス活性および低下した抗増殖活性を有する。

（項目３２） インビボ系またはインビトロ系でのインターフェロン−β−１ａの活性を長期化する方法であって、該方法は、該インターフェロン−β−１ａを、天然に存在しないポリマー部分に連結して、連結したポリマー−インターフェロン−β−１ａ組成物を生成する工程、および該連結したポリマー−インターフェロン−β−１ａ組成物を該インビボ系または該インビトロ系に導入する工程を包含する、方法。

（項目３３） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＮ末端のある部位で、前記ポリマーに連結されている、項目３２に記載の方法。

（項目３４） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａ上のＣ末端またはその付近のある部位で前記ポリマーに連結されている、項目３２に記載の方法。

（項目３５） 前記インターフェロン−β−１ａが、該インターフェロン−β−１ａのグリカン部分を介してある部位で前記ポリマーに連結されている、項目３２に記載の方法。

（項目３６） 前記インターフェロン−β−１ａが、インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質である、項目３２に記載の方法。

（項目３７） 前記インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質が免疫グロブリン分子の一部を含む、項目３６に記載の方法。

（項目３８） 項目３２または３６に記載の方法であって、前記インターフェロン−β−１ａは以下の特性のうち少なくとも１つを有する変異体インターフェロン−β−１ａである、方法：（ａ）該変異体は、野生型インターフェロン−β−１ａより高い抗ウイルス活性を有し、ここで該抗ウイルス活性が、ウイルス誘導性の細胞溶解により測定される；（ｂ）該変異体が、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗増殖活性より大きな抗ウイルス活性を有する；（ｃ）該変異体がインターフェロンレセプターに結合するが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較した場合、該変異体のレセプター結合活性と比較して、低下した抗ウイルス活性および低下した抗増殖活性を有する。

（項目３９） 前記ポリマーがポリアルキレングリコールを含む、項目３２に記載の方法。

（項目４０） 被験体における脈管形成を阻害する方法であって、該方法が、項目２３に記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。

本発明の他の局面、特徴、および改変物は、以下の開示および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかである。

図１．Ｉ型インターフェロンレセプター鎖の細胞外ドメインを含むダイマー融合タンパク質ＩＦＡＲ２／Ｉｇ（ヒトＩｇＧ１定常ドメインに融合されたＩＦＮＡＲ２外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ））に対する、アラニン置換インターフェロン−β−１ａ変異体の結合。ＩＦＮＡＲ２レセプター鎖についてのアラニン置換ＩＦＮ変異体（Ａ１〜Ｅ）の結合親和性を、実施例１（部分節Ｄ）に記載の通りに決定した。ヒストグラムは、野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βに対する、このアッセイにおけるそれらの結合親和性を表す（％ｗ．ｔ．）。％ｗ．ｔ．値を、（野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βの親和性）／変異体ＩＦＮ−βの親和性の１００倍として算出した。個々の実験（Ｎ＝３）についての％ｗ．ｔ．（白丸）および実験セットについての平均％ｗ．ｔ．（×）を示す。変異体Ａ２、ＡＢ１、ＡＢ２およびＥは、ｗ．ｔ．ｈｉｓ−ＩＦＮ−βのＥＣ５０（^*）よりも５００倍高い濃度では、ＩＦＮＡＲ２／Ｆｃを結合しなかった。 図２．Ｄａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞において発現されたＩ型インターフェロン細胞表面レセプター複合体（「ＩＦＮＡＲ１／２複合体」）へのアラニン置換インターフェロン−β−１ａ変異体の結合。アラニン置換変異体（Ａ１〜Ｅ）のレセプター結合特性を、実施例１（部分節Ｄ）に記載される、ＦＡＣＳベースの細胞表面レセプター結合アッセイを使用して決定した。このヒストグラムは、野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βに対する、このアッセイにおけるそれらのレセプター結合親和性（％ｗ．ｔ．）を表す。各変異体についての％ｗ．ｔ．を、（野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βの親和性）／変異体ＩＦＮ−βの親和性の１００倍として算出した。個々の実験についての％ｗ．ｔ．値（白丸）および実験セットについての％ｗ．ｔ．値（×）の平均を示す。 図３．アラニン置換インターフェロン−β−１ａ変異体の抗ウイルス活性。アラニン置換変異体（Ａ１〜Ｅ）の抗ウイルス活性を、実施例１（部分節Ｅ）に記載のＥＭＣウイルスを用いてチャレンジしたヒトＡ５４９細胞において決定した。このヒストグラムは、野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βに対する、このアッセイにおけるそれらの活性（％ｗ．ｔ．）を表す。％ｗ．ｔ．を、（野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βの濃度［５０ｃｐｅ］）／変異体ＩＦＮ−βの濃度［５０ｃｐｅ］の１００倍として算出した。複数のアッセイについての％ｗ．ｔ．（白丸）および実験セットについての平均（×）を示す。 図４．アラニン置換インターフェロン−β−１ａ変異体の抗増殖活性。アラニン置換変異体（Ａｌ〜Ｅ）の抗増殖活性を、実施例１（部分節Ｅ）に記載のように、Ｄａｕｉ Ｂｉｅｋｉｔｔリンパ腫細胞において決定した。このヒストグラムは、野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−βに対する、このアッセイにおけるそれらの活性（％ｗ．ｔ．）を表す。％ｗ．ｔ．を、（ｗ．ｔ．ｈｉｓ−ＩＮＦ−βの濃度（５０％増殖阻害）／変異体ＩＦＮ−βの濃度（５０％増殖阻害））の１００倍として計算した。複数のアッセイについての％ｗ．ｔ．（白丸）および実験セットについての平均（×）を示す。 図５．アラニン置換インターフェロン−β−１ａ変異体の相対的抗ウイルスおよび抗増殖活性。抗ウイルスアッセイ（ｘ軸）および抗増殖アッセイ（ｙ軸）におけるアラニン置換変異体（Ａｌ〜Ｅ）の相対活性を、比較した。図３および４に示した平均パーセント野生型ｈｉｓ−ＩＦＮ−β（％ｗ．ｔ．×）を、この比較のために使用した。両方の活性における協調変化を提示するこれらの変異体は、垂直線におちついた。抗増殖活性における変化に対して不釣合いである抗ウイルス活性における変化を提示するこれらの変異体は、対角線から有意にずれた（ＤＥ１、Ｄ、Ｃ１）。有意性を、使用して平均％ｗ．ｔ．値に固有の標準偏差を考慮して決定した。 図６．ペプチドマッピングによるＰＥＧ化の部位の局在。ＰＥＧ化および未改変のインターフェロン−β−１ａを、ペプチドマッピング分析に供した。サンプルを、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで消化し、そしてＣ₄カラムでの逆相ＨＰＬＣに供した。このカラムを、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの０〜７０％の勾配を用いて展開した。このカラム溶出物を、２１４ｎｍでモニターした。パネルａ、未改変のインターフェロン−１ａ。パネルｂ、ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａ。矢印は、アミノ酸残基１〜１９を含む、インターフェロン−β−１ａのＮ末端エンドプロテイナーゼＬｙｓペプチドの溶出位置を印付ける。 図７．結合体化および非結合体化インターフェロン−β−１ａの抗ウイルス活性。Ｘ軸上に示した濃度でのインターフェロン−β−１ａまたはＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａの活性を、脳心筋炎ウイルスを用いてチャレンジしたヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞を使用して抗ウイルスアッセイにおいて評価した。ウイルスとのインキュベーションの２日後に、生存細胞を、ＭＴＴで染色し、このプレートを、４５０ｎｍで読み取り、そして細胞生存度を反映する吸光度をＹ軸に示す。標準偏差をエラーバーとして示す。５０％のウイルス殺傷を提供した（「５０％細胞変性効果」）（５０％の最大ＯＤ４５０）、インターフェロン−β−１ａまたはＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａの濃度は、約１１ｐｇ／ｍｌであり、そしてＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａについての５０％細胞変性効果は、約１１ｐｇ／ｍｌであった。 図８．熱変性を使用する結合体の安定化の評価。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ中のＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａおよび未処理インターフェロン−β−１ａコントロールを、１℃／分の固定速度で加熱した。変性を、２８０ｎｍでの吸光度変化をモニターすることによって追跡した。（ａ）未改変インターフェロン−β−１ａ（ｂ）ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａ。 図９．インターフェロン−β−１ａまたはＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａで処置したマウスの血漿におけるインターフェロン−β−１ａ抗ウイルス活性の測定。マウスに、５０，０００ユニットのインターフェロン−β−１ａまたは５０，０００ユニットのＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａ（２０Ｋ ＰＥＧを含む）のいずれかをｉｖ注射する。これらのマウスの血液を、Ｘ軸上に示される、インターフェロン注射後の様々な時間で眼窩採血を介して得る。各時点で採血した少なくとも３匹のマウスが存在し、そして血漿を調製し、そしてインターフェロン−βの活性が脳心筋炎ウイルスでチャレンジしたヒト肺癌腫（Ａ４５９）細胞を使用して抗ウイルスアッセイにおいて評価するまで凍結する。生存細胞をＭＴＴ溶液で染色し、血漿を４５０ｎｍで読み取り、細胞生存度およびインターフェロン−β活性を反映する吸光度を決定した。標準曲線を、インターフェロン−β−１ａを使用して各プレートについて作製し、そして使用して、各サンプルにおけるインターフェロン−β活性の量を決定した。個々の動物からのデータを示す。 図１０．ヒスチジンタグ化インターフェロン−β遺伝子の全長ＤＮＡ配列およびそのタンパク質産物。ヒスチジンタグ化ＩＦＮ−β−１ａの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）およびタンパク質配列（配列番号２）を示す。切断したＶＣＡＭ−１シグナル配列は、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ₆、４〜９位）の上流の３アミノ末端残基（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ）を残す。エンテロキナーゼリンカー配列（ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）を、スペーサー（１０〜１２位、ＳｅｒＳｅｒＧｌｙ）によってヒスチジンタグから分離する。天然のＩＦＮ−β−１ａ配列は、位置（Ｍｅｔ１８〜Ａｓｎ１８３）におよぶ。

（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「共有結合した（された）」とは、特定化された部分が、互いに直接的に共有結合されるか、または介在する部分（例えば、架橋、スペーサー、または連結部分）を通じて互いに間接的に共有結合されるされることを意味する。

インターフェロン−「インターフェロン」（「ＩＦＮ」とも称される）は、ウイルス、ポリペプチド、マイトジェンなどのような種々のインデューサーへの曝露に応答して、哺乳動物細胞によって産生される、小さな種特異的一本鎖ポリペプチドである。本発明で使用される最も好ましいインターフェロンは、グリコシル化されたヒトインターフェロン−βであり、これは残基８０（Ａｓｎ８０）でグリコシル化され、そして好ましくは、組換えＤＮＡ技術を介して誘導される。この好ましいグリコシル化されたインターフェロン−βは、「インターフェロン−ベータ−１ａ」または「ＩＮＦ−ベータ−１ａ」または「ＩＦＮ−β−１ａ」または「インターフェロンベータ１ａ」または「インターフェロン−β−１ａ」と呼ばれ、これらは全て、交換可能に使用される。用語「ＩＮＦ−ベータ−１ａ」はまた、その変異体もまた、残基８０（Ａｓｎ８０）でグリコシル化される場合、このような変異体を包含することを意味する（例えば、実施例１）。タンパク質（インターフェロンを含む）を産生するための組換えＤＮＡ方法は、公知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第５，１４９，６３６号、同第５，１７９，０１７号（Ａｘｅｌら）および同第４，４７０，４６１号（Ｋａｕｆｍａｎ）を参照のこと。

本発明の方法において使用され得る好ましいインターフェロン−β−１ａポリヌクレオチドは、様々な脊椎動物（好ましくは、哺乳動物）の野生型インターフェロンβ遺伝子配列に由来し、そして以下の米国特許において記載されるような、当業者に周知の方法を使用して得られる：米国特許第５，６４１，６５６（１９９７年６月２４日発行：ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｖｉａｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ａｖｉａｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、米国特許第５，６０５，６８８号（１９９７年２月２５日：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｄｏｇ ａｎｄ ｈｏｒｓｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）；米国特許第５，２３１，１７６号（１９９３年７月２７日、ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）；米国特許第５，０７１，７６１号（１９９１年１２月１０日、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ＬｙＩＦＮ−ａｌｐｈａ−２ ａｎｄ ＬｙＩＦＮ−ａｌｐｈａ−３）；米国特許第４，９７０，１６１号（１９９０年１１月１３日、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）；米国特許第４，７３８，９３１号（１９８８年４月１９日、ＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｅｔａ ｇｅｎｅ）；米国特許第４，６９５，５４３号（１９８７年９月２２日、ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｘ−１ ｇｅｎｅ）および米国特許第４，４５６，７４８号（１９８４年６月２６日、ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ｎａｔｕｒａｌｌｙ， ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）。

インターフェロン−β−１ａの変異体は、本発明に従って使用され得る。変異体は、当業者に公知の、特異的変異誘発の従来の方法を使用して発生される。さらに、本発明は、機能的に等価なインターフェロン−β−１ａポリペプチドをコードする機能的に等価なインターフェロン−β−１ａポリヌクレオチドを提供する。

インターフェロン−β−１ａをコードする第１のポリヌクレオチドは、それが、以下の条件の少なくとも１つを満たす場合、インターフェロン−β−１ａをコードする第２のポリヌクレオチドと比較して、「機能的に等価」である：
（ａ）「機能的等価物」が、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして／または第１のポリヌクレオチド配列へと縮重される、第１のポリヌクレオチドである。より好ましくは、それは、インターフェロン−β−１ａの活性を有する変異体インターフェロンをコードする；
（ｂ）「機能的等価物」が、第２のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。

要約すると、用語「インターフェロン」は、上記に列挙された薬剤ならびにそれらの機能的等価物を含むが、これらに限定されない。それゆえ、本明細書中で使用される場合、用語「機能的等価物」とは、そのインターフェロンが機能的等価物とみなされるようび、哺乳動物レシピエントに対する同じかもしくは改良された有益な効果を有するインターフェロン−β−１ａタンパク質、またはそのインターフェロン−β−１ａタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。当業者に明らかなように、機能的に等価なタンパク質は、組換え技術によって、例えば、「機能的に等価なＤＮＡ」を発現することによって、産生され得る。従って、本発明は、天然に存在するＤＮＡによってコードされるインターフェロン−β−１ａタンパク質、ならびに天然に存在するＤＮＡによってコードされるのと同じタンパク質をコードする天然には存在しないＤＮＡによってコードされるインターフェロン−β−１ａを包含する。配列をコードするヌクレオチドの縮重に起因して、他のポリヌクレオチドは、インターフェロン−β−１ａをコードするために使用され得る。これらは、配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、従ってサイレント変化が産生される、上記の配列の全てまたは部分を含む。このような変更された配列は、これらの配列の等価物とみなす。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン（ＴＴＣまたはＴＴＴ）によってコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによってコードされ、そしてＨｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによってコードされる。反対に、Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドンＴＧＧによってコードされる。従って、特定のインターフェロンをコードする所定のＤＮＡ配列について、それをコードする多くのＤＮＡ縮重配列が存在することが理解される。これらの縮重ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内であると考えられる。

「融合」とは、それらの個々のペプチド骨格を介する、それらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じての、２つ以上のタンパク質またはそのフラグメントの共線状連結（ｃｏ−ｌｎｎｅａｒ ｌｉｎｋａｇｅ）をいう。タンパク質またはそのフラグメントが異なる供給源に由来することが好ましい。従って、好ましい融合タンパク質は、インターフェロンではない第２の部分に共有結合されたインターフェロン−β−１ａのタンパク質またはフラグメントを含む。詳細には、「インターフェロン−β−１ａ／Ｉｇ融合」は、免疫グロブリン鎖のＮ末端に連結された本発明のインターフェロン−β−１ａ分子またはそのフラグメントを含むタンパク質であり、ここで免疫グロブリンのＮ末端の部分は、インターフェロン−β−１ａと置換される。

「組換え」とは、本明細書中で使用される場合、タンパク質が、組換え哺乳動物発現系から誘導されることを意味する。ほとんどの細菌培養（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるタンパク質は、グリカンを含まないので、これらの発現系は好ましくない。酵母において発現されるタンパク質は、哺乳動物細胞によって発現されるものとは異なるオリゴサッカリド構造を有し得る。

「生物学的に活性」とは、インターフェロン−β １ａの特徴として本明細書を通じて使用される場合、特定の分子が、実施例１（以下を参照こと）に示される型のインビトロ抗ウイルスアッセイにおいて測定されるような抗ウイルス活性を可能にするに十分な、本明細書中に開示される本発明の形態とのアミノ酸配列相同性を共有することを意味する。

「治療用組成物」とは、本明細書中で使用される場合、本発明のタンパク質および他の生理学的に適合可能な成分を含む、として規定される。治療用組成物は、賦形剤（例えば、水、ミネラル、およびタンパク質のようなキャリア）を含み得る。

本発明の薬剤の「有効量」とは、処置される特定の状態に対して結果を産生するか、またはそれに対する影響を発揮する量である。

「アミノ酸」−ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のモノマー単位。天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に見出される２０のアミノ酸が存在し、それらの全ては、Ｌ型異性体である。この用語はまた、これらのアミノ酸のアナログならびにこれらのタンパク質アミノ酸のＤ型異性体およびそのアナログを含む。

「誘導体化」アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であり、ここでは、通常存在する側鎖または末端基が、化学反応によって改変される。このような改変としては、例えば、以下が挙げられる：γ−カルボキシル化、β−カルボキシル化、硫酸化、スルホン化、リン酸化、アミド化、エステル化、Ｎ−アセチル化、カルボベンジル化（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌａｔｉｏｎ）、トシル化、および当該分野で公知の他の改変。「誘導体化ポリペプチド」は、１つ以上の誘導体化アミノ酸を含むポリペプチドである。

「タンパク質」−本質的に２０のアミノ酸のいずれかからなる任意のポリマー。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用されるが、「ペプチド」は、しばしば小ポリペプチドに関して使用され、当該分野におけるこれらの用語の使用頻度は重複し、そして変動する。用語「タンパク質」とは、本明細書中で使用される場合、他に注記されなければ、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。

「変異体」−生物の遺伝物質における任意の変化、特に、野生型ポリヌクレオチド配列における任意の変化（すなわち、欠失、置換、付加または改変）または野生型タンパク質における任意の変化。用語「ムテイン」は、「変異体」と交換可能に使用される。

「野生型」−通常にはインビボで存在するような、天然に存在する、それぞれ、タンパク質のエキソンのポリヌクレオチド配列もしくはその部分、またはタンパク質配列もしくはその部分。

「標準的なハイブリダイゼーション条件」−ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、０．５×ＳＳＣ〜約５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等価な塩および温度条件。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作の規定であり、そしてハイブリダイゼーション条件の一定範囲を包含する。より高いストリンジェンシーは、例えば、プラークスクリーン緩衝液（０．２％ ポリビニルピロリドン、０．２％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％ リン酸ナトリウム；１％ ＳＤＳ）；１０％ 硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いた６５℃で１２〜２０時間のハイブリダイゼーション工程、ならびに７５ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳを用いた６５℃での洗浄工程を含み得る。より低いストリンジェンシー条件は、例えば、プラークスクリーン緩衝液、１０％ 硫酸デキストランおよび１１０μｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いた５５℃で１２〜２０時間のハイブリダイゼーション工程、ならびに３００ｍＭ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナトリウム（２×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳを用いた５５℃での洗浄工程を含み得る。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第６．３．１〜６．３．６節（１９８９）もまた参照のこと。

「発現制御配列」−遺伝子に作動可能に連結された場合にそれらの遺伝子の発現を制御および調節するポリヌクレオチド配列。

「作動可能に連結される（た）」−ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、発現制御配列に作動可能に連結され、その発現制御配列がポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する。用語「作動可能に連結される（た）」は、発現されるポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、発現制御配列の制御下でのこのポリヌクレオチド配列の発現、およびこのポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの生成を可能にするように正しいオープンリーディングフレームを維持することを含む。

「発現ベクター」−発現ベクターが宿主細胞に導入される場合に、少なくとも１つの遺伝子の発現を可能にする（他の一般的例の中でも）ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはファージ）。このベクターは、細胞中で複製されてもよいし、複製されなくてもよい。

「単離される（た）」（「実質的に純粋」と交換可能に使用される）−ポリペプチドをコードする核酸（すなわち、ポリヌクレオチド配列）に適用される場合には、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの一部、ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドを意味する。これらは、その起源または操作により：（ｉ）天然で結合している全てのポリヌクレオチドと結合していない（例えば、発現ベクターとして宿主細胞に存在するポリヌクレオチドまたはその一部）；または（ｉｉ）天然に連結している以外の、核酸または他の化学的部分に連結している；または（ｉｉｉ）天然に存在しない。「単離される（た）」によって、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅される；（ｉｉ）化学合成される；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え生成される；または（ｉｖ）切断およびゲル分離により精製される、ポリヌクレオチド配列がさらに意味される。

従って、「実質的に純粋な核酸」は、核酸が由来している生物の天然に存在するゲノムにおいて通常は連続しているコード配列の一方または両方とはすぐに連続していない核酸である。実質的に純粋なＤＮＡはまた、さらなる配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。

「単離される（た）」（「実質的に純粋」と交換可能に使用される）−ポリペプチドに対して適用される場合には、ポリペプチドまたはその一部を意味し、これらは、その起源または操作により：（ｉ）発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞に存在する；または（ｉｉ）天然に連結している以外の、タンパク質または他の化学的部分と連結している；または（ｉｉｉ）天然に存在しない。「単離される（た）」によって、（ｉ）化学合成される；または（ｉｉ）宿主細胞において発現され、そして関連するタンパク質から精製される、タンパク質および核酸がさらに意味される。この用語は、一般には、天然で共に存在する他のタンパク質から分離しているポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはまた、精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス（ポリアクリルアミド）のような物質から分離される。

「異種プロモーター」−本明細書中で使用される場合は、遺伝子または精製された核酸と天然には結合しないプロモーターである。

「相同（な）」−本明細書中で使用される場合は、用語「同一」と類似であり、そして２つのポリペプチド分子間または２つの核酸間の配列類似性をいう。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンにより占有されるか、または２つのポリペプチドの各々における位置がリジンにより占有される場合）、それぞれの分子は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列により共有される適合位置または相同な位置の数を比較された位置の数で割って１００をかけた関数である。例えば、２つの配列間で１０個の位置のうち６個が適合または相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例を挙げると、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の相同性を共有する（計６個の位置のうち３個が適合している）。一般に、２つの配列が整列されて、最大の相同性が与えられた場合、比較が行われる。このような整列は、例えば、Ｎｅｅｄｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）の方法を用いて提供され得、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムにより簡便に実行され得る。相同な配列は、同一または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容された点変異」である。これに関して、参照配列における残基の「保存的置換」は、共有結合または水素結合を形成する能力などを含む、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する）それらの置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：補遺３，第２２章：３５４−３５２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）における「受容される点変異」について規定される基準を満たすものである。

用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書中で交換可能に使用される。

用語「脈管形成」および「新生血管形成」は、それらの最も広い意味において、新たな血管の増加を意味する。特に、「脈管形成」はまた、腫瘍部位での新たな血管の増加をいう。

「ＩＦＮＡＲ２」、「ＩＦＮＡＲ１」、「ＩＦＮＡＲ１／２」とは、細胞表面１型インターフェロンレセプターを含むことが公知のタンパク質をいう。ＩＦＮＡＲ２鎖の細胞外部分（外部ドメイン）は、単独で、インターフェロンαまたはインターフェロンβを結合し得る。

本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）１９８４；Ｔｒａｎｓｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７＋Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｊｗｅｌｌ編）１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８６。

（インターフェロン−β）
インターフェロン−β−１ａは、疾患状態、生理学的状態、症状または病因因子の処置、寛解または減弱、あるいはこれらの評価または診断のための薬剤として有用である。この用語はまた、それ自体が、融合タンパク質（例えば、免疫グロブリン−インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質（同時係属出願番号６０／１０４，５７２および同６０／１２０，１６１に記載されるような））の部分である、インターフェロン−β−１ａをいう。融合タンパク質の調製は、一般的に、当業者の周知である。

本発明者らは、インターフェロン−β−１ａの機能を破壊しないポリマー結合のための固有の部位を見出した。さらに、本発明者らはまた、ポリマー結合のための部位を独立して調べるための部位特異的変異誘発法を使用した（実施例１を参照のこと）。手短に言えば、本発明者らは、活性およびレセプター結合に必要とされる残基のマッピングを目指して、ヒトインターフェロン−β−１ａの変異分析を行った。インターフェロン−β−１ａの３Ｄ結晶構造の入手可能性（上記および実施例１を参照のこと）は、本発明者らが、アラニン（または、セリン）置換のための、インターフェロンβレセプター相互作用に利用可能な、溶媒に露出される残基を同定し、そして分子内結合に関与するアミノ酸を保持することを可能にする。インターフェロン−β−１ａのヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）およびループ（ＡＢ１、ＡＢ２、ＡＢ３、ＣＤ１、ＣＤ２、ＤＥ１、ＤＥ２）の各々が、異なる領域に沿って２〜８残基間で置換される、１５のアラニンスキャニング変異のパネルを設計した。実施例１を参照のこと。

哺乳動物細胞で発現された変異体（図１０およびｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列について、それぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１および配列番号２）のアフィニティー精製のために、アミノ末端ヒスチジンタグ（「ｈｉｓ」タグ）を含んだ。これらの変異体の機能的コンセンサスを、抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイにおいて評価する。非放射活性結合アッセイを開発し、これらの変異体をインターフェロンβ表面細胞レセプター（ＩＦＮＡＲ１／２細胞表面レセプター）へのそれらの結合について分析した。さらに、ＩＦＮＡＲ２−エクトドメイン／Ｉｇ融合タンパク質を使用してインターフェロンを結合する、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、インターフェロン−β−１ａとＩＦＮＡＲ２との間の表面の相互作用をマッピングした（実施例１を参照のこと）。これらの変異分析は、Ｎ末端およびＣ末端が、レセプター結合または生物学的機能に重要でないインターフェロンβ分子の部分に位置することを実証した。

これらの変異体は、本発明のインターフェロン−β−１ａ部分のさらなる改変体であり、これは、野生型のインターフェロン−β−１ａに見出されない新規な特性を示すので、特に有用であり得る（実施例１を参照のこと）。本発明者らは、標的化された変異誘発によって引き起こされる３つの型の効果を同定した。これらの効果は、特定の状況下でのインターフェロン薬物開発に有利であり得る。これらの３つの型の効果は、以下のとおりである：（ａ）ｈｉｓ−野生型インターフェロン−β−１ａの抗ウイルス活性より高い抗ウイルス活性を有する変異体（例えば、変異体Ｃ１）；（ｂ）ｈｉｓ−野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗ウイルスアッセイおよび抗増殖性アッセイの両方において活性を提示するが、その抗増殖活性は、抗ウイルス活性に対して不釣合に低い、変異体（例えば、変異体Ｃ１、ＤおよびＤＥ１）；および（ｃ）ｈｉｓ−野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、レセプター結合に対して不釣合に低い、抗ウイルス活性および抗増殖性活性を示す、機能的アンタゴニスト（例えば、Ａ１、Ｂ２、ＣＤ２およびＤＥ１）。

（ポリマー部分）
本発明の広い範囲内において、単一のポリマー分子が、インターフェロン−β−１ａとの結合体化に使用され得るが、１より多いポリマー分子も同様に結合され得ることもまた意図される。本発明の結合体化インターフェロン−β−１ａ組成物は、インビボおよび非インビボ適用の両方において、有用性を見出し得る。さらに、この結合体化ポリマーは、目的用途適用に適切な、任意の他の基、部分、または他の結合体化される種を利用し得る。例として、ポリマーに、そのポリマー対してＵＶ分解耐性、または抗酸化、あるいは他の特性または特徴を付与する、機能性部分を共有結合させることが、いくつかの適用において有用であり得る。さらなる例として、ポリマーを官能基化して、そのポリマーを反応性または架橋可能な性質にするか、結合体化物質全体の種々の特性または特徴を増強することが、いくつかの適用において有利であり得る。従って、ポリマーは、その意図される目的のための結合体化インターフェロン−β−１ａ組成物の効力を妨げない、任意の官能基、反復基、連結または他の構成構造を含み得る。本発明の他の目的および利点は、以下の開示および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかである。

これらの所望の特徴を達成するために有用に使用され得る例示的ポリマーは、例示的反応スキームにおいて、本明細書中以下に記載される。共有結合されたペプチドの適用において、このポリマーは官能化され得、次いで、このペプチドの遊離アミノ酸に結合され、不安定な結合を形成する。

インターフェロン−β−１ａは、最も好ましくは、ポリマー上の末端反応基を介して、結合体化されるが、結合体化はまた、非末端反応基からの分枝され得る。この反応基を有するポリマーは、本明細書中「活性化ポリマー」として命名される。この反応基は、タンパク質上の遊離アミノ基または他の反応基と選択的に反応する。この活性化ポリマーは、結合が、インターフェロン−β−１ａの任意の利用可能なアミノ基（例えば、リジンのαアミノ基またはεアミノ基）で生じ得るように、反応される。インターフェロン−β−１ａの遊離のカルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、酸化された糖鎖部分およびメルカプト基（これらが、利用可能である場合）もまた、結合部位として使用され得る。

ポリマーは、インターフェロン−β−１ａ分子上の任意の位置で結合され得るが、ポリマー結合の最も好ましい部位は、インターフェロン−β−１ａのＮ末端である。第２の部位は、Ｃ末端またはＣ末端近辺であり、かつ糖部分を介する。従って、本発明は、その最も好ましい実施形態として、以下を意図する：（ｉ）インターフェロン−β−１ａのＮ末端結合型ポリマー結合体；（ｉｉ）インターフェロン−β−１ａのＣ末端結合型ポリマー結合体；（ｉｉｉ）ポリマー結合体の糖結合型結合体；ならびに（ｉｖ）インターフェロン−β−１ａ融合タンパク質のＮ末端結合型ポリマー結合体、Ｃ末端結合型ポリマー結合体および糖結合型ポリマー結合体。

タンパク質濃度に依存して、一般にタンパク質１モルあたり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが、使用される。最終量は、その産物の非特異的改変を最小化しながら、この反応の程度を最大化することと、同時に、可能な場合にそのタンパク質の半減期を同時に至適化しながら、至適活性を維持する化学を規定することとの間の平衡である。好ましくは、このタンパク質の生物学的活性の少なくとも約５０％が維持され、最も好ましくは、１００％が維持される。

この反応は、この反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合、生物学的に活性な物質を不活性ポリマーと反応させる（好ましくは、約ｐＨ５〜７で）ために使用される、任意の適切な方法によって生じ得る。一般的に、このプロセスは、活性化ポリマー（これは、少なくとも１つの末端ヒドロキシル基を有し得る）を調製する工程、およびその後、タンパク質をこの活性化ポリマーと反応させて、処方に適切な可溶性タンパク質を生成する工程を包含する。上記の改変反応は、１以上の工程を含み得る、いくつかの方法によって行われ得る。

上記のように、本発明の最も好ましい実施形態は、インターフェロン−β−１ａのＮ末端を、ポリマーへの結合として利用する。適切な方法は、Ｎ末端改変型インターフェロン−β−１ａを選択的に得るために利用可能である。１つの方法は、還元的アルキル化方法によって例示され、これは、インターフェロン−β−１ａに対する誘導体化に利用可能な、異なる型の一級アミノ基の差示的な反応性（リジン上のεアミノ基 対 Ｎ末端メチオニン上のアミノ基）を利用する。適切な選択条件下で、インターフェロン−β−１ａのそのＮ末端でのカルボニル基含有ポリマーでの実質的に選択的な誘導体化が、達成され得る。この反応は、インターフェロン−β−１ａのリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαアミノ基との間のｐＫａの差異の利用を可能にさせるｐＨで行われる。この型の化学は、当業者に周知である。

本発明者らは、この選択性が、ＰＥＧ−アルデヒドポリマーを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でインターフェロン−β−１ａと反応させる条件下で、低ｐＨ（一般的に、５〜６）で反応を行うことによって維持される反応スキームを利用した。この結果は、ＰＥＧ−インターフェロン−β−１ａの精製ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ質量分析法およびペプチド配列決定／マッピングでの分析後に、そのＮ末端が、ＰＥＧ部分によって特異的に標的化されるインターフェロン−β−１ａを生じた。

インターフェロン−β−１ａの結晶構造は、そのＮ末端およびＣ末端が、互いに近接に位置するような状態である（Ｋａｒｐｕｓａｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１１８１３−１１８１８を参照のこと）。従って、インターフェロン−β−１ａのＣ末端の改変もまた、活性に対する最小の効果を有するはずである。ポリアルキレングリコールポリマー（例えば、ＰＥＧ）をＣ末端に標的化するための単純な化学ストラテジーは存在しないが、そのポリマー部分を標的化するために使用され得る部位を遺伝子操作することは容易である。例えば、Ｃ末端またはＣ末端近辺にある部位でのＣｙｓの組み込みは、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテートで活性化した、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）を使用する、特異的改変を可能にする。これらの誘導体は、これらの試薬のＣｙｓに対する高度な選択性に起因して、この操作されたシステインの改変に特異的に使用され得る。他のストラテジー（例えば、標的化され得るヒスチジンタグの組み込み（Ｆａｎｃｙら（１９９６）Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．３：５５１）またはさらなるグリコシル化部位の組み込み）は、インターフェロン−β−１ａのＣ末端を改変するための他の代替法を提示する。

インターフェロン−β−１ａ上のグリカンもまた、活性を変化させることなく、さらなる改変を可能にする位置に存在する。化学的改変のための部位として糖を標的化するための方法もまた周知であり、従って、ポリアルキレングリコールポリマーは、酸化によって活性化されたインターフェロン−β−１ａ上の糖に、直接的かつ特異的に付加され得るようである。例えば、アルデヒドおよびケトンとの縮合による比較的安定なヒドラゾン結合を形成する、ポリエチレングリコール−ヒドラジヒドラジドが生成され得る。この特性は、酸化オリゴサッカリド結合を介するタンパク質の改変に使用されている。Ａｎｄｒｅｓｚ，Ｈ．ら（１９７８）、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１を参照のこと。特に、ＰＥＧ−カルボキシメチルヒドラジドの亜硝酸塩での処理は、アミノ基に対して反応性の求電子活性基である、ＰＥＧ−カルボキシメチルアジドを生成する。この反応は、ポリアルキレングリコール改変型タンパク質を調製するために同様に使用され得る。米国特許第４，１０１，３８０号および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。

本発明者らは、チオールリンカー媒介化学が、タンパク質の架橋をさらに容易にし得ることを、以前に発見した。特に、本発明者らは、過ヨウ素酸ナトリウムでの炭水化物部分上の反応性アルデヒドの生成、このアルデヒドを介するシスタミン結合体の形成およびこのシスタミン上のチオール基を介する架橋の誘導のような手段を使用して、ＬＦＡ−３およびＣＤ４のホモタイプマルチマーを生成した。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｂ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２４４−１８２４９およびＣｈｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２３７−１８２４３を参照のこと。従って、本発明者らは、この型の化学がまた、リンカーが糖に組み込まれ、そしてポリアルキレングリコールポリマーがそのリンカーに結合される、ポリアルキレングリコールポリマーでの改変に適切であると考えた。アミノチオールまたはヒドラジンを含有リンカーは、単一のポリマー基の付加を可能にする一方で、複数のポリマーが付加されるように、そして／またはインターフェロン−β−１ａに対するそのポリマーの空間的配向を変化させるように、このリンカー構造が、改変され得る。

本発明の実施において、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルポリアルキレングリコールのポリアルキレングリコール残基（好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））またはこのようなグリコールのポリ（オキソ）アルキレングリコール残基は、目的のポリマー系に有利に組み込まれる。従って、タンパク質が結合されるポリマーは、全ての場合において、このポリマーが室温の水中で可溶性であるという条件でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のホモポリマーであり得るか、またはポリオキシエチル化ポリオールである。このようなポリマーの非限定的な例としては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー（例えば、ＰＥＧまたはポリプロピレングリコール）、ポリオキシエチレン化グリコール、それらのそれらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマー（このブロックコポリマーの水溶性が維持される場合）が挙げられる。ポリオキシエチル化ポリオールの例としては、例えば、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グリセロールなどが挙げられる。ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する同じ骨格である。従って、この分枝化は、体内において外来因子として必ずしもみなされない。

ポリアルキレンオキシドの代替物として、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマーなどが使用され得る。当業者は、前述のリストが、単なる例示であり、そして本明細書中に記載される性質を有する全てのポリマー材料が意図されることを認識する。

ポリマーは、任意の特定の分子量を有する必要はないが、分子量は、約３００〜１００，０００、より好ましくは、１０，０００〜４０，０００であることが好ましい。特に、２０，０００以上のサイズが、腎臓における濾過に起因するタンパク質の損失の防止において最適である。

ポリアルキレングリコール誘導体化は、以下のポリアルキレングリコール誘導体の特性に関連するような、本発明の実施におけるポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体の処方物において多くの有利な特性を有する：水溶性の改善（それと同時に抗原性または免疫原性応答を全く誘発しない）；高度な生体適合性；ポリアルキレングリコール誘導体のインビボ生分解性の非存在；および生存生物による排出の容易性。

さらに、本発明の別の局面において、ポリマー成分に共有結合されたインターフェロン−β−１ａが利用され得、ここで、この結合体の性質として、切断可能な共有化学結合が挙げられる。これは、ポリマーがインターフェロン−β−１ａから切断され得る時間経過を考慮した制御を可能にする。インターフェロン−β−１ａ薬物とポリマーとの間のこの共有結合は、化学反応または酵素反応によって切断され得る。ポリマー−インターフェロン−β−１ａ産物は、受容可能な量の活性を保持する。同時に、ポリエチレングリコール部分が、この結合体化ポリマー中に存在し、このポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体に、高い水溶性および長期の血液循環能力を与える。これらの改善された特徴の結果として、本発明は、インビボ適用における、活性なポリマー−インターフェロン−β−１ａ種および加水分解切断後の、バイオアベイラビリティのインターフェロン−β−１ａ自体の非経口送達、鼻内送達および経口送達、の両方を意図する。

本明細書中に記載される反応スキームは、例えば、非経口および経口投与のための可溶性、安定性および細胞膜親和性を達成するためにインターフェロン−β−１ａの改変において使用され得る反応および構造に関して、例示目的のみに提供され、限定されないことが理解されるべきである。最も好ましいＮ末端結合体化産物を得るための、ポリマーのインターフェロン−β−１ａとの反応は、広範な種の反応スキームを使用して容易に行われる。インターフェロン−β−１ａ結合体の活性および安定性は、異なる分子サイズのポリマーを使用することによって、いくつかの方法において変更され得る。この結合体の可溶性は、ポリマー組成物に組み込まれるポリエチレングリコールフラグメントの割合およびサイズを変化させることによって、変更され得る。

（有用性）
本発明の治療適用のために価値のあるポリアルキレングリコール誘導ポリマーの固有の特性は、その一般的な生体適合性である。ポリマーは、種々の水溶性特性を有し、そして毒性ではない。これらは、非免疫原性および非抗原性であると考えられ、そして本明細書中に記載の条件下で結合体化される場合に、インターフェロン−β−１ａ部分の生物学的活性を干渉しない。これらは、血中での長期の循環を有し、そして生存生物から容易に排出される。

本発明の産物は、治療的インターフェロン−β−１ａの半減期を維持する際に有用であることが見出され、そして例えば、治療投与のために、水または受容可能な液体媒体中に溶解させることによって調製され得る。投与は、非経口経路、エアロゾル経路、または経口経路のいずれかによる。微細なコロイド懸濁液が、デポー効果を生じるように非経口投与または経口経路によるために調製され得るが、エアロゾル処方物は、本質的に液体または乾燥粉末であり得る。乾燥の、凍結乾燥状態または液体処方物において、本発明のインターフェロン−β−１ａ−ポリマー結合体は、良好な貯蔵安定性を有する。結合体化インターフェロン−β−１ａの熱安定性（実施例３）は、脱水工程を有する粉末処方プロセスにおいて有利である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ／９５／０６００８（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ」）を参照のこと。

本発明の治療ポリマー結合体は、インターフェロン−β−１ａ構成成分が有効である、任意の状況または疾患状態の予防または処置のために利用され得る。さらに、本発明のポリマーベースの結合体は、生物系または生物学的検体におけるにおける構成、状況または疾患状態の診断において、ならびに非病理学系における診断目的において、利用され得る。

治療的用法において、本発明は、このような状況または疾患状態を有するかまたは潜在的に感受性であり、このような処置が必要な動物被験体を処置する方法を意図し、この方法は、この状況または疾患状態に治療効果的である本発明のポリマー結合体の有効量を、このような動物に投与する工程を包含する。本発明のポリマー結合体によって処置されるべき被験体としては、哺乳動物被験体、そして最も好ましくはヒト被験体が挙げられる。闘うべき特定の状況または疾患状態に依存して、動物被験体は、任意の適切な治療効果的かつ安全な投与量で、本発明のポリマー結合体を投与され得る。この用量は、当業者の能力の範囲内で、かつ過度の実験なく、容易に決定され得る。Ｉ型インターフェロンの種の関門のために、適切な種由来のインターフェロンを用いて、本明細書中に記載のようなインターフェロン−ポリマー結合体を生成することが必要であり得る。

インターフェロン−β−１ａの抗細胞増殖性活性は周知である。特に、本明細書中に記載の特定のインターフェロン−β−１ａポリマー結合体は、腫瘍および癌（例えば、骨原性肉腫、リンパ腫、急性リンパ性白血病、乳癌、黒色腫および鼻咽頭癌）、ならびに自己免疫状態（例えば、線維症、狼瘡および多発性硬化症）の処置に有用である。これらの結合体化タンパク質（特に、本明細書中に記載の特定のインターフェロン−β−１ａムテイン結合体）によって示される抗ウイルス活性は、ウイルス疾患（例えば、ＥＣＭ感染、インフルエンザ、および他の気道感染、狂犬病、および肝炎）の処置に有用であり得る。本明細書中に記載される結合体化タンパク質によって示されるインターフェロン−β−１ａの免疫調節活性は、自己免疫疾患および炎症性疾患（例えば、線維症、多発性硬化症）の処置に有用であり得ることもまた予期される。インターフェロンが、新しい血管の形成を阻害する（すなわち、脈管形成および新生血管形成を阻害する）能力は、本発明の結合体を、脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスおよびＯｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群）を処置するために使用可能にする。

さらに、インターフェロンの抗内皮活性は、かなりの間、知られており、インターフェロン作用の１つの潜在的機構は、腫瘍細胞によって生成された脈管形成因子の産生または効力を阻害することによって、内皮細胞活性を干渉することであり得る。いくつかの血管腫瘍（例えば、血管腫）は、インターフェロンでの処置に特に感受性である。インターフェロン−αでの処置は、この疾患についての唯一の実証された処置である。本発明のインターフェロン−β−１ａ結合体での処置は、薬物動態および薬力学の点で実質的な薬学的利点を提供することが予期される。なぜなら、この結合体は、非結合体化インターフェロンより長時間、血管系中に維持され、従って、抗脈管形成剤としての使用のために、より効率的かつ効果的な治療をもたらすと予期されるからである。実施例８を参照のこと。

本発明のポリマー−インターフェロン−β−１ａ結合体は、それ自体で投与され得、そして薬学的に受容可能なエステル、塩およびその他の生理学的に機能的な誘導体の形態で投与され得る。このような薬学的および医薬処方物において、インターフェロン−β−１ａは好ましくは、１以上の薬学的に受容可能なキャリア、および必要に応じて、任意の他の治療成分と共に使用される。キャリアは、この処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに過度に有害でないという意味において薬学的に受容可能でなければならない。インターフェロン−β−１ａは、上記のような所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量、および所望の日用量を達成するのに適切な量で提供される。

処方物としては、非経口投与および非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に適切な処方物が挙げられ、そして特定の投与様式としては、経口、直腸、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、局所的、鼻、眼、皮下、筋内、静脈内、経皮、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、リンパ、膣、および子宮内への投与が挙げられる。経口投与、鼻投与および非経口投与に適切な処方物が、好ましい。

インターフェロン−β−１ａは、液体溶液を含む処方物において利用される場合、この処方物は、経口または非経口的に、有利に投与され得る。インターフェロン−β−１ａが、液体懸濁液処方物中で、または生体適合性キャリア処方物中の粉末として使用される場合、この処方物は、経口、直腸または気管支に、有利に投与され得る。

インターフェロン−β−１ａが散剤化固体の形態で直接使用される場合、インターフェロン−β−１ａは、有利に経口的に投与され得る。あるいは、インターフェロン−β−１ａは、キャリアガス中の散剤の噴霧を介して、経鼻的または経気管支的に投与されて、散剤のガス状の分散を形成し、これは、適切な噴霧デバイスを備える呼吸経路から患者によって吸入される。

本発明のポリマー結合体を含む処方物は、単位用量形態で簡便に提供され得、そして薬学の技術分野において周知である方法のいずれかによって調製され得る。このような方法は、一般的に、活性成分に、１つ以上の補助成分を構成するキャリアを付随させる工程を包含する。代表的には、活性成分に、均一にかつ密接に、液体キャリア、微細に分裂させた固体キャリア、またはその両方を付随させること、次いで、必要な場合、生成物を所望の処方物の用量形態に形成することによって処方物を調製する。

経口投与に適切な本発明の処方物は、カプセル剤、カシェ剤、錠剤、またはロゼンジのような個別の単位として提供され得、各々は、散剤もしくは顆粒；または水性溶液もしくは非水性溶液中の懸濁物（例えば、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液、または一回分（ｄｒａｕｇｈｔ））として活性成分の所定の量を含む。

錠剤は、必要に応じて、１つ以上の補助成分を用いて、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮された錠剤は、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または抜染剤とともに必要に応じて混合される散剤または顆粒のような自由に流動する形態にある活性化合物とともに、適切な機械中で圧縮されることによって調製され得る。適切なキャリアとの粉末ポリマー結合体の混合物からなる成形される錠剤は、適切な機械中で成形することによって作製され得る。

シロップ剤は、濃縮された糖（例えば、ショ糖）の水溶液に活性化合物を添加することによって作製され得、これにまた任意の補助成分を添加し得る。このような補助成分には、人工香味料、適切な保存料、糖の結晶を保持するための薬剤、および任意の他の成分の可溶性を増大させる薬剤（例えば、ポリヒドロキシアルコール（例えば、グリセロールまたはソルビトール））が含まれ得る。

非経口投与のために適切な処方物は、簡便に、活性結合体の滅菌水性調製物を含み、これは、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である（例えば、生理食塩水溶液）。このような処方物には、血液成分または１つ以上の器官に化合物を標的化するために設計される、懸濁剤および濃厚剤または他の微粒子系が含まれ得る。その処方剤は、単位用量形態または複数用量形態で提供され得る。

鼻用スプレー処方物は、保存剤および等張剤を有する活性結合体の精製された水溶液を含む。このような処方物は、好ましくは、鼻の粘膜と適合可能なｐＨおよび等張状態に調整される。

直腸投与のための処方物は、適切なキャリア（例えば、ココアバター、水素化脂肪、または水素化脂肪カルボン酸）を有する坐剤として提供され得る。

眼の処方物（例えば、点眼剤）は、ｐＨおよび等張性の因子が眼のｐＨおよび等張性に好ましく適合する以外は、鼻用スプレーと同様の方法によって調製される。

局所的処方物は、１つ以上の媒体（例えば、鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール、または局所的薬学的処方のために使用される他の基剤）中に可溶化されるかまたは懸濁される本発明の結合体を含む。

上述の成分に加えて、本発明の処方物はさらに、希釈剤、緩衝剤、香味剤、崩壊剤、界面活性剤、濃厚剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などから選択される１つ以上の補助成分を含み得る。

従って、本発明は、非治療的適用の好ましい例証的な適用として、溶液中でのインターフェロン−β−１ａのインビトロ安定化のための適切なポリマーの提供を意図する。そのポリマーは、例えば、インターフェロン−β−１ａの温度安定性および酵素分解耐性を増大するために利用され得る。本発明の様式における結合を介するインターフェロン−β−１ａに特徴的な温度安定性の増強は、保存期間の改善、室温安定性、ならびに研究用試薬およびキットの強固さの手段を提供する。

以下の実施例は、本発明を例証するために提供され、そしてその限定としては解釈されるべきではない。特に、インビボで、本明細書中に記載された動物実験が変更され得、その結果、基本的な方法論の他の改変およびバリエーションが可能であることが理解される。例えば、実施例５において、当業者は、他のネオプテリンアッセイを使用し得るか、または使用される霊長類の数および種類を変更し得る。実施例に対するこれらの変更およびバリエーションは、本発明の意図および範囲にあると見なされる。

（実施例１：アラニン／セリン置換変異を使用するヒトインターフェロン−β−１ａの構造／活性研究：レセプター結合部位および機能的ドメインの分析）
（Ａ．概観）
ヒトインターフェロン−β−１ａ（ＩＮＦ−β−１ａ）の広範な変異分析を、活性およびレセプター結合に必要である残基のマッピングの目的で行った。ヒトＩＮＦ−βの３−Ｄ結晶構造（Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１１８１３−１１８１８）の利用可能性は、本発明者らに、レセプター相互作用のために利用可能な、溶媒にさらされている残基である、アラニン（またはセリン）置換を同定することおよび分子内結合に関与するアミノ酸を保持することを可能にした。各ヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）およびループ（ＡＢ、ＣＤ、ＤＥ）の別個の領域に沿って２残基と８残基との間を置換する、１５アラニン置換変異のパネルを設計した。アフィニティー精製のための６ヒスチジン残基を含むアミノ末端ヒスチジンタグ、ならびにアミノ末端伸長の除去のためのエンテロキナーゼ切断部位を含めた。得られるインターフェロンは、「ｈｉｓタグ化インターフェロン（ＩＦＮ）−β」または「Ｈｉｓ−インターフェロン−β」または「Ｈｉｓ₆−インターフェロン−β」などといわれる。

種々の変異体ｈｉｓタグ化ＩＦＮ−β発現プラスミドを、野生型ＩＦＮ−β遺伝子構築物を変異誘発のための鋳型として使用して構築した。変異誘発ストラテジーは、野生型ｈｉｓタグ化ＩＦＮβ遺伝子を通して独特な制限酵素切断部位を最初に導入する工程を包含し、次いでアラニン（またはセリン）置換変異をコードする合成オリゴヌクレオチド二重鎖を用いて選択された制限酵素間で別個のＤＮＡ配列を置き換える工程を包含した。最後に、変異体ＩＦＮ遺伝子を、ヒト２９３腎臓細胞株中での哺乳動物細胞発現を指向するプラスミドにサブクローニングした。

これらの変異の機能的な配列を、抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイにおいて評価した。非放射活性ＩＦＮ結合アッセイを開発して、ヒトＤａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞の表面レセプター（「ＩＦＮＡＲ１／２複合体」）への結合においてこれらの変異体を分析した。さらに、ｈｉｓ−ＩＦＮ−β変異体とＩＦＮＡＲ２との間の相互作用表面をマッピングするためのアッセイを開発した。これは、ＩＦＮＡＲ２／Ｉｇ融合タンパク質を利用し、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインに融合したＩＦＮレセプタータンパク質ＩＦＮＡＲ２細胞外ドメインからなった。

（１．変異誘発の鋳型としてのインターフェロンβ遺伝子の作製）
ＩＦＮ−βのアラニン（またはセリン）置換変異体を生成するための本発明者らのストラテジーは、最初に、改変ＩＦＮ−β遺伝子を作製することであった。この遺伝子は、野生型タンパク質をコードするが、遺伝子を横切って散在する独特な制限酵素切断部位を有した。その独特な部位は、変異コドンをコードする合成オリゴヌクレオチド二重鎖についての野生型配列を交換するために使用された。変異遺伝子の作製のために適切なヒトＩＦＮ−β−１ａ発現カセットを得るために、ＩＦＮ−β ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃Ｅ０００２９）を、ＰＣＲによって増幅した。ＩＦＮ−β遺伝子のプラスミドｐＪＢ１０７（ｐＡＣＹＣ１８４の誘導体、Ｒｏｓｅら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１）３５５を参照のこと）への最初のクローニングは、変異誘発を通して生成される特定の制限部位を欠くプラスミド中での遺伝子の部位特異的変異誘発を実行するために必要であった。

ヒトＩＦＮ−β遺伝子のコード配列をサブクローニングするために使用されるＰＣＲプライマーはまた、本発明者らに、そのＩＦＮ−β遺伝子の上流かつその遺伝子とインフレームでエンテロキナーゼ切断部位を導入することを可能にした。５’ＰＣＲプライマー ５’ＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号３：「ＢＥＴ−０２１」）および３’プライマー ５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧＴＣ−３’（配列番号４：「ＢＥＴ−０２２」）ならびにプラスミドｐＭＪＢ１０７部位へのクローニングのために有用な隣接する制限酵素部位（ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩ）。得られるＤＮＡは、ＰＣＲフラグメントＡといわれる。

ヒト血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）シグナル配列由来の効率的なシグナル配列および６ヒスチジンタグを、ｐＤＳＷ２４７から生成された第２のＤＮＡフラグメント（フラグメントＢ）からの最終構築物に導入した。プラスミドｐＤＳＷ２４７は、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の誘導体であり、ここからＥＢＮＡ−１遺伝子が欠失され、そしてこの誘導体は、６ヒスチジンタグの上流にかつこれとインフレームに融合されたＶＣＡＭ−１シグナル配列（ＶＣＡＭｓｓ）を有する。ＶＣＡＭｓｓ−１／ヒスチジンタグカセット部分を生成するために使用されたＰＣＲプライマーは、フラグメントＢ ＤＮＡの切除を可能にする、隣接する制限酵素切断部位（ＮｏｔＩおよびＢｓｐＥＩ）を組み込んでいるＫＩＤ３６９（５’ＰＣＲプライマー ５’−ＡＧＣＴＴＣＣＧＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＴ−３’：配列番号５）およびＫＩＤ−４２１（３’プライマー ＣＣＧＧＡＧＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡ−３’：配列番号６）であった。

ＶＣＡＭ−１シグナル配列、ｈｉｓタグおよびインターフェロン−β遺伝子を有するプラスミドベクターを作製するために、本発明者らは、プラスミドベクターｐＭＪＢ１０７（ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ切断された）、ＰＣＲフラグメントＡ（ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩ切断された）、およびフラグメントＢ（ＮｏｔＩおよびＢｓｐＥＩ切断された）からゲル生成されたＤＮＡフラグメントを使用して、３工程連結（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。連結されたプラスミドを使用して、ＪＡ２２１またはＸＬ１−ＢｌｕｅのＥ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかを形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして制限地図分析によってインサートについて試験した。ミニプレップＤＮＡを作製し、そしてインサートの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。得られた構築物を、ｐＣＭＧ２６０と名付けた。

（２．ｐＣＭＧ２６０におけるヒトインターフェロン−βのアラニン置換変異体の作製）
プラスミドｐＣＭＧ２６０を、多数回の変異誘発のための鋳型として使用した（Ｕ．Ｓ．Ｅ．部位特異的変異誘発キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））。これは、独特な制限切断部位を、ＩＦＮ−βタンパク質コード配列に沿った位置に導入するが、タンパク質の得られる配列を変化させない。変異誘発されたプラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのＪＡ２２１またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ株のいずれかを形質転換し、そして組換えコロニーをクロラムフェニコール耐性について選択した。クロラムフェニコール耐性コロニーを、さらに、ＤＮＡ制限マッピング分析によって、所望の独特な制限酵素部位の存在について試験した。得られるＩＦＮ−βプラスミドである、ｐＣＭＧ２７５．８は、独特な制限酵素切断部位の全セットを含み、そしてその遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。改変された、ｈｉｓタグ化インターフェロン−β遺伝子の全ＤＮＡ配列（配列番号１）は、タンパク質コード配列（配列番号２）とともに、図１０に示される。

アラニン置換変異のフルセットを、表１に示す（以下）。変異の名前は、変異が導入された構造的領域（ヘリックスおよびループ）を特定する。アラニン（セリン）置換の全体のパネルは、ヒトＩＦＮ−βの１６５アミノ酸のうちの６５の変異を生じる。

変異体のパネルを、ｐＣＭＧ２７５．８から、独特な制限部位間のＤＮＡのセグメントを表２（以下を参照のこと）に示される遺伝子コード情報を有する合成オリゴヌクレオチド二重鎖と置換することによって作製した。種々のアラニン置換変異体プラスミドを作製するために、ゲル精製したｐＣＭＧ２７５．８ベクター（各々のＩＦＮ−β構造領域について以下のリストに示されるように、適切な制限酵素を用いて切断した）およびオリゴヌクレオチド二重鎖（表２において示されるコード鎖配列）を一緒に連結した。連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉのＪＡ２２１株を形質転換し、そして組換えコロニーを、アンピシリン耐性について選択した。アンピシリン耐性コロニーを、適切な制限酵素部位についてスクリーニングすることによって変異の挿入の存在について試験した。２つの変異体（Ａ２およびＣＤ２）について、クローニングストラテジーは、合成ヌクレオチドの２つの二重鎖（表２に示す）を使用することを伴った。この二重鎖は相補的な突出末端を有し、互いにおよびベクターＩＦＮ−β骨格を３工程連結で連結することを可能にする。以下のリストは、表２からの変異したオリゴヌクレオチドをクローニングするために使用された部位を例証する。このクローニングスキーム（サブセクションＢ）は、インターフェロン−β遺伝子上のこれらの独特な部位の位置を示す。

（表１．^HUＩＦＮ−βのアラニン置換変異の位置）

ＩＦＮ−βと示された線は、野生型ヒトＩＦＮ−β配列を示す。ＩＦＮ−β残基のアラニン置換またはセリン置換を各々の変異体について示し、そして関連する領域の下のダッシュは、野生型配列を示す。ヘリックス構造およびループ構造を、変異体の下に実線として示す。ＤＥループは、ＤヘリックスとＥヘリックスとの間にわたる。２つのさらなるアラニン置換変異体（Ｈ９３Ａ、Ｈ９７Ａ、およびＨ１２１Ａ）を生成し、そして抗ウイルス活性において分析して、結晶構造二量体において亜鉛をキレートするこれらのヒスチジンを変異させる効果を評価した。これらの変異体の両方は、抗ウイルス活性において完全な野生型活性を保持しており、このことは、亜鉛媒介二量体形成が、ＩＦＮ−β活性に重要ではないことを示唆する。

（Ｂ．ＥＢＮＡ２９３発現プラスミドの構築）
ＶＣＡＭ−１シグナル配列、ｈｉｓタグ、ならびにエンテロキナーゼ切断部位に融合された野生型遺伝子および変異体ＩＦＮ−β遺伝子を、７６１塩基対ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限フラグメントとしてゲル精製した。精製した遺伝子を、図式に示すように、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ切断したプラスミドベクターｐＤＳＷ２４７にサブクローニングした。プラスミドｐＤＳＷ２４７は、ヒトＥＢＮＡ２９３腎臓細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）におけるタンパク質の一過性発現のための発現ベクターである。このベクターは、クローニングストラテジーについての図式（以下）に見られるように、サイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーターおよびこの系における高いレベルの遺伝子発現のために必要とされるＥＢＶ調節エレメント、ならびにＥ．ｃｏｌｉ（アンピシリン耐性）およびＥＢＮＡ２９３細胞（ハイグロマイシン耐性）についての選択マーカーを含む。連結したプラスミドを使用して、ＪＡ２２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかを使用して形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを拾い上げて、制限地図分析によってインサートについて試験した。マルチプレップＤＮＡを作製し、そしてインサートの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。所望の変異した配列を示すポジティブクローンを使用して、以下に記載するように、ヒトＥＢＮＡ２９３腎臓細胞をトランスフェクトするために使用した。

全体のクローニングストラテジーを以下に示す：
（クローニングストラテジーおよびＩＦＮ−β発現プラスミドの図的表現）

（Ｃ．ＩＦＮ−β−１ａアラニン置換変異体の発現および定量）
ヒトＥＢＮＡ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ，Ｔ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３０１６−３０２５）を、１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ グルタミン、および２５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中のサブコンフルエント培養物として維持した。ｐＤＳＷ２４７発現プラスミドを、リポフェクタミンプロトコル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥＢＮＡ ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。馴化培地を、トランスフェクションの３〜４日後に収集し、細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてｈｉｓ−ＩＦＮ−β濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。

ＥＬＩＳＡアッセイを、ポリクローナルウサギ抗体（プロテインＡ精製したＩｇＧ、抗体は精製したヒトＩＦＮ−β−１ａに対して惹起された）を用いて９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコートして行い、そして同じポリクローナルウサギＩｇＧのビオチン化型を、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗ．Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いるインターフェロン検出を可能にする二次試薬として使用した。インターフェロン−β−１ａの一連の希釈を使用して、標準濃度曲線を生成した。ＥＢＮＡトランスフェクト体からのｈｉｓ−ＩＦＮ−β含有馴化培地を、希釈して、ＥＬＩＳＡアッセイにおける１０ｎｇ／ｍｌと０．３ｎｇ／ｍｌとの間の範囲の濃度を有するサンプルを得た。ＥＬＩＳＡによって決定された培地中のＩＦＮ−βの濃度を確認するために、ウェスタンブロット分析を実行した。還元した培養上清およびＩＦＮ−β−１ａ標準を、１０〜２０％勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＰＤＶＦ膜上にブロットした。免疫反応性バンドを、ウサギポリクローナル抗ＩＦＮ−β−１ａ抗血清（＃４４７，Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、二次抗血清はＩＦＮ−β−１ａに対して惹起された）、続いてＨＲＲ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いる処理を用いて検出した。

（Ｄ．レセプター結合についてのインターフェロン−β変異体の評価）
Ｃにおいて記載されたインターフェロン−β変異体のレセプター結合特性を、２つの異なる結合アッセイを使用して評価した。１つのアッセイは、融合タンパク質ＩＦＮＡＲ２／Ｉｇに対するインターフェロン−β変異体の結合を測定した。この融合タンパク質は、ヒトＩｇＧの定常領域の部分に融合したヒトＩＦＮＡＲ２レセプター鎖の細胞外ドメインを含む。ＩＦＮＡＲ２−Ｆｃを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞中で発現し、そして製造業者の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，カタログ番号＃２０３３４）に従ってプロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。インターフェロン−β変異体のＩＦＮＡＲ２−Ｆｃへの結合を、ＥＬＩＳＡ形式アッセイにおいて測定した。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ ９．６）中１０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（ＣＤＧ
５−ＡＡ９、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩、平底９６ウェルプレートをコートすることによって調製した。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ中０．５％脱脂粉乳で、室温で１時間ブロックした。２回以上の洗浄後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の０．５％ミルク中の１μｇ／ｍｌ ＩＦＮＡＲ２−Ｆｃの５０μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートし、次いでプレートを２回以上洗浄した。インターフェロン−β変異体のＩＦＮＡＲ２−Ｆｃへの結合を、５０μｌ／ウェルの変異体インターフェロン−β馴化培地（１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で連続的に希釈した）中に添加すること、および４℃で２時間インキュベートすることによって測定した。インターフェロン−β変異体の希釈は、代表的には、およそ１μＭから下方に１０ｐＭまでの範囲であった。洗浄後、プレートに結合したインターフェロン−βを、ウサギポリクローナル抗インターフェロン抗体（＃４４７）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：１０００希釈からなるカクテルの５０μｌ／ウェルを添加すること、および４℃で１５分間インキュベートすることによって検出した。２回の洗浄の後、ＨＲＰ基質を添加し、そしてプレートを４℃でインキュベートし、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で４５０ｎｍの吸光度を読みとった。データを、吸光度対変異体インターフェロン−βの濃度をプロットし、そして変異体インターフェロン−βのＩＦＮＡＲ２−Ｆｃへの結合についての親和性を単純な双曲線式に一致させることによって決定した。これらの分析からの結果を図１に示し、ここでは、少なくとも３つの独立した実験から決定された各変異体についての結合親和性が、Ｈｉｓ６−野生型インターフェロン−β−１ａについて測定された親和性の割合として表現される。

第２のレセプター結合アッセイを使用して、インターフェロン−β変異体が両方のレセプター鎖（ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２、これらは、ともにインターフェロン−βについてのレセプターを含む）を発現するＤａｕｄｉ細胞に結合する親和性を測定する。このＦＡＣＳに基づくアッセイは、インターフェロン−βが結合したレセプターから、占有されていない（遊離の）レセプターを区別するために、ＩＦＮＡＲ１、ＥＡ１２（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体をブロックすることに使用した。Ｄａｕｒｉ細胞（２．５×１０⁷細胞／ｍｌで２０μｌ）を、９６ウェルＶ底
ＥＬＩＳＡプレートに配置し、そして種々の濃度のインターフェロン−β変異体（２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中；５％ ＦＢＳ、ＰＢＳ中の０．１％ ＮａＮ₃）とともに４℃で
１時間インキュベートした。インターフェロン−β変異体の所望の連続希釈は、０．５μＭから下方に０．５ｐＭまでの範囲であった。各ウェルに１００ｎｇのビオチン化マウス抗ＩＦＮＡＲ１モノクローナル抗体ＥＡ１２（１０μｌ）を添加し、そしてプレートを室温で２分間インキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した（４℃）。次いで、細胞を、Ｒ−フィコエリトリン結合体化ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：２００希釈の５０μｌ／ウェルとともに４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒドを含む３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、そして１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０５２）に移した。次いで、サンプルをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーによって分析した。データを、平均チャネル蛍光強度（ＭＦＣＩ）対インターフェロン−β変異体の濃度としてプロットし；結合親和性を、抗体染色の５０％阻害を与えるインターフェロン−βの濃度として規定した。各変異体を、複数回試験した。図２は、本発明の方法によって決定され、各実験においてＨｉｓ６−野生型インターフェロン−β−１ａについて測定された親和性の割合として表現された、各インターフェロン−βについてのレセプター結合親和性を示す。

（Ｅ．機能についてのインターフェロン−β変異体の評価）
インターフェロン−β変異体をまた、抗ウイルス活性に関するインビトロアッセイを用いて機能的な活性について、そして細胞増殖を阻害するインターフェロン−βの能力について試験した。各々三つ組のデータ点を伴った、最低三回の抗ウイルスアッセイを、各々の変異体において実施した。Ｈｉｓ₆−野生型インターフェロン−β−１ａを、すべての
実験において基準として含めた。この抗ウイルスアッセイは、変異インターフェロン−βの２倍階段希釈を用いて、ウイルスによる細胞死滅からの完全な抗ウイルス防御と無防御との間の範囲にわたる濃度で、Ａ５４９ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）を一晩処理することによって実施した。次の日、この細胞を、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）を用いて、インターフェロンの存在なしに完全な細胞の死滅を生じる希釈度で、２日間チャレンジした。次いで、プレートを、代謝性色素であるＭＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ−フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド）（Ｍ−５６５５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて発色させた。ＭＴＴのストック溶液を、ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌで調製し濾過滅菌し、そしてこの溶液５０μｌを、細胞培養液中に希釈した（１００μｌ／ウェル）。室温で３０〜６０分間のインキュベーションに続いて、ＭＴＴ／培地溶液を捨て、細胞を、１００μｌのＰＢＳを用いて洗浄し、そして最後に代謝された色素を、９０％イソプロパノール中の１．２Ｎの塩酸１００μｌ中に可溶化した。生存細胞（色素の存在によって証明されるように）を、４５０ｎｍの吸光度によって定量した。データを、インターフェロン−β変異体の濃度に対する吸光度をプロットすることによって解析し、各々の変異体の活性を、５０％の細胞が死滅する濃度として規定した。図３は、各々の実験におけるヒスタグ化野生型インターフェロン−β−１ａについて、測定された活性の百分率として表された各々の変異体の活性を示す。

インターフェロン−β変異体をまた、抗増殖アッセイにおいて機能に関して評価した。ヒトＤａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ ２１３）を、１０％の限定された胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６２０中に、２×１０⁵細胞／ｍｌで播種した。
各々のウェルはまた、１００μｌ／ウェルの最終総容量の培地中に、インターフェロン−β変異体の所定の濃度を含む；用いられたインターフェロン−β濃度を、Ｄａｕｄｉ細胞の増殖の最大阻害から無阻害（すなわち、完全な増殖）までの間の範囲にわたって選んだ。二つ組の実験点を、試験されたインターフェロン−β変異体の各々の濃度について用い、そして二つ組のセットの未処理細胞を、すべての実験に含めた。細胞を、３７℃で２日間、５％のＣＯ２インキュベーター内でインキュベートし、５０μｌ培地中に１μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジン（（メチル−³Ｈ）チミジン、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＴＲＫ７５８）を、各々のウェルに添加した後、さらに４時間インキュベートした。細胞を、ＬＫＢプレートハーベスタ−を用いて回収した。そして、トリチウム化チミジンの取りこみをＬＫＢβプレートリーダーを用いて測定した。二つ組の実験の値を平均化し、そして標準偏差を決定した。データを、平均数／分 対 インターフェロン−β変異体の濃度としてプロットし、各々の変異体の活性を、観察される増殖阻害の最大値の５０％を示すのに必要な濃度として定義した。各々の変異体についての複数のアッセイを、実施した。図４は、各々の実験におけるヒスタグ化野生型インターフェロン−β−１ａについて見出された活性の百分率として表された結果を示す。

（Ｆ．インターフェロン−β変異体の特性）
ヒスチジンタグ化野生型インターフェロン−β−１ａは、抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイにおいて、タグのない野生型インターフェロン−β−１ａについて見出される対応する活性の各々約１／３の活性を有することが見出された。インターフェロン−β変異体Ａ１−Ｅのすべてが同一のヒスタグ配列をそのＮ末端に含むので、この分子の特性における変異体の効果は、抗ウイルスアッセイ、抗増殖アッセイおよび結合アッセイに対するこれらの変異体の活性を、ヒスタグ化野生型インターフェロン−β−１ａについて観察される活性と比較することによって決定した。そうすることにおいて、本発明者らは、ヒスタグ化野生型インターフェロン−β−１ａと比較した変異体Ａ１−Ｅの活性における変動が、これら同一の変異体がＮ末端のヒスタグの非存在下で有する効果と、定性的におよび定量的にほぼ同一であることを仮定する。他の可溶性サイトカインのタグ化または融合構築物についての等価な仮定は、特に、タグ化または融合構築物のインビトロでの機能的な活性が、本明細書中の場合のように野生型サイトカインの活性と近接する場合、アラニンスキャンニング変異誘発の技術の熟練者は一般に正しいと考える。例えば、Ｐｅａｒｃｅ Ｋ．Ｈ．Ｊｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０５９５−２０６０２（１９９７）およびＪｏｎｅｓ Ｊ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１６６７−１１６７４（１９９８）を参照のこと。

図１〜４に示したデータは、標的化された変異誘発によって生じた効果の３つの型を示す。これらの効果は、特定の環境下でのインターフェロン薬物の開発について有利であり得る。この効果の３つの型は、以下である：（ａ）野生型インターフェロン−β−１ａの活性よりも高い抗ウイルス活性を伴う変異体（例えば、Ｃ１変異体）；（ｂ）抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイの両方において活性を示すが、野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、抗ウイルス活性の割には抗増殖活性が不釣合いに低い変異体（例えば、Ｃ１、ＤおよびＤＥ１変異体）；および（ｃ）野生型インターフェロン−β−１ａと比較して、レセプター結合び対して不釣合いに低い抗ウイルス活性および抗増殖活性を示す、機能的なアンタゴニスト（例えば、Ａ１、Ｂ２、ＣＤ２およびＤＥ１）。いくつかの変異体が、一つを超えるクラスに分類されることが理解され得る。これらのクラスを、以下に総説する。リストされたこれらの例に関して、これらのクラスの変異体を特徴付ける一方、これらの領域の他の変異体が活性に対して類似の、またはさらに増強された効果を生じ得ることが評価されるべきである：
ａ）変異体Ｃ１は、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａの有する活性に比べて約６倍を超える抗ウイルス活性を有する。この変異体およびこの型の他の変異体は、抗ウイルス効果の所定のレベルを達成するために投与されなければならないインターフェロン−βの量を減少するのに有用であることが予想される。投与されたタンパク質の量の低下は、このタンパク質の免疫原性を減少することを予想させ、そして機序に基づかない毒性からの副作用をまた減少し得る。このクラスの変異は、インターフェロン−β投与の治療的利点がその抗ウイルス効果から生じ、そして抗増殖効果が毒性または所望されない副作用に寄与するといった状況において有利であると予想される。

（ｂ）抗ウイルスアッセイおよび抗増殖アッセイにおけるアラニン置換変異体の相対的な活性（％野生型）を、図５において比較する。座標的に変化した活性（すなわち、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａの活性とは、同一因子によって異なる抗ウイルス活性および抗増殖活性）は、ほとんどの変異体において見られる（対角線にある）。しかし、いくつかの変異体は、対角線からのずれによって証明されるように、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａに比較して、その他と相対的な一つのアッセイにおける活性により大きな変更を示す。３つのこのような変異体を、以下の表３に示す。変異体Ｃ１は、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａの活性よりも約６倍高い抗ウイルス活性を示すが、抗増殖アッセイにおける活性は、野生型のそれと類似する。従って、変異体Ｃ１は、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａに対して、その抗増殖活性を５．２倍だけ増強された抗ウイルス活性を有する。同様に、変異体Ｄは、抗ウイルスアッセイにおいて野生型の活性の６５％を示すが、抗増殖アッセイにおいては野生型の活性のたった２０％を示し、従って、野生型に比べてその抗増殖活性の３．４倍増強された抗ウイルス活性を有する。変異体ＤＥ１は、抗ウイルスアッセイにおいて野生型の活性の２６％を示すが、抗増殖アッセイにおいてはたった８．５％を示し、従って、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａに比べてその抗増殖活性の３．０倍増強された抗ウイルス活性を有する。所望の抗ウイルス活性のレベルに達するのに十分な濃度において投与される場合、これらの変異体タンパク質は、野生型タンパク質より実質的に低いレベルの抗増殖活性を示す。クラス（ａ）中のもののようなこのクラスの変異体は、インターフェロン−β投与の治療的利点がその抗ウイルス効果から生じ、そして抗増殖効果が毒性または所望されない副作用に寄与するといった状況において有利であると予想される。

（ｃ）野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａに比べてレセプター結合が低い抗ウイルス活性および抗増殖活性を伴う変異体（下の表４を参照のこと）。変異体Ａ１は、野生型ヒスタグ化インターフェロン−β−１ａに関して観察される活性より２．０倍および１．８倍高い抗ウイルス活性および抗増殖活性を示すが、Ｄａｕｄｉ細胞上の同族のレセプターに野生型より２９倍高い親和性を伴って結合する。従って、この変異体のＩＦＮ−βレセプターへの結合は、このタンパク質の抗ウイルス活性および抗増殖活性に比べて約１５倍増強される。同様に、変異体Ｂ２、ＣＤ２およびＤＥ１は、それぞれ、４．６倍、４．６倍および１８倍の抗ウイルス活性を越える、そして３．５倍、１５倍および５４倍の抗増殖活性を越える結合の増強性を示す。これらのタンパク質は、内在性ＩＦＮ−β、およびおそらく他の内在性タイプＩインターフェロンの活性の機能的なアンタゴニストとして有用であることが予想される。なぜなら、これらが、レセプターに結合する能力およびレセプターを占有する能力を有し、そしてなお野生型ＩＦＮ−βと共にみられる標的細胞における機能的な応答のごく小さな割合を生じるからである。

（Ｇ．インターフェロンの３次元構造に対するムテイン関連性）
マウスインターフェロン−βの非グリコシル化型（Ｔ．Ｓｅｎｄａ、Ｓ．ＳａｉｔｏｈおよびＹ．Ｍｉｔｓｕｉ．Ｒｉｆｉｎｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β ａｔ ２．１５
Å Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５３：１８７〜２０７（１９９５））およびヒトインターフェロンα−２ｂ（Ｒ．Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｌ．Ｊ．Ｗａｌｔｅｒ，Ａ．Ｈｒｕｚａ，Ｐ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｐ．Ｐ Ｔｒｏｔｔａ，Ｔ．Ｌ．ＮａｇａｂｈｕｓｈａｎおよびＭ．Ｒ．Ｗａｌｔｅｒ．Ｚｉｎｃ Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｄｉｍｅｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α２ｂ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．４：１４５３−１４６３（１９９６））に関する発表された結晶構造が、ヒトインターフェロン−βのペプチド骨格のモデルを提供した一方、本発明者らは、インターフェロン−βのグリコシル化状態に関する構造を最近解析した（Ｍ．Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．Ｎｏｌｔｅ，Ｃ．Ｂ．Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｍｅｉｅｒ，Ｗ．Ｎ．Ｌｉｐｓｃｏｍｂ，およびＳ．Ｅ Ｇｏｅｌｚ．Ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β ａｔ ２．２ Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１８１３〜１１８１８（１９９７））。

本発明者らの変異の解析の結果は、インターフェロン−β−１ａの３Ｄ構造に関して要約され得る（本明細書中には示さず）。特定の変異体は、活性において（２〜５倍以上に減少した）減少を生じた。この変異された領域は、表１および２に与えられた置換に一致した。抗ウイルス活性および抗増殖活性に重要な残基は、インターフェロン−β−１ａ分子の下半分に位置する（パネルａおよびｂ）。アミノ末端およびカルボキシ末端が位置されるこの分子の上半分における変異は、生物学的な活性およびレセプター結合に対する効果を有さない。

Ａ２へリックス、ＡＢ、ＡＢ２ループおよびＥへリックスの変異は、機能上のこれらの効果において最も重要であり、両活性および細胞表面レセプター結合の劇的な減少を生じる。本発明者らのアッセイにおいてこれらの変異体のいずれもＩＦＮＡＲ／Ｆｃに結合しなかったので、この領域（Ａ２へリックス、ＡＢおよびＡＢ２ループならびにＥへリックス）は、ＩＦＮＡＲ２結合部位に一致する。

ＩＦＮＡＲ２結合に重要なこれらの変異もまた細胞の結合に影響を及ぼす一方、細胞表面結合特性もまた、この分子の他の領域（Ｂ１へリックス、Ｃ２へリックス）の残基によって影響される。これは、インターフェロン−β−１ａ分子のＮ末端、Ｃ末端およびグリコシル化Ｃへリックス領域がレセプター結合部位の中にないアラニン置換変異体の効果を示す３Ｄモデル（本明細書中には示さず）に見られ得る。これらの領域における変異は、生物学的活性を減少せず、細胞表面レセプター結合も減少しない。

（実施例２：結合体化インターフェロン−β−１ａの調製および特徴付け）
（Ａ．ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）インターフェロンの調製）
２５０μｇ／ｍｌの濃度の非処方インターフェロン−β−１ａ（ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）として販売）バルク中間体（１００ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．２、２００ｍＭのＮａＣｌ中）を、等量の１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０に希釈し、ｐＨを、ＨＣｌを用いて５．０に調整した。このサンプルを、６ｍｇインターフェロン−β−１ａ／ｍｌ樹脂でＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上にロードした。このカラムを、５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ５．５、７５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄し、産物を、３０ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ６．０、６００ｍＭのＮａＣｌを用いて溶出した。溶出画分を、２８０ｎｍでその吸光度を分析し、そしてサンプル中のインターフェロンの濃度を、１ｍｇ／ｍｌ溶液に関して１．５１の吸光係数を用いて吸光度より推定した。

ＳＰ溶出液からのインターフェロン−β−１ａの１ｍｇ／ｍｌ溶液に、０．５Ｍリン酸ナトリウム ｐＨ６．０を、５０ｍＭになるように加え、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭｉｌＷａｕｋｅｅ、ＷＩ）を、５ｍＭになるように加え、そして２０Ｋ ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、５ｍｇ／ｍｌになるように加えた。このサンプルを、室温で２０時間インキュベートした。ＰＥＧ化インターフェロンを、移動相として５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ５．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ ＦＰＬＣサイズ分離カラム（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦに始まる一連のクロマトグラフィー工程により反応産物より精製した。サイズ分離カラムの結果、改変型および非改変型のインターフェロン−βのベースライン分離を生じた（本明細書中にはクロマトグラフは示さず）。ゲル濾過からのＰＥＧ−インターフェロン−β含有溶出プールを、水を用いて１：１に希釈し、そして、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム上に２ｍｇインターフェロン−β／ｍｌ樹脂でロードした。このカラムを、５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ５．５、７５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄し、次いでＰＥＧ化インターフェロン−βを、５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ５．５、８００ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムから溶出した。溶出画分を、２８０ｎｍでの吸光度によってタンパク質含量を分析した。ＰＥＧ部分が２８０ｎｍでの吸光度に寄与しない場合、このＰＥＧ化インターフェロン−β濃度を、インターフェロン当量において報告する。
（Ｂ．ＰＥＧ化インターフェロンの生化学的な特徴付け）
サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって改変の程度を分析した（本明細書中にはゲルは示さず）。１つのＰＥＧの付加によって、分析において容易に明らかな２０ｋＤａから５５ｋＤａへインターフェロンの見かけの分子量におけるずれが生じた。ＰＥＧ化サンプルにおいて、非改変型インターフェロン−βの証拠もさらなるＰＥＧ基の存在により生じる高分子量型の証拠も、いずれも存在しない。１つのＰＥＧの存在を、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって確認した。ＰＥＧ化反応の特異性を、ペプチドマッピングによって評価した。２４０μｌの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中のＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａの２０μｇアリコート、およびコントロールとしての非改変型インターフェロン−β−１ａを、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ由来のリシルエンドプロテアーゼ（Ｗａｋｏ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）１．５μｇを用いて２７℃で３〜４時間消化した。２００ｍｇのグアニジンＨＣｌを、各々のサンプルに加え、そして切断産物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ₄カラム（０．４６×２５ｃｍ）上で０．
１％ ＴＦＡ中に０〜７０％のアセトニトリルの３０分間の勾配を用いて、１．４ｍｌ／分の流速で分画した。このカラム溶出物を、２１４ｎｍの吸光度についてモニターした。

この解析の結果を、図６に示す。インターフェロン−β−１ａのエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ切断からの予想されたペプチド全てを、Ｎ末端配列決定法および質量分析法によって同定し、これらのペプチドのうちインターフェロンのＮ末端（ＡＰ８）を含むペプチドのみが、マップからのその消滅によって明らかなように、改変によって変化した。従って、このマッピングデータは、ＰＥＧ部分がこのペプチドに特異的に付着することを示す。このデータは、Ｎ末端改変のみがこのペプチドの特異的な消失を生じたので、ＰＥＧ改変がタンパク質のＮ末端に標的化されるということをさらに示す。

この結論についての更なる証拠は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ切断からＰＥＧ化Ｎ末端ペプチドを単離し、切断されたペプチドをさらに、臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いて切断し、そしてこのサンプルを、ソース崩壊後マトリックス補助レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｏｓｔ ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ）（ＭＡＬＤＩ ＰＳＤ）配列決定解析に供することによって得た。Ｎ末端ペプチドのＣＮＢｒ切断はさらに、このペプチドをＰＥＧ部分を含む末端メチオニン（Ｍ１）およびＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲ（この成熟インターフェロン−β配列の残基２〜１１）の二つのペプチドに切断し得る。配列決定分析は、この処理の予想された結果である非改変型ペプチドＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲを同定した。

インターフェロン−β−１ａサンプルの抗ウイルス活性を、上で概述したＭＴＴ染色を含む手順を用いて脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスに曝露されたヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）に対して試験した。簡単には、Ａ５４９細胞を、ウイルスのチャレンジ前に、インターフェロン−β−１ａまたはペグ改変インターフェロン−β−１ａ（４０００、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、７５、６２．５、３１．２５、５０、３３．３、２２．２、１４．８、９．９、６．６、４．３９ｐｇ／ｍｌ）を用いて２４時間前処理した。このアッセイを、各々のインターフェロン−β−１ａ濃度に対する二つ組のデータ点を用いて実施した。標準偏差を、図７中にエラーバーとして示す。５０％ウイルス死滅度（「５０％の細胞変性効果」）（５０％の最大値ＯＤ₄₅₀）を提供するインターフェロン−
β−１ａ（処方されたか、またはバルク）の濃度は、約１１ｐｇ／ｍｌであり、そしてＰＥＧ改変インターフェロン−β−１ａに関する５０％細胞変性効果は、約１１ｐｇ／ｍｌである。従って、ＰＥＧ結合は、インターフェロン−β−１ａの抗ウイルス活性を変化させない。このアッセイにおいて、本発明者らは、インターフェロン−β−１ａの比活性が、インターフェロン−β−１ｂの比活性より約１０倍大きいことを日常的に見出し、従って、ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａは、任意のインターフェロン−β−ｂ産物よりも有意により活性である。

インターフェロン−β−１ａをまた、Ｆｌｕｋａ、Ｉｎｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７５９３６、Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ）から購入した５Ｋ ＰＥＧアルデヒド部分を用いて、２ｍｇ／ｍｌの５Ｋ ＰＥＧを含む反応を除いて２０Ｋ ＰＥＧアルデヒドを用いた改変のために記載された同一の手順に従って、ＰＥＧ化した。５Ｋ ＰＥＧを用いた改変もまた、Ｎ末端に対して非常に特異的であり、インターフェロン−β−１ａの抗ウイルス活性を変化させない。２０Ｋ添加物に類似して、５Ｋ ＰＥＧ インターフェロン−β−１ａは、抗ウイルスアッセイにおいて非改変インターフェロン−β−１ａと区別できなかった。

（実施例３．ＰＥＧ化は、インターフェロン−β−１ａをストレス誘導型凝集から保護する）
インターフェロン−βの凝集は、活性に有害な効果を有する。以前に、本発明者らは、インターフェロン−βの非グリコシル化型と対比して、グリコシル化がインターフェロン−β−１ａの安定性に劇的な効果を有することを示し、グリコシル化がインターフェロン−β−１ａのより高い比活性に寄与することを推測した（Ｒｕｎｋｅｌ Ｌ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：６４１〜６４９）。ポリアルキレングリコールポリマーとの結合体化がさらにインターフェロン−βを安定化し得るか否かを研究するために、本発明者らは、ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａを以下の手順を用いた熱ストレスに供した：
熱変性を、コンピューター制御の電熱性（ｔｈｅｒｍｏｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｈｅａｔｅｄ）キュベットホルダーを取り付けたＣＡＲＹ ３ ＵＶ可視化分光光度計を用いて実施した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ中のインターフェロン−β−１ａの溶液を、１ｍｌキュベットの中で２５℃で平衡にした。次いでキュベットホルダーの温度は、２℃／分の割合で２５℃〜８０℃へ勾配をなし、そしてタンパク質の変性を２８０ｎｍでの吸光度の連続的なモニタリングにより追跡した。この協同的な進展の事象の中間点であるＴｍは、計測された吸光度が、協同的な進展の遷移のいずれかの側の直線的な領域から外挿された直線によって規定された値の間の中途である温度の決定による融解曲線から得られた。

この分析からの結果を、図８に示す。非ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａが６０℃での５０％の遷移点を伴って変性されかつ凝集されたのに対して、８０℃でさえＰＥＧ化インターフェロン−βの凝集の証拠は存在しなかった。独立した解析において、本発明者らは、熱ストレスの処理を９５℃に拡大し、そしてこのより高い温度でさえ、本発明者らは、凝集の証拠を見ていない。従って、このポリアルキレングリコールポリマーとの結合体は、このタンパク質の安定性に対して顕著かつ有益な効果を有する。類似の安定性は、２０Ｋ ＰＥＧおよび５Ｋ ＰＥＧを含む改変インターフェロン−β−１ａを用いて見られる。

（実施例４．インターフェロン−β−１ａおよびＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａを処置をしたマウス血漿中のインターフェロン−β−１ａ抗ウイルス活性の測定）
マウス（Ｃ５７Ｂ１／６）に、５０，０００単位のインターフェロン−β−１ａまたは２０Ｋ ＰＥＧを含む５０，０００単位のＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａまたはコントロールとして与える等量のリン酸緩衝液のいずれかを、尾静脈を通じて静脈注入した。これらのマウスからの血液は、注入後異なる時間点において眼窩採血を介して得られた（直後、０．２５、１、４、２４および４８時間）。各々の時間点において少なくとも３匹のマウスを採血する。全血を抗凝血薬を含むチューブに回収する一方、細胞を、除去し、そして生じる血清を、アッセイの時まで凍結した。次いでこれらの血漿サンプルを、抗ウイルスアッセイにおいて試験した。

この血漿サンプルを、無血清培地中に１：１０に希釈し、０．２μｍのシリンジフィルターに通した。希釈したサンプルを、抗ウイルスアッセイに試験する。サンプルを、Ａ５４９細胞を含む９６ウェル組織培養プレートの指定されたウェル中に滴定する。標準インターフェロン−β−１ａの希釈（１０、６．７、４．４、２．９、１．３、０．９および０．６Ｕ／ｍｌ）および４つの血漿サンプルの希釈を、全てのプレートでアッセイした。Ａ５４９細胞を、ＥＭＣウイルスのチャレンジの前に、希釈された血漿サンプルを用いて２４時間前処理した。ウイルスを用いた２日間のインキュベーションに続いて、生存細胞を、ＭＴＴ（リン酸緩衝液中に５ｍｇ／ｍｌ）の溶液で１時間染色し、リン酸緩衝液で洗浄し、そしてイソプロパノール中の１．２ＮのＨＣｌで可溶化する。ウェルを、４５０ｎｍで読み取った。標準曲線を、各々のプレートに生成し、そして各々の試験サンプル中のインターフェロン−β−１ａの量を決定するのに用いた。異なるマウスからのサンプル中の活性を、図９において時間点に対してグラフ化した。

時間の関数として、ＰＥＧ化インターフェロン−β−１ａの循環からのより緩やかな消失は、ＰＥＧ化サンプルの半減期が未処理インターフェロン−β−１ａコントロールの半減期よりも長いということを示す。コントロールが４時間後にほとんど消失したのに対して、ＰＥＧ化産物の有意な割合は、４８時間後に検出された。血清中の最初の活性のレベルおよび４８時間後に残るレベルに基づいて、本発明者らは、ＰＥＧ化インターフェロンの半減期が、非改変インターフェロン−β−１ａの半減期に比べて延長したことを推測する。本研究からの第二の非常に重要な発見は、０時および６０分後の類似する高いレベルの活性によって証明されるように、ＰＥＧ化形態が分布相の間にほとんど失われないことである。このデータは、ＰＥＧ化産物の分布がコントロールインターフェロン−β−１ａとは異なり、血管系に非常に限定されることを示す。

（実施例５：霊長類における比較の薬物動態および薬力学）
（一般的プロトコール）
比較研究をポリマー−インターフェロンβ １ａ結合体およびネイティブなインターフェロン−β １ａ（非処方化バルク中間体インターフェロン−β−１ａ（リン酸ナトリウムおよびＮａＣｌ、ｐＨ７．２中）の場合）で実行し、霊長類におけるそれらの相対的安定性および活性を決定する。これらの研究において、霊長類におけるポリマー−インターフェロン−β １ａ結合体の薬物動態および薬力学は、ネイティブなインターフェロン−β １ａの薬物動態および薬力学を比較し、そして合理的な推論をヒトにおいて予期し得る。

（動物および方法）
（研究デザイン）
これは、結合体化されたインターフェロン−β−１ａおよび結合体化されていないインターフェロン−β−１ａの比較の薬物動態および薬力学を評価するための、並行する群の反復用量研究である。

健常な霊長類（好ましくはアカゲザル）を、本研究のために用いる。投与の前に、全ての動物を、試験物投与の前１４日内に、２回の機会で、Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙにより疾病、健康の徴候について評価する：１回の評価は最初の試験物投与の前２４時間内でなければならない。健常動物のみに試験物を投与する。評価には、一般的な身体的検査、およびベースラインの臨床病理のための投与前の血液採取、およびインターフェロン−β−１ａに対するベースラインの抗体レベルを含む。全ての動物を秤量し、そして体温を試験物投与の前２４時間内に記録した。

１２例の被験体を登録し、ＰＥＧ−インターフェロン−β−１ａ結合体または非結合体のいずれか（さもなければインターフェロン−β−１ａそのもの）として、インターフェロン−β−１ａの１ＭＵ／ｋｇを投与するグループに割当てる。投与は、皮下（ＳＣ）経路または静脈内（ＩＶ）経路のいずれかである。全ての動物は、インターフェロン−β処置に未経験でなければならない。それぞれの動物は、２回の機会で投与される；用量は、４週間まで間隔をあけられる。この用量の容積は１．０ｍＬ／ｋｇである。

各注射後、種々の時間間隔で、薬物動態学的試験のために血液を採取する。インターフェロンが誘導した、生物学的応答マーカーである血清ネオプテリンの測定のための血液サンプルをまた、研究薬物の投与後、採取する。

研究期間の評価としては、毒性の兆候について、投与後３０分および１時間で行った臨床観察を含む。毎日、ケージのそばで観察を行い、そして全身的外観、毒性の徴候、不快感および挙動における変化を記録する。体重および体温を、投与後２１日間を通じて一定間隔で記録する。

（アッセイ方法）
血清中のインターフェロンβのレベルを、細胞変性効果（ＣＰＥ）バイオアッセイを用いて定量する。ＣＰＥアッセイは、インターフェロン媒介性抗ウイルス活性のレベルを測定する。サンプル中の抗ウイルス活性のレベルは、血液が吸引された時点でそのサンプル中に含まれている活性なインターフェロンの分子数を反映する。このアプローチは、インターフェロンβの薬物動態を評価する標準的な方法であった。この研究で用いられるＣＰＥアッセイは、インターフェロンβが、ヒト肺癌腫細胞（Ａ５４９、＃ＣＣＬ−１８５、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスに起因する細胞傷害性から防御する能力を検出する。この細胞を、インターフェロン誘導性タンパク質（これは次いで、抗ウイルス反応を上昇する）の誘導および合成を可能にするため血清サンプルとともに１５〜２０時間プレインキュベートする。後に、ＥＭＣウイルスを添加し、そしてさらに３０時間インキュベートし、その後、細胞傷害性の評価をクリスタルバイオレット染色を用いて行う。インターフェロンβの内部標準およびＰＥＧ結合体の内部標準をそれぞれのアッセイプレートにおいてサンプルと同時に試験する。この標準を、天然のヒト線維芽細胞インターフェロン参照標準（ＷＨＯ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，Ｇｂ−２３−９０２−５３）に対して較正する。それぞれのアッセイプレートはまた、いかなる種類のインターフェロンβもＥＭＣも含まない細胞増殖コントロールウェルを含み、そしてウイルスコントロールウェルは、細胞およびＥＭＣを含むがインターフェロンβを含まない。標準およびサンプルを含有するコントロールプレートをまた、細胞増殖へのサンプルの効果（もし存在するならば）を決定するために準備する。これらのプレートをウイルスの添加なしに染色する。

サンプルおよび標準を、それぞれの２つの複製アッセイプレート上で二連で試験し、１サンプルあたり４つのデータポイントを得る。４つの複製の幾何平均濃度を報告する。このアッセイにおける検出限界は１０ユニット（Ｕ）／ｍｌである。

ネオプテリンの血清濃度を市販のアッセイを用いて、臨床薬理学的単位で決定する。

（薬物動態学的方法および統計学的方法） Ｒｓｔｒｉｐ ＴＭソフトウェア（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ、Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ ＣＩｔｙ、ＵＴ）を用いて、薬物動態モデルにデータを適合させる。幾何平均濃度を各群について時間でプロットする。アッセイ結果は希釈度で表現されるので、幾何平均は、算術平均よりも適切であると考えられる。血清インターフェロンレベルをベースライン値について調節し、そして検出不能な血清濃度は５Ｕ／ｍｌに設定する。これは、検出下限の１／２を示す。

ＩＶ注入データについては、２コンパートメントのＩＶ注入モデルが、各被験体についての検出可能な血清濃度に適合する、そしてＳＣデータは、２コンパートメント注射モデルに適合する。

以下の薬物動態学的パラメーターを算出する：
（ｉ）観察されたピーク濃度、Ｃ_max（Ｕ／ｍｌ）；
（ｉｉ）台形公式を用いる、０〜４８時間の曲線下面積、ＡＵＣ；
（ｉｉｉ）排泄半減期；
および、ＩＶ注入データ（ＩＶが用いられる場合）から、以下を算出する：
（ｉｖ）分布半減期（ｈ）；
（ｖ）クリアランス（ｍｌ／ｈ）
（ｖｉ）見かけの分布容積、Ｖｄ（Ｌ）。

ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ，ＮＣ）ソフトウェアを用いて、ＳＣ注射およびＩＭ注射後、排泄半減期を算出する。

ネオプテリンについては、各群について、時間による算術平均を示す。ベースラインからの最大変化Ｅ_maxを算出する。Ｃ_max、ＡＵＣおよびＥ_maxを一元分散分析に供し、投薬
群を比較する。Ｃ_maxおよびＡＵＣを、分析の前に対数変換し；幾何平均を報告する。

（実施例６：アカゲザルにおけるＰＥＧ化されたインターフェロンβ−ｌａおよびインターフェロン−β−ｌａの薬物動態の比較評価）
（材料および方法）
インターフェロンβ−１ａまたはＰＥＧ化ＩＦＮ β−１ａを実施例５の一般的プロトコールに記載のように、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）経路により、１日目、および２９日目に再度アカゲザルに投与した。１日目、６匹のサルに、ＩＦＮβ−１ａ（１経路あたり３匹）を与え、そして別の６匹のサルにＰＥＧ化ＩＦＮβｌａ（１経路あたり３匹）を与えた。２９日目に、この用量を繰り返した。このＩＶ用量を、橈側皮静脈または伏在静脈に緩徐なボーラス注射で投与した。

このＳＣ用量を注射部位を剃毛した後、背中の皮膚の下に投与した。特定の時点で、大腿静脈を介して血液を収集し、血清を得るために凝血させた。血清を、確証（バリデート）された抗ウイルスＣＰＥ方法を用いて機能的薬物のレベルについて、そして血清ネオプテリンおよびβ２マイクログロブリンレベルについて（活性の薬力学測定値として）分析した。Ｗｉｎ Ｎｏｌｉｎ バージョン２．０ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ、ＮＣ）を用いて薬物動態パラメーターを算出した。

標準的なモデル−独立方法（非コンパートメント分析）により濃度データを分析して、薬物動態学的パラメーターを得た。台形公式を用いて、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌバージョン５．０のソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ ＷＡ）を使用して、算術平均および標準偏差をむ、統計解析を実行した。定量の下限（ＢＬＱ）と報告された濃度値は、薬力学的分析において用いなかった。異なるコンピュータおよびコンピュータプログラムが、異なって数を切り捨てる（ｒｏｕｎｄ ｏｆｆ）かまたは切り捨てる（ｔｒｕｎｃａｔｅ）という事実に起因して、いくつかの表における値（例えば、平均、標準偏差または個々の値）は、他の表における値から、個々に算出したデータから、または統計学的分析データからわずかに異なり得る。データの統合性も解釈も、これらの相違による影響を受けなかった。

（結果および考察）
投与の各々の経路の内で、ＰＥＧ化されたＩＦＮβ−ｌａは、より高い生体有用性（血清中濃度−時間曲線の下の面積によって測定される場合）を呈した。加えて、ＳＣ経路によって投与される場合、ＰＥＧ化されたＩＦＮβ−ｌａは、ＩＦＮβ−ｌａと比べて、より高い絶対的な生体有用性を有した。本発明者らは、表５に薬物動態学的パラメーターを要約する。ＩＶ経路およびＳＣ経路の両方によるＰＥＧ化されたＩＦＮβ−ｌａの投与は、半減期の延長およびＩＦＮβ−ｌａのＡＵＣの増大を生じる。

初回用量のＩＶ投与後、ＩＦＮ β−１ａおよびＰＥＧ化ＩＦＮβ−１ａの平均（±標準偏差）ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）は、それぞれ、６４００（±０）および１０８００（±３．５）Ｕ／ｍＬであった。平均（±標準偏差）ＡＵＣ値は、それぞれ、４４５３（±７９９）および３４３７３（±３６０１）Ｕ^*ｈｒ／ｍＬであった。最初のＳＣ投与後
、ＩＦＮ β−１ａおよびＰＥＧ化ＩＦＮβ−１ａの平均（±標準偏差）Ｃｍａｘは、それぞれ、２７７（±７５）および１０８０（±３８１）Ｕ／ｍＬであった。平均（±標準偏差）ＡＵＣ値は、それぞれ、４７５３（±３１７０）および４４９５２（±１４４３）Ｕ^*ｈｒ／ｍＬであった。

血清ネオプテリンおよび血清β２ミクログロブリンの両方のレベルは、ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ化されたＩＦＮ−βでの処置後、上昇し、これは産物の薬理学的活性を示した。使用する高用量の試験化合物で、投与のいずれの経路によっても、ＩＦＮβ−ｌａおよびＰＥＧ化されたＩＦＮβ−ｌａの薬理学的活性の相違は存在しなかった（データ示さず）。

（実施例７：種々の様式の投与後のラットにおけるＰＥＧ化インターフェロンβ−ｌａおよびインターフェロン−β−ｌａの薬物動態学の比較評価）
この研究の目的は、いくつかの投与経路による、インターフェロンβ−ｌおよびＰＥＧ化されたインターフェロンβ−ｌａのバイオアベイラビリティー比較を決定することであった。

（材料および方法：）
本発明者らは、１つの経路／処方物につき２匹のラットを用いる薬物動態学的解析のため、雌性Ｌｅｗｉｓラット（それぞれ１９０グラムで）を使用した。ラットに、頸静脈カニューレを挿入し、そしてヒトインターフェロンβ−ｌａまたは５ＫのＰＥＧ化されたヒトインターフェロンβ−ｌａまたは２０Ｋのヒトインターフェロンβｌａ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７．２中の、１４ｍｇ／ｍｌのＨＳＡからなるビヒクル中）を、静脈内に腹膜内に、経口的に、皮下的に、または気管内に投与した。７２時間の期間を通じて、０．５分、１５分、３０分、７５分、３時間、２４ｈ、４８時間および７２時間に血液を数回処理した。このプロトコルを表６に示す。血清中にインターフェロンβを検出するため血清サンプル上で細胞変性効果（ＣＰＥ）バイオアッセイを、実行した。改変されていないインターフェロンβ−ｌａおよび２０ＫのＰＥＧを用いてＰＥＧ化されるインターフェロンβ−ｌａによって生じる結果を、表７に示す。全ての場合において、ＰＥＧ化は、ｔ_l/2およびＡＵＣの有意な増加を生じた。

（実施例 ８：ポリマー−結合体化インターフェロンβ−ｌａの抗脈管形成効果：インビトロにおける内皮細胞増殖を阻害するＰＥＧ化されたインターフェロンβ−ｌａの能力の評価）
ヒト血管内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２ＶＯ−Ｐ７５）およびヒト皮膚微小血管内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２Ｍ１−Ｃ２５）を、ＣＳ−Ｃ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４Ｚ０−５００）を用いて培養中で維持する。実験の２４時間前に、細胞をトリプシン処理して、アッセイ培地（９０％のＭ１９９および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ））において再懸濁して、所望の細胞密度に調節する。次いで、細胞を、ゼラチン被覆した２４または９６ウェルプレートに、それぞれ１２，５００細胞／ウェルまたは２，０００細胞／ウェルのいずれかでプレートする。

一晩のインキュベーションの後、アッセイ培地を、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号４００６０）および種々の濃度の結合体化インターフェロン−β−１ａタンパク質および非結合体化インターフェロン−β−１ａタンパク質、または陽性コントロール（エンドスタチンは、ｂＦＧＦに対する抗体であり得るので、陽性コントロールとして用いられ得る）を含有する新鮮培地と交換する。最終容積は、２４ウェルプレートで０．５ｍｌ、または９６ウェルプレート中で０．２ｍｌに調節する。

７２時間以後、細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数のためにトリプシン処理し、ＣｙＱｕａｎｔ蛍光読取りのために凍結させるか、または［３Ｈ］チミジンによって標識する。結合体化されたインターフェロン−β１ａおよび非結合体化インターフェロン−βｌａによるインビトロでの内皮細胞増殖の阻害は匹敵するものであった。これは、この設定においてインターフェロンが機能する能力を、ＰＥＧ化が妨げなかったことを示した。

このインビトロアッセイは、インビボで抗血管形成性の効果を表し得る血管内皮細胞増殖に対する効果について、本発明のヒトインターフェロンβ分子を試験する。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．、Ｔ．Ｂｏｅｈｍ、Ｙ． Ｓｈｉｎｇ、Ｎ． Ｆｕｋａｌ、Ｇ． Ｖａｓｉｏｓ、Ｗ．Ｌａｎｅ、Ｅ．Ｆｌｙｎｎ、Ｊ．Ｂｉｒｋｈｅａｄ、Ｂ．ＯｌｓｅｎおよびＪ．Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９７）．Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ：Ａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ ８８、２７７〜２８５を参照のこと。

（実施例９：結合体化インターフェロン−β−ｌａの抗脈管形成効果および血管新生効果を試験するためのインビボモデル
本願明細書において記載されている分子の抗脈管形成効果および抗新生血管効果について試験するために種々のモデルが開発された。これらのモデルのいくつかは、米国特許５，７３３，８７６号（１９９８年３月３１日：「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」および同第５，１３５，９１９号（１９９２年８月４日：「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」）において記載されている。他のアッセイとしては、Ｓ．ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｆｏｌｋｍａｎの殻なし（ｓｈｅｌｌ−ｌｅｓｓ）漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ；Ｎａｔｕｒｅ、２９７，３０７（１９８２）およびＲ．Ｃｒｕｍ．Ｓ．ＳｚａｂｏおよびＪ．Ｆｏｌｋｍａｎ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３０．１３７５（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ．らのマウス背部気嚢法（ｍｏｕｓｅ ｄｏｒｓａｌ ａｉｒ ｓａｃ ｍｅｔｈｏｄ）脈管形成モデル；Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３３，２７５（１９７１）、ならびにＧｉｍｂｒｏｎｅ，Ｍ．Ａ．Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ。５２，４１３（１９７４）のラット角膜マイクロポケットアッセイ（ここでは、各角膜に、ＥＶＡ（エチレン酢酸ビニルコポリマー）ペレットに植えつけられた、５００ｎｇの塩基性ＦＧＦ（ウシ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を移植することにより、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系統（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｊａｐａｎ）の成体雄性ラットにおいて、角膜血管新生が誘導される）が挙げられる。

動物モデルにおける抗脈管形成効果について、ＰＥＧ化されたマウスのインターフェロンβを試験するための他の方法は、もともとＣａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第３部、第３巻、２号（１９７２年９月）および補遺のＩｎ Ｖｉｖｏ
Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｓ、１９７６−１９８２（１９８４年２月、ＮＩＨ公開番号８４−２６３５）に記載のように、新規な潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのプロトコールを含む（がこれに限定されない）。

Ｉ型インターフェロンの種間障壁のため、げっ歯類モデルにおけるポリマー結合体化インターフェロンβの抗脈管形成活性を評価するために、ポリマー結合体化げっ歯類インターフェロンβ調製物を生成する。このようなスクリーニング方法は、皮下に移植されたＬｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ上のＰＥＧ化されたマウスインターフェロンβの抗脈管形成効果について試験するためのプロトコールによって例証される。

（腫瘍系統の起源：）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺の癌腫として、１９５１年に自然に発症した。

（試験手順の概要：）腫瘍フラグメントを、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスの腋窩部に皮下移植する。試験剤（すなわち、本発明のＰＥＧ化インターフェロン）を、腫瘍の移植後、種々の日数にて、種々の用量で、皮下（ＳＣ）、または腹腔内（ＩＰ）投与する。測定されるパラメーターは、メジアン生残時間である。結果を、コントロール生残時間のパーセンテージとして表す。

（動物：） 生殖：Ｃ５７ＢＬ／６マウス 試験：Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス 重量：マウスは、雄性については１８ｇｍ、そして雌性については１７ｇｍの最小重量であり、３ｇｍの重量範囲内でなければならない 性別：１つの実験の全ての検査およびコントロール動物については１つの性別を用いる 供与源：当然ながら、実現可能ならば、１つの実験において全ての動物について１つの供給源
（実験のサイズ：）
１試験群あたり１０動物
（腫瘍移植：）
（生殖：）
フラグメント：ｓ．ｃ．ドナー腫瘍の２〜４ｍｍのフラグメントを調製する
時間：１３日〜１５日
部位：鼠径部の穿刺で腋窩部にフラグメントをｓ．ｃ．移植する。

（試験：）
フラグメント：ｓ．ｃ．ドナー腫瘍の２〜４ｍｍフラグメントを調製する
時間：１３日〜１５日。

部位：鼠径部の穿刺で腋窩部にフラグメントをｓ．ｃ．移植する。

（試験スケジュール：）
０日目：腫瘍を移植する。細菌培養を行う。あらゆる奇数実験において陽性コントロール化合物を試験する。材料を調製する。毎日、死亡を記録する。
１日目：培養を点検する。汚染される場合、実験を廃棄する。動物を無作為化する。指示される（１日目およびその後の日）ように、処理する。
２日目：培養を再点検する。汚染される場合、実験を廃棄する。
５日目：２日目、および初回の試験剤の毒性評価の日、秤量する。
１４日目：早期死亡日をコントロールする。
４８日目：とらない日をコントロールする。
６０日目：実験をおわり、評価する。肺にひどい腫瘍がないか調べる。

（品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）：）
あらゆる奇数実験において、陽性コントロール化合物（ＮＳＣ２６２７１（１００ｍｇ／ｋｇ／注射の用量のＣｙｔｏｘａｎ））を予定する。このためのレジメンは、１日目のみの腹腔内である。陽性コントロールについての試験／コントロールの下限は１４０％である。許容可能な未処理コントロールのメジアン生残時間は１９〜３５．６日である。

（評価：）
測定されるパラメーターは、１日目および５日目についての、メジアン生残時間、Ｃｏｍｐｕｔｅ平均動物体重であり、全ての試験群について試験／コントロール比を計算する。実施（ｓｔａｇｉｎｇ）日および最終評価日の平均の動物体重を計算する。試験／コントロール比を、５日目に６５％をこえる生存動物を有する全ての試験群について計算する。８６％より小さい試験／コントロール比の値は、毒性を示す。過剰の体重変化の相違（試験からコントロールを減算）が、また、毒性を評価する際に用いられ得る。

（活性のための基準：）
１４０％以上の初期の試験／コントロール比が、中程度の活性を示すのに必要であると考えられる。１５０％以上の再現可能な試験／コントロール比の値は、有意な活性と考えられる。

Claims (12)

1. グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子のＮ末端でポリアルキレングリコールポリマーに連結された、グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子を調製する方法であって、該方法は、
   ａ）活性化ポリアルキレングリコールポリマーを調製する工程；
   ｂ）反応混合物中、還元的アルキル化条件下で、該グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子を該活性化ポリアルキレングリコールポリマーと反応させる工程；
   ｃ）該活性化ポリアルキレングリコールポリマーを該グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子のＮ末端に連結させる工程；および
   ｄ）該反応混合物を精製して、該グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子のＮ末端でポリアルキレングリコールポリマーに連結された、精製されたグリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子を得る工程
   を包含し、該グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子は、以下：
   
   
   から選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
2. 前記反応させる工程（ｂ）が、タンパク質１モルあたり１．０〜１０モルの活性化ポリマーの反応を含む、請求項１に記載の方法。
3. 還元的アルキル化が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記ポリアルキレングリコールポリマーの分子量が、５〜４０キロダルトンである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ポリアルキレングリコールポリマーが、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、複数のヒスチジン残基、ヒドラジン基、または、アミノチオール基から選択される基によって、インターフェロン−βに連結される、請求項１に記載の方法。
6. 前記ポリアルキレングリコールポリマーが、ポリエチレングリコールポリマーである、請求項１に記載の方法。
7. 前記ポリエチレングリコールポリマーが、２０キロダルトンのＰＥＧアルデヒドである、請求項６に記載の方法。
8. 前記方法がさらに、前記ポリアルキレングリコールポリマーが連結されたグリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子と、皮下投与または静脈内投与に適した薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を調製する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
9. 前記精製する工程が、一連のクロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記一連のクロマトグラフィーが、サイズ分離カラムの使用を含む、請求項９に記載の方法。
11. 還元的アルキル化が、ｐＨ５〜７で行われる、請求項１に記載の方法。
12. 前記グリコシル化インターフェロンβ−１ａ分子が、以下のアミノ酸配列：
    
    を有する、請求項１に記載の方法。